BR112013000392A2 - partículas de distribuição semelhante a vírion para moléculas de rna autorreplicantes - Google Patents

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Abstract

PARTÍCULA DE DISTRIBUIÇÃO SEMELHANTE A VÍRION PARA MOLÉCULAS DE RNA AUTORREPLICANTES, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO A MESMA E SEU USO. A imunização por ácidos nucleicos é obtida pela distribuição de um RNA autorreplicante encapsulado em uma pequena partícula. O RNA codifica um imunógeno de interesse, e a partícula pode distribuir esse RNA pela mímica da função de distribuição de um vírus natural de RNA. Assim, a invenção provê uma partícula não vírion para distribuição in vivo de RNA a uma célula de vertebrados, em que a partícula compreende um material de distribuição que encapsula uma molécula de RNA autorreplicante que codifica um imunó-geno. Essas partículas são úteis como componentes em composições farmacêuticas para imunização de indivíduos contra várias doenças.

Description

PARTÍCULA DE DISTRIBUIÇÃO SEMELHANTE A VÍRION PARA MOLÉCULAS DE RNA AUTORREPLICANTES, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO A MESMA E SEU USO
[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório US 61/361.828 (depositado em 6 de julho de 2010), cujo conteúdo é incorporado neste documento pela referência para todos os fins.
CAMPO DE TÉCNICO
[002] A invenção está no campo de distribuição não viral de RNAs autorreplicantes para imunização.
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
[003] A distribuição de ácidos nucleicos para a imunização de animais foi uma meta por diversos anos. Várias abordagens foram testadas, incluindo o uso de DNA ou RNA, de veículos de distribuição viral ou não viral (ou mesmo nenhum veículo de distribuição, em uma vacina "nua"), de vetores que se replicam ou não, ou de vetores virais ou não virais.
[004] Permanece a necessidade de vacinas de ácido nucleico avançadas e melhoradas e, em particular, de melhores modos de distribuição de vacinas de ácido nucleico.
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO
[005] De acordo com a invenção, a imunização de ácido nucleico é obtida pela distribuição de um RNA autorreplicante encapsulado e/ou adsorvido a uma pequena partícula. O RNA codifica um imunógeno de interesse, e a partícula pode distribuir esse RNA pela mímica da função de distribuição de um vírus natural.
[006] Assim, a invenção provê uma partícula não vírion para distribuição in vivo de RNA a uma célula de vertebrados, em que a partícula compreende um material de distribuição que encapsula uma molécula de RNA autorreplicante que codifica um imunógeno. A invenção também provê uma partícula não vírion para distribuição in vivo de RNA a uma célula de vertebrados, em que a partícula compreende um material de distribuição ao qual é adsorvida uma molécula de RNA autorreplicante que codifica um imunógeno. Estas partículas são úteis como componentes em composições farmacêuticas para imunização de indivíduos contra várias doenças. A combinação da utilização de uma partícula não vírion para distribuir um RNA autorreplicante provê um modo de provocar uma resposta imune forte específica contra o imunógeno, ao mesmo tempo em que distribui apenas uma baixa dose de RNA. Ademais, estas partículas podem facilmente ser fabricadas em escala comercial. A partícula
[007] Partículas da invenção são partículas não vírion, ou seja, elas não são um vírion. Portanto, a partícula não compreende um capsídeo proteico. Ao evitar a necessidade de criar uma partícula de capsídeo, a invenção não requer uma linhagem celular de empacotamento, permitindo assim uma extrapolação mais fácil para a produção comercial e minimizando o risco de que vírus infecciosos perigosos sejam produzidos inadvertidamente.
[008] Em vez de encapsular o RNA em um vírion, as partículas da invenção são formadas de um material de distribuição. Vários materiais são adequados para a formação de partículas que possam distribuir RNA a uma célula de vertebrados in vivo. Dois materiais de distribuição de interesse particular são (i) lipídeos anfifílicos que podem formar lipossomos e (ii) polímeros atóxicos e biodegradáveis, que podem formar micropartículas. Se a distribuição for por lipossomos, o RNA deve ser encapsulado; se a distribuição for por micropartículas poliméricas, o RNA pode ser encapsulado ou adsorvido. Um terceiro material de distribuição de interesse é o produto de reação em partículas de um polímero, um reticulador, um RNA e um monômero carregado.
[009] Assim, uma modalidade de uma partícula da invenção compreende um lipossomo que encapsula uma molécula de RNA autorreplicante que codifica um imunógeno, enquanto outra modalidade compreende uma micropartícula polimérica que encapsula uma molécula de RNA autorreplicante que codifica um imunógeno, e outra modalidade compreende uma micropartícula polimérica na qual é adsorvida uma molécula de RNA autorreplicante que codifica um imunógeno. Em todos os três casos, as partículas preferivelmente são consideravelmente esféricas. Em uma quarta modalidade, uma partícula da invenção compreende o produto de reação em partículas de um polímero, um reticulador, molécula de RNA autorreplicantes que codifica um imunógeno e um monômero carregado. Estas partículas são formadas em moldes e, portanto, podem ser criadas com qualquer formato incluindo, mas não está limitada a, esferas.
[0010] O RNA pode ser encapsulado nas partículas (particularmente se a partícula for um lipossomo). Isso significa que o RNA dentro das partículas (como em um vírus natural) está separado de qualquer meio externo pelo material de distribuição, e foi demonstrado que o encapsulamento protege o RNA da digestão por RNase. O encapsulamento pode assumir várias formas. Por exemplo, em algumas modalidades (como em um lipossomo unilamelar) o material de distribuição forma uma camada externa em torno de um núcleo aquoso contendo RNA, enquanto em outras modalidades (por exemplo, em partículas moldadas) o material de distribuição constitui uma matriz na qual o RNA está imerso. As partículas podem incluir algum RNA externo (por exemplo, na superfície das partículas), mas pelo menos metade do RNA (e idealmente todo ele) fica encapsulado. O encapsulamento em lipossomos é diferente, por exemplo, dos complexos de lipídeo/RNA divulgados na referência 1.
[0011] O RNA pode ser adsorvido às partículas (particularmente se a partícula for uma micropartícula polimérica). Isso significa que o RNA não está separado de qualquer meio externo pelo material de distribuição, ao contrário do genoma de RNA de um vírus natural. As partículas podem incluir algum RNA encapsulado (por exemplo, no núcleo de uma partícula), mas pelo menos metade do RNA (e idealmente todo ele) é adsorvida. Lipossomos
[0012] Vários lipídeos anfifílicos podem formar bicamadas em meio aquoso para encapsular um núcleo aquoso contendo RNA como um lipossomo. Estes lipídeos podem ter um grupo de cabeça hidrofílica zwiteriônica, catiônica ou aniônica. Formação de lipossomos a partir de fosfolipídeos aniônicos data da década de 1960 e lipídeos que formam lipossomo catiônico foram estudados desde a década de 1990.
Alguns fosfolipídeos são aniônicos, enquanto outros são zwiteriônicos e outros são catiônicos. Classes adequadas de fosfolipídeos incluem, mas não está limitada a, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas e fosfatidil-gliceróis e alguns fosfolipídeos úteis estão listados na Tabela 1. Lipídeos catiônicos úteis incluem, mas não está limitado a, dioleoíla trimetilamônio propano (DOTAP), 1,2-distearilóxi- N,N-dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleilóxi-N,N- dimetil-3-aminopropano (DODMA), 1,2-dilinoleilóxi-N,N- dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinolenilóxi-N,N- dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Lipídeos zwiteriônicos incluem, mas não está limitado a, lipídeos zwiteriônicos de acila e lipídeos zwiteriônicos de éter. São exemplos de lipídeos zwiteriônicos úteis DPPC, DOPC e dodecilfosfocolina. Os lipídeos podem ser saturados ou insaturados. O uso de pelo menos um lipídeo insaturado para a preparação de lipossomos é preferencial. Se um lipídeo insaturado tem duas caudas, ambas as caudas podem ser insaturadas, ou ele pode ter uma cauda saturada e uma cauda insaturada.
[0013] Partículas lipossomais da invenção podem ser formadas a partir de um único lipídeo ou a partir de uma mistura de lipídeos. Uma mistura pode compreender (i) uma mistura de lipídeos aniônicos, (ii) uma mistura de lipídeos catiônicos, (iii) uma mistura de lipídeos zwiteriônicos, (iv) uma mistura de lipídeos aniônicos e lipídeos catiônicos, (v) uma mistura de lipídeos aniônicos e lipídeos zwiteriônicos (vi) uma mistura de lipídeos zwiteriônicos e lipídeos catiônicos, ou (vii) uma mistura de lipídeos aniônicos, lipídeos catiônicos e lipídeos zwiteriônicos. Da mesma forma, uma mistura pode compreender tanto lipídeos saturados como insaturados. Por exemplo, uma mistura pode compreender DSPC (zwiteriônico saturado), DlinDMA (catiônico, insaturado), e/ou DMG (aniônico, saturado). Se for utilizada uma mistura de lipídeos, nem todos os lipídeos componentes da mistura precisam ser anfifílicos, por exemplo, um ou mais lipídeos anfifílicos podem ser misturados com colesterol.
[0014] A parte hidrofílica de um lipídeo pode ser PEGuilada (ou seja, modificada por ligação covalente de um polietileno glicol). Esta modificação pode aumentar a estabilidade e evitar a adsorção não específica dos lipossomos. Por exemplo, os lipídeos podem ser conjugados a PEG usando técnicas tais como aquelas divulgadas nas referências 2 e 3. Vários comprimentos de PEG podem ser usados, por exemplo, entre 0,5-8kDa.
[0015] Uma mistura de DSPC, DlinDMA, PEG-DMG e colesterol é usada nos exemplos.
[0016] Partículas lipossomais geralmente são divididas em três grupos: vesículas multilamelares (MLV); pequenas vesículas unilamelares (SUV); e grandes vesículas unilamelares (LUV). MLVs têm múltiplas bicamadas em cada vesícula, formando vários compartimentos aquosos separados. SUVs e LUVs têm uma única bicamada que encapsula um núcleo aquoso; SUVs tipicamente têm um diâmetro ≤50nm e LUVs têm um diâmetro >50nm. Partículas lipossomais da invenção são idealmente LUVs com diâmetro na faixa de 50-220nm. Para uma composição que compreende uma população de LUVs com diâmetros diferentes: (i) pelo menos 80% por número deve ter diâmetros na faixa de 20-220nm, (ii) o diâmetro médio (Zav, por intensidade) da população está idealmente na faixa de 40-200nm, e/ou (iii) os diâmetros devem ter um índice de polidispersividade <0,2. Espera-se que os complexos de lipossomo/RNA da referência 1 tenham um diâmetro na faixa de 600-800nm e tenham uma alta polidispersividade.
[0017] Técnicas para preparar lipossomos adequados são bem conhecidas na técnica, por exemplo, veja as referências 4 a 6. Um método útil é descrito na referência 7 e envolve a mistura de (i) uma solução etanólica de lipídeos, de (ii) uma solução aquosa de ácido nucleico e de (iii) tampão, seguida pela mistura, equilíbrio, diluição e purificação. Os lipossomos preferidos da invenção podem ser obtidos por este processo de mistura. Micropartículas poliméricas
[0018] Vários polímeros podem formar micropartículas para encapsular ou adsorver RNA de acordo com a invenção. O uso de um polímero consideravelmente atóxico significa que um receptor pode receber com segurança as partículas e o uso de um polímero biodegradável significa que as partículas podem ser metabolizadas após a distribuição para evitar a persistência a longo prazo. Polímeros úteis também são esterilizáveis, para auxiliar na preparação de formulações de grau farmacêutico.
[0019] Polímeros atóxicos e biodegradáveis adequados incluem, mas não está limitado a, poli(α-hidróxi ácidos), ácidos poli-hidróxi butíricos, polilactonas (incluindo policaprolactonas), polidioxanonas,
polivalerolactona, poliortoésteres, polianidridos, policinoacrilatos, policarbonatos derivados de tirosina ou poliéster-amidas, e suas combinações.
[0020] Em algumas modalidades, as micropartículas são formados a partir de poli(α-hidróxi-ácidos), tal como poli(lactídeos) ("PLA"), copolímeros de lactídeo e glicolídeo tal como um poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo) ("PLG") e copolímeros de D,L-lactídeo e caprolactona. Polímeros de PLG úteis incluem aqueles que têm uma razão molar de lactídeo/glicolídeo variando, por exemplo, de 20:80 a 80: 20, por exemplo, 25:75, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 75:25. Polímeros de PLG úteis incluem aqueles com peso molecular entre, por exemplo, 5.000-200.000 Da, por exemplo, entre 10.000-100.000, 20.000-70.000, 30.000-
40.000, 40.000-50.000 Da.
[0021] As micropartículas têm idealmente um diâmetro na faixa de 0,02 µm a 8 µm. Para uma composição que compreende uma população de micropartículas com diâmetros diferentes, pelo menos 80% deve ter diâmetros na faixa de 0,03-7 µm.
[0022] Técnicas para preparar micropartículas adequadas são bem conhecidas na técnica, por exemplo, vejas as referências 6, 8 (em especial o capítulo 7) e 9. Para facilitar a adsorção de RNA, uma micropartícula pode incluir um lipídeo e/ou tensoativo catiônico, por exemplo, como divulgado nas referências 10 & 11.
[0023] As micropartículas da invenção podem ter um potencial zeta entre 40-100 mV.
[0024] Uma vantagem de micropartículas sobre lipossomos é que elas são facilmente liofilizadas para armazenamento estável. Partículas moldadas
[0025] Um terceiro material de distribuição de interesse é o produto de reação em partículas de um polímero, um reticulador, um RNA autorreplicante que codifica um imunógeno e um monômero carregado. Estes quatro componentes podem ser misturados como um líquido, colocados em um molde (por exemplo, compreendendo um perfluorpoliéter) e então curados para formar as partículas de acordo com o formato e dimensões do molde. Detalhes de um método adequado de produção são divulgados na ref. 12. Esses métodos provêem uma nanopartícula de polímero oligomérico reticulado biodegradável.
[0026] Idealmente, as partículas têm a maior dimensão de corte transversal de ≤5 µm. Elas podem ter uma carga global positiva.
[0027] Polímeros adequados incluem, mas não está limitado a: um ácido poli(acrílico); um sulfonato de poli(estireno); uma carboximetilcelulose (CMC); um álcool poli(vinílico); um óxido de poli(etileno); uma poli(vinil pirrolidona); um dextrano; um álcool poli(vinilpirrolidona- co-vinil acetato-co-vinílico). Um polímero preferido é uma poli(vinil pirrolidinona). A quantidade de polímero para formar as partículas pode estar entre 2-75% em peso, por exemplo, 10-60% em peso, 20-60% em peso.
[0028] Reticuladores adequados podem incluir um dissulfeto e/ou cetal. Por exemplo, reticulador pode compreender dimetacrilato de poli(épsilon-caprolactona)-b-
tetraetileno glicol-b-poli(épsilon-capro lactona), dimetacrilato de poli(épsilon-caprolactona)-b-poli(etileno glicol)-b-poli(épsilon-capro lactona), dimatacrilato de ácido poli(lático)-b-tetraetileno glicol-b-ácido poli(lático), dimetacrilato de ácido poli(lático)-b- poli(etileno glicol)-b-ácido poli(lático), dimetacrilato de ácido poli(glicólico)-b-tetraetileno glicol-b-ácido poli(glicólico), dimetacrilato de ácido poli(glicólico)-b- poli(etileno glicol)-b-ácido poli(glicólico), diacrilato de poli(épsilon-caprolactona)-b-tetraetileno glicol-b- poli(épsilon-caprolactona), diacrilto de poli(épsilon- caprolactona)-b-poli(etileno glicol)-b-poli(épsilon- caprolactona), diacrilato de ácido poli(lático)-b- tetraetileno glicol-b-ácido poli(lático), diacrilato de ácido poli(lático)-b-poli(etileno glicol)-b-ácido poli(lático), diacrilato de ácido poli(glicólico)-b- tetraetileno glicol-b-ácido poli(glicólico), diacrilato de ácido poli(glicólico)-b-poli(etileno glicol)-b-ácido poli(glicólico), silano, metacrilatos contendo silício, ou dimetildi(metacriloilóxi-1-etóxi) silano. A quantidade de reticulador para formar as partículas pode estar entre 10- 25% em peso, por exemplo, 10-60% em peso, 20-60% em peso.
[0029] Os monômeros carregados podem ser aniônicos ou catiônicos. Esses incluem, mas não está limitado a: cloreto de [2-(acriloilóxi)etil]trimetil amônio (AETMAC) e o cloridrato metacrilato de 2-aminoetila (AEM-HCl). A quantidade de monômero carregado para formar as partículas pode estar entre 2-75% em peso.
[0030] A quantidade de RNA para formar as partículas pode estar entre 0,25-20% em peso.
[0031] Uma mistura de pré-cura dentro de um molde pode incluir um iniciador. Por exemplo, o molde pode incluir ≤1% em peso de iniciador, ≤0,5% em peso de iniciador, ou ≤0,1% em peso de iniciador. Entre 0,1-0,5% de iniciador é útil. Fotoiniciadores como DEAP e DPT são úteis, por exemplo, para uso com cura por ultravioleta.
[0032] A invenção pode usar alguns dos materiais divulgados na tabela 1 ou nos exemplos 1-15 da referência 12, a não ser que aquele os componentes do siRNA seja substituído nisso por RNAs autorreplicantes como nisto.
O RNA
[0033] Partículas da invenção incluem uma molécula de RNA autorreplicante que (ao contrário do siRNA) codifique um imunógeno. Após a administração in vivo das partículas, o RNA é liberado das partículas e é traduzido dentro de uma célula para prover o imunógeno in situ.
[0034] Ao contrário da referência 13, o RNA em partículas da invenção é autorreplicante. Uma molécula de RNA autorreplicante (replicon) pode, quando distribuída a uma célula de vertebrados mesmo sem quaisquer proteínas, levar à produção de múltiplos RNAs filhos por transcrição a partir de si mesma (através de uma cópia antissentido que ela gera a partir de si mesma). Uma molécula de RNA a autorreplicante é desse modo tipicamente uma molécula de fita-+ que pode ser traduzida diretamente após distribuição a uma célula, e esta tradução provê uma polimerase de RNA RNA-dependente que em seguida produz tanto transcritos antissentido como em sentido a partir do RNA distribuído. Assim, o RNA distribuído leva à produção de múltiplos RNAs filhos. Estes RNAs filhos, assim como transcritos subgenômicos colineares, podem eles mesmos ser traduzidos para prover a expressão in situ de um imunógeno codificado, ou podem ser transcritos para prover mais transcritos com o mesmo sentido do RNA distribuído que são traduzidos para prover a expressão in situ do imunógeno. Os resultados globais da sequência de transcrições é uma enorme amplificação do número de RNAs de replicon introduzido e assim o imunógeno codificado torna-se um produto de polipeptídeo principal das células.
[0035] Um sistema adequado para alcançar a autorreplicação dessa maneira é usar um replicon baseado em alfavírus. Estes replicons são RNAs de fita-+ que levam à tradução de uma replicase (ou replicase-transcriptase) após a distribuição a uma célula. A replicase é traduzida como uma poliproteína que se autocliva para prover um complexo de replicação que cria cópias de --fita genômica do RNA fita-+ distribuído. Estes transcritos de fita-- podem eles mesmos ser transcritos para dar cópias adicionais do RNA parental de fita-+ e também dar um transcrito subgenômico que codifique o imunógeno. A tradução do transcrito subgenômico conduz assim à expressão in situ do imunógeno pela célula infectada. Replicons de alfavírus adequados podem usar uma replicase de um vírus Sindbis, de um vírus da floresta de Semliki, de um vírus da encefalite equina oriental, um vírus da encefalite equina venezuelana, etc. Sequências de vírus mutante ou selvagem podem ser usadas, por exemplo, o mutante TC83 atenuado de VEEV foi utilizado em replicons [14].
[0036] Uma molécula de RNA autorreplicante preferida codifica assim (i) uma polimerase de RNA RNA-
dependente que pode transcrever RNA a partir da molécula de RNA autorreplicante e (ii) um imunógeno. A polimerase pode ser uma replicase de alfavírus, por exemplo, que compreenda uma ou mais das proteínas de alfavírus nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4.
[0037] Considerando que genomas de alfavírus naturais codificam proteínas estruturais do vírion além da poliproteína replicase não estrutural, é preferível que as moléculas de RNA autorreplicante da invenção não codifiquem proteínas estruturais de alfavírus. Assim, um RNA autorreplicante preferido pode levar à produção de cópias de RNA genômico de si mesmo em uma célula, mas não à produção de vírions contendo RNA. A incapacidade de produzir estes vírions significa que, ao contrário de um alfavírus selvagem, a molécula de RNA autorreplicante não pode perpetuar-se na forma infecciosa. As proteínas estruturais do alfavírus que são necessárias à perpetuação nos vírus selvagens estão ausentes de RNAs autorreplicantes da invenção e seu lugar é tomado por genes que codificam o imunógeno de interesse, tal que o transcrito subgenômico codifique o imunógeno ao invés das proteínas estruturais do vírion de alfavírus.
[0038] Assim, uma molécula de RNA autorreplicante útil com a invenção pode ter duas fases de leitura aberta. A primeira fase de leitura aberta (5') codifica uma replicase; a segunda fase de leitura aberta (3') codifica um imunógeno. Em algumas modalidades, o RNA pode ter fase de leitura aberta adicionais (por exemplo, a jusante), por exemplo, para codificar mais imunógenos (veja abaixo) ou para codificar polipeptídeos acessórios.
[0039] Uma molécula de RNA autorreplicante preferida tem um cap 5' (por exemplo, uma 7- metilguanosina). Este cap pode intensificar a tradução in vivo do RNA. Em algumas modalidades, a sequência 5' da molécula de RNA autorreplicante deve ser selecionada para garantir a compatibilidade com a replicase codificada.
[0040] Uma molécula de RNA autorreplicante pode ter uma cauda poli-A 3'. Também pode incluir uma sequência de reconhecimento da polimerase poli-A (por exemplo, AAUAAA) perto de sua extremidade 3'.
[0041] Moléculas de RNA autorreplicante podem ter vários comprimentos, mas possuem tipicamente 5000-25000 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 8000-15000 nucleotídeos, ou 9000-12000 nucleotídeos. Assim, o RNA é maior do que o visto na distribuição de siRNA.
[0042] Moléculas de RNA autorreplicante tipicamente serão de fita simples. RNAs de fita simples podem em geral iniciar um efeito adjuvante ligando-se a TLR7, TLR8, RNA helicases e/ou PKR. O RNA distribuído na forma de dupla fita (dsRNA) pode se ligar a TLR3 e este receptor também pode ser acionado pelo dsRNA que é formado durante a replicação de um RNA de fita simples ou dentro da estrutura secundária de um RNA de fita simples.
[0043] O RNA autorreplicante pode convenientemente ser preparado por transcrição in vitro (IVT). A IVT pode usar um molde (cDNA) criado e propagado na forma de plasmídeo em bactérias, ou criado sinteticamente (por exemplo, por métodos de engenharia pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou síntese de genes). Por exemplo, uma RNA polimerase DNA-dependente (como as RNA polimerases de bacteriófago T7, T3 ou SP6) pode ser usada para transcrever o RNA autorreplicante a partir de um molde de DNA. Reações adequadas de capping e adição de poli-A podem ser usadas como necessário (embora o poli-A de replicon seja em geral codificado pelo molde de DNA). Estas RNA polimerases podem ter requisitos estringentes para os nucleotídeos 5' trascritos e em algumas modalidades, estes requistos devem ser combinados com os requisitos da replicase codificada, para garantir que o RNA transcrito por IVT possa funcionar eficientemente como um substrato para sua replicase auto- codificada.
[0044] Como discutido na referência 15, o RNA autorreplicante pode incluir (além de qualquer estrutura cap de 5') um ou mais nucleotídeos que possuam uma nucleobase modificada. Assim, o RNA pode compreender m5C (5-metilcitidina), m5U (5-metiluridina), m6A (N6- metiladenosina), s2U (2-tiouridina), Um (2'-O- metiluridina), m1A (1-metiladenosina); m2A (2- metiladenosina); Am (2'-O-metiladenosina); ms2m6A (2- metiltio-N6-metiladenosina); i6A (N6-isopenteniladenosina); ms2i6A (2-metiltio-N6-isopenteniladenosina); io6A (N6-(cis- hidróxi-isopentenil)adenosina); ms2io6A (2-metiltio-N6- (cis-hidróxi-isopentenil) adenosina); g6A (N6- glicinilcarbamoiladenosina); t6A (N6-treonil carbamoiladenosina); ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina); m6t6A (N6-metil-N6- treonilcarbamoiladenosina); hn6A (N6.- hidroxinorvalilcarbamoil adenosina); ms2hn6A (2-metiltio- N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina); Ar(p) (2'-O- ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina); M1I (1-
metilinosina); m'lm (1,2'-O-dimetilinosina); m3C (3- metilcitidina); Cm (2T-O-metilcitidina); s2C (2- tiocitidina); ac4C (N4-acetilcitidina); f5C (5- fonilcitidina); m5Cm (5,2-O-dimetilcitidina); ac4Cm (N4- acetil-2T-O-metilcitidina); k2C (lisidina); m1G (1- metilguanosina); m2G (N2-metilguanosina); m7G (7- metilguanosina); Gm (2'-O-metilguanosina); m22G (N2,N2- dimetilguanosina); m2Gm (N2,2'-O-dimetilguanosina); m22Gm (N2,N2,2'-O-trimetilguanosina); Gr(p) (2'-O- ribosilguanosina (fosfato)); yW (wibutosina); o2yW (peroxiwibutosina); OHyW (hidroxiwibutosina); OHyW* (hidroxiwibutosina submodificada); imG (wiosina); mimG (metilguanosina); Q (queuosina); oQ (epoxiqueuosina); galQ (galtactosil-queuosina); manQ (manosil-queuosina); preQo (7-ciano-7-deazaguanosina); preQi (7-aminometil-7- deazaguanosina); G (arqueiosina); D (di-hidrouridina); m5Um (5,2'-O-dimetiluridina); s4U (4-tiouridina); m5s2U (5- metil-2-tiouridina); s2Um (2-tio-2'-O-metiluridina); acp3U (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina); ho5U (5- hidroxiuridina); mo5U (5-metoxiuridina); cmo5U (ácido uridino 5-oxiacético); mcmo5U (éster metílico de ácido uridino 5-oxiacético); chm5U (5-(carboxi- hidroximetil)uridina)); mchm5U (éster metílico de 5- (carbóxi-hidroximetil)uridina); mcm5U (5-metoxicarbonil metiluridina); mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil-2-O- metiluridina); mcm5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2- tiouridina); nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridina); mnm5U (5- metilaminometiluridina); mnm5s2U (5-metilaminometil-2- tiouridina); mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridina); ncm5U (5-carbamoilmetil uridina); ncm5Um (5-carbamoilmetil-
2'-O-metiluridina); cmnm5U (5- carboximetilaminometiluridina); cnmm5Um (5- carboximetilaminometil-2-L- O-metiluridina); cmnm5s2U (5-carboximetilaminometil-2- tiouridina); m62A (N6,N6-dimetiladenosina); Tm (2'-O- metilinosina); m4C (N4-metilcitidina); m4Cm (N4,2-O- dimetilcitidina); hm5C (5-hidroximetilcitidina); m3U (3- metiluridina); cm5U (5-carboximetiluridina); m6Am (N6,T-O- dimetiladenosina); rn62Am (N6,N6,O-2-trimetiladenosina); m2'7G (N2,7-dimetilguanosina); m2'2'7G (N2,N2,7- trimetilguanosina); m3Um (3,2T-O-dimetiluridina); m5D (5- metildi-hidrouridina); f5Cm (5-formil-2'-O-metilcitidina); m1Gm (1,2'-O-dimetilguanosina); m'Am (1,2-O-dimetil adenosina) irinometiluridina); tm5s2U (S-taurinometil-2- tiouridina)); imG-14 (4-demetil guanosina); imG2 (isoguanosina); ou ac6A (N6-acetiladenosina), hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, seus derivados 7-substituídos, di- hidrouracila, pseudouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5- aminouracila, 5-alquiluracila-(C1-C6), 5-metiluracila, 5- alqueniluracila-(C2-C6), 5-alquiniluracila-(C2-C6), 5- (hidroximetil)uracila, 5-clorouracila, 5-fluoruracila, 5- bromouracila, 5-hidroxicitosina, 5-alquilcitosina-(C1-C6), 5-metilcitosina, 5- alquenilcitosina-(C2-C6), 5-alquinilcitosina-(C2-C6), 5- clorocitosina, 5-fluorcitosina, 5-bromocitosina, N2- dimetilguanina, 7-deazaguanina, 8-azaguanina, guanina 7- deaza-7-substituída, 7-deaza-7-alquinilguanina-(C2-C6), guanina 7-deaza-8-substituída, 8-hidroxiguanina, 6- tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2-amino-6- cloropurina, 2,4-diaminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-
azapurina, 7-deazapurina substituída, purina 7-deaza-7- substituída, purina 7-deaza-8-substituída, ou um nucleotídeo abásico. Por exemplo, um RNA autorreplicante pode incluir uma ou mais nucleobases de pirimidina modificadas, como resíduos de pseudouridina e/ou 5- metilcitosina. Em algumas modalidades, no entanto, o RNA não inclui nucleobases modificadas e não pode incluir nucleotídeos modificados, ou seja, todos os nucleotídeos no RNA são ribonucleotídeos padrões A, C, G e U (exceto por qualquer estrutura de cap 5', que pode incluir uma metilguanosina 7'). Em outras modalidades, o RNA pode incluir um cap 5' compreendendo uma metilguanosina, e os primeiros 3 ribonucleotídeos 5' podem ser metilados na posição 2' da ribose.
[0045] Um RNA usado com a invenção idealmente inclui apenas ligações fosfodiéster entre nucleosídeos, mas em algumas modalidades pode conter ligações de fosforamidato, fosforotioato e/ou metilfosfonato.
[0046] A quantidade de RNA por partícula pode variar, e o número de moléculas individuais de RNA autorreplicante por partícula pode depender das características da partícula a ser usada. Em geral, uma partícula pode incluir 1-500 moléculas de RNA. Para um lipossomo, o número de moléculas de RNA é tipicamente ≤50 por lipossomo, por exemplo < 20, < 10, < 5 ou 1-4. Para uma micropartícula polimérica, o número de moléculas de RNA dependerá do diâmetro da partícula, mas pode ser ≤ 50 por partícula (por exemplo, < 20, < 10, < 5, ou 1-4) ou de 50- 200 por partícula. Idealmente, uma partícula inclui menos de 10 espécies diferentes de RNA, por exemplo, 5, 4, 3 ou 2 espécies diferentes; mais preferivelmente, uma partícula inclui uma única espécie de RNA, ou seja, todas as moléculas de RNA na partícula têm o mesmo comprimento e a mesma sequência. O imunógeno
[0047] As moléculas de RNA autorreplicantes usadas com a invenção codificam um imunógeno polipeptídico. Após a administração das partículas, o imunógeno é traduzido in vivo e pode provocar uma resposta imune do receptor. O imunógeno pode provocar uma resposta imune contra uma bactéria, um vírus, um fungo ou um parasita (ou, em algumas modalidades, contra um alérgeno; e em outras modalidades, contra um antígeno tumoral). A resposta imune pode compreender uma resposta de anticorpo (geralmente incluindo IgG) e/ou a uma resposta imune mediada por célula. O imunógeno polipeptídico tipicamente irá provocar uma resposta imune que reconheça o correspondente polipeptídeo bacteriano, viral, fúngico ou parasita (ou alérgeno ou tumoral), mas em algumas modalidades, o polipeptídeo pode agir como um mimotopo para eliciar uma resposta imune que reconheça um sacarídeo bacteriano, viral, fúngico ou parasita. O imunógeno será tipicamente um polipeptídeo de superfície, por exemplo, uma adesina, uma hemaglutinina, uma glicoproteína do envelope, uma glicoproteína de espícula, etc.
[0048] Moléculas de RNA autorreplicante podem codificar um único imunógeno polipeptídico ou múltiplos polipeptídeos. Múltiplos imunógenos podem ser apresentados como um único imunógeno polipeptídico (polipeptídeo de fusão) ou como polipeptídeos separados. Se os imunógenos forem expressos como polipeptídeos separados, então, um ou mais destes podem ser providos com um IRES a montante ou um elemento promotor viral adicional. Em alternativa, vários imunógenos podem ser expressos a partir de uma poliproteína que codifique imunógenos individuais fundidos a uma protease autocatalítica curta (por exemplo, proteína 2A do vírus da febre aftosa), ou como inteínas.
[0049] Ao contrário das referências 1 e 16, o RNA codifica um imunógeno. Para evitar dúvidas, a invenção não abrange RNA que codifique uma luciferase de vaga-lume ou que codifique uma proteína de fusão de β-galactosidase de E. coli ou que codifique uma proteína verde fluorescente (GFP). Além disso, o RNA não é RNA total de timo de camundongo.
[0050] Em algumas modalidades, o imunógeno provoca uma resposta imune contra uma destas bactérias:
[0051] Neisseria meningitidis: imunógenos úteis incluem, mas não está limitado a, proteínas de membrana como adesinas, autotransportadores, toxinas, proteínas de aquisição de ferro e proteína de ligação ao do fator H. Uma combinação de três polipeptídeos úteis é divulgada na referência 17.
[0052] Streptococcus pneumoniae: imunógenos polipeptídicos úteis são divulgados na referência 18. Estes incluem, mas não está limitado a, a subunidade de pilus de RrgB, o precursor da beta-N-acetil-hexosaminidase (spr0057), spr0096, proteínas de estresse geral GSP-781 (spr2021, SP2216), serina/treonina quinase StkP (SP1732) e adesina de superfície pneumocócica PsaA.
[0053] Streptococcus pyogenes: imunógenos úteis incluem, mas não está limitado a, os polipeptídeos divulgados nas referências 19 e 20.
[0054] Moraxella catarrhalis.
[0055] Bordetella pertussis: imunógenos de pertussis úteis incluem, mas não está limitado a, a toxina ou toxoide pertussis (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina e aglutinogênios 2 e 3.
[0056] Staphylococcus aureus: Imunógenos úteis incluem, mas não está limitado a, os polipeptídeos divulgados na referência 21, como uma hemolisina, esxA, esxB, proteína de ligação a ferri cromo (sta006) e/ou a lipoproteína sta011.
[0057] Clostridium tetani: o imunógeno típico é o toxóide tetânico.
[0058] Cornynebacterium diphtheriae: o imunógeno típico é o toxóide diftérico.
[0059] Haemophilus influenzae: Imunógenos úteis incluem, mas não está limitado a, os polipeptídeos divulgados nas referências 22 e 23.
[0060] Pseudomonas aeruginosa
[0061] Streptococcus agalactiae: imunógenos úteis incluem, mas não está limitado a, os polipeptídeos divulgados na referência 19.
[0062] Chlamydia trachomatis: Imunógenos úteis incluem, mas não está limitado a, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-like, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA e MurG (por exemplo, como divulgado na referência 24. LcrE
[25] e HtrA [26] são dois imunógenos preferidos.
[0063] Chlamydia pneumoniae: Imunógenos úteis incluem, mas não está limitado a, os polipeptídeos divulgados na referência 27.
[0064] Helicobacter pylori: Imunógenos úteis incluem, mas não está limitado a, CagA, VacA, NAP e/ou urease [28].
[0065] Escherichia coli: Imunógenos úteis incluem, mas não está limitado a, imunógenos, derivados de E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAggEC), E. coli de adesão difusa (DAEC), E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli patogênica extraintestinal (ExPEC) e/ou E. coli entero-hemorrágica (EHEC). Cepas de ExPEC incluem E. coli uropatogênica (UPEC) e E. coli associada à meningite/sepse (MNEC). Imunógenos polipeptídicos de UPEC úteis são divulgados nas referências 29 e 30. Imunógenos de MNEC úteis são divulgados na referência 31. Um imunógeno útil para vários tipos de E. coli é AcfD [32].
[0066] Bacillus anthracis
[0067] Yersinia pestis: Imunógenos úteis incluem, mas não está limitado a, aqueles divulgados nas referências 33 e 34.
[0068] Staphylococcus epidermis
[0069] Staphylococcus epidermis
[0070] Clostridium perfringens ou Clostridium botulinums
[0071] Legionella pneumophila
[0072] Coxiella burnetii
[0073] Brucella, como B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis, B. pinnipediae.
[0074] Francisella, como F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis.
[0075] Neisseria gonorrhoeae
[0076] Treponema pallidum
[0077] Haemophilus ducreyi
[0078] Enterococcus faecalis ou Enterococcus faecium
[0079] Staphylococcus saprophyticus
[0080] Yersinia enterocolitica
[0081] Mycobacterium tuberculosis
[0082] Rickettsia
[0083] Listeria monocytogenes
[0084] Vibrio cholerae
[0085] Salmonella typhi
[0086] Borrelia burgdorferi
[0087] Porphyromonas gingivalis
[0088] Klebsiella
[0089] Em algumas modalidades, o imunógeno provoca uma resposta imune contra um desses vírus:
[0090] Ortomixovírus: Imunógenos úteis podem ser de um vírus influenza A, B ou C, como a hemaglutinina, neuraminidase ou proteínas M2 de matriz. Se o imunógeno for uma hemaglutinina do vírus influenza A, pode ser de qualquer subtipo, por exemplo, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16.
[0091] Vírus Paramyxoviridae: Os imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, aqueles derivados de pneumovírus (por exemplo, vírus do sincício respiratório, RSV), rubulavírus (por exemplo, vírus mumps), paramixovírus
(por exemplo, vírus parainfluenza), metapneumovírus e morbillivírus (por exemplo, sarampo).
[0092] Poxviridae: Imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de ortopoxvírus como Variola vera, mas não está limitado a, Variola major e Variola minor.
[0093] Picornavírus: Imunógenos virais incluem, mas não estão limitado a, os derivados de Picornavírus, como enterovírus, rinovírus, Heparnavírus, Cardiovírus e Aftovírus. Em uma modalidade, o enterovírus é um poliovírus, por exemplo, um poliovírus tipo 1, tipo 2 e/ou tipo 3. Em outra modalidade, o enterovírus é um enterovírus EV71. Em outra modalidade, o enterovírus é um vírus coxsackie A ou B.
[0094] Buniavírus: Imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de um ortobuniavírus, como vírus de encefalite da Califórnia, um flebovírus, como o vírus da febre do vale Rift, ou um nairovírus, como vírus de febre hemorrágica da Crimeia-Congo.
[0095] Heparnavírus: Imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de um heparnavírus, como o vírus da hepatite A (HAV).
[0096] Filovírus: Imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de um filovírus, como um vírus Ebola (incluindo um ebolavírus do Zaire, Costa do Marfim, Reston ou Sudão) ou um vírus Marburg.
[0097] Togavírus: Os imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de um Togavírus, como um Rubivírus, um Alfavírus, ou um Aterivírus. Isso inclui o vírus da rubéola.
[0098] Flavivírus: Imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de um Flavivírus, como o vírus da encefalite Tick-Borne (TBE), o vírus da Dengue (tipos 1, 2, 3 ou 4), o vírus da febre amarela, o vírus da encefalite japonesa, o vírus da floresta de Kyasanur, o vírus da encefalite do Nilo Ocidental, o vírus da encefalite de St. Louis, o vírus da encefalite de Primavera-Verão russa, o vírus da encefalite de Powassan.
[0099] Pestivírus: Os imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de um Pestivírus, como a diarreia viral bovina (BVDV), peste suína clássica (CSFV) ou doença de fronteira (BDV).
[00100] Hepadnavírus: Imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de um Hepadnavírus, como o vírus da hepatite B. Uma composição pode incluir o antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg).
[00101] Outros vírus de hepatite: Uma composição pode incluir um imunógeno de um vírus da hepatite C, vírus da hepatite delta, vírus da hepatite E, ou vírus da hepatite G.
[00102] Rabdovírus: Imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de um Rabdovírus, como um Lissavírus (por exemplo, um vírus da raiva) e Vesiculovírus (VSV).
[00103] Caliciviridae: Os imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de Calciviridae, como o vírus Norwalk (Norovírus), e vírus semelhantes ao Norwalk, como o vírus do Havaí e o vírus da montanha de neve.
[00104] Coronavírus: Imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de um coronavírus SARS, de bronquite infecciosa aviária (IBV), de vírus da hepatite de camundongos (MHV) e de vírus da gastroenterite transmissível porcina (TGEV). O imunógeno de coronavírus pode ser um polipeptídeo de espícula.
[00105] Retrovírus: Imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de um Oncovírus, de um Lentivírus (por exemplo, HIV-1 ou HIV-2) ou de um Espumavírus.
[00106] Reovírus: Os imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de um ortoreovírus, um rotavírus, um orbivírus ou um coltivírus.
[00107] Parvovírus: Os imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados do Parvovírus B19.
[00108] Herpesvírus: Os imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, aqueles derivados de um herpesvírus humano, como, a título de exemplo, vírus do Herpes Simplex (HSV) (por exemplo, HSV tipos 1 e 2), vírus varicela-zoster (VZV), vírus Epstein-Barr (EBV), citomegalovírus (CMV), herpesvírus humano 6 (HHV6), herpesvírus humano 7 (HHV7) e herpesvírus humano 8 (HHV8).
[00109] Papovavírus: Os imunógenos virais incluem, mas não está limitado a, os derivados de papilomavírus e poliomavírus. O papilomavírus (humano) pode ser de sorotipo 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 ou 65, por exemplo, de um ou mais dentre os sorotipos 6, 11, 16 e/ou 18.
[00110] Adenovírus: Os imunógenos virais incluem os derivados de adenovírus sorotipo 36 (Ad-36).
[00111] Em algumas modalidades, o imunógeno provoca uma resposta imune contra um vírus que infecta peixes, como: vírus da anemia de salmão infeccioso (ISAV), vírus da doença pancreática de salmão (SPDV), vírus da necrose pancreática infecciosa (IPNV), vírus do bagre do canal (CCV), vírus da doença linfocística de peixes (FLDV), vírus da necrose hematopoiética infecciosa (IHN), herpesvírus koi, vírus semelhante a picorna de salmão (também conhecido como vírus semelhante a picorna de salmão do Atlântico), vírus de salmão sem litoral (LSV), rotavírus de salmão do Atlântico (ASR), vírus da doença de truta morango (TSD), vírus de tumor de salmão prateado (CSTV), ou vírus da septicemia hemorrágica viral (VHSV).
[00112] Os imunógenos fúngicos podem ser derivados de Dermatophytres, incluindo: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum e/ou Trichophyton faviforme; ou de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis e Enterocytozoon bieneusi; os menos comuns são Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp e Cladosporium spp.
[00113] Em algumas modalidades, o imunógeno provoca uma resposta imune contra um parasita do gênero Plasmodium, como P. falciparum, P. vivax, P. malariae ou P. ovale. Assim, a invenção pode ser utilizada para imunização contra a malária. Em algumas modalidades, o imunógeno provoca uma resposta imune contra um parasita da família Caligidae, particularmente aqueles dos gêneros Lepeophtheirus e Caligus, por exemplo, piolhos do mar como Lepeophtheirus salmonis ou Caligus rogercresseyi.
[00114] Em algumas modalidades, o imunógeno provoca uma resposta imune contra: alérgenos de pólen (alérgenos de árvore, de erva, de erva daninha e pólen de gramíneas); alérgenos de insetos ou aracnídeos (alérgenos respiratórios, de saliva e de veneno, por exemplo, alérgenos de ácaros, alégenos de barata e de mosquitos, alérgenos de veneno de himenoptera); alérgenos de pelo e caspa animais (por exemplo, de cão, gato, cavalo, rato, camundongo, etc.); e alérgenos alimentares (por exemplo, a gliadina). Importantes alérgenos de pólen de ervas, gramíneas e árvores são os que se originam das ordens taxonômicas Fagales, Oleales, Pinales e Platanaceae, incluindo, entre outros, bétula (Betula), amieiro (Alnus), aveleira (Corylus), choupo-branco (Carpinus) e azeitona (Olea), cedro (Cryptomeria e Juniperus), árvore plana (Platanus), a ordem Poales incluindo gramíneas dos gêneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale e Sorghum, as ordens Asterales e Urticales incluindo ervas dos gêneros Ambrosia, Artemisia e Parietaria.
Outros importantes alérgenos de inalação são os de ácaros da poeira doméstica dos gêneros Dermatophagoides e Euroglyphus, ácaros de armazenamento, por exemplo, Lepidoglyphys, Glycyphagus e Tyrophagus, os de baratas, mosquitos e pulgas, por exemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus e Ctenocepphalides e os de mamíferos, como os de gato, cachorro e cavalo, alérgenos de veneno incluindo os provenientes de picada ou mordida de insetos, como os da ordem taxonômica Hymenoptera, incluindo abelhas (Apidae), vespas (Vespidea) e formigas (Formicoidae).
[00115] Em algumas modalidades, o imunógeno é um antígeno tumoral selecionado dentre: (a) antígenos de câncer-testículo como NY-ESO-1, SSX2, SCP1 assim como as famílias polipeptídicas RAGE, BAGE, GAGE e MAGE, por exemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 e MAGE- 12 (que podem ser usados, por exemplo, para direcionamento a melanoma, tumores de pulmão, cabeça e pescoço, NSCLC, mama, gastrointestinais e de bexiga; (b) antígenos mutados, por exemplo, p53 (associada a vários tumores sólidos, por exemplo, câner colorretal, de pulmão, de cabeça e pescoço), p21/Ras (associada a, por exemplo, melanoma, câncer de pâncreas e câncer colorretal), CDK4 (associada a, por exemplo, melanoma), MUMl (associada a, por exemplo, melanoma), caspase-8 (associada a, por exemplo, câncer de cabeça e pescoço), CIA 0205 (associada a, por exemplo, câncer de bexiga), HLA-A2-R1701, beta- catenina (associada a, por exemplo, melanoma), TCR (associado a, por exemplo, linfoma não-Hodgkin de células T), BCR-abl (associada a, por exemplo, leucemia mieloide crônica), triosefosfato isomerase, KIA 0205, CDC-27 e LDLR- FUT; (c) antígenos superexpressos, por exemplo, galectina 4 (associada a, por exemplo, câncer colorretal), galectina 9 (associada a, por exemplo, doença de Hodgkin), proteinase 3 (associada a, por exemplo, leucemia mieloide crônica), WT-1 (associada a, por exemplo, várias leucemias), anidrase carbônica (associada a, por exemplo, câncer renal), aldolase A (associada a, por exemplo, câncer de pulmão), PRAME (associada a, por exemplo, melanoma), HER-2/neu (associada a, por exemplo, câncer de mama, cólon, pulmão e ovário), mamaglobina, alfa-fetoproteína (associada a, por exemplo, hepatoma), KSA (associada a, por exemplo, câncer colorretal), gastrina (associada a, por exemplo, câncer gástrico e pancreático), proteína catalítica da telomerase, MUC-1 (associada a, por exemplo, câncer de mama e ovário), G-250 (associada a, por exemplo, carcinoma de células renais), p53 (associada a, por exemplo, câncer de mama, cólon) e antígeno carcino-embrionário (associado a, por exemplo, câncer de mama, câncer de pulmão e cânceres do trato gastrointestinal como câncer colorretal); (d) antígenos compartilhados, por exemplo, antígenos de diferenciação de melanoma-melanócito como MART-l/Melan A, gplOO, MC1R, receptor do hormônio estimulante de melanócitos, tirosinase, proteína relacionado à tirosinase- 1/TRPI e proteína relacionada à tirosinase-2/TRP2 (associados a, por exemplo, melanoma); (e) antígenos associados à próstata, como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, associados a, por exemplo, câncer de próstata; (f) idiotipos de imunoglobulina (associados a mieloma e linfomas de células B, por exemplo). Em determinadas modalidades, os imunógenos tumorais incluem, mas não estão limitados a, pi 5, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH- IGK, MYL-RAR, antígenos do vírus Epstein-Barr, EBNA, antígenos de papilomavírus humano (HPV), incluindo E6 e E7, antígenos do vírus da hepatite B e C, antígenos de vírus linfotrópico de célula T humana, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23Hl, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM
17.1, NuMa, K-ras, pl6, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA
27.29YBCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO- 029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA- 50, MG7-Ag,
MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína associada à ciclofilina C proteína de ligação à Mac-2), TAAL6, TAG72, TLP, TPS e similares. Composições farmacêuticas
[00116] As partículas da invenção são úteis como componentes em composições farmacêuticas para imunização de indivíduos contra várias doenças. Estas composições tipicamente incluirão um veículo farmaceuticamente aceitável, além das partículas. Uma discussão detalhada dos veículos farmaceuticamente aceitáveis está disponível na referência 35.
[00117] Uma composição farmacêutica da invenção pode incluir uma ou mais pequenas moléculas imunopotencializadoras. Por exemplo, a composição pode incluir um agonista de TLR2 (por exemplo, Pam3CSK4), um agonista de TLR4 (por exemplo, um aminoalquil glicosaminida fosfato, como E6020), um agonista de TLR7 (por exemplo, imiquimod), um agonista de TLR8 (por exemplo, resiquimod) e/ou um agonista de TLR9 (por exemplo, IC31). Qualquer agonista desses tem idealmente um peso molecular <2000Da. No caso de um RNA ser encapsulado, em algumas modalidades tais agonistas também são encapsulados com o RNA, mas em outras modalidades são desencapsulados. No caso de uma RNA ser adsorvido a uma partícula, em algumas modalidades tais agonistas também são adsorvidos com o RNA, mas em outras modalidades são desadsorvidos.
[00118] As composições farmacêuticas da invenção podem incluir as partículas de água pura (por exemplo, w.f.i.), ou em um tampão, por exemplo, um tampão fosfato, tampão Tris, um tampão de borato, tampão de succinato, um tampão de histidina, ou um tampão de citrato. Sais de tampão estarão tipicamente incluídos na faixa de 5-20mM.
[00119] As composições farmacêuticas da invenção podem ter um pH entre 5,0 e 9,5, por exemplo, entre 6,0 e 8,0.
[00120] As composições da invenção podem incluir sais de sódio (por exemplo, cloreto de sódio) para dar tonicidade. Uma concentração de 10+2 mg/mL de NaCl é típica, por exemplo, cerca de 9 mg/mL.
[00121] As composições da invenção podem incluir quelantes de íons metálicos. Estes podem prolongar a estabilidade do RNA através da remoção de íons que podem acelerar a hidrólise de fosfodiéster. Assim, uma composição pode incluir um ou mais dentre EDTA, EGTA, BAPTA, ácido pentético, etc... Tais quelantes estão tipicamente presentes em entre 10-500µM, por exemplo, 0,1mM. Um sal de citrato, como citrato de sódio, também pode atuar como um quelante, enquanto vantajosamente também provê atividade tamponante.
[00122] As composições farmacêuticas da invenção podem ter uma osmolalidade entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, por exemplo, entre 240-360 mOsm/kg ou entre 290-310 mOsm/kg.
[00123] As composições farmacêuticas da invenção podem incluir um ou mais conservantes, como tiomersal ou 2- fenoxietanol. As composições sem mercúrio são preferidas e podem ser preparadas vacinas sem conservantes.
[00124] As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente estéreis.
[00125] As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente apirogênicas, por exemplo, que contenham < 1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose e preferivelmente < 0,1 EU por dose.
[00126] As composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente sem glúten.
[00127] As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas na forma de dose unitária. Em algumas modalidades, uma dose unitária pode ter um volume entre 0,1-1,0mL, por exemplo, cerca de 0,5mL.
[00128] As composições podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões. A composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, por um inalador, usando um pulverizador fino. A composição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como spray ou gotas. Injetáveis para administração intramuscular são típicos.
[00129] As composições compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de partículas, assim como quaisquer outros componentes, conforme necessário. Por 'quantidade imunologicamente eficaz', entende-se que a administração dessa quantidade a um indivíduo, em dose única ou como parte de uma série, é eficaz para o tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia dependendo da saúde e da condição física do indivíduo a ser tratado, da idade, do grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata, etc.), da capacidade do sistema imunológico do indivíduo de sintetizar anticorpos, do grau de proteção desejado, da formulação da vacina, da avaliação do médico assistente da situação médica e de outros fatores relevantes. Espera-se que a quantidade cairá em um intervalo relativamente amplo que pode ser determinado através de ensaios rotineiros. O teor da partícula e do RNA das composições da invenção será geralmente expresso em termos da quantidade de RNA por dose. Uma dose preferida tem ≤100µg de RNA (por exemplo, 10-100 µg, como cerca de 10 µg, 25 µg, 50 µg, 75 µg ou 100 µg), mas pode ser vista expressão em níveis muito mais baixos, por exemplo, ≤1 µg/dose, ≤100ng/dose, ≤10ng/dose, ≤1ng/dose, etc.
[00130] A invenção também provê um dispositivo de dstribuição (por exemplo, seringa, nebulizador, pulverizador, inalador, adesivo epidérmico, etc.) contendo uma composição farmacêutica da invenção. Este dispositivo pode ser utilizado para administrar a composição a um indivíduo vertebrado.
[00131] As partículas da invenção não incluem ribossomos. Métodos de tratamento e usos médicos
[00132] Em contraste com as partículas divulgadas na referência 16, as partículas e as composições farmacêuticas da invenção são para uso in vivo para provocar uma resposta imune contra um imunógeno de interesse.
[00133] A invenção provê um método para induzir uma resposta imunológica em um vertebrado, compreendendo a etapa de administração de uma quantidade eficaz de uma partícula ou composição farmacêutica da invenção. A resposta imune é preferivelmente protetora e preferivelmente envolve anticorpos e/ou imunidade mediada por células. O método pode gerar uma resposta de reforço.
[00134] A invenção provê também uma partícula ou composição farmacêutica da invenção para uso em um método para induzir uma resposta imune em um vertebrado.
[00135] A invenção também provê o uso de uma partícula da invenção na fabricação de um medicamento para induzir uma resposta imune em um vertebrado.
[00136] Ao induzir uma resposta imune no vertebrado por esses usos e métodos, o vertebrado pode ser protegido contra várias doenças e/ou infecções, por exemplo, contra doenças bacterianas e/ou virais, como discutido acima. As partículas e composições são imunogênicas e mais preferivelmente são composições de vacina. Vacinas de acordo com a invenção podem ser profiláticas (ou seja, para prevenir a infecção) ou terapêuticas (ou seja, para tratar a infecção), mas tipicamente serão profiláticas.
[00137] O vertebrado é preferivelmente um mamífero, como um ser humano ou um grande mamífero veterinário (por exemplo, cavalos, gado, cervos, cabras, porcos). Se a vacina for para uso profilático, o ser humano é preferivelmente uma criança (por exemplo, uma criança ou infante) ou um adolescente; se a vacina for para uso terapêutico, o ser humano é preferivelmente, um adolescente ou um adulto. Uma vacina destinada a crianças também pode ser administrada a adultos, por exemplo, para avaliar a segurança, dosagem, imunogenicidade, etc.
[00138] As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser usadas para tratar tanto crianças como adultos. Assim, um paciente humano pode ter menos de 1 ano de idade, menos de 5 anos de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 15-55 anos idade, ou pelo menos 55 anos de idade. Os pacientes preferidos para receber as vacinas são os idosos (por exemplo, ≥50 anos de idade, ≥60 anos de idade e preferivelmente ≥65 anos), os jovens (por exemplo, ≤5 anos de idade), pacientes hospitalizados, profissionais de saúde, pessoal militar e de serviço armado, mulheres grávidas, os doentes crônicos, ou pacientes imunodeficientes. Entretanto, as vacinas não são adequadas somente para estes grupos, e podem ser usadas de modo mais geral em uma população.
[00139] As composições da invenção serão administradas em geral diretamente a um paciente. A distribuição direta pode ser realizada por injeção parenteral (por exemplo, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intradérmica, ou para o espaço intersticial de um tecido; ao contrário da referência 1, a injeção intraglossal não é tipicamente usada com a presente invenção). Vias alternativas de distribuição incluem a administração retal, oral (por exemplo, comprimido, spray), bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdérmica ou transcutânea, intranasal, ocular, aural, pulmonar ou outra por mucosa. Administração intradérmica e intramuscular são duas vias preferidas. A injeção pode ser através de uma agulha (por exemplo, uma agulha hipodérmica), mas a injeção sem agulha pode ser usada em alternativa. Uma típica dose intramuscular é de 0,5 mL.
[00140] A invenção pode ser utilizada para provocar imunidade sistêmica e/ou de mucosas, preferivelmente para provocar uma imunidade de mucosa e/ou sistêmica intensificada.
[00141] A dosagem pode ser um cronograma de dose única ou um cronograma de dose múltipla.
Múltiplas doses podem ser usadas em um cronograma de imunização primária e/ou em um cronograma de imunização de reforço.
Em um cronograma de dose múltipla, as várias doses podem ser dadas pelas mesmas vias ou por vias diferentes, por exemplo, uma primeira parenteral e uma de reforço de mucosa, uma primeira de mucosa e uma de reforço parenteral, etc.
Doses múltiplas serão tipicamente administradas com pelo menos 1 semana de intervalo (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas, etc.). Em uma modalidade, doses múltiplas podem ser administradas aproximadamente 6 semanas, 10 semanas e 14 semanas após o nascimento, por exemplo, em uma idade de 6 semanas, 10 semanas e 14 semanas, como frequentemente utilizado no Programa Expandido em Imunização da Organização Mundial da Saúde ("EPI"). Em uma modalidade alternativa, duas doses primárias são administradas com cerca de dois meses de intervalo, por exemplo, com cerca de 7, 8 ou 9 semanas de intervalo, seguidas por uma ou mais doses de reforço cerca de 6 meses a 1 ano após a segunda dose primária, por exemplo, cerca de 6, 8, 10 ou 12 meses após a segunda dose primária.
Em uma modalidade adicional, três doses primárias são administradas com cerca de dois meses de intervalo, por exemplo, com cerca de 7, 8 ou 9 semanas de intervalo, seguidas por uma ou mais doses de reforço, cerca de 6 meses a 1 ano após a terceira dose primária, por exemplo, cerca de 6, 8, 10 ou 12 meses após a terceira dose primária.
Modalidades gerais
[00142] Em algumas modalidades da invenção, o RNA não inclui nucleotídeos modificados (veja acima). Em outras modalidades, o RNA pode opcionalmente incluir pelo menos um nucleotídeo modificado, desde que uma ou mais das seguintes características (já divulgadas acima) também sejam necessárias:
[00143] Se o RNA for distribuído com um lipossomo, o lipossomo compreenderá DSDMA, DODMA, DLinDMA e/ou DLenDMA.
[00144] Se o RNA for encapsulado em um lipossomo, a parte hidrofílica de um lipídeo no lipossomo será peguilado.
[00145] Se o RNA for encapsulado em um lipossomo, pelo menos 80% dos lipossomos terá diâmetros na faixa de 20-220nm.
[00146] Se o RNA for distribuído com uma micropartícula, a micropartícula será uma micropartícula de polímero biodegradável e atóxico.
[00147] Se o RNA for distribuído com uma micropartícula, as micropartículas terão um diâmetro na faixa de 0,02µm a 8µm.
[00148] Se o RNA for distribuído com uma micropartícula, pelo menos 80% das micropartículas terão um diâmetro na faixa de 0,03-7µm.
[00149] Se o RNA for distribuído com uma micropartícula, a composição será liofilizada.
[00150] O RNA tem uma cauda poli-A 3' e o imunógeno pode provocar uma resposta imune in vivo contra uma bactéria, um vírus, um fungo ou um parasita.
[00151] O RNA é distribuído em combinação com um quelante de íon metálico com um sistema de distribuição selecionado de (i) lipossomos, (ii) micropartículas de polímero biodegradável e atóxico. Geral
[00152] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, os métodos convencionais da Química, Bioquímica, Biologia Molecular, Imunologia e Farmacologia, dentro do conhecimento da técnica. Tais técnicas são explicadas inteiramente na literatura. Veja, por exemplo, as referências 36-42, etc.
[00153] O termo "que compreenda" abrange "que inclua", assim como "que consista", por exemplo, uma composição "que compreenda" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.
[00154] O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x é opcional e significa, por exemplo, x±10%.
[00155] A palavra "consideravelmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "consideravelmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Se necessário, a palavra "consideravelmente" pode ser omitida da definição da invenção.
[00156] Referências à carga, aos cátions, aos ânions, aos zwiteríons, etc, são tomadas em pH 7.
[00157] TLR3 é o receptor semelhante a Toll 3. É um único receptor transmembrana que desempenha um papel fundamental no sistema imune inato. Os agonistas de TLR3 conhecidos incluem poly(LC). "TLR3" é o nome HGNC aprovado para o gene que codifica este receptor, e sua única HGNC ID é HGNC: 11849. A sequência RefSeq para o gene de TLR3 humano é GI:2459625.
[00158] TLR7 é o receptor semelhante a Toll 7. É um único receptor transmembrana que desempenha um papel fundamental no sistema imune inato. Os agonistas de TLR7 conhecidos incluem, por exemplo, imiquimod. "TLR7" é o nome HGNC aprovado para o gene que codifica este receptor, e sua única HGNC ID é HGNC: 15631. A sequência RefSeq para o gene de TLR7 humano é GI: 67944638.
[00159] TLR8 é o receptor semelhante a Toll 8. É um único receptor transmembrana que desempenha um papel fundamental no sistema imune inato. Os agonistas conhecidos de TLR8 incluem, por exemplo, resiquimod. "TLR8" é o nome HGNC aprovado para o gene que codifica este receptor, e sua única HGNC ID é HGNC: 15632. A sequência RefSeq para o gene de TLR8 humano é GI:20302165.
[00160] A família de receptores semelhantes a RIG-1 ("RLR") inclui várias helicases de RNA que desempenham papéis fundamentais no sistema imune inato [43]. RLR-1 (também conhecido como RIG-1 ou gene 1 induzível por ácido retinoico) tem dois domínios de recrutamento de caspase perto de sua extremidade N-terminal. O nome HGNC aprovado para o gene que codifica a helicase RLR-1 é "DDX58" (para o box DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) polipeptídeo 58) e o HGNC ID único é HGNC: 19102. A sequência RefSeq para o gene de RLR- 1 humano é GI:77732514. RLR-2 (também conhecido como MDA5 ou gene 5 associado à diferenciação de melanoma) também tem dois domínios de recrutamento de caspase perto de sua extremidade N-terminal. O nome HGNC aprovado para o gene que codifica a helicase RLR-2 é "IFIH1" (para interferon induzido por domínio 1 da helicase C) e o HGNC ID único é HGNC: 18873. A sequência RefSeq para o gene de RLR-2 humano é GI: 27886567. RLR-3 (também conhecido como LGP2 ou <laboratório de genética e fisiologia 2>) não tem domínios de recrutamento de caspase. O nome HGNC aprovado para o gene que codifica a helicase RLR-3 é "DHX58" (para o box DEXH (Asp-Glu-X-His) polipeptídeo 58) e o HGNC ID único é HGNC: 29517. A sequência RefSeq para o gene de RLR-3 humano é GI: 149408121.
[00161] PKR é uma proteína quinase dependente de RNA dupla fita. Desempenha um papel fundamental no sistema imune inato. "EIF2AK2" (para fator 2 de iniciação de tradução eucariótica-alfa quinase 2) é o nome HGNC aprovado para o gene que codifica esta enzima, e sua HGNC ID única é HGNC: 9437. A sequência RefSeq para o gene de PKR humano é GI:208431825.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00162] A figura 1 mostra um gel com RNA corado. As raias mostram (1) marcadores (2) replicon puro (naked) (3) replicon após tratamento com RNase (4) replicon encapsulado em lipossomo (5) lipossomo após tratamento com RNase (6) lipossomo tratado com RNase em seguida submetido à extração com fenol/clorofórmio.
[00163] A figura 2 é uma micrografia eletrônica de lipossomos.
[00164] A figura 3 mostra a expressão proteica (como unidades de luz relativas, RLU) nos dias 1, 3 e 6 após a distribuição de RNA como um replicon embalado por vírion (quadrados), RNA puro (naked) (triângulos), ou como micropartículas (círculos).
[00165] A figura 4 mostra um gel com RNA corado. As raias mostram (1) marcadores (2) replicon puro (naked) (3) replicon encapsulado em lipossomo (4) lipossomo tratado com RNase em seguida submetido à extração com fenol/clorofórmio.
[00166] A figura 5 mostra a expressão proteica nos dias 1, 3 e 6 após a distribuição de RNA como um replicon embalado por vírion (quadrados), como RNA puro (naked) (lozangos), ou em lipossomos (+ = 0,1µg, x = 1µg).
[00167] A Figura 6 mostra a expressão proteica nos dias 1, 3 e 6 após a distribuição de quatro doses diferentes de RNA encapsulado em lipossomo.
[00168] A Figura 7 mostra os títulos de IgG anti-F em animais que recebem replicon embalado por vírion (VRP ou VSRP), 1µg de RNA puro, e 1µg de RNA encapsulado em lipossomo.
[00169] A Figura 8 mostra os títulos de IgG anti-F em animais que recebem VRP, 1µg de RNA puro, e 0,1g ou 1µg de RNA encapsulado em lipossomo.
[00170] A Figura 9 mostra os títulos de anticorpo neutralizante em animais que recebem VRP, 0,1g ou 1µg de RNA encapsulado em lipossomo.
[00171] A Figura 10 mostra níveis de expressão após a distribuição de um replicon como RNA puro (círculos), RNA encapsulado em lipossomo (triângulo & quadrado), ou como um lipoplex (triângulo invertido).
[00172] A Figura 11 mostra títulos de IgG específicos para F (2 semanas após a segunda dose) após a distribuição de um replicon como RNA puro (0,01-1µg), RNA encapsulado em lipossomo (0,01-10µg), ou embalados como um vírion (VRP, 106 unidades infecciosas ou UI).
[00173] A Figura 12 mostra títulos de IgG específicos para F (círculos) e títulos PRNT (quadrados) após a distribuição de um replicon como RNA puro (1µg), RNA encapsulado em lipossomo (0,1 ou 1µg), ou embalado como um vírion (VRP, 106 UI). Os títulos em camundongos naïve também são mostrados. Linhas sólidas mostram meios geométricos.
[00174] A Figura 13 mostra a produção de citocina intracelular após a re-estimulação com peptídeos sintéticos que representam os principais epítopos na proteína F, 4 semanas depois uma segunda dose. O eixo y mostra a % de citocina+ de CD8+CD4-.
[00175] A Figura 14 mostra os títulos de IgG específicos para F (média logio títulos ± desv pad) por 63 dias (figura 14A) e 210 dias (figura 14B) após a imunização de bezerros. As três linhas distinguem-se facilmente no dia 63 e são, de baixo para cima: controle negativo de PBS; RNA distribuído em lipossomo; e o produto "Triangle 4".
[00176] A Figura 15 mostra os títulos de IgG de soro anti-HIV em resposta a RNA puro ("RNA") ou encapsulado em lipossomo ("LNP"), ou a DNA distribuído por eletroporação no músculo.
[00177] A Figura 16 mostra os títulos de IgG em 13 grupos de camundongos. Cada círculo é um camundongo individual, e as linhas contínuas mostram meios geométricos. A linha horizontal pontilhada é o limite de deteção do ensaio. Os 13 grupos são, da esquerda para a direita, A a M, como descrito abaixo.
[00178] A figura 17 mostra (A) IL-6 e (B) IFNa (pg/mL), liberado por pDC. Existem 4 pares de barras, da esquerda para a direita: controle; imunizados com RNA + DOTAP; imunizados com RNA + lipofectamina; e imunizados com RNA em lipossomos. Em cada par, a barra preta são camundongos selvagens, a cinza é o mutante rsq1.
MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Replicons de RNA
[00179] Vários replicons são usados abaixo. Em geral, estes são baseados em um genoma de alfavírus híbrido com proteínas não estruturais do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), um sinal de empacotamento do vírus sindbis e um UTR 3' de vírus sindbis ou de um VEEV mutante. O replicon possui cerca de lOkb de comprimento e tem uma cauda poli-A.
[00180] O DNA de plasmídeo que codifica replicons de alfavírus (denominados: pT7-mVEEV-FL.RSVF ou A317; pT7- mVEEV-SEAP ou A306; pSP6-VCR-GFP ou A50) serviu como um molde para a síntese de RNA in vitro. Os replicons contêm os elementos genéticos de alfavírus necessários para replicação do RNA, mas carecem daqueles que codificam os produtos gênicos necessários para a montagem da partícula; as proteínas estruturais em vez disso são substituídas por uma proteína de interesse (um repórter, como um SEAP ou GFP, ou um imunógeno, como a proteína RSV F completa) e, portanto, os replicons são incapazes de induzir a geração de partículas infecciosas. Um promotor de bacteriófago (T7 ou SP6) a montante do cDNA de alfavírus facilita a síntese de RNA de replicon in vitro e uma ribozima de vírus delta da hepatite (HDV) imediatamente a jusante da cauda poli(A)
gera a extremidade 3' correta por meio de sua atividade autoclivante.
[00181] Após a linearização do plasmídeo de DNA a jusante da ribozima de HDV com uma endonuclease de restrição apropriada, transcrições de escoamento (run-off) foram sintetizados in vitro usando RNA polimerase DNA- dependente derivada de bacteriófago T7 ou SP6. As transcrições foram realizadas por 2 horas a 37oC na presença de 7,5 mM (RNA polimerase de T7) ou 5 mM (RNA polimerase de SP6) de cada um dos trifosfatos de nucleosídeos (ATP, CTP, GTP e UTP) seguindo as instruções providas pelo fabricante (Ambion). Após a transcrição, o molde de DNA foi digerido com a DNase TURBO (Ambion). O RNA de replicon foi precipitado com LiCl e reconstituído em água livre de nuclease. RNA sem cap foi submetido à inserção de cap pós-transcricionalmente com a enzima de capping de Vaccinia (VCE) utilizando o sistema de capping ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies), como descrito no manual do usuário; replicons com cap inserido desta forma recebem o prefixo "v", por exemplo, vA317 é o replicon A317 com cap inserido por VCE. O RNA com cap inserido pós- transcricionalmente foi precipitado com LiCl e reconstituído em água livre de nuclease. A concentração das amostras de RNA foi determinada pela medição da OD260nm. A integridade dos transcritos in vitro foi confirmada por eletroforese em gel de agarose desnaturante. Adsorção PLG
[00182] As micropartículas foram feitas usando 500mg de PLG RG503 (razão molar de lactídeo/glicolídeo 50:50, PM ~30kDa) e 20 mg de DOTAP usando um homogeneizador Omni
Macro. A suspensão de partículas foi agitada a 150 rpm durante a noite e, em seguida, filtrada através de um o filtro estéril de 40 µm para armazenamento a 2-8 C. O RNA autorreplicante foi adsorvido às partículas.Para preparar 1 mL de suspensão de PLG/RNA, o volume necessário de suspensão de partícula PLG foi adicionado a um frasco e água livre de nuclease foi adicionada para levar o volume a 900µL. Cem microlitros de RNA (10 µg/mL) foi adicionada gota a gota à suspensão de PLG, com agitação constante. O PLG/RNA foi incubado em temperatura ambiente por 30 min. Para 1 mL de suspensão reconstituída, 45mg de manitol, 15mg de sacarose e 250-500 µg de PVA foram adicionados. Os frascos foram congelados a -80oC e liofilizados.
[00183] Para avaliar a adsorção de RNA, 100 µL da suspensão de partículas foram centrifugados a 10.000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi coletado. O PLG/RNA foi reconstituído utilizando 1mL de água livre de nuclease. À 100 µL da suspensão de partículas (1 µg de RNA) foi adicionado 1mg de sulfato de heparina. A mistura foi agitada em vórtex e deixada em repouso à temperatura ambiente por 30 min para dessorção de RNA. A suspensão de partículas foi centrifugada e o sobrenadante foi coletado.
[00184] Para estabilidade de RNAse, 100 µL da suspensão de partículas foram incubados com 6,4mAU de RNase A à temperatura ambiente por 30 min. A RNAse foi inativada o com 0,126mAU de Proteinase K a 55 C por 10 min. Foi adicionado 1mg de sulfato de heparina para a desorção do RNA seguido de centrifugação.As amostras de sobrenadante contendo RNA foram misturadas com corante em tampão para o amostra com formaldeído, aquecidas a 65 C por 10 min e analisadas usando um gel desnaturante a 1% (460ng de RNA carregadas por raia).
[00185] Para avaliar a expressão, camundongos Balb/c foram imunizados com 1µg de RNA em 100 µL de volume de injeção intramuscular (50µL/perna) no dia 0. Os soros foram coletados nos dias 1, 3 e 6. A expressão proteica foi determinada utilizando um ensaio de quimioluminescência. Como mostrado na Figura 3, a expressão foi maior quando o RNA foi distribuído por PLG (triângulos) que sem qualquer partícula de distribuição (círculos). Encapsulamento lipossomal
[00186] O RNA foi encapsulado em lipossomos feitos pelo método das referências 7 e 44. Os lipossomos foram feitos de 10% de DSPC (zwiteriônico), 40% de DlinDMA (catiônico), 48% de colesterol e 2% de DMG conjugado a PEG (PEG de 2kDa). Essas proporções se referem a %> moles no lipossomo total.
[00187] DlinDMA (1,2-dilinoleilóxi-N,N-dimetil-3- aminopropano) foi sintetizado usando o procedimento da referência 2. DSPC (1,2-diastearoil-sn-glicero-3- fosfocolina) foi adquirido na Genzyme. O colesterol foi obtido da Sigma-Aldrich. O DMG conjugado a PEG (1,2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metóxi(polietileno glicol), sal de amônio), DOTAP (1,2- dioleoil-3-trimetilamônio-propano, sal de cloreto) e DC-col (cloridrato de 3-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]) colesterol foram da Avanti Polar Lipids.
[00188] Em resumo, os lipídeos foram dissolvidos em etanol (2 mL), um replicon de RNA foi dissolvido em tampão (2 mL, 100mM de citrato de sódio, pH 6) e estes foram misturados com 2 mL de tampão seguido de 1 hora de equilíbrio. A mistura foi diluída em 6mL de tampão, em seguida filtrada. O produto resultante continha lipossomos, com ~95% de eficiência de encapsulamento.
[00189] Por exemplo, em um determinado método, soluções-estoque lipídicas frescas foram preparadas em etanol. Foram pesados e dissolvidos 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DSPC, 27,8 mg de colesterol e 8,07 mg de PEG-DMG em 7,55 mL de etanol. A solução-estoque lipídica recém- preparada foi gentilmente oscilada a 37oC, por cerca de 15 min para formar uma mistura homogênea. Em seguida, 755 µL do estoque foram adicionados a 1,245 mL de etanol para fazer uma solução-estoque lipídica de trabalho de 2 mL. Esta quantidade de lipídeos foi usada para formar lipossomos com 250 µg de RNA. Uma solução de trabalho de 2 mL de RNA também foi preparada a partir de uma solução- estoque de ~1µg/µL em 100 mM de tampão citrato (pH 6). Três frascos de vidro de 20 mL (com magnetos) foram lavados com solução RNase Away (Molecular BioProducts) e lavados com muita água MilliQ antes do uso para descontaminar os frascos de RNases. Um dos frascos foi usado para a solução de trabalho de RNA e os outros para coletar as misturas de lipídeo e RNA (como descrito adiante). As soluções de RNA e lipídeo de trabalho foram aquecidas a 37oC por 10 min antes de serem carregadas em seringas luer-lok de 3cc. Foram carregados 2 mL de tampão citrato (pH 6) em outra seringa 3 cc. Seringas contendo RNA e os lipídeos foram conectadas a um misturador T (PEEKTM 500 µm ID junção, Idex Health Science) utilizando tubos de FEP (etileno-propileno fluorado; todos os tubos FEP usados tiveram um diâmetro interno de 2 mm e um diâmetro externo de 3mm; obtidos na Idex Health Science). A saída do misturador T também foi com tubos FEP.
A terceira seringa contendo o tampão citrato foi conectada a um pedaço de tubo separado.
Todas as seringas foram em seguida levadas a uma vazão de 7 mL/min utilizando uma bomba de seringa.
As saídas de tubo foram posicionadas para coletar as misturas em um frasco de vidro de 20 mL (durante a agitação). O magneto foi retirado e a solução de etanol/aquosa foi equilibrada a temperatura ambiente por 1 h.
Foram carregados 4 mL da mistura em uma seringa 5 cc, que foi conectada a um pedaço de tubo FEP e em outra seringa 5 cc conectada a um tubo FEP de mesmo comprimento, uma quantidade igual de tampão citrato (pH 6) a 100 mM foi carregada.
As duas seringas foram levadas â vazão de 7 mL/min usando a bomba de seringa e a mistura final, coletada em um frasco de vidro de 20 mL (durante a agitação). Em seguida, a mistura coletada a partir da segunda etapa de mistura (lipossomos) passou por uma membrana Mustang Q (um suporte de troca aniônica que se liga e remove moléculas aniônicas, obtida da Pall Corporation). Antes de utilizar esta membrana para os lipossomos, 4 mL de NaOH 1 M, 4 mL de NaCl 1 M e 10 mL de tampão citrato a 100 mM (pH 6) passaram sucessivamente através dela.
Os lipossomos foram aquecidos por 10 min a 37 [graus] C antes de passar pela membrana.
Em seguida, os lipossomos foram concentrados a 2 mL e dializados contra 10-15 volumes de PBS 1X usando filtração de fluxo tangencial antes de recuperar o produto final.
As membranas em fibra oca e sistema TFF foram adquiridos na Spectrum Labs (Rancho Dominguez) e foram utilizados de acordo com as orientações do fabricante. Foram usadas membranas de filtração por fibra oca de polissulfona com um limite de corte de tamanho de poro de 100 kD e área de superfície de 8 cm2. Para experimentos in vitro e in vivo, as formulações foram diluídas para a concentração de RNA necessária com PBS 1X. Métodos de fabricação de lipossomos adicionais são divulgados abaixo.
[00190] A figura 2 mostra um exemplo de micrografia eletrônica de lipossomos preparados por esses métodos. Estes lipossomos contêm RNA encapsulado que codifica antígeno RSV F completo. Espalhamento dinâmico de luz de um lote mostrou um diâmetro médio de 141nm (pela intensidade) ou 78nm (por número).
[00191] A porcentagem de RNA encapsulado e concentração de RNA foi determinada pelo kit de reagente de RNA Quant-iT RiboGreen (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. O padrão de RNA ribossomal, provido no kit foi usado para gerar uma curva padrão. Os lipossomos foram diluídos 10x ou 100x em tampão TE 1X (do kit) antes da adição do corante. Separadamente, os lipossomos foram diluídos 10x ou 100x em tampão TE 1X contendo 0,5% Triton X antes da adição do corante (para romper os lipossomos e assim avaliar o RNA total). Depois, uma quantidade igual de corante foi adicionada para cada solução e em seguida ~180 µL de cada solução após a adição de corante foram carregados em duplicata em uma placa de cultura de tecido de 96 poços. A fluorescência (Ex 485 nm, Em 528 nm) foi lida em um leitor de microplacas. Todas as formulações de lipossomos foram dosadas in vivo com base na quantidade de RNA encapsulado.
[00192] O encapsulamento em lipossomos demonstrou proteger o RNA da digestão por RNase.
Os experimentos usaram 3,8mAU de RNase A por micrograma de RNA, incubados por 30 minutos à temperatura ambiente.
A RNAse foi inativada com Proteinase K a 55 [graus]C por 10 minutos.
Uma mistura v/v 1:1 de amostra para 25:24:1 v/v/v de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico foi adicionada em seguida para extrair o RNA dos lipídeos na fase aquosa.
As amostras foram misturadas por agitação em vórtes durante alguns segundos e, em seguida, colocadas em uma centrífuga por 15 minutos a 12 k RPM.
A fase aquosa (contendo o RNA) foi removida e usada para analisar o RNA.
Antes de carregar (400 ng de RNA por poço) todas as amostras foram incubadas tampão de amostra com formaldeído, desnaturadas por 10 minutos a 65oC e resfriadas a temperatura ambiente.
Marcadores da Ambion Millennium foram usados para aproximar o peso molecular da construção de RNA.
O gel foi corrido a 90 V.
O gel foi corado usando 0,1% de SYBR gold de acordo com as orientações do fabricante em água por oscilação em temperatura ambiente por 1 hora.
A figura 1 mostra que a RNase digere completamente o RNA na ausência de encapsulamento (raia 3). O RNA é indetectável após encapsulamento (raia 4), e nenhuma mudança é vista se esses lipossomos forem tratados com RNase (raia 4). Após serem tratados com RNase, os lipossomos são submetidos a extração com fenol, RNA não digerido é visto (raia 6). Mesmo depois de 1 semana a 4oC, o RNA poderia ser visto sem qualquer fragmentação (Figura 4, seta). A expressão proteica in vivo estava inalterada após 6 semanas a 4oC e um ciclo de congelamento-descongelamento. Portanto, o RNA encapsulado em lipossomo é estável.
[00193] Para avaliar a expressão in vivo do RNA, uma enzima repórter (SEAP; fosfatase alcalina secretada) foi codificada no replicon, ao invés de um imunógeno. Os níveis de expressão foram medidos em soros diluídos 1:4 em tampão de diluição Phospha-Light 1X usando um substrato fosfato alcalino quimioluminescente. Camundongos BALB/c de 8-10 semanas de idade (5/grupo) foram injetados por via intramuscular no dia 0, 50µL por perna com dose de RNA de 0,1µg ou 1µg. O mesmo vetor também foi administrado sem os lipossomos (em PBS 1X sem RNase) a 1µg. Replicons embalados por vírion ambém foram testados. Replicons embalados por vírion usados neste documento (referidos como "VRPs") foram obtidos com os métodos da referência 45, onde o replicon de alfavírus é derivado do VEEV mutante ou de uma quimera derivada do genoma de VEEV engenheirado para conter a UTR 3' do vírus sindbis e um sinal de empacotamento (PS) do vírus sindbis, embalado por co-eletroporação deles em células BHK com RNAs auxiliares defeituosos que codifiquem os genes de glicoproteína e de capsídeo do vírus sindbis.
[00194] Como mostrado na Figura 5, o encapsulamento aumentou os níveis de SEAP em cerca de ½ log na dose de ^g, e no dia 6 a expressão a partir de dose encapsulada de O.^g correspondeu a níveis vistos com dose não encapsulada de ^g. No dia 3, os níveis de expressão excederam os alcançados com VRPs (quadrados). Assim, os expressos aumentaram quando o RNA foi formulado em lipossomos em relação ao controle de RNA puro, mesmo em uma dose mais baixa de 10x. A expressão também foi maior em relação ao controle VRP, mas a cinética de expressão foi muito diferente (veja a Figura 5). A distribuição do RNA com eletroporação resultou na expressão aumentada em relação ao controle de RNA puro, mas estes níveis foram inferiores aos de lipossomos.
[00195] Experimentos com SEAP adicionais mostraram uma clara dose-resposta in vivo, com a expressão vista após a distribuição de tão pouco quanto 1ng de RNA (Figura 6). Experimentos adicionais comparando a expressão de replicons encapsulados e puros indicaram que 0,01µg de RNA encapsulado era equivalente a 1µg de RNA puro. Com uma dose de 0,5µg de RNA, o material encapsulado deu uma expressão 12 vezes maior no dia 6; com 0,1µg de dose os níveis foram 24 vezes maiores no dia 6.
[00196] Em vez de avaliar níveis médios no grupo, animais individuais também foram estudados. Embora diversos animais não tenham respondido aos replicons puros, o encapsulamento eliminou os não respondedores.
[00197] Experimentos adicionais substituíram DlinDMA por DOTAP. Embora os lipossomos com DOTAP tenham dado melhor expressão do que o replicon puro, foram inferiores aos lipossomos com DlinDMA (diferença de 2 a 3 vezes no dia 1).
[00198] Para avaliar a imunogenicidade in vivo, foi construído um replicon para expressar a proteína F completa do vírus sincicial respiratório (VSR). Este foi distribuído puro (1µg), encapsulado em lipossomos (0,1 ou 1µg), ou embalado em vírions (106 UI; "VRP") nos dias 0 e 21. A figura 7 mostra títulos de IgG anti-F 2 semanas após a segunda dose, e os lipossomos claramente intensificam a imunogenicidade. A figura 8 mostra títulos 2 semanas mais tarde, ponto pelo qual não houve diferença estatística entre o RNA encapsulado a 0,1µg, o RNA encapsulado a 1µg, e o grupo VRP. Títulos de neutralização (medidos como 60% de redução de placa, "PRNT60") não foram significativamente diferentes nestes três grupos 2 semanas após a segunda dose (Figura 9). A figura 12 mostra os títulos de PRNT e IgG 4 semanas após a segunda dose.
[00199] A figura 13 confirma que o RNA provoca uma resposta robusta de células T CD8.
[00200] Experimentos adicionais compararam títulos de IgG específicos para F emcamundongos que recebem VRP, 0,1µg de RNA encapsulado em lipossomo, ou 1µg de RNA encapsulado em lipossomo. Proporções de título (VRP:lipossomo) em vários momentos após a segunda dose foram como se segue: 2 semanas 4 semanas 8 semanas 0,1µg 2,9 1,0 1,1 1µg 2,3 0,9 0,9
[00201] Assim, o RNA encapsulado em lipossomo induz essencialmente a mesma magnitude de resposta imune como visto com a distribuição por vírion.
[00202] Experimentos adicionais mostraram respostas de IgG específico para F superiores com uma dose de 10µg, respostas equivalentes para doses de 1µg e 0,1µg, e uma menor resposta com uma dose de 0,01µg. A figura 11 mostra os títulos de IgG emcamundongos que recebem o replicon na forma pura em 3 doses diferentes, em lipossomas em 4 doses diferentes, ou como VRP (106 UI). A resposta vista com 1µg de RNA encapsulado em lipossomo foi estatisticamente insignificante (ANOVA) quando comparada a VRP, mas a maior resposta vista com 10µg de RNA encapsulado em lipossomo foi estatisticamente significante (p < 0,05) em comparação com ambos desses grupos.
[00203] Um estudo adicional confirmou que as 0,1µg de RNA encapsulado em lipossomo deram respostas de IgG anti-F muito maiores (15 dias após a segunda dose) do que 0,1µg de DNA distribuído, e ainda foram mais imunogênicas do que 20µg de DNA plasmidial codificando o antígeno F, distribuído por eletroporação (sistema de entrega de DNA ElgenTM, Inovio).
[00204] Os camundongos mostraram poucos sinais visuais de angústia (perda de peso, etc.) após receberem replicon de RNA encapsulado em lipossomo, embora uma perda de peso transitória de 3-4% tenha sido vista após uma segunda dose de 10µg de RNA. Em contraste, a distribuição de 10µg de DNA encapsulado em lipossomo levou a 8-10% de perda de peso. Mecanismo de ação
[00205] Células dendríticas derivadas de medula óssea (pDC) foram obtidas de camundongos selvagens ou da cepa mutante "Resq" (rsq1). A cepa mutante tem uma mutação pontual na extremidade amino-terminal de seu receptor TLR7 que abole a sinalização de TLR7 sem afetar a ligação ao ligante [46]. As células foram estimuladas com RNA de replicon formulado com DOTAP, lipofectamina 2000 ou dentro de um lipossomo. Como mostrado na Figura 17, IL-6 e INFa foram induzidos em células WT, mas essa resposta foi quase totalmente revogada em camundongos mutantes. Estes resultados mostram que o TLR7 é necessário para o reconhecimento de RNA em células imunes, e que replicons encapsulados em lipossomo podem fazer células imunes secretar altos níveis tanto de interferons como de citocinas pró-inflamatórias.
[00206] Em geral, os replicons de RNA distribuídos por lipossomo demonstraram induzir várias citocinas séricas até 24 horas após a injeção intramuscular (IFN-α, IP-10 (CXCL-10), IL-6, KC, IL-5, IL-13, MCP-1 e MIP-a), embora só MIP-1 tenha sido induzida por RNA puro e o lipossomo sozinho induzido apenas IL-6.
[00207] Demonstrou-se que IFN-α contribui para a resposta imune ao replicon que codifica RSV-F encapsulado em lipossomo, porque um anticorpo anti-receptor de IFNa (IFNAR1) reduziu a IgG sérica específica para F em uma redução de 10 vezes após 2 vacinações.
[00208] Replicons de RNA distribuídos por lipossomo em geral têm sido vistos como provocadores de um perfil de subtipo IgG1:IgG2 equilibrado em camundongos, às vezes com uma maior razão IgG2a/IgG1 do que o visto com DNA eletroporado ou com imunizações de proteína/MF59 (ou seja, uma resposta imune tipo Th1). Métodos de fabricação de lipossomo
[00209] Em geral, oito diferentes métodos têm sido utilizados para a preparação de lipossomos de acordo com a invenção. Estes são referidos no texto como métodos (A) a (H) e diferem principalmente em relação à filtragem e etapas de TFF. Detalhes são como se segue:
[00210] Soluções-estoque lipídicas frescas em etanol foram preparadas. Foram pesados e dissolvidos 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DSPC, 27,8 mg de colesterol e 8,07 mg de PEG DMG 2000 em 7,55 mL de etanol.
A solução-estoque lipídica recém-preparada foi gentilmente oscilada a 37oC, por cerca de 15 min para formar uma mistura homogênea.
Em seguida, 755 µL do estoque foram adicionados a 1,245 mL de etanol para fazer uma solução-estoque lipídica de trabalho de 2 mL.
Esta quantidade de lipídeos foi usada para formar lipossomos com 250 µg de RNA.
Uma solução de trabalho de 2 mL de RNA também foi preparada a partir de uma solução- estoque de ~ 1µg/µL em 100 mM de tampão citrato (pH 6). Três frascos de vidro de 20 mL (com magnetos) foram rinsados com solução RNase Away (Molecular BioProducts, San Diego, CA) e lavados com muita água MilliQ antes do uso para descontaminar os frascos de RNases.
Um dos frascos foi usado para a solução de trabalho de RNA e os outros para coletar as misturas de lipídeo e RNA (como descrito adiante). As soluções de RNA e lipídeo de trabalho foram aquecidas a 37 [graus] C por 10 min antes de serem carregadas em seringas luer-lok de 3cm3. Foram carregados 2 mL de tampão citrato (pH 6) em outra seringa 3 cm3. Seringas contendo RNA e os lipídeos foram conectadas a um misturador T (PEEKTM 500 µm ID junção, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) utilizando tubos de FEP (etileno-propileno fluorado; todos os tubos FEP têm um diâmetro interno de 2 mm x diâmetro externo de 3mm, fornecidos por Idex Health Science). A saída do misturador T também foi com tubos FEP.
A terceira seringa contendo o tampão citrato foi conectada a um pedaço de tubo FEP separado.
Todas as seringas foram em seguida levadas a uma vazão de 7 mL/min utilizando uma bomba de seringa.
As saídas de tubo foram posicionadas para coletar as misturas em um frasco de vidro de 20 mL (durante a agitação). O magneto foi retirado e a solução de etanol/aquosa foi equilibrada a temperatura ambiente por 1 hora.
Foram carregados 4 mL da mistura em uma seringa 5 cm3, que foi conectada a um pedaço de tubo FEP e em outra seringa 5 cm3 conectada a um tubo FEP de mesmo comprimento, uma quantidade igual de tampão citrato (pH 6) a 100 mM foi carregada.
As duas seringas foram levadas â vazão de 7 mL/min usando a bomba de seringa e a mistura final, coletada em um frasco de vidro de 20 mL (durante a agitação). Em seguida, a mistura coletada a partir da segunda etapa de mistura (lipossomos) passou por uma membrana Mustang Q (um suporte de troca aniônica que se liga e remove moléculas aniônicas, obtida da Pall Corporation, AnnArbor, MI, USA). Antes de passar os lipossomos, 4 mL de NaOH 1 M, 4 mL de NaCl 1 M e 10 mL de tampão citrato a 100 mM (pH 6) passaram sucessivamente através da membrana Mustang.
Os lipossomos foram aquecidos por 10 min a 37 [graus] C antes de passar pela membrana.
Em seguida, os lipossomos foram concentrados a 2 mL e dializados contra 10-15 volumes de PBS 1X usando TFF antes de recuperar o produto final.
As membranas de filtração em fibra oca e sistema TFF foram adquiridos na Spectrum Labs e foram utilizados de acordo com as orientações do fabricante.
Foram usadas membranas de filtração por fibra oca de polissulfona (número da peça P/N: X1AB-100-20P) com um limite de corte de tamanho de poro de 100 kD e área de superfície de 8 cm2. Para experimentos in vitro e in vivo, as formulações foram diluídas para a concentração de RNA necessária com PBS 1X.
[00211] Como o método (A), exceto que, após a oscilação, 226,7 µL do estoque foram adicionados a 1,773 mL de etanol para fazer uma solução-estoque lipídica de trabalho de 2 mL, modificando assim a proporção de lipídeo:RNA.
[00212] Como o método (B) exceto que a filtração em Mustang foi omitida, então os lipossomos foram do frasco de vidro de 20 mL para a diálise TFF.
[00213] Como o método C, exceto que o TFF usou membranas de fibra oca de polietersulfona (PES) (número de peça 1 (P-C 1 - 100E- 100-0 IN) com um limite de corte de tamanho de poro de 100 kD e área de superfície de 20 cm2.
[00214] Como o método (D) exceto que a membrana Mustang foi usada, como no método (A).
[00215] Como o método (A) exceto que a filtração em Mustang foi omitida, então os lipossomos foram do frasco de vidro de 20 mL para a diálise TFF.
[00216] Como o método (D), exceto que uma solução de trabalho de 4 mL de RNA foi preparada a partir de uma solução-estoque de ~1µg/µL em 100 mM de tampão citrato (pH 6). Em seguida, quatro frascos de vidro de 20 mL foram preparados da mesma maneira. Dois deles foram usados para a solução de trabalho de RNA (2 mL em cada frasco) e os outros para coletar as misturas de lipídeos e RNA, como em (C). Ao invés do uso de misturador T, seringas contendo RNA e os lipídeos foram conectadas a um Chip de junção de Mitos Droplet (um dispositivo microfluidico de vidro obtido da Syrris, No. da peça 3000158) usando tubos PTFE (0,03 polegadas de diâmetro interno x 1/16 polegadas de diâmetro externo) que usa um conector de borda de 4-vias (Syrris).
Dois fluxos de RNA e um fluxo de lipídeos foram impulsionados por bombas de seringa e a mistura do etanol e fase aquosa foi feita na junção X (100 µm x 105 µm) do chip. A vazão de todos os três fluxos foi mantida a 1,5 mL/min, daí a razão da vazão aquosa total para a de etanol foi de 2:1. A saída do tubo foi posicionada para coletar as misturas em um frasco de vidro de 20 mL (durante a agitação). O magneto foi retirado e a solução de etanol/aquosa foi equilibrada a temperatura ambiente por 1 h. Em seguida, a mistura foi carregada em uma seringa 5 cm3, que foi equipada para outro pedaço de tubo de PTFE; em outra seringa 5 cm3 com igual comprimento de tubo PTFE, um volume igual de tampão citrato a 100 mM (pH 6) foi carregado. As duas seringas foram levadas â vazão de 3 mL/min usando uma bomba de seringa e a mistura final coletada em um frasco de vidro de 20 mL (durante a agitação). Em seguida, os lipossomos foram concentrados a 2 mL e dializados contra 10-15 volumes de PBS 1X usando TFF, como em (D).
[00217] Como no método (A), exceto que os 2mL de solução-estoque de lipídeos de trabalho foram feitos pela mistura de 120,9 µL do estoque de lipídeos com 1,879 mL de etanol. Além disso, após a mistura no misturador T, os lipossomos do frasco de 20 mL foram carregados em cassete de diálise Slide-A-Lyzer da Pierce (Thermo Scientific, força extra, 0,5-3 mL de capacidade) e dializados contra 400-500 mL de PBS 1X durante a noite a 4oC em um recipiente de plástico autoclavado antes de recuperar o produto final. Expressão em BHK
[00218] Lipossomos com diferentes lipídeos foram incubados com células BHK durante a noite e avaliados em relação à potência de expressão proteica. A partir de uma linha de base com RV05 a expressão de lipídeos poderia ser aumentada 18x, pela adição de 10% de 1,2-difitanoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DPyPE) ao lipossomo, 10x pela adição de 10% de 18:2 (cis) fosfatidilcolina e 900 x usando em vez disso RV01.
[00219] Em geral, estudos in vivo mostraram que caudas lipídicas insaturadas tendem a aumentar títulos de IgG produzidos contra antígenos codificados. Imunogenicidade de RSV
[00220] O replicon autorreplicante vA317 que codifica a proteína F de RSV foi administrado a camundongos BALB/c, 4 ou 8 animais por grupo, por vacinações intramusculares bilaterais (50 µL por perna) nos dias 0 e 21 com o replicon (1µg) sozinho ou formulado como lipossomos com DlinDMA ("RV01") ou DOTAP ("RV13"). Os lipossomos RV01 tinham 40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de colesterol e 2% de PEG-DMG, mas com diferentes quantidades de RNA. Os lipossomos de RV13 tinham 40% de DOTAP, 10% de DPE, 48% de colesterol e 2% de PEG-DMG. Para comparação, o DNA plasmidial puro (20 µg) expressando o mesmo antígeno RSV-F foi distribuído usando eletroporação ou com lipossomos RV01(10) (0,1µg de DNA). Quatro camundongos foram usados como grupo controle naïve.
[00221] Os lipossomos foram preparados pelo método (D) ou método (B). Para alguns lipossomas feitos pelo método (D), foi utilizada o dobro ou a metade da quantidade de RNA. O diâmetro médio da partícula Z, índice de polidispersividade e eficiência de encapsulamento dos lipossomas foram os seguintes: RV Zav (nm) pdI % de Preparação encapsulamento RV01 (10) 158,6 0,088 90,7 (A) RV01 (08) 156,8 0,144 88,6 (A) RV01 (05) 136,5 0,136 99 (B) RV01 (09) 153,2 0,067 76,7 (A) RV01 (10) 134,7 0,147 87,8* (A) RV01 (02) 128,3 0,179 97 (A) * Para esta formulação RV01(10), o ácido nucleico foi DNA não RNA
[00222] O soro foi coletado para análise de anticorpos nos dias 14, 36 e 49. Baços foram coletados de camundongos no dia 49 para análise de células T.
[00223] Títulos de IgG de soro específico para F (GMT) foram os seguintes: RV Dia 14 Dia 36 Plasmídeo de DNA 439 6712 puro RNA A317 puro 78 2291 RV01 (10) 3020 26170 RV01 (08) 2326 9720 RV01 (05) 5352 54907 RV01 (09) 4428 51316 DNA RV01 (10) 5 13 RV13 (02) 644 3616
[00224] A proporção de células T que são citocina- positivas e específicas para o peptídeo F51-66 de RSV é como se segue, apresentando apenas figuras que estão estatistica e significativamente acima de zero: RV CD4+CD8- CD4-CD8+ IFNγ IL2 IL5 TNFα IFNγ IL2 IL5 TNFα Plasmídeo de 0,04 0,07 0,10 0,57 0,29 0,66 DNA puro RNA A317 puro 0,04 0,05 0,08 0,57 0,23 0,67 RV01 (10) 0,07 0,10 0,13 1,30 0,59 1,32 RV01 (08) 0,02 0,04 0,06 0,46 0,30 0,51 RV01 (05) 0,08 0,12 0,15 1,90 0,68 1,94 RV01 (09) 0,06 0,08 0,09 1,62 0,67 1,71 DNA RV01 (10) 0,03 0,08 RV13 (02) 0,03 0,04 0,06 1,15 0,41 1,18
[00225] Assim, as formulações de lipossomo intensificaram significativamente a imunogenicidade em relação aos controles de RNA puro, como determinado pelo aumento de títulos de IgG específicos para F e frequências de células T. O DNA plasmidial formulado com lipossomos, ou distribuído puro usando eletroporação, foi significativamente menos imunogênico que o RNA autorreplicante formulado em lipossomo.
[00226] As vacinas de RNA de RV01 foram mais imunogênicas que a vacina de RV13. RV01 tem uma amina terciária no grupo de cabeça com um pKa de cerca de 5,8 e também inclui caudas de alquila insaturada. RV13 tem caudas de alquila insaturada, mas sua cabeça de grupo tem uma amina quaternária e é muito fortemente catiônica. Lipossomos - exigência para o encapsulamento
[00227] Para avaliar se o efeito visto nos grupos de lipossomos deveu-se meramente aos componentes do lipossomo,
ou se estava relacionado com o encapsulamento, o replicon foi administrado na forma encapsulada (com dois protocolos diferentes de purificação, 0,1µg de RNA), ou misturado com os lipossomos após sua formação (um "lipoplex" não encapsulado, 0,1µg de RNA), ou como RNA puro (1µg). A Figura 10 mostra que o lipoplex deu os mais baixos níveis de expressão, mostrando que mostra o encapsulamento é essencial para a expressão potente.
[00228] Experimentos adicionais usaram três RNAs diferentes: (i) replicon 'vA317' que expressa RSV-F, ou seja, a glicoproteína de fusão de superfície de VRS; (ii) replicon 'vA17' que expressa GFP; e (iii) 'vA336' que é defeituoso em replicação e codifica GFP.
[00229] Os RNAs foram distribuídos puros ou com lipossomos feitos pelo método (D). Lipossomos vazios foram feitos pelo método (D) mas sem qualquer RNA. Quatro formulações de lipossomo tinham estas características: RNA Tamanho da Polidispersividade Encapsulamento Partícula de RNA Zav (nm) vA317 155,7 0,113 86,6% vA17 148,4 0,139 92% vA336 145,1 0,143 92,9% Vazio 147,9 0,147 -
[00230] Camundongos BALB/c, 5 animais por grupo, receberam vacinas intramusculares bilaterais (50 por perna) nos dias 0 e 21 com:
[00231] Grupo 1 RNA de RSV-F suto-replicante puro (vA317, 0,1µg)
[00232] Grupo 2 RNA de RSV-F autorreplicante (vA317, 0,1 µg) encapsulado em lipossomos
[00233] Grupo 3 RNA de RSV-F autorreplicante (vA317, 0,1 µg) adicionado aos lipossomos vazios
[00234] Grupo 4 proteína de subunidade F (5 µg)
[00235] O soro foi coletado para análise de anticorpos nos dias 14, 35 e 51. Títulos de IgG de soro específico para F (GMT) foram medidos; se um animal individual tinha um título de <25 (limite de detecção), a ele era atribuído um título de 5. Além disso, baços foram coletados de camundongos no dia 51 para análise de células T, para determinar as células que eram citocina-positivas e específicas para o peptídeo F51-66 de RSV (CD4+) ou para os peptídeos F de RSV F85-93 e F249-258 (CD8+).
[00236] Os títulos de IgG foram como a seguir, nos grupos e em camundongos controle não imunizados: Dia 1 2 3 4 - 14 22 1819 5 5 5 290 32533 9 19877 5 51 463 30511 18 20853 5
[00237] Títulos de neutralização de soro de RSV no dia 51 foram os seguintes: Dia 1 2 3 4 51 35 50 24 38
[00238] Animais mostrando células T esplênicas CD4+ específicas para F de RSV no dia 51 foram os seguintes, onde um número (% de células positivas) é dado somente se a resposta estimulada estiver estatistica e significativamente acima de zero: Citocina 1 2 3 4
IFN-γ 0,04 IL2 0,02 0,06 0,02 IL5 TNFα 0,03 0,05
[00239] Animais mostrando células T esplênicas CD8+ específicas para F de RSV no dia 51 foram os seguintes, onde um número é dado somente se a resposta estimulada estiver estatistica e significativamente acima de zero: Citocina 1 2 3 4 IFN-γ 0,37 0,87 IL2 0,11 0,40 0,04 IL5 TNFα 0,29 0,79 0,06
[00240] Assim, o encapsulamento de RNA nos lipossomos é necessário de a imunogenicidade elevada, visto que uma mistura simples de RNA e dos lipossomas (grupo 3) não foi imunogênica (na verdade, menos imunogênica que o RNA puro).
[00241] Em outros estudos, camundongos receberam várias combinações de (i) replicon de RNA autorreplicante codificando proteína completa de F de RSV (ii) replicon de RNA codificando GFP autorreplicante (iii) replicon de RNA codificando GFP com um nocaute em nsP4 que elimina a auto- replicação (iv) proteína F completa de RSV. 13 grupos receberam no total: A - - B 0,1µg de (i), puro - C 0,1µg de (i), encapsulado em - lipossomo D 0,1µg de (i), com lipossomos -
separados E 0,1µg de (i), puro 10µg de (ii), puro F 0,1µg de (i), puro 10µg de (iii), puro G 0,1µg de (i), encapsulado em 10µg de (ii), puro lipossomo H 0,1µg de (i), encapsulado em 10µg de (iii), puro lipossomo I 0,1µg de (i), encapsulado em 1µg de (ii), encapsulado lipossomo em lipossomo J 0,1µg de (i), encapsulado em 1µg de (iii), lipossomo encapsulado em lipossomo K 5µg de proteína F - L 5µg de proteína F 1µg de (ii), encapsulado em lipossomo M 5µg de proteína F 1µg de (iii), encapsulado em lipossomo
[00242] Os resultados na Figura 16 mostraram que respostas de IgG específicas para F requeriram encapsulamento no lipossomo em vez de mera co-distribuição (comparar grupos C & D). Uma comparação dos grupos K, L e M mostra que o RNA proveu um efeito adjuvante contra a proteína co-distribuída, e este efeito foi visto tanto com o RNA replicante como com o não replicante. A imunogenicidade de RSV em diferentes cepas de camundongo
[00243] O replicon "vA142" codifica a glicoproteína de fusão (F) de superfície selvagem completa de RSV, mas com o peptídeo de fusão deletado, e a extremidade 3' é formada por clivagem mediada por ribozima. Foi testado em três cepas de camundongo diferentes.
[00244] Camundongos BALB/c receberam vacinas intramusculares bilaterais (50 µL por perna) nos dias 0 e
22. Os animais foram divididos em 8 grupos de teste (5 animais por grupo) e um controle naïve (2 animais):
[00245] O grupo 1 recebeu replicon puro (1 µg).
[00246] O grupo 2 recebeu 1µg de replicon distribuído em lipossomos "RV01(37)" com 40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de Choi, 2% de DMG conjugado a PEG.
[00247] O grupo 3 recebeu o mesmo que o grupo 2, mas em 0,1µg de RNA.
[00248] O grupo 4 recebeu 1µg de replicon em lipossomos "RV17(10)" (40% de RV17 (veja acima), 10% de DSPC, 49,5% de colesterol, 0,5% de PEG-DMG).
[00249] O grupo 5 foi 1µg de replicon em lipossomos "RV05(11)" (40% de lipídeo RV07, 30% de PE 18:2 (DLoPE, 28% de colesterol, 2% de PEG-DMG).
[00250] O grupo 6 recebeu 0,1µg de replicon em lipossomos "RV 17(10)".
[00251] O grupo 7 recebeu 5 µg de proteína de subunidade RSV-F com adjuvante hidróxido de alumínio.
[00252] O grupo 8 foi um controle naïve (2 animais)
[00253] Os soros foram coletados para análise de anticorpos nos dias 14, 35 e 49. GMTs de IgG de soro específico para F foram: Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 14 82 2463 1789 2496 1171 1295 1293 5 1538 34181 25605 23579 13718 8887 73809 5
[00254] No dia 35 títulos de IgG1 e IgG2a específicos para F (GMT), foram os seguintes: IgG 1 2 3 4 5 6 7
IgG1 94 6238 4836 7425 8288 1817 78604 IgG2a 5386 77064 59084 33749 14437 17624 24
[00255] Títulos de anticorpos neutralizantes de soro de RSV nos dias 35 e 49 foram os seguintes (dados são 60% de títulos de neutralização de redução de placa de combinações de 2-5 camundongos, 1 combinação por grupo): Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 35 <20 143 20 101 32 30 111 <20 49 <20 139 <20 83 41 32 1009 <20
[00256] Os baços foram coletados no dia 49 para análise de células T. As frequências médias líquidas de células T citocina-positivas específicas para F (CD4+ ou CD8+) foram as seguintes, apresentando apenas figuras que estavam estatistica e significativamente acima de zero (específicos para os peptídeos de RSV F51-66, F 164- 178, F309-323 para CD4+, ou para os peptídeos F85-93 e F249-258 para CD8+): Grupo CD4+CD8- CD4-CD8+ IFNγ IL2 IL5 TNFα IFNγ IL2 IL5 TNFα 1 0,03 0,06 0,08 0,47 0,29 0,48 2 0,05 0,10 0,08 1,35 0,52 1,11 3 0,03 0,07 0,06 0,64 0,31 0,61 4 0,05 0,09 0,07 1,17 0,65 1,09 0,03 0,08 0,07 0,65 0,28 0,58 6 0,05 0,07 0,07 0,74 0,36 0,66 7 0,02 0,04 0,04 8
[00257] Camundongos C57BL/6 foram imunizados da mesma forma, mas um 9o grupo recebeu VRPs (1x106 UI)
expressando a glicoproteína de fusão de superfície selvagem completa de RSV (deleção do peptídeo de fusão).
[00258] Os soros foram coletados para análise de anticorpos nos dias 14, 35 & 49. Títulos (GMT) de IgG específico para F foram: Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 14 1140 2133 1026 2792 3045 1330 2975 5 1101 1721 5532 3184 3882 9525 2409 39251 5 12139
[00259] No dia 35 títulos de IgG1 e IgG2a específicos para F (GMT), foram os seguintes: IgG 1 2 3 4 5 6 7 8 IgG1 66 247 14 328 468 92 56258 79 IgG2a 2170 7685 5055 6161 1573 2944 35 14229
[00260] Títulos de anticorpos neutralizantes de soro de RSV nos dias 35 e 49 foram os seguintes (dados são 60% de títulos de neutralização de redução de placa de combinações de 2-5 camundongos, 1 combinação por grupo): Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 35 <20 27 29 22 36 <20 28 <20 <20 49 <20 44 30 23 36 <20 33 <20 37
[00261] Os baços foram coletados no dia 49 para análise de células T. As frequências médias líquidas de células T citocina-positivas específicas para F (CD8+) foram as seguintes, apresentando apenas figuras que estavam estatistica e significativamente acima de zero (específicas para os peptídeos de RSV F85-93 e F249-258): Grupo CD4-CD8+ IFNγ IL2 IL5 TNFα 1 0,42 0,13 0,37
2 1,21 0,37 1,02 3 1,01 0,26 0,77 4 1,26 0,23 0,93 2,13 0,70 1,77 6 0,59 0,19 0,49 7 0,10 0,05 8 9 2,83 0,72 2,26
[00262] Nove grupos de camundongos C3H/HeN foram imunizados da mesma forma. Títulos (GMT) de IgG específicos para F foram: Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 14 5 2049 1666 1102 298 984 3519 5 806 152 27754 19008 17693 3424 6100 62297 5 17249
[00263] No dia 35 títulos de IgG1 e IgG2a específicos para F (GMT), foram os seguintes: IgG 1 2 3 4 5 6 7 8 IgG1 5 1323 170 211 136 34 83114 189 IgG2a 302 136941 78424 67385 15667 27085 3800 72727
[00264] Títulos de anticorpos neutralizantes de soro de RSV nos dias 35 e 49 foram os seguintes: Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 35 <20 539 260 65 101 95 443 <20 595 49 <20 456 296 35 82 125 1148 <20 387
[00265] Assim, três lipídeos diferentes (RVOl, RV05, RV17; pKa 5,8, 5,85, 6,1) foram testados em três diferentes cepas de camundongo endogâmicos. Para todas as 3 cepas, RVOl foi mais eficaz do que RV17; para as cepas BALB/c e C3H, RV05 foi menos eficaz do que RVOl ou RV17, mas foi mais eficaz na cepa B6. Em todos os casos, no entanto, os lipossomos foram mais eficazes do que duas nanoemulsões catiônicas que foram testadas em paralelo. A imunogenicidade de CMV
[00266] Lipossomos RV01 com DLinDMA como o lipídeo catiônico foram usados para distribuir replicons de RNA codificando glicoproteínas de citomegalovírus (CMV). O replicon "vA160" codifica glicoproteínas completas H e L (gH/gL), enquanto o replicon "vA322" codifica uma forma solúvel (gHsol/gL). As duas proteínas estão sob o controle de promotores subgenômicos separados em um único replicon; a co-administração de dois vetores separados, um codificando gH e um codificando gL, não deu bons resultados.
[00267] Camundongos BALB/c, 10 por grupo, receberam vacinas intramusculares bilaterais (50 µL por perna) nos dias 0, 21 e 42 com VRPs expressando gH/gL (1x106 UI), VRPs expressando gHsol/gL (1x106 UI) e PBS como controles. Dois grupos de teste receberam 1µg do replicon vA160 ou vA322 formulado em lipossomos (40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de Choi, 2% de PEG-DMG; feitos usando o método (D), mas com 150 µg de RNA de tamanho de lote).
[00268] Os lipossomos de vA160 tinham um diâmetro Zav de168nm, um pdl de 0,144 e 87,4% de encapsulamento. Os lipossomos de vA322 tinham um diâmetro Zav de162nm, um pdl de 0,131 e 90% de encapsulamento.
[00269] Os replicons foram capazes de expressar duas proteínas a partir de um único vetor.
[00270] Os soros foram coletados para análise imunológica no dia 63 (3wp3). Os títulos de neutralização de CMV (a recíproca da diluição do soro produzindo uma redução de 50% no número de focos de vírus positivo por poço, em relação aos controles) foram os seguintes: gH/gL de VRP gHsol/gL de gH/gL de gHsol/gL de VRP lipossomo lipossomo 4576 2393 4240 10062
[00271] RNA expressando uma forma completa ou solúvel do complexo gH/gL de CMV assim provocou altos títulos de anticorpos, neutralizantes, como analisada em células epiteliais. Os títulos médios provocados pelos RNAs encapsulados em lipossomos foram pelo menos tão altos quanto os VRPs correspondentes.
[00272] Experimentos repetidos confirmaram que o replicon foi capaz de expressar duas proteínas a partir de um único vetor. O replicon de RNA deu um título 3wp3 de 11457, comparado a 5516 com VRPs.
[00273] Experimentos adicionais usaram replicons diferentes, além de vA160. O replicon vA526 expressa o complexo pentamérico de CMV (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) sob o controle de três promotores subgenômicos: o primeiro conduz a expressão de gH; o segundo conduz a expressão de gL; o terceiro conduz a expressão da poliproteína UL128-2A- UL130-2A-UL131, que contém dois sítios de clivagem 2A entre os três genes UL. O replicon vA527 expressa o complexo pentamérico de CMV através de três promotores subgenômicos e dois IRESs: o primeiro promotor subgenômico conduz a expressão de gH; o segundo promotor subgenômico conduz a expressão de gL; o terceiro promotor subgenômico conduz a expressão de UL128; UL130 está sob o controle de um IRES de EMCV; UL131 está sob o controle de um IRES de EV71. Esses três replicons foram distribuídos por lipossomo (método (H), com 150µg de tamanho de lote) ou por VRPs.
[00274] Camundongos BALB/c, 10 grupos de 10 animais, receberam vacinas intramusculares bilaterais (50 µL por perna) nos dias 0, 21 e 42 com:
[00275] Grupo 1 VRPs expressando gH FL/gL (1x106 UI)
[00276] Grupo 2 pentamérica, 2A VRP (1x105 UI)
[00277] Grupo 3 pentamérica, 2A VRP (1x106 UI)
[00278] Grupo 4 pentamérica, IRES VRP (1x105 UI)
[00279] Grupo 5 vA160 de RNA autorreplicante (1µg) formulado em lipossomos
[00280] Grupo 6 vA256 de RNA autorreplicante (1µg) formulado em lipossomos
[00281] Grupo 7 vA527 de RNA autorreplicante (1µg) formulado em lipossomos
[00282] Grupo 8 vA160 de RNA autorreplicante (1µg) formulado em uma nanoemulsão catiônica
[00283] Grupo 9 vA256 de RNA autorreplicante (^g) formulado em uma nanoemulsão catiônica
[00284] Grupo 10 vA527 de RNA autorreplicante (^g) formulado em uma nanoemulsão catiônica.
[00285] Os soros foram coletados para análise imunológica nos dias 21 (3wpl), 42 (3wp2) e 63 (3wp3).
[00286] Os títulos de neutralização de soro de CMV nos dias 21, 42 e 63 foram: Grupo de vacina 3wp1 3wp2 3wp3 1 126 6296 26525 2 N/A N/A 6769 3 N/A 3442 7348 4 N/A N/A 2265
8 N/A N/A 845 9 N/A N/A 228 N/A N/A 413
[00287] Portanto, RNA autorreplicante pode ser usado para expressar antígenos múltiplos a partir de um único vetor e para erguer uma resposta imune potente e específica. O replicon pode expressar cinco antígenos (complexo pentamérico de CMV (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) e erguer uma resposta imune potente. O RNA autorreplicante distribuído em lipossomos foi capaz de provocar títulos elevados de anticorpo neutralizante, como avaliado em células epiteliais, em todos os pontos de tempo avaliados (3wp1, 3wp2 e 3wp3). Estas respostas foram superiores aos VRPs correspondentes e às nanoemulsões catiônicas. Volume de distribuição
[00288] A distribuição hidrodinâmica emprega a força gerada pela injeção rápida de um grande volume de solução para ultrapassar as barreiras físicas das membranas celulares que impedem a entrada de compostos grandes e impermeáveis à membrana em células. Este fenômeno foi demonstrado anteriormente como sendo útil para a distribuição intracelular de vacinas de DNA.
[00289] Um volume típico de distribuição a camundongo para injeção intramuscular é 50 µL para a perna posterior, que é um volume relativamente alto para um músculo da perna de camundongo. Em contraste, uma dose intramuscular humana de ~0,5mL é relativamente pequena. Se a imunogenicidade em camundongos fosse dependente de volume, então a eficácia de vacinas de replicon seria devida, pelo menos em parte, às forças hidrodinâmicas, o que não seria encorajador para utilização das mesmas vacinas em humanos e animais maiores.
[00290] O replicon vA317 foi distribuído a camundongos BALB/c, 10 por grupo, por vacinas intramusculares bilaterais (5 ou 50 por perna) no dia 0 e 21:
[00291] O grupo 1 recebeu replicon puro, 0,2µg em 50 µL por perna
[00292] O grupo 2 recebeu replicon puro, 0,2 µg em 5 µL por perna
[00293] O grupo 3 recebeu replicon formulado em lipossomo (0,2 µg, 50 µL por perna)
[00294] O grupo 4 recebeu replicon formulado em lipossomo (0,2 µg, 5 µL por perna)
[00295] O soro foi coletado para análise de anticorpos nos dias 14 e 35. GMTs de IgG de soro específico para F foram: Dia 1 2 3 4 14 42 21 2669 2610 241 154 17655 18516
[00296] Assim, a imunogenicidade do replicon formulado não variou de acordo com o volume distribuído, indicando assim que estas vacinas de RNA não dependem de distribuição hidrodinâmica para sua eficácia. Cinética de expressão
[00297] Um replicon de RNA autorreplicante ("vA31 1") que expressa um gene repórter de luciferase (luc) foi usado para estudar a cinética de expressão proteica após a injeção. Camundongos BALB/c, 5 animais por grupo, receberam vacinas intramusculares bilaterais (50 µL por perna) no dia 0, com:
[00298] Grupo 1 DNA expressando luciferase, distribuído usando eletroporação (10 µg)
[00299] Grupo 2 RNA autorreplicante (1 µg) formulado em lipossomos
[00300] Grupo 3 RNA autorreplicante (1µg) formulado com uma nanoemulsão catiônica
[00301] Grupo 4 RNA autorreplicante (1 µg) formulado com uma nanoemulsão catiônica
[00302] Grupo 5 VRP (1x106 UI) expressando luciferase
[00303] Antes da vacinação, os camundongos foram depilados. Os camundongos foram anestesiados (2% de isoflurano em oxigênio), o pelo primeiro foi removido com uma lâmina elétrica e então Nair química. Os dados de bioluminescência foram adquiridos em seguida usando um sistema de imagens Xenogen IVIS 200 (Caliper Life Sciences) nos dias 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63 e 70. Cinco minutos antes das imagens, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 8 mg/kg de solução de luciferina. Os animais foram então anestesiados e transferidos para o sistema das imagens. Os tempos de aquisição de imagem foram mantidos constantes, visto que o sinal de bioluminescência foi medido com uma câmera de CCD resfriada.
[00304] Em termos visuais, as células expressando luciferase foram vistas permanecendo principalmente no local da injeção de RNA e os animais visualizados após a remoção dos quadríceps não mostraram sinal.
[00305] Em termos quantitativos, a expressão de luciferase foi medida como luminosidade média durante um período de 70 dias (p/s/cm2/sr), e os resultados foram como se segue para 5 grupos: Dia 1 2 3 4 5 3 8,69E+07 3,33E+06 2,11E+06 9,71E+06 1,46E+07 7 1,04E+08 8,14E+06 1,83E+07 5,94E+07 1,64E+07 14 8,16E+07 2,91E+06 9,22E+06 3,48E+07 8,49E+05 21 1,27E+07 3,13E+05 6,79E+04 5,07E+05 6,79E+05 28 1,42E+07 6,37E+05 2,36E+04 4,06E+03 2,00E+03 1,21E+07 6,12E+05 2,08E+03 42 1,49E+07 8,70E+05 49 1,17E+07 2,04E+05 63 9,69E+06 1,72E+03 70 9,29E+06
[00306] O RNA autorreplicante formulado com nanoemulsões catiônicas mostrou bioluminescência mensurável no dia 3, que chegou ao pico no dia 7 e, em seguida, foi reduzida a níveis basais nos dias 28 a 35. Quando formulado em lipossomos, o RNA mostrou bioluminescência mensurável no dia 3, que chegou ao pico no dia 7 e foi reduzida a níveis basais no dia 63. O RNA distribuído usando VRPs mostrou bioluminescência aumentada no dia 21, quando comparado com o RNA formulado, mas a expressão tinha sido reduzida a níveis basais no dia 28. O DNA eletroporado mostrou o nível mais alto de bioluminescência em todos os tempos medidos e os níveis de bioluminescência não foram reduzidos a níveis basais nos 70 dias do experimento.
Via de distribuição
[00307] O RNA encapsulado em lipossomos codificando gpl40 de HIV foi distribuído a camundongos, por via intramuscular, intradérmica, ou subcutânea. Todas as três vias levaram a elevados níveis de IgG de soro de anticorpos específicos para HIV (Figura 15), ultrapassando os títulos vistos em resposta a DNA intramuscular eletroporado. Sigmodon
[00308] Um estudo foi realizado em Sigmodon (Sigmodon hispidis) em vez de camundongos. Em uma dose o encapsulamento em lipossomo aumentou os títulos de IgG específica para F em 8,3 vezes comparado ao RNA puro e aumentou os títulos PRNT em 9,5 vezes. A magnitude da resposta de anticorpos foi equivalente àquela induzida por 5x106 UI de VRP. Tanto o RNA puro como o encapsulado em lipossomo foram capazes de proteger os sigmodons do desafio com RSV (1x105 unidades formadoras de plaque), reduzindo a carga viral do pulmão em pelo menos 3,5 logs. O encapsulamento aumentou a redução cerca de 2 vezes.
[00309] Trabalho adicional em sigmodons utilizou quatro replicons diferentes: vA317 expressa RSV-F completa; vA318 expressa RSV-F truncada (cauda transmembrana e citoplasmática removidas); vA142 expressa RSV-F com seu peptídeo de fusão deletado; vA140 expressa a RSV-F truncada também sem seu peptídeo. Sigmodons, 4 a 8 animais por grupo, receberam vacinas intramusculares (100 µL em uma perna) nos dias 0 e 21 com os quatro replicons diferentes em duas doses (1,0 e 0,1µg) formuladas em lipossomos feitos pelo método (D), mas com um tamanho de lote de RNA de 150 µg. Grupos controle receberam uma vacina proteica de subunidade de RSV-F (5 µg) com adjuvante alúmen (8 animais/grupo), VRPs expressando RSV-F completas (1x106 UI, 8 animais/grupo), ou controle naïve (4 animais/grupo). O soro foi coletado para análise de anticorpos nos dias 0, 21 e 34.
[00310] Os títulos de IgG de soro específico para F e os títulos de anticorpos neutralizantes de soro de RSV nos dias 21 e 34 foram: Grupo IgG, IgG, NT, NT, dia 21 dia 34 dia 21 dia 34 1 µg de vA317 915 2249 115 459 0,1 µg de vA317 343 734 87 95 1 µg de vA318 335 1861 50 277 0,1 µg de vA318 129 926 66 239 1 µg de vA142 778 4819 92 211 0,1 µg de vA142 554 2549 78 141 1 µg de vA140 182 919 96 194 0,1 µg de vA140 61 332 29 72 µg de subunidade de 13765 86506 930 4744 trímero de F/alúmen 1x106 UI de VRP-F 1877 19179 104 4528 completa Naïve 5 5 10 15
[00311] Todos os quatro replicons avaliadas neste estudo (vA317, vA318, vA142, vA140) foram imunogênicos em sigmodons quando distribuídos por lipossomo, embora os títulos de neutralização de soro tenham sido pelo menos dez vezes inferiores aos induzida por vacinas proteicas com adjuvante ou por VRPs. As vacinas de lipossomo/RNA provocaram IgG específica para F em soro e anticorpos neutralizantes de RSV após a primeira vacinação, e uma segunda vacinação reforçou a resposta eficazmente. Os títulos de IgG específica para F após a segunda vacinação com ^g de replicon foram 2 a 3 vezes maiores do que após a segunda vacinação com 0,1 µg de replicon. Os quatro replicons provocaram títulos de anticorpo comparáveis, sugerindo que RSV-F completa e truncada, cada uma com ou sem o peptídeo de fusão, são imunogênicas de modo similar em sigmodons.
[00312] Trabalho adicional em sigmodons usou novamente os replicons vA317, vA318 e vA142. Sigmodons, 2-8 animais por grupo, receberam vacinas intramusculares (100 µL em uma perna) nos dias 0 e 21 com os replicons (0,1 ou 1µg) escapsulados em lipossomos RVOI feitos pelo método (D), mas com um tamanho de lote de RNA de 150 µg. Grupos controle receberam a vacina proteica de subunidade de RSV-F (5 µg) com adjuvante alúmen ou VRPs expressando RSV-F completa (1x106 UI, 8 animais/grupo). Todos estes animais receberam uma terceira vacinação (dia 56) com vacina proteica de subunidade de RSV-F (5 µg) com adjuvante alúmen. Além disso, houve um controle naïve (4 animais/grupo). Além disso, um grupo extra recebeu vacinas intramusculares bilaterais (50 µL por perna) nos dias 0 e 56 com 1µg de RNA de vA317 em lipossomos, mas não recebeu uma terceira vacinação com a vacina proteica de subunidade.
[00313] O soro foi coletado para análise de anticorpos nos dias 0, 21, 35, 56, 70, além dos dias 14, 28 & 42 para o grupo extra. Os títulos de IgG sérica específica para F (GMT), foram os seguintes: dia 21 dia 35 dia 56 dia 70
1 µg de vA318 260 1027 332 14263 0,1 µg de vA318 95 274 144 2017 1 µg de vA142 483 1847 1124 11168 0,1 µg de vA142 314 871 418 11023 1 µg de vA317 841 4032 1452 13852 1x106 VRP (F completa) 2075 3938 1596 14574 µg de subunidade de 12685 54526 25846 48864 trímero de F/alúmen Naïve 5 5 5 5
[00314] Os títulos de neutralização de soro foram os seguintes (60% de títulos de neutralização de RSV para 2 combinações de 3-4 animais por grupo, GMT destas 2 combinações por grupo): dia 21 dia 35 dia 56 dia 70 1 µg de vA318 58 134 111 6344 0,1 µg de vA318 41 102 63 6647 1 µg de vA142 77 340 202 5427 0,1 µg de vA142 35 65 56 2223 1 µg de vA317 19 290 200 4189 1x106 VRP (F completa) 104 1539 558 2876 5 µg de subunidade de 448 4457 1630 3631 trímero de F/alúmen Naïve 10 10 10
[00315] Os títulos de soro e títulos de neutralização para o grupo extra foram os seguintes: Dia 14 21 28 35 42 56 70 IgG 397 561 535 501 405 295 3589 NT 52 82 90 106 80 101 1348
[00316] Assim, os replicons são confirmados como imunogênicos em sigmodons, provocando IgG específica para F de soro e anticorpos neutralizante de RSV após a primeira vacinação. Uma segunda vacinação reforçou as respostas eficazmente. Os títulos de IgG específica para F após a segunda vacinação com 1,0 µg de replicon foram 1,5 a 4 vezes maiores do que após a segunda vacinação com 0,1 µg de replicon.
[00317] A terceira vacinação (proteína no dia 56) não aumentou os títulos em sigmodons previamente vacinados com subunidade de trímero F + alúmen, mas proveu um grande aumento para títulos em sigmodons previamente vacinados com replicon. Na maioria dos casos, os títulos de neutralização de soro para RSV, após duas vacinas de replicon seguidas por reforço de proteína foram maiores ou iguais a títulos induzidos por duas ou três vacinas proteicas sequenciais.
[00318] Este estudo também avaliou a cinética da resposta de anticorpos a 1,0 µ g de vA317. Títulos de neutrlização de RSV e IgG sérica específica para F induzidos por uma única vacina atingiram seus picos em torno do dia 21 e foram mantidos até pelo menos o dia 56 (50-70% de queda no título de IgG específica para F, pouca mudança no título de neutralização de RSV). Uma segunda vacina homóloga foi dada a estes animais no dia 56 e aumentou os títulos de anticorpos a um nível pelo menos igual ao atingido quando a segunda vacina foi administrada no dia 21.
[00319] Experimentos adicionais envolveram um desafio viral. O replicon de vA368 codifica a glicoproteína de fusão superfície selvagem completa de RSV com o peptídeo de fusão deletado, com a expressão conduzida pelo IRES de EV71. Sigmodons, 7 por grupo, receberam vacinas intramusculares (100 µL por perna) nos dias 0 e 21 com vA368 em lipossomos preparados pelo método (H), tamanho de lote de RNA de 175 µg, ou com VRPs tendo o mesmo replicon. Um grupo controle recebeu 5 µg de proteína com adjuvante alúmen, e um grupo controle naïve também foi incluído.
[00320] Todos os grupos receberam um desafio intranasal (i.n.) com 1x106 UFP de RSV quatro semanas após a imunização final. O soro foi coletado para análise de anticorpos nos dias 0, 21 e 35. Títulos pulmonares virais foram medidos 5 dias após o desafio. Os resultados foram os seguintes: Lipossomo VRP Proteína Naïve Títulos de IgG Sérica Específica para F (GMT) Dia 21 370 1017 28988 5 Dia 35 2636 2002 113843 5 Títulos de neutralização (GMT) Dia 21 47 65 336 10 Dia 35 308 271 5188 10 Carga viral pulmonar (ufp por grama de pulmão) Dia 54 422 225 124 694110
[00321] Assim, a vacina de RNA reduziu a carga viral do pulmão em mais de três logs, de aproximadamente 106 UFP/g em sigmodons controle não vacinados para menos de 103 UFP/g em sigmodons vacinados. Estudo de grande mamífero
[00322] Um estudo de animal grande foi realizado em bovinos. Bezerros (4-6 semanas de idade, -60-80 kg, 5 por grupo) foram imunizados com 66µg de vA317 de replicon codificando a proteína F de RSV completa nos dias 0, 21, 86 e 146. Os replicons foram formulados em lipossomos. PBS sozinho foi usado como um controle negativo e uma vacina licenciada foi usada como um controle positivo ("Triângulo 4" da Fort Dodge, que contém vírus inativados). Todos os bezerros receberam 15 µ g de proteína F com adjuvante com a emulsão MF59 no dia 146. Uma vaca foi vacinada por engano com a vacina errada no dia 86 em vez da Triangle 4 e então seus dados foram excluídos do dia 100 em diante.
[00323] As vacinas de RNA codificaram F de RSV humano, enquanto a vacina "Triangle 4" contém F de RSV bovino, mas a proteína F de RSV é altamente conservada entre BRSV e HRSV.
[00324] Os lipossomos foram feitos pelo método (E), exceto que utilizou-se um tamanho de lote de 1,5 mg de RNA.
[00325] Os bezerros receberam 2mL de cada vacina experimental, administrada por via intramuscular como 2 x 1 mL de cada lado do pescoço. Em contraste, a vacina "Triangle 4" foi administrada como uma dose única de 2 mL no pescoço.
[00326] O soro foi coletado para análise de anticorpos nos dias 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 181, 188, 195 e 202. Se um animal individual tivesse um título abaixo do limite de deteção a ele era atribuído um título de 5
[00327] A figura 14A mostra títulos de IgG específica para F durante os primeiros 63 dias. O replicon de RNA foi imunogênico nas vacas através de lipossomos, embora tenha dado títulos mais baixos do que a vacina licenciada. Todas as vacas vacinadas apresentaram anticorpos específicos para F após a segunda dose e os títulos foram muito estáveis no período de 2 a 6 semanas após a segunda dose (e foram particularmente estáveis para as vacinas de RNA).
[00328] A figura 14B mostra títulos de IgG sériva específica para F (GMT) em 210 dias, e os valores medidos até o dia 202 foram os seguintes: D0 3wp1 2wp2 5wp2 ~9wp2 2wp3 8wp3 2wp4 5wp4 8wp4 D21 D35 D56 D86 D100 D146 D160 D181 D202 PBS 5 5 5 5 5 5 5 46 98 150 Lipossomo 5 5 12 11 20 768 74 20774 7022 2353 Triangle 5 5 1784 721 514 3406 336 13376 4775 2133 4
[00329] Os títulos de anticorpos neutralizantes de soro de RSV foram os seguintes: D0 2wp2 5wp2 2wp3 3wp3 4wp3 8wp3 2wp4 3wp4 4wp4 D35 D56 D100 D107 D107 D146 D160 D167 D174 PBS 12 10 10 14 18 20 14 10 10 10 Lipossomo 13 10 10 20 13 17 13 47 26 21 Triangle 12 15 13 39 38 41 13 24 26 15 4
[00330] O material usado para a segunda dose de lipossomo não foi recém-preparado, e o mesmo lote de RNA mostrou uma diminuição na potência em um estudo de imunogenicidade em camundongo. Portanto, é possível que a vacina tivesse sido mais imunogênica se material fresco hovesse sido usado para todas as vacinas.
[00331] Quando avaliados com complemento, os anticorpos neutralizantes foram detectados em todas as vacas vacinadas. Neste ensaio, todos os bezerros vacinados tiveram bons títulos de anticorpos neutralizantes após a segunda vacina de RNA. Além disso, a vacina de RNA provocou títulos de IgG sérica específica para F que foram detectados em alguns bezerros após a segunda vacina e em todos os bezerros após a terceira.
[00332] RSV-F com adjuvante MF59 foi capaz de aumentar a resposta de IgG em todos os bezerros previamente vacinados, e de aumentar títulos de neutralização independentes de complemento de bezerros previamente vacinados com RNA.
[00333] Prova de conceito para vacinas de RNA em grandes animais é particularmente importante à luz da perda de potência observada anteriormente com vacinas baseadas em DNA, ao mover-se de pequenos modelos animais para animais maiores e seres humanos. Uma dose típico para uma vacina de DNA para vaca seria de 0,5-1 mg [47,48] e, portanto, é muito incentivador que respostas imunes tenham sido induzidas com apenas 66 µg de RNA.
[00334] Entender-se-á que a invenção foi descrita a título de exemplo apenas e que podem ser feitas modificações, embora permanecendo dentro do escopo e espírito de invenção. Tabela 1: fosfolipídeos úteis DDPC 1,2-Didecanoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DEPA 1,2-Dierucoil-sn-Glicero-3-Fosfato DEPC 1,2-Erucoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DEPE 1,2-Dierucoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DEPG 1,2-Dierucoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1- glicerol...) DLOPC 1,2-Linoleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
DLPA 1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-Fosfato DLPC 1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DLPE l,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DLPG 1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1- glicerol...) DLPS l,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina DMG l,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DMPA 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-Fosfato DMPC 1,2-Dimyristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DMPE l,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DMPG 1,2-Miristoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1- glicerol...) DMPS l,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserine DOPA l,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfato DOPC 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DOPE l,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DOPG 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1- glicerol...) DOPS l,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina DPPA 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfato DPPC 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DPPE l,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DPPG 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1- glicerol...) DPPS l,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina DPyPE l,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DSPA 1,2-Distearoil-sn-Glicero-3-Fosfato DSPC l,2-Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina DSPE 1,2-Diostearpil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina DSPG 1,2-Distearoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(l-
glicerol...) DSPS 1,2-Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina EPC Ovo-PC HEPC PC de Ovo Hidrogenado HSPC PC de Soja Hidrogenada de Elevada Pureza HSPC PC de Soja Hidrogenada LYSOPC MYRISTIC 1-Miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina LYSOPC PALMITIC l-Palmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina LYSOPC STEARIC l-Estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina Milk Sfingomyelin MPPC l-Miristoil,2-palmitoil-sn-Glicero 3-fosfatidilcolina MSPC l-Miristoil,2-estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina PMPC l-Palmitoil,2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina POPC l-Palmitoil,2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina POPE l-Palmitoil-2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidil etanolamina POPG 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3 [Fosfatidil-rac-(1- glicerol)...] PSPC l-Palmitoil,2-estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina SMPC l-Estearoil,2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina SOPC l-Estearoil,2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina SPPC l-Estearoil,2-palmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
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Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Partícula não vírion para distribuição in vivo de RNA em uma célula de vertebrado, caracterizada pelo fato de que (a) a partícula compreende um material de distribuição (i) que encapsula uma molécula de RNA autorreplicante que codifica um imunógeno ou (ii) em que uma molécula de RNA autorreplicante que codifica um imunógeno é adsorvida, e (b) o RNA não inclui nucleotídeos modificados.
2. Partícula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a partícula é um lipossomo e o RNA está encapsulado nela.
3. Partícula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a partícula é uma micropartícula polimérica não tóxica e biodegradável e o RNA é adsorvido a ela.
4. Partícula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a partícula é uma nanopartícula de polímero oligomérico reticulado biodegradável formada pela reação de um polímero, um reticulador, um monômero carregado e o RNA.
5. Partícula, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o lipossomo compreende um lipídeo com um grupo de cabeça catiônico.
6. Partícula, de acordo com a reivindicação 2 ou 5, caracterizada pelo fato de que o lipossomo compreende um lipídeo com um grupo de cabeça zwiteriônico.
7. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 5 e 6, caracterizada pelo fato de que o lipossomo tem um diâmetro na faixa de 50 a 220nm.
8. Partícula, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a partícula compreende um poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo).
9. Partícula, de acordo com a reivindicação 3 ou 8, caracterizada pelo fato de que a partícula tem um diâmetro de 30nm a 7 µm.
10. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a molécula de RNA autorreplicante codifica (i) uma RNA polimerase RNA-dependente que pode transcrever RNA a partir da molécula de RNA autorreplicante e (ii) um imunógeno.
11. Partícula, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a molécula de RNA tem duas fases de leitura abertas, a primeira das quais codifica uma replicase de alfavírus e a segunda das quais codifica o imunógeno.
12. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a molécula de RNA possui comprimento de 9000 a 12000 nucleotídeos.
13. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o imunógeno pode provocar uma resposta imune in vivo contra uma bactéria, um vírus, um fungo ou um parasita.
14. Partícula, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o imunógeno pode provocar uma resposta imune in vivo contra a glicoproteína F de vírus sincicial respiratório.
15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma partícula conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. Uso da partícula, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou da composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 15, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para induzir uma resposta imune protetora em um vertebrado.
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