CN116333006A - 一种带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,涉及寡核苷酸固相合成技术领域。本发明无需在寡核苷酸的合成之后单独进行荧光标记物的化学反应,缩短了合成周期。能够实现合成自动化,而且不需要使用额外的设备。将带有亚磷酰胺基团的荧光标记物与脱除的保护基的固相载体发生偶合后,大幅提升了单步的偶联产率。本发明还避免了过量添加荧光标记物从而造成的荧光标记物的浪费,节约了成本。此外,固相合成方法所使用的试剂相对无毒无害,更环保。
Description
技术领域
本发明涉及寡核苷酸固相合成技术领域,具体而言,涉及一种带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法。
背景技术
荧光标记的核酸序列常被用于疾病的检测、辅助诊断、诊断。目前的荧光标记的核酸都是通过化学合成的方法制得。化学合成脱氧核糖寡核苷酸是指通过促使核苷酸单体间形成5’-3’磷酸二酯键,从而将多个核苷酸单元连接为脱氧核糖寡核苷酸链的过程。
目前主流的寡核苷酸合成方法采用的是固相合成法,首先将核苷酸上的5’-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护,碱基上的氨基用酰基保护,3’-OH用咪唑/氮唑类化合物进行活化。将第一个核苷酸的3’-OH与固相树脂结合在一起,并脱去5’-OH上的保护基,使裸露的5’-OH与第二个核苷酸β-氰乙基直接保护的3’位的亚磷酰胺之间形成一个亚磷酸三酯,亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯,再加入二氯乙酸除去第二个核苷酸的5’-OH上的保护基。至此,寡核苷酸链已经延伸了一个核苷酸单元,并可投入下一轮延伸反应。经过若干轮的延伸反应,整个寡核苷酸片段合成完毕之后,用浓氢氧化铵将寡核苷酸片段从固相树脂上洗脱下来,经过脱保护和纯化得到寡核苷酸。
该方法的荧光标记的核酸的是通过固相合成方法优先得到前端序列(图3所示),再经过氨解脱保护和纯化,最终冻干后得到冻干粉。核酸序列末端的氨基与荧光标记物活化酯(图2所示)进行缩合反应,最终得到了荧光标记的核酸产品。
目前的合成方法存在多步反应,合成周期长,需要把核酸部分纯化冻干后,然后连接上荧光修饰物,最后进行纯化冻干。目前所采用的合成方法不仅需要核酸的固相合成,也需要进行常规的化学反应。目前的方法存在偶联效率偏低,且一般荧光标记物都需要过量,最终的转化率(粗品纯度)只能达到70~80%左右。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法以提高带有荧光标记物的寡核苷酸的偶联率,提高固相合成的产率,简化合成步骤,缩短合成周期。
本发明是这样实现的:
本发明提供了一种带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,其包括如下步骤:
(a)使得结合有第一个核苷酸的固相载体与脱保护试剂接触,从而脱除第一个核苷酸的5’-OH上的保护基;
(b)使得步骤(a)的固相载体与活化剂、核苷酸单体接触,使得核苷酸单体的三价P与固相载体上的脱除了保护基的5’-OH发生偶合;
(c)氧化;
(d)盖帽;
(e)重复步骤(a)-(d);
(f)在合成最后一个核苷酸时,在步骤(b)中,将带有亚磷酰胺基团的荧光标记物、活化剂与结合有寡核苷酸的固相载体接触,带有亚磷酰胺基团的荧光标记物通过与寡核苷酸的5’-OH形成P-O键共价结合;
带有亚磷酰胺基团的荧光标记物的结构式如下式(I)所示:
(c)氧化;
(d)盖帽;
(e)重复步骤(a)-(d)。
发明人发现,将原有活化酯形式的荧光标记物替换为带有亚磷酰胺基团的荧光标记物,可以直接仅通过固相合成完成带有荧光标记物的寡核苷酸的合成。与现有技术相比,无需在寡核苷酸的合成之后单独进行荧光标记物的化学反应,缩短了合成周期。采用本发明提供的固相合成方法,能够实现合成自动化,而且不需要使用额外的设备。发明人发现,带有亚磷酰胺基团的荧光标记物与固相载体脱除的保护基的3‘-OH发生偶合后,大幅提升了单步的偶联产率(超过98%),显著提升了固相合成的产率(收率)。此外,采用上述的合成方法,也避免了过量添加荧光标记物从而造成的荧光标记物的浪费,节约了成本。本发明提供的固相合成方法所使用的试剂相对无毒无害,更环保,为合成期间实验人员的身体健康提供了一定的保障。
步骤是(d)盖帽为了控制杂质,将上一步没有参与反应的活性位点进行反应,避免其参与下一步偶联反应。
上述步骤(e),此反应循环可以重复一次或多次,每循环一次,核苷酸链向5’-OH方向延伸一个核苷酸,直到合成出所要长度的寡核苷酸。当反应循环以氧化步骤结束时,得到的是5’-保护的寡核苷酸。当反应循环是以去保护步骤结尾时,得到的是5’-去保护的寡核苷酸。
盖帽可以防止未缩合的5’-OH进一步缩合造成错误延伸。在合成最后一个核苷酸时可以省略盖帽的步骤。
在本发明应用较佳的实施方式中,偶合制得如下式(II)所示的产物:
式(II):
B1:表示被酰基类保护基保护的天然型碱基或被酰基类保护基保护的修饰碱基。
被保护的核苷碱基是其中碱基的活性官能基被保护的核苷碱基。通常,核苷碱基具有能用胺保护基保护,例如通过形成酰胺或氨基甲酸酯加以保护的胺基。例如,腺嘌呤和胞嘧啶的胺基通常用苯甲酰保护基保护,而鸟嘌呤的胺基一般用异丁酰基、乙酰基或叔丁基苯氧基乙酰基保护。然而,也可以使用其它的保护方案。例如,为了快速去保护,腺嘌呤和鸟嘌呤的胺基用苯氧乙酰基保护,而胞嘧啶的胺基用异丁酰基保护。当使用带有被保护的核苷酸碱基的本发明多聚体合成低聚核苷酸时,除去保护基的条件将取决于所用的保护基。当使用酰胺基形式保护的氨基时,可以用碱溶液,例如浓氨水溶液、正甲胺溶液或叔丁胺/氢氧化铵溶液,处理该低聚核苷酸来除掉。
在一种可选的实施方式中,酰基类保护基包括不限于乙酰基、苯甲酰基、苯氧基乙酰基、异丁酰基或异丙基羰基;
在一种可选的实施方式中,天然型碱基为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基;
在一种可选的实施方式中,修饰碱基为5-甲基胞嘧啶基、5-氟尿嘧啶基、7-甲基鸟嘌呤基或7-脱氮腺嘌呤基。
在一种可选的实施方式中,B1表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基;
R:表示荧光标记物的发光基团;
R2:表示卤素原子、硝基或甲氧基;在一种可选的实施方式中,卤素原子为氟、氯、溴或碘;
n:为正整数;在一种可选的实施方式中,n为1-100的整数;
A+:表示三烷基铵离子或二烷基铵离子。
在本发明应用较佳的实施方式中,发光基团选自荧光素类染料及其衍生物;
在一种可选的实施方式中,荧光素类染料及其衍生物包括但不限于:异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)或其类似物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物和Alexa系列染料及其衍生物;
在一种可选的实施方式中,罗丹明类染料及其衍生物包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)或其类似物)、ROX;
在一种可选的实施方式中,Cy系列染料及其衍生物包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3或其类似物;
在一种可选的实施方式中,Alexa系列染料及其衍生物包括但不限于:AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物。
在本发明应用较佳的实施方式中,脱保护试剂包括不限于三氯乙酸的二氯甲烷溶液、三氟乙酸的乙腈溶液、二氯乙酸的甲苯溶液或二氯乙酸的二氯甲烷溶液。若脱保护试剂选自强酸,会对合成的核酸产生破坏。
在一种可选的实施方式中,脱保护试剂选自3%-10%的二氯乙酸的甲苯溶液。
在本发明应用较佳的实施方式中,活化剂选自四唑、5-乙硫基四唑、二氰基咪唑或吡啶鎓盐;
在一种可选的实施方式中,活化剂选自5-乙硫基四氮唑的乙腈溶液和4,5-二氰基咪唑的乙腈溶液中的任意一种;
在一种可选的实施方式中,每1mmol的固相合成规模中,活化剂以及带有亚磷酰胺基团的荧光标记物的反应当量分别为5~9mmol和1.5-2.0mmol。例如活化剂以及带有亚磷酰胺基团的荧光标记物的反应当量分别为5~7mmol和1.5-2.0mmol。
在本发明应用较佳的实施方式中,步骤(c)的氧化是使固相载体与氧化剂或硫化剂接触;
在一种可选的实施方式中,氧化剂选自碘液。硫化剂选自二硫化二苯乙酰或5-氨基-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮。
在本发明应用较佳的实施方式中,步骤(e)结束后,还包括脱氰乙基,然后使得固相支持物与合成的产物分离。
在本发明应用较佳的实施方式中,脱氰乙基是采用二乙胺的乙腈溶液或三乙胺的乙腈溶液脱除氰乙基基团;
在一种可选的实施方式中,采用20%~50%的二乙胺的乙腈溶液或三乙胺的乙腈溶液处理固相支持物,处理时间为10~120分钟。
在本发明应用较佳的实施方式中,使得固相支持物与合成的产物分离的方法包括:采用浓氨水、氨气和甲胺水溶液中的至少一种对固相支持物进行切割,在20~70℃条件下反应1~24小时。
合成的寡核苷酸仍共价结合于固相载体上,使用氨解法从固相载体上除掉寡核苷酸。氨解温度可以为25、50、60、70℃或其间的任何温度;氨解时间通常为约1小时至约24小时或更长时间,例如2h,5h,10h,18h或24h。随后,上述方法还可以包括使用选自脱盐、MOP、PAGE、PAGE Plus或HPLC的纯化方式来纯化合成的寡核苷酸。
固相支持物为可控孔玻璃的固体支持物(CPG)、聚苯乙烯树脂(PS)固相支持物、微孔聚酰胺、聚乙二醇包覆的聚苯乙烯,以及载在聚苯乙烯上的聚乙二醇。
需要说明的是,固相载体可以是适合固相寡核苷酸合成的任何固相载体,例如但不限于聚二甲基丙烯酰胺,以Tentagel的商品名称销售的那些固相载体。
例如固相载体是带有氨基修饰的活性官能团的CPG。CPG的粒径可以是小于或等于5μm,小于或等于25μm,小于或等于50μm,小于或等于100μm,小于或等于200μm,小于或等于500μm或更大。
本发明具有以下有益效果:
(1)本发明采用带有亚磷酰胺基团的荧光标记物参与偶合反应,可以直接仅通过固相合成完成带有荧光标记物的寡核苷酸的合成。与现有技术相比,无需在寡核苷酸的合成结束,进行纯化后,单独进行荧光标记物的化学反应,缩短了合成周期。
(2)本发明提供的固相合成方法,能够实现合成自动化,而且不需要使用额外的设备。
(3)带有亚磷酰胺基团的荧光标记物与脱除的保护基的固相载体发生偶合后,大幅提升了单步的偶联产率(超过98%),显著提升了固相合成的产率(收率)。
(4)避免了过量添加荧光标记物从而造成的荧光标记物的浪费,节约了成本。
(5)固相合成方法所使用的试剂相对无毒无害,更环保,为合成期间实验人员的身体健康提供了一定的保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为固相合成路线图;
图2为原有的活化酯形式的荧光标记物(R为各类型的荧光标记物);
图3为常规的核苷酸结构式(B1:表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基;R1:表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基三苯甲基;R2:表示卤素原子、硝基或甲氧基;n:为1-100的整数;上述酰基可以为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基;卤素原子可以为氯或溴)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,合成步骤图参照图1所示,依次进行脱保护基,偶联,氧化,盖帽四个步骤,具体包括如下步骤:
(1)首先将核苷酸上的5’-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护,碱基上的氨基用苯甲酰基保护,3’-OH用咪唑/氮唑类化合物进行活化。
(2)将第一个核苷酸的3’-OH与固相树脂结合在一起,并采用3%的二氯乙酸/甲苯溶液脱去5’-OH上的保护基。
(3)偶联:使得步骤(2)的固相载体置于含有活化剂的反应柱中进行反应、核苷酸单体接触,使得核苷酸单体的三价P与固相载体上的脱除了保护基的5’-OH发生偶合;
活化剂为0.35M的ETT(5-乙硫基四氮唑)/乙腈溶液,每1mmol的固相合成规模中,活化剂的反应当量为9mmol。
(4)氧化:采用0.05M的碘水溶液进行氧化。
(5)盖帽:盖帽试剂包括盖帽A和盖帽B,盖帽A:乙酸酐/乙腈=2:8;盖帽B:N-甲基咪唑/吡啶/乙腈=2:3:5;
(6)重复进行步骤(2-5);
在合成最后一个核苷酸时,在步骤(3)中,将带有亚磷酰胺基团的Cy5 CEPhosphoramidite(荧光标记物的一种)、ETT、与结合有寡核苷酸的固相载体接触,带有亚磷酰胺基团的Cy5 CE Phosphoramidite通过与寡核苷酸的5’-OH形成P-O键共价结合;使得带有亚磷酰胺基团的荧光标记物与脱除的保护基的固相载体发生偶合。每1mmol的固相合成规模中,活化剂以及Cy5 CE Phosphoramidite的反应当量分别为9mmol和1.5mmol。
荧光标记物为Cy5 CE Phosphoramidite,其结构式如下:
(7)脱氰乙基:采用20%~50%的二乙胺/乙腈溶液(本实施例为20%的二乙胺/乙腈溶液),或者三乙胺/乙腈溶液,进行脱除氰乙基基团,反应时间10~120分钟。
(8)固相合成结束后,采用浓氨水使得固相支持物与合成的产物分离,在20℃情况下,反应18小时。然后用漏斗进行过滤,去除固相支持物,收集过滤液,即为产品,后续再进行纯化工作。
实施例2
与实施例1相比,区别仅在于,荧光标记物不同,其余的制备方法和条件相同,本实施例中的发光基团为羧基荧光素(FAM)。
实施例3
与实施例1相比,区别仅在于,荧光标记物不同,其余的制备方法和条件相同,本实施例中的发光基团为ROX。
实施例4
与实施例1相比,区别仅在于,荧光标记物不同,其余的制备方法和条件相同,本实施例中的发光基团为AlexaFluor350。
实施例5
与实施例1相比,区别仅在于,荧光标记物不同,其余的制备方法和条件相同,本实施例中的发光基团为四甲基罗丹明(TAMRA)。采用0.6M的ETT/乙腈溶液为活化剂。
实施例6
与实施例1相比,区别仅在于,不进行盖帽,其余的制备方法和条件相同。
对比例1
与实施例1相比,区别仅在于:
首先将核苷酸上的5’-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护,碱基上的氨基用酰基保护,3’-OH用咪唑/氮唑类化合物进行活化。将第一个核苷酸的3’-OH与固相树脂结合在一起,并脱去5’-OH上的保护基,使裸露的5’-OH与第二个核苷酸β-氰乙基直接保护的3’位的亚磷酰胺之间形成一个亚磷酸三酯,亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯,再加入3%的二氯乙酸/甲苯溶液除去第二个核苷酸的5’-OH上的保护基。
至此,寡核苷酸链已经延伸了一个核苷酸单元,并可投入下一轮延伸反应。经过若干轮的延伸反应,整个寡核苷酸片段合成完毕之后,用浓氢氧化铵将寡核苷酸片段从固相树脂上洗脱下来,经过脱保护和纯化得到寡核苷酸。
再经过氨解脱保护和纯化,最终冻干后得到冻干粉。
核酸序列末端的氨基与荧光标记物活化酯进行缩合反应,最终得到了荧光标记的核酸产品。
实验例1
分别采用实施例1和对比例1的固相合成方法如下表所示的序列。并统计合成周期,收率的数据。由此可见,本发明实施例1提供的方法将合成周期缩短了一半以上,产品收率大幅提升。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,其特征在于,其包括如下步骤:
(a)使得结合有第一个核苷酸的固相载体与脱保护试剂接触,从而脱除第一个核苷酸的5’-OH上的保护基;
(b)使得步骤(a)的固相载体与活化剂、核苷酸单体接触,使得核苷酸单体的三价P与固相载体上的脱除了保护基的5’-OH发生偶合;
(c)氧化;
(d)盖帽;
(e)重复步骤(a)-(d);
(f)在合成最后一个核苷酸时,在步骤(b)中,将带有亚磷酰胺基团的荧光标记物、活化剂、与结合有寡核苷酸的固相载体接触,带有亚磷酰胺基团的荧光标记物通过与寡核苷酸的5’-OH形成P-O键共价结合;
所述带有亚磷酰胺基团的荧光标记物的结构式如下式(I)所示:
3.根据权利要求2所述的带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,其特征在于,所述酰基类保护基为乙酰基、苯甲酰基、苯氧基乙酰基、异丁酰基或异丙基羰基;
优选地,所述天然型碱基为腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基;
优选地,所述修饰碱基为5-甲基胞嘧啶基、5-氟尿嘧啶基、7-甲基鸟嘌呤基或7-脱氮腺嘌呤基;
优选地,所述B1表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基;
R:表示荧光标记物的发光基团;
R2:表示卤素原子、硝基或甲氧基;优选地,所述卤素原子为氟、氯、溴或碘;
n:为正整数;优选地,n为1-100的整数;
A+:表示三烷基铵离子或二烷基铵离子。
4.根据权利要求1所述的带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,其特征在于,所述发光基团选自荧光素类染料及其衍生物;
优选地,所述荧光素类染料及其衍生物选自:异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)或其类似物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物和Alexa系列染料及其衍生物;
优选地,所述罗丹明类染料及其衍生物选自红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)或其类似物)、ROX;
优选地,所述Cy系列染料及其衍生物选自Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3或其类似物;
优选地,所述Alexa系列染料及其衍生物选自:AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物。
5.根据权利要求1或4所述的带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,其特征在于,所述脱保护试剂选自三氯乙酸的二氯甲烷溶液、三氟乙酸的乙腈溶液、二氯乙酸的甲苯溶液或二氯乙酸的二氯甲烷溶液;
优选地,所述脱保护试剂选自3%-10%的二氯乙酸的甲苯溶液。
6.根据权利要求1或4所述的带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,其特征在于,所述活化剂选自四唑、5-乙硫基四唑、二氰基咪唑或吡啶鎓盐;
优选地,所述活化剂选自5-乙硫基四氮唑的乙腈溶液和4,5-二氰基咪唑的乙腈溶液中的任意一种;
优选地,每1mmol的固相合成规模中,所述活化剂以及带有亚磷酰胺基团的荧光标记物的反应当量分别为5~9mmol和1.5-2.0mmol。
7.根据权利要求1或4所述的带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,其特征在于,所述步骤(c)的氧化是使固相载体与氧化剂或硫化剂接触;
优选地,所述氧化剂选自碘液。
8.根据权利要求1或4所述的带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,其特征在于,所述步骤(e)结束后,还包括脱氰乙基,然后使得固相支持物与合成的产物分离。
9.根据权利要求8所述的带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,其特征在于,所述脱氰乙基是采用二乙胺的乙腈溶液或三乙胺的乙腈溶液脱除氰乙基基团;
优选地,采用20%~50%的二乙胺的乙腈溶液或三乙胺的乙腈溶液处理固相支持物,处理时间为10~120分钟。
10.根据权利要求8所述的带有荧光标记物的寡核苷酸的固相合成方法,其特征在于,使得固相支持物与合成的产物分离的方法包括:采用浓氨水、氨气和甲胺水溶液中的至少一种对固相支持物进行切割,在20~70℃条件下反应1~24小时;
优选地,所述固相支持物为可控孔玻璃的固体支持物(CPG)、聚苯乙烯树脂(PS)固相支持物、微孔聚酰胺、聚乙二醇包覆的聚苯乙烯,或载在聚苯乙烯上的聚乙二醇。
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