JP7402503B2 - デザイナーdna組換え酵素を利用したゲノムを遺伝的に改変するための方法及び手段 - Google Patents
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Description
ゲノム編集の分野における近年のブレークスルーは現在、DNAの損傷を修復し、インビトロ又は生体内で機能不全に陥った細胞を置換し、操作し、又は再生させる革新的なアプローチを確立する真の機会をもたらしている。
一例はPCSK9(プロタンパク質変換酵素サブチリシン/ケキシン9型)をコードする遺伝子であり、これを阻害するとコレステロールレベル及び低密度リポタンパク質粒子(LDL)の血中濃度を低下させることが知られている。
i. 潜在的スペーサー配列である2つの配列についての対象とする配列を含む、ゲノム又はその部分をスクリーニングする工程(これらの潜在的スペーサー配列は、少なくとも 5 bp、好ましくは少なくとも7 bp、より好ましくは8 bp、及び好ましくは最大12、より好ましくは最大10 bpの長さである。潜在的スペーサー配列の一方は対象とする配列の上流にあり、潜在的スペーサー配列の他方は、対象とする配列の下流にある。2つの配列は好ましくは100 kb、より好ましくは10 kb、及びさらにより好ましくは2 kbの最大距離、及び好ましくは150 bpの最小距離をとる。)
ii.潜在的標的部位を同定(規定)する工程((工程i.で得られた)潜在的スペーサー配列並びにそれを縁取る配列は、潜在的標的配列を形成する。(工程i.で得られた)各潜在的スペーサー配列について、その一方の側の隣接ヌクレオチド、好ましくは10~20ヌクレオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチド、最も好ましくは13ヌクレオチドは潜在的第1の部分部位を形成し、かつその他方の側の隣接ヌクレオチド、好ましくは10~20ヌクレオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチドは潜在的第2の部分部位を形成する。従って、両方の潜在的部分部位及びそれらの間のスペーサー配列は、潜在的標的部位を形成する。)を含み、
iii.工程ii.で同定された潜在的標的部位を好ましくはさらにスクリーニングして、宿主ゲノム中の(どこにも)出現せず、そのために配列特異的組換え、特に欠失が保証される潜在的標的配列を選択する、前記方法に関する。
i. 潜在的標的部位である2つの配列についての対象とする配列を含む、ゲノム又はその部分をスクリーニングすること(これらの潜在的標的部位は、少なくとも 5 bp、好ましくは少なくとも7 bp、より好ましくは8 bp、及び好ましくは最大12、より好ましくは最大10 bpの長さであるスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチドを有する第1の部分部位及び第2の部分部位を含む。潜在的標的部位の一方は対象とする配列の上流にあり、潜在的標的部位の他方は、対象とする配列の下流にある。2つの配列は好ましくは100 kb、より好ましくは10 kb、及びさらにより好ましくは2 kbの最大距離、及び好ましくは150 bpの最小距離をとる。置換を可能にするため、スペーサー配列は同一とならないように選択する。スペーサー配列は、少なくとも30%~100%、好ましくは50%のヌクレオチドだけ異なる。従って、スペーサー配列は好ましくは0%~50%、又は少なくとも70%未満の配列同一性を有する。)を含み、
ii.工程i.で同定された潜在的標的部位を好ましくはさらにスクリーニングして、宿主ゲノム中の(どこにも)出現せず、そのために(ドナー配列を用いて、以下参照)配列特異的置換が保証される潜在的標的配列を選択する、前記方法によって同定する。
a) 改変するべきヌクレオチド配列(対象とする部位)の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、改変するべきヌクレオチド配列の下流の(好ましくは30~40塩基対の長さである)ヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択する工程(ここで、標的部位の配列は、同一ではない。同一ではない(not identical)又は同一ではない(non-identical)標的配列という用語は、上記の通り定義する。標的部位の一方又は両方は非対称であり、対称な部位はゲノム中にほとんど見つからない点で有利である。各々の標的部位はスペーサー配列(先に定義した通り、好ましくは5~12ヌクレオチド)によって隔てられた第1の部分部位及び第2の部分部位(先に定義した通り、好ましくは10~20ヌクレオチド)を含む。好ましくは、標的配列は各々DNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位との相同性を有する部分部位を含むように選択する。相同性とは、一定数のヌクレオチド位置に同一の塩基を有することを意味する。好ましくは、各部分部位はDNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位と少なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好ましくは少なくとも30%同一なヌクレオチド位置を有する。さらに、先に説明した通り、部分部位は好ましくは、相互間に相同性を有する。好ましくは、各部分部位は、同じ標的部位の他の部分部位及び/又は他の標的部位の部分部位と少なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好ましくは少なくとも30%同一なヌクレオチド位置を有する。)
b) a)で基質として選択した第1の標的部位及び第2の標的部位を含む核酸を使用してDNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは最大4つのライブラリに対して、分子指向性進化法を適用する工程、を含み、
(分子指向性進化法又は分子指向性進化法及び合理的設計の組合わせにより)a1)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つのデザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う。
a2) DNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位となる4つの配列を同定する工程(ここで、第1の配列は(a1)に従って選択する)第1の標的部位の第1の部分部位と相同であり、第2の配列は(a1)に従って選択する)第1の標的部位の第2の部分部位と相同であり、第3の配列は(a1)に従って選択する)第2の標的部位の第1の部分部位と相同であり、第4の配列は(a1)に従って選択する)第2の標的部位の第2の部分部位と相同である)。
この工程において、工程a2)で同定する部分部位及び工程a1)で選択する標的部位の間の混合物である、中間標的部位を好ましくは作製する。
工程a2)で規定する配列を認識するDNA組換え酵素に対し、第1の中間標的部位及び/又は第2の中間標的部位を含む核酸を基質として使用して、分子指向性進化法を適用する。
i) 各々DNA組換え酵素の(異なる)ライブラリをコードする1、2、3、又は4つの遺伝子(ここで、ライブラリをコードする遺伝子は、同じプロモーターの制御下にある)
ii) 好ましくは発現ベクター中にたった1回だけ出現する制限酵素の認識部位(固有の認識部位)である、ネガティブ選択マーカーを縁取る第1の標的部位及び第2の標的部位を含む基質核酸、を含む。
c) ライブラリから工程b)において得られた少なくとも1つのDNA組換え酵素の核酸を単離する工程;及び好ましくは
d) 工程c)で得られた核酸を好適な送達ベクターにクローニングする工程、をさらに含み得る。
1. 本発明のデザイナーDNA組換え酵素をコードする先に記載の発現ベクター又は送達ベクター(ここで、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、ゲノム中で対象とする配列を縁取る2つの同一でない標的部位で、部位特異的組換えを誘導する)
2. 対象とする配列と置換する所望の配列(ドナーDNA)を縁取る同じ2つの同一でない標的部位を含むドナー配列である、ヌクレオチド配列(ここで、所望の配列は第1の標的部位及び第2の標的部位に隣接する)、及びDNA組換え酵素の発現、を有する細胞に形質導入するための方法を含む。
i) 本発明のデザイナーDNA組換え酵素、又は本発明のデザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸若しくはベクター(ここで、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、ゲノム中で対象とする配列を縁取る2つの同一でない標的部位で、部位特異的組換えを誘導する)
ii) 対象とする配列と置換する所望の配列(ドナーDNA)を縁取る同じ2つの同一でない標的部位を含むドナー配列である、ヌクレオチド配列(ここで、所望の配列は第1の標的部位及び第2の標的部位に隣接する)、を含むセット又はキットに関する。好ましくはドナー配列を細胞当たり複数のコピーで提供し、標的配列の置換率を増加させる(図3も参照されたい)。
メンケス病、ミトコンドリア筋症、及びNINDS脳梁欠損症を含み得る。これらの疾患は、国立衛生研究所のウェブサイトで遺伝的脳障害の小区分においてさらに記載されている。
DRiGRについての好ましい実施態様において、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、血友病Bの原因となるF9遺伝子のエキソン8中の突然変異を置換する。エキソン8は重度の形態の血友病Bにおいて高頻度に突然変異しており、この集団中に出現する突然変異は公知である(www.factorix.org)。
X17は、任意のアミノ酸であり、好ましくはD又はGである。
X19は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X22は、任意のアミノ酸であり、好ましくはG又はEである。
X30は、小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましくはV又はAから選択される。
X43は、正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X60は、任意のアミノ酸であり、好ましくはN又はDである。
X68は、任意のアミノ酸であり、好ましくはP又はSである。
X69は正又は負に荷電したアミノ酸であり、好ましくはD、E、K、またはR、より好ましくはE又はKから選択される
X81は極性アミノ酸であり、好ましくはS、T、C、K、又はR、より好ましくはC又はRから選択される。
X84は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X89は任意のアミノ酸であり、好ましくはL又はQである。
X93は小さなアミノ酸であり、好ましくはC、S、及びA、より好ましくはC又はAから選択される。
X140は任意のアミノ酸であり、好ましくはI又はTである。
X166は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選択される。
X177は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選択される。
X182は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選択される。
X183は正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X186は極性アミノ酸であり、好ましくはS又はTである。
X206は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X222は、任意のアミノ酸であり、好ましくはV又はEである。
X225は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選択される。
X237は極性アミノ酸であり、好ましくはS、T、C、又はY、より好ましくはY又はCから選択される。
X239は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、V、又はF、より好ましくはF又はIから選択される。
X249は小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましくはV又はAから選択される。
X259は任意のアミノ酸であり、好ましくはF又はPである。
X260は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X264は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はDである。
X278は任意のアミノ酸であり、好ましくはL又はQである。
X284は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選択される。
X318は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はLから選択される。
X342は任意のアミノ酸であり、好ましくはG又はDである。
X3は任意のアミノ酸であり、好ましくはK又はNである。
X5は任意のアミノ酸であり、好ましくはP又はQである。
X8は任意のアミノ酸であり、好ましくはH又はTである。
X14は、非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV 、より好ましくはI又はLから選択される。
X16は、小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましくはV又はAから選択される。
X18は小さなアミノ酸であり、好ましくはA又はGである。
X19は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X20は極性アミノ酸であり、好ましくはS、T、N、又はQ、より好ましくはS又はNから選択される。
X21は任意のアミノ酸であり、好ましくはD又はGである。
X31は、非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、V、及びF、より好ましくはL又はFから選択される。
X39は正又は負に荷電したアミノ酸であり、好ましくはD、E、K、又はR、より好ましくはK又はEから選択される
X80は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X84は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X93は、任意のアミノ酸であり、好ましくはC又はAである。
X97は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、V、及びM、より好ましくはL又はMから選択される。
X125は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはI又はVから選択される。
X132は正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X182は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはI又はVから選択される。
X183は正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X186は極性アミノ酸であり、好ましくはT又はSである。
X195は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはI又はVから選択される。
X206は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X216は、任意のアミノ酸であり、好ましくはG又はRである。
X249は、小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましくはV又はAから選択される。
X253は任意のアミノ酸であり、好ましくはI又はTである。
X259は、任意のアミノ酸であり、好ましくはP又はSである。
X260は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X264は、非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはV又はI(又はL)から選択される。
X266は小さなアミノ酸であり、好ましくはA又はGである。
X273は芳香族又はヘテロ芳香族アミノ酸であり、好ましくはH又はYである。
X276は任意のアミノ酸であり、好ましくはK又はQである。
X278は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はDである。
X306は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはL又はIから選択される。
X325は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはL又はIから選択される。
1. 本発明のF9デザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸を含む送達ベクター、
2. F9遺伝子のエキソン8又はその機能的突然変異体をコードする配列を縁取るloxF9a及びLoxF9b部位を含むドナー配列、並びにDNA組換え酵素の発現を用いて細胞に形質導入するための方法を含む。
―本発明によるF9デザイナーDNA組換え酵素又はそれをコードし、かつ発現する核酸又はベクター、
―loxF9a及びloxF9b標的部位に隣接したF9遺伝子のエキソン8又はその機能的突然変異体をコードする配列を含むドナー配列
を導入することにより、F9遺伝子の(非機能的又は機能不全)突然変異体エキソン8を置換する(ここで、F9デザイナーDNA組換え酵素は、部位特異的組換えでドナー配列により突然変異体エキソン8を含む配列を置換する)ための方法をさらに含む。
―本発明によるF9デザイナーDNA組換え酵素又はそれをコードする核酸又はベクター、
―loxF9a及びloxF9b標的部位に隣接したF9遺伝子のエキソン8又はその機能的突然変異体をコードする配列を含むドナー配列を含むキットを含む。
DRiGDについての好ましい実施態様において、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、ヒト第7染色体上の配列を欠失させる。このデザイナーDNA組換え酵素はさらに、HexデザイナーDNA組換え酵素と呼ばれ、配列番号:40及び配列番号:41の非対称なHex1及びHex2標的部位を認識する:
DRiGDの有用性を実証するために、本発明者らは少なくとも150 bpにより隔てられたすべての8 bp反復配列についてヒトゲノムをスクリーニングした:ゲノムから最大2 kbを欠失させるための範囲内の潜在的標的部位は、ヒトゲノム中のほかのどこにも出現しない8 bpの反復配列の左13 bp及び右13 bpの配列を示す。図12はヒトPCSK9遺伝子中のDNA組換え酵素の309個全ての考え得る標的部位の結果を示す。図13はヒトパピローマウイルス(HPV16)中のDNA組換え酵素の176個全ての考え得る標的部位の結果を示す。
DRiGR発明の実現可能性を実証するために、本発明者らは共に適用した場合にヒト第IX因子(F9)遺伝子のエキソン8を置換することができるリコンビナーゼを作製した。このエキソンは血友病Bに罹患する患者において高い頻度で突然変異を有する。本発明者らの結果は、適切なドナーベクター及び共同して機能する2つのリコンビナーゼの発現を提供して、このエキソンを異なる配列に効率的に置換することができることを実証する(図6、図9、及び図11)。
Rec F9-1:配列番号:3及びRec F9-2a:配列番号:4
Rec F9-1b:配列番号:5及びRec F9-2b:配列番号:6
(工程1:)
第1の工程において、2つのリコンビナーゼライブラリを先に記載のSLiDEアプローチを使用して個別に進化させた(Buchholz及びStewartの文献、2001並びにWO 2002044409 A2―図8を参照されたい)。手短に説明すると、実施例2に記載の各ライブラリを中間標的部位(loxF9-AL、AR、BLS、BLRS、BL、BR―実施例2を参照されたい)の組換えに向けて進化させ、最終的に2つの標的部位、loxF9a又はloxF9bの1つの組換えに到達させた。新たな突然変異を誤りを起こしやすいPCR及びDNAシャッフルにより導入し、かつ選択圧をリコンビナーゼの発現レベルを介してさらに調節した。活性を有するリコンビナーゼをそれぞれの標的部位を組換えてベクターに由来する標的部位と隣接した配列を欠失させるそれらの能力によって選択した(図8を参照されたい)。
第2の工程において、単一のリコンビナーゼライブラリを進化させ、複製欠損pDonorを用いた選択スキームに従いDRiGRを実施した(図9を参照されたい)。これには、ベクターバックボーンpF9(ソース)(= pDuoF9、配列番号:21)中の工程1で作製したライブラリに由来するリコンビナーゼコード配列のクローニングを伴う。このベクター中1~4つのリコンビナーゼライブラリを、両酵素の転写を一体に結び付けるオペロン様構造をとる共通の誘導性プロモーターから発現させることができる。このライブラリのサイズは、100,000クローンを超える。
第3の工程において、単一のリコンビナーゼライブラリを進化させ、高コピー数プラスミドpDonor-ex8を用い(図14、配列番号:37を参照されたい)、抗生物質による選択及びドナーベクターの統合を分割から分離することなく、異なる選択スキームに従って(図14を参照されたい)、DRiGR 2.0を実施した。これには、ベクターバックボーンpF9(ソース)(= pDuoF9(ソース)配列番号:21 )中の工程2で作製したライブラリに由来するリコンビナーゼコード配列のクローニングを伴う。続いて、ライブラリを既にpDonor-ex8を有するエレクトロコンピテント大腸菌XL1-Blue細胞へと形質転換した。形質転換細胞を15 μg/mlクロラムフェニコール、15 μg/mlカナマイシン、及び1~200 μg/ml L-アラビノースを含む100 ml LB培地中で増殖させた。このライブラリのサイズは、100,000クローンを超えた。
工程1の後、R#1(配列番号:34):工程2の後、R#7-B5(配列番号:35)、及び最終工程3の後、 Rec F9-3(配列番号:36)。
治療的設定におけるF9リコンビナーゼを利用するために、F9-1及びF9-2の両方のコード配列をF9遺伝子のエキソン8の野生型又はPadua突然変異(R338L)に隣接するloxF9a及びloxF9aを含むドナー配列とともに送達ベクター(例えば、アデノ随伴ウイルスベクター)へクローニングする。そのようなベクターの複数コピーでの標的細胞への送達は、ゲノム中の不活性化突然変異を置換する(図11を参照されたい)。
DRiGDの有用性を実証するため、ヒトゲノムの第7染色体上の特異的DNA配列を切除するためのリコンビナーゼを進化させた。
Hex-R-#7:配列番号:46及びHex-L-#7:配列番号:47
Hex-R-#30:配列番号:48及びHex-L-#30:配列番号:49
(態様1)
ゲノム中の対象とする配列の部位特異的DNA組換えを誘導することができるDNA組換え酵素の潜在的標的部位となる配列を同定するための方法であって:
i. 該対象とする配列を含む該ゲノム又はその部分を少なくとも5 bp、最大12 bpの長さの潜在的スペーサー配列である2つの配列についてスクリーニングする工程であって、該潜在的スペーサー配列の一方が該対象とする配列の上流にあり、かつ該潜在的スペーサー配列の他方が該対象とする配列の下流にあり、かつ該2つの配列が100 kbの最大距離及び150 bpの最小距離をとる、前記工程;
ii. 各々の潜在的スペーサー配列について、それらの一方の側の隣接するヌクレオチド、好ましくは10~20ヌクレオチドが、潜在的第1の部分部位を形成すること、及び他方の側の隣接するヌクレオチド、好ましくは10~20ヌクレオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチドが、潜在的第2の部分部位を形成することを決定することによって該潜在的標的部位を同定する工程であって、ここで両方の潜在的部分部位及びそれらの間の該スペーサー配列により該潜在的標的部位が形成される、前記工程、を含み、
iii. 工程ii.で同定された該潜在的標的部位をさらにスクリーニングして、宿主ゲノム中の(どこにも)出現せず、そのために配列特異的欠失が保証される潜在的標的配列を選択する、前記方法。
(態様2)
部位特異的DNA組換えを誘導してゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えることにより、該ゲノム中のヌクレオチド配列を改変することができるデザイナーDNA組換え酵素を調製するための方法であって:
a) 改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、及び該改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択する工程であって、ここで、これら標的部位の配列は同一でなく、各々の標的部位が5~12ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチドの第1の部分部位及び第2の部分部位を含み、態様1記載の工程を工程a)の前に、又はその部分として実施する、前記工程;
b) a)において基質として選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクターを使用して、DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリに分子指向性進化法を適用する工程を含み、
a)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つの該デザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う、前記方法。
(態様3)
前記DNA組換え酵素が欠失に好適であり、かつ前記(潜在的)スペーサー配列が同一である、態様1又は2記載の方法。
(態様4)
前記DNA組換え酵素が置換に好適であり、かつ前記(潜在的)スペーサー配列が同一でない、態様1又は2記載の方法。
(態様5)
部位特異的DNA組換えを誘導してゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えることにより、該ゲノム中のヌクレオチド配列を置換することができるデザイナーDNA組換え酵素を調製するための方法であって:
a) 改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、及び該改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択する工程であって、ここで、これら標的部位の配列は同一でなく、各々の標的部位が5~12ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチドの第1の部分部位及び第2の部分部位を含む、前記工程
b) a)において基質として選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクターを使用して、DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリに分子指向性進化法を適用する工程を含み、
ここで工程bは、ベクター及び合成配列間の組換えを選択するために該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含む該合成配列の存在下実施され、
a)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つの該デザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う、前記方法。
(態様6)
前記改変すべきヌクレオチド配列が突然変異、特に点突然変異、フレームシフト突然変異、欠失、又は挿入を含む配列である、態様1~5のいずれか1項記載の方法。
(態様7)
工程b)で使用する前記ベクターが前記DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリをコードし、かつ前記第1及び第2の標的部位の間にあるネガティブ選択マーカー、より好ましくは制限酵素の少なくとも1つの固有の認識部位を含む、発現ベクターである、態様1~6のいずれか1項記載の方法。
(態様8)
前記合成配列が前記第1及び第2の標的部位の間にあるポジティブ選択マーカーを含む、置換に好適なデザイナーDNA組換え酵素を調製するための態様5~7のいずれか1項記載の方法。
(態様9)
工程b)を3つの副工程:
i) 前記少なくとも1つのライブラリを人工配列なしで進化させる副工程;
ii) 工程i)の結果として得られる該少なくとも1つのライブラリを、ポジティブ選択マーカーを有する人工配列を使用して進化させる副工程;
iii) 工程ii)の結果として該少なくとも1つのライブラリをポジティブ選択マーカーを有さない人工配列を用いて得る副工程、で実施する、置換に好適なデザイナーDNA組換え酵素を調製するための態様5~8のいずれか1項記載の方法。
(態様10)
態様1~9のいずれか1項記載の方法により取得することができる、デザイナーDNA組換え酵素。
(態様11)
少なくとも2つの異なる単量体を含み、ここで前記酵素が前記ゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えることにより宿主生物の該ゲノム中での前記部位特異的DNA組換えを誘導することができ、前記標的部位の配列が同一でなく、好ましくは態様1~9のいずれか1項記載の方法によって取得することができる、好ましくは態様10記載のデザイナーDNA組換え酵素。
(態様12)
単量体が配列番号:1(Rec F9-1)による配列、あるいは配列番号1、又は好ましくは配列番号:28、配列番号:3、若しくは配列番号:5と少なくとも95%の配列同一性、好ましくは98%の配列同一性を有する配列を含み、かつ単量体が配列番号:2(Rec F9-2)による配列、あるいは配列番号:2、又は好ましくは配列番号:29、配列番号:4、若しくは配列番号:6と少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%の配列同一性、より好ましくは98%の配列同一性を有する配列を含む、態様10又は11記載のデザイナーDNA組換え酵素。
(態様13)
配列番号:1(Rec F9-1)、及び/若しくは配列番号:2(Rec F9-2)、若しくは配列番号:36(Rec F9-3)、若しくは配列番号:46(Hex-R-#7)、及び/若しくは配列番号:47(Hex-L-#7)、若しくは配列番号:48(Hex-R-#30)、及び/若しくは配列番号:49(Hex-L-#30)による配列、配列番号:1及び/若しくは2、若しくは配列番号:36、若しくは配列番号:46、及び/若しくは配列番号:47、若しくは配列番号:48、及び/若しくは配列番号:49と、又は好ましくは配列番号:28、29、若しくは3~6から選択される少なくとも1つの配列と、少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%の配列同一性、より好ましくは98%の配列同一性を有する配列を含む、デザイナーDNA組換え酵素。
(態様14)
対象とするヌクレオチド配列を改変するための部位特異的DNA組換えが、第1の標的部位及び第2の標的部位を組換えることによりゲノム中で誘導され、両方の標的部位が該ゲノム中に天然に出現し、かつそれらが前記デザイナーDNA組換え酵素又は該DNA組換え酵素をコードする核酸若しくはベクターを導入することにより同一とはならず、ここで該標的部位が前記対象とする配列を縁取っており、各々の標的部位が5~12ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた10~20ヌクレオチドの第1の部分部位及び第2の部分部位を含む、医薬における使用のための態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素、態様9~11のいずれか1項記載のDNA組換え酵素をコードする医薬における使用のための核酸又はベクター。
(態様15)
両方の標的部位が同一のスペーサー配列を含み、組換えにより前記対象とする配列が欠失する、態様14記載の医薬における使用のためのデザイナーDNA組換え酵素又は核酸又はベクター。
(態様16)
両方の標的部位が同一でないスペーサー配列を含み、さらに所望の配列を縁取る両方の標的部位を含む合成ドナー配列を提供し、組換えにより前記対象とする配列が該所望の配列によって置換される、態様14記載の医薬における使用のためのデザイナーDNA組換え酵素又は核酸又はベクター。
(態様17)
態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸又はベクター。
(態様18)
配列番号:7(loxF9a)及び配列番号:8(loxF9b)、配列番号:7若しくは8との少なくとも90%の配列同一性を有する配列、又はこれらに逆相補的な核酸配列から選択される核酸。
(態様19)
態様17若しくは18記載の核酸若しくはベクターを含む宿主細胞、宿主臓器、若しくは非ヒト宿主生物、及び/又は態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素。
(態様20)
第1の標的部位及び第2の標的部位を組換えることによりゲノム中の対象とするヌクレオチド配列を改変し、ここで両方の標的部位は該ゲノム中に天然に出現し、かつそれらが態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様10~13のいずれか1項記載のDNA組換え酵素をコードする核酸若しくはベクターを導入することにより同一とはならない、前記部位特異的DNA組換えを誘導する方法。
(態様21)
そのスペーサー配列が異なる前記第1及び第2の標的部位を選択すること、及び該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含む合成配列をさらに提供することにより前記対象とするヌクレオチド配列の置換を誘導し、ここで該第1及び第2の標的部位が所望の配列を縁取っており、又は同一のスペーサー配列を含む該第1及び第2の標的部位を選択することによって該対象とするヌクレオチド配列の欠失を誘導する、態様20記載の方法。
(態様22)
ゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組み換えることによる、部位特異的DNA組換えにより、該ゲノム中の対象とする配列を置換するためのキットであって:
―態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様17若しくは18記載の核酸若しくはベクター;
―前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位に隣接する前記対象とする配列と置換する、所望の配列を含む合成配列、を含む、前記キット。
(態様23)
2つの認識部位の間の部位特異的DNA組換えを触媒する、態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素の使用。
(態様24)
前記対象とする配列をノックアウトされ、又は改変された配列を有する細胞又は多細胞生物を作製する、態様23記載の使用。
(態様25)
前記標的部位が配列番号:7(loxF9a)及び配列番号:8(loxF9b)と同一であるか、又はこれらに逆相補的である配列から選択される、態様23記載の使用。
(態様26)
態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様9記載の核酸若しくはベクターを含む、医薬組成物。
Claims (10)
- ゲノム中の対象とする配列の部位特異的DNA組換えを誘導することができるDNA組換え酵素の潜在的標的部位となる配列を同定するための方法であって:
i. 該対象とする配列を含む該ゲノム又はその部分を少なくとも5 bp、最大12 bpの長さの潜在的スペーサー配列である2つの配列についてスクリーニングする工程であって、該潜在的スペーサー配列の一方が該対象とする配列の上流にあり、かつ該潜在的スペーサー配列の他方が該対象とする配列の下流にあり、かつ該2つの配列が100 kbの最大距離及び150 bpの最小距離をとる、前記工程;
ii. 各々の潜在的スペーサー配列について、潜在的第1の部分部位を形成する該スペーサー配列の一方の側の隣接する10~20ヌクレオチド、及び潜在的第2の部分部位を形成する該スペーサー配列の他方の側の隣接する10~20ヌクレオチドを決定することによって該潜在的標的部位を同定する工程であって、ここで両方の潜在的部分部位及びそれらの間の該スペーサー配列により該潜在的標的部位が形成される、前記工程;
iii. 工程ii.で同定された該潜在的標的部位をさらにスクリーニングして、宿主ゲノム中のどこにも出現せず、そのために配列特異的組換えが保証される潜在的標的配列を選択する工程;及び
iv. 工程iii.で得られた潜在的標的配列のリストから標的配列を選択する工程、
を含み、
該同定された潜在的標的部位の配列が同一でない、前記方法。 - 部位特異的DNA組換えを誘導して同じゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えることにより、該ゲノム中のヌクレオチド配列を改変することができるデザイナーDNA組換え酵素を調製するための方法であって:
a) 改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、及び該改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択する工程であって、ここで、該標的部位の配列は同一でなく、各々の標的部位が5~12ヌクレオチドを有するスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチドを有する第1の部分部位及び第2の部分部位を含み、請求項1記載の工程を工程a)の前に実施する、前記工程;
b) a)において基質として選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクターを使用して、DNA組換え酵素の少なくとも2つのライブラリに分子指向性進化法を適用する工程であって、a)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つの該デザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う、前記工程、
を含み、
該DNA組換え酵素が少なくとも2つの異なる単量体を含む、前記方法。 - 前記DNA組換え酵素が欠失に好適であり、かつ前記潜在的スペーサー配列が同一である、請求項2記載の方法。
- 前記DNA組換え酵素が置換に好適であり、かつ前記潜在的スペーサー配列が同一でない、請求項2記載の方法。
- 工程bが、前記ベクターと合成配列との間の組換えについて選択するために、前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位を含む該合成配列の存在下で実施される、請求項4記載の方法。
- 前記改変すべきヌクレオチド配列が突然変異、特に点突然変異、フレームシフト突然変異、欠失、又は挿入を含む配列である、請求項2~5のいずれか1項記載の方法。
- 工程b)で使用する前記ベクターがDNA組換え酵素の少なくとも2つのライブラリをコードし、かつ前記第1及び第2の標的部位の間にあるネガティブ選択マーカーを含む、発現ベクターである、請求項2~6のいずれか1項記載の方法。
- 前記合成配列が前記第1及び第2の標的部位の間にあるポジティブ選択マーカーを含む、置換に好適なデザイナーDNA組換え酵素を調製するための、請求項5記載の方法。
- 工程b)を3つの副工程:
i) 前記少なくとも2つのライブラリを人工配列なしで進化させる副工程;
ii) 工程i)の結果として得られる該少なくとも2つのライブラリを、ポジティブ選択マーカーを有する人工配列を使用して進化させる副工程;
iii) 工程ii)の結果として得られる該少なくとも2つのライブラリをポジティブ選択マーカーを有さない人工配列を使用して進化させる副工程、で実施する、置換に好適なデザイナーDNA組換え酵素を調製するための、請求項5~8のいずれか1項記載の方法。 - 前記標的部位が、配列番号:7(loxF9a)の核酸配列、又はこれに逆相補的な核酸配列、及び配列番号:8(loxF9b)の核酸配列、又はこれに逆相補的な核酸配列を含む、F9遺伝子の標的部位である、請求項2~9のいずれか1項記載の方法。
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