CN108368482A - 寡核酸变体文库及其合成 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于生成编码核酸序列的预定变体的高度准确的寡核酸文库的方法。变异程度可能是完全的，其导致饱和的变体文库，或者所述变异程度可能是不完全的，其导致选择性的变体文库。本文所述的变异寡核酸文库可被设计用于通过转录或翻译进一步加工。本文所述的变异寡核酸文库可被设计为生成变异RNA、DNA和/或蛋白质群体。本文进一步提供了用于鉴定具有增加或降低活性的变异物种的方法，其应用于调节用于治疗或减少疾病的治疗剂的生物学功能及设计。

Description

寡核酸变体文库及其合成
交叉引用
本申请要求2015年9月18日提交的美国临时申请号62/220,879、2015年12月4日提交的美国临时申请号62/263,548和2016年6月23日提交的美国临时申请号62/354,034的权益。所有上述申请均通过引用并入本文。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交的序列表，并且其通过引用以其全文并入于此。创建于2016年9月12日的所述ASCII副本被命名为44854_718_601_SL.txt且大小为7,841个字节。
背景技术
合成生物学的基石是设计、构建和测试过程—一个需要DNA的迭代过程，以使得便于快速且合算地生成和优化这些定制途径和生物体。在设计阶段，构成DNA的A、C、T和G核苷酸被构建成会包含感兴趣的基因座或途径的多种基因序列，其中每个序列变体代表待进行测试的特定假设。这些变异基因序列代表序列空间的子集，这一概念起源于进化生物学，并且适用于组成基因、基因组、转录物组和蛋白质组的全部序列。
通常针对每个设计-构建-测试周期设计许多不同的变体，以实现对序列空间的充分采样并最大化优化设计的可能性。尽管在概念上很简单，但与常规合成方法相关的速度、通量和质量的工艺瓶颈抑制了这一周期进展速度，从而延长了开发时间。由于极其准确的DNA的高成本和当前合成技术的有限通量，因此无法充分探究序列空间仍然是限速步骤。
从构建阶段开始，两个过程值得注意：寡核酸合成和基因合成。以往，通过分子克隆实现不同基因变体的合成。这种方法虽然稳定，但无法放大。早期化学基因合成工作力度集中于产生大量具有重叠序列同源性的寡核酸。随后将这些寡核酸合并，并经历多轮聚合酶链反应(PCR)，使重叠的寡核酸连接成全长双链基因。许多因素阻碍了这一方法，包括构建耗时耗力、亚磷酰胺需求量大、原材料昂贵以及最终产品的纳摩尔产量(明显低于下游步骤所需量)，并且大量单独的寡核酸需要一个96孔板来建立一个基因的合成。
在微阵列上合成寡核酸使得基因合成的通量明显增加。可以在微阵列表面上合成大量的寡核酸，然后切下并合在一起。对于特定基因所指定的每种寡核酸含有独特的条形码序列，其能够将特定的寡核苷酸亚群分组(depooled)并组装成感兴趣的基因。在该过程的这个阶段，将每个子池转移至96孔板中的一个孔中，将通量增加到96个基因。虽然通量比经典方法高两个数量级，但由于缺乏成本效益且周转时间缓慢，它仍然不能充分支持一次需要数千个序列的设计、构建和测试周期。
发明内容
本文提供了调节蛋白质活性的方法，该方法包括：提供编码至少约30,000个不同的寡核酸的预定序列，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个编码与单个参考序列相比的变异密码子序列；提供具有表面的结构；合成所述至少约30,000个不同的寡核酸，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个均从所述表面延伸；将所述至少约30,000个不同的寡核酸与DNA聚合酶和所述单个参考序列混合以形成变异核酸文库；将所述变异核酸文库转移至细胞并表达多种变异蛋白质；以及鉴定与所述多种变异蛋白质的变异蛋白质相关的活性，其中所述活性相对于由所述单个参考序列编码的蛋白质进行调节。本文进一步提供了其中所述活性包括细胞繁殖、生长、粘附、死亡、迁移、能量产生、氧利用、代谢活性、细胞信号传导、老化、对自由基损伤的应答或其任意组合的方法。本文进一步提供了其中所述细胞为真核细胞或原核细胞的方法。本文进一步提供了其中所述细胞为细菌、植物、小鼠或灵长类动物细胞的方法。本文进一步提供了其中所述变异核酸文库编码变异基因或其片段的序列的方法。本文进一步提供了其中所述变异蛋白质为抗体、酶或肽的方法。本文进一步提供了其中所述变异蛋白质对另一种分子具有增强或降低的结合亲和力的方法。本文进一步提供了其中所述变异蛋白质具有增强或降低的酶活性的方法。本文进一步提供了其中向有需要的受试者施用由所述变异核酸文库编码的单个变异核酸的方法。本文进一步提供了其中所述至少约30,000个不同的寡核酸相比于所述多个不同的寡核酸的预定序列具有小于1/1000个碱基的总错误率的方法。
本文提供了调节细胞活性的方法，该方法包括：提供编码至少约30,000个不同的寡核酸的预定序列，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个编码与单个参考序列相比的预定的变异序列；提供具有表面的结构；合成所述至少约30,000个不同的寡核酸，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个均从所述表面延伸；并且其中所述至少约30,000个不同的寡核酸相比于所述多个不同的寡核酸的预定序列具有小于1/1000个碱基的总错误率；将所述至少约30,000个不同的寡核酸与DNA聚合酶和所述单个参考序列混合以形成变异核酸文库；将所述变异核酸文库转移至第一组细胞；以及测量细胞活性的变化，其中针对所述第一组细胞或第二组细胞测量所述细胞活性，其中所述第二组细胞用至少一种从所述第一组细胞中分离的表达产物来处理。本文进一步提供了其中所述细胞活性包括繁殖、生长、粘附、死亡、迁移、能量产生、氧利用、代谢活性、细胞信号传导、对自由基损伤的应答或其任意组合的方法。本文进一步提供了其中所述第一组细胞或所述第二组细胞为真核细胞或原核细胞的方法。本文进一步提供了其中所述第一组细胞或所述第二组细胞为细菌、植物、小鼠或灵长类动物细胞的方法。本文进一步提供了其中所述变异核酸文库编码变异基因或其片段的序列的方法。本文进一步提供了其包括翻译每种变异基因以形成蛋白质的方法。本文进一步提供了其中所述蛋白质为抗体、酶或肽的方法。本文进一步提供了其中所述变异核酸文库编码所述抗体的可变区或恒定区的至少一部分的方法。本文进一步提供了其中所述变异核酸文库编码所述抗体的至少一个CDR区的方法。本文进一步提供了其中所述蛋白质对另一种分子具有增强或降低的结合亲和力，或者其中所述蛋白质具有增强或降低的酶活性的方法。本文进一步提供了其中所述变异核酸文库编码转录调节序列的方法。本文进一步提供了其中所述转录调节序列为启动子序列、UTR序列或终止子序列的方法。本文进一步提供了其中所述变异核酸文库编码在转录时编码mRNA、miRNA或shRNA的序列的方法。
本文提供了治疗或减少疾病状态的方法，该方法包括：提供编码至少约30,000个不同的寡核酸的预定序列，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个编码与单个参考序列相比的变异密码子序列；提供具有表面的结构；合成所述至少约30,000个不同的寡核酸，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个均从所述表面延伸；将所述至少约30,000个不同的寡核酸与DNA聚合酶和所述单个参考序列混合以形成变异核酸文库；将所述变异核酸文库转移至从受试者中获得的细胞；鉴定与由变异核酸文库编码的变异核酸相关的有害活性的降低；以及向有需要的受试者施用由所述变异核酸文库编码的所述变异核酸，从而治疗或减少所述疾病状态。本文进一步提供了其中所述疾病状态与细胞增殖性病症、自身免疫性病症、病毒性病症或细菌性疾病相关的方法。本文进一步提供了其中所述至少约30,000个不同的寡核酸相比于所述多个不同的寡核酸的预定序列具有小于1/1000个碱基的总错误率的方法。
本文提供了核酸合成的方法，该方法包括：提供编码多个不同的寡核酸的预定序列，其中所述不同的寡核酸中的每一个的长度为至少20个碱基，并且其中所述多个不同的寡核酸对于至少一个序列的至少3个密码子中的每一个编码最多19个变体，并且其中所述多个不同的寡核酸共同编码至少一个基因及其变体；提供具有表面的结构；合成所述多个不同的寡核酸，其中所述不同的寡核酸中的每一个均从所述表面延伸；以及组装来自所述多个不同的寡核酸的变异核酸文库。本文进一步提供了其中所述多个不同的寡核酸包含至少75,000个不同的寡核酸的方法。本文进一步提供了其中共同编码单个基因及其变体的所述多个不同的寡核酸的子集位于所述结构表面上的单簇(clusters)内的方法。本文进一步提供了其中所述结构的表面包含至少6000个所述单簇的方法。本文进一步提供了其中每个簇位于直径约0.5至2mm的通道内的方法。本文进一步提供了其中所述单簇包含50至500个用于核酸延伸的座位的方法。本文进一步提供了其中所述多个不同的寡核酸共同编码一个以上基因的变体的方法。本文进一步提供了其中所述多个不同的寡核酸共同编码至少5,000个基因的变体的方法。本文进一步提供了其中所述变异核酸文库编码酶、肽或抗体的至少一部分的方法。本文进一步提供了其中每个变异核酸编码至少85％的基因的序列的方法。本文进一步提供了其中通过表达共同包含本文所述的不同寡核酸的多个表达构建体而生成蛋白质文库的方法。
本文提供了寡核酸文库，其包含多个不同的寡核酸，其中每个不同的寡核酸的长度为至少12个碱基，其中所述多个不同的寡核酸对于至少3个密码子中的每一个编码约19个变体，并且其中所述多个不同的寡核酸相比于所述多个不同的寡核酸的预定序列具有小于1/1000个碱基的总错误率。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸相比于所述多个不同的寡核酸的预定序列具有小于1/1500个碱基的总错误率。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸相比于所述多个不同的寡核酸的预定序列具有小于1/2000个碱基的总错误率。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸中的每一个的长度为至少30个碱基。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸中的每一个的长度为至少50个碱基。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸中的每一个的长度为12至100个碱基。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸共同编码基因至少85％的序列。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸共同编码基因中的多个外显子的序列。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述基因编码抗体、酶或肽的至少一部分。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸包含编码所述抗体的可变区或恒定区的寡核酸。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸包含编码所述抗体的至少一个CDR区的寡核酸。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸共同编码表达盒中的一个或多个区段的序列。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述表达盒包含至少一个启动子区域，并且所述多个不同的寡核酸包含编码所述启动子区域的至少一部分的寡核酸。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述表达盒包含两个启动子区域。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少3个密码子是连续的。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少3个密码子是不连续的。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少3个密码子中的至少2个彼此相隔至少一个密码子位置。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述文库包含编码4、5、6、7、8、9或10个密码子中的密码子变体的不同寡核酸。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸编码至少4个密码子中的所有可能的密码子变体。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述不同的寡核酸均不编码多于三个组氨酸残基的密码子。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述不同的寡核酸均不编码多于四个组氨酸残基的密码子。
本文提供了寡核酸文库，其包含至少75,000个不同的寡核酸，其中所述至少75,000个不同的寡核酸中的每一个的长度为至少30个碱基，其中所述至少75,000个不同的寡核酸对于至少一个序列的至少3个密码子中的每一个编码至少3个变体，并且其中所述至少75,000个不同的寡核酸相比于所述多个不同的寡核酸的预定序列具有小于1/1000个碱基的总错误率。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少75,000个不同的寡核酸相比于所述至少75,000个不同的寡核酸的预定序列具有小于1/1500个碱基的总错误率。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少75,000个不同的寡核酸中的每一个包含至少50个碱基的长度。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少75,000个不同的寡核酸共同编码基因至少85％的序列。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少75,000个不同的寡核酸共同编码相同基因中的多个外显子的序列。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述基因编码抗体、酶或衔接蛋白中的至少一部分。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少75,000个不同的寡核酸包含编码所述抗体的可变区或恒定区的寡核酸。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少75,000个不同的寡核酸包含编码所述抗体的至少一个互补决定区(CDR)的寡核酸。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少75,000个不同的寡核酸共同编码表达盒中的一个或多个区段的序列。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述表达盒包含至少一个启动子区域，并且所述至少75,000个不同的寡核酸包含编码所述启动子区域的至少一部分的寡核酸。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述表达盒包含两个启动子区域。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少3个密码子是连续的。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少3个密码子是不连续的。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少3个密码子中的至少2个彼此相隔至少一个密码子位置。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述至少75,000个不同的寡核酸编码至少3个密码子中的所有可能的密码子变体。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述不同的寡核酸均不编码多于三个组氨酸残基的密码子。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述不同的寡核酸均不编码多于四个组氨酸残基的密码子。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述文库包含至少100,000个不同的寡核酸。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述文库包含至少700,000个不同的寡核酸。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述文库包含至少1,000,000个不同的寡核酸。
本文提供了寡核酸文库，其包含多个不同的寡核酸，其中每个不同的寡核酸的长度为约20至130个碱基，其中所述多个不同的寡核酸对于至少一个序列的至少3个密码子中的每一个共同编码约19个变体，并且其中所述多个不同的寡核酸相比于所述多个不同的寡核酸的预定序列具有小于1/1000个碱基的总错误率。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸包含50至500个不同的寡核酸。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述多个不同的寡核酸共同编码至少50个变异基因。本文进一步提供了寡核酸文库，其中将所述50至500个不同的寡核酸附接至结构的表面，并位于非连续簇内。本文进一步提供了寡核酸文库，其中所述50至500个不同的寡核酸共同编码至少50个变异基因。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文，其程度犹如具体地和个别地指出每一单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
图1A-1D描绘了结合PCR诱变步骤合成变异生物分子的处理工艺流程。
图2A-2D描绘了生成包含在单个预定密码子位点处与参考寡核酸序列不同的核酸序列的寡核酸的处理工艺流程。
图3A-3F描绘了从模板寡核酸生成一组寡核酸变体的备选工作流程，其中每个变体在单个密码子位置处包含不同的核酸序列。每个变异寡核酸在其单个密码子位置处编码不同的氨基酸，不同的密码子由X、Y和Z表示。
图4A-4E描绘了具有多个氨基酸(每个残基由单个圆圈表示)的参考氨基酸序列(图4A)和使用本文所述方法生成的变异氨基酸序列(图4B、4C、4D和4E)。参考氨基酸序列和变异序列由本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。
图5A-5B描绘了参考氨基酸序列(图5A，SEQ ID NO:24)和变异氨基酸序列文库(图5B，按出现顺序分别为SEQ ID NO 25-31)，每个变体包含单个残基变体(由“X”表示)。参考氨基酸序列和变异序列由本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。
图6A-6B描绘了参考氨基酸序列(图6A)和变异氨基酸序列文库(图6B)，每个变体包含单个位置变体的两个位点。每个变体由不同图案的圆圈表示。参考氨基酸序列和变异序列由本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。
图7A-7B描绘了参考氨基酸序列(图7A)和变异氨基酸序列文库(图7B)，每个变体包含一段氨基酸(由围绕圆圈的框表示)，每一段具有其序列与参考氨基酸序列不同的三个位点的位置变体(编码组氨酸)。参考氨基酸序列和变异序列由本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。
图8A-8B描绘了参考氨基酸序列(图8A)和变异氨基酸序列文库(图8B)，每个变体包含两段氨基酸序列(由围绕圆圈的框表示)，每一段具有其序列与参考氨基酸序列不同的一个位点的单个位置变体(由有图案的圆圈表示)。参考氨基酸序列和变异序列由本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。
图9A-9B描绘了参考氨基酸序列(图9A)和氨基酸序列变体文库(图9B)，每个变体包含一段氨基酸(由有图案的圆圈表示)，每一段具有其序列与参考氨基酸序列不同的单个位点的多个位置变体。在该图示中，5个位置是不同的，其中第一个位置具有50/50的K/R比率；第二个位置具有50/25/25的V/L/S比率，第三个位置具有50/25/25的Y/R/D比率，第四个位置对于所有氨基酸具有相等比率，并且第五个位置G/P比率为75/25。参考氨基酸序列和变异序列由本文所述的过程生成的核酸及其变体来编码。
图10描绘了编码具有CDR1、CDR2和CDR3区的抗体的模板寡核酸，其中每个CDR区包含多个变异位点，每个单位点(由星号表示)包含单个位置和/或与不同于模板寡核酸序列的任何密码子序列可互换的多个连续位置的区段。
图11描绘了通过互换两个表达盒(例如启动子、开放阅读框和终止子)的区段以生成表达盒的变体文库而生成的示例性数目的变体。
图12呈现了说明如本文所公开的基因合成的示例性处理工作流程的步骤图。
图13图示了计算机系统的示例。
图14为图示计算机系统的架构的框图。
图15是说明网络的示图，该网络被配置用于并入多个计算机系统、多个蜂窝电话和个人数据助理，以及网络附加存储(NAS)。
图16是使用共享虚拟地址存储空间的多处理器计算机系统的框图。
图17描绘了通过凝胶电泳解析的PCR反应产物的BioAnalyzer绘图(plot)。
图18描绘了显示96组PCR产物的电泳图，每组PCR产物的序列与单个密码子位置处的野生型模板核酸不同，其中每组中的单个密码子位置位于野生型模板核酸序列中的不同位点。每组PCR产物包含19个变异寡核酸，每个变体在其单个密码子位置处编码不同的氨基酸。
具体实施方式
除非另有说明，否则本公开内容采用在本领域技术范围内的常规分子生物学技术。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
定义
贯穿本公开内容，各个实施方案以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述只是为了方便和简明，而不应被解释为对任何实施方案的范围的硬性限制。相应地，除非上下文另有明确规定，对范围的描述应被认为明确公开了所有可能的子范围以及该范围内精确到下限单位十分之一的单个数值。例如，诸如从1至6的范围描述应被认为已经明确公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及该范围内的单个值，例如，1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的宽度如何，这都是适用的。这些中间范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也被涵盖于本公开内容之中，但受制于所声称范围中的任何被明确排除的限值。除非上下文另有明确规定，当所声称范围包括限值中之一或全部两者时，排除了这些包括的限值中之一或全部二者的范围也被包括在本公开内容中。
本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制任何实施方案。除非上下文另有明确规定，否则如本文所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也预期包括复数形式。将进一步理解的是，术语“包括”和/或“包含”在本说明书中使用时指定所述特征、整体、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但不排除存在或添加一个或多个特征、整体、步骤、操作、元件、组件和/或其群体。如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何或所有组合。
除非特别说明或从上下文中明显看出，否则如本文所使用的，关于数字或数字范围的术语“约”应理解为所述数字及其数字+/-10％，或对于范围列出的值低于所列下限的10％且高于所列上限的10％。
变体文库合成
本文所述的方法提供了合成各自编码至少一个预定参考核酸序列的预定变体的寡核酸文库。在一些情况下，预定参考序列为编码蛋白质的核酸序列，并且变体文库包含编码至少单个密码子的变异的序列，使得由合成的核酸编码的后续蛋白质中的单个残基的多个不同变体通过标准翻译过程而生成。核酸序列中合成的特定变化可通过将核苷酸变化结合到重叠或平端寡核酸引物中来引入。或者，寡核酸群体可共同编码长核酸(例如，基因)及其变体。在这种方式中，寡核酸群体可进行杂交并且经历标准分子生物技术以形成长核酸(例如，基因)及其变体。当长核酸(例如，基因)及其变体在细胞中表达时，生成变异蛋白质文库。类似地，本文提供了合成编码RNA序列(例如，miRNA、shRNA和mRNA)或DNA序列(例如，增强子、启动子、UTR和终止子区)的变体文库的方法。本文还提供了使用本文所述的方法合成的文库中所选择出的变体的下游应用。下游应用包括鉴定具有增强的生物相关功能(例如，生物化学亲和力、酶活性、细胞活性变化)和用于治疗或预防疾病状态的变异核酸或蛋白质序列。
合成后进行PCR诱变
合成寡核酸变体文库的第一个过程是用于PCR诱变方法。在该工作流程中，合成多个寡核酸，其中每个寡核酸编码参考核酸序列的预定变体的预定序列。参考附图，图1A-1D中描绘了示例性工作流程，其中寡核酸在表面上生成。图1A描绘了具有121个座位的表面的单簇的放大视图。图1B中描绘的每个寡核酸均为可用于从参考核酸序列中扩增以产生变异长核酸文库(图1C)的引物。然后，变异长核酸文库任选地经历转录和/或翻译以生成变异RNA或蛋白质文库(图1D)。在该示例性说明中，描绘了具有基本上平面的表面的装置用于从头合成寡核酸(图1A)。在一些情况下，该装置包含一簇座位，其中每个座位为寡核酸延伸的位点。在一些情况下，单簇包含生成所期望的变异序列文库所需的所有寡核酸变体。在替代的方式中，板包含未分隔成簇的座位域。
本文所述的从头合成的寡核酸文库可包含多个寡核酸，每个寡核酸在第一位置(位置“x”)处有至少一个变异序列，并且每个变异寡核酸在第一轮PCR中用作引物以生成第一延伸产物。在该实例中，第一寡核酸220中的位置“x”编码变异密码子序列，即来自参考序列的19种可能变体中的一种。参见图2A。包含与第一寡核酸的序列重叠的序列的第二寡核酸225也在另一轮的PCR中用作引物以生成第二延伸产物。此外，外部引物215、230可用于扩增来自长核酸序列的片段。所得到的扩增产物是长核酸序列235、240的片段。参见图2B。然后使长核酸序列235、240的片段杂交，并经历延伸反应以形成长核酸245的变体。参见图2C。第一和第二延伸产物的重叠末端可用作第二轮PCR的引物，从而生成含有变体的第三延伸产物(图2D)。为了增加产量，长核酸的变体在包括DNA聚合酶、扩增试剂和外部引物215、230的反应中进行扩增。在一些情况下，第二寡核酸包含相邻但不包括变异位点的序列。在备选的方式中，生成具有与第二寡核酸相重叠的区域的第一寡核酸。在这种情况下，合成在单个密码子处具有最多19个变体的变异的第一寡核酸。第二寡核酸不包含变异序列。任选地，第一群体包含第一寡核酸变体和在不同密码子位点处编码变体的其它寡核酸。或者，第一寡核酸和第二寡核酸可被设计用于平端连接。
在备选方式中，图3A-3F描绘了诱变PCR方法。在这样的过程中，包含第一和第二链305、310的模板核酸分子300在含有第一引物315和第二引物320的PCR反应中得以扩增(图3A)。扩增反应包括作为核苷酸试剂的尿嘧啶。生成尿嘧啶标记的延伸产物325(图3B)，任选地进行纯化，并且用作使用第一寡核酸335和多个第二寡核酸330以生成第一延伸产物340和345的后续PCR反应的模板(图3C-3D)。在该过程中，多个第二寡核酸330包含编码变异序列的寡核酸(在图3C中表示为X、Y和Z)。尿嘧啶标记的模板核酸通过尿嘧啶特异性切除试剂，例如从New England Biolabs商业上可获得的USER digest进行消化。添加变体335和具有变体X、Y和Z的不同密码子330并且进行有限的PCR步骤以生成图3D。在将含尿嘧啶的模板消化后，延伸产物的重叠末端用于引发PCR反应，其中第一延伸产物340和345与第一外部引物350和第二外部引物355组合起到引物的作用，从而生成在变异位点处含有多个变体X、Y和Z的核酸分子360的文库(图3F)。
从头合成具有长核酸的变体和非变体部分的群体
在用于合成变体文库的第二个过程中，表面用于从头合成长核酸的多个片段，其中至少一个片段以多种形式合成，每种形式具有不同的变异序列。在这种方式中，从头合成装配变异长程核酸文库所需的全部片段。合成的片段可具有重叠的序列，使得在合成之后，片段文库经历杂交。杂交后，可进行延伸反应以填充任何互补空位。
或者，合成的片段可以用引物来扩增，随后经历平端连接或重叠杂交。在一些情况下，该装置包含一簇座位，其中每个座位是寡核酸延伸的位点。在一些情况下，单簇包含预定长核酸的所有寡核酸变体和其他片段序列以生成所期望的变异核酸序列文库。该簇可包含约50至500个座位。在一些方式中，簇包含500个以上的座位。
第一寡核酸群体中的每个单独的寡核酸可在簇的单独的、可单独寻址的座位上生成。一个寡核酸变体可以由多个可单独寻址的座位表示。第一寡核酸群体中的每个变体可以表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。在一些情况下，第一寡核酸群体中的每个变体在3个或更少的座位处表示。在一些情况下，第一寡核酸群体中的每个变体在两个座位处表示。在一些情况下，第一寡核酸群体中的每个变体仅在单个座位处表示。
本文提供了生成较低丰余性的核酸文库的方法。在一些情况下，在不需要超过1次合成变异寡核苷酸的情况下生成变异寡苷核酸以获得期望的变异寡核苷酸。在一些情况下，本公开内容提供了在不需要超过1、2、3、4、5次、6、7、8、9、10或更多次的情况下合成变异寡核苷酸以生成期望的变异寡核苷酸的方法。
在不需要在超过1个非连续位点处合成变异寡核苷酸的情况下生成变异寡核苷酸以获得期望的变异寡核苷酸。本公开内容提供了在不需要在超过1个位点、2个位点、3个位点、4个位点、5个位点、6个位点、7个位点、8个位点、9个位点或10个位点处合成变异寡核苷酸的情况下生成变异寡核苷酸以生成期望的变异寡核苷酸的方法。在一些情况下，在至多6、5、4、3、2或1个非连续位点处合成寡核苷酸。相同的寡核苷酸可以在表面上的1、2或3个非连续座位中合成。
在一些情况下，代表单个变异寡核苷酸的座位的量是下游加工(例如，扩增反应或细胞测定)所需的核酸材料的量的函数。在一些情况下，代表单个变异寡核苷酸的座位的量是单簇中可用座位的函数。
本文提供了用于生成寡核酸文库的方法，该寡核酸文库包含在参考核酸的多个位点处不同的变异寡核酸。在这种情况下，每个变体文库均在一簇座位内的可单独寻址的座位上生成。应当理解，由寡核酸文库表示的变异位点的数目将由簇中的可单独寻址的座位的数目和每个位点处所需变体的数目来确定。在一些情况下，每个簇包含约50至500个座位。在一些情况下，每个簇包含100至150个座位。
在示例性方式中，19个变体在变异位点处表示编码19种可能的变异氨基酸中的每一个的相应密码子。在另一个示例性情况下，61个变体在变异位点处表示编码19种可能的变异氨基酸中的每一个的相应三联体。在非限制性实例中，簇包含121个可单独寻址的座位。在该实例中，寡核酸群体包含每个单位点变体的6次重复(6次重复×1个变异位点×19个变体＝114个座位)、每个双位点变体的3次重复(3次重复×2个变异位点×19个变体＝114个座位)或每个三位点变体的2次重复(2次重复×3个变异位点×19个变体＝114个座位)。在一些情况下，寡核酸群体包含四个、五个、六个或六个以上变异位点处的变体。
密码子变异
本文所述的变异寡核酸文库可包含多个寡核酸，其中每个寡核酸编码与参考核酸序列相比的变异密码子序列。在一些情况下，第一寡核酸群体中的每个寡核酸在单个变异位点处含有变体。在一些情况下，第一寡核酸群体在单个变异位点处含有多个变体，使得第一寡核酸群体在相同变异位点处含有一个以上变体。第一寡核酸群体可包含在相同变异位点处共同编码多个密码子变体的寡核酸。第一寡核酸群体可包含在相同位置处共同编码高达19个或更多个密码子的寡核酸。第一寡核酸群体可包含在相同位置处共同编码高达60个变异三联体的寡核酸，或者第一寡核酸群体可包含在相同位置处共同编码高达61个不同密码子三联体的寡核酸。每个变体可编码在翻译过程中导致不同氨基酸的密码子。表1提供了变异位点可能的每个密码子(和代表性氨基酸)的列表。
表1.密码子和氨基酸列表
寡核酸群体可包含在多个位置处共同编码高达20个密码子变异的不同寡核酸。在这种情况下，群体中的每个寡核酸包含相同寡核酸中超过一个位置的密码子变异。在一些情况下，群体中的每个寡核酸包含单个寡核酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个密码子的密码子变异。在一些情况下，每个变异长核酸包含在单个长核酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个密码子的密码子变异。在一些情况下，变异寡核酸群体包含在单个寡核酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个密码子的密码子变异。在一些情况下，变异寡核酸群体包含在单个长核酸中的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个密码子的密码子变异。
本文提供了其中在含有多个可单独寻址的座位的第二簇上生成第二寡核酸群体的过程。第二寡核酸群体可包含对于每个密码子位置恒定(即，编码每个位置处的相同氨基酸)的多个第二寡核酸。第二寡核酸可与第一寡核酸的至少一部分重叠。在一些情况下，第二寡核酸不包含在第一寡核酸上所表示的变异位点。或者，第二寡核酸群体可包含多个针对一个或多个密码子位置变异的第二寡核酸。
本文提供了用于合成寡核酸文库的方法，其中生成包含多个密码子位置的变体的单个寡核酸群体。第一寡核酸群体可在含有多个可单独寻址的座位的第一簇上生成。在这种情况下，第一寡核酸群体包含不同密码子位置的变体。在一些情况下，不同位点是连续的(即，编码连续的氨基酸)。第一寡核苷酸群体可包含在相同或另外的变异位点处共同编码最多19个密码子变体的不同寡核酸。第一寡核苷酸群体可包括多个第一寡核酸，其在位置x处含有最多19个变体、在位置y处含有最多19个变体和在位置z处含有最多19个变体。在这样的方式中，每个变体编码不同的氨基酸，使得在每个不同的变异位点处编码最多19个氨基酸变体。在另外的情况下，第二寡核酸群体在含有多个可单独寻址的座位的第二簇上生成。第二寡核酸群体可包含对于每个密码子位置恒定的多个第二寡核酸(即，编码每个位置处的相同氨基酸)。第二寡核酸可与第一寡核酸的至少一部分重叠。第二种寡核酸可不包含第一寡核酸所表示的变异位点。
通过本文所述的过程生成的变异核酸文库提供了变异蛋白质文库的生成。在第一个示例性方式中，模板寡核酸编码序列，其在转录和翻译时产生具有多个密码子位置的参考氨基酸序列(图4A)，由单个圆圈表示。模板的寡核酸变体可使用本文所述的方法生成。在一些情况下，寡核酸中存在单个变体，导致单个氨基酸序列(图4B)。在一些情况下，寡核酸中存在多于一个变体，其中变体通过一个或多个密码子隔开，导致在变异残基之间具有间隔的蛋白质(图4C)。在一些情况下，寡核酸中存在多于一个变体，其中变体是顺序的并且彼此相邻或连续，导致间隔的残基变异段(图4D)。在一些情况下，寡核酸中存在两段变体，其中每段变体包含顺序的和相邻或连续的变体(图4E)。
本文提供了生成寡核酸变体文库的方法，其中每个变体包含单个位置密码子变体。在一个实例中，模板寡核酸具有多个密码子位置，其中示例性氨基酸残基由具有它们各自的单字母代码蛋白质密码子的圆圈表示，图5A。图5B描绘了由变异核酸文库编码的氨基酸变体文库，其中每个变体包含位于不同单个位点处的单个位置变体(由“X”表示)。第一个位置变体具有任意密码子来取代丙氨酸，第二个变体用由变异核酸文库编码的任意密码子来取代色氨酸，第三个变体用任意密码子来取代异亮氨酸，第四个变体用任意密码子来取代赖氨酸，第五个变体用任意密码子来取代精氨酸，第六个变体用任意密码子来取代谷氨酸，以及第七个变体用任意密码子来取代谷氨酰胺。当全部或小于全部密码子变体由变异核酸文库编码时，在蛋白质表达(即，DNA转录的标准细胞事件之后进行翻译和加工事件)之后生成相应的氨基酸序列变体群体。
在一些方式中，利用多个位点的单个位置变体来生成文库。如图6A所描绘的，提供了野生型模板。图6B描绘了具有单个位置密码子变体的两个位点的所得氨基酸序列，其中编码不同氨基酸的每个密码子变体由带不同图案的圆圈表示。
本文提供了生成具有一段多位点、单位置变体的文库的方法。每段寡核酸可具有1、2、3、4、5或更多个变体。每段寡核酸可具有至少1个变体。每段寡核酸可具有至少2个变体。每段寡核酸可具有至少3个变体。例如，一段5个寡核酸可具有1个变体。一段5个寡核酸可具有2个变体。一段5个寡核酸可具有3个变体。一段5个寡核酸可具有4个变体。例如，一段4个寡核酸可具有1个变体。一段4个寡核酸可具有2个变体。一段4个寡核酸可具有3个变体。一段4个寡核酸可具有4个变体。
在一些情况下，单个位置变体可全部编码相同的氨基酸，例如组氨酸。如图7A中所描绘的，提供了参考氨基酸序列。在这种方式中，一段寡核酸编码多个位点的单个位置变体，并且在表达时产生具有编码组氨酸的所有单个位置变体的氨基酸序列，图7B。在一些实施方案中，通过本文所述的方法合成的变体文库在所得到的氨基酸序列中未编码多于4个组氨酸残基。
在一些情况下，通过本文所述的方法生成的核酸变体文库提供了具有单独的变异段的氨基酸序列的表达。图8A中描绘了模板氨基酸序列。一段寡核酸在两个区段中可以仅具有1个变异密码子，并且当表达时产生图8B中所描绘的氨基酸序列。在图8B中由带不同图案的圆圈描绘变体以表明氨基酸的变异在单一区段中处于不同的位置。
本文提供了合成具有1、2、3或更多个密码子变体的寡核酸文库的方法和装置，其中选择性地控制每个位点的变体。单个位点变体的两种氨基酸之比可以为约1:100、1:50、1:10、1:5、1:3、1:2、1:1。单个位点变体的三种氨基酸之比可以为约1:1:100、1:1:50、1:1:20、1:1:10、1:1:5、1:1:3、1:1:2、1:1:1、1:10:10、1:5:5、1:3:3或1:2:2。图9A描绘了由野生型核酸序列编码的野生型参考氨基酸序列。图9B描绘了氨基酸变体文库，其中每个变体包含一段序列(由带图案的圆圈表示)，其中每个位置可以在所得到的变异蛋白质文库中具有一定比率的氨基酸。所得到的变异蛋白质文库由通过本文所述方法生成的变异核酸文库予以编码。在该示图中，5个位置是不同的：第一位置900具有50/50的K/R比；第二位置910具有50/25/25的V/L/S比，第三位置920具有50/25/25的Y/R/D比，第四位置930对于所有20种氨基酸为等比，以及第五位置940对于G/P比为75/25。本文所述的比仅是示例性的。
在一些情况下，生成合成变体文库，其编码最终翻译成蛋白质的氨基酸序列的核酸序列。示例性氨基酸序列包括编码小肽以及至少一部分大肽(例如抗体序列)的氨基酸序列。在一些情况下，合成的寡核酸各自编码一部分抗体序列中的变异密码子。变体合成的寡核酸部分的示例性抗体序列编码包括其抗原结合区或可变区或其片段。本文所述的寡核酸所编码的实例抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，双抗体，线性抗体，单链抗体分子和从抗体片段中形成的多特异性抗体的一部分。本文所述的寡核酸所编码的实例抗体区域包括但不限于Fc区、Fab区、Fab区的可变区、Fab区的恒定区、重链或轻链的可变区(VH或VL)或VH或VL的特异性互补决定区(CDR)的一部分。通过本文公开的方法生成的变体文库可导致本文所述的一个或多个抗体区域的变异。在一个示例性过程中，生成编码几个CDR的核酸的变体文库。参见图10。编码具有CDR1 1010、CDR2 1020和CDR3 1030区的抗体的模板核酸通过本文所述的方法进行修饰，其中每个CDR区包含多个变异位点。生成重链或轻链1015、1025和1035的单个可变域中的3个CDR中的每一个的变异。每个位点(由星号表示)可包含可与不同于模板寡核酸序列的任何密码子序列互换的单个位置、一段多个连续位置或两者。变体文库的多样性可通过使用本文提供的方法而显著增加，具有高达约1010多样性或更多。
表达盒中的变异
在一些情况下，生成合成变体文库，其编码表达构建体的一部分。表达构建体的示例性部分包括启动子、开放阅读框和终止区。在一些情况下，表达构建体编码一个、两个、三个或更多个表达盒。如图11所描绘的，可生成寡核苷酸文库，其编码在构成表达构建体盒部分的单个位点或多个位点分隔区域的密码子变异。为了生成两个构建体表达盒，合成编码第一启动子1110、第一开放阅读框1120、第一终止子1130、第二启动子1140、第二开放阅读框1150或第二终止子序列1160的变异序列的至少一部分的变异寡核酸。如前述实例中所述，经过几轮扩增后，生成1,024个表达构建体文库。图11提供了一个示例性方式。在一些情况下，另外的调节序列如非翻译调节区(UTR)或增强子区也包括在本文提到的表达盒中。表达盒可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个组分，其变异序列通过本文所述的方法生成。在一些情况下，表达构建体在多顺反子载体中包含多于一个基因。在一个实例中，将合成的DNA寡核酸插入到病毒载体(例如，慢病毒)中并随后包装用于转导至细胞中，或插入到非病毒载体中用于转移至细胞中，随后进行筛选和分析。
本文公开的用于插入核酸的表达载体包含真核(例如，细菌和真菌)和原核(例如，哺乳动物、植物和昆虫表达载体)。示例性表达载体包括但不限于哺乳动物表达载体：pSF-CMV-NEO-NH2-PPT-3XFLAG、pSF-CMV-NEO-COOH-3XFLAG、pSF-CMV-PURO-NH2-GST-TEV、pSF-OXB20-COOH-TEV-FLAG(R)-6His、pCEP4pDEST27、pSF-CMV-Ub-KrYFP、pSF-CMV-FMDV-daGFP、pEF1a-mCherry-N1载体、pEF1a-td西红柿载体、pSF-CMV-FMDV-Hygro、pSF-CMV-PGK-Puro、pMCP-tag(m)和pSF-CMV-PURO-NH2-CMYC；细菌表达载体：pSF-OXB20-BetaGal、pSF-OXB20-Fluc、pSF-OXB20和pSF-Tac；植物表达载体：pRI 101-AN DNA和pCambia2301；和酵母表达载体：pTYB21和pKLAC2以及昆虫载体：pAc5.1/V5-His A和pDEST8。示例性细胞包括但不限于原核细胞和真核细胞。示例性真核细胞包括但不限于动物、植物和真菌细胞。示例性动物细胞包括但不限于昆虫、鱼和哺乳动物细胞。示例性哺乳动物细胞包括小鼠、人和灵长类动物细胞。通过本文所述的方法合成的核酸可以通过本领域已知的各种方法(包括但不限于转染、转导和电穿孔)转移至细胞中。测试的示例性细胞功能包括但不限于细胞增殖、迁移/粘附、代谢和细胞信号传导活性的变化。
高度平行的核酸合成
本文提供了一种平台方法，其利用对从寡核酸合成到硅上纳米孔内的基因组装的端到端过程的小型化、平行化及垂直整合以创建革命性的合成平台。本文所述的装置(与96孔板具有相同的占地面积(footprint))提供了一种硅合成平台，与传统合成方法相比，该硅合成平台能够将通量提高高达1,000倍或更多，其中在单次高度平行化运行中产生高达约1,000,000个或更多个的寡核酸或10,000个或更多个的基因。
随着新一代测序的出现，高分辨率基因组数据已成为深入研究各种基因在正常生物学和疾病发病机理中的生物学作用的研究的重要因素。本研究的核心是分子生物学的中心法则和“连续信息的逐残基传送”的概念。将DNA中编码的基因组信息转录成信息，随后将其翻译成蛋白质，该蛋白质是在给定的生物学途径内的活性产物。
另一个激动人心的研究领域是关于着眼于高度特异性细胞靶标的治疗性分子的发现、研发和制备。高度多样化的DNA序列文库是用于靶向治疗的开发流程的核心。基因突变体用于在设计、构建和测试蛋白质工程循环中表达蛋白质，理想情况下使这些蛋白质工程循环选出在高度表达对其治疗靶标具有高亲和力的蛋白质的优化基因。作为实例，考虑受体的结合口袋(binding pocket)。同时测试结合口袋内所有残基的所有序列排列的能力将允许进行彻底的探究，从而增加成功的可能性。饱和诱变(其中研究人员试图在受体内的特定位点处生成所有可能的突变)代表了这种发展挑战的一种方法。虽然它成本高、耗费时间和劳动，但它能够将每个变体引入到每个位置。相反，组合诱变(其中几个选定的位置或短段的DNA可广泛地得以修饰)生成了具有偏向变现的不完整的变体库。
为了加速药物开发流程，具有可用于测试的在正确位置处以预期频率可获得的期望变体的文库(换言之，精确文库)使得能够降低成本以及筛选的周转时间。本文提供了用于合成寡核酸合成变体文库的方法，其提供了以预期的频率精确引入每种期望的变体。对于最终用户来说，这意味着不仅能够彻底对序列空间进行采样，而且能够以高效的方式查询这些假设，从而降低成本和筛选时间。全基因组编辑可以阐明重要的途径，可以检测每个变体和序列排列以获得最佳功能性的文库，并且可以使用数以千计的基因重建整个途径和基因组，以重新设计生物系统以发现药物。
在第一个实例中，药物本身可使用本文所述的方法进行优化。例如，为了改善抗体的特定功能，设计并合成编码部分抗体的变异寡核酸文库。然后可以通过本文所述的过程生成抗体的变异核酸文库(例如，PCR诱变之后插入载体中)。然后在生产细胞系中表达抗体并筛选增强的活性。实例筛选包括检查对抗原的结合亲和力、稳定性或效应器功能(例如，ADCC、补体或凋亡)的调节。优化抗体的示例性区域包括但不限于Fc区、Fab区、Fab区的可变区、Fab区的恒定区、重链或轻链的可变域(VH或VL)和VH或VL的特异性互补决定区(CDR)。
或者，要优化的分子是用作活化剂或竞争性抑制剂的受体结合表位。在合成核酸的变体文库之后，可以将核酸的变体文库插入到载体序列中，随后在细胞中表达。受体抗原可以在细胞(例如，昆虫、哺乳动物或细菌)中表达，随后进行纯化，或者其可以在细胞(例如，哺乳动物)中表达以检测来自序列变异的功能性结果。功能性结果包括但不限于蛋白质表达、结合亲和力和稳定性的变化。细胞功能性结果包括但不限于繁殖、生长、粘附、死亡、迁移、能量产生、氧利用、代谢活性、细胞信号传导、老化、对自由基损伤的应答或其任意组合的变化。在一些实施方案中，用于优化所选择的蛋白质的类型为酶、转运蛋白、G蛋白偶联受体、电压门控离子通道、转录因子、聚合酶、衔接蛋白(没有酶活性的蛋白质，用于将两种其他蛋白质结合在一起)和细胞骨架蛋白。酶的示例性类型包括但不限于信号传导酶(例如蛋白激酶、蛋白磷酸酶、磷酸二酯酶、组蛋白去乙酰化酶和GTP酶)。
本文提供了包含涉及整个途径或整个基因组的分子的变体的变异核酸文库。示例性的途径包括但不限于代谢、细胞死亡、细胞周期进展、免疫细胞活化、炎症应答、血管生成、淋巴生成、低氧和氧化应激应答或细胞粘附/迁移途径。细胞死亡途径中的示例性蛋白质包括但不限于Fas、Cadd、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、IAP、TNFR1、TNF、TNFR2、NF-kB、TRAFs、ASK、BAD和Akt。细胞周期途径中的示例性蛋白质包括但不限于NFkB、E2F、Rb、p53、p21、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E和cdc 25。细胞迁移途径中的示例性蛋白质包括但不限于Ras、Raf、PLC、丝切蛋白、MEK、ERK、MLP、LIMK、ROCK、RhoA、Src、Rac、肌球蛋白II、ARP2/3、MAPK、PIP2、整联蛋白、踝蛋白、kindlin、migfilin和细丝蛋白。
通过本文所述的方法合成的核酸文库可以在各种细胞类型中表达。示例性的细胞类型包括原核生物(例如，细菌和真菌)和真核生物(例如，植物和动物)。示例性的动物包括但不限于小鼠、兔子、灵长类动物、鱼和昆虫。示例性的植物包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。示例性的植物还包括但不限于微藻类，海带，蓝藻细菌和绿色、棕色和红色藻类，小麦，烟草和玉米，大米，棉花，蔬菜和水果。
通过本文所述的方法合成的核酸文库可以在与疾病状态相关的各种细胞中表达。与疾病状态相关的细胞包括细胞系、组织样品、来自受试者的原代细胞、从受试者扩增的培养细胞或模型系统中的细胞。示例性的模型系统包括但不限于疾病状态的植物和动物模型。
通过本文所述的方法合成的核酸文库可以在各种细胞类型中表达以评估细胞活性的变化。示例性的细胞活性包括但不限于增殖、周期进展、细胞死亡、粘附、迁移、繁殖、细胞信号传导、能量产生、氧利用、代谢活性和老化、对自由基损伤的应答或其任意组合。
为了鉴定与预防、减少或治疗疾病状态相关的变异分子，本文所述的变异核酸文库在与疾病状态相关的细胞中表达，或者在其中可以诱导疾病状态的细胞中表达。在一些情况下，药剂用于在细胞中诱导疾病状态。用于疾病状态诱导的示例性工具包括但不限于Cre/Lox重组系统、LPS炎症诱导和链脲菌素诱导低血糖。与疾病状态相关的细胞可以是来自模型系统的细胞或培养细胞以及来自患有特定疾病状况的受试者的细胞。示例性疾病状况包括细菌、真菌、病毒、自身免疫性或增殖性病症(例如，癌症)。在一些情况下，变异核酸文库在来自受试者的模型系统、细胞系或原代细胞中表达，并筛选至少一种细胞活性的变化。示例性的细胞活性包括但不限于增殖、周期进展、细胞死亡、粘附、迁移、繁殖、细胞信号传导、能量产生、氧利用、代谢活性和老化、对自由基损伤的应答或其任意组合。
基底
本文提供了包含多个簇的基底，其中每个簇包含多个支持寡核酸附着和合成的座位。如本文所用的术语“座位”是指结构上的非连续区域，其提供了对从表面延伸的单个预定序列进行编码的寡核苷酸的支持。在一些情况下，座位在二维表面(例如，基本上平面的表面)上。在一些情况下，座位是指表面上的非连续的凸起或凹陷的位点，例如孔、微孔、通道或柱杆(post)。在一些情况下，座位的表面包含主动功能化以附接至少一个用于寡核酸合成的核苷酸，或者优选地，用于合成寡核酸群体的相同核苷酸群体的材料。在一些情况下，寡核酸是指编码相同核酸序列的寡核酸群体。在一些情况下，装置的表面包括基底的一个或多个表面。
使用所提供的系统和方法在文库内合成的寡核酸的平均错误率常常可以小于1/1000、小于1/1250、小于1/1500、小于1/2000、小于1/3000或更低。在一些情况下，使用所提供的系统和方法在文库内合成的寡核酸的平均错误率小于1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1250、1/1300、1/1400、1/1500、1/1600、1/1700、1/1800、1/1900、1/2000、1/3000或更低。在一些情况下，使用所提供的系统和方法在文库内合成的寡核酸的平均错误率小于1/1000。
在一些情况下，相比于预定序列，使用所提供的系统和方法在文库内合成的寡核酸的总错误率小于1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1250、1/1300、1/1400、1/1500、1/1600、1/1700、1/1800、1/1900、1/2000、1/3000或更低。在一些情况下，使用所提供的系统和方法在文库内合成的寡核酸的总错误率小于1/500、1/600、1/700、1/800、1/900或1/1000。在一些情况下，使用所提供的系统和方法在文库内合成的寡核酸的总错误率小于1/1000。
在一些情况下，错误校正酶可用于使用所提供的系统和方法在文库内合成的寡核酸。在一些情况下，相比于预定序列，具有错误校正的寡核酸的总错误率可小于1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1100、1/1200、1/1300、1/1400、1/1500、1/1600、1/1700、1/1800、1/1900、1/2000、1/3000或更低。在一些情况下，使用所提供的系统和方法在文库内合成的具有错误校正的寡核酸的总错误率可小于1/500、1/600、1/700、1/800、1/900或1/1000。在一些情况下，使用所提供的系统和方法在文库内合成的具有错误校正的寡核酸的总错误率可小于1/1000。
错误率可限制基因合成产生基因变体文库的价值。错误率为1/300时，在1500个碱基对的基因中约0.7％的克隆将是正确的。由于大多数来自寡核苷酸合成的错误导致移码突变，所以在这样的文库中超过99％的克隆将不会产生全长蛋白质。将错误率降低75％将使正确的克隆的比例提高40倍。本公开内容的方法和组合物使得能够以比通常观察到的基因合成方法更低的错误率快速从头合成大寡核苷酸和基因文库，该低的错误率是由于合成质量的改善和使得能够以大规模平行且具时效性的方式进行的错误校正方法的适用性两者。因此，可以以在整个文库中或超过80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多的文库中低于1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1250、1/1500、1/2000、1/2500、1/3000、1/4000、1/5000、1/6000、1/7000、1/8000、1/9000、1/10000、1/12000、1/15000、1/20000、1/25000、1/30000、1/40000、1/50000、1/60000、1/70000、1/80000、1/90000、1/100000、1/125000、1/150000、1/200000、1/300000、1/400000、1/500000、1/600000、1/700000、1/800000、1/900000、1/1000000或更低的碱基插入、缺失、置换或总错误率来合成文库。本公开内容的方法和组合物还涉及具有低错误率的大合成寡核苷酸和基因文库，该错误率与该文库的至少一个子集中至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多的寡核苷酸或基因相关，涉及与预定/预选序列相比的无错误序列。在一些情况下，文库内的独立体积中至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多的寡核苷酸或基因具有相同的序列。在一些情况下，与超过95％、96％、97％.98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％95％、96％、97％.98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高的相似性或同一性相关的任意寡核苷酸或基因中的至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多具有相同序列。在一些情况下，优化与寡核苷酸或基因上的特定座位有关的错误率。因此，一个或多个作为大文库的部分的寡核苷酸或基因的给定座位或多个选定座位可各自具有低于1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/1250、1/1500、1/2000、1/2500、1/3000、1/4000、1/5000、1/6000、1/7000、1/8000、1/9000、1/10000、1/12000、1/15000、1/20000、1/25000、1/30000、1/40000、1/50000、1/60000、1/70000、1/80000、1/90000、1/100000、1/125000、1/150000、1/200000、1/300000、1/400000、1/500000、1/600000、1/700000、1/800000、1/900000、1/1000000或更低的错误率。在各种情况下，这类错误优化的座位可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、30000、50000、75000、100000、500000、1000000、2000000、3000000个或更多个座位。错误优化的座位可分布到至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、30000、75000、100000、500000、1000000、2000000、3000000个或更多个寡核苷酸或基因。
可在使用或不使用错误校正的情形下获得错误率。错误率可在整个文库，或在文库的超过80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％、99.99％或更多中获得。
本文提供了可包含表面的结构，该表面支持在共同支持物上的可寻址位置处合成具有不同预定序列的多种寡核酸。在一些情况下，装置提供支持合成超过2,000、5,000、10,000、20,000、30,000、50,000、75,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000、10,000,000个或更多个不同的寡核酸。在一些情况下，该装置提供支持合成超过2,000、5,000、10,000、20,000、30,000、50,000、75,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000、10,000,000个或更多个编码不同序列的寡核酸。在一些情况下，至少一部分寡核酸具有相同的序列或被配置为用相同的序列合成。
本文提供了用于制造和生长长度约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000个碱基的寡核酸的方法和装置。在一些情况下，所形成的寡核酸的长度为约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或225个碱基。寡核酸的长度可以为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个碱基。寡核酸可以是长度为10至225个碱基、长度为12至100个碱基、长度为20至150个碱基、长度为20至130个碱基或长度为30至100个碱基。
在一些情况下，寡核酸在基底的不同座位上合成，其中每个座位支持合成寡核酸群体。在一些情况下，每个座位支持合成具有与在另一座位上生长的寡核酸群体不同序列的寡核酸群体。在一些情况下，装置的座位位于多个簇内。在一些情况下，装置包含至少10、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、20000、30000、40000、50000个或更多个簇。在一些情况下，装置包含超过2,000、5,000、10,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,100,000、1,200,000、1,300,000、1,400,000、1,500,000、1,600,000、1,700,000、1,800,000、1,900,000、2,000,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000或10,000,000个或更多个不同的座位。在一些情况下，装置包含约10,000个不同的座位。单簇内的座位的量在不同情况下是不同的。在一些情况下，每个簇包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、130、150、200、300、400、500个或更多个座位。在一些情况下，每个簇包含约50-500个座位。在一些情况下，每个簇包含约100-200个座位。在一些情况下，每个簇包含约100-150个座位。在一些情况下，每个簇包含约109、121、130或137个座位。在一些情况下，每个簇包含约19、20、61、64个或更多个座位。
装置上合成的不同寡核酸的数目可取决于基底中可用的不同座位的数目。在一些情况下，装置的簇内的座位密度为至少或约1个座位/mm2、10个座位/mm2、25个座位/mm2、50个座位/mm2、65个座位/mm2、75个座位/mm2、100个座位/mm2、130个座位/mm2、150个座位/mm2、175个座位/mm2、200个座位/mm2、300个座位/mm2、400个座位/mm2、500个座位/mm2、1,000个座位/mm2或更大。在一些情况下，装置包含约10个座位/mm2至约500个座位/mm2、约25个座位/mm2至约400个座位/mm2、约50个座位/mm2至约500个座位/mm2、约100个座位/mm2至约500个座位/mm2、约150个座位/mm2至约500个座位/mm2、约10个座位/mm2至约250个座位/mm2、约50个座位/mm2至约250个座位/mm2、约10个座位/mm2至约200个座位/mm2或约50个座位/mm2至约200个座位/mm2。在一些情况下，簇内两个相邻座位中心的距离为约10um至约500um、约10um至约200um或约10um至约100um。在一些情况下，距相邻座位的两个中心的距离为大于约10um、20um、30um、40um、50um、60um、70um、80um、90um或100um。在一些情况下，距两个相邻座位的中心的距离为小于约200um、150um、100um、80um、70um、60um、50um、40um、30um、20um或10um。在一些情况下，每个座位具有约0.5um、1um、2um、3um、4um、5um、6um、7um、8um、9um、10um、20um、30um、40um、50um、60um、70um、80um、90um或100um的宽度。在一些情况下，每个座位具有约0.5um至100um、约0.5um至50um、约10um至75um或约0.5um至50um的宽度。
在一些情况下，装置内的簇密度为至少或约1个簇/100mm2、1簇/10mm2、1个簇/5mm2、1个簇/4mm2、1个簇/3mm2、1个簇/2mm2、1个簇/1mm2、2个簇/1mm2、3个簇/1mm2、4个簇/1mm2、5个簇/1mm2、10个簇/1mm2、50个簇/1mm2或更大。在一些情况下，装置包含约1个簇/10mm2至约10个簇/1mm2。在一些情况下，距两个相邻簇的中心的距离为小于约50um、100um、200um、500um、1000um或2000um或5000um。在一些情况下，距两个相邻簇的中心的距离为约50um至约100um、约50um至约200um、约50um至约300um、约50um至约500um和约100um至约2000um。在一些情况下，距两个相邻簇的中心的距离为约0.05mm至约50mm、约0.05mm至约10mm、约0.05mm至约5mm、约0.05mm至约4mm、约0.05mm至约3mm、约0.05mm至约2mm、约0.1mmand 10mm、约0.2mm and 10mm、约0.3mm至约10mm、约0.4mm至约10mm、约0.5mm and 10mm、约0.5mm至约5mm或约0.5mm至约2mm。在一些情况下，每个簇沿着一个维度具有约0.5至2mm、约0.5至1mm或约1至2mm的直径或宽度。在一些情况下，每个簇沿着一个维度具有约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mm的直径或宽度。在一些情况下，每个簇沿着一个维度具有约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.15、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mm的内径或宽度。
装置可以为大约标准96孔板的尺寸，例如约100至200mm乘约50至150mm。在一些情况下，装置具有小于或等于约1000mm、500mm、450mm、400mm、300mm、250nm、200mm、150mm、100mm或50mm的直径。在一些情况下，装置的直径为约25mm至1000mm、约25mm至约800mm、约25mm至约600mm、约25mm至约500mm、约25mm至约400mm、约25mm至约300mm或约25mm至约200。装置尺寸的非限制性实例包括约300mm、200mm、150mm、130mm、100mm、76mm、51mm和25mm。在一些情况下，装置具有至少约100mm2、200mm2、500mm2、1,000mm2、2,000mm2、5,000mm2、10,000mm2、12,000mm2、15,000mm2、20,000mm2、30,000mm2、40,000mm2、50,000mm2或更大的平面表面积。在一些情况下，装置的厚度为约50mm至约2000mm、约50mm至约1000mm、约100mm至约1000mm、约200mm至约1000mm或约250mm至约1000mm。装置厚度的非限制性实例包括275mm、375mm、525mm、625mm、675mm、725mm、775mm和925mm。在一些情况下，装置的厚度随直径而变化，并取决于基底的组成。例如，包含硅之外的材料的装置具有与相同直径的硅装置不同的厚度。装置厚度可以由所用材料的机械强度来确定，并且该装置必须足够厚以在操作期间支撑其自身重量而不会破裂。在一些情况下，结构包含本文所述的多个装置。
表面材料
本文提供的基底、装置和反应器由适用于本文所述的方法和组合物的各种材料制成。在某些情况下，装置材料被制造成展现出低水平的核苷酸结合。在一些情况下，修饰装置材料以生成展现出高水平核苷酸结合的不同表面。在一些情况下，装置材料对可见光和/或紫外光是透明的。在一些情况下，装置材料具有足够的导电性，例如能够在整个或部分基底上形成均匀的电场。在一些情况下，将导电材料连接到电接地。在一些情况下，该装置是导热的或隔热的。在一些情况下，该材料是耐化学品和耐热的，以支持化学或生化反应，例如寡核酸合成反应过程。在一些情况下，装置包含柔性材料。柔性材料包括但不限于改性尼龙、未改性尼龙、硝化纤维素、聚丙烯等。在一些情况下，装置包含刚性材料。刚性材料包括但不限于玻璃、熔融石英、硅、二氧化硅、氮化硅、塑料(例如聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯，以及其混合物等)和金属(例如，金、铂等)。在一些情况下，装置由包含硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃或其任意组合的材料制成。在一些情况下，装置使用本文所列材料或本领域中已知的任何其他合适材料的组合制成。
表面结构
本文提供了包含凸起和/或凹陷特征的装置。具有这种特征的一个益处是增加表面积以支持寡核酸合成。在一些情况下，具有凸起和/或凹陷特征的装置被称为三维基底。在一些情况下，三维装置包含一个或多个通道。在一些情况下，一个或多个座位包含通道。在一些情况下，通道可通过沉积装置如寡核酸合成仪进行试剂沉积。在一些情况下，试剂和/或流体收集在与一个或多个通道流体连通的较大的孔中。例如，装置包含对应于具有簇的多个座位的多个通道，并且多个通道与该簇的一个孔流体连通。在一些方法中，寡核酸文库在簇的多个座位中合成。
在一些情况下，所述结构被配置为允许用于表面上寡核酸合成的受控制的流动和质量传递路径。在一些情况下，装置的构造允许针对在寡核酸合成过程中受控制的且均匀分布的质量传递路径、化学暴露次数和/或洗涤功效。在一些情况下，装置的构造允许增加扫描效率，诸如通过提供足以用于生长的寡核酸的体积，使得由生长的寡核酸所排除的体积占可用于或适合于生长寡核酸的初始可用体积的不超过50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少。在一些情况下，三维结构允许流体的受管控的流动，从而允许化学暴露的快速交换。
本文提供了合成1fM、5fM、10fM、25fM、50fM、75fM、100fM、200fM、300fM、400fM、500fM、600fM、700fM、800fM、900fM、1pM、5pM、10pM、25pM、50pM、75pM、100pM、200pM、300pM、400pM、500pM、600pM、700pM、800pM、900pM或更多的量的DNA的方法。在一些情况下，寡核苷酸可跨越长度约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的基因。基因可以变化最高约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％。
不同的寡核酸可以共同编码至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％基因的序列。在一些情况下，寡核酸可以编码50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多基因的序列。在一些情况下，寡核酸可以编码80％、85％、90％、95％或更多基因的序列。
在一些情况下，通过物理结构实现隔离。在一些情况下，通过表面的差异功能化以生成用于寡核酸合成的活化和钝化区域来实现隔离。差异功能化还可在装置表面上呈现交替疏水性，从而造成可引起沉积的试剂结珠或润湿的水接触角效应。采用较大的结构可减少飞溅和邻近斑点的试剂对不同的寡核酸合成位置的交叉污染。在一些情况下，使用装置如寡核酸合成仪将试剂沉积到不同的寡核酸合成位置。具有三维特征的基底以允许以低错误率(例如，小于1:500、1:1000、1:1500、1:2,000；1:3,000；1:5,000或1:10,000)合成大量寡核酸(例如，超过约10,000)的方式配置。在一些情况下，装置包含密度为约或大于约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400或500个特征/mm2的特征。
装置的孔可具有与基底的另一个孔相同或不同的宽度、高度和/或体积。装置的通道可具有与基底的另一个通道相同或不同的宽度、高度和/或体积。在一些情况下，簇的宽度为约0.05mm至约50mm、约0.05mm至约10mm、约0.05mm至约5mm、约0.05mm至约4mm、约0.05mm至约3mm、约0.05mm至约2mm、约0.05mm至约1mm、约0.05mm至约0.5mm、约0.05mm至约0.1mm、约0.1mm and 10mm、约0.2mm and 10mm、约0.3mm至约10mm、约0.4mm至约10mm、约0.5mm and 10mm、约0.5mm至约5mm或约0.5mm至约2mm。在一些情况下，包含簇的孔的宽度为约0.05mm至约50mm、约0.05mm至约10mm、约0.05mm至约5mm、约0.05mm至约4mm、约0.05mm至约3mm、约0.05mm至约2mm、约0.05mm至约1mm、约0.05mm至约0.5mm、约0.05mm至约0.1mm、约0.1mm and 10mm、约0.2mm and 10mm、约0.3mm至约10mm、约0.4mm至约10mm、约0.5mm and10mm、约0.5mm至约5mm或约0.5mm至约2mm。在一些情况下，簇的宽度为小于或约5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm或0.05mm。在一些情况下，簇的宽度为约1.0至1.3mm。在一些情况下，簇的宽度为约1.150mm。在一些情况下，孔的宽度为小于或约5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm或0.05mm。在一些情况下，孔的宽度为约1.0至1.3mm。在一些情况下，孔的宽度为约1.150mm。在一些情况下，簇的宽度为约0.08mm。在一些情况下，孔的宽度为约0.08mm。簇的宽度可以是指两维或三维基底内的簇。
在一些情况下，孔的高度为约20um至约1000um、约50um至约1000um、约100um至约1000um、约200um至约1000um、约300um至约1000um、约400um至约1000um或约500um至约1000um。在一些情况下，孔的高度为小于约1000um、小于约900um、小于约800um、小于约700um或小于约600um。
在一些情况下，装置包含对应于簇内多个座位的多个通道，其中通道的高度或深度为约5um至约500um、约5um至约400um、约5um至约300um、约5um至约200um、约5um至约100um、约5um至约50um或约10um至约50um。在一些情况下，通道的高度为小于100um、小于80um、小于60um、小于40um或小于20um。
在一些情况下，通道、座位(例如，在基本上平面的基底中)或通道和座位二者(例如，在其中座位对应于通道的三维装置中)的直径为约1um至约1000um、约1um至约500um、约1um至约200um、约1um至约100um、约5um至约100um或约10um至约100um，例如约90um、80um、70um、60um、50um、40um、30um、20um or 10um。在一些情况下，通道、座位或通道和座位二者的直径为小于约100um、90um、80um、70um、60um、50um、40um、30um、20um或10um。在一些情况下，距两个相邻通道、座位或通道和座位二者的中心的距离为约1um至约500um、约1um至约200um、约1um至约100um、约5um至约200um、约5um至约100um、约5um至约50um或约5um至约30um，例如约20um。
表面修饰
在各种情况下，采用表面修饰通过加成工艺或减成工艺进行对表面的化学和/或物理改变，以改变装置表面或装置表面的选定位点或区域的一种或多种化学和/或物理性质。例如，表面修饰包括但不限于：(1)改变表面的润湿性质；(2)对表面进行功能化，即，提供、修改或取代表面官能团；(3)对表面进行除功能化，即，移除表面官能团；(4)以其他方式例如通过刻蚀来改变表面的化学组成；(5)增大或减小表面粗糙度；(6)在表面上提供涂层，例如，展现出与表面的润湿性质不同的润湿性质的涂层；和/或(7)在表面上沉积微粒。
在一些情况下，在表面顶部添加化学层(被称为粘合促进剂)有利于基底表面上的座位的结构化图案。用于提高粘合力的示例性表面包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅和氮化硅。在一些情况下，粘合促进剂是具有高表面能的化学品。在一些情况下，第二化学层在基底的表面上沉积。在一些情况下，第二化学层具有低表面能。在一些情况下，涂覆在表面上的化学层的表面能支持液滴在表面上的定位。取决于所选择的图案布置，在座位处的流体接触的座位和/或区域的接近度是可变的。
在一些情况下，核酸或其他部分(例如用于寡核酸合成)所沉积到的装置表面或解析座位是光滑的或基本上平面的(例如，二维的)，或者具有不规则形态，诸如凸起或凹陷特征(例如，三维特征)。在一些情况下，用一个或多个不同化合物层来修饰装置表面。感兴趣的此类修饰层包括但不限于无机层和有机层，诸如金属、金属氧化物，聚合物、有机小分子等。非限制性聚合物层包括肽、蛋白质、核酸或其模拟物(例如，肽核酸等)、多糖、磷脂、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯胺、聚芳硫醚、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯，以及本文所述的或除此之外本领域中已知的任何其他合适的化合物。在一些情况下，聚合物为杂聚物。在一些情况下，聚合物为均聚物。在一些情况下，聚合物包含功能部分或为缀合的。
在一些情况下，装置的解析座位使用增大和/或减小表面能的一个或多个部分进行功能化。在一些情况下，所述部分是化学惰性的。在一些情况下，所述部分被配置为支持期望的化学反应，例如在寡核酸合成反应中的一个或多个过程。表面的表面能或疏水性是决定核苷酸附着到表面上的亲和力的因素。在一些情况下，用于装置功能化的方法可包括：(a)提供具有包含二氧化硅的表面的装置；和(b)使用本文所述的或其它方式本领域中已知的合适的硅烷化剂(例如，有机官能烷氧基硅烷分子)来使所述表面得以硅烷化。
在一些情况下，有机官能烷氧基硅烷分子包括二甲基氯十八烷基硅烷、甲基二氯十八烷基硅烷、三氯十八烷基硅烷、三甲基十八烷基硅烷、三乙基十八烷基硅烷或其任意组合。在一些情况下，装置表面包含用聚乙烯/聚丙烯功能化(通过γ辐射或铬酸氧化并还原成羟烷基表面而功能化)、高度交联的聚苯乙烯-二乙烯基苯(通过氯甲基化衍生化，并胺化成苄胺功能表面)、尼龙(末端氨基己基基团是直接反应性的)或以还原的聚四氟乙烯来刻蚀。在通过引用以其全文并入本文的美国专利号5474796中描述了其它方法和功能化试剂。
在一些情况下，装置表面通常经由存在于装置表面上的反应性亲水部分，在有效地将硅烷偶联至装置表面的反应条件下，使装置表面与含有硅烷混合物的衍生化组合物相接触来进行功能化。硅烷化一般可用于通过自组装而使用有机官能烷氧基硅烷分子来覆盖表面。
还可使用本领域中当前已知的多种硅氧烷功能化试剂，例如用于降低或增大表面能。有机官能烷氧基硅烷可根据其有机官能来分类。
本文提供了可包含能够与核苷偶联的试剂的图案化的装置。在一些情况下，装置可以涂覆有活性剂。在一些情况下，装置可以涂覆有钝化剂。用于包含在本文所述的涂层材料中的示例性活性剂包括但不限于N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、3-缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPS)、3-碘-丙基三甲氧基硅烷、丁基-醛-三甲氧基硅烷、二聚仲氨烷基硅氧烷、(3-氨丙基)-二乙氧基-甲基硅烷、(3-氨丙基)二甲基-乙氧基硅烷和(3-氨丙基)-三甲氧基硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)-二甲基-乙氧基硅烷、缩水甘油基氧基-三甲氧基硅烷、(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷，3-4环氧环己基-乙基三甲氧基硅烷以及(3-巯基丙基)-甲基-二甲氧基硅烷、烯丙基三氯氯硅烷、7-辛-1-烯基三氯氯硅烷或双(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)胺。
包含在本文所述的涂层材料中的示例性钝化剂包括但不限于全氟辛基三氯硅烷；十三氟-1,1,2,2-四氢辛基三氯硅烷；1H,1H,2H,2H-氟辛基三乙氧基硅烷(FOS)；三氯(1H,1H,2H,2H–全氟辛基)硅烷；叔丁基-[5-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)吲哚-1-基]-二甲基-硅烷；CYTOPTM；FluorinertTM；全氟辛基三氯硅烷(PFOTCS)；全氟辛基二甲基氯硅烷(PFODCS)；全氟癸基三乙氧基硅烷(PFDTES)；五氟苯基丙基-二甲基丙基氯-硅烷(PFPTES)；全氟辛基三乙氧基硅烷；全氟辛基三甲氧基硅烷；辛基氯硅烷；二甲基氯十八烷基硅烷；甲基二氯十八烷基硅烷；三氯十八烷基硅烷；三甲基十八烷基硅烷；三乙基十八烷基硅烷；或十八烷基三氯硅烷。
在一些情况下，功能化剂包含烃硅烷如十八烷基三氯硅烷。在一些情况下，功能化剂包括11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、缩水甘油基氧基丙基/三甲氧基硅烷和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺。
寡核苷酸合成
用于寡核酸合成的本公开内容的方法可包括涉及亚磷酰胺化学法的过程。在一些情况下，寡核酸合成包括将碱基与亚磷酰胺偶联。寡核酸合成可包括通过在偶联条件下沉积亚磷酰胺来偶联碱基，其中相同的碱基任选地与亚磷酰胺多次沉积，即双偶联。寡核酸合成可包括未反应位点的加帽。在一些情况下，加帽是任选的。寡核酸合成还可包括氧化或氧化步骤或多个氧化步骤。寡核酸合成可包括解封闭、脱三苯甲基化和硫化。在一些情况下，寡核酸合成包括氧化或硫化。在一些情况下，在寡核酸合成反应期间的一个步骤或每个步骤之间，例如使用四唑或乙腈来洗涤该装置。亚磷酰胺合成方法中任何一步的时间范围可小于约2min、1min、50sec、40sec、30sec、20sec和10sec。
使用亚磷酰胺方法的寡核酸合成可包括将亚磷酰胺构建区(例如，核苷亚磷酰胺)随后添加至生长的寡核酸链以形成亚磷酸三酯键。亚磷酰胺寡核酸合成沿3’至5’方向进行。亚磷酰胺寡核酸合成允许在每个合成循环中将一个核苷酸控制添加至生长的核酸链。在一些情况下，每个合成循环包含偶联步骤。亚磷酰胺偶联包括在活化的核苷亚磷酰胺和结合至基底的核苷之间(例如通过连接体)形成亚磷酸三酯键。在一些情况下，将核苷亚磷酰胺提供给活化的装置。在一些情况下，将核苷亚磷酰胺提供给具有活化剂的装置。在一些情况下，核苷亚磷酰胺以相对于基底结合核苷1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100倍或更多倍过量来提供给装置。在一些情况下，添加核苷亚磷酰胺在无水环境中(例如，在无水乙腈中)进行。添加核苷亚磷酰胺后，任选地洗涤该装置。在一些情况下，偶联步骤重复一次或多次额外的时间，任选地在向基底添加核苷亚磷酰胺之间进行洗涤步骤。在一些情况下，本文使用的寡核酸合成方法包括1、2、3或更多个连续的偶联步骤。在许多情况下，在偶联之前与装置结合的核苷通过去除保护基团来脱保护，其中保护基团起防止聚合的作用。常见的保护基团为4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)。
偶联后，亚磷酰胺寡核酸合成方法任选地包含加帽步骤。在加帽步骤中，用加帽试剂处理生长的寡核酸。加帽步骤可用于在进一步链延伸偶联后封闭未反应的基底结合的5’-OH基团，从而防止形成具有内部碱基缺失的寡核酸。此外，用1H-四唑的活化的亚磷酰胺可能在很小的程度上与鸟苷的O6位置反应。不受理论的束缚，在用I2/水氧化后，该副产物(可能是经由O6-N7迁移)可经历脱嘌呤。无嘌呤位点可终止在寡核苷酸的最终脱保护的过程中被切割，从而降低全长产物的产率。O6修饰可通过在用I2/水氧化之前用加帽试剂处理而去除。在一些情况下，与没有加帽的合成相比，在寡核酸合成过程中包含加帽步骤会降低错误率。作为实例，加帽步骤包括用乙酸酐和1-甲基咪唑的混合物处理基底结合的寡核酸。在加帽步骤之后，可任选地洗涤装置。
在一些情况下，在添加核苷亚磷酰胺之后，并任选地在加帽和一个或多个洗涤步骤之后，装置结合生长的核酸得以氧化。氧化步骤包括将亚磷酸三酯氧化成四配位磷酸三酯(一种天然存在的磷酸二酯核苷间键的受保护的前体)。在一些情况下，生长的寡核酸的氧化通过任选地在弱碱(例如，吡啶、二甲基吡啶、三甲吡啶)存在下用碘和水处理来实现。氧化可在无水条件下采用例如叔丁基过氧化氢或(1S)-(+)-(10-樟脑磺酰基)-氧杂吖丙啶(CSO)进行。在一些方法中，在氧化之后进行加帽步骤。第二个加帽步骤允许装置干燥，因为可能持续存在的来自氧化的残余水可以抑制随后的偶联。氧化后，可任选地洗涤装置和生长的寡核酸。在一些情况下，氧化步骤用硫化步骤来取代，以获得寡核苷酸硫代磷酸酯，其中任何加帽步骤可在硫化之后进行。许多试剂能够进行有效地硫转移，包括但不限于3-(二甲基氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮、DDTT、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(也被称为Beaucage试剂)以及N,N,N'N'-四乙基秋兰姆二硫化物(TETD)。
为了使核苷掺入的后续循环通过偶联而发生，移除装置结合生长的寡核酸的受保护的5’末端，使得伯醇羟基与下一个核苷亚磷酰胺反应。在一些情况下，保护基团为DMT并且用在二氯甲烷中的三氯乙酸进行解封闭。进行延长时间的脱三苯甲基化或者使用比推荐的酸溶液更强的酸溶液进行脱三苯甲基化可导致固体支持物结合的寡核苷酸的脱嘌呤增加，并因此降低了所需的全长产物的产率。本文所述的本公开内容的方法和组合物提供了受控的解封闭条件，从而限制不期望的脱嘌呤反应。在一些情况下，装置结合的寡核酸在解封闭后洗涤。在一些情况下，解封闭后的有效洗涤有助于合成的寡核酸具有低错误率。
用于合成寡核酸的方法通常涉及以下步骤的迭代序列：将受保护的单体应用于活性功能化表面(例如，座位)以与活化表面、连接体或与先前脱保护的单体连接；使所施加的单体脱保护，使得其与随后施加的受保护的单体反应；以及应用另一种受保护的单体进行连接。一个或多个中间步骤包括氧化或硫化。在一些情况下，一个或多个洗涤步骤在一个或全部步骤之前或之后。
基于亚磷酰胺的寡核酸合成的方法包括一系列化学步骤。在一些情况下，合成方法的一个或多个步骤涉及试剂循环，其中该方法的一个或多个步骤包括向该装置施加对该步骤有用的试剂。例如，试剂通过一系列液相沉积和真空干燥步骤进行循环。对于包含三维特征如孔、微孔、通道等的基底，试剂可任选地经由孔和/或通道穿过装置的一个或多个区域。
本文所述的方法和系统涉及用于合成寡核苷酸的寡核苷酸合成装置。该合成可以是平行的。例如可以平行合成至少或约至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、10000、50000、75000、100000个或更多个寡核苷酸。可以平行合成的寡核酸的总数可以为2-100000、3-50000、4-10000、5-1000、6-900、7-850、8-800、9-750、10-700、11-650、12-600、13-550、14-500、15-450、16-400、17-350、18-300、19-250、20-200、21-150,22-100、23-50、24-45、25-40、30-35。本领域技术人员知晓，平行合成的寡核苷酸的总数可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-100。平行合成的寡核苷酸的总数可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。在装置内合成的寡核苷酸的总摩尔质量或寡核苷酸中的每一种的摩尔质量可以为至少或至少约10、20、30、40、50、100、250、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、25000、50000、75000、100000皮摩尔或更大。寡核苷酸中的每一种的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可以为至少或约至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、300、400、500个核苷酸或更多。寡核苷酸中的每一种的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可以为至多或约至多500、400、300、200、150、100、50、45、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个核苷酸或更少。寡核苷酸中的每一种的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可以处于10-500、9-400、11-300、12-200、13-150、14-100、15-50、16-45、17-40、18-35、19-25之间。本领域技术人员知晓，寡核苷酸中每一种的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如100-300。寡核苷酸中的每一种的长度或装置内寡核苷酸的平均长度可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。
本文提供的表面上寡核酸合成的方法允许以较快的速度合成。作为实例，合成每小时至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、125、150、175、200个核苷酸或更多。核苷酸包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿苷构建区或其类似物/修饰形式。在一些情况下，寡核酸文库在基底上平行合成。例如，包含约或至少约100；1,000；10,000；30,000；75,000；100,000；1,000,000；2,000,000；3,000,000；4,000,000；或5,000,000个解析座位的装置能够支持合成至少相同数目的不同的寡核酸，其中编码不同序列的寡核酸在解析座位上合成。在一些情况下，寡核酸文库在具有本文所述的低错误率的装置上在少于约三个月、两个月、一个月、三周、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、24小时或更短的时间内合成。在一些情况下，使用本文所述的基底和方法从低错误率合成的寡核酸文库中组装的较大核酸在少于约三个月、两个月、一个月、三周、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、24小时或更短的时间内制备。
在一些情况下，本文所述的方法提供了生成包含在多个密码子位点处不同的变异寡核酸的寡核酸文库。在一些情况下，寡核酸可具有1个位点、2个位点、3个位点、4个位点、5个位点、6个位点、7个位点、8个位点、9个位点、10个位点、11个位点、12个位点、13个位点、14个位点、15个位点、16个位点、17个位点、18个位点、19个位点、20个位点、30个位点、40个位点、50个位点或更多个变异密码子位点。
在一些情况下，变异密码子位点的一个或多个位点可以是相邻的。在一些情况下，变异密码子位点的一个或多个位点可以是不相邻的并且由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个密码子隔开。
在一些情况下，寡核酸可包含变异密码子位点的多个位点，其中所有变异密码子位点彼此相邻形成一段变异密码子位点。在一些情况下，寡核酸可包含变异密码子位点的多个位点，其中变异密码子位点彼此不相邻。在一些情况下，寡核酸可包含变异密码子位点的多个位点，其中一些变异密码子位点彼此相邻形成一段变异密码子位点，并且一些变异密码子位点彼此不相邻。
参考附图，图12图示了用于从较短寡核酸合成核酸(例如，基因)的示例性处理工作流程。该工作流程大致划分为以下阶段：(1)从头合成单链寡核酸文库，(2)连接寡核酸以形成更大的片段，(3)错误校正，(4)质量控制，以及(5)运输。在从头合成之前，预先选择预期的核酸序列或核酸序列组。例如，预先选择一组基因用于生成。
一旦选择用于生成的大寡核酸，则设计预定的寡核酸文库用于从头合成。用于生成高密度寡核酸阵列的各种合适的方法是已知的。在工作流程示例中，提供了装置表面层1201。在该示例中，改变表面的化学性质以改进寡核酸合成过程。生成低表面能的区域以排斥液体，同时生成高表面能的区域以吸引液体。表面本身可以是平面表面的形式或者包含形状的变化，例如增加表面积的突起或微孔。在工作流程示例中，如在通过引用以其全文并入本文的国际专利申请公开WO/2015/021080中所公开的，所选择的高表面能分子具有支持DNA化学过程的双重功能。
寡核酸阵列的原位制备在固体支持物上进行，并利用单核苷酸延伸过程平行延伸多个寡聚物。材料沉积装置如寡核酸合成仪被设计为以逐步方式释放试剂，使得多个寡核酸平行地一次延伸一个残基以生成具有预定核酸序列的寡聚物1202。在一些情况下，寡核酸在该阶段从表面上切下。切割包括例如用氨或甲胺来气体切割。
将生成的寡核酸文库放置于反应室中。在该示例性工作流程中，反应室(也被称为“纳米反应器”)为硅涂覆的孔，其含有PCR试剂并降低到寡核酸文库1203上。在寡核酸密封1204之前或之后，添加试剂以从基底释放寡核酸。在示例性工作流程中，寡核酸在纳米反应器密封1205之后释放。一旦释放，单链寡核酸的片段杂交以跨越整个长程DNA序列。部分杂交1205是可能的，因为每个合成的寡核酸被设计为具有与池中的至少一个其他寡核酸重叠的一小部分。
杂交后，开始PCA反应。在聚合酶循环过程中，寡核酸与互补片段退火并且空位由聚合酶填充。根据那些寡核酸彼此发现，每个循环随机增加各个片段的长度。片段之间的互补性允许形成完整的大跨度双链DNA 1206。
在PCA完成之后，将纳米反应器与装置分开1207并定位成与具有用于PCR引物的装置相互作用1208。密封后，纳米反应器经历PCR 1209并扩增较大的核酸。在PCR之后1210，打开纳米室1211，添加错误校正试剂1212，将腔室密封1213并进行错误校正反应以去除与来自双链PCR扩增产物的互补性差的错配碱基对和/或链1214。打开并分离纳米反应器1215。错误校正产物接下来经历另外的处理步骤如PCR和分子条形码化，随后包装1222用于运输1223。
在一些情况下，采取质量控制措施。在错误校正之后，质量控制步骤包括例如与具有用于扩增错误校正产品的测序引物的晶片进行相互作用1216，将晶片密封到含有错误校正扩增产物的腔室中1217，并执行另一轮扩增1218。打开纳米反应器1219，并且合并产物1220并进行测序1221。在做出可接受的质量控制检测之后，包装产品1222准许进行运输1223。
在一些情况下，通过诸如图12中的工作流程生成的核酸使用本文公开的重叠引物经历诱变。在一些情况下，通过在固体支持物上原位制备来生成引物文库并利用单核苷酸延伸过程平行延伸多个寡聚体。沉积装置如寡核酸合成仪被设计为以逐步方式释放试剂，使得多个寡核酸平行地一次延伸一个残基以生成具有预定核酸序列1202的寡聚物。
计算机系统
本文所述的任何系统均可以可操作地连接至计算机，并且可以本地或远程地通过计算机进行自动化。在各种情况下，本公开内容的方法和系统可进一步包括计算机系统上的软件程序及其使用。相应地，对于分配/抽真空/再填充功能的同步如编排和同步材料沉积装置运动、分配动作和真空致动的计算机化控制处于本公开内容的范围内。计算机系统可被编程为在用户指定的碱基序列与材料沉积装置的位置之间接合，以将正确的试剂递送至基底的指定区域。
图13中示出的计算机系统1300可被理解为能够从介质1311和/或网络端口1305读取指令的逻辑设备，其可任选地连接至具有固定介质1312的服务器1309。诸如图13示出的系统可包括CPU 1301、磁盘驱动器1303、任选的输入设备如键盘1315和/或鼠标1316以及任选的监视器1307。可通过示出的通信媒介实现与本地或远程位置处的服务器的数据通信。通信媒介可包括传输和/或接收数据的任何手段。例如，通信媒介可以是网络连接、无线连接或因特网连接。这样的连接可提供经由万维网的通信。可以预期有关本公开内容的数据可经过这样的网络或连接而传输，以便由图13所示的用户方1322接收和/或审阅。
图14是示出可与本公开内容的示例实例结合使用的计算机系统1400的第一示例架构的框图。如图14所示，该示例计算机系统可包括用于处理指令的处理器1402。处理器的非限制性实例包括：Intel XeonTM处理器、AMD OpteronTM处理器、Samsung 32-bit RISCARM 1176JZ(F)-S v1.0TM处理器、ARM Cortex-A8Samsung S5PC100TM处理器、ARM Cortex-A8Apple A4TM处理器、Marvell PXA 930TM处理器或功能上等效的处理器。多个执行线程可用于并行处理。在一些情况下，也可以使用多个处理器或具有多核的处理器，无论是在单一计算机系统中，在群集中，还是通过包含多个计算机、蜂窝电话和/或个人数据助理设备的网络跨系统分布。
如图14所示，高速缓冲存储器1404可连接至或并入处理器1402，以提供由处理器1402新近或频繁使用的指令或数据的高速存储器。处理器1402通过处理器总线1408连接至北桥1406。北桥1406通过存储器总线1412连接至随机存取存储器(RAM)1410，并管理处理器1402对RAM 1410的访问。北桥1406还通过芯片集总线1416连接至南桥1414。南桥1414又连接至外围总线1418。外围总线可以是例如PCI、PCI-X、PCI Express或其他外围总线。北桥和南桥通常被称为处理器芯片集，并管理在处理器、RAM与外围总线1418上的外围组件之间的数据传送。在一些供选择的架构中，北桥的功能性可以并入处理器，而不是使用单独的北桥芯片。在一些情况下，系统1400可包括附接至外围总线1418的加速器卡1422。加速器可包括现场可编程门阵列(FPGA)或用于加速某个处理的其他硬件。例如，加速器可用于适应性数据重建或用来评估在扩展集处理中使用的代数表达式。
软件和数据存储在外部存储器1424中并可加载至RAM 1410和/或高速缓冲存储器1404中，以供处理器使用。系统1400包括用于管理系统资源的操作系统；操作系统的非限制性实例包括：Linux、WindowsTM、MACOSTM、BlackBerry OSTM、iOSTM和其他功能上等效的操作系统，以及在操作系统顶部运行的、用于根据本公开内容的示例实例管理数据存储和优化的应用软件。在该实例中，系统1400还包括与外围总线连接的网络接口卡(NIC)1420和1421，以提供与外部存储如网络附加存储(NAS)和可用于分布式并行处理的其他计算机系统的网络接口。
图15是显示了具有多个计算机系统1502a和1502b、多个蜂窝电话和个人数据助理1502c以及网络附加存储(NAS)1504a和1504b的网络1500的示图。在示例实施方案中，系统1502a、1502b和1502c可管理数据存储并优化对存储在网络附加存储(NAS)1504a和1504b中的数据的数据访问。数学模型可用于该数据并使用跨计算机系统1502a和1502b和蜂窝电话以及个人数据助理系统1502c的分布式并行处理进行评估。计算机系统1502a和1502b和蜂窝电话以及个人数据助理系统1502c也可提供对存储在网络附加存储(NAS)1504a和1504b中的数据的适应性数据重建的并行处理。图15仅示出了一个实例，而多种多样的其他计算机架构和系统可与本公开内容的多个实例一起使用。例如，刀片式服务器可用来提供并行处理。处理器刀片可通过背板连接，以提供并行处理。存储还可通过单独的网络接口连接至背板或作为网络附加存储(NAS)。在一些示例实例中，处理器可维持单独的存储空间并通过网络接口、背板或其他连接器传输数据以便由其他处理器并行处理。在其他情况下，部分或全部的处理器可使用共享的虚拟地址存储空间。
图16是根据示例实例使用共享虚拟地址存储空间的多处理器计算机系统1600的框图。该系统包括可访问共享的存储器子系统1604的多个处理器1602a-f。该系统中并入存储器子系统1604中的多个可编程硬件存储算法处理器(MAP)1606a-f。MAP 1606a-f中的每一个可包括存储器1608a-f和一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)1610a-f。MAP提供了可配置的功能单元，并且可向FPGA 1610a-f提供特定算法或算法的部分，以便与各自的处理器密切协调处理。例如，在示例实例中，MAP可用来评估与数据模型相关的代数表达式以及用来进行适应性数据重建。在该示例中，每一个MAP可被用于这些目的的所有处理器全局访问。在一种配置中，每一个MAP可使用直接存储器访问(DMA)以访问相关联的存储器1608a-f，使其独立于且异步于各自的微处理器1602a-f而执行任务。在这一配置中，MAP可将结果直接提供给另一MAP以用于流水处理和并行执行算法。
以上计算机架构和系统仅为实例，并且多种多样的其他计算机、蜂窝电话和个人数据助理架构和系统可与示例实例结合使用，其包括使用普通处理器、协处理器、FPGA和其他可编程逻辑设备、芯片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)和其他处理和逻辑元件的任何组合的系统。在一些情况下，全部或部分计算机系统可用软件或硬件来实现。任何种类的数据存储介质可与示例实例结合使用，其包括随机存取存储器、硬盘驱动器、闪速存储器、磁带驱动器、磁盘阵列、网络附加存储(NAS)和其他的本地或分布式数据存储设备和系统。
在示例实例中，计算机系统可使用在任何上述或其他计算机架构和系统上执行的软件模块来实现。在其他实例中，系统的功能可部分或完全地在固件、可编程逻辑设备如图13所示的现场可编程门阵列(FPGA)、芯片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)或其他处理和逻辑元件中实现。例如，集处理器(Set Processor)和优化器可通过使用硬件加速器卡如图13所图示的加速器卡1322用硬件加速方式实现。
阐述以下实施例是向本领域技术人员更清楚地说明本文所公开的实施方案的原理和实践，并且不被解释为限制任何要求保护的实施方案的范围。除非另有说明，否则所有份数和百分比均以重量计。
实施例
以下实施例是为了说明本公开内容的各种实施方案的目的而给出的，并且不意味着以任何方式限制本公开内容。本实施例连同目前表示优选实施方案的本文所述之方法是示例性的，并且不旨在限制本公开内容的范围。本领域技术人员将想到其中的变化以及包含在由权利要求的范围所限定的本公开内容的精神之下的其他用途。
实施例1：装置表面的功能化
将装置进行功能化以支持寡核酸文库的附着和合成。首先使用包含90％H2SO4和10％H2O2的水虎鱼溶液(piranha solution)将装置表面润湿清洗20分钟。将该装置在具有去离子水的几个烧杯中冲洗，在去离子水鹅颈管水龙头下保持5min，并用N2干燥。随后将该装置在NH4OH(1:100；3mL:300mL)中浸泡5min，使用手枪喷嘴(handgun)以去离子水冲洗，在具有去离子水的连续三个烧杯中各浸泡1min，随后再使用手枪喷嘴以去离子水冲洗。然后通过将装置表面暴露于O2来等离子体清洗该装置。使用SAMCO PC-300仪器在下游模式下以250瓦的O2等离子体蚀刻1min。
用包含N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺的溶液使用具有以下参数的YES-1224P气相沉积烘箱系统使清洁的装置表面主动功能化：0.5至1托，60min，70℃，135℃汽化器。使用Brewer Science200X旋转涂布仪对装置表面进行抗蚀剂涂覆。将SPRTM 3612光致抗蚀剂以2500rpm旋涂在装置上，时长40sec。该装置在Brewer热板上以90℃预烘30min。使用Karl Suss MA6掩模对准机对装置进行光刻。将该装置暴露2.2sec并在MSF 26A中显影1min。剩余的显影剂用手枪喷嘴冲洗，并将装置在水中浸泡5min。该装置在烘箱中以100℃烘烤30min，随后使用Nikon L200目视检查光刻缺陷。采用除渣工艺利用SAMCO PC-300仪器以250瓦的O2等离子体蚀刻1min来去除残余抗蚀剂。
用全氟辛基三氯硅烷与10μL轻矿物油混合的100μL溶液使装置表面功能钝化。将该装置放置于腔室中，泵送10min，随后将阀门关闭至泵并静置10min。该腔室通风排气。该装置通过在70℃下在500mL NMP中以最大功率超声波处理(在Crest系统上9次)进行两次5min浸泡来剥离抗蚀剂。然后将装置在室温下在500mL异丙醇中浸泡5min，并以最大功率进行超声波处理。将该装置浸入300mL的200标准乙醇中并用N2吹干。激活该功能化表面以用作寡核酸合成的支持物。
实施例2：在寡核苷酸合成装置上合成50-聚体序列
将二维寡核苷酸合成装置组装至流动池中，其与流动池(Applied Biosystems(ABI394DNA合成仪")连接。该二维寡核苷酸合成装置用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基-4-羟基丁酰胺(Gelest)均匀地功能化，其用来使用本文所述的寡核苷酸合成方法合成50bp的示例性寡核苷酸("50-聚体寡核苷酸”)。
该50-聚体的序列如SEQ ID NO.:20所述。5'AGACAATCAACCATTTGGGGTGGACAGCCTTGACCTCTAGACTTCGGCAT##TTTTTTTTTT3'(SEQ ID NO.:20)，其中#表示胸苷-琥珀酰己酰胺CED亚磷酰胺(来自ChemGenes的CLP-2244)，它是能够在脱保护过程中使寡核苷酸从表面上释放的可切割的连接体。
根据表2中的方案和ABI合成仪，使用标准DNA合成化学法(偶联、加帽、氧化和解封闭)完成合成。
表2：
亚磷酰胺/活化剂组合以类似于本体试剂通过流动池的递送的方式进行递送。当在全部时间内保持环境被试剂“润湿”时，不进行干燥步骤。
从ABI 394合成仪中去除限流器，以使得能够更快速流动。在没有限流器的情况下，酰胺类(amidites)(在ACN中0.1M)、活化剂(在ACN中的0.25M苯甲酰基硫基四唑(“BTT”；来自GlenResearch的30-3070-xx))和Ox(在20％吡啶、10％水和70％THF中的0.02M I2)的流速大致为约100uL/sec，乙腈(“ACN”)和加帽试剂(帽A和帽B的1:1混合物，其中帽A是在THF/吡啶中的乙酸酐，帽B是在THF中的16％1-甲基咪唑(1-methylimidizole))的流速大致为约200uL/sec，解封闭剂(在甲苯中的3％二氯乙酸)的流速大致为约300uL/sec(与之相比，在有限流器的情况下，所有试剂均为约50uL/sec)。观测完全排出氧化剂的时间，相应地调节化学品流动时间的时间选择，并在不同的化学品之间引入额外的ACN洗涤。寡核苷酸合成之后，芯片在75psi下在气态氨中脱保护过夜。将五滴水施加到表面上以回收寡核酸。随后在BioAnalyzer小RNA芯片上分析所回收的寡核酸(数据未示出)。
实施例3：在寡核苷酸合成装置上合成100-聚体序列
使用在实施例2中描述的用于合成50-聚体序列的相同过程，在两个不同的硅芯片上合成100-聚体寡核苷酸(“100-聚体寡核苷酸”；5'CGGGATCCTTATCGTCATCGTCGTACAGATCCCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATACCATGATGATGATGATGATGAGAACCCCGCAT##TTTTTTTTTT3'，其中#表示胸苷-琥珀酰己酰胺CED亚磷酰胺(来自ChemGenes的CLP-2244)；SEQ ID NO.:21)，第一个用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基-4-羟基丁酰胺均匀地功能化，而第二个用11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷和正癸基三乙氧基硅烷的5/95混合物功能化，并在BioAnalyzer仪器上分析从表面提取的寡核酸(数据未示出)。
在50uL PCR混合物(25uL NEB Q5主混合物，2.5uL 10uM正向引物，2.5uL 10uM反向引物，从表面提取的1uL寡核酸，和加至50uL的水)中使用正向(5'ATGCGGGGTTCTCATCATC3'；SEQ ID NO.:22)和反向(5'CGGGATCCTTATCGTCATCG3'；SEQ IDNO.:23)引物，使用下列热循环程序，进一步PCR扩增来自两个芯片的全部十个样品：
98C，30sec
98C，10sec；63C，10sec；72C，10sec；重复12个循环
72C，2min
PCR产物还在BioAnalyzer上运行(数据未示出)，在100-聚体位置处显示尖锐峰。然后，对PCR扩增的样品进行克隆，并进行Sanger测序。表3总结了从来自芯片1的斑点1-5采集的样品和从来自芯片2的斑点6-10采集的样品的Sanger测序结果。
表3:
斑点 错误率 循环效率
1 1/763bp 99.87％
2 1/824bp 99.88％
3 1/780bp 99.87％
4 1/429bp 99.77％
5 1/1525bp 99.93％
6 1/1615bp 99.94％
7 1/531bp 99.81％
8 1/1769bp 99.94％
9 1/854bp 99.88％
10 1/1451bp 99.93％
因此，合成的寡核苷酸的高质量和均匀性在具有不同表面化学的两个芯片上重复。总体上，89％，相当于被测序的262个100-聚体中的233个是没有错误的完美序列。
最后，表4总结了从来自斑点1-10的寡核苷酸样品中获得的序列的错误特征。
表4:
实施例4：通过单位点、单位置诱变生成寡核酸文库
从头合成寡核酸引物用于一系列PCR反应以产生模板核酸的寡核酸变体文库，参见图2A-2D。图2A中生成了四种类型的引物：外部5’引物215、外部3’引物230、内部5’引物225和内部3’引物220。内部5’引物/第一寡核酸220和内部3’引物/第二寡核酸225使用如表2中大体上概括的寡核酸合成方法生成。内部5’引物/第一寡核酸220代表一组预定序列的最多19个引物，其中该组中的每个引物在序列的单个位点中与单个密码子处的另一个引物不同。
在具有至少两个簇的装置上进行寡核酸合成，每个簇具有121个可单独寻址的座位。
内部5’引物225和内部3’引物220在不同的簇中合成。内部5’引物225重复121次，在单簇内的121个座位上延伸。对于内部3’引物220，变异序列的19个引物中的每一个均在6个不同的座位上各自延伸，导致在114个不同座位上延伸114个寡核酸。
将合成的寡核酸从装置表面上切下并转移到塑料小瓶中。如图2B所示，使用长核酸序列235、240的片段进行第一PCR反应以扩增模板核酸。如图2C-2D所示，使用引物组合和第一PCR反应的产物作为模板进行第二PCR反应。第二PCR产物的分析在BioAnalyzer上进行，如图17的曲线所示。
实施例5：生成包含96个不同组的单位置变体的寡核酸文库
大体上如图2A中所示和实施例2中所提到的，四组引物使用从头寡核酸合成来生成。对于内部5’引物220，生成96个不同组的引物，每组引物靶向位于模板寡核酸的单个位点内的不同单个密码子。对于每组引物，生成19种不同的变体，每种变体在单个位点处包含编码不同氨基酸的密码子。大体上如图2A-2D中所示和实施例2中所述，使用所生成的引物进行两轮PCR。96组扩增产物在电泳图(图18)中可视化，其用于计算100％扩增成功率。
实施例6：生成包含500个不同组的单位置变体的寡核酸文库
大体上如图2A中所示和实施例2中所提到的，四组引物使用从头寡核酸合成来生成。对于内部5’引物220，生成500个不同组的引物，每组引物靶向位于模板寡核酸的单个位点内的不同单个密码子。对于每组引物，产生19个不同的变体，每个变体在单个位点处包含编码不同氨基酸的密码子。大体上如图2A中所示和实施例2中所述，使用所生成的引物进行两轮PCR。电泳图显示了具有在不同单个位点处具有19个变体的核酸群体的500组PCR产物中的每一个(数据未示出)。该文库的全面测序分析显示了在预选密码子突变(序列追踪和分析数据未示出)中大于99％的成功率。
实施例7：1位置的单位点诱变引物
表3中提供了用于黄色荧光蛋白的密码子变异设计的实例。在这种情况下，来自50-聚体序列的单个密码子变化19次。变异核酸序列用粗体字表示。野生型引物序列为：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCAT(SEQ ID NO.:1)。在这种情况下，野生型密码子编码缬氨酸，由SEQ ID NO.:1中的下划线所示。因此，以下19个变体不包括编码缬氨酸的密码子。在备选的实例中，如果要考虑所有的三联体，那么将生成全部60个变体，包括野生型密码子的备选序列。
表3.
实施例8：单位点、双位置的寡核酸变体
在类似于实施例2中所述的条件下进行从头寡核酸合成。生成装置上的单簇，其在单个位点处含有针对2个连续密码子位置的寡核酸的合成预定变体，每个位置为编码氨基酸的密码子。在这种布置中，对于每个寡核酸有3次重复的2个位置，生成19个变体/每个位置，导致合成114个寡核酸。
实施例9：多位点、双位置的寡核酸变体
在类似于实施例2中所述的条件进行从头寡核酸合成。生成装置上的单簇，其含有针对2个非连续密码子位置的寡核酸的合成预定变体，每个位置为编码氨基酸的密码子。在这种布置中，对于2个位置生成19个变体/每个位置。
实施例10：单段、三位置的寡核酸变体
在类似于实施例2中所述的条件下进行从头寡核酸合成。生成装置上的单簇，其含有针对3个连续密码子位置的参照寡核酸的合成预定变体。在3个连续的密码子位置布置中，对于每个寡核酸有2次重复的3个位置，生成19个变体/每个位置，并导致合成114个寡核酸。
实施例11：多位点、三位置的寡核酸变体
在类似于实施例2中所述的条件下进行从头寡核酸合成。生成装置上的单簇，其含有针对至少3个非连续密码子位置的参照寡核酸的合成预定变体。在预定的区域内，编码3个组氨酸残基的密码子的位置是不同的。
实施例12：多位点、多位置的寡核酸变体
在类似于实施例2中所述的条件下进行从头寡核酸合成。生成装置上的单簇，其含有针对1个或多个区段中的1个或多个密码子位置的参考寡核酸的合成预定变体。该文库中的五个位置是不同的。第一个位置编码在表达蛋白质中所得到的50/50的K/R比的密码子；第二个位置编码在表达蛋白质中所得到的50/25/25的V/L/S比的密码子，第三个位置编码在表达蛋白质中所得到的50/25/25的Y/R/D比的密码子，第四个位置编码在表达蛋白质中所得到的对于所有氨基酸等比的密码子，和第五个位置编码在表达蛋白质中所得到G/P比为75/25的密码子。
实施例13：在具有多个变异位点的CDR中的延伸
如实施例4-6和8-12中所示生成寡核苷酸文库，其编码在单个位点或其中在每个位置预选变体的多个位点处的密码子变异。变异区编码CDR的至少一部分。参见例如图10。从装置表面释放合成的寡核酸，并用作引物以生成核酸文库，其在细胞中表达以生成变异蛋白质文库。评估变异抗体与表位的结合亲和力的增加。
实施例14：用于表达不同肽的模块化质粒组分
如实施例4-6和8-12中所示生成寡核苷酸文库，其编码在构成表达构建体盒的部分的每个单独区域的多个位点处或单个位点处的密码子变异，如图11中所描绘的。为了生成两个构建体表达盒，合成编码第一启动子1110、第一开放阅读框1120、第一终止子1130、第二启动子1140、第二开放阅读框1150或第二终止子序列1160的变异序列的至少一部分的变异寡核酸。经过多轮扩增后，如前述实施例中所述，生成1,024个表达构建体的文库。
实施例15：多位点、单位置变体
如实施例4-6和8-12中所示生成寡核苷酸文库，其编码在编码至少一部分核酸的区域中的多个位点处或单个位点处的密码子变异。生成寡核酸变体文库，其中该文库由多个位点、单个位置变体组成。参见例如图6B。
实施例16：变体文库合成
在类似于实施例2中所述的条件下进行从头寡核酸合成。从头合成至少30,000个不同的寡核酸，其中不同的寡核酸中的每一个均编码氨基酸序列的不同密码子变体。所合成的至少30,000个不同寡核酸相比于至少30,000个不同寡核酸中的每一个的预定序列具有小于1/1000个碱基的总错误率。该文库用于长核酸的PCR诱变，并且形成至少30,000个不同的变异核酸。
实施例17：孔中的变体文库合成
在类似于实施例2中所述的条件下进行从头寡核酸合成。生成装置上的单簇，其含有针对2个密码子位置的参照寡核酸的合成预定变体。在2个连续密码子位置布置中，对于每个寡核酸有2次重复的2个位置，生成19个变体/每个位置，并导致合成38个寡核酸。每个变异序列的长度为40个碱基。在相同的簇中，生成另外的非变异寡核酸序列，其中另外的非变异寡核酸和变异核酸共同编码基因的编码序列的38个变体。寡核酸中的每一个均具有至少一个区域与寡核酸的另一个区域反向互补。通过气态氨切割来释放簇中的寡核酸。包含水的销(pin)与该簇接触，拾取寡核酸，并将寡核酸移动到小瓶中。该小瓶还含有用于聚合酶循环组装(PCA)反应的DNA聚合酶试剂。寡核酸退火，通过延伸反应填充空位，并形成所得到的的双链DNA分子，形成变异核酸文库。然后将任选地经历限制性内切酶的变异核酸文库连接到表达载体中。
实施例18：针对蛋白质结合亲和力的变化筛选变异核酸文库
如实施例16或17中所述生成多个表达载体。在该实施例中，表达载体为HIS标记的细菌表达载体。将载体文库电穿孔到细菌细胞中，随后选择克隆用于表达和纯化HIS标记的变异蛋白质。针对与靶分子的结合亲和力的变化筛选变异蛋白质。
通过诸如使用金属亲和色谱法(IMAC)的方法检查亲和性，其中使用金属离子涂覆的树脂(例如，IDA-琼脂糖或NTA-琼脂糖)来分离HIS-标记的蛋白质。由于组氨酸残基串在特定缓冲条件下与几种类型的固定化金属离子(包括镍、钴和铜)结合，所以可以纯化并检测表达的His-标记的蛋白质。结合/清洗缓冲液的实例由含有10-25mM咪唑的Tris-缓冲生理盐水(TBS)pH 7.2组成。从IMAC柱中洗脱和回收捕获的His-标记的蛋白质用高浓度的咪唑(至少200mM)(洗脱剂)、低pH(例如，0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.5)或过量的强螯合剂(例如，EDTA)来完成。
或者，抗His标记抗体可商购用于涉及His-标记的蛋白质的测定方法中，如分离His-标记的蛋白质的拉下(pull-down)测定或检测His-标记的蛋白质的免疫印迹测定。
实施例19：针对细胞粘附和迁移调节剂活性的变化筛选变异核酸文库
如实施例16或17中所述生成多个表达载体。在该实施例中，表达载体为GFP-标记的哺乳动物表达载体。将从文库中分离的克隆瞬时转染到哺乳动物细胞中。或者，从含有表达构建体的细胞中表达且分离蛋白质，随后将蛋白质递送至细胞用于进一步测量。进行免疫荧光测定以评估GFP标记的变异表达产物的细胞定位的变化。进行FACS测定来评估与GFP标记的变异蛋白质表达产物的非变体形式相互作用的跨膜蛋白的构象状态的变化。进行伤口愈合测定以评估表达GFP标记的变异蛋白质的细胞侵入由在细胞培养皿上刮擦产生的空间的能力的变化。使用荧光光源和照相机对表达GFP标记的蛋白质的细胞进行鉴定及追踪。
实施例20：针对抑制病毒进展的肽筛选变异核酸文库
如实施例16或17中所述生成多种表达载体。在该实施例中，表达载体为FLAG-标记的哺乳动物表达载体，并且变异核酸文库编码肽序列。原代哺乳动物细胞从患有病毒病症的受试者中获得。或者，用病毒感染来自健康受试者的原代细胞。将细胞接种在一系列微孔皿上。将从变体文库中分离的克隆瞬时转染至细胞中。或者，从含有表达构建体的细胞中表达且分离蛋白质，随后将蛋白质递送至细胞用于进一步测量。进行细胞存活测定以评估受感染细胞与变异肽相关的增强的存活。示例性病毒包括但不限于禽流感、寨卡病毒(zikavirus)、汉坦病毒、丙型肝炎、天花。
一个示例性测定为中性红细胞毒性测定，其使用中性红染料，当添加至细胞中时，由于中性红的轻度阳离子性质，其扩散穿过质膜并积聚在酸性溶酶体区室中。病毒诱导的细胞变性导致膜破碎和溶酶体ATP驱动质子易位活性的丧失。细胞内中性红的随后减少可以采用分光光度法以多孔板形式式进行评估。表达变异肽的细胞通过信号获得(gain-of-signal)颜色测定中细胞内中性红的增加来评分。针对抑制病毒诱导的细胞变性的肽来评估细胞。
实施例21：筛选提高或降低细胞代谢活性的变异蛋白质
为了鉴定导致细胞代谢活性变化的表达产物，如实施例16或17中所述生成多种表达载体。在该实施例中，将表达载体转移(例如，通过转染或转导)至接种在一系列微孔皿上的细胞中。然后针对代谢活性的一种或多种变化筛选细胞。或者，从含有表达构建体的细胞中表达并分离蛋白质，随后将蛋白质递送至细胞用于测量代谢活性。任选地，在筛选一种或多种代谢活性变化之前，用毒素处理用于测量代谢活性的细胞。所施用的示例性毒素包括但不限于肉毒杆菌毒素(包括免疫学类型：A、B、C1、C2、D、E、F和G)、葡萄球菌肠毒素B、鼠疫耶尔森氏菌、丙型肝炎、芥子剂、重金属、氰化物、内毒素、炭疽杆菌、寨卡病毒、禽流感、除草剂、杀虫剂、汞、有机磷酸酯和蓖麻毒素。
基础能量需求来源于代谢底物(例如，葡萄糖)的氧化，其通过涉及有氧三羧酸(TCA)或Kreb循环的氧化磷酸化或无氧糖酵解来进行。当糖酵解是能量的主要来源时，细胞的代谢活性可通过监测细胞分泌代谢酸性产物(例如，乳酸盐和CO2)的速率来估计。在有氧代谢的情况下，细胞外氧的消耗和氧化自由基的产生反映了细胞的能量需求。细胞内氧化还原电位可通过NADH和NAD+的自发荧光测量来测量。由细胞释放的能量(例如，热量)的量来源于代谢过程中产生和/或消耗的物质的分析值，其在正常设定下可由消耗的氧气量(例如，4.8kcal/l O2)预测。热产生和氧利用之间的偶联可能受到毒素的干扰。直接微量热法测量热隔离样品的温度升高。因此，当与氧气消耗量测量相结合时，量热法可用于检测毒素的解偶联活性。
用于测量代谢活性的各种标记物的变化的各种方法和装置是本领域中已知的。例如，在通过引用以其全文并入本文的美国专利号7,704,745中讨论了这样的方法、装置和标记物。简而言之，记录每种细胞群体的任何以下特征的测量值：葡萄糖、乳酸盐、CO2、NADH与NAD+比例、热量、O2消耗量和自由基产生。筛选的细胞可包括肝细胞、巨噬细胞或成神经细胞瘤细胞。筛选的细胞可以是细胞系、来自受试者的原代细胞或来自模型系统(例如，小鼠模型)的细胞。
各种技术可用于测量单细胞或位于多孔板的腔室内的细胞群体的氧气消耗速率。例如，包含细胞的腔室可具有记录温度、电流或荧光变化的传感器以及耦合到每个腔室以监测荧光的光学系统(例如，光纤耦合光学系统)。在该实例中，每个腔室均具有用于照射光源的窗口以激发腔室内的分子。纤维耦合光学系统可检测自发荧光以测量细胞内NADH/NAD比例和电压以及钙敏感染料以确定跨膜电位和细胞内钙。另外，对CO2和/或O2敏感的荧光染料信号的变化予以检测。
实施例22：针对癌细胞的选择性靶向筛选变异核酸文库
如实施例16或17中所述生成多个表达载体。在该实施例中，表达载体为FLAG-标记的哺乳动物表达载体，并且变异核酸文库编码肽序列。将来自变体文库的分离的克隆分别瞬时转染至癌细胞和非癌细胞中。在癌细胞和非癌细胞二者上进行细胞存活和细胞死亡测定，每个细胞表达由变异核酸编码的变异肽。针对与变异肽相关的选择性癌细胞杀伤来评估细胞。癌细胞任选地是来自被诊断患有癌症的受试者的癌细胞系或原发性癌细胞。在来自被诊断患有癌症的受试者的原发癌细胞的情况下，任选地选择在筛选测定中鉴定的变异肽以供施用于受试者。或者，从含有蛋白质表达构建体的细胞中表达且分离蛋白质，随后将蛋白质递送至癌细胞和非癌细胞以供进一步测量。
虽然本文已经示出和描述了本公开内容的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅仅是通过示例的方式提供的。本领域技术人员在不脱离本公开内容的情况下将会想到许多变化、改变和替代。应当理解，可在实施本公开内容时采用本文描述的本公开内容的实施方案的各种替代方案。旨在以下述权利要求限定本公开内容的范围，并且由此涵盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。
序列表
<110> 特韦斯特生物科学公司
<120> 寡核酸变体文库及其合成
<130> 44854-718.601
<140>
<141>
<150> 62/354,034
<151> 2016-06-23
<150> 62/263,548
<151> 2015-12-04
<150> 62/220,879
<151> 2015-09-18
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
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<400> 12
atgaatagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 13
atgaaaagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 14
atggatagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 15
atggaaagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 16
atgtgtagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 17
atgtggagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 18
atgcgtagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 19
atgggtagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccat 44
<210> 20
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 20
agacaatcaa ccatttgggg tggacagcct tgacctctag acttcggcat tttttttttt 60
tt 62
<210> 21
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 21
cgggatcctt atcgtcatcg tcgtacagat cccgacccat ttgctgtcca ccagtcatgc 60
tagccatacc atgatgatga tgatgatgag aaccccgcat tttttttttt tt 112
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 22
atgcggggtt ctcatcatc 19
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
引物
<400> 23
cgggatcctt atcgtcatcg 20
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 24
Ala Trp Ile Lys Arg Glu Gln
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任意氨基酸
<400> 25
Xaa Trp Ile Lys Arg Glu Gln
1 5
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任意氨基酸
<400> 26
Ala Xaa Ile Lys Arg Glu Gln
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任意氨基酸
<400> 27
Ala Trp Xaa Lys Arg Glu Gln
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任意氨基酸
<400> 28
Ala Trp Ile Xaa Arg Glu Gln
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任意氨基酸
<400> 29
Ala Trp Ile Lys Xaa Glu Gln
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 任意氨基酸
<400> 30
Ala Trp Ile Lys Arg Xaa Gln
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 任意氨基酸
<400> 31
Ala Trp Ile Lys Arg Glu Xaa
1 5

Claims (35)

1.一种调节蛋白质活性的方法，所述方法包括：
a)提供编码至少约30,000个不同的寡核酸的预定序列，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个编码与单个参考序列相比的变异密码子序列；
b)提供具有表面的结构；
c)合成所述至少约30,000个不同的寡核酸，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个均从所述表面延伸；
d)将所述至少约30,000个不同的寡核酸与DNA聚合酶及所述单个参考序列混合以形成变异核酸文库；
e)将所述变异核酸文库转移至细胞中并表达多种变异蛋白质；以及
f)鉴定与所述多种变异蛋白质的变异蛋白质相关的活性，其中所述活性相对于由所述单个参考序列编码的蛋白质进行调节。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性包括细胞繁殖、生长、粘附、死亡、迁移、能量产生、氧利用、代谢活性、细胞信号传导、老化、对自由基损伤的应答或其任意组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为真核细胞或原核细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为细菌、植物、小鼠或灵长类动物细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述变异核酸文库编码变异基因或其片段的序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述变异蛋白质为抗体、酶或肽。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述变异蛋白质对另一种分子具有增强或降低的结合亲和力。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述变异蛋白质具有增强或降低的酶活性。
9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括向有需要的受试者施用由所述变异核酸文库编码的单个变异核酸。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸相比于所述多个不同的寡苷酸的预定序列具有小于1/1000个碱基的总错误率。
11.一种调节细胞活性的方法，所述方法包括：
a)提供编码至少约30,000个不同的寡核酸的预定序列，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个编码与单个参考序列相比的预定的变异序列；
b)提供具有表面的结构；
c)合成所述至少约30,000个不同的寡核酸，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个均从所述表面延伸；并且其中所述至少约30,000个不同的寡核酸相比于所述多个不同的寡核酸的预定序列具有小于1/1000个碱基的总错误率；
d)将所述至少约30,000个不同的寡核酸与DNA聚合酶及所述单个参考序列混合以形成变异核酸文库；
e)将所述变异核酸文库转移至第一组细胞；以及
f)测量细胞活性的变化，其中针对所述第一组细胞或第二组细胞测量所述细胞活性，其中所述第二组细胞用至少一种从所述第一组细胞中分离的表达产物来处理。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞活性包括繁殖、生长、粘附、死亡、迁移、能量产生、氧利用、代谢活性、细胞信号传导、对自由基损伤的应答或其任意组合。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一组细胞或所述第二组细胞为真核细胞或原核细胞。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一组细胞或所述第二组细胞为细菌、植物、小鼠或灵长类动物细胞。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述变异核酸文库编码变异基因或其片段的序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括翻译每种变异基因以形成蛋白质。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述蛋白质为抗体、酶或肽。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述变异核酸文库编码所述抗体的可变区或恒定区的至少一部分。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述变异核酸文库编码所述抗体的至少一个CDR区。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述蛋白质对另一种分子具有增强或降低的结合亲和力，或者其中所述蛋白质具有增强或降低的酶活性。
21.根据权利要求11所述的方法，其中所述变异核酸文库编码转录调节序列。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述转录调节序列为启动子序列、UTR序列或终止子序列。
23.根据权利要求11所述的方法，其中所述变异核酸文库编码在转录时编码mRNA、miRNA或shRNA的序列。
24.一种治疗或减少疾病状态的方法，所述方法包括：
a)提供编码至少约30,000个不同的寡核酸的预定序列，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个编码与单个参考序列相比的变异密码子序列；
b)提供具有表面的结构；
c)合成所述至少约30,000个不同的寡核酸，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸中的每一个均从所述表面延伸；
d)将所述至少约30,000个不同的寡核酸与DNA聚合酶及所述单个参考序列混合以形成变异核酸文库；
e)将所述变异核酸文库转移至从受试者中获得的细胞；
f)鉴定与由变异核酸文库编码的变异核酸相关的有害活性的降低；
g)向有需要的受试者施用由所述变异核酸文库编码的所述变异核酸，从而治疗或减少所述疾病状态。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述疾病状态与细胞增殖性病症、自身免疫性病症、病毒性病症或细菌性病症相关。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少约30,000个不同的寡核酸相比于所述多个不同的寡核酸的预定序列具有小于1/1000个碱基的总错误率。
27.一种核酸合成方法，所述方法包括：
a)提供编码多个不同的寡核酸的预定序列，其中所述不同的寡核酸中的每一个的长度为至少20个碱基，并且其中所述多个不同的寡核酸对于至少一个序列的至少3个密码子中的每一个编码最多19个变体，并且其中所述多个不同的寡核酸共同编码至少一个基因及其变体；
b)提供具有表面的结构；
c)合成所述多个不同的寡核酸，其中所述不同的寡核酸中的每一个均从所述表面延伸；以及
d)组装来自所述多个不同的寡核酸的变异核酸文库。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述多个不同的寡核酸包含至少75,000个不同的寡核酸。
29.根据权利要求27所述的方法，其中共同编码单个基因及其变体的所述多个不同的寡核酸的子集位于所述结构的表面上的单簇内。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述结构的表面包含至少6000个所述单簇。
31.根据权利要求30所述的方法，其中每个簇位于直径约0.5至2mm的通道内。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述单簇包含50至500个用于核酸延伸的座位。
33.根据权利要求27所述的方法，其中所述多个不同的寡核酸共同编码一个以上基因的变体。
34.根据权利要求27所述的方法，其中所述多个不同的寡核酸共同编码至少5,000个基因的变体。
35.根据权利要求27所述的方法，其中所述变异核酸文库编码酶、肽或抗体的至少一部分。
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