KR101718406B1 - 역방향 합성 ｒｎａ용 ｒｎａ 합성-포스포라미디트, 및 리간드, 크로모포어의 용이한 도입, 및 합성 ｒｎａ 3´-말단에서의 변형에서의 적용 - Google Patents

역방향 합성 ｒｎａ용 ｒｎａ 합성-포스포라미디트, 및 리간드, 크로모포어의 용이한 도입, 및 합성 ｒｎａ 3´-말단에서의 변형에서의 적용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 새로운 포스포라미디트에 관한 것으로, A-n-bz, C-n-bz, C-n-ac, G-n-ac 및 U가 98%를 초과하는 HPLC 순도 및 99%를 초과하는 31P NMR 순도로 제조된다. RNA 올리고머의 역 5'→3' 방향 합성의 새로운 방법을 개발하고 기술하였다. 상기 방법의 사용은 99%에 근접하는 커플링 효능을 갖는 고품질의 RNA 합성을 가능하게 하는 것으로 실증되었다.

Description

역방향 합성 ＲＮＡ용 ＲＮＡ 합성-포스포라미디트, 및 리간드, 크로모포어의 용이한 도입, 및 합성 ＲＮＡ 3´-말단에서의 변형에서의 적용{RNA SYNTHESIS PHOSPHORAMIDITES FOR SYNTHETIC RNA IN THE REVERSE DIRECTION, AND APPLICATION IN CONVENIENT INTRODUCTION OF LIGANDS, CHROMOPHORES AND MODIFICATIONS OF SYNTHETIC RNA AT THE 3´-END}
본 발명은 2008년 9월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 61/191,065에 대해 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참고 문헌으로 편입된다.
본 발명은 새로운 RNA 모노머 포스포라미디트 및 역 5' → 3' 방향의 새로운 RNA 올리고뉴클레오티드 합성 방법에 적절한 이에 상응하는 고체 지지체에 관한 것이다. 이러한 접근은 고순도로 치료용 등급(therapeutic grade)의 RNA 올리고뉴클레오티드의 생산을 가능하게 하기 위해 3'-말단에서의 다양한 변형의 정확하고 효과적인 도입을 가능하게 하는 매우 정확한 올리고뉴클레오티드 합성을 유도할 수 있다.
3'→5' 방향의 정의된 서열의 RNA 합성은 현재 매우 잘 확립되어 있고 방대하게 다양한 치료용 등급의 RNA 앱타머, tRNAs, siRNA 및 생물학적으로 활성인 RNA 분자의 합성 및 발달에 사용되고 있다.
이러한 접근은 적절한 N-보호그룹: 일반적으로 5'-보호 그룹, 가장 대중적인 것은 디메톡시트리페닐, 즉 DMT 그룹; 2'-보호 그룹, 이 중 가장 대중적인 것은 t-부틸디메틸실릴 에테르; 및 3'-포스포라미디트, 이 중 가장 대중적인 것은 시아노에틸 디이소프로필을 갖는 리보뉴클레오시드를 이용한다(성분 1). 상기 성분은 그 후 적절한 N-보호 그룹, 고체 지지체에 부착된 리보뉴클레오시드의 2' 또는 3' 숙시네이트를 갖는 뉴클레오시드와 결합한다(성분 2). 성분 1 및 5'-OH-n-보호된-2',3'-보호된-뉴클레오시드(성분 3)의 커플링(coupling)이 또한 다이머 및 올리고리보뉴클레오티드를 유도하는 활성인자(activator)의 존재 하의 용액에서 획득되며, 후속적으로 산화(3'→5' 방향 합성) 또한 3',5'-인터뉴클레오티드 연결을 갖는 보호된 디뉴클레오티드를 유도한다, Ogilvie, K.K., Can. J. Chem., 58, 2686, 1980 (스킴 1).
그러나, 역 방향(5' → 3' 방향)에서의 RNA 합성은 지급까지 획득된 바 없었다.
상기 성분 1의 2'-실릴 에테르가 광범위하게 개발되었고 이들은 현저하게 안정성을 갖는 것으로 알려졌다. 실릴 에테르의 가용매분해(Solvolysis)가 광범위하게 연구되었고 벌키한 알킬 실릴 에테르가 높은 정도의 안정성을 갖는 것으로 알려졌다; Bazani, B and Chvalowski, V Chemistry of organosilicon compounds, Vol. 1, Academic Press, New York, 1965. 올리고 리보뉴클레오티드 합성을 위한 2'-히드록시 보호 그룹으로서 광범위한 연구 작업이 Ogilvie 및 그 동료들에 의해 후속적으로 이루어졌다(Ogilvie, K.K., Sadana, K.L, Thompson, E.A., Quilliam, M.A., and Westmore, J.B tetrahedron Letters, 15, 2861-2864, 1974; Ogilvie, K.K., Beaucage, S.L, Entwistle, D.W., Thompson, E.A., Quilliam, M.A., and Westmore, J.B. J. Carbohydrate nucledosides Nucleotides, 3, 197-227, 1976　; Ogilvie, K.K. Proceedings of the 5th International Round Table on nucledosides, Nucleotides and Their Biological Applications, Rideout, J.L., Henry , D.W., and Beacham L.M., III, eds., Academic, London, pp. 209-256,1983).
이러한 연구들은 후속적으로 용액 상 및 고체 상 올리고뉴클레오티드 합성 모두를 처리할 수 있는 방법의 연속적인 개발, 및 tRNA의 크기 및 특성의 RNA 분자의 최초의 화학적 합성을 유도하였다(Usman, N., Ogilvie, K.K., Jiang, M.-Y., and Cedergren, R.J. J. Am . Chem . Soc. 109, 7845-7854, 1987; Ogilvie, K.K., Usman, N., Nicoghosian, K, and Cedergren, R.J. Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 85, 5764-5768, 1988　; Bratty, J., Wu, T., Nicoghosian, K., Ogilvie, K.K., Perrault, J.-P., Keith, G. and Cedergren, R., FEBS Lett. 269, 60-64, 1990). 상기 문헌은 후속적인 우수한 발행물을 상세하게 검토하였다:　Gait, M.J., Pritchard, C. and Slim, G., nucledosides and Their Analogs: A Practical Approach (Gait, M.J., ed.), Oxford University Press Oxford, England, pp 25-48, 1991. RNA 합성을 위해 최근에 이용된 다른 보호 그룹은 다음과 같다: 비스( 2-아세톡시에틸-옥시)메틸(ACE), Scaringe, S.A., Wincott, F.E., Caruthers, M.H., J. Am. Chem. Soc., 120: 11820-11821, 1998; 트리이소프로필실릴옥시 메틸(TOM), Pitsch, S., Weiss, P.A., Jenny, L., Stutz, A., Wu, X., Helv. Chim. Acta. 84, 3773-3795, 2001 및 t-부틸디디티오메틸(DTM)(구조 1), Semenyuk, A., Foldesi, A., Johansson, T., Estmer-Nilsson , C., Blomgren, P., Brannvall, M., Kirsebom, L.A., Kwiatkowski, M., J.Am. Chem. Soc., 128: 12356-12357, 2006 이 도입되었다. 그러나, 이러한 공정 중 어느 것도 역방향 RNA 합성의 수행을 처리할 수 없었고(5' → 3' 방향); 따라서 이들은 역방향 합성을 통해 획득할 수 있는 많은 리간드 및 크로모포어를 RNA 분자의 3'-말단에 편리하고 효과적으로 도입할 수 있는 능력이 결여되어 있다.
변형된 아라비노 당(sugar)을 갖는 화학적으로 변형된(modified) RNA, 2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D_아라비노핵산(arabinonucleic acid)(FANA; 구조 2) 및 2'-데옥시-4'-티오-2'-플루오로-베타-D_아라비노핵산(4'-티오-FANA; 구조 3)을 siRMA 활성을 위한 서열로 합성하였다, Dowler, T., Bergeron, D., Tedeschi, Anna-Lisa, Paquet, L., Ferrari, N., Damha, M.J., Nucl. Acids Res., 34, 1669-1675, 2006. 상기 새로운 2'-보호기 중에서 이를 위한 화학적 성질이 개발되었고, 상기 2'-보호 2-시아노에톡시메틸(CEM) (구조 4)는 매우 긴 RNA를 제조하는 것으로 나타났으나, 이는 통상적인 RNA 합성, 즉 3' → 5' 방향의 합성을 수행한다. 나아가, 이러한 공정에 의해 제조된 상기 RNA의 품질은 의문으로 남겨진다.
Figure 112011025090473-pct00001
(2'- DTM -RNA 아미디트(amidites))
구조 (1)
Figure 112011025090473-pct00002
Figure 112011025090473-pct00003
구조 (2) 구조 (3) 2'- F-ANA 변형된 포스포라미디트 4'-티오-2'-F-ANA 변형된 포스포라미디트
Figure 112011025090473-pct00004
구조 (4)
2'- CEM 보호된 RNA 중간체
T7 RNA 폴리머라제(polymerase)에 의한 시험관(in vitro)전사와 같은 합성의 비능률 및 스케일의 제한을 피할 수 있기 때문에 RNA의 화학적 합성이 바람직하다, Helm, M., Brule, H., Giege, R., Fl또는ence, C., RNA, 5:618-621, 1999. RNA의 화학적 합성은 RNA 구조 및 기능의 연구를 위해서도 바람직하며, 작용 그룹의 위치 특이적(site specific) 도입과 같은 다양한 유용한 변형이 선택적으로 획득될 수 있다; viz., disulphide cross linking as a probe of RNA tertiary structures, Maglott, E.J., Glick, G.D., Nucl. Acids Res., 26: 1301-1308, 1999.
긴 RNA의 합성은 tRNA와 같이 생물학적으로 활성인 분자에 있어서 매우 중요하고, 이러한 합성이 획득되었다; Persson, T., Kutzke, U., Busch, S., Held, R., Harmann, R.K., Bioorgan. Med. Chem., 9:51-56, 2001; Oglvie, K.K., Usman, N., Nicoghosian, K., Cedrgren, R.J., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:5764-5768, 1988; Bratty, J., Wu, T., Nicoghosian, K., Ogilvie, K.K., Perreault, J.-P., Keith, G., Cedergren, R.J., F.E.B.S. Lett., 269:60-64 , 1990; Gasparutto, D., Livache, T., Bazin, H., Duplaa, A.M., Guy, A., Khorlin, A., Molko, D., Roget, A., Teoule, R., Nucl. Acids. Res., 20:5159-5166, 1992; Goodwin, J.T., Stanick, W.A., Glick, G.D., J.또는g. Chem., 59:7941-7943, 1994. 상기 본 문단에 언급된 어떠한 기술도 그러나 역 방향(5' → 3' 방향)의 RNA 합성을 고려하지 않고, 따라서 3'- 말단의 선택적인 도입을 위한 많은 그룹의 실현 및 편리한 도입은 어려움으로 남는다.
본 발명은 본 발명의 역 RNA 아미디트(amidites)를 이용한 자동화된 올리고 합성이 이루어지는 동안 각 단계 당 보다 높은 결합 효율을 관찰하였으며, 보다 높은 순도를 획득하고 매우 긴 올리고를 제조하기 위한 보다 큰 능력의 결과를 가져왔다. 이들은 또한 본 발명은 M+1 종(species)이 없는 올리고뉴클레오티드를 유도하는 것을 실증하며, 상기 종은 HPLC 분석 또는 정제 또는 젤 정제하는 동안 바라는 피크의 어깨와 같은 근거리(closer) 불순물을 유발하는 것이다.
리보뉴클레오시드의 2'-히드록실 상의 상기 t-부틸디메틸 실릴 보호 그룹은 3'-포스포라미디트를 제조하고 이들을 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용하기 위해 선택한 그룹이었으며, 이는 3'-히드록실 위치로 오히려 쉽게 이동하는 것으로 나타났다. 이는 충분하고 상세하게 문서화되었다(Ogilvie, K.K., and Entwistle, D.W. Carbohydrate Res., 89, 203-210, 1981; Wu, T., and Ogilvie, K.K. J. org . Chem., 55, 4717-4734, 1990). 이러한 이동은 바라는 포스포라미디트의 합성을 복잡하게 하고 대응하는 이성질체를 정확히 분석하고 최종 모노머의 어떠한 오염을 방제하는 효율적인 정제 방법을 필요로 한다.
본 발명은 고순도의 RNA 합성에 관한 것으로, 특히 선택된 그룹을 합성된 RNA의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 도입하는 것이다. 이러한 RNA는 치료, 진단, 의약 디자인 및 세포 내 환경에서 RNA 서열의 선택적인 억제, 세포 내에 존재하는 상이한 타입의 RNA의 작용 차단에 있어서 방대한 적용을 갖는다.
핵산에 기초한 분자를 이용한 mRNA 수준에서의 유전자 발현의 침묵(Silencing)은 흥미로운 접근이며 이는 선택적인 유전자 억제에 대한 큰 잠재력은 제공하고 다양한 생화학적 및 약학적 공정의 조절 및 관리에 있어서의 적용에 대한 큰 가능성을 보여준다. Fire etal.에 의한 초기 연구, Fire, A., Xu, S., Montgomery, M.K., Kostas, S.A., Driver, S.E., and Mello, C.C, Nature, 391, 806-811, 1998,는 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 내 RNA 개입(interference)이 21 및 22 뉴클레오티드 RNA 서열에 의해 매개되는 것을 보여주었다. 이는 나아가 21 및 22 뉴클레오티드 RNA에 의해 매개되는 작은 이중 가닥 RNA에 의한 유전자 발현의 특이적인 억제의 일반적인 현상으로 확실해졌다, Genes Dev., 15, 188-200, 2001. Capie, N.J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., and Morgan , R.A.에 의해 병행된 연구는 무척추동물 및 척추동물에서 작은 이중 가닥 (dS) RNA에 의한 특이적인 유전자 발현의 이러한 유사한 현상을 확인하였다. 후속적으로 방대한 양의 연구가 상기 연구의 확증을 이끌었으며 RNAi를 선택적인, 그리고 매우 특이적인 유전자 억제 및 조절을 위한 강력한 도구로서 확립하였다; Nishikura, K., Cell, 107, 415-418, 2001; Nykanen, A., Haley, B., Zamore, P.D., Cell, 107, 309-321, 2001; Tuschl, T., Nat. Biotechnol., 20, 446-448, 2002; Mittal, V., Nature Rev., 5, 355-365, 2004; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 6047-6052, 2002; Donze, O. & Picard, D., Nucl. Acids. Res., 30, e46,2002; Sui, G.,Soohoo, C., Affar el, B., Gay, F., Shi, Y., Forrester, W.c., and Shi, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5515-5520, 2002; Paddison, P.J.,Caudy, A.A., Bernstein, E., Hannon, G.J.; and Conklin, D.S., Genes Dev., 16, 948-959, 2002.
자연발생적인 이중가닥(ds) RNA 서열 외에도, 화학적으로 변형된(modified) RNA가 2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노핵산(FANA)을 이용한 포유류 세포에서 siRNA 활성을 위한 서열 내로의 유사한 혹은 향상된 RNA 간섭을 유발하는 것으로 나타났다, Dowler, T., Bergeron, D., Tedeschi, Anna-Lisa, Paquet, L., Ferrari, N., Damha, M.J., Nucl. Acids Res., 34, 1669-1675, 2006.
siRNA 특성의 향상을 위한 다양한 다른 변형이 추구되었으며, 이는 백본(backbone)의 화학적 성질의 변화인 2'-당 변형 및 염기(핵염기) 변형을 포함하며, 이들 중 일부가 최근 검토되었다; Nawrot, B, and Sipa, K., Curr. Top. Med. Chem., 6,913-925, 2006; Manoharan, M. Curr. Opin. Chem. Biol., 8, 570-579, 2004. 상기 siRNA의 PS 변형은 잘 용인되었지만(tolerated), 일부 보고는 증가된 독성 및 어느 정도 감소된 효능을 나타냈다; Harborth, J., Elbasir, S.M., Vandenburgh, K., Manninga, H., Scaringe, S.A., Weber, K., Tuschl, T., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 13, 83-105, 2003. 이 중에는 2'-O-메틸 변형이 있으나, 이는 A 형(RNA 유사) 헬릭스를 유지하고, 서열 내 이러한 변형의 수에 의존하여 siRNA 활성을 유지하거나 감소시키는 것으로 나타났다, Chiu, Y.L., Rana, T.M., RNA, 9, 1034-1048, 2003. 또한 서열의 많은 2'-O-메틸 변형이 센스(sense) 가닥 내에 siRNA 활성의 손실 없이 만들어질 수 있는 것으로 나타났다, Kraynack,B.A., Baker, B.F., RNA, 12, 163-176, 2006.
siRNA 서열의 중심 영역이 회피되는 경우, 특히 높은 결합 친화성을 수여하는 바이시클릭 잠금 핵산(LNA's)이 또한 siRNA 서열 내로 도입되었다, Braash, D.A., Jensen, S., Liu, Y., Kaur, K., Arar, K., White, M.A., and Corey , D.R., Biochemistry, 42, 7967-7995, 2003. 유사하게 알트리톨(altritol) 당 변형된 올리고 뉴클레오티드(ANA)가 최근 보고되었다. 알트리톨 당은 단단한 형태(rigid conformation)를 제공하고 서열 내에서 특이적인 방식으로 RNA와 함께 매우 안정한 듀플렉스(duplexes)를 형성하는 것으로 나타났으며, 나아가 A(RNA 형) 형태에 머무르는 것으로 나타났다. MDR1 유전자를 표적으로 하는 ANA 변형된 siRNAs는 변형되지 않은 대조구와 비교할 때 향상된 효능을 나타내는 것으로 나타났으며, 특히 이러한 변형은 센스 혹은 안티센스 가닥의 3'- 말단에 가까운 경우에 효과적이다; Fisher, M., Abramov, M., Aerschot, A.V., Xu, D., Juliano, R.L., Herdewijn, P., Nucl. Acids Res.,35, 1064-1074, 2007.
효과적인 RNA 간섭(interference)이 일어나기 위한 다양한 요건 중, 수많은 관찰 및 사실들이 확립되었다. 따라서, 상기 RNA는 표적과 동일한 영역 내에서 이중 가닥(ds)이어야 한다. 화학적 요건으로는, 트리포스페이트로 변환될 수 있는 5'-말단의 능력 외에, A, C, G의 변형이 간섭 활성과 완전히 호환될 수 있는 것(compatible)이어야 하는 것으로 발견되었다. 2'-플루오로, 2'-아미노 우라실, 2'-데옥시 티미딘, 및 2'-데옥시싸이티딘과 같은 RNA의 백본 변형이 상기 변형된 RNA를 결과 이중 가닥 내에서 안정화하는 것으로 나타났다. 상기 뉴클레오시드 염기 변형 중 5- 브로모우라실, 4- 티오우라실, 5-이오도우라실, 5-( 3-아미노알릴)- 우라실, 이노신이 상기 RNA 간섭 복합체(RNAi & RISC complex) 내에 쉽게 편입되었다. 유사하게 이노신은 구아노신으로 대체될 수 있다.
콜레스테롤-컨쥬게이트(conjugated) siRNA는 세포 내로의 전달을 획득하여 유전자의 발현을 침묵하게(silence) 할 수 있는 것으로 나타났다. 나아가, 지질(lipid) 컨쥬게이트 siRNA, 담즙산, 및 긴사슬 지방산은 인비보(in vivo)에서 세포 내로의 RNA 흡수(uptake) 및 유전자 발현의 침묵을 매개할 수 있는 것으로 나타났다. 조직 내에서 효과적이고 선택적인 siRNA 컨쥬게이트의 흡수는 리포단백질(lipoprotein) 입자와의 최대 연관(association), 리포단백질/수용체 상호작용 및 막관통 단백질 매개 흡수에 의존한다. 높은 밀도의 리포단백질은 siRNA의 간, 내장(gut), 신장 및 스테로이드 함유 기관 내로의 전달을 지시하는 것으로 나타났다. 나아가 LDL은 siRNA를 주로 간으로 지시하고 LDL 수용체는 siRNA의 전달에 관여하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 의약의 발달에 이용될 수 있는 적절한 전달 시스템에 의한 siRNA 흡수에 대한 큰 가능성을 보여준다.(Article by Marcus Stoffel, OTS, 2007, p.64.)
siRNA는 뉴클레아제 분해, 염증 폐지(abrogate), 표적 유전자 침묵의 감소(reduce off)에 대해 보호되기 위해 화학적 변형으로 디자인될 수 있고, 그에 따라 표적 유전자에 대한 효과를 향상시킬 수 있는 것으로 제안되었다. 세포(cellular) 흡수의 향상을 가능하게 하는 지질 및 다른 친유성 분자의 전달 운반체(vehicles) 또는 컨쥬게이트(conjugates)는 치료적 발달에 필수적이다. 이러한 siRNA는 현재 인간 표적 검증(validation)을 위해 발전되고 있으며, 질병의 경로를 간섭하고 의약 발달에 대하 새로운 한계를 발달시킨다. Alan Sachs, Merck, Oligonucleotide Therapeutics Conference (OTS), page 80, 2007.
siRNA의 센스 가닥의 3'-말단은 변형될 수 있고 변형을 용인할 수 있는 것으로 나타났고, 다수의 주요 문헌에 상세하게 나타난 바와 같이 리간드의 부착이 이러한 말단(도 1 및 2)에서 가장 적절하다; RNAi 내에서 siRNA의 작용: a chemical modification, Ya-Lin Chiu and Tariq Rana, RNA, 9, 1034-1048, 2003; M. Manoharan, Curr. Opin. Chem.Biol, 6, 570-579,2004; Nawrot, B. and Sipa, K., Curr.Top.Med. Chem., 6, 913-925, 2006; Scaringe, S., Marshall, W.S., Khvorova, A., Naty. Biotechnol., 22, 326-30, 2004.
Figure 112011025090473-pct00005
<---안티센스 가닥
5'-안티센스 가닥
다이어그램(1). (siRNA 듀플렉스)
Figure 112011025090473-pct00006
다이어그램(2). (안티센스 가닥에 상보적인 m-RNA)
친유성 또는 친수성 기의 도입 및 siRNA 전달의 향상 및 표적의 최적화가 바이오-컨쥬게이션(bio-conjugation)을 통해 다루어졌고 획득되었다(다이어그램 1). 일반적으로 상기 부착은 바람직하게는 센스 가닥의 3'-말단에서 이루어지고, 때때로 안티센스 가닥의 3'-말단에서 이루어진다. 뉴클레아제 내성 siRNA의 디자인은 효과적인 치료법을 개발하기 위한 치열한 연구 및 최근의 개발의 주제였다. 따라서, 2-티오우리딘, 슈도우리딘, 디하이드로우리딘과 같은 염기 변형은 RNA 분자의 형태(conformations)에 대한 영향과 관련된 생물학적 활성을 나타내었다; Sipa, K., Sochacka, E., Kazmierczak-Baranska, J., Maszewska, M., Janicka, M., Nowak, G., Nawrot, B., RNA, 13, 1301-1316, 2007. 2'-변형된 RNA, 특히 2'-플루오로는 뉴클레아제에 대해 우수한 내성을 가지며 인비보에서 생물학적으로 활성인 것으로 나타났다, Layzer, J.M., McCaffrey, A.P., Tanner, A.K., Huang, Z., Kay, M.A., and Sullenger, B.A., RNA, 10, 766-771, 2004. 2'-O-alkyl-modification , such as 2'-Omethyl's and 2'-O-MOE, Prakash, S., Allerson, CV.R., Dande,P., Vickers, T.A., Siofi, T.A., Jarres, R., Baker, B.F., Swayze, E.E., Griffey, R.H., and Bhat, B., J.Med. Chem., 48, 4247, 4253, 2005. 동일한 저자는 siRNA 특성의 개선 및 RNAi 향상을 위해 4'-티오 변형된 당 뉴클레오시드를 2'-O 알킬 변형과 조합으로 사용하였다, Dande, P., Prakas, T.P., Sioufi, N., Gaus, H., Jarres, R., Berdeja, A., Swayne, E.E., Griffey, R.H., Bhat, B.K, J. Med. Chem., 49, 1624-1634, 2006. 인터뉴클레오티드(internucleotide) 포스페이트를 siRNAs의 포스포로티오에이트 및 보라노포스페이트로 대체하는 것은 인비보 내의 가능성을 나타냈다, Li, Z.Y., Mao, H., Kallick, D.A., and G또는enstein, D.G., Biochem. Biophys. Res. Comm., 329, 1026-1030, 2005; Hall, A.H.S., Wan, J., Shaughnessy, E.E., Ramsay Shaw, B., Alexander, K.A., Nucl. Acids Res., 32, 5991-6000, 2004.
siRNA 분자의 바이오컨쥬게이트, RNA 분자, 앱타머 및 합성 DMNA 분자는 생물학적으로 인비보 내 안정성 및 뉴클레오시드의 적절한 변형에 추가로 세포막 투과성을 위한 중요한 특징을 필요로 한다: 불충분한 횡단-막(cross- membrane) 세포 흡수는 siRNA, 다른 단일 가닥 RNA 또는 다양한 DNA 분자의 이용을 제한한다. 따라서, siRNA의 3'-말단에 부착된 콜레스테롤은 인비보 세포 유통(trafficking) 및 치료적 유전자의 침묵을 개선하는 것으로 나타났다, Soutschek, J., Akine, A., Bramlage, B., Charisse, K., Constein, R., Donoghue, M., Elbasir, S., Geickk, A., Hadwiger,P., Harborth, J., Nature, 432, 173-0178, 2004.
다양한 컨쥬게이션 중 콜레스테롤을 제외하고 개발된 것은 하기와 같다:
(a) 세포 투과 펩티드(CPPs) 또는 막 투과 펩티(MPPs)드라고도 불리는 천연 및 합성 단백질 형질도입 도메인(PTDs), 이는 플라즈마 막과 상호작용할 수 있는 짧은 아미노산 서열이다. MPP-siRNA 컨쥬게이트의 흡수는 신속하게 일어난다. 이러한 펩티드는 표준 가닥의 3'-에 바람직하게 컨쥬게이트될 수 있다.
(b) 다른 다양이온(polycation) 분자가 RNA의 센스 혹은 안티센스 가닥의 3'-말달에 컨쥬게이트될 수 있다.
(c) 다양한 복합체 내에서 사용된 PEG(polyethylene glycols-oligonucleotide conjugates)는 표적 세포 내에서의 흡수 후에 현저한 유전자 침묵 효과를 소유한다, Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., and Kataoka, K., J. Am. Chem. Soc., 127, 1624-1625, 2005.
(d) 앱타머는 siRNA의 위치 특이적인 전달을 위해 사용되었다. 앱타머가 이들 표적에 높은 친화성을 갖기 때문에 상기 siRNA와의 컨쥬게이트는 우수한 전달 시스템으로서 작용하고, 이는 표적 유전자 발현의 효과적인 억제의 결과를 가져온다, Chu, T.C., Twu, K.Y., Ellington, A.D. and Levy, M., Nucl. Acids Res., 34(10), e73, 2006. 이러한 분자는 siRNA의 3'-말단 또는 다른 생물학적으로 활성인 올리고뉴클레오티드에 다시 컨쥬게이트될 수 있다.
(e) 본 발명을 통해 3'-말단의 다양한 지질 컨쥬게이트를 획득할 수 있고 이는 올리고뉴클레오티드의 효과적인 내재화를 위해 사용될 수 있다. 상기 친유성 부(moiety)는 히드록실 작용기로 구성되어 포스포라미디트를 합성할 수 있다. 유사하게 상기 친유성 부는 말단에 카르복실 작용기를 가질 수 있다. 후자는, 역 합성된 올리고뉴클레오티드의, C-6 아미노 링커 아미디트와 같은 아미노 링커(linkers)의 마지막 첨가에 의해 합성된 스페이서(spacer)를 갖는 3'-아미노기의 카르복실 부에 DCC(dicyclohexyl cabodiimide) 또는 유사한 커플링제를 이용하여 연결될 수 있다.
본 연구는 Paula, De. D., Bentley, M.V.L.B., Mahao, R.L., RNA, 13, 431-456,2007에 의해 명쾌하게 검토되었다.
siRNA와 밀접하게 연관된 RNA의 다른 클래스는 microRNA이며, 통상적으로 miRNA로 언급된다. 이들은 논코딩(non coding) RNA의 큰 클래스이며 유전자의 조절에 큰 역할을 한다, Bartel, D.P. Cell, 116,281-297, 2004; He, L., Hannon, G.J. Nat. Rev. Genet, 5:522-531, 2004; Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T., Science, 204:853-858,2001. 인간 게놈에는 적어도 1000 miRNA가 전체 게놈에 흩어져 있다. 이러한 micro RNA의 다수는 많은 수의 표적 mRNA를 하향조정(down regulate)한다, Lim, L.P., Lau, N.C., Garrett- Engele, P., Grimson, A., Schelter, J.M., Castle, J., Bartel, D.P., Linsey, P.S., Johnson, J.M., Nature, 433:769-773, 2005. miRNA의 상이한 조합이 포유류의 세포에서 표적 유전자의 조절에 관여할 수 있다. siRNA가 miRNAs와 같은 작용을 할 수 있는 것 또한 밝혀졌다; Krek, A., Grun, D., Poy, M.N., Wolf, R., Rosenberg, L., Epstein, E.J., MacMenamin, P., da Piedade, I., Gunsalus, K.C., Stoffel, M., Nat. Genet., 37: 495-500, 2005; Doench, J.G., Petersen, C.P., Sharp, P.A., Genes Dev., 17:438-442, 2003. 상기 miRNA는 치료법 및 유전자 조절에 큰 가능성을 갖는다, Hammond, S.M., Trends Mol. Med. 12:99-101, 2006. 현재 많은 노력이 miRNA 경로의 이해, 발달 및 질병에서 이들의 역할에 헌신되고 있으며, 특히 암에 촛점이 맞춰져있다. 상기 miRNA 표적이 치료법 및 진단의 발달을 위해 발전되었다. 많은 수의 miRNA가 확인되었고 이들의 역할이 마이크로어레이(microarrays), PCR 및 인포메틱스(formatics)를 통해 결정되었다. miRNA를 표적하기 위해 디자인된 RNA의 합성은 또한 siRNA에서 요구된 바와 같이 RNA의 안정성 및 보다 나은 세포 흡수를 위한 바이오컨쥬게이션을 위해 RNA 합성 및 다른 변형을 요구한다. 본 발명에 의해 예상되는 역합성은 이러한 연구 및 발전의 속도를 가속화할 수 있다.
많은 다양한 치료용 등급(therapeutic grade)의 RNA 및 siRNA의 합성은 올리고뉴클레오티드의 3'-말달의 변형 또는 라벨링(labeling)을 필요로 한다. siRNA의 경우에는 일반적으로 센스 가닥의 3'-말단이다. 친유성, 긴사슬 리간드 또는 크로모포어를 필요로 하는 상기 변형된 RNA의 3'-말단의 합성은 3'→5' 합성 방법을 이용하는 경우 어렵고, 대응하는 고체 지지체를 필요로 하며 일반적으로 바라는 소수성 변형을 함유하는 많은 양의 절단(truncated) 서열 때문에 일반적으로 낮은 커플링 효율성 및 최종 올리고뉴클레오티드의 낮은 순도의 결과를 가져온다.
본 발명은 이러한 문제에 대해 5'→3' 방향 RNA 합성을 위한 역 RNA 모노머 포스포라미디트를 개발하여 접근한다. 이러한 방식은 매우 정확한 올리고뉴클레오티드 합성을 유도하며 3'- 말단에서 다양한 변형의 정확하고 효과적인 도입을 가능하게 한다. 안정성을 향상시키고 추가의 바람직한 생화학적 특성의 유도(eliciting)를 위해 이러한 기술은 과거에 개발되어 왔던 2'-5'-링크된 DNA (구조 5) 및 RNA (구조 6)를 이용할 수 있다.
Figure 112011025090473-pct00007
Figure 112011025090473-pct00008
구조 (5). (2'-5'-링크된 DNA 유닛) 구조 (6). (2'-5'-링크된 RNA 유닛)
효율적인 RNA 전달을 위해 그리고 올리고뉴클레오티드의 세포적 농도의 증가를 위해 올리고뉴클레오티드를 포함하는 지질이 일반적으로 합성되며, 이는 합성 뉴클레오시드를 포함하는 지질이 AZT와 같은 많은 합성 뉴클레오시드 약의 흡수를 향상시키기 때문이다. 리포이드(Lipipoid) 핵산은 올리고뉴클레오티드의 친수성을 감소시키는 것으로 기대된다. 유사하게 콜레스테롤과 같은 소수성 분자가 LDL 입자 및 리포단백질에 결합할 수 있고 이러한 단백질들이 관여된 수송(transpott) 올리고뉴클레오티드에 대한 전달 과정을 활성화시킬 수 있다. 또한 지질(lipidoic) 핵산이 올리고뉴클레오티드의 효능을 향상시키는 것으로 나타났다. Shea, R.G., Marsters, J.C., Bischofberger, N., Nucleic Acids Res., 18, 3777, 1990; Letsinger, R.L., Zhang, G., Sun, D.K., Ikeuchi, T., Sarin, P.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553, 1989; Oberhauser, B., and Wagner, E., Nucleic Acids Res., 20, 533, 1992; Saison,-Behmoaras, T., Tocque, B., Rey, I., Chassignol, M., Thuong, N.T., Helene, C. The EMBO Journal , 10, 1111, 1991; Reed, M.W., Adams, A.D., Nelson, J.S., MeyeR.B., Jr., Bioconjugate Chem., 2, 217, 1991; Polushin,N.N., Cohen, J., J. Nucleic Acids Res., 22, 5492, 1994; Vu, H., Murphy, M., Riegel, Joyce, M., Jayaraman, K., nucleosides & Nucleotides , 12, 853, 1993; Marasco, Jr., Angelino, N.J., Paul, B., Dolnick, B.J., 테트라hedron Lett., 35, 3029, 1994. 상기 연구에서, 아다만탄(구조 7), 에이코세노익산(구조 8), 및 콜레스테롤과 같은 일련의 소수성기의 Tm이 올리고데옥시 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 부착되었고 상보적인 RNA 서열로 혼성화되었다; 상기 Tm은 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌고, 이는 이러한 그룹이 올리고 혼성화 특성을 방해하지 않는 것을 나타낸다; Manoharan, M., Tivel, K.L., Andrade, L.K., Cook, P.D., tetrahedron Lett., 36, 1995; Manoharan, M., Tivel, K.L., Cook, P.D., tetrahedron Lett., 36, 3651-3654, 1995; Gerlt, J.A. Nucleases, 2 nd Edition, Linn, S.M., Lloyd, R.S., Roberts, R.J., Eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, p-10, 1993.
Figure 112011025090473-pct00009
Figure 112011025090473-pct00010
구조 7. 아다만탄 아세트산 구조 8.Cis-11-에이코세노익산
Figure 112011025090473-pct00011
Figure 112011025090473-pct00012
구조 9. 콜레스테롤 구조 10. 2,3-디헥사덱실-rac-글리세롤
앞선 지질(lipidoic) 분자 외에 높은 가능성을 보여준 다른 클래스의 분자는 짧은 및 긴 사슬 폴리에틸렌글리콜(PEG)이다, Bonora, G.M., Burcovich, B., Veronese, F.M., Plyasunova, O., Pokrovsky, A. and Zarytova, V., XII International Round Table Conference, nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications, La Jolla, CA, Sept., 15-19, PPI 89, 1996. 합성 RNA 및 DNA 분자의 효율적인 전달을 위한 다양한 올리고뉴클레오티드에 대한 PEG 부착은 매우 바람직한 특성을 나타내었다. PEG-올리고머는 빠른 분해를 억제하여 우수한 효소적 안정적을 나타내었다. 열적 용융 거동은 영향을 받지 않았고, 그에 따라 여전히 이중 가닥 형태의 특성을 보유하였다.
역 RNA 포스포라미디트의 제조를 위한 본 발명자들의 접근은 선택적인 5'-벤조일, 아세틸, 레불리닐(levulinyl) 또는 치환된 5'-벤조일n-보호된 리보뉴클레오시드과 같은 5'- 에스테르의 도입을 필요로 한다. 2'-tBD실릴 또는 2'-TOM(triisopropyl silyl methoxy; TOM) 과 같은 2'- 위치에서 적절한 보호기의 후속적인 도입이 요구된다. 이들의 스킴 내에서 이들은 이러한 목적을 달성하기 위한 선택된 분자의 합성을 나타낸다.
표적 화합물, 구조들(16a-e)을 제조하기 위해 필요한 중요한 중간체는 2'-실릴에테르-5'-O 아실화된-N-보호된 리보뉴클레오시드, 화합물(23a-e)이다. 이를 위해 필요한 제1 중간체는 5'-아실화된-N-보호된 리보뉴클레오시드 화합물(22a-e)이다. 본 발명자들이 아는 한 화합물 (21a-e)는 보고된 바 없었다. 과거에 RNA 합성을 위해 보고된 상기 화합물은 중간체(intermediates), 구조 11, 12 및 13을 이용하였다. 5'-아세테이트와 함께 다양한 2' 및 3 '아세테이트; viz., 5'-벤조일 보호된 뉴클레오시드; Reese, B.E., Jarman, M., Reese, C.B., tetrahedron, 24, 639, 1968; Neilson, T., Werstiuk, E.S., Can. J. Chem. 49, 493, 1971; Neilon, T., Wastrodowski, E.V., Werstiuk, E.S., Can. J. Chem., 51, 1068, 1973; Eckstein, F., Cramer, F., Chem.Ber., 98, 995, 1965; Zemlicka, J., Chladek, S., Tet. Lett., 3057, 1965, Amarnath,V. & Broom, A.D., Chemical Reviews, 77, 183-219,1977. 그러나, 본 발명은 구조 (22a-e)에서와 같은 자유 2' 및 3' 히드록실기를 필요로 한다.
Figure 112011025090473-pct00013
Figure 112011025090473-pct00014
Figure 112011025090473-pct00015
구조 11. 구조 12 구조 13
본 명세서에서 통상적인 방법(3'→5') 및 역 방향(5'→3')에 의한 RNA의 비교 합성 및 정제를 수행하였다. 괄찰된 것은 하기와 같다: 고순도의 RNAs, 매끄러운 3'-컨쥬게이션-콜레스테롤, HEG 및 PEG(Polyethylene glycols) & 역 RNA 합성에서 M+1 부존재의 증명
합성 스킴의 상세 내용이 스킴 (2)에 개괄적으로 서술되어 있다. 상기 2',3'-이소프로필리덴 작용(function)이 사용되어 n-보호된 리보뉴클레오시드 리보스의 2',3' 히드록실기를 보호한다. 다수의 바람직한 n-보호기가 스킴(2)에 나타나 있다. 상기 5'-히드록시기가 후속적으로 보호되고, 바람직하게는 벤조일기로 보호되어 일반 구조 21의 화합물을 획득한다. 상기 이소프로필기는 그 후 당업계에 잘 알려진 선택적으로 약한 산성 조건 하에서 제거된다. 이러한 단계는 일반식 22의 화합물을 유도한다. TBDM 실릴 클로라이드(tert-butyl dimethyl silyl chloride)와의 후속적인 반응은 일반식 23의 모노실릴 화합물을 유도한다. 본 발명자들은 3'-그룹, 즉 화합물 구조 24의 형성이 이러한 공정에서 바람직하지 않은 것을 관찰하였다. 대부분의 경우에 구조가 화학적 및 분석적 방법에 의해 23으로 확인되는 정확한 생성물이 관찰되었다.
상기 언급된 공정의 각각의 단계에서 정제를 결정화(crystallization) 또는 컬럼 크로마토그래피를 통해 수행하였다. 피리딘 내 디메톡시트리틸 클로라이드(DMT-chloride)를 이용한 후속적인 반응은 일반 구조 26의 3'-DMT-2'-TBDMS-n-보호된 뉴클레오시드를 유도한다. 각각의 화합물은 컬럼 크로마토그래피에 의해 완전히 정제되었다.
이들의 2'-TBDMS 에테르를 제조하기 위해 이들은 TBDMS 그룹을 이용하나, 다른 실릴 에테르가 이 단계에서 사용될 수 있다. 주의 깊은 수성/메탄올릭(methanolic) NaOH 가수분해는 일반 구조 27의 자유 5'-히드록실기를 갖는 화합물의 결과를 가져온다.
수성 혹은 메탄올릭 베이스(base)를 이용한 선택적인 5'-벤조일 제거는 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 화합물 3'-DMT-2'-TBDMS-n-보호된 뉴클레오시드(구조 27)를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상기 정제된 화합물(구조 27)을 후속적으로 n,n-디이소프로필아미노 시아노에틸 포스폰아미딕 클로라이드 또는 2-시아노에틸, n,n,n,n-테트라이소프로필 포스판과 같은 인산화 시약에 의해 인산화하여 대응하는 포스포라미디트(구조 16)을 수득한다. 인산화 시약, n,n-디이소프로필아미노 시아노에틸 포스폰아미딕 클로라이드 또는 2-시아노에틸, n,n,n,n-테트라이소프로필 포스판(포스판)는 모두 상업적으로 입수할 수 있고, 대응하는 포스포라미디트를 제조하기 위한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
본 발명은 새로운 RNA 모노머 포스포라미디트 및 역 5' → 3' 방향의 새로운 RNA 올리고뉴클레오티드 합성 방법에 적절한 이에 상응하는 고체 지지체에 관한 것이다. 역 방향(5' → 3' 방향)에서의 RNA 합성은 지급까지 획득된 바 없었다.
본 발명은 하기 구조(14)로 표현되는 새로운 RNA 모노머 포스포라미디트를 제공한다. 개발된 합성 경로는 바라는 포스포라미디트를 바라지 않는 이성질체(isomers)에 의한 오염 없이 획득할 수 있게 한다.
Figure 112011025090473-pct00016
구조 (14)
상기 본 발명의 RNA 포스포라미디트 모노머는 리보뉴클레오시드에 3'-DMT 기를 가지며, 5'-시아노에틸포스포라미디트(CED) 및 다양한 메틸옥시 또는 실릴 보호기를 상기 라이보스 부의 2'- 위치에 갖는다(구조 14). 상기 고체 지지체는 3'-DMT기를 함유하는 보호된 RNA를 가지며 5'-말단이 고체 지지체에 부착된다.(구조 15).
Figure 112011025090473-pct00017
구조 (15)
상기 RNA 포스포라미디트는 역, 5'→3' 방향의 올리고뉴클레오티드 합성에 사용될 수 있다. 다수의 RNA 합성, 통상적인(3'→5') 및 역방향(5'→3')이 실험의 일부로서 수행되었다.
RNA 올리고머의 3'-말단에서의 변형 또는 라벨링은 대응하는 포스포라미디트 또는 활성 에스테르를 사용하여 합성의 마지막에 부착될 수 있고 특별한 고체 지지체를 필요로 하지 않는다. 나아가, 본 발명의 접근은 매우 정확한 3'-라벨링된 올리고뉴클레오티드를 유도하고 비싼 정제 방법을 필요로 하지 않는다.
고순도 수준의 RNA가 역방향(5'→3')에 의한 RNA 합성에서 지속적으로 획득되어 콜레스테롤, HEG (hexaethyloxyglycol) 및 PEG ( Polyeethylene glycols)와 같은 분자의 매끄러운 3'-컨쥬게이션의 결과를 가져온다. 상기 RNA 합성에 있어서 역방향(5'→3')에서는 M+1 올리고뉴클레오티드 불순물이 존재하지 않는 것이 또한 실증되었다.
본 발명은 본 발명의 역 RNA 아미디트(amidites)를 이용한 자동화된 올리고 합성이 이루어지는 동안 각 단계 당 보다 높은 결합 효율을 관찰하였으며, 보다 높은 순도를 획득하고 매우 긴 올리고를 제조하기 위한 보다 큰 능력의 결과를 가져왔다. 이들은 또한 본 발명은 M+1 종(species)이 없는 올리고뉴클레오티드를 유도하는 것을 실증하며, 상기 종은 HPLC 분석 또는 정제 또는 젤 정제하는 동안 바라는 피크의 어깨와 같은 근거리(closer) 불순물을 유발하는 것이다.
상술한 내용은 하기의 예시적인 구현의 설명에 의해 보다 상세하게 기술되며, 첨부된 도면에 있어서 동일한 참고 번호는 다른 관점에 있어서 동일한 부분을 나타낸다.
도 1은 N 4 -벤조일-2'O-TBDMS-3'-O-DMT-아데노신-5'-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포라미디트(16a)의 HPLC- 크로마토그램, 98.6% 순도.
도 2는 N 4 -벤조일-2'O-TBDMS-3'-O-DMT-아데노신-5'-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포라미디트(16a)의 NMR 31P 스펙트럼, 149.465ppm & 149.307 ppm에 뾰족한 더블릿(doublet); 델타;0.158, 98.6% 순도.
도 3은 N4-아세틸-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-시티딘-5'-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포라미디트 (16c)의 HPLC- 크로마토그램, 96.9% 순도.
도 4는 N4-아세틸-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-시티딘-5'-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포라미디트 (16c)의 NMR 31P 스펙트럼, 149.447 ppm & 149.197 ppp에 뾰족한 더블릿(doublet); 델타;0.250,100% 순도.
도 5는 N2-이소부티릴-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-구아노신-5'-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포라미디트 (16d)의 HPLC-크로마토그램, 98.3% 순도.
도 6은 N2-이소부티릴-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-구아노신-5'-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포라미디트 (16d)의 NMR 31P 스펙트럼, 149.731 ppm & 149.048ppm에서 뾰족한 더블릿(doublet), 델타;0.683, 100% 순도.
도 6a는 화합물(16d)의 질량 스펙트럼; N2-이소부티릴-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-구아노신-5'-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포라미디트, 음이온 질량; 969.4에서 관찰됨; 계산됨(calculated); 970.18.
도 6b는 화합물(16d)의 매스 스펙트럼; N2-이소부티릴-2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-구아노신-5'-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포라미디트, 양이온 질량; 993.0에서 관찰됨; 계산됨; 993.18 (+Na).
도 7. 5'→3' RNA 합성 및 3'-변형에 대한 적용의 도식적 표현
도 8. 커플링 효율 트리틸 히스토그램 노트(Tritil Histogram　Notes)(21 mer RNA 합성): 커플링 효율(염기 레벨링(base leveling)에 의한 단계적 수율)　: 99.6%; 최종 수율(연속 평균(rolling average)에 의해): 100%　; 모노머 G에 대한 단계적 수율: 100% ; 모노머 A에 대한 단계적 수율: 99.2%　; 모노머 C에 대한 단계적 수율: 99.6% ; 모노머 G에 대한 단계적 수율: 99.6%　; 모노머 U에 대한 단계적 수율:100.0%
도 9는 통상적인 방법(3'→5' 방향)에 의해 제조된 조질의 올리고뉴클레오티드 SEQ ID No: 1의 전기영동도(Electropherogram)
도 9a는 통상적인 방법(3'→5' 방향)에 의해 제조된 정제된 올리고뉴클레오티드 SEQ ID No: 1의 전기영동도. Expedite Model 8909-1 umole 스케일(scale). 조질의 순도;90.78%.
도 10은 역 RNA 합성(5'→3' 방향)에 의해 제조된 조질의 21-mer RNA의 전기영동도. Expedite Model 8909-1 umole 스케일. 조질의 순도;78.55. 참고: 역합성에서는 M+1이 존재하지 않는 것으로 보임.
도 11은 통상적인 방법에 의해 제조된 조질의 올리고뉴클레오티드 SEQ ID No: 2의 전기영동도. 통상적인 방법(3'→5' 방향)에 의해 제조된 3'-콜레스테롤 CPG를 갖는 조질의 21-mer RNA. Expedite Model 8909-1 umole 스케일. 조질의 순도; 82.83%. 참고: 오른쪽 편에 험프(humps) 존재, 대부분 M+1 종(species)에 기인함.
도 12는 역 RNA 합성(5'→3' 방향)에 의해 제조된 조질의 올리고뉴클레오티드 SEQ ID No: 2 의 전기영동도. Expedite Model 8909-1 umole 스케일. 조질의 순도; 85.76%. 참고: 역합성에서는 M+1이 존재하지 않는 것으로 보임.
도 13은 3'-콜레스테롤-TEG 링커(linker)를 갖는 21-Mer RNA. 역 방향(5'→3' 방향) 합성 및 HPLC 정제. 1 umole 스케일. 순도; 99.9%.
도 14는 역 RNA 합성에 의해 제조된 조질의 올리고뉴클레오티드 SEQ ID No: 4의 전기영동도. 조질의 순도; 56.60%.
도 15는 역 방향(5'→3')에 의해 합성되고 HEG(Hexa-ethyloxyglycol) 부착이 후속된 21-Mer RNA. HPLC 정제 후, 순도; 94.39%.
도 16은 역합성에 의해 제조된 조질의 올리고뉴클레오티드 SEQ ID No: 3의 전기영동도. 3'-PEG(Polyethyleneglycol; MW; 2000)를 이용한 21- mer RNA 합성. Expedite model 8909-1 umole 스케일 합성. 조질의 순도; 91.87%. 정확히 분리된 넓은 피크가 존재함.
도 17은 역합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드 SEQ ID No: 4의 전기영동도. 3'-PEG(Polyethyleneglycol; MW; 2000)를 이용한 21- mer RNA 합성. Expedite model 8909-1 umole 스케일 합성. 역 상(Reverse phase) HPLC 정제됨; 순도; 100%.
도 18은 3'-PEG -2000 부착을 갖는 21- mer RNA의 ESI 질량 스펙트럼(Mass Spectral) 분석, 도 17에 나타난 바와 같이 정제된 RNA. 상기 합성은 역방향(5'→3' 방향)으로 수행됨. 상기 PEG-2000는 마지막 단계로서 대응하는 포스포라미디트를 통해 부착됨, ChemGenes catalog ;CLP-3119 계산된 분자량: 8684.1 관찰된 분자량: 8681.1 Note: PEG-2000를 갖는 상기 계산된 분자량의 양 편에 RNA의 적어도 14 PEG 종(species)의 분포가 존재함. 따라서, 8417.1 내지 8945.3까지의 종은 글리콜 유닛의 상이한 분자량으로 존재함(+/- 44).
일 구현으로 본 발명은 화학식(1)의 새로운 포스포라미디트에 관한 것이며,
Figure 112011025090473-pct00018
화학식 (1)
여기서,
Y는 산소 또는 황;
W는 산소, 질소 또는 불소;
R4는 삼차 부틸 디메틸 실릴(TBDMS), 트리이소프로필실릴 옥시메틸렌, 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc), 알킬, 아릴 및 아세틸로 이루어진 그룹으로부터 선택되며;
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 보호기(a protecting group)이며;
R1은 알킬 또는 아릴기;
R2는 알킬 또는 아릴기;
R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴; 그리고
B는 수소 또는 각 일차 아민이 아민 보호기로 임의로 기능화된(functionalize) 핵염기(nucleobase)이다.
다른 구현으로, 본 발명은 화학식 (1)의 포스포라미디트에 관한 것이다:
Figure 112011025090473-pct00019
화학식 (1)
여기서,
Y는 산소 또는 황;
W는 황;
R4는 벤조일, 아세틸 또는 이황화물(disulfide);
Z는 디메톡시 트리페닐(DMT), 모노메톡시 트리페닐(MMT) 및 트리메톡시 트리페닐(TMT)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 보호기;
R1은 알킬 또는 아릴기;
R2는 알킬 또는 아릴기;
R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴; 그리고
B는 수소 또는 각 일차 아민이 아민 보호기로 임의로 기능화된(functionalize) 핵염기(nucleobase)이다.
본 발명은 또한 하기로부터 선택되는 구조식으로 표현되는 RNA 올리고머의 합성을 위해 5'- 에서 3'-을 향한 방향으로의 결합(bond) 형성에 의해 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Figure 112011025090473-pct00020

상기 방법은 하기 화합물
Figure 112011025090473-pct00021
을 반응시키는 단계를 포함하며,
여기서;
B는 수소 또는 각 일차 아민이 아민 보호기로 임의로 기능화된(functionalize) 핵염기(nucleobase)이며;
n은 0 내지 98이며;
Y는 산소 또는 황;
W는 산소, 질소, 황 또는 불소;
R4는 W가 황이 아닌 경우, TBDMS, 트리이소프로필실릴 옥시메틸렌, Fmoc, 알킬, 아릴, 또는 아세틸과 같은 실릴 에테르이나; W가 황인 경우 R4는 벤조일, 아세틸 또는 이황화물이며;
Z는 DMT, MMT, 또는 TMT 보호기이며;
R1 및 R2는 알킬 또는 아릴기로부터 독립적으로 선택되며;
R3는 시아노에틸, 알킬 또는 아릴이며; 그리고
M은 수소 라디칼 또는 Y-CO-이며; 여기서 Y는 고체 지지체에 대한 부착에 적절한 링커(linker)이다.
단독으로 사용되거나 또는 "아릴알킬" 또는 "시클로알킬알킬"과 같이 보다 큰 부의 일부로서 사용되는 상기 용어 "알킬"은 1-10 탄소 원자를 갖는 직선 또는 분지의 탄화수소 라디칼을 의미하며, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, i-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실 등을 포함한다.
상기 용어 "시클로알킬"은 3-12 탄소 원자를 갖는 모노시클릭, 바이시클릭 또는 트리시클릭, 포화 탄화수소 고리를 의미하며, 예를 들어 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 바이시클로[2.2.2]옥틸, 바이시클로[2.2.1]헵틸, 스피로 [4.4]노네인, 아다만틸 등을 포함한다.
단독으로 사용되거나 또는 "아릴알킬"에서와 같이 큰 부(moiety)의 일부로서 사용된 "아릴"은 6-10 원소 카보시클릭 방향족 모노시클릭 또는 폴리시클릭 고리 시스템을 의미한다. 예를 들어 페닐 및 나프틸을 포함한다. 상기 용어 "아릴"은 또한 비방향족 카보시클릭 고리 또는 헤테로시클릭기에 융합된 페닐 고리를 포함한다. 상기 용어 "아릴"은 "방향족기", "아릴 고리", "방향족 고리", "아릴기" 및 "방향족기"와 교체가능하게 사용될 수 있다.
"헤테로"는 고리 시스템 내 적어도 하나의 원소를 N, S, 및 O로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로 원자로 대체한 것을 의미한다. 헤테로 고리는 1, 2, 3, 또는 4 탄소 원자가 헤테로 원소로 대체될 수 있다.
"헤테로시클릴"은 O, N 및 S로부터 선택된 1 내지 4 고리 헤테로 원자를 포함하는, 3 내지 20 원소, 3 내지 12 원소, 또는 3 내지 8 원소의 포화 또는 불포화, 비-방향족, 모노시클릭 또는 폴리시클릭 고리 시스템을 의미한다. 예시적인 헤테로시클릴은 피롤리딘, 피롤리딘-2-온, 1-메틸피롤리딘-2-온, 피페리딘, 피페리딘-2-온, 2-피리돈, 4-피리, 피페라진, 1-(2,2,2-트리플루오로에틸)피페라진, 피페라진-2-온, 5,6-디히드로피리미딘-4-온, 피리미딘-4-온, 테트라히드로퓨란, 테트라히드로피란, 테트라히드로티오펜, 테트라히드로티오피란, 이속사졸리딘, 1,3-디옥솔란, 1,3-디티올란, 1,3-디옥산, 1,4-디옥산, 1,3-디티안(dithiane), 1,4-디티안, 옥사졸리딘-2-온, 이미다졸리딘-2-온, 이미다졸리딘-2,4-디온, 테트라히드로피리미딘-2(1H)-온, 모르폴린, N-메틸모르폴린, 모르폴린-3-온, 1,3-옥사진안-2-온, 티오모르폴린, 티오모르폴린 1,1-다이옥사이드, 테트라히드로-1,2,5-티아옥사졸 1,1-다이옥사이드, 테트라히드로-2H-1,2-티아진 1,1-다이옥사이드, 헥사히드로-1,2,6-티아디아진 1,1-다이옥사이드, 테트라히드로-1,2,5-티아디아졸 1,1-다이옥사이드 및 이소티아졸리딘 1,1-다이옥사이드를 포함한다.
"헤테로시클릴" 또한 헤테로아릴기를 포함한다. 상기 용어 "헤테로아릴"은 N, O, 및 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4 헤테로 원자를 포함하는 5-10 원소 1가 헤테로 방향족 모노시클릭 및 폴리시클릭 고리 라디칼을 의미한다. 상기 용어 "헤테로아릴"은 또한 비-방향족 카보시클릭 고리 또는 헤테로시클릴기에 융합된 모노시클릭 헤테로아릴 고리를 포함한다. 헤테로아릴기는 퓨릴, 티에닐, 티오페닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 옥사디아졸릴, 트리아졸릴, 티아디아졸릴, 피리디닐, 피리디닐-N-옥사이드, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 인돌리지닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조[b]퓨릴, 벤조[b]티에닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 퓨리닐, 4H-퀴놀리지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 벤조티에닐, 벤조퓨라닐, 2,3-디히드로벤조퓨라닐, 벤조디옥솔릴, 벤즈이미다졸릴, 인다졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤족사졸릴, 벤조티아졸릴, 신놀리닐, 프탈지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 1,8-나프티리디닐, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴-1-옥사이드, 1,2,5-티아디아졸릴-1,1-다이옥사이드, 1,3,4-티아디아졸릴, 1,2,4-트리아지닐, 1,3,5-트리아지닐, 테트라졸릴, 및 프테리디닐(pteridinyl)을 포함한다. 상기 용어 "헤테로아릴", "헤테로아릴 고리", 및 "헤테로아릴기"는 본 명세서에서 교체가능하게 사용된다.
B는 수소, 천연(natural) 또는 인공(unnatural) 핵염기, 보호된 핵염기, 보호된 천연 또는 인공 핵염기, 헤테로사이클 또는 보호된 헤테로사이클이다. 예를 들어, 핵염기는 각 일차 아민이 아민 보호기로 임의로 기능화(functionalize) 될 수 있으며, 실시예에 기술된 것 및, A(N-Bz), A(N-Ac), A(N-tBPac), A(N-Pac), C(N-Bz), C(N-Ac), C(N-tBPac), C(N-Pac), G(N-iBu), G(N-Ac), G(N-tBPac), G(N-Pac), I, 또는 U를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
당해 기술분야에 알려진 고체 상(solid phase) 합성에 적절한 어떠한 고체 지지체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 적절한 고체 지지체의 예는 조절된 다공 유리, 폴리스티렌, 폴리(디메틸아크릴아미드)와 같은 미세다공성 폴리아미드, 및 폴리에틸렌 코팅된 폴리스티렌을 포함한다. 또한 본 명세서에서 고려되는 것은 본 발명의 화합물을 고체 지지체에 부착하기에 적절한 링커(linkers)의 사용이다. 링커는 당업계에 잘 알려져 있다.
아민, 히드록시 및 티올 보호기가 당업계에 알려져 있다. 아민 보호기의 예는 Greene, et al., Protective Groups in organic Synthesis (1991), John Wiley & Sons, Inc., pages 309-405,를 참고할 수 있으며, 이들의 가르침은 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 바람직하게 아민은 아미드 또는 카바미드로서 보호된다. 히드록시 보호기의 예는 Id., pages 10-142,를 참고하며, 이들의 가르침은 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 바람직한 히드록시 보호기는 t-부틸디메틸실릴기이다. 티올 보호기의 예는 Id., pages 277-308,을 참고하며, 이들의 가르침은 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 산 불안정(labile) 보호기는 상기 기를 브뢴스테드 또는 루이스 산에 접촉하여 제거될 수 있는 보호기이다. 산 불안정 보호기는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 일반적인 산 불안정기의 예는 치환된 또는 미치환된 트리틸기(Id., 페이지 60-62), 치환된 또는 미치환된 테트라히드로피라닐기(Id., 페이지 31-34), 치환된 또는 미치환된 테트라히드로퓨라닐기(Id., 페이지 36-37) 또는 픽실기(Id., 페이지 65)을 포함한다. 바람직한 산 불안정 보호기는 치환된 또는 미치환된 트리틸이며, 예를 들어 4,4'-디메톡시트리틸 (이하 "DMT")이다. 트리틸기는 바람직하게는 알콕시기와 같은 전자 제공 치환기에 의해 치환된다. 뉴클레오시드 염기(bases)는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 및 우리실과 같은 천연 발생 염기 및 7-데아자(deaza)구아닌, 7-데아자-8-아자구아닌, 5-프로피닐시토신, 5-프로피닐우리실, 7-데아자아데닌, 7-데아자-8-아자아데닌, 7-데아자-6-옥소퓨린, 6-옥소퓨린, 3-데아자아데노신, 2-옥소-5-메틸피리미딘, 2-옥소-4-메틸티오-5-메틸피리미딘, 2-티오카보닐-4-옥소-5-메틸피리미딘, 4-옥소-5-메틸피리미딘, 2-아미노-퓨린, 5-플루오로우리실, 2,6-디아미노퓨린, 8-아미노퓨린, 4-트리아졸로-5-메틸티민, 및 4-트리아졸로-5-메틸우리실과 같은 변형된 염기를 포함한다.
보호된 뉴클레오시드 염기는 염기의 반응성 작용기가 보호된 뉴클레오시드 염기이다. 유사하게, 보호된 헤테로사이클은 상기 헤테로사이클의 반응성 치환기가 보호된 헤테로사이클이다. 전형적으로, 뉴클레오시드 염기 또는 헤테로사이클은 아미드 또는 카바미드와 같은 아민 보호기로 보호될 수 있는 아민기를 갖는다. 예를 들어 아데닌 및 시토신의 아민기는 전형적으로 벤조일 보호기로 보호되고, 구아닌의 아민기는 전형적으로 이소부티릴기, 아세틸기 또는 t-부틸페녹시아세틸기로 보호된다. 그러나, 다른 보호 스킴이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 빠른 탈보호를 위해, 상기 아데닌 및 구아닌의 아민기는 페녹시아세틸기로 보호되고 시토신의 아민기는 이소부티릴기 또는 아세틸기로 보호된다. 핵염기 또는 헤테로사이클 보호기 제고의 조건은 사용된 보호기에 의존한다. 아미드 보호기가 사용된 경우, 이는 올리고뉴클레오티드를 농축된 암모늄 히드록시드 용액, n-메틸아민 용액 또는 암모늄 히드록시드 내 t-부틸아민 용액과 같은 염기 용액으로 처리하여 제거할 수 있다.
상기 논의, 실험적 데이터 및 하기의 도 9-18로부터의 본 발명의 방법의 핵심 특징은 하기의 관찰을 포함한다:
I. 조질의 RNA는 역 RNA 합성(5'-3' 방향)과 비교할 때 통상적인 방법(3'-5' 방향)에서 근거리의 불순물을 더욱 갖는다. 따라서 정제 후에 역 RNA 합성에 의해 합성된 RNA가 보다 순수하다.
II. 상술한 특징은 RNA의 3'-말단에 부착된 콜레스테롤의 합성에서 더욱 가시적이다(도 11 vs. 도 12 참고). 따라서 역 RNA 합성에 의해 합성된 3'-말단에 콜레스테롤을 갖는 RNA를 정제하는 것이 더욱 용이하다(도 12 참고).
III. M+1 불순물은 역 RNA 합성 방법에 의한 RNA 합성에서 본질적으로 결여되어 있다.
리보뉴클레오시드- 3'- DMT-2'- tBD실릴-5'-포스포라미디트 분자 내 상기 3'-DMT는 올리고뉴클레오티드의 커플링 단계 동안 그리고 올리고뉴클레오티드 사슬 연장의 커플링 시간 내에 5-에틸티오테트라졸 또는 유사한 활성화제(activator)에 의해 절단되지 않는 것으로 상정된다.
IV. 통상적인 방법(3'-5')에 의해 접근할 수 없는 3'-말단에 마크로분자를 포함하는 RNA는 역 RNA 합성(5'-3' 방향)에 의해 용이하게 합성될 수 있다. 이러한 RNA는 고순도로 제조될 수 있다.
V. 3'-PEG RNA (21- mer)를 합성하였고, 정제 후에는 본질적으로 100% 순수하다(see FIGS. 16, 17 and 18).
본 발명의 상기 역 RNA 모노머 포스포라미디트는 리보뉴클레오시드 내에 3'-DMT기를 수반하며, 2'-tBD실릴 (tBDSi) -5'-시아노에틸포스포라미디트 (CED)(구조 16), 3'-DMT-2'-tBD실릴-5'-석시닐-Icaa CPG-n-보호된 뉴클레오시드 (구조 17) 또는 3'- DMT-2'-트리이소프로필실롤록시메틸 (TOM)- 5'-CED 포스포라미디트기(구조 18)를 수반한다.
Figure 112011025090473-pct00022
구조 (16). 3'-DMT-2'-tBD실릴-5'-아미디트
(역 RNA-tBD실릴-아미디트)
Figure 112011025090473-pct00023
구조 (17). 3'-DMT-2'-tBD실릴-5'-CPG
(역 RNA-tBD실릴- 5'-Icaa CPG)
Figure 112011025090473-pct00024
구조 (18). 3'-DMT-2'-TOM (트리이소프로필실릴 옥시메틸렌) -5'-아미디트
(역 RNA- TOM -5'- 아미디트)
본 발명은 또한 개시된 조성물의 제조 방법을 가르친다. 초기 염기 보호된 뉴클레오시드 19는 이소프로필리덴 보호된 뉴클레오시드 20을 제공한다. 이소프로필리덴기의 제거에 후속적인 벤조일화는 5'-벤조일화된 뉴클레오시드 22를 산출한다. 피리딘 내 DMS 클로라이드를 이용한 연속적인 실릴화 반응은 2'- 및 3'- TBDMS 보호된 뉴클레오시드의 혼합물을(23 및 24) 각각 3:2의 비율로 제공한다. 컬럼 크로마토그래피 후 이성질체를 분석하였고 % 수율로 단리하였다. 상기 이성질체 23의 나아간 반응은 3'-DMT-2'-TBDMS 보호된 뉴클레오시드 26을 제공하였다.
따라서 3'-히드록실기의 후속적인 기능화가 이루어지는 동안 2'-tBd실릴기의 현저한 이동이 일어나는 것으로 생각된다.
Figure 112011025090473-pct00025
스킴 (1)
3'-히드록실기를 DMT-(4,4-디메톡시트리틸)로 기능화하는 동안, 현저한 이동은 일어나지 않은 것으로 관찰되었다. 또한, 상기 3'-TBDMS 보호된 이성질체 24는 피리딘 내 DMT 클로라이드를 갖는 이성질체 23과 같은 동일한 트리틸화 반응에 관련되어 있으나, 뉴클레오시드 25 는 이러한 반응에서는 관찰되지 않았다. 따라서, 2'-TBDMS 보호된 뉴클레오시드 23 및 그 이성질체 24의 오염의 경우, 원하지 않는 이성질체 25가 상기 트리틸화 조건에서 형성될 수 없고 바라는 뉴클레오시드 26가 고순도로 단리 될 수 있다. 상기 3'-TBDMS 보호된 뉴클레오시드 24는 바라는 생성물의 합성에서 사용될 수 있고 상기 스킴 1에 기술된 이성질체화 공정 때문에 23으로 변환될 수 있다.
메탄올 내 소듐 히드록시드를 이용한 5'-벤조일기의 제거에 CEDP 및 DIPA 테트라졸레이트를 이용한 포스피틸화(phosphitilation) 반응이 후속되고 최종 역 포스포라미디트 16이 제공된다.
Figure 112011025090473-pct00026
스킴 (2)
역 포스포라미디트를 이용한 올리고뉴클레오티드 합성이 5'→3' 방향으로 수행되었다.
하기에 제공된 예가 본 발명을 더욱 상세하게 설명하며; 이들은 설명을 위한 것으로 본 발명을 어떠한 견지에서도 제한하는 것으로 의도되는 것은 아니다. 특히 하기의 실시예는 본 발명의 화합물을 획득하기 위한 방법을 실증한다. 본 발명의 화합물 제조에 유용한 출발 물질 및 이의 중간체는 상업적으로 입수가능하거나 또는 상업적으로 입수가능한 재료로부터 공지의 합성 방법 및 시약을 이용하여 제조될 수 있다. 모든 올리고뉴클레오티드 서열은 좌측의 5'말단으로부터 우측의 3' 말단으로 기재되었다. 3'- DMT -5'- CED 포스포라미디트의 커플링 효율은 단계 당 우수한 99%를 나타내었고, 고순도의 RNA를 유도하였다. 다수의 호모폴리머 및 20-21머(mers) 올리고뉴클레오티드는 이러한 모노머 포스포라미디트를 이용하여 합성되었다. 전형적인 데이터가 도 (8)에 나타나 있다.
본 발명자들의 데이터는 3'→5' 방향의 합성에서의 표준 3'-CED 포스포라미디트(도 9 및 10 참고)와 비교할 때 상기 역 RNA 모노머(5'→3'방향)를 이용한 올리고 합성이 이루어지는 동안 커플링 효율에 차이가 없음을 보여준다.
본 발명의 다른 구현은 올리고뉴클레오티드의 3'-말단의 변형 또는 라벨링을 수반하는 리보핵산 올리고머의 합성 방법을 제공한다. 친유성, 긴사슬 리간드 또는 크로모포어 플루오로포어 및 퀀쳐(quenchers)를 필요로 하는 3'-말단 변형된 RNA 합성은 이에 대응하는 포스포라미디트를 이용하여 수행할 수 있다. 도 11 및 12에 도시된 바와 같이 본 발명자들의 데이터는 5'→3'방향의 합성이 통상의 방법에 비해 매우 뚜렸한 이점을 갖는 것을 보여준다.
나아가, HEG 또는 PEG-2000와 같은 고체 지지체 상에서 이용할 수 없는 상기 3'-변형은 5'→3'방향 합성 및 역-상 HPLC의 정제에 의해 용이하게 도입될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 SEQ ID No 4는 RP HPLC에 의해 정제되고 95-98 % 순도의 생성물을 제공하였다(도 15 참고).
실시예 1
스킴 2에 나타난 바와 같은 N 2 - 이소부티릴 -2'- O - TBDMS -3'- O - DMT - 구아노신 -5'-시아노에틸- N,N- 디이소프로필 - 포스포라미디트 (16d)의 합성
N 2 - 이소부티릴 -2'- O - TBDMS -3'- O - DMT -5'- O - 벤조일 - 구아노신 (26d): 60 mL 피리딘 내 4 g (7.0 mmol) 화합물 23d 의 용액에 9.5 g (28.0 mmol) 의 DMT 클로라이드를 하나의 부분으로(in one portion) 실온에서 48 시간 동안 첨가하였다. 반응 혼합물을 2mL의 차가운 메탄올로 퀀칭하고(quenched) 그 후 용매(solvent)의 반을 감소된 압력 하에서 제거하고 20 mL의 클로로포름과 혼합하고, 50 mL의 포화 소듐 바이카보네이트 및 50 mL의 염수로 세척하였다. 유기층을 분리하고 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 5:2:3의 클로로포름/헥산/아세톤을 이용한 플래쉬 크로마토그래피는 1.7 g (27.8%)의 화합물 26d을 제공하였다. LC 시스템:5:2:3 클로로포름/헥산/아세톤, Rf = 0.42. ESMS 896.1 [C48H55N5O9Si (M+Na)+ requires 896.1].
N 2 - 이소부티릴 -2'- O - TBDMS -3'- O - DMT - 구아노신 (27d): 196 mL 피리딘 내 14 g (16.0 mmol)의 화합물 26d 및 21 mL의 메탄올 혼합물에 16 mL의 2 M 수성 용액의 소듐 히드록시드(32.0 mmol)를 0-5 oC에서 교반과 함께 25분의 코스 동안 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 15 mL의 2 M HCl로 중화하였다. 상기 용매를 감소된 압력 하에서 제거하고 잔여물을 두 부분의 25 mL의 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 결합하고(combined), 50 mL의 염수로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 5:2:3의 클로로포름/헥산/아세톤을 이용한 플래쉬 크로마토그래피는 10.4 g (84.3%)의 화합물 27d를 제공하였다. 1H NMR (CDCl3/D2O) d -0.54 (s, 3H), 0.01 (s, 3H), 088 (s, 9H), 1.21 (d, 3H, J=7.0 Hz), 1.23 (d, 3H, J=7.0), 2.66 (qq, 1H, J=7.0), 2.89 (d, 1H, J=12 Hz), 3.28 (s, 1H), 3.37 (dd, 1H, J5a ,5b=15 Hz, J5 ,4=2.5Hz) 3.80 (s, 6H), 4.24 (d, 1H, J=5 Hz), 4.83 (dd, 1H, J2 ,1=8 Hz, J2 ,3=5 Hz), 5.97 (d, 1H, J=8 Hz), 6.84 (dd, 4H, J=9 Hz, J=2 Hz), 7.23 (t, 1H, J=7.5 Hz), 7.30 (t, 2H, J=7 Hz), 7.45 (m, 4H), 7.59 (d, 2H, J=7.5 Hz), 7.77 (s, 1H). ESMS 792.8 [C41H51N5O8Si (M+Na)+ requires 792.9].
N 2 - 이소부티릴 -2'- O - TBDMS -3'- O - DMT - 구아노신 -5'- 시아노에틸 - N,N- 디이소프로 필 - 포스포라미디트 (16d): 104 mL의 아세토니트릴 내 10.4 g (13.5 mmol)의 화합물 27, 3.4 g (26.12 mmol)의 에틸티오테트라졸, 4.7 mL (27 mmol)의 DIPEA 및 1.08 mL (13.5 mmol)의 N-메틸이미다졸에 8.4 mL (26.12 mmol)의 2-시아노에틸-N,N,N,N-테트라이소프로필포스판을 실온에서 교반과 함께 적가하였다. 3 시간 후 상기 반응 혼합물을 100 mL의 에틸아세테이트로 희석하고 200 mL의 포화 소듐 바이카보네이트 및 200 mL의 염수로 세척하였다. 상기 유기층을 분리하고 2 g의 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 7:2:1의 클로로포름/헥산/트리에틸아민을 이용한 플래쉬 크로마토그래피는 12 g (92.1%)의 화합물 16d.를 제공하였다. 31P NMR (CDCl3) d 149.05 및 149.73. ESMS 993.3 [C50H68N7O9PSi (M+Na)+ requires 993.2].
실시예 2
N 4 -아세틸-2'- O - TBDMS -3'- O - DMT - 시티딘 -5'- 시아노에틸 - N,N- 디이소프로필 - 포스포라미디트 (16c)의 합성.
N 4 -아세틸-2'- O - TBDMS -3'- O - DMT - 시티딘 (27c): 54 mL의 피리딘 내 5g(6.2 mmol)의 화합물 26c 및 6 mL의 메탄올 혼합물 용액에 6.2 mL의 2 M 수성 용액 소듐 히드록시드(12.4 mmol)를 25분의 과정 동안 0-5 oC에서 교반과 함께 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 6 mL의 2 M HCl로 중화하였다. 상기 용매를 감소된 압력 하에서 제거하고 잔여물을 두 부분의 15 mL의 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 결합하고(combined), 50 mL의 염수로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 5:2:3 클로로포름/헥산/아세톤을 이용한 플래쉬 크로마토그래피는 4 g (91.9%)의 화합물 27c을 제공하였다. 1H NMR (CDCl3/D2O) d 0.07 (s, 3H), 0.16 (s, 3H), 0.97 (s, 9H), 2.24 (s, 3H), 3.16 (br. d, 1H, J5a ,5b=12 Hz), 3.55 (br. d, 1H, J5a ,5b=12 Hz) 3.79 (s, 6H), 4.08 (t, 1H, J=4.5 Hz), 4.44 (br. s., 1H), 4.78 (br. s., 1H), 5.61 (d, 1H, J= 4.1), 6.80 (dd, 4H, J=7 Hz, J=3 Hz), 7.22 (t, 1H, J=7.5 Hz), 7.27 (t, 2H, J=7 Hz), 7.38 (m, 4H), 7.52 (d, 2H, J=7.3 Hz), 8.08 (br.s, 1H). ESMS 724.8 [C38H47N3O8Si (M+Na)+ requires 724.3].
N 4 -아세틸-2'- O - TBDMS -3'- O - DMT - 시티딘 -5'- 시아노에틸 - N,N- 디이소프로필 - 포 스포라미디트 (16c): N 2 -이소부티릴-2'- O-TBDMS-3'- O-DMT-구아노신-5'-시아노에틸-N,N-디이소프로필-포스포라미디트 (16d)와 유사하게 제조하였다. 수율은 62.6 %. 31P NMR (CDCl3) d 149.1 및 149.5. ESMS 925.0 [C47H64N5O9PSi (M+Na)+ requires 924.4].
실시예 3
2 '- O - TBDMS -3'- O - DMT -우리딘-5'- 시아노에틸 - N,N- 디이소프로필 - 포스포라미디 트 (16k)의 합성.
2'- O - TBDMS -3'- O - DMT -우리딘 (27k): 450 mL의 피리딘 내 30 g (39.3 mmol)의 화합물 26k 및 45 mL의 메탄올 혼합물의 용액에 40 mL의 2 M 수용액의 소듐 히드록시드(80.0 mmol)를 25분의 경과 동안 0-5 oC에서 교반과 함께 적가하였다. 상기 반응 혼합물은 40 mL의 2 M HCl로 중화하였다. 상기 용매를 감소된 압력 하에서 제거하고 50 mL의 클로로포름 두 부분으로 추출하였다. 유기층을 결합하고(combined), 50 mL의 염수로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 6.5:2:1.5 클로로포름/헥산/아세톤을 이용한 플래쉬 크로마토그래피는 24 g (92.5%)의 화합물 9k을 제공하였다. 1H NMR (CDCl3) d 0.06 (s, 3H), 0.14 (s, 3H), 0.97 (s, 9H), 2.12 (br. d, 1H, J=4 Hz), 3.16 (br. dd, 1H, J5a ,5b=12.7 Hz, J5a4=7.6 Hz), 3.55 (br. d, 1H, J5a,5b=12.7 Hz J5b4=4.3 Hz) 3.65-3-64 (m, 1H) 3.79 (s, 6H), 4.07 (t, 1H, J=4.3 Hz), 4.28 (t, 1H, J=4.3 Hz), 5.66 (d, 1H, J=4.9 Hz), 5.69 (d, 1H, J= 8.1 Hz), 6.82 (dd, 4H, J=7 Hz, J=3 Hz), 7.22 (t, 1H, J=7.5 Hz), 7.28 (t, 2H, J=7 Hz), 7.38 (d, 4H, J=8.9 Hz), 7.54 (d, 2H, J=8.8 Hz), 7.68 (d, 1H, J=8.2), 8.74 (br. s, 1H). ESMS [C36H44N2O8Si (M+Na)+ requires 683.3].
2'-O - TBDMS -3 '-O - DMT -우리딘-5 '- 시아노에틸 - N,N- 디이소프로필 - 포스포라미디 트 (16k): 190 mL의 THF 내 24.0 g (36.4 mmol)의 화합물 27k, 24 mL (182 mmol)의 콜리딘, 2.88 mL의 N-메틸이미다졸에 16.22 mL (72.8 mmol)의 2-시아노에틸-N,N, 디이소프로필포스폰아미딕 클로라이드를 교반과 함께 실온의 Ar 하에서 적가하였다. 1.25 시간 후 상기 반응 혼합물은 100 mL의 에틸아세테이트로 희석하고 200 mL의 포화 소듐 바이카보네이트 및 200 mL의 염수로 세척하였다. 상기 유기층을 분리하고 20 g의 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 5:4:1 에틸아세테이트/헥산/트리에틸아민을 이용한 플래쉬 크로마토그래피는 18 g (80.0%)의 화합물 16k을 제공하였다. 31P NMR (CDCl3) d 148.9 and 149.6. ESMS 884.1 [C45H61N4O9PSi (M+Na)+ requires 884.0].
실시예 4
N 4 - 벤조일 -2'O - TBDMS -3'- O - DMT -아데노신-5'- 시아노에틸 - N,N- 디이소프로필 - 포 스포라미디트 (16a)의 합성.
N 4 - 벤조일 -2'- O - TBDMS -3'- O - DMT -아데노신 (27a): 189 mL의 피리딘 내 14 g (15.7 mmol)의 화합물 26a 및 21 mL의 메탄올 혼합물의 용액에 15.7 mL의 2 M 수용액의 소듐 히드록시드(31.4 mmol)를 교반과 함께 0-5 oC에서 25 분의 경과 시간 동안 적하하였다. 상기 반응 혼합물을 12 mL의 2 M HCl로 중화하였다. 상기 용매를 감소된 압력 하에서 제거하였고 잔여물을 25 mL 클로로포름의 두 부분으로 추출하였다. 유기층을 결합하고(combined), 50 mL의 염수로 세척하고 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 6.5:2:1.5 클로로포름/헥산/아세톤을 이용한 플래쉬 크로마토그래피는 11.0 g (88.9%)의 화합물 27a을 제공하였다. 수율(Yield)은 %. 1H NMR (CDCl3/H2O) d -0.75 (s, 3H), -0.01 (s, 3H), 0.86 (s, 9H), 3.03 (t, 1H, J5a ,5b=12.8 Hz), 3.29 (s, 1H), 3.47 (br. d, 1H, J5a ,5b=12.8 Hz) 3.80 (s, 6H), 4.35 (d, 1H, J=4.9 Hz), 5.17 (dd, 1H, J=8 Hz, J=5 Hz), 5.93 (dd, 1H, J= 12 Hz, J=2 Hz), 6.15 (d, 1H, J=8 Hz), 6.85 (dd, 4H, J=7 Hz, J=3 Hz), 7.23 (t, 1H, J=7.5 Hz), 7.30 (t, 2H, J=7 Hz), 7.48 (m, 4H), 7.52 (t, 2H, J=7.3 Hz), 7.62 (d, 3H, J=7.5 Hz), 8.03 (d, 2H, J=7.5 Hz), 8.14 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 9.07 (s, 1H). ESMS [C44H49N5O7Si (M+Na)+ requires 787.3].
N 4 - 벤조일 -2'-O - TBDMS -3 '-O - DMT -아데노신-5 '- 시아노에틸 - N,N- 디이소프로필 -포스포라미디트 (16a): 88 mL의 증류된 THF 내 11.0 g (12.0 mmol)의 화합물 27a, 9.2 mL (60.0 mmol)의 콜리딘, 1.1 mL의 N-메틸이미다졸의 용액에 6.23 mL (24.0 mmol)의 2-시아노에틸-N,N, 디이소프로필-포스폰아미딕 클로라이드를 Ar 하의 실온에서 교반과 함께 적가하였다. 1.25 시간 후 상기 반응 혼합물을 50 mL의 에틸아세테이트로 희석하고 100 mL의 포화 소듐 바이카보네이트 및 100 mL의 염수로 세척하였다. 상기 유기층을 분리하고 10 g의 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 5:4:1 에틸아세테이트/헥산/트리에틸아민을 이용한 플래쉬 크로마토그래피는 9.0 g 77.7%)의 화합물 16a을 제공하였다 31P NMR (CDCl3) d 143.97 and 144.14. ESMS 987.2 [C53H66N7O8PSi (M+Na)+ requires 987.45 ].
구조 3'- O - DMT -2'- O - TBDMS 뉴클레오시드 27a, 27c, 27d, 27k, 16a, 16c, 16d, 16k 및 5'- O - DMT -2'- O - TBDMS 뉴클레오시드 28-31의 비교 1 H NMR 데이터.
Figure 112011025090473-pct00027
구조 (28)
표 1. 구조 27d, 16d 및 구조 28의 비교 1H NMR 데이터.
[표 1]
Figure 112011025090473-pct00028
Figure 112011025090473-pct00029
구조 (29)
표 2. 구조 27c, 16c 및 구조 29의 비교 1H NMR 데이터.
[표 2]
Figure 112011025090473-pct00030
Figure 112011025090473-pct00031
구조 (30)
표 3. 구조 27k, 16k 및 구조 30의 비교 1H NMR 데이터.
[표 3]
Figure 112011025090473-pct00032
Figure 112011025090473-pct00033
구조 (31).
표 4. 구조 27a, 16a 및 구조 31의 비교 1H NMR 데이터.
[표 4]
Figure 112011025090473-pct00034

실시예 5
2'- O - TBDMS -3'- O - DMT -우리딘-5'- succinyl - CPG 의 합성.
2'- O - TBDMS -3'- O - DMT - 우리딘 -5'- succinate: 20 mL의 피리딘 내 2.0 g (3.03 mmol)의 화합물 27k 및 0.11 g (0.91 mmol)의 DMAP 용액에 0.9 g (9.1 mmol)의 숙시닉 무수물을 37 oC에서 교반과 함께 첨가하였다. 12 시간 후 상기 반응 혼합물을 30 mL의 클로로포름으로 희석하고 50 mL의 염수로 세척하였다. 상기 유기층을 분리하고 10 g의 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 5:3:2:0.01:0.05 클로로포름/헥산/아세톤/피리딘/메탄올을 이용한 플래쉬 크로마토그래피는 1.8 g (75.9 %)의 2'-O-TBDMS-3'-O-DMT-우리딘-5'-숙시네이트를 제공하였다. 1H NMR (CDCl3/D2O) d 0.05 (s, 3H), 0.07 (s, 3H), 0.96 (s, 9H), 2.21 (dt, 1H, J=17 Hz, J=6 Hz), 2.40-2.46 (m, 1H), 2.51 (dt, 1H, J=17 Hz, J=6 Hz), 2.60-2.66 (m, 1H), 3.42 (t, 1H, J=3.3 Hz), 3.77 (s, 6H), 3.95-3.98 (m, 2 H), 4.11 (br.d, 1H, J=12.8 Hz), 4.16 (m, 1H), 5.72 (d, 1H, J=2.8 Hz), 5.74 (d, 1H, J= 8.1 Hz), 6.79 (dd, 4H, J=9 Hz, J=1.9 Hz), 7.21 (t, 1H, J=7 Hz), 7.25 (t, 2H, J=7 Hz), 7.38 (d, 4H, J=8.9 Hz), 7.48 (d, 2H, J=7.2 Hz), 7.61 (d, 1H, J=8.2 Hz), 7.72 (t, 1H, J=5.9 Hz), 8.61 (br.d, 1H, J=4.4 Hz). ESMS 784.2 [C40H48N2O11Si (M+Na)+ requires 783.9].
2'- O - TBDMS -3'- O - DMT - 우리딘 -5'- succinyl - CPG: 60 mL의 DMF 내 18 g의 아미노-lcca-CPG 및 3.6 mL의 트리에틸아민의 서스펜션에 4 mL의 DMF 내 1.8 g (2.3 mmol)의 O-TBDMS-3'-O-DMT-우리딘-5'-숙시네이트, 0.408 g (3.55 mmol) N-히드록시숙신이미드 및 0.586 g (2.76 mmol)의 DCC 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 37 oC까지 승온시켰다. 16 시간 후 CPG를 여과하고, 3x20 mL 부분(portion)의 아세토니트릴로 세척하고, 피리딘/N-메틸이미다졸 내 아세틱 무수물 혼합물로 캡핑하고(capped) 이세토니트릴의 3x20 mL 부분으로 세척하였다. 고체 지지체를 감소된 압력 하에서 건조시키고 뉴클레오시드 로딩(loading)을 DMT 제거 공정으로 측정하고 44.2 mmol/g 로딩을 갖는 18 g의 최종 생성물을 수득하였다.
실시예 6
올리고뉴클레오티드 합성: 하기의 올리고뉴클레오티드(표 5)를 3'→5' 방향의 표준(standard) RNA 포스포라미디트 화학(chemistry)을 1 mmole 스케일(scale)로 사용하여 합성하였다. 상기 합성은 Expedite 8900 합성기(synthesizer) 상에서 표준 RNA 1 mmole 사이클(cycle)을 이용하여 합성되었다.
합성에 후속적으로, 조절된 다공(pore) 글래스(CPG) 고체 지지체를 2 ml 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)에 옮겼다. 올리고뉴클레오티드를 상기 CPG로부터 분리하고(cleave) 1 ml의 물 내 40% 메틸아민 용액에서 30 분간 65oC에서 인큐베이션 하여 탈보호한다. 상층액(supernatant)을 제거하고 상기 CPG를 1 ml의 물로 세척하고; 상층액을 모으고(pooled) 건조시킨다. 상기 t-부틸-디메틸실릴 보호기를 250 ul의 새로운 무수 트리에틸암모늄-트리하이드로플루오라이드로 실온의 초음파 배쓰(bath)에서 2 시간 동안 처리하여 상기 RNA 잔여물로부터 제거하였다. 상기 올리고뉴클레오티드를 1.5 ml의 n-부탄올에 의해 침전시키고; 상기 시료를 -70oC까지 1시간 동안 냉각시키고 그 후 10,000g에서 10 분간 원심분리하였다. 상기 상층액을 붓고(decanted), 펠렛을 n-부탄올로 다시 한번 세척하였다.
상기 올리고뉴클레오티드를 그 후 선형 역-상 HPLC에 의해 0.1 M 트리에틸-암모늄 아세테이트 (TEAA) pH 7.2 내 아세토니트릴의 선형 구배(linear gradient)를 이용하여 정제하였다. 상기 전체 샘플을 Hamilton PRP-1 컬럼(1.0 cm x 25 cm)에 로딩하고 선형 5% 내지 50% 아세토니트릴 구배로 40분 동안 용출시킨다(elute). 샘플을 260 nm에서 관찰하고 바라는 올리고뉴클레오티드 종(species)에 상응하는 피크를 수집하고(collected), 모으고(pooled), 그리고 동결건조(lyophilized)한다.
상기 올리고뉴클레오티드 샘플을 200 ul의 멸균 수 내에 용해시키고 1 ml의 2% LiClO4를 첨가하여 침전시키고 10,000g에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 붓고(decanted) 상기 펠렛을 10% 수성 아세톤으로 세척하였다. 올리고뉴클레오티드 합성에 적절한 상기 표준 dT 및 콜레스테롤 대응 고체 지지체가 사용되었다.
표 5. 통상적인 방법에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드 서열
[표 5]
Figure 112011025090473-pct00035

하기의 올리고뉴클레오티드(표 6)를 5'→3' 방향의 역 포스포라미디트 화학(chemistry)을 1 mmole 스케일(scale)로 사용하여 합성하였다. 표준 공정과 같은 동일한 합성 사이클(cycle) 및 보조적인 시약이 역 합성을 위해 사용되었다. 상기 역 rC-lcaa-CPG를 모든 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용하였다. 상기 올리고뉴클레오티드 SEQ ID No.의 2-43'-변형을 콜레스테롤, PEG-2000 또는 HEG 포스포라미디트 각각을 이용하여 도입하였다.
표 6. 역 방법에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드 서열
[표 6]
Figure 112011025090473-pct00036

조질의 올리고뉴클레오티드를 CE 및 ESI 질량분석법(mass-spectrometry)에 의해 분석하였다.
올리고뉴클레오티드 3'-말단에서의 용이한 부착을 위한 다양한 수의 적용이 가능한다. 몇몇 예가 도 7에 개괄되어 있다:
1. 콜레스테롤, C-18, 트리에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜과 같은 긴 사슬 지방족 사슬과 같은 벌키 분자의 RNA의 3'-말단에서의 부착을 위해, 이러한 아미디트와의 직접 커플링(Direct coupling)이 용이하게 획득될 수 있다.
2. PEG 2000 아미디트 및 PEG 4000 아미디트와 같은 폴리에틸렌 글리콜의 RNA 분자의 3'-말단의 부착.
3. 3'-티올 변형의 용이한 부착을 위해. 용이하게 입수가능한 아미디트, viz., C-3 이황화물, C-6 이황화물로부터의 3'-이황화물.
4. 비오틴 아미디트를 통한 단일의 단계에서의 3'- 비오틴 부착 및 이러한 목적을 위한 비오틴 CPG의 회피.
5. siRNA의 센스 가닥(3'- 말단)의 변형. 돌출(overhang)의 변형(modification)은 표적된 mRNA의 인식에 영향을 미치지 않는 것으로 기대되며, 안티센스 siRNA 가닥이 표적의 인식을 가이드 하기 때문이다. siRNA 전달의 향상을 위한 유용한 변형이 용이하게 디자인될 수 있다.
표 3. 구조 27k, 28k 및 화학식 8의 비교 1H NMR 데이터.
[표 3]
Figure 112011025090473-pct00037

본 발명자들은 하기 기록에서 다양한 혁신, 이점 및 가능성, 그리고 본 발명의 몇몇 생성물 및 상세한 방법을 요약하였다. 이러한 리스트는 편리하고 설명적인 요약을 제공하기 위한 것이고, 이는 완전하거나, 철저하거나, 한정하는 것이 아니다.
* 일반 화학식 1의 유도된 뉴클레오시드 및 포스포라미디트:
Figure 112011025090473-pct00038
여기서
Y는 산소 또는 황;
W는 산소, 질소, 황 또는 불소;
R4은 W가 황이 아닌 경우 TBDMS, 트리이소프로필실릴 옥시메틸렌, Fmoc, 알킬, 아릴, 또는 아세틸과 같은 실릴 에테르이나; W가 황인 경우 R4은 벤조일, 아세틸 또는 이황화물;
Z는 DMT, MMT, 또는 TMT 보호기;
R1 및 R2은 독립적으로 알킬 또는 아릴기로부터 선택되며;
R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴이다.
* 일반 화학식 2의 고체 지지체에 부착된 유도된 뉴클레오시드:
Figure 112011025090473-pct00039
여기서,
M은 수소 라디칼 또는 Y-CO-;
Y는 길이 2 내지 20 원자의 사슬이며, 산소, 질소 및 황으로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로 원자로 임의로 치환된 탄화수소이거나 또는 CPG, 폴리스티렌 또는 올리고뉴클레오티드 합성에 적절한 어떠한 다른 고체 지지체와 같은 고체 지지체를 연결하기에 적절한 링커(linker)를 필수적으로 포함하며;
W는 산소, 질소, 황 또는 불소;
R은 W이 황이 아닌 경우 TBDMS, 트리이소프로필실릴 옥시메틸렌, Fmoc, 알킬, 아릴, 아미노 또는 아세틸과 같은 실릴 에테르이나; W가 황인 경우 R은 벤조일, 아세틸 또는 이황화물;
Z는 DMT, MMT, 또는 TMT 보호기이다.
* 합성적인 RNA 올리고머에서 화학식 10에서 나타난 5'→3' 방향의 올리고뉴클레오티드 결합 형성을 위한 방법. 상기 RNA는 천연 또는 변형된 핵 염기(nucleo bases), 갭머(gapmers), 포스포다이에스테르, 포스포로티에이트(phosphorothiates)를 포함할 수 있다. 상기 합성은 자동, 반자동화 된 DNA/RNA 또는 다른 합성기 상에서 수행되거나 수동적으로 수행될 수 있다. 상기 합성은 마이크로그램 내지 키로그램 스케일의 다양한 스케일에서 수행될 수 있다.
Figure 112011025090473-pct00040
화학식 (10)
* 대응하는 포스포라미디트(화학식 11)를 이용한 RNA 분자의 3'- 말단에서의 변형의 부착 방법으로, 여기서 L은 비오틴 또는 콜레스테롤이거나, 플루오로포어, 퀀쳐 다이(quencher dyes), 폴리에틸렌 글리콜 및 펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것과 같은 변형이다.
Figure 112011025090473-pct00041
화학식 (11)
* 고순도의 RNA의 결과를 가져오는 역 방향 (5'→3') RNA 합성을 이용한 자동화된 고순도의 RNA 합성.
* 콜레스테롤, 헥사에틸옥시글리콜(HEG) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 마크로분자를 이용한 RNA의 3-'컨쥬게이션.
* 역방향(5'→3')에서의 자동화된 RNA 합성의 적용, M+1 올리고뉴클레오티드 분술물 결여의 결과를 가져옴.
* 상기에서 언급된 이러한 방법에 의해 편입된 변형된 뉴클레오시드는 하나 이상의 5-플루오로-U, 5-플루오로 dU, 5-플루오로-dC, 5-플루오로(Fluro)-rC, 슈도우리딘, 5-메틸-dU, 5-메틸-rU, 5-메틸-dC, 5-메틸-rC, 5-브로모-dU, 5-브로모-rU, 5-브로모-dC, 5-브로모-rC, 5-이오도-dU, 5-이오도-rU, 5-비닐-dU, 5-비닐-rU, 5-비닐 티미딘, N-3 메틸데옥시 우리딘, N-3 메틸-리보우리딘, N-3 메틸 티미딘, 4-티오 우리딘, 4-티오-2'-데옥시우리딘, 2,6-디아미노퓨린 데옥시 리보시드, N-3 메틸 리보티미딘, 2, 6-디아미노퓨린 리보시드, 8-브로모 2'-데옥시 아데노신, 8-브로모-r-아데노신, 8-옥소-데옥시 아데노신, 8-옥소-리보아데노신, 8-옥소-2'-데옥시-아데노신, 8-옥소-리보아데노신, 8-옥소-데옥시 이노신, 8-옥소-리보 이노신, 8-브로모-데옥시 이노신, 8-브로모-리보-이노신, N-1 메틸-리보아데노신, N-1 메틸-2'-데옥시 아데노신, N-1 메틸 2'-데옥시 이노신, N-1 메틸 리보아데노신, N-1 메틸데옥시 구아노신, N-1-메틸- 리보구아노신, 에테노 아데노신, 에테노 2'- 데옥시 아데노신, 퓨린 2'-데옥시 리보시드, 퓨린-리보뉴클레오시드, 2-아미노퓨린-2'-데옥시리보시드, 2-아미노퓨린-리보뉴클레오시드와 같은 퓨린 또는 피리미딘 변형을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
* 이러한 방법에 의해 합성된 RNA의 내부 위치의 라벨링을 Fluoroscein-C-5 dT, Dabcyl- C-5 티미딘, 내부 카르복실기 5-dU-메틸 아크릴레이트, 비오틴 dT (비오틴은 dU의 C-5에 스페이서를 통해 부착됨), 아미노-dT ( 말단 아미노는 C-6 스페이서를 통해 C-5 dU에 부착됨)와 같은 크로모포어로 획득하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
* 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 A, C, G, U , 이노신 및 2'-플루오로를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은 2'- 데옥시-2'-플루오로 리보 뉴클레오시드 (2'-F-ANAs)를 본 발명에 의한 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 이상의 위치에 포함할 수 있다.
* 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 A, C, G, U , 이노신 및 2'-메톡시를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은 2'-데옥시-2'-메톡시 리보 뉴클레오시드 (2'-OMe-)를 본 발명에 의한 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 이상의 위치에 포함할 수 있다.
* 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 A, C, G, U , 이노신 및 2'-아미노를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은 2'- 데옥시-2'-아미노 리보 뉴클레오시드 (2'-NH2)를 본 발명에 의한 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 이상의 위치에 포함할 수 있다.
* 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 A, C, G, U , 이노신 및 2'-말단 아미노를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은, 뉴클레오시드 상의 2-10 원자 스페이서를 통해 부착된, 2'- 데옥시-2'- 말단 아미노 리보 뉴클레오시드 (2'-말단 NH2)를 본 발명에 의한 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 이상의 위치에 포함할 수 있다.
* 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 A, C, G, U , 이노신 및 2'-MOE를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은 2'- 데옥시-2'-아미노 리보 뉴클레오시드 (2'-MOE)를 본 발명에 의한 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 이상의 위치에 포함할 수 있다.
* 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 A, C, G, U , 이노신 및 2'-OEt, O-프로파르길, 2'-O-부틴를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은, 2'- 데옥시-2'-에톡시, 프로파르길, 부틴 리보 뉴클레오시드 (2'-OEt, O-프로파르길, 2'-O-부틴)과 같은 닫른 2'-O-알킬기를 본 발명에 의한 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 이상의 위치에 포함할 수 있다.
* 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 A, C, G, U , 이노신 및 2'-F-ANAs를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은 2'- 데옥시-2'-플루오로 아라비노 뉴클레오시드 (2'-F-ANAs)를 본 발명에 의한 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 이상의 위치에 포함할 수 있다.
* 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 A, C, G, U , 이노신 및 4'-S-FANAs를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은 2'- 데옥시-2'-플루오로 4'-티오아라비노 뉴클레오시드 (4'-S-FANAs)를 본 발명에 의한 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 이상의 위치에 포함할 수 있다.
* RNA는 서열 내 서열의 3'-말단 또는 서열의 5'-말단에 하나 이상의 2'-5'-연결(linkage)로 수행될 수 있다.
* 3'-말단을 갖는 RNA는 3'-히드록실 작용에 의해 부착된 dT, dC, dG , 티미딘와 같은 역 부착된 데옥시 뉴클레오시드를 포함하는 본 발명의 방법에 의해 합성될 수 있다.
* 3'-말단을 갖는 RNA는 2'- 또는 3'-히드록실 작용에 의해 부착된 rA, rC, rG, rU와 같은 역 부착된 리보뉴클레오시드를 포함하는 본 발명의 방법에 의해 합성될 수 있다.
* 상기 역 RNA 합성은 2'-트리이소프로필실릴옥시 메틸 (TOM) 보호기를 포함하여 획득될 수 있다.
* 상기 역 RNA 합성은 2'-t-부틸디티오메틸 (DTM) 보호기를 포함하여 획득될 수 있다.
* 상기 역 RNA 합성은 2'- 데옥시-2'- 플루오로- 베타-D-아라비노핵산 (FANA)을 포함하는 변형된 염기를 포함하여 획득될 수 있다.
* 상기 역 RNA 합성은 4'-티오- 2'- 데옥시-2'- 플루오로- 베타-D-아라비노핵산 (4'-티오- FANA)를 포함하는 변형된 염기를 포함하여 획득될 수 있다.
* 상기 역 RNA 합성은 2'-O메틸 변형을 이용한 변형된 당을 포함하여 획득될 수 있다.
* 상기 역 RNA 합성은 바이시클릭 잠김(locked) 핵산(LNA's)을 이용하여 획득될 수 있다.
* 상기 역 RNA 합성은 알트리톨 당 변형된 올리고뉴클레오티드 (ANA)를 포함하는 변형된 당을 이용할 수 있다.
* 상기 역 RNA 합성은 RNA의 3'-말단에 소수성 부 상의 아미디트 작용을 통해서 또는 말단 아미노기를 갖는 역 합성된 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에서 아미노 링커를 통해서 친유성 또는 소수성기의 컨쥬게이션 단계를 포함할 수 있다. 후자의 합성은 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에서의 아미노와 친유성 부 상의 카르목실릭 작용 사이의 커플링 단계를 포함한다.
* 상기 역 RNA 합성은 펩티드의 자유 아민 작용 또는 역 합성된 RNA 상의 3'- 말단 카르복실릭 작용을 이용하여 세포 관통 펩티드(CPPs) 또는 막 침투 펩티드(MPPs)와 같은 펩티드의 컨쥬게이션 단계를 포함할 수 있다. 적절한 카르복실 작용을 갖는 CPPs 및 MPPs는 상기 역 합성된 RNA의 3'-말단의 자유 말단 아미노 작용기에 커플링될 수 있다.
* 상기 역 RNA 합성은 2'-5'- 연결된 DNA 유닛 또는 2'-5'- RNA 단위를 서열 내, 서열의 3'-말단 또는 서열의 5'-말단에 포함한다.
당해 기술분야의 숙련자들은 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 구현의 많은 등가물(equivalents)을 인식하거나 또는 알 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기의 청구항에 포함되는 것으로 의도된다. 종속항에 기술된 어떠한 조합의 구현 또한 본 발명의 견지에 포함된다.

Claims (3)

  1. 화학식 (1)의 포스포라미디트,
    Figure 112016080782938-pct00042

    화학식 (1)
    여기서,
    Y는 산소 또는 황;
    W는 산소;
    R4는 삼차 부틸 디메틸 실릴 (TBDMS), 트리이소프로필실릴 옥시메틸렌, 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (FMOC), 알킬, 아릴, 및 아세틸로 구성된 그룹의 한 멤버이며;
    Z는 4,4'-디메톡시 트리페닐 메틸 (DMT), 4-모노메톡시 트리페닐 메틸 (MMT) 및 4,4',4"-트리메톡시 트리페닐 메틸 (TMT)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 보호기;
    R1은 알킬 또는 아릴기;
    R2는 알킬 또는 아릴기;
    R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴; 그리고
    B는 수소 또는 임의로 각 일차 아민이 아민 보호기로 기능화된 핵염기이다.

  2. 삭제
  3. 하기 두 화합물을 반응시키는 단계를 포함하며;
    Figure 112016080782938-pct00044
    및
    Figure 112016080782938-pct00068

    하기로부터 선택되는 구조 화학식에 의해 표현되는 RNA 올리고머 합성을 위한, 5'에서 3' 방향으로의 결합 형성에 의한 올리고뉴클레오티드의 제조 방법:
    Figure 112016080782938-pct00046

    여기서;
    B는 수소 또는 임의로 각 일차 아민이 아민 보호기로 기능화된 핵염기이며;
    n은 0 내지 98이며;
    Y는 산소 또는 황;
    W는 산소;
    R4는 삼차 부틸 디메틸 실릴 (TBDMS), 트리이소프로필실릴 옥시메틸렌, 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (FMOC), 알킬, 아릴, 또는 아세틸이며;
    Z는 4,4'-디메톡시 트리페닐 메틸 (DMT), 4-모노메톡시 트리페닐 메틸 (MMT) 및 4,4',4"-트리메톡시 트리페닐 메틸 (TMT)로 구성되는 그룹으로부터 선택되며;
    R1 및 R2는 알킬 및 아릴기로부터 독립적으로 선택되며;
    R3은 시아노에틸, 알킬 또는 아릴이며; 그리고
    M은 수소 라디칼 또는 Y-CO-이며; 여기서 Y는 고체 지지체에 부착하기에 적절한 링커(linker)이다.
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