JP5714490B2 - Rna合成、リバース方向での合成rnaためのホスホラミダイト、及びrnaオリゴマーの合成のための5’から3’方向に対する結合形成によるオリゴヌクレオチドを調製する方法 - Google Patents
Rna合成、リバース方向での合成rnaためのホスホラミダイト、及びrnaオリゴマーの合成のための5’から3’方向に対する結合形成によるオリゴヌクレオチドを調製する方法 Download PDFInfo
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Description
(a)天然及び合成のタンパク質形質導入ドメイン(protein transduction domains(PTD))は、細胞透過ペプチド(CPP)または膜透過ペプチド(MPP)とも呼ばれ、細胞膜と相互作用できる短いアミノ酸配列である。MPP−siRNA複合体の取り込みがすぐに起こる。そのようなペプチドが鎖の3’の位置に好んで結合することができる。
(b)他のポリカチオン分子がRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖の何れかの3’末端に結像することができる。
(c)PEG(polyethylene glycols-oligonucleotide conjuagates)が、標的細胞に取り込まれた後の様々な複合体処理特異的遺伝子サイレンシング効果に用いられている(Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., and Kataoka, K., J. Am. Chem. Soc, 127, 1624-1625, 2005)。
(d)アプタマーがsiRNAの部位特的運搬に用いられている。アプタマーはそれらの標的に対して高い親和性を有するので、siRNAとの複合体が優れた運搬システムとして機能し、標的の遺伝子発現の効果的な阻害を生じる(Chu, T.C., Twu, K.Y., Ellington, A.D. and Levy, M., Nucl. Acids Res., 34(10), e73, 2006)。これらの分子はsiRNAまたは他の生物的に活性なオリゴヌクレオチドの3’末端に再度結合することができる。
(e)3’末端での様々な脂質複合体が本発明を介して達成することができ、オリゴヌクレオチドの効果的な内部移行に利用することができる。親油性の部分は、ホスホラミダイトを合成するための水酸基機能を構成することができる。同様に、親油性の部分は、末端でカルボキシル基の機能を有することができる。後者は、C−6アミノリンカーアミダイトのようなアミノリンカーの最終的な付加により合成され、リバースの合成オリゴヌクレオチドの、DCC(dicyclohexyl cabodiimide)または同様のカップリング試薬を用いるカルボキシル基部分に対するスペーサを有する3’−アミノ基と結合することができる。
により精製された。精製した化合物(構造27)は、対応するホスホラミダイト(構造16)を得るために、n,n- diisopropylamino cyanoethyl phosphonamidic chlorideまたは2- cyanoethyl,n,n,n,n- tetraisopropyl phosphaneのようなリン酸化試薬でその後リン酸化した。リン酸化試薬n,n-diisopropylamino cyanoethyl phosphonamidic chlorideまたは2- cyanoethyl, n,n,n,n-tetraisopropyl phosphaneはともに、市場で用意に入手可能であり、対応するホスホラミダイトを生成するためのリン酸化方法は公知である。
ここで、
Yは酸素または硫黄であり;
Wは酸素、窒素及びフッ素であり;
R4は三級ブチルジメチルシリル(tert butyl dimethyl silyl)(TBDMS)、トリイソプロピニルシリルオキシメチレン(triisopropylsilyl oxymethylene)、フルオレニルオキシカルボニル(fluorenylmethyloxycarbonyl)(Fmoc)、アルキル(alkyl)、アリル(aryl)及びアセチル(acetyl)からなる群の一因であり;
Zはジメトキシトリフェニル(dimethoxy triphenyl(DMT))、モノメトキシトリフェヘニル(monomethoxy triphenyl(MMT))及びトリメトキシトリフェニル(trimethoxy triphenyl(TMT))からなる保護基であり;
R1はアルキル(alkyl)またはアリル(aryl)基であり;
R2はアルキル(alkyl)またはアリル(aryl)基であり;
R3はシアノエチル(cyanoethyl,)、アルキル(alkyl)またはアリル(aryl)基である;及び
Bは水素、またはアミン保護基のある各1級アミンで付加的に機能化するヌクレアーゼである。
ここで、
Yは酸素または硫黄であり;
Wは硫黄であり;
R4はベンゾイル(benzoyl)、アセチル(acetyl)またはジスルフィド(disulfide)であり;
Zはジメトキシトリフェニル(dimethoxy triphenyl(DMT))、モノメトキシトリフェヘニル(monomethoxy triphenyl(MMT))及びトリメトキシトリフェニル(trimethoxy triphenyl(TMT))からなる保護基であり;
R1はアルキル(alkyl)またはアリル(aryl)基であり;
R2はアルキル(alkyl)またはアリル(aryl)基であり;
R3はシアノエチル(cyanoethyl,)、アルキル(alkyl)またはアリル(aryl)基であり;及び
Bは水素、またはアミン保護基のある各1級アミンで付加的に機能化するヌクレアーゼである。
前記方法は以下の化合物を反応させるステップを含む。
ここで、
Bは水素、またはアミン保護基のある各1級アミンで付加的に機能化するヌクレアーゼであり;
nは0から98であり;
Yは酸素または硫黄であり;
Wは酸素、窒素、硫黄またはフッ素であり;
R4はTBDMSのようなシリルエーテル(silyl ether)、トリイソプロピルシリルオキシメチレン(triisopropylsilyl oxymethylene)、Fmoc、アルキル(alkyl)、アリル(aryl)またはアセチル(acetyl)であり;Wが硫黄の時
R4はベンゾイル(benzoyl)、アセチル(acetyl)またはジスルフィド(disulfide)であり;
ZはDMT、MMT、TMT保護基であり;
R1及びR2はアルキル(alkyl)またはアリル(aryl)基から独立して選択され;
R3はシアノエチル(cyanoethyl,)、アルキル(alkyl)またはアリル(aryl)基であり;及び
Mは水素ラジカル、Y−COであり;ここで、Yは固体支持体への付着に安定なリンカーである。
I.粗製のRNAは、リバースRNA合成(5´−3´)と比較して、従来の方法(3´−5´方向)において多くの不純物(N−1)を有する。したがって、精製後のリバースのRNA合成により合成されたRNAはより純粋である。
II.上述の特徴は、RNAの3’末端に付着したコレステロールの合成に顕著に見られる(図11対図12)。したがって、リバースRNA合成により合成された3’末端でのコレステロールとRNAを精製するのはより簡単である(図12参照)。
III.M+1不純物は、リバースのRNA合成方法により合成されたRNAに基本的に存在しない。オリゴヌクレオチドカップリングステップやオリゴヌクレオチド鎖伸張のカップリング時間において、分子中で、ribonucleoside-3'-DMT-2'-tBDsilyl-5'-phosphoramidites、3'- DMTは5-ethylthiotetrazoleや同様の活性剤により切断されないことを前提とする。
IV.従来の方法(3´→5´方向)による一般的にアクセス出来ない3’末端での巨大分子を含むRNAは、リバースRNA合成(5´→3´)による合成は容易である。これらのRNAは、高純度で生成される。
V.3’−PEG RNA(21塩基)が合成され、精製後は基本的に100%純粋であった(図16、17及び18参照)。
スキーム2に見られるようなN2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-guanosine-5'-cyanoethyl-N,N- diisopropyl-phosphoramidite(16d)
N2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-5'--benzoyl-guanosine(26d):
60mLのピリジン中に化合物23dの4g(7.0mmol)溶液のために、9.5g(28.0mmol)の塩化DMTが一部に室温で48時間添加された。反応混合物は、2mLの冷たいメタノールで急冷され、溶液の半分が減圧下で取り除かれ、20mLのクロロホルムで混合され、50mLの飽和重炭酸ナトリウムと50mLの塩水で洗浄された。有機層が分離され、無水Na2SO4上で乾燥させた。クロロホルム/ヘキサン/アセトン、5:2:3でのフラシュクロマトグラフィが1.7gの化合物26d(27.8%)を提供した。TLCシステム:クロロホルム/ヘキサン/アセトン、5:2:3、Rf=0.42、ESMS 896.1 [C48H55N5O9Si(M+Na)+が要求する896.1]。
196mLのピリジンと21mLのメタノール混合物中に化合物26dの14g(16.0mmol)溶液のために、16mLの2M塩化ナトリウム溶液(32.0mmol)が25分間で0〜5℃で攪拌しながら滴下して添加された。反応液は、15mLの2M塩酸で中和した。溶媒は減圧下で除去され、残りは、25mLのクロロホルムの2つの部分で抽出された。有機層は合されて、50mLの塩水で洗浄され、無水Na2SO4上で乾燥させた。クロロホルム/ヘキサン/アセトン、5:2:3でフラシュクロマトグラフィが10.4gの化合物27d(84.3%)を提供した。1H NMR(CDCl3/D2O)δ -0.54 (s, 3H), 0.01 (s, 3H), 088 (s, 9H), 1.21 (d, 3H, J=7.0 Hz), 1.23 (d, 3H, J=7.0), 2.66 (qq, IH, J=7.0), 2.89 (d, IH, J=12 Hz), 3.28 (s, IH), 3.37 (dd, IH, J5a,5b=15 Hz, J5>4=2.5Hz) 3.80 (s, 6H), 4.24 (d, IH, J=5 Hz), 4.83 (dd, IH, J2>i=8 Hz, J2,3=5 Hz), 5.97 (d, IH, J=8 Hz), 6.84 (dd, 4H, J=9 Hz, J=2 Hz), 7.23 (t, IH, J=7.5 Hz), 7.30 (t, 2H, J=7 Hz), 7.45 (m, 4H), 7.59 (d, 2H, J=7.5 Hz), 7.77 (s, IH). ESMS 792.8 [C41H51N5O8Si(M+Na)+が要求する792.9]。
104mLのアセトニトリル中に、10.4g(13.5mmol)の化合物27、3.4g(26.12mmol)のethylthiotetrazole、4.7mL(27mmol)のDIPEA及び1.08mL(13.5mmol)のN-methylimidazoleの溶液のために、8.4mL(26.12mmol)の2-cyanoethyl-N,N,N,N-tetraisopropylphosphaneを室温でAr下で攪拌しながら滴下して添加した。3時間後、反応混合物は100mLの酢酸エチルで希釈し、200mLの飽和重炭酸ナトリウム及び200mLの塩水で洗浄した。有機物層は分離され、無水Na2SO4上で乾燥させた。クロロホルム/ヘキサン/トリエチルアミン、7:2:1でのフラシュクロマトグラフィが12g(92.1%)の化合物16dを提供した。31P NMR(CDCl3)δ149.05 and 149.73. ESMS 993.3 [C50H68N7O9PSi (M+Na)+が要求する993.2]。
N4-Acetyl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-cytidine(27c):
54mLのピリジンと6mLのメタノール混合物中の5g(6.2mmol)の化合物26cの溶液のために、6.2mLの2M水酸化ナトリウム水溶液(12.4mmol)が25分間で0〜5℃で攪拌しながら滴下して添加された。反応液は、6mLの2M塩酸で中和した。溶媒は減圧下で除去され、残りは、15mLのクロロホルムの2つの部分で抽出された。有機層は合されて、50mLの塩水で洗浄され、無水Na2SO4上で乾燥させた。クロロホルム/ヘキサン/アセトン、5:2:3でフラシュクロマトグラフィが4gの化合物27c(91.9%)を提供した。1H NMR(CDCl3/D2O)δ 0.07 (s, 3H), 0.16 (s, 3H), 0.97 (s, 9H), 2.24 (s, 3H), 3.16 (br.d, IH, J5a,5b=12 Hz), 3.55 (br.d, IH, J5a,5b=12 Hz) 3.79 (s, 6H), 4.08 (t, IH, J=4.5 Hz), 4.44 (br.s., IH), 4.78 (br.s., IH), 5.61 (d, IH, J= 4.1), 6.80 (dd, 4H, J=7 Hz, J=3 Hz), 7.22 (t, IH, J=7.5 Hz), 7.27 (t, 2H, J=7 Hz), 7.38 (m, 4H), 7.52 (d, 2H, J=7.3 Hz), 8.08 (br.s, IH). ESMS 724.8 [C38H47N3O8Si (M+Na)+が要求する724.3]。
N2-Isobutyryl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-guanosine-5'-cyanoethyl-N,N'-diisopropyl-phosphoramidite(16d)と同じように調製された。収率は62.6%である。31P NMR(CDCl3)δ149.1 and 149.5. ESMS 925.0 [C47H64N5O9PSi (M+Na)+が要求する924.4]。
2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-Uridine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite(16k)
2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-Uridine(27k):
450mLのピリジンと45mLのメタノール混合物中の30g(39.3mmol)溶液のために、40mLの2M水酸化ナトリウム水溶液(80.0mmol)が25分間で0〜5℃で攪拌しながら滴下して添加された。反応液は、40mLの2M塩酸で中和した。溶媒は減圧下で除去され、残りは、50mLのクロロホルムの2つの部分で抽出された。有機層は合されて、50mLの塩水で洗浄され、無水Na2SO4上で乾燥させた。クロロホルム/ヘキサン/アセトン、6.5:2:1.5でフラシュクロマトグラフィが24gの化合物9k(92.5%)を提供した。1H NMR(CDCl3)δ 0.06 (s, 3H), 0.14 (s, 3H), 0.97 (s, 9H), 2.12 (br.d, IH, J=4 Hz), 3.16 (br.dd, IH, J5a,5b=12.7 Hz, J5a4=7.6 Hz), 3.55 (br.d, IH, J5a>5b=12.7 Hz J5b4=4.3 Hz) 3.65- 3-64 (m, IH) 3.79 (s, 6H), 4.07 (t, IH, J=4.3 Hz), 4.28 (t, IH, J=4.3 Hz), 5.66 (d, IH, J=4.9 Hz), 5.69 (d, IH, J= 8.1 Hz), 6.82 (dd, 4H, J=7 Hz, J=3 Hz), 7.22 (t, IH, J=7.5 Hz), 7.28 (t, 2H, J=7 Hz), 7.38 (d, 4H, J=8.9 Hz), 7.54 (d, 2H, J=8.8 Hz), 7.68 (d, IH, J=8.2), 8.74 (br.s, IH). ESMS [C36H44N2O8Si (M+Na)+が要求する683.3].
190mLのTHF中の24.0g(36.4mmol)化合物27k、24mL(182mmol)のcollidine、2.88mLのN-methylimidazole溶液のために、16.22mL(72.8mmol)の2-cyanoethyl-N,N, diisopropylphosphonamidic chlorideを室温で、Ar下で攪拌しながら滴下して添加した。1.25時間後、反応混合物は100mLの酢酸エチルで希釈し、200mLの飽和重炭酸ナトリウム及び200mLの塩水で洗浄した。有機物層は分離され、20gの無水Na2SO4上で乾燥させた。酢酸エチル/ヘキサン/トリエチルアミン、5:4:1でのフラシュクロマトグラフィが18g(80.0%)の化合物16kを提供した。31P NMR(CDCl3)δ148.9 and 149.6. ESMS 884.1 [C45H61N4O9PSi (M+Na)+が要求する884.0]。
N4-Benzoyl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-adenosine-5'-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidite(16a)
N4-Benzoyl-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-adenosine(27a):
189mLのピリジンと21mLのメタノール混合物中の14g(15.7mmol)の化合物26aの溶液のために、15.7mLの2M水酸化ナトリウム水溶液(31.4mmol)が25分間で0〜5℃で攪拌しながら滴下して添加された。反応液は、12mLの2M塩酸で中和した。溶媒は減圧下で除去され、残りは、15mLのクロロホルムの2つの部分で抽出された。有機層は合されて、50mLの塩水で洗浄され、無水Na2SO4上で乾燥させた。クロロホルム/ヘキサン/アセトン、6.5:2:1.5でフラシュクロマトグラフィが11.0gの化合物27a(88.9%)を提供した。収量は%である。1H NMR(CDCl3/H2O)δ -0.75 (s, 3H), -0.01 (s, 3H), 0.86 (s, 9H), 3.03 (t, IH, J5a,5b=12.8 Hz), 3.29 (s, IH), 3.47 (br.d, IH, J5a,5b=12.8 Hz) 3.80 (s, 6H), 4.35 (d, IH, J=4.9 Hz), 5.17 (dd, IH, J=8 Hz, J=5 Hz), 5.93 (dd, IH, J= 12 Hz, J=2 Hz), 6.15 (d, IH, J=8 Hz), 6.85 (dd, 4H, J=7 Hz, J=3 Hz), 7.23 (t, IH, J=7.5 Hz), 7.30 (t, 2H, J=7 Hz), 7.48 (m, 4H), 7.52 (t, 2H, J=7.3 Hz), 7.62 (d, 3H, J=7.5 Hz), 8.03 (d, 2H, J=7.5 Hz), 8.14 (s, IH), 8.77 (s, IH), 9.07 (s, IH). ESMS [C44H49N5O7Si (M+Na)+が要求する787.3]。
88mLの蒸留したTHF中の11.0g(12.0mmol)の化合物27a、9.2mL(60.0mmol)のcollidine、1.1mLのN-methylimidazole溶液のために、6.23mL(24.0mmol)の2-cyanoethyl-N,N diisopropylphosphonamidic chlorideを室温で、Ar下で攪拌しながら滴下して添加した。1.25時間後、反応混合物は50mLの酢酸エチルで希釈し、100mLの飽和重炭酸ナトリウム及び100mLの塩水で洗浄した。有機物層は分離され、10gの無水Na2SO4上で乾燥させた。酢酸エチル/ヘキサン/トリエチルアミン、5:4:1でのフラシュクロマトグラフィが9.0g(77.7%)の化合物16aを提供した。31P NMR(CDCl3)δ143.97 and 144.14. ESMS 987.2 [C53H66N7O8PSi (M+Na)+が要求する987.45]。
2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-uridine-5'-succinyl-CPGの合成
2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-Uridine-5'-succinate:
20mLのピリジン中の2.0g(3.03mmol)の化合物27k及び0.11g(0.91mmol)の溶液のために、37℃で攪拌しながら0.9g(9.1mmol)無水コハク酸が添加された。12時間後、反応混合物は30mLのクロロホルムで希釈し、50mLの塩水で洗浄した。有機物層は分離され、無水Na2SO4上で乾燥させた。クロロホルム/ヘキサン/アセトン/ピリジン/メタノール、5:3:2:0.01:0.05でのフラシュクロマトグラフィが1.8g(75.9%)の2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-uridine-5'-succinateを提供した。1H NMR(CDCl3/H2O)δ 0.05 (s, 3H), 0.07 (s, 3H), 0.96 (s, 9H), 2.21 (dt, IH, J=17 Hz, J=6 Hz), 2.40-2.46 (m, IH), 2.51 (dt, IH, J=17 Hz, J=6 Hz), 2.60-2.66 (m, IH), 3.42 (t, IH, J=3.3 Hz), 3.77 (s, 6H), 3.95-3.98 (m, 2 H), 4.11 (br.d, IH, J=12.8 Hz), 4.16 (m, IH), 5.72 (d, IH, J=2.8 Hz), 5.74 (d, IH, J= 8.1 Hz), 6.79 (dd, 4H, J=9 Hz, J=I.9 Hz), 7.21 (t, IH, J=7 Hz), 7.25 (t, 2H, J=7 Hz), 7.38 (d, 4H, J=8.9 Hz), 7.48 (d, 2H, J=7.2 Hz), 7.61 (d, IH, J=8.2 Hz), 7.72 (t, IH, J=5.9 Hz), 8.61 (br.d, IH, J=4.4 Hz). ESMS 784.2 [C40H48N2O11Si (M+Na)+が要求する783.9]。
60mLのDMF中の18gのamino-lcca-CPG及び3.6mLのtriethylamineの懸濁液のために、4mLのDMF中に1.8g(2.3mmol)のO-TBDMS-3'-O-DMT-uridine-5'-succinate、0.408g(3.55mmol)のN-hydroxysuccinimide及び0.586g(2.76mmol)のDCCの溶液を添加した。反応混合物は37℃に加温された。16時間後、CPGが濾過され、3×20mLの部分のアセトニトリルで洗浄し、ピリジン/N-methylimidazole混合物中の無水酢酸で覆われ、3×20mLの部分のアセトニトリルで洗浄した。固体支持体は減圧下で乾燥され、ヌクレオシドのロードはDMT除去工程により測定され、44.2μmol/gのロードで18gの最終生成物を得た。
続くオリゴヌクレオチド(表5)が1μmolスケールで3´→5´方向の標準RNAホスホラミダイト試薬を用いて合成された。合成は、標準RNA 1μmolを用いてExpedite 8900合成装置で実施された。
1.コレステロール、C−18等の長鎖脂肪族化合物、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコールのようなRNAの3’末端での大きな分子の付着用。
これらのアミダイトとの直接カップリングが容易に達成される。
2.RNA分子の3’末端でのPEG2000アミダイト及びPEG4000アミダイトのようなポリエチレングリコールの付着。
3.3’−チオール修飾の簡単な付着用。容易に用いられるアミダイト、viz、C−3ジスルフィド、C−6ジスルフィドからの3’−ジスルフィド。
4.この目的のためにビオチンCPGを防ぎ、1ステップのビオチンアミダイトを介した3’−ビオチン付着。
5.siRNAのセンス鎖の3’末端の修飾。アンチセンスsiRNA鎖が標的認識を導くように、siRNAのセンス鎖(3’末端)の突出部が標的のmRNA複合体に影響することが予想される。siRNAの運搬の改善のための便利な修飾が容易に設計可能である。
ここで、
Yは酸素または硫黄であり;
Wは酸素、窒素、硫黄及びフッ素であり;
R4はTBDMS、トリイソプロピニルシリルオキシメチレンFmoc、アルキル、アリル及びアセチルのようなシリルエーテルであり;;Wが硫黄の時、R4はベンゾイル、アセチルまたはジスルフィドであり;
ZはDMT、MMT及びTMT保護基であり;
R1及びR2はアルキルまたはアリル基から独立して選択され;
R3はシアノエチル、アルキルまたはアリル基である。
ここで、
Mは水素ラジカル、Y−COであり;
Yは2〜20の長さの原子の鎖であり、基本的に炭化水素鎖からなり、酸素、窒素及び硫黄からなる群から独立して選択された追加的に1つ以上のヘテロ原子により置換され、CPG、ポリスチレンまたはオリゴヌクレオチド合成に適した他のいずれかの固体支持体のような、固体支持体への付着に安定なリンカーであり;
Wは酸素、窒素、硫黄またはフッ素であり;
RはTBDMSのようなシリルエーテル、トリイソプロピルシリルオキシメチレン、Fmoc、アルキル(alkyl)、アリルまたはアセチルであり、Wが硫黄の時、Rはベンゾイル、アセチルまたはジスルフィドであり;
ZはDMT、MMT、TMT保護基である。
ここで、Lはビオチンまたはコレステロール、または蛍光プローブ、消光染料、ポリエチレングリコール、及びペプチドからなる群から選ばれるような修飾
Claims (2)
- 式1のホスホラミダイトであって、
ここで、
Yは酸素または硫黄であり;
Wは酸素であり;
R4は三級ブチルジメチルシリル(TBDMS)、トリイソプロピニルシリルオキシメチレン、フルオレニルオキシカルボニル(Fmoc)、アルキル、アリル及びアセチルからなる群の一員であり;
Zはジメトキシトリフェニル(DMT)、モノメトキシトリフェニル(MMT)及びトリメトキシトリフェニル(TMT)からなる保護基であり;
R1はアルキルまたはアリル基であり;
R2はアルキルまたはアリル基であり;
R3はシアノエチル、アルキルまたはアリル基である;及び
Bは水素、またはアミン保護基のある各アミンで付加的に機能化する核酸塩基であり、前記核酸塩基は、adenine、guanine、cytosine、thymine、uricil、A(N-Bz)、A(N-Ac)、A(N-tBPac)、A(N-Pac)、C(N-Bz)、C(N-Ac)、C(N-tBPac)、C(N-Pac)、G(N-iBu)、G(N-Ac)、G(N-tBPac)、G(N-Pac)からなる群から選択されるホスホラミダイト。 - 以下から選択された構造式によって表されるRNAオリゴマーの合成のための5’から3’方向に対する結合形成によるオリゴヌクレオチドを調製する方法であって、
前記方法は以下の化合物を反応させるステップを含み、
ここで、
Bは水素、またはアミン保護基のある各アミンで付加的に機能化する核酸塩基であり、前記核酸塩基は、adenine、guanine、cytosine、thymine、uricil、A(N-Bz)、A(N-Ac)、A(N-tBPac)、A(N-Pac)、C(N-Bz)、C(N-Ac)、C(N-tBPac)、C(N-Pac)、G(N-iBu)、G(N-Ac)、G(N-tBPac)、G(N-Pac)からなる群から選択され;
nは0から98であり;
Yは酸素または硫黄であり;
Wは酸素であり;
R4は三級ブチルジメチルシリル(TBDMS)、トリイソプロピルシリルオキシメチレン、フルオレニルオキシカルボニル(Fmoc)、アルキル、アリルまたはアセチルであり;
Zはジメトキシトリフェニル(DMT)、モノメトキシトリフェニル(MMT)、トリメトキシトリフェニル(TMT)からなる保護基であり;
R1及びR2はアルキルまたはアリル基から独立して選択され;
R3はシアノエチル、アルキルまたはアリル基であり;及び
Mは水素ラジカル、Y−CO−であり;ここで、Yは固体支持体への付着に安定なリンカーである方法。
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