CN112771062B - 用于纯化寡核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于纯化寡核苷酸的新方法，所述方法包括通过用酸性缓冲溶液进行切向流过滤，除去所述寡核苷酸的5'‑O‑寡核苷酸末端的酸不稳定的5'羟基保护基。所述方法需要的步骤较少且使自动化程度更高。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于纯化寡核苷酸的新方法，该方法包括通过用酸性缓冲溶液进行切向流过滤，除去寡核苷酸的5'-O-寡核苷酸末端的酸不稳定的5'羟基保护基。
背景技术
通常通过固相合成制备的寡核苷酸在从树脂上裂解后，仍然含有大量杂质。对于15至20个单体长度的标准单体，API纯度至多在70％至80％的范围内。对于化学改性的单体或对于更长的序列，API含量通常甚至更低。
发明内容
已经开发出选择性分离方法来制备满足治疗应用规格的高纯度寡核苷酸。
在一种方法中，寡核苷酸在从树脂上裂解后，在5'-O-寡核苷酸末端留有酸不稳定的5'羟基保护基。该基团的疏水性允许应用有效的色谱技术进行纯化。
通常的策略是使粗寡核苷酸经历以下步骤(例如Krotz等人，Organic ProcessResearch&Development 2003,7,47-52)
a)反相色谱
b)浓缩和脱盐
c)去除溶液中的酸不稳定的5'羟基保护基，并且
d)进一步浓缩和脱盐
已经发现，由于单个操作步骤a)至d)的数量，该已知方法需要大量的操作时间。
本发明的目的是减少步骤的数量，实现更高的自动化程度并且由此减少总体操作时间。
已经发现，用如上所概述的用于纯化寡核苷酸的新方法可以达到本发明的目的。
具体实施方式
提出以下定义以说明和定义用于描述本文中本发明的各种术语的含义和范围。
术语酸不稳定的5'羟基保护基定义为在合适的酸的帮助下可裂解并具有疏水性的保护基。
典型的酸不稳定的5'羟基保护基选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、9-苯基-呫吨-9-、9-(对甲苯基)-呫吨-9-基或选自叔丁基二甲基甲硅烷基，优选地选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基或三苯甲基、或甚至更优选地选自4,4'-二甲氧基三苯甲基。
如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或更多个共价连接的核苷酸的分子。出于用作有治疗价值的寡核苷酸的用途，通常以10个至40个核苷酸，优选10个至25个核苷酸的长度合成寡核苷酸。
寡核苷酸可以由任选地修饰的DNA、RNA或LNA核苷单体或其组合组成。
LNA核苷单体为经修饰的核苷，其在核苷酸的核糖糖环的C2'和C4'之间包含接头基团(称为双基或桥)。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。
如本文所用，任选地修饰是指通过引入糖部分或核碱基部分的一种或多种修饰，与等价DNA、RNA或LNA核苷相比经修饰的核苷。在一个优选的实施例中，经修饰的核苷包含经修饰的糖部分，并且例如可包含一个或多个经2'取代的核苷和/或一个或多个LNA核苷。术语经修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”互换使用。
通常，DNA、RNA或LNA核苷通过磷酸二酯(P＝O)和/或硫代磷酸酯(P＝S)核苷间键连接，其将两个核苷共价偶联在一起。
因此，在一些寡核苷酸中，所有核苷间键均可以由磷酸二酯(P＝O)组成，在其他寡核苷酸中，所有核苷内键均可以由硫代磷酸酯(P＝S)组成，或者在另外一些寡核苷酸中，核苷间键的序列不同并且既包含磷酸二酯(P＝O)，也包含硫代磷酸酯(P＝S)核苷。
核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可以任选地包括具有同等功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，对于LNA核苷，用大写字母A、T、G和MeC(5-甲基胞嘧啶)描述核碱基部分，并且对于DNA核苷，用小写字母a、t、g、c和MeC描述核碱基部分。经修饰的核碱基包括但不限于带有保护基的核碱基，诸如叔丁基苯氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、乙酰基、异丁酰基或二甲基甲酰胺基(参见Wikipedia，Phosphoramidi t-Synthese，https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit-Synthese，2016年3月24日)。
优选地，寡核苷酸由任选地修饰的DNA、RNA或LNA核苷单体或其组合组成，并且长度为10个至40个、优选10个至25个核苷酸。
寡核苷酸合成的原理是本领域众所周知的(参见例如Oligonucleotidesynthesis；Wikipedia,the free encyclopedia；https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide synthesis，2016年3月15日)。
如今，使用计算机控制的合成仪可自动进行更大规模的寡核苷酸合成。
通常，寡核苷酸合成为固相合成，其中组装的寡核苷酸通过其3'-末端羟基基团共价结合到固体载体物质，并在链组装的整个过程中保持附着于其上。合适的载体为可商购的大孔聚苯乙烯载体，例如GE Healthcare的Primer support 5G或Kinovate的载体。
寡核苷酸合成原则上是将核苷酸残基逐步添加至生长链的5'-末端，直到组装出期望的序列。
通常，每次添加都称为合成循环，原则上由以下化学反应组成
a1)使固体载体上的保护羟基基团解封闭，
a2)将第一核苷作为活化的亚磷酰胺与固体载体上的游离羟基基团偶联，
a3)氧化或硫化相应的P连接核苷以形成相应的磷酸二酯(P＝O)或相应的硫代磷酸酯(P＝S)；
a4)任选地，将固体载体上的任何未反应的羟基基团封端；
a5)使附着于固体载体的第一核苷的5'羟基基团解封闭；
a6)将第二核苷作为活化的亚磷酰胺偶联以形成各自的P连接二聚体；
a7)氧化或硫化相应的P连接二核苷以形成相应的磷酸二酯(P＝O)或相应的硫代磷酸酯(P＝S)；
a8)任选地，将任何未反应的5'羟基基团封端；
a9)重复之前的步骤a5至a8，直到组装出期望的序列。
随后可以用浓氨水从树脂上裂解。在该裂解过程中，也除去了磷酸酯和核苷酸碱基上的保护基。
裂解后的粗寡核苷酸在5'-O-寡核苷酸末端留有酸不稳定的5'羟基保护基。
该方法的特征在于，通过用酸性缓冲溶液进行切向流过滤，除去寡核苷酸的5'-O-寡核苷酸末端的酸不稳定的5'羟基保护基。
术语酸不稳定的5'羟基保护基如上定义为在合适的酸的帮助下可裂解并具有疏水性的保护基。
典型的酸不稳定的5'羟基保护基选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、9-苯基-呫吨-9-、9-(对甲苯基)-呫吨-9-基或选自叔丁基二甲基甲硅烷基，优选地选自4,4'-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基或三苯甲基，或甚至更优选地选自4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)。
酸性缓冲剂为弱酸及其共轭碱的水溶液，其用质子酸酸化以使pH在期望的范围内。
典型的酸性缓冲剂为乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，其由作为弱酸的乙酸或柠檬酸及其作为共轭碱的钠盐组成。
用于酸性缓冲剂酸化的质子酸可选自含水无机酸，诸如选自盐酸、磷酸、硫酸或硝酸，但通常选自含水盐酸。
期望的pH范围理想地介于2至6之间，优选地介于2.5至4.0之间，甚至更优选地介于2.8至3.5之间。
酸性缓冲溶液还可以包含量为5％(V)至50％(V)，优选地量为20％(V)至40％(V)的极性质子或极性非质子有机溶剂。
合适的极性质子溶剂为伯脂族醇，诸如甲醇、乙醇或异丙醇，优选地为乙醇。
合适的极性非质子溶剂为乙腈、二甲基亚砜或N-甲基-2-吡咯烷酮，但优选地为乙腈。
在一个优选的实施例中，酸缓冲剂为乙酸盐缓冲剂，其用含水盐酸酸化至pH范围为2.8至3.5，然后用乙醇稀释以形成含有35％(V)至45％(V)乙醇的缓冲溶液。
乙酸盐的浓度可以在10mmol/l至1mol/l的范围内选择，优选地在50mmol/l至250mmol/l的范围内选择。
切向流过滤的特征在于，进料在相对于渗透侧为正压下(切向地)穿过过滤膜。小于膜孔径的一部分物质以渗透液或滤液的形式穿过膜；其他所有物质则作为渗余物保留在膜的进料侧。
合适的膜是可商购的，例如购自Merck Millipore的商品名为PelliconTM或购自Sartorius的商品名为HydrosartTM的膜。
本发明的方法有利地与截留分子量(MWCO)≤5kDA，优选地≤2.5kDA，更优选地为0.5-2.5kDA，甚至更优选地为1.8-2.2kDA的膜一起发挥作用。
切向流过滤在0.5至10.0巴，更优选地1.0至4巴，甚至更优选地1.5至2.0巴的跨膜压力下进行。
表示每单位面积的流量的通量通常在5至50l/h*m2的范围内，优选在9至15l/h*m2的范围内选择。
酸性缓冲溶液中的寡核苷酸含量在1.0mg/l至100.0mg/l之间，优选地在5.0mg/l至50.0mg/l之间选择。
在本发明的另一实施例中，该方法进一步包括以下步骤，所述步骤是在除去寡核苷酸的5'-O-寡核苷酸末端的酸不稳定的5'羟基保护基之后进行的：
·中和步骤，其包括通过切向流过滤将所得到的渗余物与碱中和；和
·脱盐步骤，其包括通过切向流过滤用水或水与极性质子或极性非质子有机溶剂的混合物洗涤从中和步骤获得的渗余物；以及
·任选地冻干从脱盐步骤获得的渗余物。
用于中和渗余物的合适的碱为含水无机碱，诸如碱金属氢氧化物水溶液，诸如氢氧化钠水溶液或碱性缓冲剂。
滤液的后续洗涤可以用水或水与极性质子有机溶剂的混合物进行，所述极性质子有机溶剂选自伯脂族醇，诸如甲醇、乙醇或异丙醇，优选地为乙醇。
通常，脱盐步骤以梯度进行，即以水与极性质子有机溶剂的混合物开始并以水结束。
混合物中水与极性质子有机溶剂的体积比通常介于1:1至6:1之间，优选地介于4:1至3:2之间。
在中和过程中用于切向流过滤的参数，以及在脱盐步骤中的参数，即跨膜压力，渗透物流速和膜类型通常对应于针对先前步骤所描述的参数，包括除去酸不稳定的5'羟基保护基。
在脱盐步骤之后，可以使获得的渗余物经历冻干步骤或进一步纯化，诸如以从寡核苷酸中除去残留的溶剂。
在最优选的实施例中，该方法的特征在于
·通过用酸性缓冲溶液进行切向流过滤，除去寡核苷酸5'-O-寡核苷酸末端的酸不稳定的5'羟基保护基
·中和步骤，其包括通过切向流过滤将所得到的渗余物与碱中和；和
·脱盐步骤，其包括通过切向流过滤用水或水与极性质子或极性非质子有机溶剂的混合物洗涤从中和步骤获得的渗余物；以及
·任选地冻干从脱盐步骤获得的渗余物。
脱保护步骤、中和步骤和脱盐步骤是相继的切向流过滤步骤，可以自动化并由同一软件控制的设备执行，而无需任何人工干预。
如上所述，寡核苷酸在树脂上形成后，通常用浓氨水从树脂上裂解。除了在寡核苷酸的5'-O-寡核苷酸末端的酸不稳定的5'羟基保护基外，在该裂解过程中还除去了磷酸盐和核苷酸碱基上的保护基。
在一个优选的实施例中，该方法进一步包括以下步骤，所述步骤在除去寡核苷酸的5'-O-寡核苷酸末端的酸不稳定的5’羟基保护基之前进行。该先前步骤旨在去除期望的寡核苷酸的较短长度的(非-5'-保护的)截短物。
·从树脂裂解和磷酸酯脱保护后得到的粗寡核苷酸的反相高效液相色谱或阴离子交换色谱。
阴离子交换色谱基于样品溶液的带电离子与所用缓冲介质的竞争性相互作用。可用常规的市售阴离子交换树脂，优选具有三甲基铵官能化的那些树脂进行。这些相物质可以例如从GE Healthcare、Tosoh Bioscience、Bio-Rad或Merck获得。已经用可从TosohBioscience获得的阴离子交换树脂TSKgel Super Q-5PW(QAE)取得了特别好的结果。
可以使用传统的、可商购的相材料通常为C8或C18相材料，诸如作为固定相的改性硅胶吸附剂和合适的有机溶剂(如乙腈)以及缓冲剂(如果适用)进行反相色谱。合适的改性硅胶型相材料可以选自KromasilTMC18、KromasilTMC8、YMC Triart C18和YMC Triart C8。
作为说明，寡核苷酸可以选自由以下项组成的组：
5'-(MeC*)T*T*(MeC*)t*t*c*t*a*t*c*t*a*(MeC*)g*c*A*T*-3'
其中*代表硫代磷酸酯桥；A、G、T和MeC(5-甲基胞嘧啶)为LNA核苷单体，并且a、t、c、g为DNA核苷单体。
本文公开的化合物具有以下核碱基序列
SEQ ID No.1：cttctctatctacgcat'
实例
缩写：
ACN＝乙腈
Ac2O＝乙酸酐
CV＝柱体积
DAC＝二氯乙酸
DCM＝二氯甲烷
DMT＝4,4'-二甲氧基三苯甲基
EtOH＝乙醇
NaOAc＝乙酸钠
NMI＝N-甲基咪唑？
实例1
a.合成5'-(MeC*)T*T*(MeC*)t*t*c*t*a*t*c*t*a*(MeC*)g*c*A*T*-3'
使用oligopilot-100以1.9mmol的比例，将标题化合物合成为“DMT-on”。合成参数在表1中给出。
表1：用于OP-100的合成参数。
b.从固相载体上裂解并进行RP-HPLC纯化
从树脂上裂解粗物质，通过将干燥的树脂溶解在30％氨水溶液(190mL)中并在65℃下搅拌5h来脱保护。滤出固体载体，并通过旋转蒸发将水溶液浓缩至约60mL。将该溶液进一步用H2O稀释至最终体积为100mL，并添加固体Na2CO3，以获得50mM Na2CO3溶液(124mg/mL的粗寡聚物含量)。根据表2中的参数，通过RP-HPLC来纯化一部分粗物质(80mL)。
表2：RP-HPLC纯化参数。
c.通过切向流过滤进行DMT脱保护、脱盐和浓缩
收集来自RP纯化的馏分，得到2.5L(2mg/mL的寡聚物)，并用H2O稀释至4.2L的最终体积。在配备有两个2kD截留值的Hydrosart Sartocon盒(0.1m2)的错流机器上处理该物质，以触发DMT脱保护、浓缩和切向流过滤。程序参数在表3中详细描述。
表3：错流程序的详细参数。
将冲洗后获得的溶液冻干，以获得4.00g标题产物(基于合成规模的总产率为42％，UV纯度为88％)。
Claims (15)
1.一种用于纯化寡核苷酸的方法，其包括通过用酸性缓冲溶液进行切向流过滤，除去所述寡核苷酸的5’-O-寡核苷酸末端的酸不稳定的5’羟基保护基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸不稳定的5’羟基保护基选自4,4’-二甲氧基三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、三苯甲基、9-苯基-呫吨-9-、9-(对甲苯基)-呫吨-9-基或选自叔丁基二甲基甲硅烷基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸性缓冲溶液的pH值在2至6的范围内。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述酸性缓冲溶液的pH值在2至6的范围内。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述酸性缓冲剂为弱酸及其共轭碱的水溶液，其用质子酸酸化以使pH值在期望的范围内。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酸性缓冲剂为乙酸盐缓冲剂，并且所述质子酸为盐酸。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其中所述酸性缓冲溶液另外包含极性质子或极性非质子有机溶剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述切向流过滤在0.5至10.0巴的跨膜压力下进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述切向流过滤以介于5至50l/h*m2之间的通量率进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述切向流过滤是用截留分子量≤5kDA的膜进行的。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸性缓冲溶液中的寡核苷酸含量在1.0mg/l至100.0mg/l之间选择。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤，所述步骤是在除去所述寡核苷酸的5’-O-寡核苷酸末端的酸不稳定的5’羟基保护基之后进行的：
a.中和步骤，其包括通过切向流过滤将所得到的渗余物用碱中和；和
b.脱盐步骤，其包括通过切向流过滤用水或水与极性质子或极性非质子有机溶剂的混合物洗涤从所述中和所得到的渗余物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
c.冻干从脱盐步骤获得的渗余物。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤，所述步骤是在除去所述寡核苷酸的5’-O-寡核苷酸末端的酸不稳定的5’羟基保护基之前进行：
a.从树脂裂解和磷酸酯脱保护后得到的粗寡核苷酸进行反相高效液相色谱或阴离子交换色谱。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸由任选地修饰的DNA、RNA或LNA核苷单体或其组合组成，并且长度为10个至40个核苷酸。
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