CN105283548A - Rna纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于从样品中纯化RNA的方法，包含一步或多步的正切流动过滤、羟磷灰石色谱、核心珠流通色谱或它们的任意组合。这些技术各自均有效，但在组合使用或当以特定顺序进行时显示出非常高的效率。该方法可以高效的方式纯化RNA，而不会不适当地损失效力或稳定性，从而提供其中RNA基本不含污染物的组合物。此外，可不需要有机溶剂而进行上述方法。

Description

RNA纯化方法
相关申请
本申请要求于2013年3月15日递交的美国临时申请61/799,705的权益，为了各种目的将其全部内容通过引用合并于此。
技术领域
本发明属于RNA纯化领域，特别是用于制药用途(例如用于使动物免疫)的对来自复杂样品(如在RNA的体外转录后获得的样品)的大型RNA的大规模纯化和配制的方法。
发明背景
RNA作为各种制药应用的新型备选物出现，但有效纯化仍是个挑战。这部分由于样品中不希望的污染物的不同类型和组合，而需要将这些污染物从所需的RNA种类中分离以获得纯的RNA样品。该污染物通常为任何上游过程(例如RNA制备)的组分和和副产物。当使用体外转录来制备大型RNA时，在转录成功后样品通常含有所需的RNA种类，以及各种污染物，如不希望的RNA种类、蛋白质、DNA或其片段、焦磷酸酯以及游离核苷酸。
商业的下游应用(如作为药物组合物和/或疫苗的制剂和用途)对用于大型RNA的纯化方法提出更多限制，其要求：(i)在保留RNA稳定性和功能的同时获得高纯度；(ii)与RNA的体内递送的制剂需求的相容性；和(iii)符合良好的制备实践。此外，为了促进工业应用，任何RNA纯化方法都必须确保持续、低成本且省时的操作(如快速、简单、可重复、高产率的大规模纯化)。
用于纯化大型RNA的方法在本领域已知。Pascolo等人(2006)描述了一种从分析规模的体外转录反应样品中纯化mRNA的方法(纯化20μl样品体积中的25μgRNA)。该方法涉及DNA酶处理，随后用氯化锂使较长的mRNA析出。然而，该作者报道该方法不提供高纯度的RNA，因为其不会完全除去污染物，如DNA和蛋白质。此外，该方法涉及使用有机溶剂，并且费时费力，涉及36个步骤之多，要求在不同条件下频繁人工处理样品，其中包括至少一个过夜培育步骤。因此，尽管该方法可满足研究和实验室规模的RNA纯化需求，但其具有下列缺点：低RNA纯度、重复性，并且不适合在商业规模下纯化制药级别的RNA，因而不适合在工业过程中实践。
WO2008/077592公开了一种通过使用多孔反相固定相的离子配对反相HPLC以制备规模纯化大型RNA的方法。据报道，使用该特定的多孔固定相的特殊优点在于，可避免压力过高，有助于RNA的制备性纯化。然而，该方法涉及对分离柱使用有毒(harsh)有机溶剂(如乙腈)和高温(78℃)，而采样器则采用低温(12℃)。并未说明可使用该方法从所需RNA中成功分离的污染物的性质，也没有说明对在先步骤(如DNA酶处理)的任何要求。此外，基于离子配对反相HPLC或基于离子交换树脂的RNA的色谱分离是基于分子的总电荷，并对至多约4,000至5,000个碱基的RNA分子的纯化有效。然而，大型RNA分子的纯化经受尺寸排阻效应和较差回收率的问题。此外，该方法依赖于使用有机溶剂对RNA的洗脱，但由于残留物的潜在安全考虑、较高的购买成本、其环境影响和对RNA稳定性及效应的潜在有害影响，在理想情况下应避免有机溶剂洗脱。
因而仍存在对进一步改善的RNA纯化方法的需求，特别是那些允许在保留RNA的稳定性、生物效应和功能的同时具有高产率和制药级别纯度的在工业规模下对大型RNA进行低成本且省时纯化的方法。特别需要这样的方法，其中起始样品为复杂的生物样品，如大型RNA的体外转录后获得的样品。
发明详述
为了解决这些需求，本发明提供了一种用于从样品中纯化RNA的方法，其包括一个或多个正切流动过滤步骤、一个或多个羟磷灰石色谱步骤、一个或多个核心珠流通色谱(corebeadflow-throughchromatography)步骤或它们的任意组合。这些技术可独立使用，当在组合使用或以特定顺序进行时显示非常高的效率。该方法可以高效的方式纯化RNA，而不会对效力或稳定性造成不恰当的破坏，从而提供其中RNA基本不含污染物的组合物。此外，这些方法可无需有机溶剂来进行，并且优选本发明的方法在水性条件下发生。本发明的进一步的优点为：使用基本上一次性的组分，这意味着它们可被制备为完全干净的形式(特别是不含RNA酶的形式)，仅使用一次，然后丢掉，因此避免了操作之间一直携带的污染物，这对于避免RNA酶的污染特别有效。该方法还十分快速。
在一个实施方式中，本发明提供了从样品中纯化RNA的方法，其中该方法包括一个或多个正切流动过滤步骤。
在另一个实施方式中，本发明提供了从样品中纯化RNA的方法，其中该方法包括一个或多个羟磷灰石色谱步骤。
在另一个实施方式中，本发明提供了从样品中纯化RNA的方法，其中该方法包括一个或多个核心珠流通色谱步骤。
在一个有用的实施方式中，该方法包括正切流动过滤步骤和羟磷灰石色谱步骤。正切流动过滤步骤优选在羟磷灰石色谱步骤之前。
在另一个有用的实施方式中，该方法包括核心珠流通色谱步骤和羟磷灰石色谱步骤。优选地，核心珠流通色谱步骤在羟磷灰石色谱步骤之前。
在任一个前述实施方式中，所述RNA纯化步骤之后可存在一个或多个缓冲液更换步骤，如包括正切流动过滤。
因而本发明提供了从样品中纯化和配制RNA的方法，其中该方法包括一个或多个RNA纯化的步骤和一个或多个缓冲液更换步骤。优选地，至少一个缓冲液更换步骤包括正切流动过滤。
在一个实施方式中，本发明提供了纯化和配制RNA的步骤，包括两个独立的正切流动过滤步骤。优选地，在第一步正切流动过滤中使用第一缓冲液，且在第二步正切流动过滤中使用不同的第二缓冲液。第一缓冲液和第二缓冲液通常基于两种不同的缓冲盐。例如，第一缓冲液可为基于Tris的缓冲液，而第二缓冲液可为柠檬酸盐缓冲液。优选地，第一缓冲液为纯化缓冲液，且第二缓冲液为配制缓冲液。更优选地，纯化缓冲液包含浓度在50至500mM之间，例如250mM的盐。
例如，纯化缓冲液可包含浓度在0至500mM之间的盐，如约10mM、约20mM、约25mM、约50mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM、约500mM、约10mM至约500mM、约10mM至约400mM、约10mM至约300mM、约10mM至约250mM、约20mM至约500mM、约20mM至约400mM、约20mM至约300mM、约20mM至约250mM、约30mM至约500mM、约30mM至约400mM、约30mM至约300mM、约30mM至约250mM、约40mM至约500mM、约40mM至约400mM、约40mM至约300mM、约40mM至约250mM、约50mM至约500mM、约50mM至约400mM、约40mM至约300mM或约50mM至约250mM等。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于纯化和配制RNA的方法，其在正切流动过滤步骤之前包括核心珠流通色谱的步骤。在优选的实施方式中，在核心珠流通色谱步骤中使用第一缓冲液，并在正切流动过滤的步骤中使用第二缓冲液。优选地，第一缓冲液为纯化缓冲液，且第二缓冲液为不同的配制缓冲液。更优选地，纯化缓冲液包含盐，如氯化钾或氯化钠。最优选地，纯化缓冲液包含浓度在100至500mM之间，如250mM的氯化钾。
例如，纯化缓冲液可包含浓度在0至500mM之间的氯化钾，如约50mM、约75mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM、约500mM、约50mM至约500mM、约50mM至约400mM、约50mM至约300mM、约50mM至约250mM、约75mM至约500mM、约75mM至约400mM、约75mM至约300mM、约75mM至约250mM、约100mM至约500mM、约100mM至约400mM、约100mM至约300mM、或约100mM至约250mM等。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于纯化和配制RNA的方法，其包括第一步正切流动过滤，然后第二步羟磷灰石色谱，然后第三步正切流动过滤。在优选的实施方式中，在第一步正切流动过滤中使用第一缓冲液，在第二步羟磷灰石色谱中使用不同的第二缓冲液，并在第三步正切流动过滤中使用不同的第三缓冲液。优选地，第一和第二缓冲液为纯化缓冲液，且第三缓冲液为不同的配制缓冲液。优选地，第一缓冲液不含氯化钠和/或氯化钾。最优选地，在另一步骤中，在第一步正切流动过滤之后和第二步羟磷灰石色谱之前，将氯化钠和/或氯化钾加入含RNA的样品中，直至达到100至500mM之间的最终浓度，如250mM或500mM。
例如，可向含RNA的样品中加入氯化钠和/或氯化钾，直至达到0至500mM之间的最终浓度，如约50mM、约75mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM、约500mM、约50mM至约500mM、约50mM至约400mM、约50mM至约300mM、约50mM至约250mM、约75mM至约500mM、约75mM至约400mM、约75mM至约300mM、约75mM至约250mM、约100mM至约500mM、约100mM至约400mM、约100mM至约300mM、或约100mM至约250mM等。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于纯化和配制RNA的方法，其包括第一步核心珠流通色谱，然后第二步羟磷灰石色谱，然后第三步正切流动过滤。在优选的实施方式中，在第一步核心珠流通色谱中使用第一缓冲液，在第二步羟磷灰石色谱中使用不同的第二缓冲液，并在正切流动过滤中使用不同的第三缓冲液。优选地，第一和第二缓冲液为纯化缓冲液，且第三缓冲液为不同的配制缓冲液。优选地，第一缓冲液不含氯化钠和/或氯化钾。最优选地，在另外的步骤中，在第一步核心珠流通色谱之后和第二步羟磷灰石色谱之前将氯化钠和/或氯化钾加入含RNA的样品中，直至达到100至500mM之间，如250mM或500mM的最终浓度。
例如，可向含RNA的样品中加入氯化钠和/或氯化钾，直至达到0至500mM之间的最终浓度，如约50mM、约75mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM、约500mM、约50mM至约500mM、约50mM至约400mM、约50mM至约300mM、约50mM至约250mM、约75mM至约500mM、约75mM至约400mM、约75mM至约300mM、约75mM至约250mM、约100mM至约500mM、约100mM至约400mM、约100mM至约300mM、或约100mM至约250mM等。
本发明还提供了用于从样品(如体外转录反应的产物)中纯化RNA的方法，其中在低于12小时内(如<8小时、<6小时、<4小时或<2小时)，该RNA被纯化至至少99％的纯度(如≥99.9％或甚至≥99.95％)。
在本发明的方法中，其步骤通常涉及丢弃不含RNA(或不含所需的RNA种类)的物质，同时留下含有RNA(或所需RNA种类)的物质。因而，当一种技术将起始物分为几部份时，将保留所需部分同时可丢弃不需要的部分；类似地，如果一种技术保留不希望的部分但使所需RNA流出，则应保留流出液。
RNA
根据本发明，从含RNA的样品中纯化所需的RNA。本发明的所需RNA可为双链，但优选为单链。当RNA为单链时，如mRNA或自我复制的RNA复制子时，其通常编码一种或多种蛋白，并且其中至少一种可用作下述的免疫原，但也可为任意感兴趣的非免疫原性治疗性或预防性蛋白(如作为基因治疗药物的组分)。本发明所需的RNA可为环形，但优选为链形。
RNA可为负链，但优选为正链，这样其可不需任何中间复制步骤(如反转录)就被细胞翻译。优选的正链RNA为自我复制，如下所述。优选地，RNA不是天然病毒RNA。
RNA可为小型、中型、大型RNA。小型RNA每条链的核苷酸数为10至30(如siRNA)。中型RNA每条链含有30至2000个核苷酸(如非自我复制的mRNA)。大型RNA每条链含有至少2,000个核苷酸，如每条链至少2,500个、至少3,000个、至少4,000个、至少5,000个、至少6,000个、至少7,000个、至少8,000个、至少9,000个、或至少10,000个核苷酸(如下述的自我复制的RNA)。以g/mol(或道尔顿)给出的单链RNA分子的分子量可大约使用以下公式计算：分子量＝(RNA核苷酸数)x340g/mol。
如在WO2011/005799中讨论的，RNA(特别是自我复制的RNA)除了任何5’帽结构外还可包括一个或多个具有修饰的核碱基的核苷酸。例如，RNA可包括一个或多个修饰的嘧啶核碱基，如假尿苷和/或5-甲基胞嘧啶残基。然而，在一些实施方式中，RNA包括无修饰的核碱基，并且可包括无修饰的核苷酸，即RNA中的所有核苷酸为标准A、C、G和U核糖核苷酸(除了任何5’帽结构，其可包括7’-甲基鸟苷)。在其它实施方式中，RNA可包括包含7’-甲基鸟苷的5’帽，并且第一1、2或3、5’核糖核苷酸可在核糖的2’位被甲基化。
本申请使用的RNA优选地仅在核苷之间包括磷酸二酯连接基，但在一些实施方式中其可包含氨基磷酸酯连接基、硫代磷酸酯连接基和/或甲基磷酸酯连接基。
本发明尤其适合自我复制的RNA的纯化。当被递送至脊椎动物细胞时，即使没有任何蛋白，自我复制的RNA分子(复制子)也可通过其自身的转录(通过由其自身产生的反义副本)产生多个子RNA(daughterRNA)。因而自我复制的RNA分子通常为正链分子，其在被递送至细胞后可被直接翻译，并且该翻译提供了由RNA依赖性RNA聚合酶，该RNA依赖性RNA聚合酶随后从被递送的RNA中产生反义和正义转录本。因而被转录的RNA导致产生多个子RNA。这些子RNA以及共线亚基因组转录本自身可被翻译以提供感兴趣的被编码蛋白(如免疫原)的原位表达，或可被转录以提供与被递送的RNA同义的进一步的转录本，其被翻译而提供蛋白(如免疫原)的原位表达。该转录序列的总体结果为所引入的复制子RNA数量的巨幅扩增，且因此被编码的免疫原成为细胞的主要多肽产物。在WO2012/006369和WO2013/006838种公开了合适的自我复制的RNA。
实现自我复制的一种合适的系统为使用基于α病毒的RNA复制子。在被递送至细胞后，这些正链复制子被翻译以产生复制酶(或复制酶-转录酶)。复制酶被翻译为多聚蛋白，其自动剪切以提供产生被递送的正链RNA的基因组负链副本的复制复合体。这些负链转录本自身可被转录以提供正链母RNA的进一步的副本，还提供编码免疫原的亚基因组转录本。亚基因组转录本的翻译因而导致被感染细胞原位表达免疫原。合适的α病毒复制子可使用来自辛德比斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。可使用突变型或野生型病毒序列，如在复制子中使用VEEV的减弱TC83突变体(WO2005/113782)。
因而，优选的自我复制的RNA分子编码：(i)可从自我复制的RNA分子转录RNA的由RNA依赖性RNA聚合酶；和(ii)免疫原。聚合酶可为α病毒复制酶，例如包含一个或多个α病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。
尽管天然的α病毒基因组除了非结构复制酶多聚蛋白外还编码病毒体结构蛋白，但优选本发明的自我复制的RNA分子不编码α病毒结构蛋白。因而优选的自我复制的RNA可在细胞中产生其自身的基因组RNA副本，但不产生含有RNA的病毒子。无法产生这些病毒子意味着，与野生型α病毒不同，自我复制的RNA分子无法将使自身长期保持为感染形式。在本发明的自我复制的RNA中不存在对病毒的长期保持来说必需的α病毒结构蛋白，且其位置被编码感兴趣的免疫原的基因所代替，这样亚基因组转录本就编码免疫原而非α病毒的病毒体结构蛋白。
因而本发明中使用的自我复制的RNA分子可具有两个开放阅读框。第一(5’)开放阅读框编码复制酶，第二(3’)开放阅读框编码免疫原。在一些实施方式中，RNA可具有额外的(如下游)开放阅读框，例如来编码其它免疫原(见下)或编码附属多肽。
自我复制的RNA分子可具有与被编码的复制酶相容的5’序列。
自我复制的RNA分子可具有不同长度，但其通常为5000至25000个核苷酸的长度，如8000至15000个核苷酸或9000至12000个核苷酸。
本发明中可使用的RNA分子可具有5’帽。该帽可增强RNA的体内翻译。该帽可为天然帽或非天然帽，并且通常通过5’-5’三磷酸酯桥连接至RNA的5’-末端核苷酸。已知各种帽结构，如7-甲基鸟苷(m7G)、3’-O-Me-m7G或“ARCA”(反义帽类似物)、m2,2,7G、未甲基化的帽类似物等。
本发明中可使用的RNA分子的5’核苷酸可具有5’三磷酸酯基团。在帽化的(capped)RNA中其可通过5’-至-5’桥连接至7-甲基鸟苷。5’-三磷酸酯可增强RIG-I结合，并因而促进辅助效应。
RNA分子可具有3’多聚A尾。其还可在其3’末端附近包括多聚A聚合酶识别序列(如AAUAAA)。
在一个实施方式中，本发明的方法被用于纯化修饰的mRNA；在另一个实施方式中，本发明的方法被用于纯化未修饰的mRNA。
含RNA的样品
根据本发明，从含RNA的样品中纯化所需的RNA。该样品的组成很大程度上取决于RNA的来源以及任何在先纯化步骤。本发明的方法可特别用于从体外转录(IVT)来源纯化所需RNA。在这些实施方式中，样品包含所需的RNA种类，通常还包含污染物，其包括不希望的RNA、DNA(如来自IVT的模板DNA)、蛋白(如RNA聚合酶、帽化酶、DNA酶、RNA酶抑制剂)、焦磷酸酯和/或游离核苷酸。在IVT混合物中发现的游离核苷酸或者为未反应的RNA前体(如核糖核苷三磷酸)或由DNA消化产生的降解产物(如脱氧核苷单磷酸)。用于IVT反应的典型的缓冲液为基于Tris的缓冲液，例如50mMTris(pH8.0)。使用IVT的特殊优点为，在受控反应中产生大量的所需RNA种类，以及可容易地将修饰的碱基引入RNA中。
因而，本发明的方法可包括预纯化由IVT制备的RNA的步骤。因而，本发明提供了用于制备纯化的RNA的方法，包括以下步骤：(i)进行体外转录以提供包含RNA的样品；和(ii)从样品中纯化RNA，其包括一个或多个正切流动过滤步骤、一个或多个羟磷灰石色谱步骤、一个或多个核心珠流通色谱步骤或它们的任意组合。
IVT在通常包括酶(如RNA聚合酶以及通常帽化酶)、RNA前体(例如核糖核苷三磷酸)、DNA模板、还原剂(如DTT)和合适的缓冲液的无细胞的受控生化反应中由DNA模板产生RNA。在IVT之后应除去DNA模板以避免其存在于最终产物中，因而其可被消化(如使用DNA酶)或除去。当RNA纯化方法包括正切流动过滤或核心珠色谱时，优选在纯化前除去DNA，例如使用DNA酶。相反，当该方法使用羟磷灰石色谱时，可除去DNA而无须DNA酶处理，但如果需要仍可使用DNA酶处理的步骤。
然而，本发明不限于来自体外转录反应的RNA，并且在一些实施方式中，使用体内(基于细胞的)转录、化学合成或合成基因组途径制备RNA。
本发明的方法也可用于纯化来自含RNA样品的RNA，其中所述样品为RNA病毒提取物、含RNA的细胞提取物(如来自动物、植物或细菌细胞)或含RNA的环境样品或其提取物。
从含RNA的样品中纯化RNA
RNA纯化被用于从包含感兴趣的特定RNA的组合物中除去杂质。可使用不同的纯化步骤来从该组合物的非RNA组分(如DNA和蛋白)以及其它污染RNA中分离感兴趣的RNA。
本发明的方法使用以下三种技术的一种或多种：正切流动过滤；羟磷灰石色谱；和/或核心珠流通色谱。这些方法全部可在水性条件下进行，因此本发明的方法不要求使用有机溶剂，且优选地，是在不使用有机溶剂时进行，特别是不使用那些当作为药物组合物的一部分向人体给药时有毒性的有机溶剂和/或那些可对大型RNA的稳定性产生不利影响的有机溶剂。因此，优选地，本发明的方法在不使用乙腈、氯仿、苯酚和/或甲醇的条件下进行。优选地，它们可在不使用任何有机溶剂的条件下进行。
本发明的方法可在室温下方便进行。
正切流动过滤(TFF)
根据本发明，可使用正切流动过滤(TFF)来通过除去低分子量的种类而纯化感兴趣的RNA。因而，本发明的方法可包含一个或多个TFF步骤。TFF对大型RNA种类的纯化特别有效。发明人已显示，使用TFF进行RNA纯化可实现高产率(至少90％至95％)和纯度(至少90％至99.9％)，同时保留纯化的RNA的稳定性和效应。有益地，TFF也可在纯化的同时允许缓冲液更换(透析)(或TFF可与纯化的RNA一起使用，作为独立的缓冲液更换步骤，如更换为最终的配制缓冲液。TFF易于操作，省时(RNA纯化和缓冲液更换仅用时70分钟)且由于其作为封闭系统操作，能够避免污染(如被RNA酶污染)。TFF对从IVT混合物中除去游离核苷酸尤其有效。
TFF涉及使含有样品的液体以正切方向流经滤膜。因而，TFF与死端式过滤不同，在死端式过滤中，样品穿过膜而非以正切方向流过。在TFF中，相对于滤液端，样品端通常被保持为正压。随着液体流过过滤器，其中的成分可穿过膜进入滤液。当使用IVT反应样品时，通常将核糖核苷三磷酸酯、例如被消化的模板DNA的小核酸片断和/或其它不希望的组分留在滤液中被除去，而由保留物中回收长RNA。很多TFF系统可商购(例如使用中空纤维，如可购自GEHealthcare和SpectrumLabs的那些)。TFF膜的分子量截止点(MWCO)决定了何种溶质能穿过膜(即进入滤液)而何种溶质被保留(即进入保留物)。选择本发明使用的TFF过滤器的MWCO以使基本上所有感兴趣的溶质(即所需RNA种类)留在保留物中，而不希望的组分进入滤液。可将保留物再循环至进料池中，以在额外的循环中被再过滤。与死端式过滤相比，在过滤过程中保留物被洗走，从而使得膜的堵塞(这在本领域已知为“膜污染”)被最小化，在膜上保持较高且稳定的过滤速率，并增加可连续操作该过程的时间长度。
选择符合本发明的TFF操作参数，以使得杂质可穿过滤膜而保留感兴趣的RNA，而不显著影响RNA的完整性和/或效应。
滤膜的平均孔径在本领域被称作“膜孔径”。膜孔径通常表示为kDa，指的是该膜可能保留的最小颗粒或超分子的平均分子量。或者，膜孔径可表示为μm，指的是该膜可能保留的最小颗粒的直径。该直径与相似形状分子(如球状分子)的分子量成比例。例如，对于球状分子，500kDa的膜孔径相当于约0.02μm的膜孔径。
发明人发现在250至1000kDa之间的膜孔径可有效用于纯化大型RNA，如250至750kDa之间，或优选400至600kDa之间。特别优选具有约500kDa的膜。优选地，选择膜孔径以使感兴趣的RNA分子的尺寸与膜孔径之比为至少1.5:1(如至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1或至少6:1)和/或最大非RNA杂质的尺寸与膜孔径之比为至少1:1.5(如至少1:2、至少1:3、至少1:4、至少1:5或至少1:6)。
当样品包含不同尺寸的所需RNA和不希望的RNA种类时，该方法可包括两步或更多步的正切流动过滤，其中每步使用不同膜孔径，这样在一步中除去比感兴趣的RNA更小的分子并保留含RNA的保留部分，在其它一步或多步中除去比感兴趣的RNA更大的分子，并在滤液中回收感兴趣的RNA。该方法可与羟磷灰石色谱和核心珠流通色谱结合，如下所述。因而在一个实施方式中，本发明提供用于从样品中纯化RNA的方法，其中该方法包括使用第一膜的第一步正切流动过滤，任选地包含随后的(a)额外的核心珠流通色谱和/或羟磷灰石色谱步骤，随后包含使用第二膜的第二步正切流动过滤，其中第一和第二膜具有不同孔径，这样第一膜将感兴趣的RNA保留在保留物中，且第二膜允许感兴趣的RNA穿过膜的孔进入滤液并将杂质保留在保留物中。
可使用任何合适的滤膜进行TFF。发明人发现中空纤维过滤器尤其有效。中空纤维过滤器通常包含大量(成束)的中空开口导管(纤维)，含有样品的液体由此从进料侧流向保留物侧。导管壁由膜(滤膜)组成，其通常具有交联腔(孔)的内部三维结构。可用于本发明的常见滤膜聚合物为聚砜(PS)、聚醚砜(PES)。可修饰PES(mPES)以增加亲水性并具有比未修饰的PES更高的渗透通量率。已知几种不同的方法被用来将疏水性PES膜转化为亲水性PES膜。发明人发现亲水性膜以及特别是被修饰的聚醚砜(mPES)膜对RNA纯化来说尤其有效。
TFF膜可根据其有效表面积变化。有效膜表面积通常以cm2表示，并指暴露于样品的滤膜的总表面积。中空纤维膜的有效表面积取决于纤维的平均直径和有效长度以及纤维总数。发明人发现有效膜面积可影响TFF方法的操作时间以及RNA纯化和缓冲液更换的效率。由小规模体积确定的工艺参数可通过保留过滤器的有效长度并增加有效膜面积(如增加平均纤维直径和/或纤维总数)而被应用于大体积中。
TFF方法可根据在操作中施加的跨膜压变化。跨膜压为滤膜的进料侧和滤液侧之间的平均压力差。优选地，选择跨膜压，从而实现穿过膜的流体的高流量，同时保证感兴趣的RNA从任何杂质中的有效分离并避免在滤膜表面上形成凝胶层。发明人发现，优选在1psi(6895Pa)至5psi(34475Pa)之间的跨膜压。优选地，跨膜压被设定为约2psi(13790Pa)。
TFF方法可根据剪切速率(或者在本领域也已知为截留速度)变化。剪切速率通常以秒的倒数(s-1)表示，并可根据本领域已知公式计算。优选地，选择剪切速率，从而实现穿过膜的流体的高流量，同时保证RNA的完整性并避免在滤膜表面上形成凝胶层。发明人发现优选在约500至5000s-1之间的剪切速率。更优选使用约800s-1的剪切速率。
例如，可使用约500s-1、约600s-1、约700s-1、约800s-1、约900s-1、约1000s-1、约1100s-1、约1200s-1、约1300s-1、约1400s-1、约1500s-1、约1600s-1、约1700s-1、约1800s-1、约1900s-1、约2000s-1、约2500s-1、约800s-1、约3000s-1、约3500s-1、约4000s-1、约4500s-1、约5000s-1、约500s-1至约5000s-1、约500s-1至约4000s-1、约500s-1至约3000s-1、约500s-1至约2000s-1、约500s-1至约1000s-1、约600s-1至约5000s-1、约600s-1至约4000s-1、约600s-1至约3000s-1、约600s-1至约2000s-1、约600s-1至约1000s-1、约700s-1至约5000s-1、约700s-1至约4000s-1、约700s-1至约3000s-1、约700s-1至约2000s-1、约700s-1至约1000s-1、约800s-1至约5000s-1、约800s-1至约4000s-1、约800s-1至约3000s-1、约800s-1至约2000s-1、或约800s-1至约1000s-1等的剪切速率。除了含RNA的样品外，可将流体给料至TFF系统。该流体通常为缓冲液。缓冲液的选择和组成可影响RNA纯化和/或缓冲液更换的效率、蛋白聚集水平、RNA-蛋白分离和RNA稳定性。典型的缓冲液包括基于柠檬酸和Tris的那些。发明人发现Tris类缓冲液，如含有10mMTris的缓冲液，操作得尤其好。优选地，缓冲液pH在6.5至9.0之间，7.0至8.5之间，7.5至8.5之间，7.8至8.2之间。更优选地，样品缓冲液pH为8.0。
例如，缓冲液的pH可为约6.5、约7.0、约7.5、约7.8、约8.0、约8.2、约8.5、约9.0、约6.5至约9.0之间、约6.5至约8.5之间、约6.5至约8.2之间、约6.5至约8.0之间、约7.0至约9.0之间、约7.0至约8.5之间、约7.0至约8.2之间、约7.0至约8.0之间、约7.5至约9.0之间、约7.5至约8.5之间、约7.5至约8.2之间、约7.5至约8.2之间、约7.8至约9.0之间、约7.8至约8.5之间、或约7.8至约8.2之间等。除了任何缓冲盐之外，缓冲液可进一步包含一种或多种盐。优选地，所使用的盐的类型和浓度能够减弱RNA-蛋白相互作用，同时将所需的RNA保留在溶液中。例如，可使用总浓度为150mM至500mM之间、或200mM至300mM之间的盐。优选地，盐浓度为250mM。盐可为氯化钠。
例如，缓冲液可包含总浓度在0至500mM之间的一种或多种盐，如约50mM、约75mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM、约500mM、约50mM至约500mM、约50mM至约400mM、约50mM至约300mM、约50mM至约250mM、约75mM至约500mM、约75mM至约400mM、约75mM至约300mM、约75mM至约250mM、约100mM至约500mM、约100mM至约400mM、约100mM至约300mM、或约100mM至约250mM等。
然而，发明人发现，由于在TFF期间RNA析出的风险或在任何下游方法中的不利效果，优选地应避免缓冲液中过量的盐浓度。因此优选不向用于TFF纯化的缓冲液中加入除了缓冲盐之外的盐。已知向缓冲液中加入EDTA有利地抑制了任何RNA酶活性。然而，本发明的方法可在不加入EDTA的情况下纯化RNA，因此缓冲液可不含EDTA。
额外流体(即在样品之外被加入的流体)的体积会影响在RNA纯化和/或缓冲液更换期间除去小分子的效率。然而，大的体积增加操作时间。通常，额外流体与样品的体积比在5:1至10:1之间。发明人发现约8:1的比例在确保有效纯化和/或缓冲液更换而不过度增加操作时间方面尤其有利。
羟磷灰石色谱
发明人设计了一种工业上规模可变的方法，其在使用羟磷灰石色谱从IVT混合物中纯化大型RNA中尤其有效，但也可用于纯化短的(如siRNA)和中型RNA(如mRNA)。因而本发明的方法可包含一个或多个羟磷灰石色谱步骤。
该技术的特殊优点在于可省略包含模板DNA的酶消化步骤。这构成了相对于那些依赖于模板DNA消化的现有技术方法的改进。该方法在从所需RNA种类中有效除去模板衍生的DNA或其片段以及蛋白方面尤其有利。
羟磷灰石色谱涉及羟磷灰石固定相。羟磷灰石是具有化学式[Ca5(PO4)3(OH)]2的一种磷酸钙形式。据信，核酸的羟磷灰石色谱利用了其带负电荷的磷酸酯骨架和羟磷灰石介质表面带正电荷的钙离子之间的电荷相互作用。通过应用增加的磷酸盐梯度实现差异洗脱(例如从所需RNA种类中分离蛋白、DNA和不希望的RNA种类)。缓冲液中存在的磷酸根离子与保留的核酸种类的磷酸酯基团竞争羟磷灰石介质上的钙，从而允许通过分子的选择性洗脱而进行分离。在该混合模式色谱中，结合是羟磷灰石介质的钙离子对RNA磷酸酯骨架的吸引和羟磷灰石的磷酸根对RNA磷酸根骨架的排斥之间的平衡。与离子交换色谱相比，在羟磷灰石介质上的结合强度取决于电荷密度而非总电荷。该重要区别允许根据分子的电荷密度(例如RNA相比于.DNA相比于.蛋白质)以及RNA的结合和洗脱来分离分子，而非取决于其总电荷，因此与其长度无关。因此，该方法可被用于纯化任何长度的RNA分子。
在1960年代描述了使用羟磷灰石分级分离核酸(Bernardi等人，1965)。该方法被用于包括从环境样品中离析和分离病毒RNA、dsDNA和ssDNA(Andrews-Pfannkoch等人，2010)、从组织提取的核酸中分离DNA和RNA(Beland等人，1979)以及分离用于杂交研究的DNA(Kamalay等人，1984)的应用中。据发明人所知，不存在在纯化来自IVT的RNA的生物操作中使用羟磷灰石色谱的公开证据，因此，由于样品的特性，这对本领域技术人员提出了特定的挑战。
将选择羟磷灰石色谱参数，以使所需的RNA能够被保留，然后被选择性洗脱，而不显著影响RNA的完整性和/或效力。
可使用批量形式或柱形式进行羟磷灰石色谱。优选柱形式。所述柱包含固定相。使用柱形式的纯化可包括向柱加入含RNA的样品，丢掉流出液(flow-through)，使洗脱缓冲液流过柱，并收集所需的洗脱液或其级分。该方法可包含其它步骤，如在这些步骤之前或之间的清洗步骤。合适的色谱装置在本领域已知，例如液相色谱系统，如来自GEHealthcare的液相色谱系统。
优选的羟磷灰石固定相为陶瓷羟磷灰石。陶瓷羟磷灰石为球形多孔形式的晶体羟磷灰石，并通常通过将晶体羟磷灰石在高温下烧结而获得。使用陶瓷羟磷灰石作为固定相的羟磷灰石色谱对于大规模RNA纯化来说尤其有利，因为其为能够经受高流速和重复使用的特别稳定的材料。
羟磷灰石颗粒的标称孔径通常为0.05至0.13μm之间，例如0.08至0.1μm。
标称平均粒径通常为20至80μm，例如40μm。
示例性的羟磷灰石介质为来自Bio-Rad的CHTTM陶瓷羟磷灰石(II型，40μm粒径)。
通常在250至350cm/h的线性流速，如300cm/h的线性流速下进行该色谱。可通过在260nm下测量UV吸光度来鉴定含有RNA的洗脱液级分。相对于在羟磷灰石色谱之前的制备物，洗脱液中收集的包含感兴趣的RNA的组合物是高度纯化的。在进一步的处理之前可将含有感兴趣的RNA的多个洗脱出的级分组合。
可将任何合适的磷酸盐缓冲液用于洗脱。特别优选的磷酸盐缓冲液为当在相同浓度和pH下使用时，相对于不太优选的磷酸盐缓冲液，使RNA沉淀水平最低的那种缓冲液。发明人发现磷酸钾缓冲液特别合适，并相对于磷酸钠缓冲液更为优选，因为当以相同浓度和pH使用时，相对于磷酸钠缓冲液，磷酸钾缓冲液有利地使RNA沉淀水平最低。总的来说，发明人发现优选使用具有增加的离液性(kosmotropicity)的阳离子。
发明人还发现，可改变羟磷灰石色谱参数，从而可以改善RNA和DNA的分离。这可通过在一种或多种洗脱缓冲液中使用一定量的除磷酸盐以外的盐以使在最终洗脱缓冲液中的盐浓度在洗脱过程中保持恒定来实现。可使用任何合适的盐，例如氯化钠。此外，或者可选择地，可在将样品加入羟磷灰石柱之前向样品中加入一定量的盐。例如，可向样品中加入氯化钾或氯化钠以达到100至500mM之间，例如250mM或500mM的最终浓度，并且不向磷酸盐洗脱缓冲液中加盐，从而提供了具有高产率同时保持高纯度的纯化RNA的尤其有利的方法。
例如可向样品中加入氯化纳和/或氯化钾以达到0至500mM之间的最终浓度，如约50mM、约75mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM、约500mM、约50mM至约500mM、约50mM至约400mM、约50mM至约300mM、约50mM至约250mM、约75mM至约500mM、约75mM至约400mM、约75mM至约300mM、约75mM至约250mM、约100mM至约500mM、约100mM至约400mM、约100mM至约300mM、约100mM至约250mM等。
发明人还出人意料地发现，可通过使用这样的洗脱步骤来实现对RNA而非DNA或其它杂质的选择性洗脱，其中洗脱缓冲液中的磷酸盐浓度能够使RNA被选择性洗脱。可通过经验确定合适的磷酸盐浓度的确切范围，其取决于在缓冲液中存在的任何非磷酸盐，如氯化钠。例如，当不存在其它盐时，发明人发现使用这样的洗脱步骤可实现对RNA的选择性洗脱，其中磷酸盐洗脱缓冲液具有约1.8S/m(18mS/cm)至3.8S/m(38mS/cm)之间、或2.1S/m(21mS/cm)至3S/m(30mS/cm)之间、例如约2.1S/m(21mS/cm)的电导率。
例如，磷酸盐洗脱缓冲液可具有约1.8S/m(18mS/cm)、约1.9S/m(19mS/cm)、约2.0S/m(20mS/cm)、约2.1S/m(21mS/cm)、约2.2S/m(22mS/cm)、约2.3S/m(23mS/cm)、约2.4S/m(24mS/cm)、约2.5S/m(25mS/cm)、约2.6S/m(26mS/cm)、约2.7S/m(27mS/cm)、约2.8S/m(28mS/cm)、约2.9S/m(29mS/cm)、约3.0S/m(30mS/cm)、约3.1S/m(31mS/cm)、约3.2S/m(32mS/cm)、约3.3S/m(33mS/cm)、约3.4S/m(34mS/cm)、约3.5S/m(35mS/cm)、约3.6S/m(36mS/cm)、约3.7S/m(37mS/cm)、约3.8S/m(38mS/cm)、约1.8S/m(18mS/cm)至约3.8S/m(38mS/cm)、约1.8S/m(18mS/cm)至约3.5S/m(35mS/cm)、约1.8S/m(18mS/cm)至约3.0S/m(30mS/cm)、约1.8S/m(18mS/cm)至约2.5S/m(25mS/cm)、约1.8S/m(18mS/cm)至约2.1S/m(21mS/cm)、约2.0S/m(20mS/cm)至约3.8S/m(38mS/cm)、约2.0S/m(20mS/cm)至约3.5S/m(35mS/cm)、约2.0S/m(20mS/cm)至约3.0S/m(30mS/cm)、或约2.0S/m(20mS/cm)至约2.1S/m(21mS/cm)等的电导率。
这可通过例如使用具有约180mM磷酸钾浓度的洗脱缓冲液的洗脱步骤来实现。也可使用合适浓度的其它磷酸盐缓冲液(如磷酸钠)。使用包含所述选择性RNA洗脱步骤的逐步(非连续)洗脱梯度对RNA纯化来说尤其有利。
可将以上所述的向样品和/或洗脱缓冲液中加盐以及使用逐步洗脱梯度有效结合以尤其有效地从杂质中分离RNA。例如，该方法可包括在一种或多种洗脱缓冲液中使用一定量的除磷酸盐以外的盐，以使最终洗脱缓冲液中的盐浓度在洗脱期间保持恒定，或在将样品加入羟磷灰石柱之前向样品中加入一定量的盐(任选地，不向磷酸盐洗脱缓冲液中加盐)，且其中所述洗脱包含这样的洗脱步骤，其中洗脱缓冲液中的磷酸根浓度能够使RNA被选择性洗脱。
优选地，根据本发明使用羟磷灰石色谱，并与其它RNA纯化方法结合，例如有效除去游离核苷酸的方法可在该羟磷灰石色谱之前，因为发明人出人意料地发现这些游离核苷酸可阻塞柱或使柱饱和。发明人发现，该方法的组合能够尤其有效地从体外转录样品中纯化大型RNA。例如，可在羟磷灰石色谱之前使用核心珠流通色谱或正切流动色谱作为纯化步骤。
核心珠流通色谱
根据本发明，可使用核心珠流通色谱纯化RNA。因而本发明的方法可包含一步或多步核心珠流通色谱。发明人发现该技术使获得高产率的纯RNA的快速、工业规模的纯化操作成为可能，并对于从例如在IVT反应样品中的所需RNA种类中除去蛋白质污染物尤其有利。发明人显示，可使用该方法纯化超过3兆道尔顿的非常大的RNA种类。据发明人所知，还没有使用核心珠色谱或任何其它方法能够纯化如此大的RNA种类(尤其在IVT之后)的现有技术方法。然而，本方法不限于纯化大型RNA分子，并且如下所述，只要选择合适的核心珠尺寸，该方法可用于纯化任何尺寸的RNA分子(如中型RNA)。
可使用批量模式或柱模式进行核心珠流通色谱。优选柱模式。柱包含固定相。柱模式可包括将含RNA的样品加入柱、收集流出液(flow-through)、以及任选地使洗脱缓冲液流过柱、并收集所需的洗脱液或其级分。该方法可包含其它步骤，如清洗步骤，例如在将样品加入柱之后通常向柱加入“追逐(chase)”缓冲液。合适的色谱装置为本领域已知，例如液相色谱系统，如来自GEHealthcare的液相色谱系统。
在向柱加入含RNA的样品之后，其内容物可仅通过重力穿过柱，或可施加外部压力以增加其穿过速率。在向柱加入含RNA的样品之后，也可向柱加入缓冲液，通常在本领域被称为“追逐缓冲液”，其仅通过重力穿过柱，或通过施加外部压力以增加样品组分穿过柱的速率。流速可被表示为体积流速(每单位时间流动相(例如样品和/或追逐缓冲液)穿过柱的体积)或线形流速(每单位时间流动相向前移动的距离)。计算流速以及由线形流速向体积流速转化的方法为本领域已知。
根据本发明，色谱介质由珠子组成，其由多孔材料(基质)组成，该材料通常由聚合物形成。基质包含至少两层，例如由外层(壳)包围的内层(核)，但基质也可在内层和外层之间包含一层或多层的其它(中间)层。
每层基质层可被至少一种配体官能化，或其可不被官能化。通常可通过存在或不存在至少一种配体将每层彼此区分开。
例如，可用N种不同配体使核官能化，而使用不超过N-1种的这些配体使壳官能化。N可为任何正整数，例如1。例如，核可被一种配体官能化，而壳被一种或多种不同配体官能化，或不被任何配体官能化。在优选的实施方式中，核被配体官能化，而壳不被任何配体官能化。
优选地，至少一种配体为具有多种官能性的配体，例如配体为疏水性同时带正电荷。例如，配体可为单-(C1-C8)烷基胺，例如配体可为辛胺(CH3(CH2)7NH2)。
因而，在本发明的优选实施方式中，核被配体官能化，其中配体具有多种官能性，例如，配体为疏水性且带正电荷，例如配体可为单-(C1-C8)烷基胺，例如配体可为辛胺(CH3(CH2)7NH2)，且壳不被任何配体官能化。
基质具有规定的孔径，并因而根据分子尺寸避免一部分分子进入核，该分子在柱流出液(流出模式)中收集。能够通过基质的分子进入核，在这里其通过与配体结合而被保留其中。可使用合适的洗脱液从珠子洗出被保留的分子(结合-洗脱模式)。通常，洗脱液为包含氢氧化钠(NaOH)和溶剂的溶液。
选择核心珠流通色谱参数，从而可以从一个或多个流出级分中选择性回收所需的RNA，而无须显著影响RNA的完整性和/或效力。
优选地，基质为多孔基质，例如琼脂糖，优选高度交联的琼脂糖。
基质孔径通常以kDa表示，是指有可能被基质阻拦的最小颗粒的平均分子量(也被称为MWCO)。或者，基质孔径可以μm表示，是指有可能被基质阻拦的最小颗粒的直径，如以上TFF中所述。选择孔径以使得截止点低于RNA尺寸但高于蛋白尺寸。使用该方法，可纯化那些大于核心珠的分子截止点的RNA种类。更优选地，所需RNA种类为在需要纯化的样品中最大的分子。因此，根据本发明，从一个或多个流出级分中回收RNA。
发明人发现对于较大RNA的纯化，至少250kDa的MWCO/孔径是有用的，例如至少300kDa、400kDa、500kDa、600kDa或至少700kDa等。特别优选至少约700kDa的分子量截止点。通常，选择MWCO以使感兴趣的RNA分子的分子量与MWCO之比为至少1.5:1(例如至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1或至少6:1)和/或最大的非RNA杂质的分子量与MWCO之比为至少1:1.5(例如至少1:2、至少1:3、至少1:4、至少1:5或至少1:6)。
选择珠子的平均直径(粒径)，从而在最短的操作时间内能够有效纯化RNA，而不会由于操作所需的额外压力而显著影响RNA的完整性和/或效应。更大的颗粒和更大的孔通常允许使用更低的压力，但会降低分离效率。发明人发现优选约50至100μm的粒径，其中更优选约60至90μm的粒径，并且其中甚至更优选约70至80μm的粒径。最优选约85μm的粒径。
示例性的核心珠流通色谱介质为来自GEHealthcare的CaptoTMCore700珠子。
在流出液中选择性回收由柱流出的RNA。蛋白质和短核酸被保留在珠子中。可通过在260nm下测量UV吸光度来鉴定含有RNA的流出级分。相对于在核心珠色谱步骤之前的制备物，在流出液中回收的包含感兴趣的RNA的组合物被高度纯化。可在进一步的处理之前结合含有感兴趣的RNA的多个洗脱级分。
可在使样品经过柱之前向含RNA的样品中加入一定量的盐。发明人发现这对于除去蛋白质杂质尤其有利。任何合适的盐都可以合适浓度使用，例如约150mM至500mM之间的浓度。
例如，可向含RNA的样品中加入盐直至达到0至500mM之间的最终浓度，如约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约150mM、约200mM、约250mM、约300mM、约350mM、约400mM、约450mM、约500mM、约600mM、约700mM、约750mM、约50mM至约600mM、约50mM至约550mM、约50mM至约500mM、约50mM至约400mM、约100mM至约600mM、约100mM至约550mM、约100mM至约500mM、约100mM至约400mM、约150mM至约600mM、约150mM至约550mM、约150mM至约500mM、约150mM至约400mM等。
发明人发现约125mM至250mM之间的盐浓度尤其有利，其得到具有高RNA产率和有效除去蛋白质的RNA纯化。或者，当对高RNA产率的要求更多于除去蛋白质杂质的要求时，例如当使用基本不含蛋白质的样品时，可使用不超过250mM的盐浓度，或优选不超过125mM。当对高RNA产率和/或除去核酸的高效率的要求更多于对除去蛋白质杂质的要求时，例如当使用基本不含蛋白质但含有大量游离核苷酸的样品时，加入不超过250mM的盐浓度，优选不超过125mM，最优选不加盐。
合适的盐通常为，当在相同浓度和pH下使用时，与不那么优选的盐相比，使RNA沉淀水平最低的盐。发明人发现，通常磷酸钾和/或氯化钾特别合适，并比磷酸钠和氯化钠更为优选，因为当在相同浓度和pH下使用时，钾盐相对于钠盐有利地使RNA沉淀水平最低。总的来说，发明人发现优选使用增加的离液性(kosmotropicity)的阳离子。
可在使样品通过柱之前稀释含RNA的样品。例如，可以以对应于约5倍、约4倍、约3倍、约2倍或约1倍样品体积的稀释体积稀释样品。1倍稀释是指向样品中加入与样品体积相等的稀释剂体积。可使用任何合适的稀释剂，其通常为缓冲液。合适的稀释剂是不干扰任何后续纯化或缓冲液更换步骤的稀释剂。例如，稀释剂可为与含RNA的样品的缓冲液相同的缓冲液(例如50mMTris，pH8.0)。
可改变流速以实现改善的RNA回收率和/或蛋白去除。当希望较高的RNA回收率时，200至500cm/h之间的线性流速是有利的。当希望较高的蛋白去除时，50至300cm/h之间的流速是有利的。通常，使用250至300cm/h之间、优选约275cm/h的流速以优化回收率和蛋白去除。
可将如上所述的盐填加、样品稀释和流速改变有效结合。例如，可稀释含RNA的样品，并在将样品经过柱之前向样品中加入一定量的盐。以高纯度、高产率和短的操作时间纯化大型RNA的尤其有利的方法为这样的方法，其中在将样品加入柱之前将样品稀释4倍，在275cm/h的线性流速下进行色谱，并以250mM向样品和/或追逐缓冲液中加盐(例如KCl或NaCl)。
当根据本发明使用核心珠色谱时，其对于从感兴趣的RNA中除去蛋白质污染物尤其有效。当在单次纯化运行中被加入色谱柱的含RNA样品每ml固定相(即核心珠)包含不超过5至15mg的全部蛋白(例如不超过10mg/ml或不超过13mg/ml)时，获得尤其好的结果。当全部蛋白是由为体外转录反应的典型组分的蛋白(例如T7聚合酶、帽化酶、RNA酶抑制剂和焦磷酸酶)组成时，这些数值尤其相关。
当进行大规模纯化时，可将色谱柱彼此串联以增加容量。
发明人还发现，当核心珠流通色谱步骤之后跟随TFF步骤时可实现更高的纯度水平(例如通过更有效地除去从IVT中留下的游离核苷酸)。可使用TFF步骤以同时进行RNA纯化(除去核苷酸)和更换缓冲液，采用的手段是通过在纯化/缓冲液更换过程中使用配制缓冲液。配制缓冲液与在任何在先步骤中使用的纯化缓冲液不同。
方法的组合
任何所公开的方法可在操作中单独使用，或在操作中组合使用，所述操作包括至少一步RNA纯化，以及任选的包括缓冲液更换的额外步骤。例如，TFF、核心珠流通色谱或羟磷灰石色谱被用于RNA纯化，任选地随后进行额外的TFF步骤以用于缓冲液更换和/或RNA纯化。
在另一个实例中，将TFF与羟磷灰石色谱组合使用以用于RNA纯化，任选地随后进行进一步的TFF步骤以用于缓冲液更换和/或RNA纯化。
在另一个实例中，将核心珠流通色谱与羟磷灰石色谱组合使用以用于RNA纯化，任选地随后进行TFF步骤以用于缓冲液更换和/或RNA纯化。
在另一个实例中，将TFF与核心珠流通色谱组合使用以用于RNA纯化，任选地随后进行进一步的TFF步骤以用于缓冲液更换和/或RNA纯化。
在另一个实例中，当使用核心珠流通色谱时，随后进行正切流动过滤。该方法还可包括羟磷灰石色谱，其在核心珠流通色谱之后并在正切流动过滤之前。
在另一个实例中，当使用羟磷灰石色谱时，在其之前进行正切流动过滤或核心珠流通色谱。该方法还可在羟磷灰石色谱之后包括正切流动过滤。
当方法的结合包含两步相同方法时，例如一步正切流动过滤和进一步的正切流动过滤，通常在第一步和第二步中使用两种不同缓冲液。通常，第一缓冲液在至少一种组分和/或一个特性方面与第二缓冲液不同。例如，盐浓度、盐类型、张度(tonicity)、pH或污染物的量可不同。通常缓冲液可基于不同的缓冲体系，例如第一缓冲液可为基于Tris或基于磷酸盐的缓冲液，而第二缓冲液为基于柠檬酸盐的缓冲液。
发明人已证明，上述方法的结合在最终RNA产品的纯度(例如除去核糖核苷三磷酸、蛋白质、DNA及其片断)和产率、操作容易程度、时间效率和整个操作的规模可变性方面带来更大优势。
装置特性
本发明的一个优点在于其使用一次性组件。因而本发明的方法可包括这样的步骤，在进行该方法后，用于进行该方法的装置中的一些或全部都被丢弃。例如，任何TFF柱、羟磷灰石载体和/或核心珠流通柱都可被丢弃，任何被用于连接这些柱的导管和接插件也可被丢弃。这些组件可作为生物公害废弃物被丢弃。
因而本发明的方法可使用一次性装置组件。此外，总的来说，本发明的方法使用易于除去RNA酶污染物的装置组件。该要求可被反映在组件的材料、形状、构造和尺寸中。
快速方法
如上所述，本发明提供了用于从样品中纯化RNA的方法，其中在小于12小时内将RNA纯化为至少99％的纯度。
类似地，本发明提供了用于从含有RNA、DNA、焦磷酸酯和游离核苷酸(作为未反应的RNA前体和/或作为由RNA至DNA的降解产物)的样品中纯化RNA的方法，其中该方法在小于12小时内提供不含DNA、焦磷酸酯和游离核苷酸的终产物。
含RNA的样品可为IVT反应产物，并因此会含有上述典型的IVT污染物。
可制备高纯度的RNA，例如≥99.5％、≥99.9％或甚至≥99.95％。因而被纯化物中至少99％或更多的组分(除了水和缓冲盐)为感兴趣的RNA。
该方法可在小于12小时内，例如<8小时、<6小时、<4小时或<2小时内完成，以提供纯化的RNA。
该方法可使用本文其它地方公开的任何步骤(及其组合)。优选地，自始至终使用水性条件进行该方法。
药物组合物
根据本发明纯化的RNA可用作药物组合物的组分，例如用作使受试者对各种疾病免疫的疫苗。这些组合物通常包括RNA及其药学可接受的载体。Gennaro等人对药学可接受的载体进行了全面的讨论。本发明的药物组合物还可包括一种或多种其它组分，如小分子免疫增强剂(例如TLR激动剂)。本发明的药物组合物还可包括用于RNA的递送系统，例如脂质体、水包油型乳剂或微粒。
本发明的药物组合物优选基本不含来自RNA制备和纯化的污染物。当使用IVT时，该污染物可包括蛋白质，例如酶(如聚合酶，特别是T7聚合酶)和帽化酶，游离核苷酸和模板DNA和/或其片段。
本发明的药物组合物可包括于纯水(例如w.f.i.)中或于最终制剂缓冲液中的RNA，所述缓冲液例如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。缓冲盐通常在5至20mM的范围内。
本发明的组合物可包括金属离子螯合剂。它们可通过除去能够加速磷酸二酯水解的离子而增加RNA稳定性。因而组合物可包括EDTA、EGTA、BAPTA、喷替酸等中的一种或多种。该鳌合剂的浓度通常在10至500μM之间，例如0.1mM。柠檬酸盐，例如柠檬酸钠，可也作用为鳌合剂，同时还有利地提供缓冲活性。
本发明的组合物可包括钠盐(例如氯化钠)以提供张度。典型地使用10±2mg/ml浓度的NaCl，例如约9mg/ml。
本发明的药物组合物可具有5.0至9.5之间的pH，例如6.0至8.0之间。
本发明的药物组合物可具有200mOsm/kg至400mOsm/kg之间的渗摩尔浓度，例如240至360mOsm/kg，或290至310mOsm/kg之间。
本发明的药物组合物可包括一种或多种防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。优选无汞组合物，且可制备无防腐剂疫苗。本发明的药物组合物优选无菌。
本发明的药物组合物优选无热原，例如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，且优选每剂量<0.1EU。
本发明的药物组合物优选无谷蛋白。
本发明的药物组合物可以单位剂量形式制备。在一些实施方式中，单位剂量可为0.1至1.0ml之间的体积，例如约0.5ml。
该组合物可制备为注射剂，其为溶液或悬浮液。该组合物可被制备为用于使用细喷雾进行肺部给药，例如通过吸入器。该组合物可被制备为用于作为例如喷雾或滴剂用于鼻腔给药、耳部给药或眼部给药。典型地为用于肌内给药的注射剂。
当组合物包括递送系统时，其通常为脂质体(例如参见WO2012/006376、WO2012/030901、WO2012/031043、WO2012/031046和WO2013/006825)、水包油型乳剂(例如参见WO2012/006380、WO2013/006834和WO2013/006837)或微粒(例如参见WO2012/006359)。本发明的操作可包括额外的将纯化的RNA分子与递送系统结合的步骤。类似地，本发明提供用于制备药物组合物的方法，包含以下步骤：使用本发明的方法纯化RNA；和将被纯化的RNA与递送系统(例如脂质体或水包油型乳剂)结合。
组合物包含免疫有效量的RNA以及视需要任何其它组分。‘免疫有效量’是指以单一剂量或一系列剂量的一部分向个体给药的量对治疗或预防来说是有效的。该量根据需要被治疗的个体的健康和生理状况、年龄、需要被治疗的个体的分类群(例如非人类灵长目动物、灵长目动物等)、个体的免疫系统对合成抗体的容量、需要保护的程度、疫苗的组成、治疗医生对医疗状况的评估以及其它相关因素而变化。期望该量落入相对较宽的范围内，可通过常规试验来确定。本发明组合物的RNA含量通常以每剂的RNA的量表示。优选的剂量具有≤100μg的RNA(例如10至100μg，如约10μg、25μg、50μg、75μg或100μg)，但也可见到低得多的水平，例如≤1μg/剂、≤100ng/剂、≤10ng/剂、≤1ng/剂等。
本发明还提供了包含本发明的药物组合物的递送装置(例如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮肤贴片等)。该装置可被用于将该组合物向脊椎动物受试者给药。
治疗方法和医药用途
本发明的药物组合物可体内使用以引发抗感兴趣的免疫原的免疫应答。
因而本发明提供了在脊椎动物中引发免疫应答的方法，包括给药有效量的本发明的药物组合物的步骤。该免疫应答优选是保护性的并优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。该方法可引发加强应答。
本发明还提供了本发明的药物组合物，其用于在脊椎动物中引发免疫应答。
本发明还提供了本发明的药物组合物在制造用于在脊椎动物中引发免疫应答的药物中的用途。
通过利用这些用途和方法在脊椎动物中引发免疫应答，可针对各种疾病和/或感染(例如抗上述细菌和/或病毒疾病)对脊椎动物提供保护。该组合物为免疫原性，并更优选为疫苗组合物。根据本发明的疫苗可为预防性的(即防止感染)或治疗性的(即治疗感染)，但通常为预防性的。
脊椎动物优选为哺乳动物，例如人或大型脊椎动物(例如马、牛、鹿、羊、猪)。当该疫苗用于预防性用途时，人类优选为儿童(例如幼儿或婴儿)或青少年；当该疫苗用于治疗性用途时，人类优选为青少年或成人。目标为儿童的疫苗也可向成人给药，例如用来评估安全性、剂量、免疫原性等。
根据本发明的制备疫苗可用于治疗儿童和成人。因而人类患者可为低于1岁、低于5岁、1至5岁、5至15岁、15至55岁或至少55岁。接收疫苗的患者优选为老人(例如≥50岁、≥60岁，并优选≥65岁)、幼儿(例如≤5岁)、住院患者、医护人员、武装部队和军事人员、孕妇、慢性病患者或免疫缺陷患者。疫苗不仅适用于这些群体，还可在群体中被广泛使用。
本发明的组合物通常向患者直接给药。可通过非肠道注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内、皮内或向组织的细胞间隙中)来直接递送。其它递送途径包括直肠、口腔(例如片剂、喷雾)、含服、舌下、阴道、局部、透皮(transdermal)或经皮肤(transcutaneous)、鼻内、眼部、耳部、肺部、或其它粘膜给药。皮内和肌内给药为两种优选途径。可通过注射针头(例如皮下针头)注射，但也可使用无针头注射。通常的肌内剂量为0.5ml。
本发明可被用于引发全身性和/或粘膜免疫，优选引发增强的全身性和/或粘膜免疫。
剂量可为单剂量方案或多剂量方案。多剂量可被用于原发性免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给药各种剂量，例如非肠道原发和粘膜加强、粘膜原发和非肠道加强等。通常以至少一周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔进行多剂量给药。在一个实施方式中，可在出生后约6周、10周和14周，即在6周、10周和14周的年龄进行多剂量给药，如世界卫生组织的ExpandedProgramonImmunisation(“EPI”)中经常使用的那样。在另一个实施方式中，以约2个月的间隔进行两次原发性剂量给药，例如约7、8或9周的间隔，随后在第二次原发性剂量之后的约6个月至1年时进行一次或多次加强剂量给药，例如在第二次原发性剂量后约6、8、10或12个月。在进一步的实施方式中，以约2个月的间隔进行三次原发性剂量给药，即约7、8或9周的间隔，随后在第三次原发性剂量之后约6个月至1年时进行一次或多次加强剂量给药，例如在第三次原发性剂量之后约6、8、10或12个月。
一般原则
除非另外说明，本发明的实践将使用在本领域技术范围内的常规化学、生物化学、分子生物学、免疫和药理学方法。这些技术在文献中全面描述。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可排他性地由X组成或可包括其它物质，例如X+Y。
与数值χ相关的术语“约”为任选的，并且意指例如χ±10％。
术语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。当必要时，可从本发明的限定中省略术语“基本上”。
当提到电荷、阳离子、阴离子、两性离子等时，其是指在pH7获得的。
在本发明的语境下的术语“产率”表示相比于纯化前，纯化后样品中所含的RNA的分数。通常，产率表示为％产率，根据该公式计算：[(纯化后RNA量/纯化前RNA量)x100]。可使用本领域已知方法测量样品中的RNA量，例如使用RNA特异性荧光染料，如
术语“纯化(purification)”或“纯化(purify)”是指将样品中所需RNA与不希望的组分中分离。因而“RNA纯化”是指从包含感兴趣的RNA和杂质的组合物中纯化感兴趣的RNA的方法。因而在纯化后，RNA以比纯化前更纯的形式存在。这意味着相比于纯化前，不希望的组分相对于所需RNA含量以比纯化前更低的量存在。可能需要从所需RNA中分离的含RNA样品的不希望的组分可包括DNA、脱氧核苷单磷酸、核糖核苷三磷酸、不希望的RNA种类(例如比所需RNA尺寸更长/更短的RNA或在所需RNA尺寸范围外的RNA、或双链RNA相比于单链RNA)、脱氧寡核苷酸、蛋白质(尤其是酶，如RNA聚合酶(例如T7聚合酶)、mRNA帽化酶、焦磷酸酶、DNA酶、RNA酶抑制剂)等。
术语“效力”或“功能性”描述了RNA分子的预期生物功能以及相比于RNA纯化前该功能在纯化后被保留到何种水平。例如，如果在纯化后RNA效应保持不变，则RNA的特定生物功能的程度不变，例如通过任何与一定量的输入RNA相关的编码蛋白的体内表达水平来测量。
术语“稳定性”是指RNA分子保留其结构完整性并在物理和化学操作期间抵抗降解到何种程度。例如，如果在纯化后RNA稳定性保持不变，则结构完整性水平不变，例如通过分析平均RNA尺寸或RNA尺寸分布而测量。
与RNA纯化方法相关的术语“制备性的”、“大规模”、“商业规模”和“工业规模”是指可将大量RNA纯化至至少90％的纯度。该大量为使用本发明的方法纯化，例如至少0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、250mg、500mg或者至少1000mg。
术语“固定相”是指包含在色谱床中的非流动相。
术语“粒径”是指固定相颗粒的平均直径。
术语“孔径”是指固定相会阻拦或会被膜保留在样品侧的最小颗粒的平均尺寸。该尺寸通常以粒径或分子量表达。
术语“洗脱梯度”是指在洗脱过程中洗脱液的组成连续变化或以逐步方式变化。相反，“恒溶剂洗脱”在洗脱过程中使用固定的洗脱液组成来进行。
“步骤”与RNA纯化或缓冲液更换的另一步不同，其中该步骤使用不同方法(例如正切流动过滤相比于羟磷灰石色谱)或者其中该步骤使用相同方法但在不同条件下进行(例如使用不同缓冲液、不同膜或不同固定相)。
当在另一第一步“之后”或“随后”进行第二步时，可在方法中在在先的第一步之后立刻进行第二步，即除了可能在两步之间进行的例如稀释或储存步骤之外，在第一步和第二步之间不进行其它步骤。或者，可在第一步和第二步之间进行其它步骤。
当在另一第二步“之前”或“在先”进行第一步时，可在方法中在随后的步骤之前立刻进行第一步，即除了可能在两步之间进行的例如稀释或储存步骤之外，在第一步和第二步之间不进行其它步骤。或者，可在第一步和第二步之间进行其它步骤。
附图说明
图1显示了使用正切流动过滤和羟磷灰石色谱的RNA纯化结果：体外转录反应样品–去除蛋白质–纯化前的体外转录反应样品(泳道1)、正切流动过滤后(泳道2)、羟磷灰石色谱后(泳道3)、正切流动过滤后(泳道4)。
图2A–2B显示使用羟磷灰石色谱的RNA纯化结果。图2A根据其盐析蛋白的能力说明了离子的霍夫迈斯特序列。图2B显示了在不同洗脱缓冲液中RNA聚集颗粒尺寸的动态光散射分析–x轴：以mM表示的盐浓度；y轴：以nm表示的颗粒半径。
图3A显示使用正切流动过滤和羟磷灰石色谱的RNA纯化结果：体外转录反应样品–去除蛋白质–纯化前的体外转录反应样品(泳道1)、正切流动过滤后(泳道2)、羟磷灰石色谱后(泳道3)。图3B显示了使用正切流动过滤和羟磷灰石色谱的RNA纯化结果：体外转录反应样品–除去DNA–纯化前体外转录反应样品中存在的每mgRNA的DNA(从左开始的第一个数据点)、正切流动过滤后每mgRNA的DNA(第二个数据点)、羟磷灰石色谱后每mgRNA的DNA(第三个数据点)。
图4A-4B显示使用核心珠流通色谱的RNA纯化结果：体外转录反应样品–去除蛋白质–纯化前的体外转录反应样品(行1)、核心珠流通色谱后的流出液(行2)、当场清洗柱后的洗脱液(行3)。
图5显示使用核心珠流通色谱的RNA纯化结果：体外转录反应样品–样品和追逐缓冲液中的盐对蛋白质去除的效果。
图6A显示对RNA或RNA+核苷酸的量化结果。图6B和图6D显示正切流动过滤相比于核心珠流通色谱的结果–体外转录反应样品–去除核苷酸。图6C显示正切流动过滤相比于核心珠流通色谱相比于核心珠流通色谱和羟磷灰石色谱相比于正切流动过滤和羟磷灰石色谱的结果–体外转录反应样品–去除蛋白质。
图7A-7G显示了使用本文所述方法的组合的RNA纯化结果：体外转录反应样品–对RNA回收、蛋白质去除、核苷酸去除和DNA去除的影响。图7A显示使用试验直接定量而测量的RNA回收率(样品稀释10,000倍)。图7B显示了通过定量ELISA确定的RNA样品的纯度(T7聚合酶，以斜体表示的样品低于LOQ)。该图显示对于大多数样品，通过ELISA可测量的T7在LOQ以下。图7C显示了通过定量ELISA确定的RNA样品的纯度(帽化酶，以斜体表示的样品低于LOQ，“0”相当于低于LOD)。该图显示在样品P3、CC250后和P2和P4、HTP后中，帽化酶在LOQ以下。图7D显示通过银染色的SDSpage确定的RNA样品的纯度(每个泳道装载4μgRNA)。图7E显示核苷酸去除，以OD/量化的量化比表示(Y轴表示OD/)。图7F显示使用对质粒的qPCR确定的质粒DNA携带污染。纯化前的DNA：1.0ng/剂量。纯化后：0.6/0.7ng/剂量。在HTP色谱后发现最低浓度。在全部4个过程/步骤中使用相同的TFF管柱(cartridge)：可能的携带污染。在该实验中未使用背景(缓冲液)对照。图7G显示大肠杆菌蛋白污染物的水平，通过向大肠杆菌使用宿主(大肠杆菌)oat多克隆抗体确定。在该试验中，L.O.D(检测限)为1ng/条带，每个泳道装载4μgRNA。该图显示宿主污染物低于1ng/蛋白。
图8显示了针对核心珠流通色谱的实验统计学显著性途径的设计–体外转录反应样品–参数优化–盐浓度：0mM(-1)至500mM(1)；样品稀释：无稀释(1)至4倍稀释(-1)；流速(线性速率)：50cm/h(-1)至500cm/h(1)。
具体实施方式
实施例1：对RNA产率和核酸去除进行定量的方法。
使用RNA特异性荧光染料对样品中的RNA进行定量。比较纯化前后RNA水平以计算RNA产率百分比(％)。不检测游离核苷酸。
在未纯化的体外转录(IVT)反应中发现游离核苷酸，且其包括未反应的RNA前体(核糖核苷三磷酸)和来自DNA酶消化的降解产物(脱氧核苷单磷酸)。开发了一种在RNA的存在下测量核苷酸的方法。用测量纯RNA(图6A，第一棒图)，并通过在260nm下的光密度(OD)测量纯RNA，其中使用40作为RNA的标准近似消光系数(第二棒图)。向纯RNA样品中加入质量为RNA十倍的核苷酸混合物。用(第三棒图)和通过OD(第四棒图)再次测量样品。
结果显示的测量不受样品中核苷酸存在的影响，而所检测到的OD值反映了样品中RNA和核苷酸的总浓度。作为在RNA纯化步骤后核苷酸去除的指示物的核苷酸的存在被计算为OD测量结果和试验测量结果的比例。约1的比例表明纯RNA，即完全不含核苷酸。大于1的比例指示在样品中存在核苷酸。
实施例2：使用正切流动过滤进行RNA纯化和缓冲液更换。
通过体外转录产生10-kb的RNA复制子，并用完全化学定义的酶、模板、物质和缓冲液帽化。对单一封闭系统内的RNA纯化和缓冲液更换均使用KrosFloResearchIii正切流动过滤系统(SpectrumLaboratories)。测试了以下各种参数以优化结果：膜化学、膜孔径、膜面积、跨膜压、剪切速率(截留速率)、缓冲液体积、缓冲容量、缓冲液pH、样品盐浓度以及在缓冲液中EDTA的存在。
使用优化的条件进行4次一致性运行，并证明正切流动过滤方法纯化RNA得到高回收率(>95％)、通过蛋白去除测量(通过ELISA量化，>90％的T7RNA聚合酶被除去；纯化后每75μgRNA含有5ngT7聚合酶；通过ELISA量化，>95％的牛痘帽化酶被除去)以及通过核苷酸去除测量(通过使用实施例1的试验量化，>99.9％的游离核苷酸被除去)的高纯度、效力(纯化后效力不变)和稳定性(纯化后RNA稳定)。作为单一封闭系统的操作避免了受例如RNA酶的外源性试剂的污染。该方法快速(共约70分钟)且易于操作。
如图6B和6D以及图7E所示，该方法在从样品中除去游离核苷酸方面尤其有效。如图5(泳道11)、图6C和图7B、7C和7D所示，也从样品中有效除去了蛋白质杂质。
实施例3：使用羟磷灰石色谱进行RNA纯化。
为了测试羟磷灰石色谱对于纯化大型RNA是否有效，将80μg的来自体外转录反应的被氯化锂纯化的10-kbRNA(复制子)载入羟磷灰石柱，并用由不同比例的缓冲液A(10mM磷酸盐缓冲液，pH6.8)和缓冲液B(500mM磷酸盐缓冲液，pH6.8)组成的磷酸盐线性梯度洗脱。发现mRNA可有效结合羟磷灰石柱并从其中回收。通过向羟磷灰石柱载入等量的来自体外转录反应且被氯化锂纯化的mRNA，或通过使其经过柱而将向色谱系统给料，从而测量RNA产率/回收率。计算洗脱峰下的面积，并将过柱后与未过柱纯化的比例(1401.25mAu/ml相比于1934.76mAu/ml)指示为RNA产率。计算RNA产率为72％。将来自体外转录反应且被氯化锂纯化的10-kbRNA(复制子)载入羟磷灰石柱并使用磷酸盐缓冲液洗脱。将所收集的级分4、5和6载入变性RNA凝胶上，确认光密度读数与RNA相关。
为了测试是否可使用羟磷灰石色谱从例如蛋白或未消化的DNA的污染物中有效分离RNA，在于洗脱缓冲液中的不同量盐(0-1000mM氯化钠)的存在下分析纯化的RNA的洗脱动力学。向洗脱缓冲液A和B中均加入氯化钠，以在整个磷酸盐梯度中具有恒定浓度。RNA洗脱峰的右移显示，随着盐浓度的增加，需要增加浓度的磷酸盐以用于RNA洗脱。这允许设定不同条件以从蛋白或其它杂质中进一步分离RNA。可因此向磷酸盐洗脱缓冲液中加盐来优化从杂质中对RNA的分级分离。发现mRNA的产率与洗脱缓冲液中氯化钠的浓度反向相关。
为了测试是否可更有效地从(未消化的模板)DNA中分离RNA，使用相同的参数对100μg的纯DNA或纯RNA进行羟磷灰石色谱。使用连续梯度的磷酸钾洗脱缓冲液。确定洗脱条件对使DNA从RNA分离的效果。发现在比RNA更高的磷酸盐浓度下洗脱DNA(洗脱峰右移)。发明人因此设计了逐步洗脱法，其中洗脱缓冲液中磷酸盐的浓度逐步增加，而非连续增加。因此可通过选择这样的洗脱缓冲液磷酸盐浓度使得RNA而非DNA或其它污染物被洗脱，从而选择性洗脱RNA。然后进行测试运行，其中混合等量的纯化RNA和DNA，至在溶液中的总量为200μg，并使用缓冲液A和B的逐步洗脱梯度对其进行羟磷灰石色谱。
在梯度洗脱中，在约21.04mS/cm的缓冲液电导率处发生RNA洗脱。在约30.52mS/cm处发生DNA洗脱。这表明在RNA/DNA混合物的存在下，约180mM磷酸钾的浓度(或任何产生高于21.04mS/cm且低于30.52mS/cm的电导率值的磷酸钾浓度)选择性洗脱RNA而非DNA。然后进行测试运行，其中在与上述相同的条件下分析纯化的DNA。在低于约180mM(～18％B)的磷酸钾时未观察到洗脱。该结果显示可通过逐步洗脱有效分离RNA和DNA。可通过38％缓冲液B，约380mM的磷酸钾(或任何产生高于30.52mS/cm的电导率值的磷酸钾浓度)来实现DNA洗脱。使用正切流动过滤和羟磷灰石色谱(体外转录反应样品)优化了从RNA分离DNA的洗脱条件。
在比较在羟磷灰石色谱中有效洗脱RNA的各种磷酸盐缓冲液时，发现在将RNA保留在溶液中这一方面，磷酸钾缓冲液比磷酸钠效果更好，并成为用于羟磷灰石柱洗脱的更好的备选物。动态光散射实验(图2)显示，在羟磷灰石色谱期间洗脱缓冲液中磷酸钠浓度的增加导致被洗脱的RNA的表观粒径越来越大，可能是由于盐诱导的RNA沉淀(“盐析”)。当使用相同浓度(浓度可高达500mM)的磷酸钾代替磷酸钠时该效果减弱。对磷酸钾缓冲液测试以用于从羟磷灰石柱洗脱RNA，并且在该过程的RNA纯度和回收率方面其与磷酸钠缓冲液表现相当。因此将磷酸钾确定选择为用于羟磷灰石色谱纯化RNA的盐。
接着，使用羟磷灰石色谱分析含有100μg的10-kbRNA复制子的未纯化的体外转录反应产物。将所收集的级分1、2和3载入变性RNA凝胶上。在凝胶上未见到RNA。通过反相HPLC分析级分B9(对应于级分2前紧邻级分2的级分)和C1(对应于级分3)。将洗脱时间与核苷酸标准品对比，确定了使用未纯化的体外转录反应样品在OD260处观察到的洗脱峰主要由来自体外转录反应的游离核苷酸组成。
实施例4：使用正切流动过滤和羟磷灰石色谱的RNA纯化。
对先进行正切流动过滤随后是羟磷灰石色谱的组合进行测试，测试其对于从体外转录反应样品中纯化RNA的改善的效率，特别是在将样品用于羟磷灰石之前去除核苷酸的效率。使用含有10-kbRNA复制子产物的未纯化的体外转录反应产物作为起始样品。图3A和3B显示该方法组合允许在正切流动过滤步骤中有效除去核苷酸，并在羟磷灰石色谱步骤中有效除去DNA(减少至每mg纯化的RNA中含5.93ngDNA)和蛋白质(减少至低于检测水平)，从而能够在羟磷灰石色谱步骤(将实施例3中所述的逐步洗脱梯度用于洗脱)之后回收纯化的RNA(>80％)。这尤其有效，因为可以从整个RNA纯化过程中省略模板DNA消化，导致更快的操作时间。
图1进一步确认了使用羟磷灰石色谱步骤除去蛋白质的效率，使用银染色显示蛋白质杂质的水平被减少至检测水平以下(每个泳道装载4μg的纯化RNA)。任选地，使用进一步的正切流动过滤以将磷酸盐缓冲液(在羟磷灰石色谱之后洗脱出纯化的RNA)更换为柠檬酸盐缓冲液以用于下游应用。
图6C(泳道“TFF0HTP0”相比于泳道“输入”)也确认了在正切流动过滤后结合羟磷灰石色谱的RNA纯化方法在从含RNA的样品中除去蛋白质杂质方面的有效性。
实施例5：使用核心珠流通色谱的RNA纯化。
测试核心珠流通色谱以用于RNA纯化。将含有10-kb的RNA复制子产物的未纯化的体外转录反应产物(在50mMTris中，pH8.0)用作起始样品。最初在GEExplorer100FPLC系统上使用HiScreenCaptoTMCore700柱(产品号：17-5481-15)。将样品在50mMTris，pH8.0的缓冲液中稀释至600ng/μl的最终RNA浓度(最终体积：8.5ml，含有5.1mg的RNA)。将样品注射到柱中，并用Tris缓冲液(50mM)追逐(chase)直至样品洗脱完全。流量被设定为1ml/min(对应于125cm/h)。根据制造商的说明当场清洁(CIP)并再生柱。发现可在柱流出液中回收RNA(例如，体外转录反应样品，5.1mgRNA，在洗出液中洗脱RNA)。图4A和4B显示，以较高水平的产率(图4B，泳道2相比于泳道1)从柱流出液中回收RNA，且RNA与核心珠流通色谱之前相比含有更低水平的蛋白质杂质(图4A，泳道2相比于泳道1)。
为了测试盐的存在对使用核心珠流通色谱除去蛋白质杂质的影响，测试在纯化时向样品中加入增加浓度的氯化钠或磷酸钠，以及向追逐缓冲液中加入增加浓度的氯化钠或磷酸钠。该纯化的色谱条件与前述相同。通过聚丙酰胺凝胶电泳和银染色分析含有等量纯化RNA(5μg)的流出级分。图5显示盐浓度的增加与蛋白质污染物的去除水平正相关。向样品和追逐缓冲液中加盐。箭头表示两种蛋白污染物(帽化酶大的亚单元和T7聚合酶)在最右侧的对照样品未仅使用正切流动过滤纯化体外转录反应产物之后。结论是，增加的盐浓度帮助除去蛋白质携带污染物，使得最终的蛋白质量低于使用银染色的聚丙酰胺凝胶和5μg的RNA的检测水平。
进一步优化核心珠流通色谱的条件，特别是改变盐浓度(0-500mM)、流速(50-500cm/h)和样品稀释(4倍稀释至不稀释；在加入柱之前)并评估它们对核心珠流通色谱之后的RNA产率的水平(回收率)、蛋白质去除(T7聚合酶和/或帽化酶)和核苷酸去除以及柱前压和色谱方法的操作时间的影响。图8显示实验统计学显著途径的设计。指出了被评估的所测变量以及输出参数的数值范围。模型细节：ResponseSurfaceDesigns,CentralCompositeDesigns,Inscribed。起始样品为含有感兴趣的RNA的未纯化的体外转录反应样品。通过对流出物的银染色的SDSpage评估蛋白质携带污染物，并通过蛋白条带的密度测定来定量。如实施例1中所述对核苷酸去除和RNA产率进行定量。
表1显示了在不同条件下(样品A-T)运行核心珠流通色谱后RNA产率(回收率)、蛋白质去除(T7聚合酶和帽化酶)、OD260nm数值、操作时间和柱前压的输出值。
表1
通过使用聚丙酰胺凝胶电泳以及银染色和随后使用蛋白条带的密度测定进行定量来分析核心珠色谱流出级分，从而对样品A-T中T7聚合酶的去除和帽化酶的去除的输出参数进行定量。将未纯化的体外转录样品用作对照。根据色谱条件对结果进行进一步分析：盐浓度和样品稀释对RNA回收率、T7聚合酶的去除(以相对单位进行定量)和帽化酶的去除(以相对单位进行定量)的影响；流速和样品稀释对RNA回收率、T7聚合酶的去除以及帽化酶的去除的影响；流速和盐浓度对RNA回收率、T7聚合酶的去除和帽化酶的去除的影响。
使用未纯化的体外转录反应产物作为起始样品，确定能够使用核心珠流通色谱充分去除蛋白质的每单位柱体积(CV)的最大样品体积。确定样品-柱体积比对蛋白质去除的影响。将样品稀释至10:1的最大样品/CV比(CV：1ml；ID：0.7cm；高度：2.5cm，流速：250cm/h；流量：1.6ml/min；接触时间：36秒)或64:1(CV：0.137ml；ID：0.5cm；高度：0.7cm，流速：250cm/h；流量：0.82ml/min；接触时间：10秒)，并加入氯化钾至250mM的最终浓度。通过聚丙酰胺凝胶电泳和银染色分析每次运行的流出液。发现在所用的条件下，当样品-CV比超过约10:1时发生蛋白漏出(break-through)。结论是，在所用的实验条件下，至多10的样品/CV比从蛋白质杂质中有效纯化RNA(如10mlIVT反应物可被稀释至40ml并用1ml的柱有效纯化)。
此外，关于在缓冲液中观察到的RNA沉淀程度，对用于核心珠流通色谱中的各种样品和/或追逐缓冲液组成进行比较，其中使用动态光散射测量RNA沉淀，并且将增加的表观粒径作为RNA沉淀的标记。表2总结了核心珠流通色谱的结果：在各种盐的存在下RNA聚集颗粒尺寸的动态光散射分析。第二列是指以mM表示的盐浓度。3至7列中的数值为以nm表示的颗粒半径。该表显示磷酸钾缓冲液(pH6.5)和氯化钾缓冲液(pH8.0)为用于优化的流通纯化的较好备选物。
表2
实施例6：使用核心珠流通色谱和正切流动过滤的RNA纯化。
使用未纯化的体外转录反应产物作为含有10-kbRNA复制子产物的起始样品，使用正切流动过滤或核心珠流通色谱比较核苷酸和蛋白质的去除(在样品中使用0、250或500mM的氯化钾浓度)。图6B和6D显示正切流动过滤有效除去核苷酸杂质。图6C显示核心珠流通色谱在氯化钾的存在下有效除去蛋白质杂质。因此，当希望除去核苷酸和蛋白质杂质时，希望使用核心珠流通色谱，随后进行正切流动过滤
实施例7：使用核心珠流通色谱和羟磷灰石色谱的RNA纯化。
有时可能不希望在样品和/或追逐缓冲液中存在其它盐，如氯化钾。使用未纯化的体外转录反应产物作为含有10-kbRNA复制子的起始样品，单独使用核心珠流通色谱(不含其它盐，即0mM氯化钾)或在其后还进行羟磷灰石色谱(也不含其它盐，即0mM氯化钾)，比较蛋白质去除。图6C(泳道“CC0HTP0”相比于泳道“CC0”)显示当在核心珠流通色谱之后进行羟磷灰石色谱时，即使不存在其它盐，也能够实现有效的蛋白质去除。
实施例8：方法组合以纯化RNA并更换缓冲液。
设计了四种不同的操作流(P1-Pr)以用于RNA纯化(表3)，并比较了RNA回收率/产率和纯度(图6A-6G)。
表3
将含有感兴趣的10-kbRNA复制子的体外反应物用作起始物。
RNA的纯度与每个步骤后蛋白质(来自DNA模板扩增的T7聚合酶、帽化酶、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶、大肠杆菌蛋白携带物)、质粒DNA和核苷酸的水平相关。使用实施例1的方法测量RNA回收率和核苷酸水平。使用ELISA测量蛋白水平，或使用聚丙酰胺凝胶电泳随后使用银染色或基于抗体的检测(免疫印迹)来测量蛋白水平。通过定量PCR测量DNA水平。
可使用正切流动过滤的步骤来更换缓冲液，但由于这导致纯度增加，其仍为纯化步骤。
为了比较的目的，对所有在IVT之后以及在将样品加入色谱/过滤系统之前的操作使用DNA酶进行DNA消化步骤。然而，应注意当例如使用羟磷灰石色谱时，该步骤不是强制性的。
图7A-7G显示了仅在操作1中观察到了蛋白质携带污染物(T7和帽化酶)。羟磷灰石色谱和核心珠色谱可有效去除蛋白质携带污染物。在纯化后检测到痕量，低于ELISA试验的检测水平。相比于羟磷灰石色谱，在核心珠流通纯化随后进行正切流动过滤更容易操作。RNA产率为：P1：74.8％，P2：37.3％，P3：76.2％，P4：60.7％(在表4中总结了RNA回收率)。在最终产物中，所有操作都完全去除了核苷酸。对所有操作，操作时间在45分钟至84分钟的范围内。最终产物中DNA浓度为每75μgRNA含0.6ngDNA。大肠杆菌蛋白污染物的水平低于所用的免疫印迹方法的检测水平。对于所有操作，在最终产物中通过动态光散射测量的表观RNA粒径为40-45nm半径。
表4
实施例9：RNA的大规模纯化
使用正切流动过滤、随后进行羟磷灰石色谱的组合来用于从体外转录反应样品中进行制备性RNA纯化。将含有6mg的10-kbRNA帽化复制子产物的未纯化的体外转录反应产物用作起始样品。使用10mM的Tris(pH8.0)进行正切流动过滤。保留含有RNA的级分。向样品中加入氯化钾达到500mM的最终浓度，并将样品加入羟磷灰石柱(CHTTM，陶瓷羟磷灰石II型，40μm粒径，Biorad，在GEHiScale26柱中，20cm高，100ml，在GEexplorer100上运行，流量10ml/min，线性流速300cm/h)。洗脱缓冲液为缓冲液A(10mM磷酸钾，pH6.5)和缓冲液B(1M磷酸钾，pH6.5)。用18％缓冲液B(180mM磷酸钾)选择性洗脱RNA。结果表明该方法实现具有高产率和纯度的大规模制备性RNA纯化。
使用核心珠流通色谱、随后进行TFF的组合来用于从体外转录反应样品中进行制备性RNA纯化。将含有120mg的10-kb的帽化RNA复制子产物的未纯化的体外转录样品用作起始样品。将样品稀释4倍，然后任选地加入250或500mM的氯化钾，然后将样品加入使用CaptoTMCore700珠子的核心珠流通柱。以275cm/h的线性流速(体积表示为25ml/min)进行色谱，接触时间为2.21’。然后使用TFF(中空纤维组件，500kDa截断值，mPES)将含RNA的流出液进一步纯化，浓缩2倍，并进行缓冲液交换为最终配制缓冲液(所有均在一步操作中进行)。
用100ml帽化的IVTRNA(约120mg)测试该操作，使用50ml的Captocore柱(Captocore700，2.6cm内径，10cm高度，在上述条件下运行，流量25ml/min)和790cm2TFF管柱(相同条件，流量200ml/min)。终产物在活性、纯度和产率方面具有与小规模操作相当的性质。即使在初级实验中，该操作每步具有约80％的产率，总共提供65％的回收率，并在70’(Captocore步骤12分钟，TFF58分钟)内完成。
下表显示了对于四种可用柱的合适的操作参数，其可处理10至1000ml的样品体积：
该表将流速显示为线性速率，这意味着柱的内径与该方法的限定无关。在规模放大的操作中线性速率可保持不变。使用不同的柱直径计算以ml/min表示的流速，以保持线性速率不变并因而保持相同的接触时间(即样品停留在柱内的时间)。
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Claims (17)

1.一种用于从样品中纯化RNA的方法，包括一个或多个正切流动过滤步骤、一个或多个羟磷灰石色谱步骤、一个或多个核心珠流通色谱步骤或它们的任意组合。
2.权利要求1的方法，包括：
(a)正切流动过滤步骤或核心珠流通色谱步骤；和
(b)羟磷灰石色谱步骤。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中以制备规模纯化所述RNA。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法不包括使用氯化锂、有机溶剂、高于70℃的温度和/或DNA的酶消化。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法包括丢弃不含RNA或所需RNA种类的物质，并保留含有RNA或所需RNA的物质。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品含有RNA，并含有以下中的一种或多种：质粒DNA、脱氧寡核苷酸、脱氧核苷单磷酸、核糖核苷三磷酸和蛋白质；并且任选地，其中所述样品不含基因组DNA和/或细胞膜或其片段，例如其中所述样品为体外转录反应样品。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品含有RNA，并且含有以下中的不多于四种：质粒DNA、脱氧寡核苷酸、脱氧核苷单磷酸、核糖核苷三磷酸和蛋白质；并且任选地，其中所述样品不含基因组DNA和/或细胞膜或其片段。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述RNA为单链RNA，例如mRNA。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述RNA包含至少1,000个核苷酸，例如至少5000个核苷酸的线性序列。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法使用亲水性固定相和/或亲水性膜。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法进一步包括一步或多步的包括正切流动过滤的缓冲液更换。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法进一步包括RNA制备的步骤，例如使用RNA的体外转录。
13.从样品中纯化RNA的方法，其中所述RNA在小于12个小时内被纯化为至少99％的纯度。
14.一种用于从样品中纯化RNA的方法，所述样品含有RNA、DNA、焦磷酸酯和游离核苷酸，其中所述方法在小于12个小时内提供不含DNA、焦磷酸酯和游离核苷酸的终产物。
15.一种用于制备药物组合物的方法，包括以下步骤：
(a)根据权利要求1-14中任一项的方法纯化RNA；和
(b)将纯化的RNA配制为药物组合物。
16.通过权利要求15的方法制备的药物组合物，其中所述药物组合物基本不含以下物质中的一种或多种：DNA、脱氧寡核苷酸、脱氧核苷单磷酸、核糖核苷三磷酸、聚合酶和RNA帽化酶。
17.根据权利要求16的药物组合物，其用于药物中。
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