JP6061849B2 - 自己複製ｒｎａ分子についてのビリオン様送達粒子 - Google Patents

Description

本出願は、米国仮出願第６１／３６１，８２８号（２０１０年７月６日出願）の利益を主張し、上記米国仮出願の全容は、全ての目的のために、参考として本明細書に援用される。

（技術分野）
本発明は、免疫化のための自己複製ＲＮＡの非ウイルス性送達の分野にある。

（背景技術）
動物を免疫化するための核酸の送達は、数年間にわたり目標であった。種々のアプローチが、試験されてきており、それらとしては、ＤＮＡもしくはＲＮＡの使用、ウイルスもしくは非ウイルス性送達ビヒクルの使用（またはさらには「裸の」ワクチンにおいて、送達ビヒクルなし）、複製もしくは非複製ベクターの使用、またはウイルスもしくは非ウイルス性ベクターの使用が挙げられる。

さらなる改善された核酸ワクチン、特に、核酸ワクチンの送達の改善された方法への必要性が存在している。

（発明の開示）
本発明によれば、核酸免疫化は、小粒子内に被包された、および／もしくは小粒子に吸着させられた自己複製ＲＮＡを送達することによって達成される。上記ＲＮＡは、目的の免疫原をコードし、上記粒子は、天然のウイルスの送達機能を摸倣することによって、このＲＮＡを送達し得る。

従って、本発明は、ＲＮＡを脊椎動物細胞にインビボで送達するための非ビリオン粒子を提供し、ここで上記粒子は、免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を被包する送達物質を含む。本発明はまた、ＲＮＡを脊椎動物細胞にインビボで送達するための非ビリオン粒子を提供し、ここで上記粒子は、免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ分子が吸着させられる送達物質を含む。これら粒子は、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。自己複製ＲＮＡを送達するための非ビリオン粒子の利用の組み合わせは、上記免疫原に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘発すると同時に、ごく低用量のＲＮＡを送達する方法を提供する。さらに、これら粒子は、商業スケールで容易に製造され得る。

（粒子）
本発明の粒子は、非ビリオン粒子である（すなわち、それらは、ビリオンではない）。従って、上記粒子は、タンパク質キャプシドを含まない。キャプシド粒子を作る必要性を回避することによって、本発明は、パッケージング細胞株を必要としないので、商業的生産のための容易なスケールアップおよび危険な感染性ウイルスが偶然に生成されてしまうリスクを最小にすることを可能にする。

ビリオン中にＲＮＡを被包する代わりに、本発明の粒子は、送達物質から形成される。種々の物質が、ＲＮＡを脊椎動物細胞にインビボで送達し得る粒子を形成するために適している。特に興味深い２つの送達物質は、（ｉ）リポソームを形成し得る両親媒性脂質、および（ｉｉ）微粒子を形成し得る、非毒性でかつ生分解性のポリマーである。送達がリポソームによる場合、ＲＮＡは、被包されるべきである；送達がポリマー微粒子による場合、ＲＮＡは、被包もしくは吸着させられ得る。第３の興味深い送達物質は、ポリマー、架橋剤、ＲＮＡ、および荷電したモノマーの粒状反応生成物である。

従って、本発明の粒子の一実施形態は、免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を被包するリポソームを含むのに対して、別の実施形態は、免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を被包するポリマー微粒子を含み、別の実施形態は、免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ分子が吸着したポリマー微粒子を含む。３つすべての場合において、上記粒子は、好ましくは、実質的に球状である。第４の実施形態において、本発明の粒子は、ポリマー、架橋剤、免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ分子、および荷電したモノマーの粒状反応生成物を含む。これら粒子は、型内で形成されるので、任意の形状（球が挙げられるが、これらに限定されない）で作られ得る。

ＲＮＡは、上記粒子内に被包され得る（特に、上記粒子がリポソームである場合）。このことは、上記粒子内部のＲＮＡが、上記送達物質によって任意の外部媒体から（天然のウイルスにおけるように）分離されることを意味し、被包は、ＲＮＡをＲＮａｓｅ消化から保護することが見いだされた。被包は、種々の形態をとり得る。例えば、いくつかの実施形態において（単層リポソーム（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）におけるように）、上記送達物質は、水性のＲＮＡ含有コアの周りに外側層を形成するのに対して、他の実施形態において（例えば、成形粒子におけるように）、上記送達物質は、ＲＮＡが内部に埋め込まれるマトリクスを形成する。上記粒子は、いくらかの外部ＲＮＡを含み得るが（例えば、上記粒子の表面上に）、上記ＲＮＡのうちの少なくとも半分（および理想的には、そのすべて）は、被包される。リポソーム内の被包は、例えば、参考文献１で開示される脂質／ＲＮＡ複合体とは異なる。

ＲＮＡは、上記粒子に吸着させられ得る（特に、上記粒子がポリマー微粒子である場合）。このことは、天然のウイルスのＲＮＡゲノムとは異なり、ＲＮＡが上記送達物質によって任意の外部媒体から分離されないことを意味する。上記粒子は、いくらかの被包されたＲＮＡを含み得るが（例えば、粒子のコア中に）、上記ＲＮＡのうちの少なくとも半分（および理想的には、そのすべて）は、吸着させられる。

（リポソーム）
種々の両親媒性脂質は、リポソームとして、ＲＮＡ含有水性コアを被包するように、水性環境中で二重層を形成し得る。これら脂質は、アニオン性、カチオン性もしくは両性イオン性の親水性頭部（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）を有し得る。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代以来研究されてきた。いくつかのリン脂質はアニオン性であるのに対して、他のものは、両性イオン性であり、他のものはカチオン性である。リン脂質の適切なクラスとしては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジル−グリセロールが挙げられるが、これらに限定されず、いくつかの有用なリン脂質は、表１に列挙される。有用なカチオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。両性イオン性脂質としては、アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質が挙げられるが、これらに限定されない。有用な両性イオン性脂質の例は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣおよびドデシルホスホコリンである。上記脂質は、飽和もしくは不飽和であり得る。リポソームを調製するための少なくとも１つの不飽和脂質の使用は、好ましい。不飽和脂質が２つのテールを有する場合、両方のテールが、不飽和であり得、または上記不飽和脂質は、１つの飽和テールおよび１つの不飽和テールを有し得る。

本発明のリポソーム粒子は、単一の脂質から、もしくは脂質の混合物から形成され得る。混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物、（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物、（ｉｉｉ）両性イオン性脂質の混合物、（ｉｖ）アニオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、（ｖ）アニオン性脂質と両性イオン性脂質との混合物、（ｖｉ）両性イオン性脂質とカチオン性脂質との混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質、カチオン性脂質、および両性イオン性脂質の混合物を含み得る。同様に、混合物は、飽和脂質および不飽和脂質の両方を含み得る。例えば、混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）、および／もしくはＤＭＧ（アニオン性、飽和）を含み得る。脂質の混合物が使用される場合、上記混合物中の成分である脂質のすべてが、両親媒性である必要はない（例えば、１種以上の両親媒性脂質が、コレステロールと混合され得る）。

脂質の親水性部分は、ＰＥＧ化され得る（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって改変され得る）。この改変は、上記リポソームの安定性を増大させ得、そして上記リポソームの非特異的吸着を妨げ得る。例えば、脂質は、参考文献２および３に開示されるもののような技術を使用して、ＰＥＧに結合体化され得る。ＰＥＧの種々の長さが使用され得る（例えば、０．５〜８ｋＤａ）。

ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧおよびコレステロールの混合物が、実施例において使用される。

リポソーム粒子は、通常は、３つの群に分けられる：多層小胞（ＭＬＶ）；小さな単層小胞（ＳＵＶ）；および大きな単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、各小胞において複数の二重層を有し、いくつかの別個の水性区画を形成する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、代表的には、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明のリポソーム粒子は、理想的には、５０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。様々な直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物に関しては：（ｉ）少なくとも８０％（数で）は、２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するべきであり、（ｉｉ）上記集団の平均直径（Ｚａｖ（強度で））は、理想的には、４０〜２００ｎｍの範囲にあり、そして／または（ｉｉｉ）上記直径は、多分散指数＜０．２を有するべきである。参考文献１のリポソーム／ＲＮＡ複合体は、６００〜８００ｎｍの範囲の直径を有し、高い多分散性を有すると予測される。

適切なリポソームを調製するための技術は、当該分野で周知である（例えば、参考文献４〜６を参照のこと）。１つの有用な方法は、参考文献７に記載され、（ｉ）脂質のエタノール溶液、（ｉｉ）核酸の水性溶液、および（ｉｉｉ）緩衝液を混合する工程、続いて、混合、平衡化、希釈および精製の工程を包含する。本発明の好ましいリポソームは、この混合プロセスによって得られ得る。

（ポリマー微粒子）
種々のポリマーは、本発明に従って、ＲＮＡを被包もしくは吸着するように微粒子を形成し得る。実質的に非毒性のポリマーの使用は、レシピエントが上記粒子を安全に受容し得ることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、上記粒子が、長期的な残存を回避するように送達後に代謝され得ることを意味する。有用なポリマーはまた、薬学的グレードの処方物の調製を補助するために、滅菌可能である。

適切な非毒性かつ生分解性のポリマーとしては、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン誘導ポリカーボネートもしくはポリエステル−アミド、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、上記微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、例えば、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）、ラクチドとグリコリドとのコポリマー、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）、およびＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマーから形成される。有用なＰＬＧポリマーとしては、以下の範囲のラクチド／グリコリドモル比、例えば、２０：８０〜８０：２０（例えば、２５：７５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、７５：２５）を有するものが挙げられる。有用なＰＬＧポリマーとしては、例えば、５，０００〜２００，０００Ｄａ（例えば、１０，０００〜１００，０００Ｄａ、２０，０００〜７０，０００Ｄａ、３０，０００〜４０，０００Ｄａ、４０，０００〜５０，０００Ｄａ）の分子量を有するものが挙げられる。

上記微粒子は、理想的には、０．０２μｍ〜８μｍの範囲の直径を有する。様々な直径を有する微粒子の集団を含む組成物に関して、少なくとも８０％（数で）は、０．０３〜７μｍの範囲の直径を有するべきである。

適切な微粒子を調製するための技術は、当該分野で周知である（例えば、参考文献６、８（特に、第７章）および９を参照のこと）。ＲＮＡの吸着を促進するために、微粒子は、カチオン性界面活性剤および／もしくは脂質（例えば、参考文献１０および１１に開示されるように）を含み得る。

本発明の微粒子は、４０〜１００ｍＶのゼータ電位を有し得る。

リポソームに勝る微粒子の１つの利点は、安定な貯蔵のために、微粒子が容易に凍結乾燥されることである。

（成形粒子）
第３の興味深い送達物質は、ポリマー、架橋剤、免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ、および荷電したモノマーの粒状反応生成物である。これら４種の成分は、液体として混合され得、型の中に配置され（例えば、ペルフルオロポリエーテルを含む）、次いで、硬化されて、上記型の形状および寸法に従って上記粒子が形成される。適切な製造法の詳細は、参考文献１２に開示される。これら方法は、生分解性の架橋されたオリゴマーのポリマーナノ粒子（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を提供する。

理想的には、上記粒子は、最大断面寸法≦５μｍを有する。それらは、全体的に正電荷を有し得る。

適切なポリマーとしては、ポリ（アクリル酸）；ポリ（スチレンスルホネート）；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；ポリ（ビニルアルコール）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（ビニルピロリドン）；デキストラン；ポリ（ビニルピロリドン−ｃｏ−ビニルアセテート−ｃｏ−ビニルアルコール）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいポリマーは、ポリ（ビニルピロリドン）である。上記粒子を形成するためのポリマーの量は、２〜７５ｗｔ％（例えば、１０〜６０ｗｔ％、２０〜６０ｗｔ％）であり得る。

適切な架橋剤としては、ジスルフィドおよび／もしくはケタールが挙げられ得る。例えば、上記架橋剤は、以下を含み得る：ポリ（ε−カプロラクトン）−ｂ−テトラエチレングリコール−ｂ−ポリ（ε−カプロラクトン）ジメタクリレート、ポリ（ε−カプロラクトン）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（ε−カプロラクトン）ジメタクリレート、ポリ（乳酸）−ｂ−テトラエチレングリコール−ｂ−ポリ（乳酸）ジメタクリレート、ポリ（乳酸）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（乳酸）ジメタクリレート、ポリ（グリコール酸）−ｂ−テトラエチレングリコール−ｂ−ポリ（グリコール酸）ジメタクリレート、ポリ（グリコール酸）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（グリコール酸）ジメタクリレート、ポリ（ε−カプロラクトン）−ｂ−テトラエチレングリコール−ｂ−ポリ（ε−カプロラクトン）ジアクリレート、ポリ（ε−カプロラクトン）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（ε−カプロラクトン）ジアクリレート、ポリ（乳酸）−ｂ−テトラエチレングリコール−ｂ−ポリ（乳酸）ジアクリレート、ポリ（乳酸）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（乳酸）ジアクリレート、ポリ（グリコール酸）−ｂ−テトラエチレングリコール−ｂ−ポリ（グリコール酸）ジアクリレート、ポリ（グリコール酸）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（グリコール酸）ジアクリレート、シラン、ケイ素含有メタクリレート、またはジメチルジ（メタクリロイルオキシ−ｌ−エトキシ）シラン。上記粒子を形成するための架橋剤の量は、１０〜２５ｗｔ％（例えば、１０〜６０ｗｔ％、２０〜６０ｗｔ％）であり得る。

荷電したモノマーは、カチオン性もしくはアニオン性であり得る。これらとしては、［２−（アクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド（ＡＥＴＭＡＣ）および２−アミノエチルメタクリレートヒドロクロリド（ＡＥＭ−ＨＣｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。上記粒子を形成するための荷電したモノマーの量は、２〜７５ｗｔ％であり得る。

上記粒子を形成するためのＲＮＡの量は、０．２５〜２０ｗｔ％であり得る。

型の中の硬化前（ｐｒｅ−ｃｕｒｅ）混合物は、開始剤を含み得る。例えば、上記型は、≦１ｗｔ％の開始剤、≦０．５ｗｔ％の開始剤、もしくは≦０．１ｗｔ％の開始剤を含み得る。０．１〜０．５％の開始剤は、有用である。光開始剤（例えば、ＤＥＡＰおよびＤＰＴ）は、例えば、紫外線硬化での使用に有用である。

本発明は、ｓｉＲＮＡ成分が、本明細書のように自己複製ＲＮＡによって置換されることを除いて、参考文献１２の表１もしくは実施例１〜１５に開示される材料のうちのいずれかを使用し得る。

（ＲＮＡ）
本発明の粒子は、（ｓｉＲＮＡとは異なり）免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む。上記粒子のインビボ投与の後、ＲＮＡは、上記粒子から放出され、細胞内で翻訳されて、上記免疫原をインサイチュで提供する。

参考文献１３とは異なり、本発明の粒子中のＲＮＡは、自己複製する。自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）は、あらゆるタンパク質なしで脊椎動物細胞に送達される場合でも、上記自己複製ＲＮＡ分子自体からの転写によって（上記自己複製ＲＮＡ分子自体から生成するアンチセンスコピーを介して）、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらし得る。自己複製ＲＮＡ分子は、従って、代表的には、細胞へ送達された後に直接翻訳され得るプラス鎖分子であり、この翻訳は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供し、次いで、これは、上記送達されたＲＮＡからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を生成する。従って、上記送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらす。これら娘ＲＮＡ、ならびに同一線上（ｃｏｌｌｉｎｅａｒ）のサブゲノム転写物は、それ自体が翻訳されて、コードされた免疫原のインサイチュ発現を提供し得るか、または転写されて、上記送達されたＲＮＡと同じセンスのさらなる転写物（上記免疫原のインサイチュ発現を提供するように翻訳される）を提供し得る。この一連の転写の全体的な結果は、上記導入されたレプリコンＲＮＡの数における非常に多くの増幅であり、よって、上記コードされた免疫原は、上記細胞の主なポリペプチド生成物になる。

この様式で自己複製を達成するための１つの適切なシステムは、アルファウイルスベースのレプリコンを使用することである。これらのレプリコンは、細胞への送達後に、レプリカーゼ（もしくはレプリカーゼ−転写酵素）の翻訳をもたらすプラス鎖ＲＮＡである。上記レプリカーゼは、上記送達されたプラス鎖ＲＮＡのゲノムマイナス鎖コピーを作り出す複製複合体を提供するように自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらマイナス鎖転写物は、これ自体が、上記プラス鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え、そしてまた、免疫原をコードするサブゲノム転写物を与えるように転写され得る。従って、上記サブゲノム転写物の翻訳は、上記感染した細胞による上記免疫原のインサイチュ発現をもたらす。適切なアルファウイルスレプリコンは、シンドビス・ウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用し得る。変異型ウイルスもしくは野生型ウイルスの配列が使用され得る（例えば、ＶＥＥＶの弱毒化ＴＣ８３変異体は、レプリコンにおいて使用されてきた［１４］）。

好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、従って、（ｉ）上記自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）免疫原をコードする。上記ポリメラーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ（例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４のうちの１種以上を含む）であり得る。

天然のアルファウイルスゲノムが、上記非構造レプリカーゼポリプロテインに加えて、構造的ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。従って、好ましい自己複製ＲＮＡは、細胞においてそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの生成をもたらし得るが、ＲＮＡ含有ビリオンの生成はもたらさない。これらのビリオンを生成できないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、上記自己複製ＲＮＡ分子が、感染性形態においてそれ自体を永続させられないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続に必要な上記アルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡには存在せず、それらの位置は、上記目的の免疫原をコードする遺伝子によってしめられている。その結果、上記サブゲノム転写物は、上記構造的アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく、上記免疫原をコードする。

従って、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し得る。第１の（５’側）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし；第２の（３’側）オープンリーディングフレームは、免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、例えば、さらなる免疫原（以下を参照のこと）をコードするために、もしくは補助ポリペプチドをコードするために、さらなる（例えば、下流の）オープンリーディングフレームを有し得る。

好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアノシン）を有する。このキャップは、上記ＲＮＡのインビボ翻訳を増強し得る。いくつかの実施形態において、上記自己複製ＲＮＡ分子の５’配列は、上記コードされたレプリカーゼとの適合性を確実にするように選択されなければならない。

自己複製ＲＮＡ分子は、３’ポリ−Ａテールを有し得る。それはまた、その３’末端付近にポリＡポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。

自己複製ＲＮＡ分子は、種々の長さを有し得るが、それらは、代表的には、５０００〜２５０００ヌクレオチド長（例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチド、もしくは９０００〜１２０００ヌクレオチド）である。従って、上記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ送達において認められるものより長い。

自己複製ＲＮＡ分子は、代表的には、一本鎖である。一本鎖ＲＮＡは、一般には、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＲＮＡヘリカーゼおよび／もしくはＰＫＲに結合することによってアジュバント効果を開始し得る。二本鎖形態（ｄｓＲＮＡ）において送達されたＲＮＡは、ＴＬＲ３に結合し得、このレセプターはまた、一本鎖ＲＮＡの複製の間に、もしくは一本鎖ＲＮＡの二次構造内のいずれかで形成されるｄｓＲＮＡによって駆動され得る。

上記自己複製ＲＮＡは、便宜上、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって調製され得る。ＩＶＴは、細菌においてプラスミド形態において作られ、増やされたか、または合成で作製された（例えば、遺伝子合成および／もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作法によって）（ｃＤＮＡ）テンプレートを使用し得る。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）は、ＤＮＡテンプレートから自己複製ＲＮＡを転写するために使用され得る。適切なキャッピングおよびポリＡ付加反応は、必要時に使用され得る（しかし、上記レプリコンのポリＡは、通常、上記ＤＮＡテンプレート内にコードされる）。これらＲＮＡポリメラーゼは、転写される５’ヌクレオチドについてストリンジェントな要件を有し得、いくつかの実施形態において、これらの要件は、上記ＩＶＴ転写ＲＮＡが、自己がコードするレプリカーゼの基質として効率的に機能し得ることを確実にするために、上記コードされたレプリカーゼの要件とマッチしなければならない。

参考文献１５において考察されるように、上記自己複製ＲＮＡは、（任意の５’キャップ構造に加えて）改変された核酸塩基を有する１個以上のヌクレオチドを含み得る。従って、上記ＲＮＡは、以下を含み得る：ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（ｌ−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２’−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６．−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１１（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホルミル（ｆｏｎｎｙｌ）シチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ワイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）；ＯＨｙＷ＊（改変下（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）；ｉｍＧ（ワイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガラクトシル（ｇａｌｔａｃｔｏｓｙｌ）−キューオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−キューオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ（アルカエオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ））；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン）；ｉｍＧ−１４（４−デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；もしくはａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、７−置換されたその誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換された７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、または無塩基ヌクレオチド。例えば、自己複製ＲＮＡは、１つ以上の改変されたピリミジン核酸塩基（例えば、シュードウリジンおよび／もしくは５−メチルシトシン残基）を含み得る。しかし、いくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、改変された核酸塩基を含まず、改変されたヌクレオチドを含まなくてもよい（すなわち、上記ＲＮＡ中のヌクレオチドのすべては、標準的なＡ、Ｃ、ＧおよびＵというリボヌクレオチドである（任意の５’キャップ構造を除く。これは、７’−メチルグアノシンを含み得る））。他の実施形態において、上記ＲＮＡは、７’−メチルグアノシンを含む５’キャップを含み得、最初の１個、２個もしくは３個の５’リボヌクレオチドは、リボースの２’位においてメチル化され得る。

本発明で使用されるＲＮＡは、理想的には、ヌクレオチド間にホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態において、それは、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、および／もしくはメチルホスホネート結合を含み得る。

１粒子あたりのＲＮＡの量は変動し得、１粒子あたりの個々の自己複製ＲＮＡ分子の数は、使用される粒子の特徴に依存し得る。一般に、粒子は、１〜５００個のＲＮＡ分子を含み得る。リポソームに関しては、上記ＲＮＡ分子の数は、代表的には、１リポソームあたり≦５０個（例えば、＜２０個、＜１０個、＜５個、もしくは１〜４個）である。ポリマー微粒子に関しては、ＲＮＡ分子の数は、上記粒子直径に依存するが、１粒子あたり≦５０個（例えば、＜２０個、＜１０個、＜５個、もしくは１〜４個）または１粒子あたり５０〜２００であり得る。理想的には、粒子は、１０より少ない数の異なる種のＲＮＡ（例えば、５種、４種、３種、もしくは２種の異なる種）を含み；最も好ましくは、粒子は、単一のＲＮＡ種を含む。すなわち、上記粒子におけるすべてのＲＮＡ分子が、同じ配列および配列長さを有する。

（免疫原）
本発明で使用される自己複製ＲＮＡ分子は、ポリペプチド免疫原をコードする。上記粒子の投与後に、上記免疫原は、インビボで翻訳され、レシピエントにおける免疫応答を誘発し得る。上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対して（あるいは、いくつかの実施形態において、アレルゲンに対して；および他の実施形態において、腫瘍抗原に対して）免疫応答を誘発し得る。上記免疫応答は、抗体応答（通常は、ＩｇＧを含む）および／もしくは細胞媒介性免疫応答を含み得る。上記ポリペプチド免疫原は、代表的には、対応する細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物（またはアレルゲンもしくは腫瘍）ポリペプチドを認識する免疫応答を誘発するが、いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物のサッカリドを認識する免疫応答を誘発するように、ミモトープとして作用し得る。上記免疫原は、代表的には、表面ポリペプチド（例えば、アドヘシン、ヘマグルチニン、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質など）である。

自己複製ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド免疫原もしくは複数のポリペプチドをコードし得る。複数の免疫原は、単一のポリペプチド免疫原（融合ポリペプチド）として、または別個のポリペプチドとして提示され得る。免疫原が、別個のポリペプチドとして発現される場合、これらのうちの１種以上は、上流のＩＲＥＳもしくはさらなるウイルスプロモーターエレメントとともに提供され得る。あるいは、複数の免疫原は、短い自己触媒性プロテアーゼ（例えば、口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質）に融合された個々の免疫原をコードするポリプロテインから、またはインテインとして発現され得る。

参考文献１および１６とは異なり、上記ＲＮＡは、免疫原をコードする。不確かさを避けるために、本発明は、ホタルルシフェラーゼをコードするＲＮＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードするＲＮＡ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡを含まない。また、上記ＲＮＡは、全マウス胸腺ＲＮＡではない。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これら細菌のうちの１種に対して免疫応答を誘発する：
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：有用な免疫原としては、膜タンパク質、例えば、アドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、およびＨ因子結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。３種の有用なポリペプチドの組み合わせが、参考文献１７に開示される。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用なポリペプチド免疫原は、参考文献１８に開示される。これらとしては、ＲｒｇＢ線毛サブユニット、β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ前駆体（ｓｐｒ００５７）、ｓｐｒ００９６、一般的なストレスタンパク質（ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＧＳＰ−７８１（ｓｐｒ２０２１、ＳＰ２２１６）、セリン／スレオニンキナーゼＳｔｋＰ（ＳＰ１７３２）、および肺炎球菌表面アドヘシンＰｓａＡが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ：有用な免疫原としては、参考文献１９および２０に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：有用な百日咳免疫原としては、百日咳毒素もしくはトキソイド（ＰＴ）、線維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、ペルタクチン、ならびに凝集原２および３が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：有用な免疫原としては、参考文献２１に開示されるポリペプチド（例えば、溶血素、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、フェリクロム結合タンパク質（ｓｔａ００６）および／もしくはｓｔａ０１１リポプロテイン）が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ：代表的な免疫原は、破傷風トキソイドである。

Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ：代表的な免疫原は、ジフテリアトキソイドである。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：有用な免疫原としては、参考文献２２および２３に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献１９に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：有用な免疫原としては、ＰｅｐＡ、ＬｃｒＥ、ＡｒｔＪ、ＤｎａＫ、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様、Ｌ７／Ｌ１２、ＯｍｃＡ、ＡｔｏＳ、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ、ＨｔｒＡおよびＭｕｒＧ（例えば、参考文献２４に開示されるとおり）が挙げられるが、これらに限定されない。ＬｃｒＥ［２５］およびＨｔｒＡ［２６］は、２つの好ましい免疫原である。

Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用な免疫原としては、参考文献２７に開示されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ：有用な免疫原としては、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、および／もしくはウレアーゼ［２８］が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：有用な免疫原としては、腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｉｎｇ）Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）および／もしくは腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。ＥｘＰＥＣ株としては、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）および髄膜炎／敗血症関連Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＮＥＣ）が挙げられる。有用なＵＰＥＣポリペプチド免疫原は、参考文献２９および３０に開示される。有用なＭＮＥＣ免疫原は、参考文献３１に開示される。いくつかのＥ．ｃｏｌｉタイプに有用な免疫原は、ＡｃｆＤである［３２］。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ
Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ：有用な免疫原としては、参考文献３３および３４に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、これらウイルスのうちの１種に対して免疫応答を誘発する：
オルソミクソウイルス：有用な免疫原は、インフルエンザＡ、ＢもしくはＣウイルスに由来し得る（例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼもしくはマトリクスＭ２タンパク質）。上記免疫原がインフルエンザＡウイルスヘマグルチニンである場合、それは、任意のサブタイプ（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６）に由来し得る。

パラミクソウイルス科のウイルス：ウイルス免疫原としては、肺炎ウイルス（例えば、ＲＳウイルス、ＲＳＶ）、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザ・ウイルス）、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス（例えば、麻疹）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ポックスウイルス科：ウイルス免疫原としては、オルトポックスウイルス（例えば、真正痘瘡（大痘瘡および小痘瘡が挙げられるが、これらに限定されない））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ピコルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記エンテロウイルスは、ポリオウイルス（例えば、１型、２型、および／もしくは３型のポリオウイルス）である。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、ＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態において、上記エンテロウイルスは、コクサッキーＡもしくはＢウイルスである。

ブンヤウイルス：ウイルス免疫原としては、オルソブンヤウイルス（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス（例えば、リフトバレー熱ウイルス）、もしくはナイロウイルス（例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ヘパルナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

フィロウイルス：ウイルス免疫原としては、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス（ザイールエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、レストンエボラウイルスもしくはスーダンエボラウイルスを含む））またはマールブルグウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

トガウイルス：ウイルス免疫原としては、トガウイルス（例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、もしくはアルテリウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。これは、風疹ウイルスを含む。

フラビウイルス：ウイルス免疫原としては、フラビウイルス（例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１、２、３もしくは４型）ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ペスチウイルス：ウイルス免疫原としては、ペスチウイルス（例えば、牛ウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（ＣＳＦＶ）もしくはボーダー病（ＢＤＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ヘパドナウイルス：ウイルス免疫原としては、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含み得る。

他の肝炎ウイルス：組成物は、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、もしくはＧ型肝炎ウイルスに由来する免疫原を含み得る。

ラブドウイルス：ウイルス免疫原としては、ラブドウイルス（例えば、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

カリシウイルス科：ウイルス免疫原としては、カリシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）、およびノーウォーク様ウイルス（例えば、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルス））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

コロナウイルス：ウイルス免疫原は、ＳＡＲＳコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチドであり得る。

レトロウイルス：ウイルス免疫原としては、オンコウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２）またはスプマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

レオウイルス：ウイルス免疫原としては、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、もしくはコルチウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

パルボウイルス：ウイルス免疫原としては、パルボウイルスＢ１９に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ヘルペスウイルス：ウイルス免疫原としては、ヒトヘルペスウイルス（例えば、例示に過ぎないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８））に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。

パポバウイルス：ウイルス免疫原としては、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。上記（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３もしくは６５のもの（例えば、血清型６、１１、１６および／もしくは１８のうちの１種以上に由来する）であり得る。

アデノウイルス：ウイルス免疫原としては、アデノウイルス血清型３６（Ａｄ−３６）に由来するものが挙げられる。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、魚類に感染するウイルス（例えば：伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（大西洋サケピコルナ様ウイルスとしても公知）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ＴＳＤ）、銀ザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、もしくはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ））に対する免疫応答を誘発する。

真菌免疫原は、皮膚糸状菌類（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）（以下が挙げられる：

に由来し得る。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅもしくはＰ．ｏｖａｌｅ）に由来する寄生生物に対する免疫応答を誘発する。従って、本発明は、マラリアに対して免疫化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記免疫原は、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科に由来する寄生生物、特に、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属に由来する寄生生物（例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｓもしくはＣａｌｉｇｕｓ ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉのようなフナムシ）に対する免疫応答を誘発する。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する：花粉アレルゲン（樹木花粉、草本花粉、雑草の花粉、および草の花粉のアレルゲン）；昆虫もしくは蛛形類のアレルゲン（吸入、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリアレルゲンおよび小虫アレルゲン、膜翅類毒液アレルゲン（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ ｖｅｎｏｍ ａｌｌｅｒｇｅｎ））；動物の毛およびふけのアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどに由来する）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）。樹木、草および草本に由来する重要な花粉アレルゲンは、Ｆａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓの分類学上の目およびスズカケノキ科（ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）（カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、シーダー（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない）、Ｐｏａｌｅｓの目（属Ｌｏｌｉｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ、およびＳｏｒｇｈｕｍの草が挙げられる）、ＡｓｔｅｒａｌｅｓおよびＵｒｔｉｃａｌｅｓの目（属Ａｍｂｒｏｓｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａの草本が挙げられる）から由来するそのようなものである。他の重要な吸入アレルゲンは、属ＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓおよびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓのチリダニ類、コナダニ類（ｓｔｏｒａｇｅ ｍｉｔｅ）（例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、ＧｌｙｃｙｐｈａｇｕｓおよびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ）、ゴキブリ、小虫およびノミに由来するもの（例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、ＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）、ならびに哺乳動物（例えば、ネコ、イヌおよびウマ）に由来するもの、毒液のアレルゲン（刺咬昆虫（ｓｔｉｎｇｉｎｇ ｏｒ ｂｉｔｉｎｇ ｉｎｓｅｃｔ）に由来するようなもの、例えば、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａの分類学上の目（蜂（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）が挙げられる）が挙げられる）に由来するものである。

いくつかの実施形態において、上記免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である：（ａ）がん−精巣（ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ）抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２）、これらは、例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍に対処するために使用され得る；（ｂ）変異した抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍（例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん）と関連）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんと関連）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫と関連）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫と関連）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんと関連）、ＣＩＡ ０２０５（例えば、膀胱がんと関連）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、β−カテニン（例えば、黒色腫と関連）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫と関連）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現された抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病と関連）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病と関連）、ＷＴ １（例えば、種々の白血病と関連）、炭酸脱水酵素（例えば、腎がんと関連）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんと関連）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫と関連）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんと関連）、マンマグロビン、α−フェトプロテイン（例えば、肝がんと関連）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんと関連）、ガストリン（例えば、膵臓がんおよび胃がんと関連）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がんおよび卵巣がんと関連）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞がんと関連）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんと関連）、ならびにがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん（例えば、結腸直腸がん）と関連）；（ｄ）共通抗原（ｓｈａｒｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫と関連）；（ｅ）前立腺関連抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２（例えば、前立腺がんと関連））；（ｆ）イムノグロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫と関連）。特定の実施形態において、腫瘍免疫原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バー・ウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６およびＥ７を含む）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの抗原、ヒトＴリンパ球向性ウイルス抗原、

（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなど。

（薬学的組成物）
本発明の粒子は、種々の疾患に対して被験体を免疫化するための薬学的組成物中の成分として有用である。これらの組成物は、代表的には、上記粒子に加えて、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアの詳細な考察は、参考文献３５において入手可能である。

本発明の薬学的組成物は、１種以上の低分子免疫強化因子を含み得る。例えば、上記組成物は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（例えば、Ｅ６０２０））、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、イミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えば、レシキモド）および／もしくはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＩＣ３１）を含み得る。任意のこのようなアゴニストは、理想的には、分子量＜２０００Ｄａを有する。ＲＮＡが被包される場合、いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記ＲＮＡとともに被包されるが、他の実施形態において、それらは、被包されない。ＲＮＡが粒子に吸着させられる場合、いくつかの実施形態において、このようなアゴニストもまた、上記ＲＮＡと一緒に吸着させられるが、他の実施形態において、それらは吸着させられない。

本発明の薬学的組成物は、上記粒子を、ただの水（ｐｌａｉｎ ｗａｔｅｒ）（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）もしくは緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液）中に含み得る。緩衝塩は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲において含まれる。

本発明の薬学的組成物は、５．０〜９．５（例えば、６．０〜８．０）のｐＨを有し得る。

本発明の組成物は、張度を与えるために、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が代表的である（例えば、約９ｍｇ／ｍｌ）。

本発明の組成物は、金属イオンキレート化剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速し得るイオンを除去することによって、ＲＮＡ安定性を延長し得る。従って、組成物は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ペンテト酸などのうちの１種以上を含み得る。このようなキレート化剤は、代表的には、１０〜５００μＭ（例えば、０．１ｍＭ）で存在する。クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム）はまた、キレート化剤として作用し得るのと同時に、有利なことには、緩衝化活性も提供し得る。

本発明の薬学的組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、もしくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の重量オスモル濃度を有し得る。

本発明の薬学的組成物は、１種以上の保存剤（例えば、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノール）を含み得る。水銀非含有組成物が好ましく、保存剤非含有ワクチンが調製され得る。

本発明の薬学的組成物は、好ましくは、無菌である。

本発明の薬学的組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準尺度）、および好ましくは、１用量あたり＜０．１ ＥＵを含む）。

本発明の薬学的組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。

本発明の薬学的組成物は、単位用量形態において調製され得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、０．１〜１．０ｍｌ（例えば、約０．５ｍｌ）の容積を有し得る。

上記組成物は、注射物として調製され得る（溶液もしくは懸濁物のいずれかとして）。上記組成物は、微細スプレーを使用する、肺投与（例えば、吸入器による）のために調製され得る。上記組成物は、鼻、耳もしくは眼への投与（例えば、スプレーもしくは滴剤として）のために調製され得る。筋肉内投与のための注射物が、代表的である。

組成物は、免疫学的に有効量の粒子、ならびに任意の他の成分（必要であれば）を含む。「免疫学的に有効な量」とは、個体への投与量が、単一用量においてもしくはシリーズのうちの一部としてのいずれかで、処置もしくは予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体的状態、処置されるべき個体の年齢、分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、上記個体が抗体を合成する免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、その処置している医師の医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変動する。上記量は、慣用的な治験を通じて決定され得る比較的広い範囲に入ると予測される。本発明の組成物の粒子およびＲＮＡ含有量は、一般に、１用量あたりのＲＮＡの量に関して表される。好ましい用量は、≦１００μｇ ＲＮＡ（例えば、１０〜１００μｇ（例えば、約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇもしくは１００μｇ））を有するが、発現は、遙かに低いレベル、例えば、≦１μｇ／用量、≦１００ｎｇ／用量、≦１０ｎｇ／用量、≦１ｎｇ／用量などにおいてみられ得る。

本発明はまた、本発明の薬学的組成物を含む送達デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザ、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど）を提供する。このデバイスは、上記組成物を脊椎動物被験体に投与するために使用され得る。

本発明の粒子は、リボソームを含まない。

（処置方法および医学的使用）
参考文献１６で開示される粒子とは対照的に、本発明の粒子および薬学的組成物は、目的の免疫原に対する免疫応答を誘発するためのインビボでの使用のためのものである。

本発明は、本発明の粒子もしくは薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、脊椎動物において免疫応答を惹起するための方法を提供する。上記免疫応答は、好ましくは、防御的であり、好ましくは、抗体および／もしくは細胞媒介性免疫を含む。上記方法は、ブースター応答を惹起し得る。

本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための方法において使用するための本発明の粒子もしくは薬学的組成物を提供する。

本発明はまた、脊椎動物における免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明の粒子の使用を提供する。

これら使用および方法により上記脊椎動物における免疫応答を惹起することによって、上記脊椎動物は、上記で考察されるように、種々の疾患および／もしくは感染から（例えば、細菌疾患および／もしくはウイルス疾患から）防御され得る。上記粒子および組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従うワクチンは、予防的である（すなわち、感染を妨ぐ）か、もしくは治療的である（すなわち、感染を処置する）のいずれかであり得るが、代表的には、予防的である。

上記脊椎動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトもしくは大型の獣医学的哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ）である。上記ワクチンが予防的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、小児（例えば、幼児もしくは乳児）またはティーンエイジャーである；上記ワクチンが治療的使用のためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは、ティーンエイジャーもしくは成人である。小児用に意図されたワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。

本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。従って、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、ヘルスケアワーカー、軍従事者、および軍職員、妊婦、慢性疾患患者、もしくは免疫不全患者である。しかし、上記ワクチンは、これらの群にのみ適切であるわけではなく、より一般に、集団において使用され得る。

本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって達成され得る（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、もしくは組織の間隙空間に；参考文献１とは異なり、舌内（ｉｎｔｒａｇｌｏｓｓａｌ）注射は、代表的には、本発明で使用されない）。代替の送達経路としては、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、口内、舌下、膣、局所、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻内、眼、耳、肺もしくは他の粘膜投与が挙げられる。皮内および筋肉内投与は、２つの好ましい経路である。注射は、針を介してであってもよい（例えば、皮下針）が、針なしの注射が、代わりに使用され得る。代表的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。

本発明は、全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、好ましくは、増強された全身免疫および／もしくは粘膜免疫を誘発するために、使用され得る。

投与量は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、一次免疫スケジュールにおいて、および／もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量が、同じ経路もしくは異なる経路（例えば、非経口の一次と粘膜のブースト、粘膜の一次と非経口のブーストなど）によって与えられ得る。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。一実施形態において、複数用量は、生後約６週間、１０週間、および１４週間で（例えば、世界保健機関のＥｘｐａｎｄｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ（「ＥＰＩ」）においてしばしば使用されるように、６週齢、１０週齢および１４週齢において）投与され得る。代替の実施形態において、２回の一次用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、２回目の一次用量の約６ヶ月から１年後に（例えば、２回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。さらなる実施形態において、３回の一次用量が、約２ヶ月間間隔を空けて（例えば、約７週間、８週間もしくは９週間間隔を空けて）投与され、続いて、１回以上のブースター用量が、３回目の一次用量の約６ヶ月後から１年後に（例えば、３回目の一次用量の約６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後もしくは１２ヶ月後）投与される。

（一般的実施形態）
本発明のいくつかの実施形態において、上記ＲＮＡは、改変なしのヌクレオチドを含む（上記を参照のこと）。他の実施形態において、上記ＲＮＡは、必要に応じて、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含み得るが、以下の特徴のうちの１つ以上（既に上記で開示されている）もまた、必要とされる：
Ａ． 上記ＲＮＡがリポソームとともに送達される場合、上記リポソームは、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡおよび／もしくはＤＬｅｎＤＭＡを含む。
Ｂ． 上記ＲＮＡがリポソームに被包される場合、上記リポソーム中の脂質の親水性部分は、ＰＥＧ化される。
Ｃ． 上記ＲＮＡがリポソームに被包される場合、上記リポソームの数で少なくとも８０％が、２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有する。
Ｄ． 上記ＲＮＡが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子は、非毒性でかつ生分解性のポリマー微粒子である。
Ｅ． 上記ＲＮＡが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子は、０．０２μｍ〜８μｍの範囲の直径を有する。
Ｆ． 上記ＲＮＡが微粒子とともに送達される場合、上記微粒子の数で少なくとも８０％は、０．０３〜７μｍの範囲の直径を有する。
Ｇ． 上記ＲＮＡが微粒子とともに送達される場合、上記組成物は、凍結乾燥される。
Ｈ． 上記ＲＮＡは３’ポリＡテールを有し、上記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る。
Ｉ． 上記ＲＮＡは、（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）非毒性でかつ生分解性のポリマー微粒子から選択される送達系を用いて、金属イオンキレート化剤との組み合わせにおいて送達される。

（一般）
本発明の粒子は、別段示されなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の、当該分野の技術内の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、参考文献３６〜４２などを参照のこと。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから専らなってもよいし、何かさらなるものを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

数値ｘに関して用語「約」とは、選択的であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

語句「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、語句「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。

電荷、カチオン、アニオン、両性性イオンなどへの言及は、ｐＨ７において取り扱われる。

ＴＬＲ３は、Ｔｏｌｌ様レセプター３である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ３アゴニストは、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。「ＴＬＲ３」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１１８４９である。ヒトＴＬＲ３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２４５９６２５である。

ＴＬＲ７は、Ｔｏｌｌ様レセプター７である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ７アゴニストは、例えば、イミキモドを含む。「ＴＬＲ７」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３１である。ヒトＴＬＲ７遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：６７９４４６３８である。

ＴＬＲ８は、Ｔｏｌｌ様レセプター８である。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす一回膜貫通レセプターである。既知のＴＬＲ８アゴニストは、例えば、レシキモドを含む。「ＴＬＲ８」は、このレセプターをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１５６３２である。ヒトＴＬＲ８遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０３０２１６５である。

ＲＩＧ−Ｉ様レセプター（「ＲＬＲ」）ファミリーは、先天的免疫系において重要な役割を果たす種々のＲＮＡヘリカーゼを含む［４３］。ＲＬＲ−１（ＲＩＧ−Ｉもしくはレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉとしても公知）は、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。上記ＲＬＲ−１ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＤＤＸ５８」（ＤＥＡＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）ボックスポリペプチド５８（ＤＥＡＤ （Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ） ｂｏｘ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ５８）について）であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１９１０２である。ヒトＲＬＲ−１遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：７７７３２５１４である。ＲＬＲ−２（ＭＤＡ５もしくは黒色腫分化関連遺伝子５（ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ５）としても公知）はまた、そのＮ末端付近にある２つのカスパーゼリクルートドメインを有する。ＲＬＲ−２ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、「ＩＦＩＨ１」（ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されるインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｌｉｃａｓｅ Ｃ ｄｏｍａｉｎ １）について）であり、特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：１８８７３である。ヒトＲＬＲ−２遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ： ２７８８６５６７である。ＲＬＲ−３（ＬＧＰ２もしくは遺伝学および生理学研究室２（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２）としても公知）は、カスパーゼリクルートドメインを有さない。ＲＬＲ−３ヘリカーゼをコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名は、 「ＤＨＸ５８」（ＤＥＸＨ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｈｉｓ）ボックスポリペプチド５８について）であり、特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：２９５１７である。ヒトＲＬＲ−３遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：１４９４０８１２１である。

ＰＫＲは、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼである。これは、先天的免疫系において重要な役割を果たす。「ＥＩＦ２ＡＫ２」（真核生物翻訳開始因子２−αキナーゼ２（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２−ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ ２）について）は、この酵素をコードする遺伝子の承認されたＨＧＮＣ名であり、その特有のＨＧＮＣ ＩＤは、ＨＧＮＣ：９４３７である。ヒトＰＫＲ遺伝子のＲｅｆＳｅｑ配列は、ＧＩ：２０８４３１８２５である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
脊椎動物細胞へＲＮＡをインビボで送達するための非ビリオン粒子であって、ここで、
（ａ）該粒子は、
（ｉ）送達物質であって、免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を被包している、送達物質、または
（ｉｉ）送達物質であって、免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ分子が、該送達物質に吸着させられている、送達物質
のいずれかを含み、
（ｂ）該ＲＮＡは、改変されたヌクレオチドを含まない、
非ビリオン粒子。
（項目２）
前記粒子が、リポソームであり、前記ＲＮＡが、該リポソーム中に被包されている、項目１に記載の粒子。
（項目３）
前記粒子が、非毒性かつ生分解性のポリマー微粒子であり、前記ＲＮＡが、該ポリマー微粒子に吸着させられている、項目１に記載の粒子。
（項目４）
前記粒子が、ポリマー、架橋剤、荷電したモノマーおよび前記ＲＮＡを反応させることによって形成された、生分解性の架橋されたオリゴマーのポリマーナノ粒子である、項目１に記載の粒子。
（項目５）
前記リポソームが、カチオン性頭部を有する脂質を含む、項目２に記載の粒子。
（項目６）
前記リポソームが、両性イオン性頭部を有する脂質を含む、項目２または項目５に記載の粒子。
（項目７）
前記リポソームが、５０ｎｍ〜２２０ｎｍの範囲の直径を有する、項目２、項目５または項目６に記載の粒子。
（項目８）
前記粒子が、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含む、項目３に記載の粒子。
（項目９）
前記粒子が、直径３０ｎｍ〜７μｍを有する、項目３または項目８に記載の粒子。
（項目１０）
前記自己複製ＲＮＡ分子が、
（ｉ）該自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および
（ｉｉ）免疫原
をコードする、前述の項目のいずれかに記載の粒子。
（項目１１）
前記ＲＮＡ分子が、２個のオープンリーディングフレームを有し、該２個のオープンリーディングフレームの第１のものが、アルファウイルスレプリカーゼをコードし、該２個のオープンリーディングフレームの第２のものが、前記免疫原をコードする、項目１０に記載の粒子。
（項目１２）
前記ＲＮＡ分子が、９０００〜１２０００ヌクレオチド長である、前述の項目のいずれかに記載の粒子。
（項目１３）
前記免疫原が、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘
発し得る、前述の項目のいずれかに記載の粒子。
（項目１４）
前記免疫原が、ＲＳウイルス糖タンパク質Ｆに対してインビボで免疫応答を誘発し得る、項目１３に記載の粒子。
（項目１５）
前述の項目のいずれかに記載の粒子を含む、薬学的組成物。
（項目１６）
脊椎動物において防御免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、項目１〜１４に記載の粒子、または項目１５に記載の薬学的組成物の有効量を、該脊椎動物に投与する工程を包含する、方法。

図１は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）ＲＮａｓｅ処理後のレプリコン、（４）リポソームに被包されたレプリコン、（５）ＲＮａｓｅ処理後のリポソーム、（６）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソーム、を示す。 図２は、リポソームの電子顕微鏡写真である。 図３は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（四角）として、裸のＲＮＡ（三角）として、もしくは微粒子（丸）としてＲＮＡを送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現（相対光単位、ＲＬＵとして）を示す。 図４は、染色されたＲＮＡを有するゲルを示す。レーンは、（１）マーカー、（２）裸のレプリコン、（３）リポソームに被包されたレプリコン、（４）ＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出に供したリポソームを示す。 図５は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（四角）として、裸のＲＮＡ（菱形）として、もしくはリポソーム中（＋＝０．１μｇ、×＝１μｇ）においてＲＮＡを送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現を示す。 図６は、リポソーム被包ＲＮＡの４種の異なる用量を送達した後、１日目、３日目および６日目でのタンパク質発現を示す。 図７は、ビリオンパッケージングされたレプリコン（ＶＲＰもしくはＶＳＲＰ）、１μｇ 裸のＲＮＡ、および１μｇ リポソーム被包ＲＮＡを与えられた動物における抗Ｆ ＩｇＧ力価を示す。 図８は、ＶＲＰ、１μｇ 裸のＲＮＡ、および０．１ｇもしくは１μｇのリポソーム被包ＲＮＡを与えられた動物における抗Ｆ ＩｇＧ力価を示す。 図９は、ＶＲＰ、または０．１ｇもしくは１μｇのリポソーム被包ＲＮＡのいずれかを与えられた動物における中和抗体力価を示す。 図１０は、裸のＲＮＡ（丸）、リポソーム被包ＲＮＡ（三角および四角）、またはリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）（逆三角）としてレプリコンを送達した後の発現レベルを示す。 図１１は、レプリコンを裸のＲＮＡとして（０．０１〜１μｇ）、リポソーム被包ＲＮＡとして（０．０１〜１０μｇ）、またはビリオンとしてパッケージングされたものとして（ＶＲＰ、１０^６ 感染単位もしくはＩＵ）、送達した後のＦ特異的ＩｇＧ力価（２回目の用量後２週間）を示す。 図１２は、レプリコンを裸のＲＮＡとして（１μｇ）、リポソーム被包ＲＮＡとして（０．１もしくは１μｇ）、またはビリオンとしてパッケージングされたものとして（ＶＲＰ、１０^６ ＩＵ）、送達した後のＦ特異的ＩｇＧ力価（丸）およびＰＲＮＴ力価（四角）を示す。ナイーブマウスの力価もまた、示す。実線は、幾何平均を示す。 図１３は、２回目の用量の４週間後、Ｆタンパク質中の主要なエピトープを表す合成ペプチドで再刺激した後の細胞内サイトカイン生成を示す。ｙ軸は、ＣＤ８＋ＣＤ４−の％サイトカイン＋を示す。 図１４は、仔ウシの免疫化後６３日間（図１４Ａ）および２１０日間（図１４Ｂ）にわたるＦ特異的ＩｇＧ力価（平均ｌｏｇ_１０力価±標準偏差）を示す。その３つの線は、６３日目において容易に区別され、下から上へ：ＰＢＳ陰性コントロール；リポソーム送達ＲＮＡ；および「Ｔｒｉａｎｇｌｅ ４」製品である。 図１４は、仔ウシの免疫化後６３日間（図１４Ａ）および２１０日間（図１４Ｂ）にわたるＦ特異的ＩｇＧ力価（平均ｌｏｇ_１０力価±標準偏差）を示す。その３つの線は、６３日目において容易に区別され、下から上へ：ＰＢＳ陰性コントロール；リポソーム送達ＲＮＡ；および「Ｔｒｉａｎｇｌｅ ４」製品である。 図１５は、裸の（「ＲＮＡ」）もしくはリポソーム被包（「ＬＮＰ」）ＲＮＡに応じた、または筋肉へのエレクトロポレーションによって送達されたＤＮＡに応じた、抗ＨＩＶ血清ＩｇＧ力価を示す。 図１６は、１３のマウス群におけるＩｇＧ力価を示す。各々の丸は、個々のマウスであり、実線は、幾何平均を示す。水平な破線は、アッセイの検出限界である。上記１３の群は、左から右に、以下に示されるようにＡからＭである。 図１７は、ｐＤＣによって放出された（Ａ）ＩＬ−６および（Ｂ）ＩＦＮα（ｐｇ／ｍｌ）を示す。４対のバーがあり、左から右に：コントロール；ＲＮＡ＋ＤＯＴＡＰで免疫化；ＲＮＡ＋リポフェクタミンで免疫化；およびリポソーム中のＲＮＡで免疫化である。各対において、その黒いバーは、野生型マウスであり、灰色は、ｒｓｑ１変異体である。

（発明を実施するための態様）
（ＲＮＡレプリコン）
種々のレプリコンは、以下で使用される。一般に、これらは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）に由来する非構造タンパク質、シンドビス・ウイルス由来のパッケージングシグナル、およびシンドビス・ウイルスもしくはＶＥＥＶ変異体に由来する３’ＵＴＲを有するハイブリッドアルファウイルスゲノムに基づく。上記レプリコンは、約１０ｋｂ長であり、ポリＡテールを有する。

アルファウイルスレプリコンをコードするプラスミドＤＮＡ（名称：ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＦＬ．ＲＳＶＦもしくはＡ３１７；ｐＴ７−ｍＶＥＥＶ−ＳＥＡＰもしくはＡ３０６；ｐＳＰ６−ＶＣＲ−ＧＦＰもしくはＡ５０）を、インビボでのＲＮＡ合成のテンプレートとして供した。上記レプリコンは、ＲＮＡ複製に必要とされるアルファウイルス遺伝的エレメントを含むが、粒子アセンブリに必要な遺伝子産物をコードするエレメントを欠いている；構造タンパク質は、代わりに、目的のタンパク質（レポーター（例えば、ＳＥＡＰもしくはＧＦＰ）または免疫原（例えば、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質）のいずれか）によって置き換えられるので、上記レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導できない。上記アルファウイルスｃＤＮＡの上流にあるバクテリオファージ（Ｔ７もしくはＳＰ６）プロモーターは、インビトロで上記レプリコンＲＮＡの合成を促進し、上記ポリ（Ａ）テールの直ぐ下流にあるデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムは、その自己切断活性を介して正確な３’末端を生成する。

適切な制限エンドヌクレアーゼで上記ＨＤＶリボザイムの下流で上記プラスミドＤＮＡを直線状にした後に、ランオフ転写物（ｒｕｎ−ｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を、Ｔ７もしくはＳＰ６バクテリオファージ由来ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、インビトロで合成した。転写を、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ）によって提供される指示書に従って、ヌクレオシドトリホスフェート（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）の各々の７．５ｍＭ（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）もしくは５ｍＭ（ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）の存在下で、３７℃において２時間にわたって行った。転写の後、上記テンプレートＤＮＡを、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で消化した。上記レプリコンＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップのないＲＮＡを、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇキャッピングシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ユーザーマニュアルに概説されるとおり、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）で転写後にキャップした；このようにキャップしたレプリコンに、「ｖ」の接頭文字を付ける（例えば、ｖＡ３１７は、ＶＣＥによってキャップされたＡ３１７レプリコンである）。転写後キャップされたＲＮＡを、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。上記ＲＮＡサンプルの濃度を、ＯＤ_{２６０ｎｍ}を測定することによって決定した。上記インビトロ転写物の完全性を、変性アガロースゲル電気泳動によって確認した。

（ＰＬＧ吸着）
微粒子を、５００ｍｇのＰＬＧ ＲＧ５０３（５０：５０ ラクチド／グリコリドモル比、ＭＷ約３０ｋＤａ）および２０ｍｇのＤＯＴＡＰを使用して、Ｏｍｎｉ Ｍａｃｒｏ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを使用して作製した。上記粒子懸濁物を、１５０ｒｐｍにおいて一晩振盪し、次いで、２〜８℃で貯蔵するために、４０μｍ滅菌フィルタを通して濾過した。自己複製ＲＮＡを、上記粒子に吸着させた。１ｍＬのＰＬＧ／ＲＮＡ懸濁物を調製するために、ＰＬＧ粒子懸濁物の必要容積をバイアルに添加し、ヌクレアーゼ非含有水を添加して、容積９００μＬにした。１００μＬ ＲＮＡ（１０μｇ／ｍＬ）を、一定に振盪しながら上記ＰＬＧ懸濁物に滴下した。ＰＬＧ／ＲＮＡを、室温において３０分間にわたってインキュベートした。再構成懸濁物１ｍＬについて、４５ｍｇ マンニトール、１５ｍｇ スクロースおよび２５０〜５００μｇのＰＶＡを添加した。上記バイアルを−８０℃で凍結し、凍結乾燥した。

ＲＮＡ吸着を評価するために、１００μＬ 粒子懸濁物を、１０，０００ｒｐｍにおいて５分間にわたって遠心分離し、上清を集めた。ＰＬＧ／ＲＮＡを、１ｍＬ ヌクレアーゼ非含有水を使用して再構成した。１００μＬ粒子懸濁物（１μｇ ＲＮＡ）に、１ｍｇ 硫酸ヘパリンを添加した。上記混合物をボルテックスし、室温において３０分間にわたってＲＮＡ脱着のために静置させた。粒子懸濁物を遠心分離し、上清を集めた。

ＲＮＡｓｅ安定性に関しては、１００μＬ 粒子懸濁物を、６．４ｍＡＵのＲＮａｓｅ Ａとともに室温において３０分間にわたってインキュベートした。ＲＮＡｓｅを、０．１２６ｍＡＵのプロテイナーゼＫで、５５℃において１０分間にわたって不活性化した。１ｍｇの硫酸ヘパリンを添加して、上記ＲＮＡを脱着させ、続いて、遠心分離した。ＲＮＡを含むその上清サンプルを、ホルムアルデヒドローディング色素と混合し、６５℃において１０分間にわたって加熱し、１％変性ゲル（１レーンあたり４６０ｎｇ ＲＮＡをローディング）を使用して分析した。

発現を評価するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０日目に、１００μＬ筋肉内注射容積（５０μＬ／脚）中の１μｇ ＲＮＡで免疫化した。血清を、１日目、３日目および６日目に集めた。タンパク質発現を、化学発光アッセイを使用して決定した。図３に示される様に、発現は、任意の送達粒子なし（丸）よりも、ＲＮＡをＰＬＧ（三角）によって送達した場合に高かった。

（リポソーム被包）
ＲＮＡを、参考文献７および４４の方法によって作製したリポソーム中に被包した。上記リポソームを、１０％ ＤＳＰＣ（両性イオン性）、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性）、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（２ｋＤａ ＰＥＧ）から作製した。これら割合は、総リポソーム中の％モルに言及する。

ＤｌｉｎＤＭＡ（１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン）を、参考文献２の手順を使用して合成した。ＤＳＰＣ（１，２−ジアステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）を、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ＰＥＧ結合体化ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール），アンモニウム塩）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン，塩化物塩）およびＤＣ−ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールヒドロクロリド）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓからであった。

簡潔には、脂質をエタノール（２ｍｌ）中に溶解し、ＲＮＡレプリコンを、緩衝液（２ｍｌ，１００ｍＭ クエン酸ナトリウム，ｐＨ６）中に溶解し、これらを２ｍｌの緩衝液と混合し、続いて、１時間平衡化させた。上記混合物を６ｍｌの緩衝液で希釈し、次いで、濾過した。得られた生成物は、リポソームを含み、約９５％の被包効率であった。

例えば、１つの特定の方法において、新鮮な脂質ストック溶液を、エタノール中で調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ−ＤＭＧを秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、７５５μＬの上記ストックを、１．２４５ｍＬ エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。この脂質量を使用して、２５０μｇ ＲＮＡを有するリポソームを形成した。ＲＮＡの２ｍＬ 作業溶液をまた、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の約１μｇ／μＬのストック溶液から調製した。３つの２０ｍＬ ガラスバイアル（撹拌子有り）を、ＲＮａｓｅ Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮａｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの１つを、上記ＲＮＡ作業溶液に使用し、他のものを脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ ルーアーロックシリンジに入れた。２ｍＬ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ シリンジに入れた。ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブ（フッ素化エチレン−プロピレン；使用したすべてのＦＥＰチューブは、２ｍｍ内径および３ｍｍ外径を有した；Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅから得た）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫ^ＴＭ ５００μｍ ＩＤ接合部，Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、別個の１つのチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量７ｍＬ／分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、２０ｍＬ ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの４ｍｌを、５ｃｃ シリンジに入れ、これを、ＦＥＰチューブの１つに接続し、別の５ｃｃ シリンジを、等しい長さのＦＥＰチューブに接続し、等量の１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量において作動させ、最終の混合物を、２０ｍＬ ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、第２の混合工程（リポソーム）から集めた上記混合物を、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体）を通過させた。上記リポソームに関してこの膜を使用する前に、４ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）が、連続してこの膜を通過した。リポソームを、１０分間にわたって３７℃において加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、接線流濾過を使用することによって、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ（Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）から購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび８ｃｍ^２ 表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。さらなるリポソーム製造法は、以下で開示される。

図２は、これら方法によって調製されるリポソームの例示的な電子顕微鏡写真を示す。これらリポソームは、被包された、全長ＲＳＶ Ｆ抗原をコードするＲＮＡを含む。１つのバッチの動的光散乱は、平均直径１４１ｎｍ（強度で）もしくは７８ｎｍ（数で）を示した。

被包されたＲＮＡのパーセンテージおよびＲＮＡの濃度を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、製造業者の指示書に従って決定した。上記キット中に提供されたリボソームＲＮＡ標準を使用して、標準曲線を作成した。リポソームを、１×ＴＥ緩衝液（キットから）中で、１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加した。別個に、リポソームを、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘを含む１×ＴＥ緩衝液中で１０×もしくは１００×に希釈し、その後、色素を添加した（上記リポソームを破壊するため。従って、総ＲＮＡをアッセイするため）。その後、等量の色素を各溶液に添加し、次いで、色素添加後の約１８０μＬの各溶液を、二連において、９６ウェル組織培養プレートに入れた。蛍光（励起４８５ｎｍ，発光５２８ｎｍ）を、マイクロプレートリーダーで読み取った。すべてのリポソーム処方物を、被包されたＲＮＡの量に基づいて、インビボで投与した。

リポソームにおける被包は、ＲＮａｓｅ消化からＲＮＡを保護することを示した。実験では、３．８ｍＡＵのＲＮａｓｅ Ａ／μｇ ＲＮＡを使用し、３０分間にわたって室温においてインキュベートした。ＲＮａｓｅを、プロテイナーゼＫで、５５℃において１０分間にわたって不活性化した。次いで、サンプル 対 ２５：２４：１ ｖ／ｖ／ｖ，フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの１：１ ｖ／ｖ混合物を添加して、上記ＲＮＡを上記脂質から水相へと抽出した。サンプルを、数秒間にわたってボルテックスすることによって混合し、次いで、１２ｋ ＲＰＭにおける１５分間にわたる遠心分離に置いた。上記水相（上記ＲＮＡを含む）を取り出し、上記ＲＮＡを分析するために使用した。ローディング前に（４００ｎｇ ＲＮＡ／ウェル）、上記サンプルすべてを、ホルムアルデヒドローディング色素とともにインキュベートし、１０分間にわたって６５℃において変性させ、室温へと冷却した。Ａｍｂｉｏｎ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍマーカーを使用して、上記ＲＮＡ構築物の分子量を概算した。上記ゲルを、９０Ｖにおいて泳動した。上記ゲルを、室温において１時間にわたって振盪することによって、製造業者のガイドラインに従って、水中の０．１％ ＳＹＢＲゴールドを使用して染色した。図１は、被包の非存在下でＲＮａｓｅがＲＮＡを完全に消化することを示す（レーン３）。ＲＮＡは、被包後に検出不能であり（レーン４）、これらリポソームがＲＮａｓｅで処理されても全く変化が認められない（レーン４）。ＲＮａｓｅ処理リポソームをフェノール抽出に供した後、消化されていないＲＮＡが認められる（レーン６）。４℃において１週間後ですら、上記ＲＮＡを、いかなるフラグメント化もなしに認めることができた（図４，矢印）。インビボでのタンパク質発現は、４℃において６週間および１回の凍結融解サイクル後にも変化しなかった。従って、リポソーム被包ＲＮＡは安定である。

上記ＲＮＡのインビボ発現を評価するために、免疫原ではなく、レポーター酵素（ＳＥＡＰ；分泌型アルカリホスファターゼ）を、上記レプリコン中にコードさせた。発現レベルを、化学発光アルカリホスファターゼ基質を使用して、１×Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ希釈緩衝液中で１：４希釈した血清中で測定した。８〜１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（５匹／群）に、０日目に、０．１μｇもしくは１μｇ ＲＮＡ用量で５０μｌ／脚を筋肉内に注射した。同じベクターを、１μｇにおいて上記リポソームなしで（ＲＮａｓｅ非含有１×ＰＢＳ中で）も投与した。ビリオンパッケージングされたレプリコンもまた、試験した。本明細書で使用したビリオンパッケージングされたレプリコン（「ＶＲＰ」と呼ぶ）を、参考文献４５の方法によって得た。ここでアルファウイルスレプリコンは、変異ＶＥＥＶに由来するか、またはシンドビスウイルスの３’ＵＴＲおよびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）を含むように操作されたＶＥＥＶのゲノムから得られるキメラであり、シンドビスウイルスキャプシドおよび糖タンパク質遺伝子をコードする欠損性ヘルパーＲＮＡと共にＢＨＫ細胞へと共エレクトロポレーション（ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｎｇ）することによってパッケージングした。

図５に示されるように、被包は、１μｇ用量においてＳＥＡＰレベルを約１／２対数増大させ、６日目において、０．１μｇ 被包用量からの発現は、１μｇ 非被包用量で認められたレベルに匹敵した。３日目までに、発現レベルは、ＶＲＰで達成されたものを超えた（四角）。従って、発現は、裸のＲＮＡコントロールと比較して、１０×低用量においてすら、上記ＲＮＡが上記リポソーム中に処方された場合に増大された。発現はまた、上記ＶＲＰコントロールと比較して高かったが、発現の動態は、非常に異なっていた（図５を参照のこと）。エレクトロポレーションを用いた上記ＲＮＡの送達は、上記裸のＲＮＡコントロールと比較して増大した発現を生じたが、これらレベルは、リポソームでのものより低かった。

さらなるＳＥＡＰ実験から、インビボで明らかな用量応答が示された。発現は、１ｎｇほどのＲＮＡの送達後にも認められた（図６）。被包レプリコンからの発現と裸のレプリコンからの発現とを比較するさらなる実験から、０．０１μｇ 被包ＲＮＡは、１μｇの裸のＲＮＡに等しいことが示された。ＲＮＡの０．５μｇ用量において、上記被包物質は、６日目において１２倍高い発現を与えた；０．１μｇ用量レベルでは、６日目において２４倍高かった。

上記群において平均レベルで調べるだけでなく、個々の動物もまた研究した。いくらかの動物は、裸のレプリコンに対して非応答者であったのに対して、被包は、非応答者を排除した。

さらなる実験では、ＤｌｉｎＤＭＡをＤＯＴＡＰで置換した。ＤＯＴＡＰリポソームは、裸のレプリコンより良好な発現を与えたが、それらは、ＤｌｉｎＤＭＡリポソームより劣っていた（１日目において２〜３倍の差異）。

インビボでの免疫原性を評価するために、レプリコンを構築して、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）に由来する全長Ｆタンパク質を発現させた。これを、裸（１μｇ）、リポソーム中に被包（０．１もしくは１μｇ）、またはビリオン中でパッケージング（１０^６ ＩＵ；「ＶＲＰ」）で、０日目および２１日目に送達した。図７は、２回目の用量の２週間後の抗ＦのＩｇＧ力価を示す。上記リポソームは、明らかに免疫原性を増強する。図８は、２週間後の力価を示す。この時点までに、０．１μｇの上記被包ＲＮＡと、１μｇの上記被包ＲＮＡと、上記ＶＲＰ群との間に統計学的差異は何らなかった。中和力価（６０％のプラーク減少として測定，「ＰＲＮＴ６０」）は、２回目の用量の２週間後に、これら３群において有意差はなかった（図９）。図１２は、２回目の用量の４週間後のＩｇＧ力価およびＰＲＮＴ力価の両方を示す。

図１３は、上記ＲＮＡが堅調なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発することを確認する。

さらなる実験において、ＶＲＰ、０．１μｇ リポソーム被包ＲＮＡ、もしくは１μｇ リポソーム被包ＲＮＡを与えられたマウスにおけるＦ特異的ＩｇＧ力価を比較した。２回目の用量の後の種々の時点での力価比（ＶＲＰ：リポソーム）は、以下のとおりであった：

従って、上記リポソーム被包ＲＮＡは、ビリオン送達で認められるのと本質的に同程度の免疫応答を誘導する。

さらなる実験から、優れたＦ特異的ＩｇＧ応答が１０μｇ用量で示され、これは、１μｇおよび０．１μｇ用量についての応答と等しく、０．０１μｇ用量ではより低い応答が示された。図１１は、３種の異なる用量における裸の形態において、４種の異なる用量におけるリポソームにおいて、もしくはＶＲＰ（１０^６ ＩＵ）として、上記レプリコンを与えられた動物におけるＩｇＧ力価を示す。１μｇ リポソーム被包ＲＮＡで認められた応答は、ＶＲＰと比較した場合に統計的に有意ではなかった（ＡＮＯＶＡ）が、１０μｇ リポソーム被包ＲＮＡで認められたより高い応答は、これらの群の両方と比較した場合、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。

さらなる研究から、上記０．１μｇのリポソーム被包ＲＮＡは、０．１μｇの送達されたＤＮＡより遙かに高い抗Ｆ ＩｇＧ応答を与え（２回目の用量の１５日後）、さらに、エレクトロポレーション（Ｅｌｇｅｎ^ＴＭ ＤＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｉｎｏｖｉｏ）によって送達された、上記Ｆ抗原をコードする２０μｇ プラスミドＤＮＡより免疫原性であることが確認された。

マウスは、リポソーム被包ＲＮＡレプリコンを受けた後に、ごくわずかな視覚的な苦痛の徴候（体重減少など）を示したが、３〜４％という一過性の体重減少が、１０μｇ ＲＮＡの２回目の用量後に認められた。対照的に、１０μｇ リポソーム被包ＤＮＡの送達は、８〜１０％の体重減少をもたらした。

（作用機構）
骨髄由来樹状細胞（ｐＤＣ）を、野生型マウスもしくは「Ｒｅｓｑ」（ｒｓｑ１）変異系統から得た。上記変異系統は、そのＴＬＲ７レセプターのアミノ末端において点変異を有し、これは、リガンド結合に影響を及ぼさずにＴＬＲ７シグナル伝達を破壊する［４６］。上記細胞を、ＤＯＴＡＰ、リポフェクタミン２０００で処方したレプリコンＲＮＡもしくはリポソーム内のレプリコンＲＮＡで刺激した。図１７に示されるように、ＩＬ−６およびＩＮＦαは、ＷＴ細胞において誘導されたが、この応答は、変異マウスにおいてほぼ完全に排除された。これらの結果は、ＴＬＲ７が、免疫細胞におけるＲＮＡ認識のために必要とされ、そしてリポソーム被包レプリコンが、免疫細胞に高レベルのインターフェロンおよび炎症促進性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの両方を分泌させ得ることを示す。

一般に、リポソーム送達されたＲＮＡレプリコンは、筋肉内注射の２４時間以内にいくつかの血清サイトカイン（ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ−１０）、ＩＬ−６、ＫＣ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１、およびＭＩＰ−ａ）を誘導することを示したのに対して、ＭＩＰ−１のみが、裸のＲＮＡによって誘導され、リポソーム単独は、ＩＬ−６のみを誘導した。

ＩＦＮ−αは、リポソーム被包ＲＳＶ−Ｆコードレプリコンへの免疫応答に寄与することを示した。なぜなら、抗ＩＦＮαレセプター（ＩＦＮＡＲ１）抗体は、２回のワクチン接種後に、Ｆ特異的血清ＩｇＧを１／１０に低下させたからである。

リポソーム送達されたＲＮＡレプリコンは、一般に、マウスにおいてバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａサブタイププロフィールを誘発することが認められ、ときおり、エレクトロポレーションしたＤＮＡ、もしくはタンパク質／ＭＦ５９免疫化で認められるものより高いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比（すなわち、Ｔｈ１タイプ免疫応答）が認められた。

（リポソーム製造法）
一般に、８つの異なる方法を、本発明に従うリポソームを調製するために使用した。これらは、方法（Ａ）〜（Ｈ）として本文中で言及され、主に濾過およびＴＦＦ工程に関連して異なっている。詳細は、以下のとおりである。

（Ａ）エタノール中の新鮮な脂質ストック溶液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロールおよび８．０７ｍｇのＰＥＧ ＤＭＧ ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中に溶解した。上記新たに調製した脂質ストック溶液を、３７℃において約１５分間にわたって穏やかに振盪して、均質な混合物を形成した。次いで、上記ストックのうちの７５５μＬを、１．２４５ｍＬ エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製した。この量の脂質を使用して、２５０μｇ ＲＮＡとともにリポソームを形成した。ＲＮＡの２ｍＬ 作業溶液をまた、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中のストック溶液約１μｇ／μＬから調製した。３つの２０ｍＬ ガラスバイアル（撹拌子有り）を、ＲＮａｓｅ Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）ですすぎ、使用前に多量のＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、上記バイアルのＲＮａｓｅの汚染を除去した。上記バイアルのうちの１つを、上記ＲＮＡ作業溶液に使用し、他のものを脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した（後に記載されるとおり）。作業脂質溶液およびＲＮＡ溶液を、３７℃において１０分間にわたって加熱し、その後、３ｃｃ ルーアーロックシリンジに入れた。２ｍＬ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃ シリンジに入れた。ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、ＦＥＰチューブ（フッ素化エチレン−プロピレン；すべてのＦＥＰチューブは、２ｍｍ内径×３ｍｍ外径を有した；Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅによって供給）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫ^ＴＭ ５００μｍ ＩＤ接合部，Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ， ＷＡ）に接続した。上記Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰチューブであった。上記クエン酸緩衝液を含む第３のシリンジを、別個の１つのＦＥＰチューブに接続した。次いで、すべてのシリンジを、流量７ｍＬ／分においてシリンジポンプを使用して作動させた。上記チューブ出口を、２０ｍＬ ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。上記混合物のうちの４ｍｌを、５ｃｃ シリンジに入れ、これを、ＦＥＰチューブの１つに接続し、別の５ｃｃ シリンジを、等しい長さのＦＥＰチューブに接続し、等量の１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、上記シリンジポンプを使用して７ｍＬ／分の流量において作動させ、最終の混合物を、２０ｍＬ ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、第２の混合工程（リポソーム）から集めた上記混合物を、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＡｎｎＡｒｂｏｒ， ＭＩ， ＵＳＡから得られる、結合してアニオン性分子を除去するアニオン交換支持体）を通過させた。上記リポソームを通過させる前に、４ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＬの１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）が、上記Ｍｕｓｔａｎｇ膜を連続して通過した。リポソームを、１０分間にわたって３７℃において加温し、その後、上記膜を通過させた。次に、ＴＦＦを使用して、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析し、その後、最終生成物を収集した。上記ＴＦＦシステムおよび中空ファイバー濾過膜を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓから購入し、上記製造業者のガイドラインに従って使用した。１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび８ｃｍ^２ 表面積を有するポリスルホン中空ファイバー濾過膜（部品番号Ｐ／Ｎ： Ｘ１ＡＢ−１００−２０Ｐ）を使用した。インビトロおよびインビボ実験に関しては、処方物を、１×ＰＢＳで、必要とされるＲＮＡ濃度へと希釈した。

（Ｂ）振盪後、上記ストックのうちの２２６．７μＬを、１．７７３ｍＬ エタノールに添加して、作業脂質ストック溶液２ｍＬを作製したこと（従って、上記脂質：ＲＮＡ比を改変）を除いて、方法（Ａ）のとおり。

（Ｃ）上記Ｍｕｓｔａｎｇ濾過を省略したので、リポソームが、上記２０ｍＬ ガラスバイアルから上記ＴＦＦ透析へと向かったことを除いて、方法（Ｂ）のとおり。

（Ｄ）上記ＴＦＦが、１００ｋＤ孔サイズカットオフおよび２０ｃｍ^２ 表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空ファイバー膜（部品番号 Ｐ−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を使用したことを除いて、方法（Ｃ）のとおり。

（Ｅ）方法（Ａ）のようにＭｕｓｔａｎｇ膜を使用したことを除いて、方法（Ｄ）のとおり。

（Ｆ）上記Ｍｕｓｔａｎｇ濾過を省略したので、リポソームが、上記２０ｍＬ ガラスバイアルから上記ＴＦＦ透析へと向かったことを除いて、方法（Ａ）のとおり。

（Ｇ）ＲＮＡの４ｍＬ 作業溶液を、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中の約１μｇ／μＬのストック溶液から調製したことを除いて、方法（Ｄ）のとおり。次いで、４つの２０ｍＬ ガラスバイアルを、同じ方法で調製した。それらのうちの２本を、上記ＲＮＡ作業溶液（各バイアル中２ｍＬ）に使用し、他のものを、（Ｃ）のように、上記脂質およびＲＮＡ混合物を集めるために使用した。Ｔミキサーを使用するのではなく、ＲＮＡおよび脂質を含むシリンジを、Ｍｉｔｏｓ Ｄｒｏｐｌｅｔ接合チップ（Ｓｙｒｒｉｓから得られるガラス製マイクロ流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）デバイス（部品番号 ３０００１５８））に、ＰＴＦＥチューブ（０．０３インチ内径×１／１６インチ外径）を使用して、４ウェイエッジコネクタ（Ｓｙｒｒｉｓ）を使用して接続した。２つのＲＮＡストリームおよび１つの脂質ストリームを、シリンジポンプによって作動させ、上記エタノールおよび水相の混合を、上記チップのＸ接合部（１００μｍ×１０５μｍ）において行った。３つすべてのストリームの流量を、１．５ｍＬ／分において維持し、従って、全水性の流量 対 エタノールの流量の比は、２：１であった。上記チューブ出口を、２０ｍＬ ガラスバイアルに上記混合物を集めるように配置した（撹拌しながら）。上記撹拌子を取り出し、上記エタノール／水性溶液を、室温へと１時間にわたって平衡化させた。次いで、上記混合物を５ｃｃ シリンジに入れ、これを、上記ＰＴＦＥチューブの別の１つにはめた；等しい長さのＰＴＦＥチューブ付きの別の５ｃｃ シリンジに、等容積の１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）を入れた。上記２本のシリンジを、３ｍＬ／分の流量において、シリンジポンプを使用して作動させ、最終混合物を、２０ｍＬ ガラスバイアルに集めた（撹拌しながら）。次に、（Ｄ）におけるように、ＴＦＦを使用して、リポソームを２ｍＬに濃縮し、１０〜１５容積の１×ＰＢＳに対して透析した。

（Ｈ）上記２ｍＬ作業脂質ストック溶液を、１２０．９μＬの上記脂質ストックと１．８７９ｍＬ エタノールとを混合することによって作製したことを除いて、方法（Ａ）のとおり。また、上記Ｔミキサーにおいて混合した後に、上記２０ｍＬ バイアルからの上記リポソームを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，特に強力，０．５〜３ｍＬ 容量）に入れ、オートクレーブしたプラスチック容器中、４００〜５００ｍＬの１×ＰＢＳに対して一晩４℃において透析し、その後、最終生成物を収集した。

（ＢＨＫ発現）
様々な脂質でのリポソームを、ＢＨＫ細胞とともに一晩インキュベートし、タンパク質発現能力について評価した。ＲＶ０５脂質でのベースラインから、発現を、１０％ １，２−ジフィタノイル（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）を上記リポソームに添加することによって１８×に増大させることができ、１０％ １８：２（ｃｉｓ） ホスファチジルコリンを添加することによって１０×に増大させることができ、そして代わりにＲＶ０１を使用することによって９００×に増大させることができた。

一般に、インビボ研究は、不飽和脂質テールが、コードされた抗原に対して惹起されるＩｇＧ力価を増強する傾向にあることを示した。

（ＲＳＶ免疫原性）
ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするｖＡ３１７自己複製レプリコンを、０日目および２１日目に、上記レプリコン（１μｇ）単独で、またはＤｌｉｎＤＭＡ（「ＲＶ０１」）もしくはＤＯＴＡＰ（「ＲＶ１３」）とのリポソームとして処方して、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）によって、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり４匹もしくは８匹の動物）に投与した。上記ＲＶ０１リポソームは、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ−ＤＭＧを有し、異なる量のＲＮＡを伴った。上記ＲＶ１３リポソームは、４０％ ＤＯＴＡＰ、１０％ ＤＰＥ、４８％ コレステロールおよび２％ ＰＥＧ−ＤＭＧを有した。比較のために、同じＲＳＶ−Ｆ抗原を発現する裸のプラスミドＤＮＡ（２０μｇ）を、エレクトロポレーションを使用して、もしくはＲＶ０１（１０）リポソーム（０．１μｇ ＤＮＡ）とともに、のいずれかで送達した。４匹のマウスを、ナイーブコントロール群として使用した。

リポソームを、方法（Ｄ）もしくは方法（Ｂ）によって調製した。方法（Ｄ）によって作製したいくらかのリポソームに関しては、二倍量もしくは半量のＲＮＡを使用した。上記リポソームのＺ平均粒子直径、多分散指数、および被包効率は、以下のとおりであった：

血清を、１４日目、３６日目および４９日目に抗体分析のために集めた。脾臓を、４９日目に、Ｔ細胞分析のためにマウスから採取した。

Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：

サイトカイン陽性であり、かつＲＳＶ Ｆ５１−６６ペプチドに対して特異的なＴ細胞の割合は、以下のとおりであり、統計的に有意にゼロを上回る数字のみを示す：

従って、上記リポソーム処方物は、増大したＦ特異的ＩｇＧ力価およびＴ細胞頻度によって決定される場合、上記裸のＲＮＡコントロールと比較して免疫原性を顕著に増大した。リポソームとともに処方したか、またはエレクトロポレーションを使用して裸で送達されたプラスミドＤＮＡは、リポソーム処方された自己複製ＲＮＡより顕著に免疫原性が低かった。

上記ＲＶ０１ ＲＮＡワクチンは、上記ＲＶ１３ワクチンより免疫原性であった。ＲＶ０１は、頭部の中に三級アミンを有し、これはｐＫａ約５．８を有し、さらに、不飽和アルキルテールも含む。ＲＶ１３は、不飽和アルキルテールを有するが、その頭部は、四級アミンを有し、非常に強力にカチオン性である。

（リポソーム−被包についての必要性）
上記リポソーム群において認められる効果が、上記リポソーム成分にのみ起因していたのか、または上記被包に関連していたのかを評価するために、上記レプリコンを、被包形態（２つの異なる精製プロトコルとともに， ０．１μｇ ＲＮＡ）において、またはリポソーム形成後に上記リポソームと混合して（非被包「リポプレックス」，０．１μｇ ＲＮＡ）、または裸のＲＮＡ（１μｇ）として投与した。図１０は、上記リポプレックスが、最低レベルの発現を与えたことを示す。このことは、被包がタンパク質発現に必須であることを示す。

さらなる実験は、３種の異なるＲＮＡを使用した：（ｉ）ＲＳＶ−Ｆ（すなわち、ＲＳＶの表面融合糖タンパク質）を発現する「ｖＡ３１７」レプリコン；（ｉｉ）ＧＦＰを発現する「ｖＡ１７」レプリコン；および（ｉｉｉ）複製欠損性でありかつＧＦＰをコードする「ｖＡ３３６」。

ＲＮＡを、裸で、もしくは方法（Ｄ）によって作製したリポソームとともに、のいずれかで送達した。空のリポソームを、方法（Ｄ）によって作製したが、いかなるＲＮＡも有しなかった。４種のリポソーム処方物は、以下の特徴を有した：

ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり５匹の動物）に、０日目および２１日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた：
群１ 裸の自己複製性ＲＳＶ−Ｆ ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）
群２ リポソーム中に被包された自己複製性ＲＳＶ−Ｆ ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）
群３ 空のリポソームに添加された自己複製性ＲＳＶ−Ｆ ＲＮＡ（ｖＡ３１７，０．１μｇ）
群４ Ｆサブユニットタンパク質（５μｇ）。

血清を、１４日目、３５日目および５１日目に、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）を測定した；個々の動物が力価＜２５（検出限界）を有した場合、それには力価５を割り当てた。さらに、５１日目にＴ細胞分析のために脾臓をマウスから採取して、サイトカイン陽性かつＲＳＶ Ｆ５１−６６ペプチド（ＣＤ４＋）もしくはＲＳＶ ＦペプチドＦ８５−９３およびＦ２４９−２５８（ＣＤ８＋）に対して特異的である細胞を決定した。

ＩｇＧ力価は、１０群においておよび非免疫化コントロールマウスにおいて以下のとおりであった：

５１日目でのＲＳＶ血清中和力価は、以下のとおりであった：

５１日目にＲＳＶ Ｆ特異的ＣＤ４＋脾臓Ｔ細胞を示す動物は、以下のとおりであった。ここで数字（％陽性細胞）は、上記刺激された応答が統計的に有意にゼロを上回った場合にのみ与える：

５１日目にＲＳＶ Ｆ特異的ＣＤ８＋脾臓Ｔ細胞を示す動物は、以下のとおりであった。ここで数字は、上記刺激された応答が統計的に有意にゼロを上回った場合にのみ与える：

従って、上記リポソーム内のＲＮＡの被包は、高い免疫原性に必要である。なぜなら、ＲＮＡおよび上記リポソームの単純な混合（群３）は、免疫原性ではなかったからである（実際に、裸のＲＮＡより免疫原性が低かった）。

他の研究において、（ｉ）全長ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする自己複製ＲＮＡレプリコン、（ｉｉ）自己複製性ＧＦＰコードＲＮＡレプリコン、（ｉｉｉ）ｎｓＰ４においてノックアウト（自己複製を排除する）を有するＧＦＰコードＲＮＡレプリコン、（ｉｖ）全長ＲＳＶ Ｆ−タンパク質の種々の組み合わせをマウスに与えた。１３群（合計で）に与えた：

図１６における結果は、Ｆ特異的ＩｇＧ応答が、単なる共送達ではなく、上記リポソーム中の被包を必要としたことを示す（群Ｃと群Ｄを比較のこと）。群Ｋ、群Ｌおよび群Ｍの比較から、上記ＲＮＡが、共送達したタンパク質に対してアジュバント効果を提供したことが示され、この効果は、複製性および非複製性ＲＮＡの両方で認められた。

（様々なマウス系統におけるＲＳＶ免疫原性）
レプリコン「ｖＡ１４２」は、ＲＳＶの全長野生型表面融合（Ｆ）糖タンパク質をコードするが、その融合ペプチドは欠失しており、その３’末端は、リボザイム媒介性切断によって形成される。これを、３種の異なるマウス系統において試験した。

ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目および２２日目に、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた。動物を、８つの試験群（１群あたり５匹の動物）およびナイーブコントロール（２匹の動物）へと分けた：
群１には、裸のレプリコン（１μｇ）を与えた。
群２には、４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ Ｃｈｏｌ、２％ ＰＥＧ結合体化ＤＭＧを有するリポソーム「ＲＶ０１（３７）」中で送達した１μｇ レプリコンを与えた。
群３には、群２と同じものを与えたが、０．１μｇ ＲＮＡであった。
群４には、「ＲＶ１７（１０）」リポソーム（４０％ ＲＶ１７（上記を参照のこと）、１０％ ＤＳＰＣ、４９．５％ コレステロール、０．５％ ＰＥＧ−ＤＭＧ）中において１μｇ レプリコンを与えた。
群５には、「ＲＶ０５（１１）」リポソーム（４０％ ＲＶ０７脂質、３０％ １８：２ ＰＥ（ＤＬｏＰＥ）、２８％ コレステロール、２％ ＰＥＧ−ＤＭＧ）中において１μｇ レプリコンを与えた。
群６には、「ＲＶ１７（１０）」リポソーム中において０．１μｇ レプリコンを与えた。
群７には、水酸化アルミニウムをアジュバント添加した５μｇ ＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質を与えた。
群８は、ナイーブコントロール（２匹の動物）であった。

血清を、１４日目、３５日目および４９日目に、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的血清ＩｇＧ ＧＭＴは、以下であった：

３５日目において、Ｆ特異的ＩｇＧ１力価およびＩｇＧ２ａ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：

３５日目および４９日目のＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった（データは、２〜５匹のマウスプール（１群あたり１プール）の６０％ プラーク減少中和力価である）：

４９日目に、Ｔ細胞分析のために脾臓を採取した。平均の正味Ｆ特異的サイトカイン陽性Ｔ細胞頻度（ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋）は、以下のとおりであった（これは、統計的に有意にゼロを上回った（ＣＤ４＋についてはＲＳＶペプチドであるＦ５１−６６、Ｆ１６４−１７８、Ｆ３０９−３２３、またはＣＤ８＋についてはペプチドＦ８５−９３およびＦ２４９−２５８に対して特異的）数字のみを示す）：

Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、同じように免疫化したが、第９の群には、ＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質（融合ペプチド欠失）を発現するＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）を与えた。

血清を、１４日目、３５日目および４９日目に、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下であった：

３５日目において、Ｆ特異的ＩｇＧ１力価およびＩｇＧ２ａ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：

３５日目および４９日目のＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった（データは、２〜５匹のマウスプール（１群あたり１プール）の６０％ プラーク減少中和力価である）：

４９日目に、Ｔ細胞分析のために脾臓を採取した。平均の正味Ｆ特異的サイトカイン陽性Ｔ細胞頻度（ＣＤ８＋）は、以下のとおりであった（これは、統計的に有意にゼロを上回った（ＲＳＶペプチドＦ８５−９３およびＦ２４９−２５８に対して特異的）数字のみを示す）：

Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスの９群を、同じようにして免疫化した。Ｆ特異的ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下であった：

３５日目において、Ｆ特異的ＩｇＧ１力価およびＩｇＧ２ａ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：

３５日目および４９日目のＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった：

従って、３種の異なる脂質（ＲＶ０１、ＲＶ０５、ＲＶ１７；ｐＫａは、５．８、５．８５、６．１）を、３種の異なる近交系のマウス系統において試験した。３種の系統すべてに関して、ＲＶ０１がＲＶ１７より有効であった；ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ３Ｈ系統に関しては、ＲＶ０５は、ＲＶ０１およびＲＶ１７よりも有効性が低かったが、Ｂ６系統においては、より有効であった。しかし、すべての場合において、上記リポソームは、並行して試験した２種のカチオン性ナノエマルジョンより有効であった。

（ＣＭＶ免疫原性）
ＤＬｉｎＤＭＡをカチオン性脂質として有するＲＶ０１リポソームを使用して、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質をコードするＲＮＡレプリコンを送達した。「ｖＡ１６０」レプリコンは、全長糖タンパク質ＨおよびＬ（ｇＨ／ｇＬ）をコードするのに対して、「ｖＡ３２２」レプリコンは、可溶性形態（ｇＨｓｏｌ／ｇＬ）をコードする。上記２種のタンパク質は、単一のレプリコン中の別個のサブゲノムプロモーターの制御下にある；２種の別個のベクター（１つは、ｇＨをコードし、１つは、ｇＬをコードする）の共投与は、良好な結果を与えなかった。

ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）に、０日目、２１日目および４２日目に、ｇＨ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）、ｇＨｓｏｌ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）およびコントロールとしてＰＢＳを、両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）で与えた。２つの試験群に、リポソーム（４０％ ＤｌｉｎＤＭＡ、１０％ ＤＳＰＣ、４８％ Ｃｈｏｌ、２％ ＰＥＧ−ＤＭＧ；方法（Ｄ）を使用するが、１５０μｇ ＲＮＡバッチサイズを用いて作製した）中に処方した、１μｇの上記ｖＡ１６０レプリコンもしくはｖＡ３２２レプリコンを与えた。

上記ｖＡ１６０リポソームは、Ｚａｖ直径 １６８ｎｍ、ｐｄＩ ０．１４４、および８７．４％ 被包を有した。上記ｖＡ３２２リポソームは、Ｚａｖ直径 １６２ｎｍ、ｐｄＩ ０．１３１、および９０％ 被包を有した。

上記レプリコンは、単一のベクターから２種のタンパク質を発現できた。

６３日目（３ｗｐ３）に、血清を、免疫学的分析のために集めた。ＣＭＶ中和力価（コントロールと比較して、陽性ウイルスフォーカス／ウェルの数において５０％減少を生じる血清希釈の逆数）は、以下のとおりであった：

全長もしくは可溶性形態の上記ＣＭＶ ｇＨ／ｇＬ複合体のいずれかを発現するＲＮＡは、従って、上皮細胞でアッセイされる場合、高い力価の中和抗体を誘発した。上記リポソーム被包ＲＮＡによって誘発された平均力価は、その対応するＶＲＰについてのものと少なくとも同程度に高かった。

反復実験から、上記レプリコンが、単一のベクターから２種のタンパク質を発現できることが確認された。上記ＲＮＡレプリコンは、ＶＲＰでの３ｗｐ３力価 ５５１６と比較して、３ｗｐ３力価 １１４５７を与えた。

さらなる実験は、ｖＡ１６０に加えて、異なるレプリコンを使用した。ｖＡ５２６レプリコンは、３種のサブゲノムプロモーターの制御下でＣＭＶペンタマー複合体（ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ−１３１）を発現する：第１のものは、ｇＨの発現を駆動する；第２のものは、ｇＬの発現を駆動する；第３のものは、ＵＬ１２８−２Ａ−ＵＬ１３０−２Ａ−ＵＬ１３１ポリプロテインの発現を駆動する（これは、上記３種のＵＬ遺伝子の間に２つの２Ａ切断部位を含む）。ｖＡ５２７レプリコンは、３種のサブゲノムプロモーターおよび２つのＩＲＥＳを介して、ＣＭＶペンタマー複合体を発現する：第１のサブゲノムプロモーターは、ｇＨの発現を駆動する；第２のサブゲノムプロモーターは、ｇＬの発現を駆動する；第３のサブゲノムプロモーターは、ＵＬ１２８の発現を駆動する；ＵＬ１３０は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳの制御下にある；ＵＬ１３１は、ＥＶ７１ ＩＲＥＳの制御下にある。これら３種のレプリコンを、リポソーム（方法（Ｈ），１５０μｇ バッチサイズを用いた）によって、もしくはＶＲＰによって送達した。

ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹の動物の１０群）に、０日目、２１日目および４２日目に、以下を両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）で与えた：
群１ ｇＨ ＦＬ／ｇＬを発現するＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）
群２ ペンタマー、２Ａ ＶＲＰ（１×１０^５ ＩＵ）
群３ ペンタマー、２Ａ ＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）
群４ ペンタマー、ＩＲＥＳ ＶＲＰ（１×１０^５ ＩＵ）
群５ リポソーム中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ１６０（１μｇ）
群６ リポソーム中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ５２６（１μｇ）
群７ リポソーム中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ５２７（１μｇ）
群８ カチオン性ナノエマルジョン中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ１６０（１μｇ）
群９ カチオン性ナノエマルジョン中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ５２６（１μｇ）
群１０ カチオン性ナノエマルジョン中に処方された自己複製ＲＮＡ ｖＡ５２７（１μｇ）。

血清を、２１日目（３ｗｐ１）、４２日目（３ｗｐ２）および６３日目（３ｗｐ３）に、免疫学的分析のために集めた。

２１日目、４２日目および６３日目のＣＭＶ血清中和力価は、以下であった：

従って、自己複製ＲＮＡは、単一のベクターから複数の抗原を発現するために、および強力でかつ特異的な免疫応答を惹起するために使用され得る。上記レプリコンは、５種の抗原（ＣＭＶペンタマー複合体（ｇＨ−ｇＬ−ＵＬ１２８−ＵＬ１３０−ＵＬ−１３１））を発現し得、強力な免疫応答を惹起し得る。リポソーム中で送達された自己複製ＲＮＡは、上皮細胞でアッセイされる場合、すべてのアッセイ時点（３ｗｐ１、３ｗｐ２、および３ｗｐ３）において高い力価の中和抗体を誘発できた。これら応答は、その対応するＶＲＰおよびカチオン性ナノエマルジョンより優れていた。

（送達容積）
流体力学的送達は、細胞膜の物理的障壁（大きい、膜不透過性の化合物が細胞に入らないようにする）を克服するための大きな容積の溶液の迅速な注射によって生じた力を使用する。この現象は、ＤＮＡワクチンの細胞内送達に有用であることが以前示された。

筋肉内注射にとって代表的なマウス送達容積は、後肢に５０μｌである。これは、マウスの脚の筋肉に関して、比較的大きな容積である。対照的に、約０．５ｍｌというヒト筋肉内用量は、比較的小さい。マウスにおける免疫原性が容積依存性であれば、上記レプリコンワクチンの効力は、少なくとも一部は、流体力に因り得る。このことは、ヒトおよびより大きな動物において同じワクチンを使用することを促進しない。

上記ｖＡ３１７レプリコンを、０日目および２１日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）に、両側の筋肉内ワクチン接種（５もしくは５０／脚）によって送達した：
群１には、裸のレプリコンを５０μＬ／脚において０．２μｇ与えた。
群２には、裸のレプリコンを５μＬ／脚において０．２μｇ与えた。
群３には、リポソーム処方レプリコン（０．２μｇ，５０μＬ／脚）を与えた。
群４には、リポソーム処方レプリコン（０．２μｇ，５μＬ／脚）を与えた。

１４日目および３５日目に、血清を、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的血清ＩｇＧ ＧＭＴは、以下であった：

従って、上記処方されたレプリコンの免疫原性は、送達容積に従って変動しなかった。従って、このことは、これらＲＮＡワクチンが、それらの効力に関して流体力学的送達に依存しないことを示す。

（発現動態）
ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｌｕｃ）を発現する自己複製ＲＮＡレプリコン（「ｖＡ３１１」）を、注射後のタンパク質発現の動態を研究するために使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり５匹の動物）に、０日目に、以下の両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えた：
群１ エレクトロポレーションを使用して送達される、ルシフェラーゼを発現するＤＮＡ（１０μｇ）
群２ リポソーム中に処方された自己複製ＲＮＡ（１μｇ）
群３ カチオン性ナノエマルジョンとともに処方された自己複製ＲＮＡ（１μｇ）
群４ カチオン性ナノエマルジョンとともに処方された自己複製ＲＮＡ（１μｇ）
群５ ルシフェラーゼを発現するＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ）。

ワクチン接種の前に、マウスを除毛した。マウスに麻酔をかけ（酸素中２％ イソフルラン）、まず、電気カミソリで除毛し、次いで、Ｎａｉｒで化学的に除毛した。次いで、３日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目、４９日目、６３日目および７０日目に、生体発光データを、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ ２００画像化システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得した。画像化する５分前に、マウスに、８ｍｇ／ｋｇのルシフェリン溶液を腹腔内注射した。次いで、動物に麻酔をかけ、上記画像化システムへと移した。生体発光シグナルを冷却ＣＣＤカメラで測定する際に、画像取得時間を一定に維持した。

視覚的な点から、ルシフェラーゼ発現細胞は、ＲＮＡ注射の部位において主に保持されていることが認められた。大腿四頭筋（ｑｕａｄｓ）を除去した後に画像化した動物は、何らシグナルを示さなかった。

定量的な点から、ルシフェラーゼ発現を、７０日間の期間にわたる平均輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ^２／ｓｒ）として測定し、結果は、上記５群に関して以下のとおりであった：

上記カチオン性ナノエマルジョンとともに処方した自己複製ＲＮＡは、３日目に測定可能な生体発光を示した。これは、７日目にピークに達し、次いで、２８日目〜３５日目までにバックグラウンドレベルへと低下した。リポソーム中で処方された場合、上記ＲＮＡは、３日目に、測定可能な生体発光を示した。これは、７日目にピークに達し、６３日目までにはバックグラウンドレベルへと低下した。ＶＲＰを使用して送達されたＲＮＡは、上記処方されたＲＮＡと比較した場合、２１日目に増強された生体発光を示したが、発現は、２８日目までにバックグラウンドレベルへと低下した。エレクトロポレーションしたＤＮＡは、測定したすべての時点において最高レベルの生体発光を示し、生体発光のレベルは、実験の７０日間内でバックグラウンドレベルへは低下しなかった。

（送達経路）
ＨＩＶ ｇｐ１４０をコードするリポソーム被包ＲＮＡを、マウスの筋肉内、皮内、もしくは皮下に送達した。３つの経路すべてが、ＨＩＶ特異的抗体の高い血清ＩｇＧレベルをもたらした（図１５）、このレベルは、エレクトロポレーションされた筋肉内ＤＮＡに応じて認められた力価を超えていた。

（コットンラット）
マウスの代わりに、コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｉｓ）において研究を行った。１μｇ用量において、リポソーム被包は、裸のＲＮＡと比較して、Ｆ特異的ＩｇＧ力価を８．３倍に増大させ、ＰＲＮＴ力価を９．５倍に増大させた。上記抗体応答の程度は、５×１０^６ ＩＵ ＶＲＰによって誘導されるものに等しかった。裸のＲＮＡおよびリポソーム被包ＲＮＡはともに、ＲＳＶチャレンジ（１×１０^５ プラーク形成単位）から上記コットンラットを防御することができ、肺のウイルス負荷を少なくとも３．５対数低下させた。被包は、低下を約２倍に増大させた。

コットンラットにおけるさらなる研究は、４種の異なるレプリコンを使用した：ｖＡ３１７は、全長ＲＳＶ−Ｆを発現する；ｖＡ３１８は、短縮型（膜貫通および細胞質テールが除去された）ＲＳＶ−Ｆを発現する；ｖＡ１４２は、その融合ペプチドが欠失した、ＲＳＶ−Ｆを発現する；ｖＡ１４０は、やはり上記ペプチドなしで上記短縮型ＲＳＶ−Ｆを発現する。コットンラット（１群あたり４〜８匹の動物）に、０日目および２１日目に、方法（Ｄ）によるが、１５０μｇ ＲＮＡバッチサイズで作製されたリポソーム中に処方された、２種の用量（１．０μｇおよび０．１μｇ）における、上記４種の異なるレプリコンの筋肉内ワクチン接種（１本の脚において１００μＬ）を与えた。コントロール群に、アラム（ａｌｕｍ）をアジュバント添加したＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）（８匹の動物／群）、全長ＲＳＶ−Ｆを発現するＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ， ８匹の動物／群）、もしくはナイーブコントロール（４匹の動物／群）を与えた。０日目、２１日目および３４日目に、血清を、抗体分析のために集めた。

２１日目および３４日目のＦ特異的血清ＩｇＧ力価およびＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下であった：

この研究において評価した４種のレプリコン（ｖＡ３１７、ｖＡ３１８、ｖＡ１４２、ｖＡ１４０）はすべて、リポソームによって送達される場合に、コットンラットにおいて免疫原性であったが、血清中和力価は、アジュバント添加したタンパク質ワクチンによってもしくはＶＲＰによって誘導されたものの少なくとも１／１０に低下した。上記リポソーム／ＲＮＡワクチンは、１回目のワクチン接種の後に、血清Ｆ特異的ＩｇＧおよびＲＳＶ中和抗体を誘発し、２回目のワクチン接種は、上記応答を効率的にブーストした。１μｇ レプリコンでの上記２回目のワクチン接種の後のＦ特異的ＩｇＧ力価は、０．１μｇ レプリコンでの上記第２回目のワクチン接種後より２〜３倍高かった。上記４種のレプリコンは、同等の抗体力価を誘発した。このことは、全長および短縮型のＲＳＶ−Ｆ（各々、融合ペプチドありもしくはなし）が、コットンラットにおいて同様に免疫原性であることを示唆する。

コットンラットにおけるさらなる研究は、上記ｖＡ３１７、ｖＡ３１８およびｖＡ１４２レプリコンを再び使用した。コットンラット（１群あたり２〜８匹の動物）に、０日目および２１日目に、方法（Ｄ）によるが、１５０μｇ ＲＮＡバッチサイズで作製したＲＶ０１リポソーム中に被包した上記レプリコン（０．１μｇもしくは１μｇ）での筋肉内ワクチン接種（１本の脚において１００μＬ）を与えた。コントロール群に、アラムでアジュバント添加したＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）もしくは全長ＲＳＶ−Ｆを発現するＶＲＰ（１×１０^６ ＩＵ，８匹の動物／群）を与えた。これらの動物すべてに、アラムでアジュバント添加したＲＳＶ−Ｆサブユニットタンパク質ワクチン（５μｇ）での３回目のワクチン接種（５６日目）を与えた。さらに、ナイーブコントロールが存在した（４匹の動物／群）。さらに、追加の群に、０日目および５６日目に、リポソーム中の１μｇ ｖＡ３１７ ＲＮＡでの両側の筋肉内ワクチン接種（５０μＬ／脚）を与えたが、上記サブユニットタンパク質ワクチンでの３回目のワクチン接種を与えなかった。

０日目、２１日目、３５日目、５６日目、７０日目に、加えて、追加の群に関しては１４日目、２８日目および４２日目に、血清を、抗体分析のために集めた。Ｆ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）は、以下のとおりであった：

血清中和力価は、以下のとおりであった（１群あたり３〜４匹の動物の２プールに関して、６０％ ＲＳＶ中和力価、１群あたりこれら２プールのＧＭＴ）：

上記追加の群に関する血清力価および中和力価は、以下のとおりであった：

従って、上記レプリコンは、コットンラットにおいて免疫原性であると確認され、上記１回目のワクチン接種後に血清Ｆ特異的ＩｇＧおよびＲＳＶ中和抗体を誘発する。２回目のワクチン接種は、上記応答を効率的にブーストした。１．０μｇ レプリコンでの上記２回目のワクチン接種後のＦ特異的ＩｇＧ力価は、０．１μｇ レプリコンでの上記２回目のワクチン接種後より１．５〜４倍高かった。

上記３回目のワクチン接種（５６日目にタンパク質）は、Ｆトリマーサブユニット＋アラムを以前にワクチン接種したラットにおいて力価をブーストしなかったが、レプリコンを以前にワクチン接種したコットンラットにおいて大きな力価のブーストを提供した。大部分の場合において、２回のレプリコンワクチン接種、続いて、タンパク質ブーストの後の上記ＲＳＶ血清中和力価は、２回もしくは３回の連続的なタンパク質ワクチン接種によって誘導された力価に等しいかもしくはこれより大きかった。

この研究はまた、１．０μｇ ｖＡ３１７への抗体応答の動態を評価した。１回のワクチン接種によって誘導されるＦ特異的血清ＩｇＧおよびＲＳＶ中和力価は、２１日目あたりにそのピークに達し、少なくとも５６日目まで維持された（Ｆ特異的ＩｇＧ力価において５０〜７０％低下，ＲＳＶ中和力価においてはほとんど変化なし）。同族の２回目のワクチン接種を、５６日目にこれらの動物に与えたところ、上記２回目のワクチン接種が２１日目に投与された場合に達成されたものに少なくとも等しいレベルへと抗体力価をブーストした。

さらなる実験は、ウイルスチャレンジを伴った。上記ｖＡ３６８レプリコンは、ＲＳＶの全長野生型表面融合糖タンパク質（融合ペプチドは欠失されており、発現は、上記ＥＶ７１ ＩＲＥＳによって駆動される）をコードする。コットンラット（７匹／群）に、０日目および２１日目に、方法（Ｈ）、１７５μｇ ＲＮＡバッチサイズにより調製されたリポソーム中のｖＡ３６８、もしくは同じレプリコンを有するＶＲＰでの筋肉内ワクチン接種（１００μＬ／脚）を与えた。コントロール群に、５μｇ アラムアジュバント添加タンパク質を与え、ナイーブコントロール群もまた、含めた。

すべての群に、最終免疫化の４週間後に、１×１０^６ ＰＦＵ ＲＳＶでの鼻内チャレンジ（ｉ．ｎ．）を与えた。０日目、２１日目、３５日目に、血清を、抗体分析のために集めた。ウイルス肺力価を、チャレンジの５日後、測定した。結果は以下のとおりであった：

従って、上記ＲＮＡワクチンは、非ワクチン接種コントロールコットンラットにおける約１０^６ ＰＦＵ／ｇから、ワクチン接種したコットンラットにおける１０^３ ＰＦＵ／ｇ未満へと、３対数を超えて、上記肺ウイルス負荷を低下させた。

（大型哺乳動物研究）
大型動物研究を、ウシにおいて行った。仔ウシ（４〜６週齢、約６０〜８０ｋｇ、５頭／群）を、０日目、２１日目、８６日目および１４６日目に、６６μｇの、全長ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするレプリコンｖＡ３１７で免疫化した。上記レプリコンを、リポソームの中に処方した。ＰＢＳ単独を、陰性コントロールとして使用し、認可されたワクチンを陽性コントロールとして使用した（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅの「Ｔｒｉａｎｇｌｅ ４」，死滅ウイルスを含む）。すべての仔ウシに、１４６日目に、ＭＦ５９エマルジョンをアジュバント添加した１５μｇ Ｆタンパク質を与えた。１頭のウシに、８６日目に、Ｔｒｉａｎｇｌｅ ４の代わりに間違ったワクチンで誤ってワクチン接種してしまったので、そのデータは、１００日目から排除した。

上記ＲＮＡワクチンは、ヒトＲＳＶ Ｆをコードしたのに対して、上記「Ｔｒｉａｎｇｌｅ ４」ワクチンは、ウシＲＳＶ Ｆを含むが、上記ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＢＲＳＶとＨＲＳＶとの間で高度に保存されている。

上記リポソームを、１．５ｍｇ ＲＮＡバッチサイズを使用したことを除いて、方法（Ｅ）によって作製した。

仔ウシに、２ｍｌの各実験ワクチンを与え、２×１ｍｌとして頸の各側に筋肉内投与した。対照的に、上記「Ｔｒｉａｎｇｌｅ ４」ワクチンを、頸に単一２ｍｌ用量として与えた。

０日目、１４日目、２１日目、３５日目、４２日目、５６日目、６３日目、８６日目、１００日目、１０７日目、１１４日目、１２１日目、１２８日目、１３５日目、１４６日目、１６０日目、１６７日目、１７４日目、１８１日目、１８８日目、１９５日目および２０２日目に、血清を、抗体分析のために集めた。個々の動物が検出限界未満の力価を有した場合、それには、力価５を割り当てた。

図１４Ａは、最初の６３日間にわたるＦ特異的ＩｇＧ力価を示す。上記ＲＮＡレプリコンは、リポソームを介して上記ウシにおいて免疫原性であったが、それは、上記認可されたワクチンより低い力価を与えた。すべてのワクチン接種したウシは、２回目の用量後にＦ特異的抗体を示した。力価は、上記２回目の用量の２〜６週間後の期間から非常に安定であった（そして上記ＲＮＡワクチンに関しては特に安定であった）。

図１４Ｂは、２１０日間にわたるＦ特異的血清ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）を示す。最大２０２日目までの測定値は、以下のとおりであった：

ＲＳＶ血清中和抗体力価は、以下のとおりであった：

上記２回目のリポソーム用量に使用した物質は、新たに調製せず、同じロットのＲＮＡは、マウス免疫原性研究において効力の低下を示した。従って、上記ワクチンは、新鮮な物質をすべてのワクチン接種のために使用した場合に、より免疫原性であった可能性がある。

補体とともにアッセイされる場合、中和抗体は、すべてのワクチン接種したウシにおいて検出された。このアッセイにおいて、すべてのワクチン接種した仔ウシは、上記２回目のＲＮＡワクチン接種後に良好な中和抗体力価を有した。さらに、上記ＲＮＡワクチンは、上記２回目のワクチン接種後に数頭の仔ウシにおいて、および上記第３回目の後にすべての仔ウシにおいて検出されたＦ特異的血清ＩｇＧ力価を誘発した。

ＭＦ５９アジュバント添加したＲＳＶ−Ｆは、以前にワクチン接種したすべての仔ウシにおいてＩｇＧ応答をブーストでき、ＲＮＡで以前にワクチン接種された仔ウシの補体非依存性中和力価をブーストできた。

大型動物におけるＲＮＡワクチンの構想の証明は、小動物モデルから大型動物およびヒトへと移行する場合に以前に観察された、ＤＮＡベースのワクチンでの効力の喪失を踏まえると、特に重要である。ウシＤＮＡワクチンに代表的な用量は、０．５〜１ｍｇ［４７，４８］であるので、免疫応答がわずか６６μｇのＲＮＡで誘導されたことは、非常に有望である。

本発明は、例示によって記載されてきたに過ぎず、本発明の範囲および趣旨内に留まりながら、改変が行われ得ることは、理解される。

表１：有用なリン脂質
ＤＤＰＣ １，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＡ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＥＰＣ １，２−エルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＥＰＥ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＥＰＧ １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＯＰＣ １，２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＡ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＬＰＣ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＬＰＥ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＬＰＧ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＬＰＳ １，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＭＧ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＭＰＡ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＭＰＣ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＭＰＥ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＧ １，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＭＰＳ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＯＰＡ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＯＰＣ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＧ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＯＰＳ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰＰＡ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＰＰＣ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＰＰＥ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＧ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＰＰＳ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＤＰｙＰＥ １，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＳＰＡ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート
ＤＳＰＣ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＤＳＰＥ １，２−ジステアロイル（Ｄｉｏｓｔｅａｒｐｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＤＳＰＧ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール．．．）
ＤＳＰＳ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルセリン
ＥＰＣ 卵−ＰＣ
ＨＥＰＣ 水素化卵ＰＣ
ＨＳＰＣ 高純度水素化ダイズＰＣ
ＨＳＰＣ 水素化ダイズＰＣ
ＬＹＳＯＰＣ ＭＹＲＩＳＴＩＣ １−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ ＰＡＬＭＩＴＩＣ １−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＬＹＳＯＰＣ ＳＴＥＡＲＩＣ １−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ミルクスフィンゴミエリンＭＰＰＣ １−ミリストイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ ３−ホスファチジルコリン
ＭＳＰＣ １−ミリストイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＭＰＣ １−パルミトイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ １−パルミトイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＥ １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン
ＰＯＰＧ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３［ホスファチジル−ｒａｃ−（１−グリセロール）．．．］
ＰＳＰＣ １−パルミトイル，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＭＰＣ １−ステアロイル，２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＯＰＣ １−ステアロイル，２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン
ＳＰＰＣ １−ステアロイル，２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン

Claims (12)

1. 脊椎動物細胞へＲＮＡをインビボで送達するための非ビリオン粒子であって、ここで、
   （ａ）該粒子は、リポソームであり、免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を被包している送達物質を含み、
   （ｂ）該ＲＮＡは、５’キャップ以外に改変されたヌクレオチドを含まず、
   該免疫原は、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る、
   非ビリオン粒子。
2. 脊椎動物細胞へＲＮＡをインビボで送達するための非ビリオン粒子を含む組成物であって、ここで、
   （ａ）該粒子は、リポソームであり、免疫原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を被包している送達物質を含み、
   （ｂ）該ＲＮＡは、５’キャップ以外に改変されたヌクレオチドを含まず、
   該免疫原は、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る、
   組成物。
3. 前記リポソームが、カチオン性頭部を有する脂質を含む、請求項１に記載の粒子または請求項２に記載の組成物。
4. 前記リポソームが、両性イオン性頭部を有する脂質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の粒子または組成物。
5. 前記リポソームが、５０ｎｍ〜２２０ｎｍの範囲の直径を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の粒子または組成物。
6. 前記自己複製ＲＮＡ分子が、
   （ｉ）該自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および
   （ｉｉ）免疫原
   をコードする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の粒子または組成物。
7. 前記ＲＮＡ分子が、２個のオープンリーディングフレームを有し、該２個のオープンリーディングフレームの第１のものが、アルファウイルスレプリカーゼをコードし、該２個のオープンリーディングフレームの第２のものが、前記免疫原をコードする、請求項６に記載の粒子または組成物。
8. 前記ＲＮＡ分子が、５０００〜２５０００ヌクレオチド長である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の粒子または組成物。
9. 前記免疫原が、ＲＳウイルス糖タンパク質Ｆに対してインビボで免疫応答を誘発し得る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の粒子または組成物。
10. 請求項１および３〜８のいずれか一項に記載の粒子を含むかまたは請求項２に記載の組成物を含む、薬学的組成物。
11. 脊椎動物において防御免疫応答を惹起するための医薬の製造における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の粒子もしくは組成物、または請求項１０に記載の薬学的組成物の使用。
12. 脊椎動物において防御免疫応答を惹起するために使用される、請求項１０に記載の薬学的組成物。