JP2023116580A - デザイナーdna組換え酵素を利用したゲノムを遺伝的に改変するための方法及び手段 - Google Patents
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Abstract
【課題】対象とする配列を欠失させ、又は置換することによるゲノム編集のために、ゲノム中のDNA配列を特異的に改変するための方法及び手段を提供する。【解決手段】ゲノム中に天然に出現する2つの同一でない配列を標的部位として使用し、該標的部位に対するDNA組換え酵素を作製する方法を開示する。本発明は特に、ゲノム中の突然変異を修復し、又は細胞若しくは組織由来の所定の遺伝物質を欠失させ、かつ疾患を治療する医薬に特に有用である。本発明の利点は、宿主DNA修復経路を引き入れることなくDNAの正確な部位指定的改変を可能とし、それによりランダムな挿入及び欠失(挿入欠失)を誘導することなく機能することである。【選択図】図1
Description
本発明は、ゲノム中のDNA配列を特異的に改変するための方法及び手段を提供する。デ
ザイナーDNA組換え酵素を作製するためのベクター及び方法を提供する。本発明は特に、
ゲノム中の突然変異を修復し、又は細胞若しくは組織由来の所定の遺伝物質を欠失させ、
かつ疾患を治療する医薬に有用である。さらに、本発明は(例えば、動物モデルを作出す
るための)生物学研究及び生物医学研究に有用である。
ザイナーDNA組換え酵素を作製するためのベクター及び方法を提供する。本発明は特に、
ゲノム中の突然変異を修復し、又は細胞若しくは組織由来の所定の遺伝物質を欠失させ、
かつ疾患を治療する医薬に有用である。さらに、本発明は(例えば、動物モデルを作出す
るための)生物学研究及び生物医学研究に有用である。
ヒト疾患の原因となる多くの遺伝的突然変異が、過去数十年間に特定されている。
ゲノム編集の分野における近年のブレークスルーは現在、DNAの損傷を修復し、インビト
ロ又は生体内で機能不全に陥った細胞を置換し、操作し、又は再生させる革新的なアプロ
ーチを確立する真の機会をもたらしている。
ゲノム編集の分野における近年のブレークスルーは現在、DNAの損傷を修復し、インビト
ロ又は生体内で機能不全に陥った細胞を置換し、操作し、又は再生させる革新的なアプロ
ーチを確立する真の機会をもたらしている。
しかしながら、近年開発されたゲノム編集技術の大部分、例えばジンクフィンガーヌク
レアーゼ(例えば、US20150093802 A1)、TALEN(例えば、WO2014134412 A1)、及びCRIS
PR/Cas9(例えば、US 8,697,359 B1)では、遺伝子修正の第1工程として標的座位に二本
鎖DNA切断部が導入される。これらの切断部は続いて細胞の内因性DNA修復機構の1つによ
って修復され、その結果典型的に標的座位に多数のランダムな挿入及び欠失(挿入欠失(
indels))が導入される。しかしながら、理想的には治療的ゲノム編集は、挿入欠失を導
入することなく効率的かつ特異的であるべきである。
レアーゼ(例えば、US20150093802 A1)、TALEN(例えば、WO2014134412 A1)、及びCRIS
PR/Cas9(例えば、US 8,697,359 B1)では、遺伝子修正の第1工程として標的座位に二本
鎖DNA切断部が導入される。これらの切断部は続いて細胞の内因性DNA修復機構の1つによ
って修復され、その結果典型的に標的座位に多数のランダムな挿入及び欠失(挿入欠失(
indels))が導入される。しかしながら、理想的には治療的ゲノム編集は、挿入欠失を導
入することなく効率的かつ特異的であるべきである。
DNA組換え酵素、特に部位特異的リコンビナーゼ(SSR)システムは、内因性DNA修復経
路を誘発することなく正確にDNAを操作することを可能とし、かつ処理されたDNAのインビ
ボでの切断及び即座の再結合(resealing)の両方を実現する固有の能力を有する。さら
に、SSRシステム、例えばCre/loxP(EP 0 2200 009 B1)は、モデル生物における幅広い
用途を見出しており、これらが動物において終生発現される場合でさえも、安全となり得
ることが実証されている。SSRは4量体としてその標的部位に働きかけ、これらの部位の方
向に応じて、組換えは様々な結果をもたらし得る。新規の部位特異的リコンビナーゼを得
るために、Creのアミノ酸配列を改変することができることが知られている(Buchholz F
及びStewart AFの文献、2001)。
路を誘発することなく正確にDNAを操作することを可能とし、かつ処理されたDNAのインビ
ボでの切断及び即座の再結合(resealing)の両方を実現する固有の能力を有する。さら
に、SSRシステム、例えばCre/loxP(EP 0 2200 009 B1)は、モデル生物における幅広い
用途を見出しており、これらが動物において終生発現される場合でさえも、安全となり得
ることが実証されている。SSRは4量体としてその標的部位に働きかけ、これらの部位の方
向に応じて、組換えは様々な結果をもたらし得る。新規の部位特異的リコンビナーゼを得
るために、Creのアミノ酸配列を改変することができることが知られている(Buchholz F
及びStewart AFの文献、2001)。
当技術分野で公知の他のSSRシステムには、Flp/FRTシステム(WO 1999025841 A1及びUS
6,774,279 B2)、Dre/roxシステム(US 7,422,889 B2及びUS 7,915,037 B2)、VCre/Vlo
xPシステム、及びsCre/SloxPシステム(WO 2010/143606 A1)、並びにVika/vox、Nigri/n
ox及びPanto/poxシステム(WO 2014/016248 A1)がある。
6,774,279 B2)、Dre/roxシステム(US 7,422,889 B2及びUS 7,915,037 B2)、VCre/Vlo
xPシステム、及びsCre/SloxPシステム(WO 2010/143606 A1)、並びにVika/vox、Nigri/n
ox及びPanto/poxシステム(WO 2014/016248 A1)がある。
天然のDNA組換え酵素、特に部位特異的リコンビナーゼ(SSR)システム(例えば、チロ
シン型SSR)は、一般的に4つの同一の単量体からなる。一般的に、DNA組換え酵素は、2つ
の同一かつ対称な、各々多くの場合8ヌクレオチド長の非対称なスペーサーによって隔て
られた2つの13ヌクレオチド長の部分部位からなるパリンドローム標的部位を認識する。
標的部位の数及び相対的な方向に応じて、DNA組換え酵素は遺伝的内容の欠失、挿入、逆
位、又は置換を引き起こす。
シン型SSR)は、一般的に4つの同一の単量体からなる。一般的に、DNA組換え酵素は、2つ
の同一かつ対称な、各々多くの場合8ヌクレオチド長の非対称なスペーサーによって隔て
られた2つの13ヌクレオチド長の部分部位からなるパリンドローム標的部位を認識する。
標的部位の数及び相対的な方向に応じて、DNA組換え酵素は遺伝的内容の欠失、挿入、逆
位、又は置換を引き起こす。
治療用ゲノム編集においてDNA組換え酵素を使用するためのボトルネックは、組換える
ことができる配列の数が制限されることである。
ことができる配列の数が制限されることである。
WO2008083931A1では、HIVの長鎖末端反復(LTR)配列を認識部位(loxLTR Tre 1 .0)
として使用したテイラーメイドリコンビナーゼ(tailored recombinases)(Tre 1 .0)
の指向性分子進化によってこの制限にある程度対処している。非対称な標的部位を使用し
たこのアプローチのさらなる開発は、WO2011147590 A2(Tre 3.0)及びWO2016034553 A1
(Tre 3.1及びuTre/Brec1)並びにKarpinski Jらの刊行物、2016(Brec1)に記載されて
いる。しかしながら、全ての事例においてシステムが機能するためには、ゲノム中に34塩
基対の長さの厳密な認識部位が(例えば組み込まれたHIプロウイルスのLTR中に)2つなく
てはならないため、このアプローチの有用性は制限されていた。
として使用したテイラーメイドリコンビナーゼ(tailored recombinases)(Tre 1 .0)
の指向性分子進化によってこの制限にある程度対処している。非対称な標的部位を使用し
たこのアプローチのさらなる開発は、WO2011147590 A2(Tre 3.0)及びWO2016034553 A1
(Tre 3.1及びuTre/Brec1)並びにKarpinski Jらの刊行物、2016(Brec1)に記載されて
いる。しかしながら、全ての事例においてシステムが機能するためには、ゲノム中に34塩
基対の長さの厳密な認識部位が(例えば組み込まれたHIプロウイルスのLTR中に)2つなく
てはならないため、このアプローチの有用性は制限されていた。
WO2009007982A1には、DNA組換え酵素の潜在的標的部位としてのHIV-1のLTRに位置する
核酸配列が記載されている。
核酸配列が記載されている。
US2009/0217400 A1には、非対称なloxP-M7標的部位での組換えのための酵素及び方法が
記載されている。さらに、Zhang, Cらの文献、(2015)及びUS 20170058297 A1には、非対
称なloxP-M7標的部位を認識するために必須な2つのCre突然変異体のヘテロ四量体複合体
が記載されている。しかしながら、これらの認識部位はゲノムに人為的に導入しなくては
ならない。
記載されている。さらに、Zhang, Cらの文献、(2015)及びUS 20170058297 A1には、非対
称なloxP-M7標的部位を認識するために必須な2つのCre突然変異体のヘテロ四量体複合体
が記載されている。しかしながら、これらの認識部位はゲノムに人為的に導入しなくては
ならない。
US 20040003435 A1には、対象とする配列の植物への標的化挿入のための方法であって
、野生型FLPリコンビナーゼによってなお認識され得る改変FRT部位である同一でない認識
部位に隣接する、又はこれを含む該対象とするヌクレオチド配列を含む導入カセットを導
入することを含む、前記方法が記載されている。
、野生型FLPリコンビナーゼによってなお認識され得る改変FRT部位である同一でない認識
部位に隣接する、又はこれを含む該対象とするヌクレオチド配列を含む導入カセットを導
入することを含む、前記方法が記載されている。
まとめると、最新の公知のリコンビナーゼシステムの適用は、ゲノム中に2つの認識部
位を人為的に導入しなくてはならず、又はゲノム中の対象とする配列が34塩基対の長さの
2つの同一配列と隣接しなくてはならないという事実によって制限されている。
位を人為的に導入しなくてはならず、又はゲノム中の対象とする配列が34塩基対の長さの
2つの同一配列と隣接しなくてはならないという事実によって制限されている。
従って、現在利用されている直接的なゲノム編集アプローチは、プログラム可能ヌクレ
アーゼ、例えばCRISPR/Cas9のようなRNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、US 8,657,359 B1
)に依存しているが、これはこれらの酵素の標的部位への特異性が対象とする配列に適応
して汎用され得るガイドRNAによって規定されるためである。
アーゼ、例えばCRISPR/Cas9のようなRNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、US 8,657,359 B1
)に依存しているが、これはこれらの酵素の標的部位への特異性が対象とする配列に適応
して汎用され得るガイドRNAによって規定されるためである。
しかしながら、これらのヌクレアーゼシステムは細胞の内因性DNA修復機構を必要とす
るため、典型的に標的座位に多数のランダムな挿入及び欠失(挿入欠失)が誘導される。
るため、典型的に標的座位に多数のランダムな挿入及び欠失(挿入欠失)が誘導される。
理想的なゲノム編集又は遺伝子治療では、ゲノムにさらなる改変を加えることなく、欠
陥のある遺伝子を正常な遺伝子座で置換し、又は欠陥のある遺伝子をその天然の位置から
欠失させる。従って、理想的なゲノム編集は、挿入欠失を導入することなく、効率的かつ
特異的であるべきである。
陥のある遺伝子を正常な遺伝子座で置換し、又は欠陥のある遺伝子をその天然の位置から
欠失させる。従って、理想的なゲノム編集は、挿入欠失を導入することなく、効率的かつ
特異的であるべきである。
従って本発明の目的は、ヌクレアーゼゲノム編集アプローチの欠点を克服し、同時に対
象とする配列に適応する汎用性を有する、ゲノム中のヌクレオチド配列を改変する方法を
提供することである。
象とする配列に適応する汎用性を有する、ゲノム中のヌクレオチド配列を改変する方法を
提供することである。
本発明は、ゲノム中には34塩基対の長さ(DNA組換え酵素の通常の標的部位の長さ)を
有する2つの同一な配列がほとんど見出されないという発見に基づく。
有する2つの同一な配列がほとんど見出されないという発見に基づく。
本発明は、デザイナーDNA組換え酵素の切除組換えを達成するための唯一の制約は、通
常8 bp長のスペーサー配列の保存性(例えば、図17を参照されたい)であることを本発明
者らが理解したところから始まる。組換えが起こるためにはこの配列が同一でなくてはな
らないため、組換えることのできる配列については制約が設けられている。しかしながら
、様々なゲノムの生物情報工学的解析から、ウイルス、原核生物、及びヒトゲノムを含む
真核生物ゲノムにおいて、8 bp長の直列反復配列が、高頻度に出現することが、明らかと
なった(例えば、図18、19を参照されたい)。
常8 bp長のスペーサー配列の保存性(例えば、図17を参照されたい)であることを本発明
者らが理解したところから始まる。組換えが起こるためにはこの配列が同一でなくてはな
らないため、組換えることのできる配列については制約が設けられている。しかしながら
、様々なゲノムの生物情報工学的解析から、ウイルス、原核生物、及びヒトゲノムを含む
真核生物ゲノムにおいて、8 bp長の直列反復配列が、高頻度に出現することが、明らかと
なった(例えば、図18、19を参照されたい)。
この発見に基づき、本発明者らはゲノム中の異なる標的部位を標的化するように進化さ
せたDNA組換え酵素の異なる単量体を組合わせることにより、細胞修復経路を引き入れる
ことなく、正確なゲノム編集を行うことが可能となることを理解した。従って、指向性進
化、合理的設計、又はこれらの組合わせによって作製されたDNA組換え酵素の単量体の組
合わせを作製して、ゲノム中の実質的に対象とするあらゆる配列を組換えることができる
。組換えにより配列が欠失する場合、およそ8塩基対の長さの2つの同一の配列が、ゲノム
中のスペーサー配列として必要となる。しかしながら、組換えにより配列が置換される場
合、ゲノム中のスペーサー配列は好ましくは同一でなく―この場合、同一のスペーサー配
列は人工配列上の対象とする配列と置換される所望の配列(ドナーDNA)を提供する。
せたDNA組換え酵素の異なる単量体を組合わせることにより、細胞修復経路を引き入れる
ことなく、正確なゲノム編集を行うことが可能となることを理解した。従って、指向性進
化、合理的設計、又はこれらの組合わせによって作製されたDNA組換え酵素の単量体の組
合わせを作製して、ゲノム中の実質的に対象とするあらゆる配列を組換えることができる
。組換えにより配列が欠失する場合、およそ8塩基対の長さの2つの同一の配列が、ゲノム
中のスペーサー配列として必要となる。しかしながら、組換えにより配列が置換される場
合、ゲノム中のスペーサー配列は好ましくは同一でなく―この場合、同一のスペーサー配
列は人工配列上の対象とする配列と置換される所望の配列(ドナーDNA)を提供する。
本発明は、異なるDNA組換え酵素の単量体を組合わせることにより、公知のDNA組換え酵
素のそれらが組換えることができる標的部位に関する限界を克服し、ゲノム中に天然に出
現する標的配列を認識することができるゲノム編集に有用なデザイナーDNA組換え酵素を
提供する。
素のそれらが組換えることができる標的部位に関する限界を克服し、ゲノム中に天然に出
現する標的配列を認識することができるゲノム編集に有用なデザイナーDNA組換え酵素を
提供する。
本発明の第1の態様において、本発明は、部位特異的DNA組換えを誘導し、ゲノム中に(
好ましくは、天然に)出現する2つの同一でない標的配列を組み換えることにより、ゲノ
ム中のヌクレオチド配列を改変することができるデザイナーDNA組換え酵素、及びデザイ
ナーDNA組換え酵素を調製するための方法を提供する。
好ましくは、天然に)出現する2つの同一でない標的配列を組み換えることにより、ゲノ
ム中のヌクレオチド配列を改変することができるデザイナーDNA組換え酵素、及びデザイ
ナーDNA組換え酵素を調製するための方法を提供する。
本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、ゲノム中に標的部位を人為的に導入することを
必要とせず、さらに長鎖末端反復配列(LTR)のような8ヌクレオチド超の長さ(特に、34
ヌクレオチドでない)の同一の配列の存在を要求しないという利点を有する。
必要とせず、さらに長鎖末端反復配列(LTR)のような8ヌクレオチド超の長さ(特に、34
ヌクレオチドでない)の同一の配列の存在を要求しないという利点を有する。
本発明の文脈における同一でない標的配列とは、標的部位が少なくとも2ヌクレオチド
異なることをいう。標的部位は、さらに多く、特に少なくとも3ヌクレオチドが異なり得
る点で有利である。本発明の実施態様において、標的部位は少なくとも4ヌクレオチド、
又は8ヌクレオチドさえも異なる。標的部位の少なくとも20%又はさらにより好ましくは30
%のヌクレオチド及び最大70%又はさらに最大90%のヌクレオチドが異なり得るものであり
、このことは、標的部位がわずか10~80%、好ましくは30~90%の配列同一性を有し得るこ
とを意味する点で有利である。各標的部位は、スペーサー配列(好ましくは5~12ヌクレ
オチド)によって隔てられた第1の部分部位(好ましくは10~20ヌクレオチド)及び第2の
部分部位(好ましくは10~20ヌクレオチド)を含む。一方又はさらに両方の標的部位は、
非対称であり得る点で有利であり、このことは標的部位の部分部位が互いに逆相補的でな
いことを意味する。部分部位の少なくとも20%又はさらにより好ましくは30%のヌクレオチ
ド、及び最大70%又はさらに最大90%のヌクレオチドが異なり得る点で有利であり、このこ
とは、全ての部分部位がわずか10~80%、好ましくは30~90%の配列同一性を有し得ること
を意味する。一実施態様において、標的部位の相違は部分部位においてのみあり、スペー
サー配列は同一であり、対象とする配列の欠失を誘導する。別の実施態様においてまた、
2つのスペーサー配列は異なっており、その結果対象とする配列と置換されることとなる
ドナー配列を縁取るゲノム中に出現する標的部位と同一の2つの配列を含む合成配列を提
供することにより、対象とする配列を置換することが可能となる。
異なることをいう。標的部位は、さらに多く、特に少なくとも3ヌクレオチドが異なり得
る点で有利である。本発明の実施態様において、標的部位は少なくとも4ヌクレオチド、
又は8ヌクレオチドさえも異なる。標的部位の少なくとも20%又はさらにより好ましくは30
%のヌクレオチド及び最大70%又はさらに最大90%のヌクレオチドが異なり得るものであり
、このことは、標的部位がわずか10~80%、好ましくは30~90%の配列同一性を有し得るこ
とを意味する点で有利である。各標的部位は、スペーサー配列(好ましくは5~12ヌクレ
オチド)によって隔てられた第1の部分部位(好ましくは10~20ヌクレオチド)及び第2の
部分部位(好ましくは10~20ヌクレオチド)を含む。一方又はさらに両方の標的部位は、
非対称であり得る点で有利であり、このことは標的部位の部分部位が互いに逆相補的でな
いことを意味する。部分部位の少なくとも20%又はさらにより好ましくは30%のヌクレオチ
ド、及び最大70%又はさらに最大90%のヌクレオチドが異なり得る点で有利であり、このこ
とは、全ての部分部位がわずか10~80%、好ましくは30~90%の配列同一性を有し得ること
を意味する。一実施態様において、標的部位の相違は部分部位においてのみあり、スペー
サー配列は同一であり、対象とする配列の欠失を誘導する。別の実施態様においてまた、
2つのスペーサー配列は異なっており、その結果対象とする配列と置換されることとなる
ドナー配列を縁取るゲノム中に出現する標的部位と同一の2つの配列を含む合成配列を提
供することにより、対象とする配列を置換することが可能となる。
好ましい実施態様において、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、1つ若しくは2つ、
又は最大4つの単量体を含む。一実施態様において、デザイナーDNA組換え酵素は、4つの
異なる単量体を含み、各単量体は、異なる部分部位を認識する:しかしながらまた、デザ
イナーDNA組換え酵素は2つ又は3つの異なる単量体を含み、ここで1つ又は2つの単量体が
非対称な標的部位を認識することができる。デザイナーDNA組換え酵素は、4つの同一の単
量体を含み、ここでデザイナーDNA組換え酵素は、2つの異なる非対称な標的部位を認識す
ることさえできる。本発明の異なる単量体とは、単量体が少なくとも2%、特に少なくとも
4%、好ましくは少なくとも8%のアミノ酸残基異なることを意味する。最大10%、又は最大3
0%さえものアミノ酸残基が異なり得る点で有利であり、このことは、単量体がわずか70~
98%、好ましくは90~96%、又は最大92%の配列同一性を有し得ることを意味する。
又は最大4つの単量体を含む。一実施態様において、デザイナーDNA組換え酵素は、4つの
異なる単量体を含み、各単量体は、異なる部分部位を認識する:しかしながらまた、デザ
イナーDNA組換え酵素は2つ又は3つの異なる単量体を含み、ここで1つ又は2つの単量体が
非対称な標的部位を認識することができる。デザイナーDNA組換え酵素は、4つの同一の単
量体を含み、ここでデザイナーDNA組換え酵素は、2つの異なる非対称な標的部位を認識す
ることさえできる。本発明の異なる単量体とは、単量体が少なくとも2%、特に少なくとも
4%、好ましくは少なくとも8%のアミノ酸残基異なることを意味する。最大10%、又は最大3
0%さえものアミノ酸残基が異なり得る点で有利であり、このことは、単量体がわずか70~
98%、好ましくは90~96%、又は最大92%の配列同一性を有し得ることを意味する。
従って、本発明のDNA組換え酵素は、2つ又は最大4つの異なる単量体を含むホモ四量体
又はヘテロ四量体である。
又はヘテロ四量体である。
ヘテロ四量体の好ましい実施態様において、単量体-単量体界面は、異なる単量体のみ
が四量体を形成し得る方法で遺伝子改変する(例えば、Zhangらの刊行物、2015及びUS 20
170058297 A1に記載されている)。この改変により、1つの単量体のみを含む四量体を除
く必須のヘテロ四量体が形成される。
が四量体を形成し得る方法で遺伝子改変する(例えば、Zhangらの刊行物、2015及びUS 20
170058297 A1に記載されている)。この改変により、1つの単量体のみを含む四量体を除
く必須のヘテロ四量体が形成される。
対象とする配列は、改変すべきヌクオチド配列である。これは、突然変異を含む配列で
あることが好ましい。本発明における突然変異という用語には、あらゆる種類の遺伝的又
は染色体異常、特に点突然変異、フレームシフト突然変異、転座、重複、欠失、又は挿入
を含む。
あることが好ましい。本発明における突然変異という用語には、あらゆる種類の遺伝的又
は染色体異常、特に点突然変異、フレームシフト突然変異、転座、重複、欠失、又は挿入
を含む。
あるいは、活性は疾患を引き起こし、又は遺伝子活性の阻害は症状を低下させることが
公知であるところ、対象とする配列は、不活性化させたい配列、特に病原体(細菌、ウイ
ルスのような微生物、又は寄生虫)の配列、又は癌遺伝子若しくは別の遺伝子である。
一例はPCSK9(プロタンパク質変換酵素サブチリシン/ケキシン9型)をコードする遺伝子
であり、これを阻害するとコレステロールレベル及び低密度リポタンパク質粒子(LDL)
の血中濃度を低下させることが知られている。
公知であるところ、対象とする配列は、不活性化させたい配列、特に病原体(細菌、ウイ
ルスのような微生物、又は寄生虫)の配列、又は癌遺伝子若しくは別の遺伝子である。
一例はPCSK9(プロタンパク質変換酵素サブチリシン/ケキシン9型)をコードする遺伝子
であり、これを阻害するとコレステロールレベル及び低密度リポタンパク質粒子(LDL)
の血中濃度を低下させることが知られている。
対象とする配列が挿入、重複、又は不活性化させたい配列(例えば、ウイルス配列)で
ある場合、本発明のDNA組換え酵素によって誘導される組換えにより、好ましくは挿入さ
れた配列又は不活性化させたい配列が欠失する。この欠失―さらにデザイナーDNA組換え
酵素により誘導された遺伝子欠失(DRiGD)とも呼ぶ―は、2つの標的部位中の2つの同一
のスペーサー配列によって達成される(例示的実施例について、図2も参照されたい)。
ある場合、本発明のDNA組換え酵素によって誘導される組換えにより、好ましくは挿入さ
れた配列又は不活性化させたい配列が欠失する。この欠失―さらにデザイナーDNA組換え
酵素により誘導された遺伝子欠失(DRiGD)とも呼ぶ―は、2つの標的部位中の2つの同一
のスペーサー配列によって達成される(例示的実施例について、図2も参照されたい)。
あるいは、本発明のDNA組換え酵素によって誘導される組換えにより、対象とする配列
は所望の配列により置換される。この置換―さらにデザイナーDNA組換え酵素により誘導
された遺伝子置換(DRiGR)とも呼ぶ―は、第1の標的部位及び第2の標的部位を含む合成
ドナー配列を提供することによって達成され、ここで第1及び第2の標的部位は、所望の配
列を縁取っている。対象とする配列を所望の配列で置換することにより、原理的に、点突
然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、重複、並びに欠失及び挿入さえ
もを含むあらゆる突然変異を治療することが可能である(例示的実施例について、図1も
参照されたい)。
は所望の配列により置換される。この置換―さらにデザイナーDNA組換え酵素により誘導
された遺伝子置換(DRiGR)とも呼ぶ―は、第1の標的部位及び第2の標的部位を含む合成
ドナー配列を提供することによって達成され、ここで第1及び第2の標的部位は、所望の配
列を縁取っている。対象とする配列を所望の配列で置換することにより、原理的に、点突
然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、重複、並びに欠失及び挿入さえ
もを含むあらゆる突然変異を治療することが可能である(例示的実施例について、図1も
参照されたい)。
本発明のDNA組換え酵素は、内因性DNA修復経路を誘発することなく正確にゲノム編集す
ることを可能とし、かつ処理されたDNAのインビボでの切断及び即座の再結合の両方を実
現する固有の能力を有する点で有利である。
ることを可能とし、かつ処理されたDNAのインビボでの切断及び即座の再結合の両方を実
現する固有の能力を有する点で有利である。
DNA組換え酵素という用語は、部位特異的DNA組換え事象を誘導することができる全ての
酵素、好ましくはリコンビナーゼ又はインテグラーゼ、特にトポイソメラーゼ様反応を実
行する酵素、例えば、セリン若しくはチロシンリコンビナーゼファミリーから選択される
。一実施態様において、その標的配列が工程a)で使用され、かつ工程(b)において分子指
向性進化法が適用された公知のDNA組換え酵素をCre、Dre、Cre、VCre,、sCre、FLP、Tre
(Tre 1 .0~Tre 3.1及びBrec1を含む)、Vika、Nigri、及びPantoから選択される。
酵素、好ましくはリコンビナーゼ又はインテグラーゼ、特にトポイソメラーゼ様反応を実
行する酵素、例えば、セリン若しくはチロシンリコンビナーゼファミリーから選択される
。一実施態様において、その標的配列が工程a)で使用され、かつ工程(b)において分子指
向性進化法が適用された公知のDNA組換え酵素をCre、Dre、Cre、VCre,、sCre、FLP、Tre
(Tre 1 .0~Tre 3.1及びBrec1を含む)、Vika、Nigri、及びPantoから選択される。
「デザイナー」DNA組換え酵素という用語は、本発明により所与の標的部位に対するDNA
組換え酵素が作製され、かつそのDNA組換え酵素が天然には出現しないという事実を指す
。
組換え酵素が作製され、かつそのDNA組換え酵素が天然には出現しないという事実を指す
。
一態様において、本発明は、ゲノム中の対象とする配列の、部位特異的DNA組換えを誘
導することができるDNA組換え酵素に対する、潜在的標的部位である配列を同定するため
の方法であって:
i. 潜在的スペーサー配列である2つの配列についての対象とする配列を含む、ゲノム又
はその部分をスクリーニングする工程(これらの潜在的スペーサー配列は、少なくとも 5
bp、好ましくは少なくとも7 bp、より好ましくは8 bp、及び好ましくは最大12、より好
ましくは最大10 bpの長さである。潜在的スペーサー配列の一方は対象とする配列の上流
にあり、潜在的スペーサー配列の他方は、対象とする配列の下流にある。2つの配列は好
ましくは100 kb、より好ましくは10 kb、及びさらにより好ましくは2 kbの最大距離、及
び好ましくは150 bpの最小距離をとる。)
ii.潜在的標的部位を同定(規定)する工程((工程i.で得られた)潜在的スペーサー
配列並びにそれを縁取る配列は、潜在的標的配列を形成する。(工程i.で得られた)各潜
在的スペーサー配列について、その一方の側の隣接ヌクレオチド、好ましくは10~20ヌク
レオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチド、最も好ましくは13ヌクレオチドは潜在的
第1の部分部位を形成し、かつその他方の側の隣接ヌクレオチド、好ましくは10~20ヌク
レオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチドは潜在的第2の部分部位を形成する。従っ
て、両方の潜在的部分部位及びそれらの間のスペーサー配列は、潜在的標的部位を形成す
る。)を含み、
iii.工程ii.で同定された潜在的標的部位を好ましくはさらにスクリーニングして、宿
主ゲノム中の(どこにも)出現せず、そのために配列特異的組換え、特に欠失が保証され
る潜在的標的配列を選択する、前記方法に関する。
導することができるDNA組換え酵素に対する、潜在的標的部位である配列を同定するため
の方法であって:
i. 潜在的スペーサー配列である2つの配列についての対象とする配列を含む、ゲノム又
はその部分をスクリーニングする工程(これらの潜在的スペーサー配列は、少なくとも 5
bp、好ましくは少なくとも7 bp、より好ましくは8 bp、及び好ましくは最大12、より好
ましくは最大10 bpの長さである。潜在的スペーサー配列の一方は対象とする配列の上流
にあり、潜在的スペーサー配列の他方は、対象とする配列の下流にある。2つの配列は好
ましくは100 kb、より好ましくは10 kb、及びさらにより好ましくは2 kbの最大距離、及
び好ましくは150 bpの最小距離をとる。)
ii.潜在的標的部位を同定(規定)する工程((工程i.で得られた)潜在的スペーサー
配列並びにそれを縁取る配列は、潜在的標的配列を形成する。(工程i.で得られた)各潜
在的スペーサー配列について、その一方の側の隣接ヌクレオチド、好ましくは10~20ヌク
レオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチド、最も好ましくは13ヌクレオチドは潜在的
第1の部分部位を形成し、かつその他方の側の隣接ヌクレオチド、好ましくは10~20ヌク
レオチド、より好ましくは12~15ヌクレオチドは潜在的第2の部分部位を形成する。従っ
て、両方の潜在的部分部位及びそれらの間のスペーサー配列は、潜在的標的部位を形成す
る。)を含み、
iii.工程ii.で同定された潜在的標的部位を好ましくはさらにスクリーニングして、宿
主ゲノム中の(どこにも)出現せず、そのために配列特異的組換え、特に欠失が保証され
る潜在的標的配列を選択する、前記方法に関する。
この方法は、ゲノム中の対象とする配列の欠失を誘導するDNA組換え酵素(DRiGD)の潜
在的標的部位となる配列を同定するためのスクリーニングに特に好適である。この場合、
工程i.で潜在的スペーサー配列となる2つの同一の配列についてゲノムをスクリーニング
する。この方法はまた、図18における例によって例示される。
在的標的部位となる配列を同定するためのスクリーニングに特に好適である。この場合、
工程i.で潜在的スペーサー配列となる2つの同一の配列についてゲノムをスクリーニング
する。この方法はまた、図18における例によって例示される。
一実施態様において、欠失させるべき対象とする配列は、宿主のゲノム中の配列、例え
ば癌遺伝子又は不活性化させたい別の遺伝子である。従って、工程i.でスクリーニングす
るゲノムは、宿主自体のゲノム(又は対象とする配列を含むその部分)、例えばヒトゲノ
ム又はヒト染色体の部分である。この場合、工程iii.において、好ましくは宿主のゲノム
中のどこにも出現しない(従って、対象とする配列の周囲にのみ出現する)潜在的標的配
列をスクリーニングして、配列特異的欠失を保証する。
ば癌遺伝子又は不活性化させたい別の遺伝子である。従って、工程i.でスクリーニングす
るゲノムは、宿主自体のゲノム(又は対象とする配列を含むその部分)、例えばヒトゲノ
ム又はヒト染色体の部分である。この場合、工程iii.において、好ましくは宿主のゲノム
中のどこにも出現しない(従って、対象とする配列の周囲にのみ出現する)潜在的標的配
列をスクリーニングして、配列特異的欠失を保証する。
別の実施態様において、欠失させるべき対象とする配列は、病原体、例えばウイルスの
ゲノム中の配列である。ここで、工程i.を病原体のゲノムに対して実施し、工程iii.をそ
の病原体が感染する宿主のゲノムに対して実施する。この場合、工程iii.において、好ま
しくは宿主のゲノム中に出現しない(従って、病原体のゲノム中にのみ出現する)潜在的
標的配列をスクリーニングして、配列特異的欠失を保証する。
ゲノム中の配列である。ここで、工程i.を病原体のゲノムに対して実施し、工程iii.をそ
の病原体が感染する宿主のゲノムに対して実施する。この場合、工程iii.において、好ま
しくは宿主のゲノム中に出現しない(従って、病原体のゲノム中にのみ出現する)潜在的
標的配列をスクリーニングして、配列特異的欠失を保証する。
さらに好ましい工程iv.において、標的配列は、各々DNA組換え酵素の既知の標的部位の
部分部位との相同性を有する部分部位を含む、工程ii.はiii.で得られた潜在的標的配列
のリストから選択する。相同性とは、一定数のヌクレオチド位置に同一の塩基を有するこ
とを意味する。好ましくは、各部分部位はDNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位と
少なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好ましくは少なくとも30%同一なヌクレオ
チド位置を有する。さらに、部分部位は好ましくは、相互間に相同性を有する。好ましく
は、各部分部位は、同じ標的部位の他の部分部位及び/又は他の標的部位の部分部位と少
なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好ましくは少なくとも30%同一なヌクレオチ
ド位置を有する。標的部分部位間の相同性が高いと、両方の部分部位に対する活性を有す
る単量体を作製することができ、従って組換えに要する単量体の数を低下させる見込みが
増加する。
部分部位との相同性を有する部分部位を含む、工程ii.はiii.で得られた潜在的標的配列
のリストから選択する。相同性とは、一定数のヌクレオチド位置に同一の塩基を有するこ
とを意味する。好ましくは、各部分部位はDNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位と
少なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好ましくは少なくとも30%同一なヌクレオ
チド位置を有する。さらに、部分部位は好ましくは、相互間に相同性を有する。好ましく
は、各部分部位は、同じ標的部位の他の部分部位及び/又は他の標的部位の部分部位と少
なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好ましくは少なくとも30%同一なヌクレオチ
ド位置を有する。標的部分部位間の相同性が高いと、両方の部分部位に対する活性を有す
る単量体を作製することができ、従って組換えに要する単量体の数を低下させる見込みが
増加する。
配列特異的な欠失を保証する工程iii.の選択は、工程iv.の前に実施しても、後に実施
してもよい。
してもよい。
好ましくは工程i.の間又はその前に、不活性化するべき対象の配列(好ましくは、遺伝
子又はエキソン)のゲノム中の座標を決定する。探索範囲とする対象とする配列及び縁取
る配列に及ぶ150 bp~10 kbの断片を作成する。他の遺伝子と重複する断片は除く。他の
全ての断片について、潜在的に同一なスペーサー配列―従って少なくとも1回繰り返され
ているスペーサー配列を同定する。
子又はエキソン)のゲノム中の座標を決定する。探索範囲とする対象とする配列及び縁取
る配列に及ぶ150 bp~10 kbの断片を作成する。他の遺伝子と重複する断片は除く。他の
全ての断片について、潜在的に同一なスペーサー配列―従って少なくとも1回繰り返され
ているスペーサー配列を同定する。
一実施態様において、対象とする配列(例えば不活性化させるべき遺伝子のエキソン)
又は少なくとも対象とする配列(例えばエキソン)との重複配列を縁取るスペーサー配列
は、工程ii.の前に選択する。あるいは、対象とする配列(例えば不活性化させるべき遺
伝子のエキソン)又は少なくとも対象とする配列(例えばエキソン)との重複配列を縁取
る潜在的標的部位は、工程ii.に記載の通り同定し、続いて標的部位の対を選択する。
又は少なくとも対象とする配列(例えばエキソン)との重複配列を縁取るスペーサー配列
は、工程ii.の前に選択する。あるいは、対象とする配列(例えば不活性化させるべき遺
伝子のエキソン)又は少なくとも対象とする配列(例えばエキソン)との重複配列を縁取
る潜在的標的部位は、工程ii.に記載の通り同定し、続いて標的部位の対を選択する。
別の実施態様において、この方法は、ゲノム中の対象とする配列の置換を誘導するDNA
組換え酵素(DRiGR)の潜在的標的部位となる配列を同定するために使用する。この場合
、工程i.で潜在的スペーサー配列となり、かつ同一でない2つの配列についてゲノムをス
クリーニングする。この場合、潜在的スペーサー配列は、少なくとも30%~100%、好まし
くは少なくとも50%のヌクレオチドだけ異なる。従ってこの場合、潜在的スペーサー配列
は好ましくは0%~50%、又は少なくとも70%未満の配列同一性を有する。
組換え酵素(DRiGR)の潜在的標的部位となる配列を同定するために使用する。この場合
、工程i.で潜在的スペーサー配列となり、かつ同一でない2つの配列についてゲノムをス
クリーニングする。この場合、潜在的スペーサー配列は、少なくとも30%~100%、好まし
くは少なくとも50%のヌクレオチドだけ異なる。従ってこの場合、潜在的スペーサー配列
は好ましくは0%~50%、又は少なくとも70%未満の配列同一性を有する。
さらに好ましい実施態様において、ゲノム中の対象とする配列の置換を誘導するDNA組
換え酵素(DRiGR)の潜在的標的部位となる配列を:
i. 潜在的標的部位である2つの配列についての対象とする配列を含む、ゲノム又はその
部分をスクリーニングすること(これらの潜在的標的部位は、少なくとも 5 bp、好まし
くは少なくとも7 bp、より好ましくは8 bp、及び好ましくは最大12、より好ましくは最大
10 bpの長さであるスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチド、より好
ましくは12~15ヌクレオチドを有する第1の部分部位及び第2の部分部位を含む。潜在的標
的部位の一方は対象とする配列の上流にあり、潜在的標的部位の他方は、対象とする配列
の下流にある。2つの配列は好ましくは100 kb、より好ましくは10 kb、及びさらにより好
ましくは2 kbの最大距離、及び好ましくは150 bpの最小距離をとる。置換を可能にするた
め、スペーサー配列は同一とならないように選択する。スペーサー配列は、少なくとも30
%~100%、好ましくは50%のヌクレオチドだけ異なる。従って、スペーサー配列は好ましく
は0%~50%、又は少なくとも70%未満の配列同一性を有する。)を含み、
ii.工程i.で同定された潜在的標的部位を好ましくはさらにスクリーニングして、宿主
ゲノム中の(どこにも)出現せず、そのために(ドナー配列を用いて、以下参照)配列特
異的置換が保証される潜在的標的配列を選択する、前記方法によって同定する。
換え酵素(DRiGR)の潜在的標的部位となる配列を:
i. 潜在的標的部位である2つの配列についての対象とする配列を含む、ゲノム又はその
部分をスクリーニングすること(これらの潜在的標的部位は、少なくとも 5 bp、好まし
くは少なくとも7 bp、より好ましくは8 bp、及び好ましくは最大12、より好ましくは最大
10 bpの長さであるスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチド、より好
ましくは12~15ヌクレオチドを有する第1の部分部位及び第2の部分部位を含む。潜在的標
的部位の一方は対象とする配列の上流にあり、潜在的標的部位の他方は、対象とする配列
の下流にある。2つの配列は好ましくは100 kb、より好ましくは10 kb、及びさらにより好
ましくは2 kbの最大距離、及び好ましくは150 bpの最小距離をとる。置換を可能にするた
め、スペーサー配列は同一とならないように選択する。スペーサー配列は、少なくとも30
%~100%、好ましくは50%のヌクレオチドだけ異なる。従って、スペーサー配列は好ましく
は0%~50%、又は少なくとも70%未満の配列同一性を有する。)を含み、
ii.工程i.で同定された潜在的標的部位を好ましくはさらにスクリーニングして、宿主
ゲノム中の(どこにも)出現せず、そのために(ドナー配列を用いて、以下参照)配列特
異的置換が保証される潜在的標的配列を選択する、前記方法によって同定する。
さらに好ましい工程iii.において、標的配列は、各々DNA組換え酵素の既知の標的部位
の部分部位との相同性を有する部分部位を含む、工程i.はii.で得られた潜在的標的配列
のリストから選択する。相同性とは、一定数のヌクレオチド位置に同一の塩基を有するこ
とを意味する。好ましくは、各部分部位はDNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位と
少なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好ましくは少なくとも30%同一なヌクレオ
チド位置を有する。
の部分部位との相同性を有する部分部位を含む、工程i.はii.で得られた潜在的標的配列
のリストから選択する。相同性とは、一定数のヌクレオチド位置に同一の塩基を有するこ
とを意味する。好ましくは、各部分部位はDNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位と
少なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好ましくは少なくとも30%同一なヌクレオ
チド位置を有する。
配列特異的な置換を保証する工程ii.の選択は、工程iii.の前に実施しても、後に実施
してもよい。
してもよい。
好ましくは工程i.の間又はその前に、置換するべき対象とする配列(好ましくは、遺伝
子又はエキソン)のゲノム中の座標を決定する。探索範囲とする対象とする配列及び縁取
る配列に及ぶ150 bp~10 kbの断片を作成する。他の遺伝子と重複する断片は除く。他の
全ての断片について、潜在的標的部位を同定する。
子又はエキソン)のゲノム中の座標を決定する。探索範囲とする対象とする配列及び縁取
る配列に及ぶ150 bp~10 kbの断片を作成する。他の遺伝子と重複する断片は除く。他の
全ての断片について、潜在的標的部位を同定する。
一実施態様において、対象とする配列(例えば置換するべき遺伝子のエキソン)又は少
なくとも対象とする配列(例えばエキソン)との重複配列を縁取るスペーサー配列を、選
択する。
なくとも対象とする配列(例えばエキソン)との重複配列を縁取るスペーサー配列を、選
択する。
ゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えることにより、部位特異的DNA組換え
を誘導して、ヌクレオチド配列を改変することが可能な本発明のデザイナーDNA組換え酵
素を調製するための方法(デザイナーリコンビナーゼ誘導遺伝子置換又は欠失)は:
a) 改変するべきヌクレオチド配列(対象とする部位)の上流のヌクレオチド配列を第1
の標的部位として、改変するべきヌクレオチド配列の下流の(好ましくは30~40塩基対の
長さである)ヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択する工程(ここで、標的部位
の配列は、同一ではない。同一ではない(not identical)又は同一ではない(non-identic
al)標的配列という用語は、上記の通り定義する。標的部位の一方又は両方は非対称であ
り、対称な部位はゲノム中にほとんど見つからない点で有利である。各々の標的部位はス
ペーサー配列(先に定義した通り、好ましくは5~12ヌクレオチド)によって隔てられた
第1の部分部位及び第2の部分部位(先に定義した通り、好ましくは10~20ヌクレオチド)
を含む。好ましくは、標的配列は各々DNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位との相
同性を有する部分部位を含むように選択する。相同性とは、一定数のヌクレオチド位置に
同一の塩基を有することを意味する。好ましくは、各部分部位はDNA組換え酵素の既知の
標的部位の部分部位と少なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好ましくは少なくと
も30%同一なヌクレオチド位置を有する。さらに、先に説明した通り、部分部位は好まし
くは、相互間に相同性を有する。好ましくは、各部分部位は、同じ標的部位の他の部分部
位及び/又は他の標的部位の部分部位と少なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好
ましくは少なくとも30%同一なヌクレオチド位置を有する。)
b) a)で基質として選択した第1の標的部位及び第2の標的部位を含む核酸を使用してDNA
組換え酵素の少なくとも1つのライブラリ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは最大4
つのライブラリに対して、分子指向性進化法を適用する工程、を含み、
(分子指向性進化法又は分子指向性進化法及び合理的設計の組合わせにより)a1)で選択
した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つのデザイナ
ーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う。
を誘導して、ヌクレオチド配列を改変することが可能な本発明のデザイナーDNA組換え酵
素を調製するための方法(デザイナーリコンビナーゼ誘導遺伝子置換又は欠失)は:
a) 改変するべきヌクレオチド配列(対象とする部位)の上流のヌクレオチド配列を第1
の標的部位として、改変するべきヌクレオチド配列の下流の(好ましくは30~40塩基対の
長さである)ヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択する工程(ここで、標的部位
の配列は、同一ではない。同一ではない(not identical)又は同一ではない(non-identic
al)標的配列という用語は、上記の通り定義する。標的部位の一方又は両方は非対称であ
り、対称な部位はゲノム中にほとんど見つからない点で有利である。各々の標的部位はス
ペーサー配列(先に定義した通り、好ましくは5~12ヌクレオチド)によって隔てられた
第1の部分部位及び第2の部分部位(先に定義した通り、好ましくは10~20ヌクレオチド)
を含む。好ましくは、標的配列は各々DNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位との相
同性を有する部分部位を含むように選択する。相同性とは、一定数のヌクレオチド位置に
同一の塩基を有することを意味する。好ましくは、各部分部位はDNA組換え酵素の既知の
標的部位の部分部位と少なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好ましくは少なくと
も30%同一なヌクレオチド位置を有する。さらに、先に説明した通り、部分部位は好まし
くは、相互間に相同性を有する。好ましくは、各部分部位は、同じ標的部位の他の部分部
位及び/又は他の標的部位の部分部位と少なくとも10%,、好ましくは少なくとも20%,、好
ましくは少なくとも30%同一なヌクレオチド位置を有する。)
b) a)で基質として選択した第1の標的部位及び第2の標的部位を含む核酸を使用してDNA
組換え酵素の少なくとも1つのライブラリ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは最大4
つのライブラリに対して、分子指向性進化法を適用する工程、を含み、
(分子指向性進化法又は分子指向性進化法及び合理的設計の組合わせにより)a1)で選択
した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つのデザイナ
ーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う。
デザイナーDNA組換え酵素は、任意の標的配列の対を標的化するように選択し、その結
果これらの標的部位に隣接したあらゆる対象とする配列を選択することができる。標的配
列は、宿主(例えば、細胞又は生物)ゲノム中又はウイルスのような病原体のゲノム中に
天然に出現する配列とする。本発明の状況における「ゲノム中に天然に出現する配列」と
は、標的配列が人為的に導入されたものでないこと、及び同一でない両方の配列が同じゲ
ノム中にネイティブに(天然に)出現することを意味する。
果これらの標的部位に隣接したあらゆる対象とする配列を選択することができる。標的配
列は、宿主(例えば、細胞又は生物)ゲノム中又はウイルスのような病原体のゲノム中に
天然に出現する配列とする。本発明の状況における「ゲノム中に天然に出現する配列」と
は、標的配列が人為的に導入されたものでないこと、及び同一でない両方の配列が同じゲ
ノム中にネイティブに(天然に)出現することを意味する。
ゲノムは、生物又は病原体の全ての遺伝物質と定義する。ゲノムは、一般的にDNA(又
はRNAウイルスではRNA)からなる。ゲノムは、遺伝子(コード領域又はエキソン)、(イ
ントロン及び調節配列のような)非コードDNA、並びにミトコンドリア及びクロロプラス
トの遺伝物質を含む。
はRNAウイルスではRNA)からなる。ゲノムは、遺伝子(コード領域又はエキソン)、(イ
ントロン及び調節配列のような)非コードDNA、並びにミトコンドリア及びクロロプラス
トの遺伝物質を含む。
好ましい標的配列は、宿主細胞又は宿主生物の標的ゲノム中に固有の配列を含む。一部
の生物は複数の染色体コピーを有し、この状況において「固有の」とは、その配列が染色
体1セット当たり1回きり出現することをいう。
の生物は複数の染色体コピーを有し、この状況において「固有の」とは、その配列が染色
体1セット当たり1回きり出現することをいう。
本発明者らは、予想外にもあるDNA組換え酵素を使用して、全ての部分部位が相互間で1
3個の位置のうち、7~9個だけ異なる場合に、2つの異なる標的部位を組み換えることがで
きることを見出した(実施例F9-3を参照されたい。この例では、loxF9a及びloxF9bの両方
を組換えることができる)。
3個の位置のうち、7~9個だけ異なる場合に、2つの異なる標的部位を組み換えることがで
きることを見出した(実施例F9-3を参照されたい。この例では、loxF9a及びloxF9bの両方
を組換えることができる)。
一般的に、全ての部分部位は、相互間で7つ以下の位置、好ましくは5つ以下の位置、よ
り好ましくは4つ以下の位置で異なる。1つのDNA組換え酵素のライブラリを使用して、両
方の標的部位を、特にDRiGR反応で組換えることができる酵素を進化させることができる
(図15及び16、並びに実施例についての63ページの表を参照されたい)。
り好ましくは4つ以下の位置で異なる。1つのDNA組換え酵素のライブラリを使用して、両
方の標的部位を、特にDRiGR反応で組換えることができる酵素を進化させることができる
(図15及び16、並びに実施例についての63ページの表を参照されたい)。
別の場合、部分部位は対比較における最大7つ、好ましくは5つ、より好ましくは4つの
ミスマッチの相違を示し、従って、両方の標的部位は部分部位間で最大7つ、好ましくは5
つ、より好ましくは4つのミスマッチを示す。この場合、DNA組換え酵素の2つのライブラ
リを使用して、両方の標的部位を組換えることができるように酵素を進化させる。
ミスマッチの相違を示し、従って、両方の標的部位は部分部位間で最大7つ、好ましくは5
つ、より好ましくは4つのミスマッチを示す。この場合、DNA組換え酵素の2つのライブラ
リを使用して、両方の標的部位を組換えることができるように酵素を進化させる。
さらなる場合、一方の標的部位のみが最大7つ、好ましくは5つ、より好ましくは4つの
ミスマッチを有する1対の部分部位を示し、従って、他方の標的部位は7つ超、好ましくは
5つ、より好ましくは4つのミスマッチだけ異なり、また、他方の標的部位の部分部位は、
相互に比較して7つ超、好ましくは5つ、より好ましくは4つのミスマッチを示す。この場
合、DNA組換え酵素の3つ又は4つのライブラリを使用して、両方の標的部位を組換えるこ
とができるように酵素を進化させる。
ミスマッチを有する1対の部分部位を示し、従って、他方の標的部位は7つ超、好ましくは
5つ、より好ましくは4つのミスマッチだけ異なり、また、他方の標的部位の部分部位は、
相互に比較して7つ超、好ましくは5つ、より好ましくは4つのミスマッチを示す。この場
合、DNA組換え酵素の3つ又は4つのライブラリを使用して、両方の標的部位を組換えるこ
とができるように酵素を進化させる。
工程b)で使用するDNA組換え酵素のライブラリ(複数可)を進化させて、DNA組換え酵素
の1つの単量体を得、又は共進化させて標的部位の対に一緒に働きかけるDNA組換え酵素の
少なくとも2つの単量体を得る。工程b)において使用するDNA組換え酵素の2以上のライブ
ラリの場合、それらは好ましくは作用上、好ましくは1つの発現ベクターで結び付けられ
ている。DNA組換え酵素の2以上のライブラリを使用する場合、ライブラリは好ましくは同
じ調節エレメント、好ましくは同じプロモーターの制御下で発現させる。
の1つの単量体を得、又は共進化させて標的部位の対に一緒に働きかけるDNA組換え酵素の
少なくとも2つの単量体を得る。工程b)において使用するDNA組換え酵素の2以上のライブ
ラリの場合、それらは好ましくは作用上、好ましくは1つの発現ベクターで結び付けられ
ている。DNA組換え酵素の2以上のライブラリを使用する場合、ライブラリは好ましくは同
じ調節エレメント、好ましくは同じプロモーターの制御下で発現させる。
好ましくは、DNA組換え酵素の1又は2~4つのライブラリを、共進化させるために工程b)
で使用する。特に好ましくい実施態様において、DNA組換え酵素の2~4つのライブラリを
、工程b)で使用する。
で使用する。特に好ましくい実施態様において、DNA組換え酵素の2~4つのライブラリを
、工程b)で使用する。
2以上のライブラリを使用する場合、使用するDNA組換え酵素の異なるライブラリは、標
的部位特異性の観点で異なっている。
的部位特異性の観点で異なっている。
DNA組換え酵素の2つのライブラリを使用する場合、各ライブラリ中のDNA組換え酵素は
異なる非対称の標的部位―2つの異なる部分部位から構成される標的部位を認識する点で
有利である。
異なる非対称の標的部位―2つの異なる部分部位から構成される標的部位を認識する点で
有利である。
DNA組換え酵素の4つのライブラリを使用する場合、各ライブラリ中のDNA組換え酵素は
好ましくは各々異なる非対称の標的部位の部分部位を認識する。従って、それらはヘテロ
四量体として共発現された場合にのみ、標的部位を組換える。
好ましくは各々異なる非対称の標的部位の部分部位を認識する。従って、それらはヘテロ
四量体として共発現された場合にのみ、標的部位を組換える。
好ましい実施態様において、工程b)における共進化を、DNA組換え酵素のライブラリ又
は少なくとも2つの異なるDNA組換え酵素のライブラリ、及び第1及び第2の標的部位を含む
ものをコードする発現ベクターを使用して実施する。特に、好ましい実施態様において、
発現ベクターはDNA組換え酵素の2つ又は4つのライブラリをコードする。
は少なくとも2つの異なるDNA組換え酵素のライブラリ、及び第1及び第2の標的部位を含む
ものをコードする発現ベクターを使用して実施する。特に、好ましい実施態様において、
発現ベクターはDNA組換え酵素の2つ又は4つのライブラリをコードする。
ベクターの好ましい実施態様において、ネガティブ選択マーカーは、第1及び第2の標的
部位の間にある。従って、第1及び第2の標的部位は、好ましくはネガティブ選択マーカー
を縁取る。従って、組換えが起こる場合、ネガティブ選択マーカーを有する配列が切断さ
れ、ネガティブ選択は行われない。しかしながら、組換えが起こらない場合、ネガティブ
選択マーカーは機能する。
部位の間にある。従って、第1及び第2の標的部位は、好ましくはネガティブ選択マーカー
を縁取る。従って、組換えが起こる場合、ネガティブ選択マーカーを有する配列が切断さ
れ、ネガティブ選択は行われない。しかしながら、組換えが起こらない場合、ネガティブ
選択マーカーは機能する。
好ましい実施態様において、ネガティブ選択マーカーは制限酵素の認識部位である。好
ましくは固有の認識部位とは―ベクター中に1回だけ出現する制限酵素の認識部位を意味
する。制限酵素とインキュベートすることにより、組換えを受けていない発現ベクターは
線状化する。線状化された発現ベクターは、例えば(図4~7に例示されている)非線状化
プラスミドのみを増幅するPCR用のプライマーペアを選択し、かつ/又は線状化DNAをエキ
ソヌクレアーゼで消化することによりネガティブ選択する。
ましくは固有の認識部位とは―ベクター中に1回だけ出現する制限酵素の認識部位を意味
する。制限酵素とインキュベートすることにより、組換えを受けていない発現ベクターは
線状化する。線状化された発現ベクターは、例えば(図4~7に例示されている)非線状化
プラスミドのみを増幅するPCR用のプライマーペアを選択し、かつ/又は線状化DNAをエキ
ソヌクレアーゼで消化することによりネガティブ選択する。
好ましい実施態様において、ネガティブ選択は、2以上の制限酵素認識部位を含み、好
ましくは2又は3つの(最大5つさえもの)同じ制限酵素認識部位を、特に2~3つの(又は
最大5つさえもの)異なる制限酵素認識部位を含む。
ましくは2又は3つの(最大5つさえもの)同じ制限酵素認識部位を、特に2~3つの(又は
最大5つさえもの)異なる制限酵素認識部位を含む。
これにより、組換えを受けていない発現ベクターの線状化の効率が著しく増強される。
置換をもたらす酵素の選択をさらに増強するため、好ましくはエキソヌクレアーゼを加え
て線状化DNAを消化する。
置換をもたらす酵素の選択をさらに増強するため、好ましくはエキソヌクレアーゼを加え
て線状化DNAを消化する。
第1の標的部位及び第2の標的部位を含む基質核酸(好ましくは縁取るネガティブ選択マ
ーカー)を、好ましくはDNA組換え酵素のライブラリ又はDNA組換え酵素の少なくとも2つ
の異なるライブラリをコードするDNAと同じベクターに配置する(図4及び7に例示する)
。
ーカー)を、好ましくはDNA組換え酵素のライブラリ又はDNA組換え酵素の少なくとも2つ
の異なるライブラリをコードするDNAと同じベクターに配置する(図4及び7に例示する)
。
一実施態様においてまた、方法は先に規定した発現ベクターを細胞に導入すること及び
DNA組換え酵素を発現させることを含む。あるいは、無細胞発現システムを使用する。
DNA組換え酵素を発現させることを含む。あるいは、無細胞発現システムを使用する。
本発明のDNA組換え酵素により欠失をもたらしたい場合(DRiGD)、好ましくはさらなる
DNA基質又はベクターは1つの組換え反応に使用しない。組換えに成功すると、ネガティブ
選択マーカーが切り出され、プラスミドを―好ましくはPCRによって―増幅させる(図6及
び7に例示する―pDuoSLiDE-DRiGD、pQuSLiDE-DRiGD)。本事例において先に記載の通り、
第1及び第2の標的配列は、同一のスペーサー配列を含む(図2も参照されたい)。
DNA基質又はベクターは1つの組換え反応に使用しない。組換えに成功すると、ネガティブ
選択マーカーが切り出され、プラスミドを―好ましくはPCRによって―増幅させる(図6及
び7に例示する―pDuoSLiDE-DRiGD、pQuSLiDE-DRiGD)。本事例において先に記載の通り、
第1及び第2の標的配列は、同一のスペーサー配列を含む(図2も参照されたい)。
先に記載のDNA組換え酵素の潜在的標的部位である配列を同定する方法を、好ましくは
欠失又は置換のためのデザイナーDNA組換え酵素を調製するための方法の工程a)において
、標的部位を選択するとき又は前に、実施する。
欠失又は置換のためのデザイナーDNA組換え酵素を調製するための方法の工程a)において
、標的部位を選択するとき又は前に、実施する。
本発明のDNA組換え酵素により置換をもたらしたい場合(DRiGR)、基質に加え、第1の
標的部位及び第2の標的部位を含む合成配列を使用する。本事例において先に記載の通り
、第1及び第2の標的配列は、欠失が起こることを避けるため、異なるスペーサー配列を含
む。結果として、(ライブラリをコードするベクターにある)基質上の同一の標的配列及
び合成配列を組換えることにより、組換えが置換に対して変化する。ここで、ネガティブ
選択マーカーを合成配列で組換えることにより置換する。
標的部位及び第2の標的部位を含む合成配列を使用する。本事例において先に記載の通り
、第1及び第2の標的配列は、欠失が起こることを避けるため、異なるスペーサー配列を含
む。結果として、(ライブラリをコードするベクターにある)基質上の同一の標的配列及
び合成配列を組換えることにより、組換えが置換に対して変化する。ここで、ネガティブ
選択マーカーを合成配列で組換えることにより置換する。
好ましい実施態様において、合成配列は複製欠損プラスミドである(例えば、図4及び5
も参照されたい)。しかしながら、代替の実施態様において、線状DNA鎖を使用する。別
の好ましい実施態様において、合成配列は高コピー数プラスミド上にある(例えば図14を
参照されたい)。
も参照されたい)。しかしながら、代替の実施態様において、線状DNA鎖を使用する。別
の好ましい実施態様において、合成配列は高コピー数プラスミド上にある(例えば図14を
参照されたい)。
置換をもたらすDNA組換え酵素をさらに選択するため、合成配列は、好ましくは第1及び
第2の標的の間のポジティブ選択マーカーを含む。組換えが起こる場合、ポジティブ選択
マーカーを有する配列を発現ベクターに挿入し、かつポジティブ選択マーカーを有する発
現ベクターをポジティブ選択することができる。一実施態様において、ポジティブ選択マ
ーカーは抗生物質耐性遺伝子である。従って、ベクターの細胞への導入後、ポジティブ選
択マーカーを有するベクターを含む細胞を、容易に選択することができる。
第2の標的の間のポジティブ選択マーカーを含む。組換えが起こる場合、ポジティブ選択
マーカーを有する配列を発現ベクターに挿入し、かつポジティブ選択マーカーを有する発
現ベクターをポジティブ選択することができる。一実施態様において、ポジティブ選択マ
ーカーは抗生物質耐性遺伝子である。従って、ベクターの細胞への導入後、ポジティブ選
択マーカーを有するベクターを含む細胞を、容易に選択することができる。
(DRiGRについての)一実施態様において、ベクターは第1及び第2の標的部位の間にネ
ガティブ選択マーカーを有し、合成配列は第1及び第2の標的部位の間にポジティブ選択マ
ーカーをさらに含む。
ガティブ選択マーカーを有し、合成配列は第1及び第2の標的部位の間にポジティブ選択マ
ーカーをさらに含む。
他のネガティブ及びポジティブ選択マーカーは、当業者に公知である。さらに適用可能
なネガティブ選択マーカーには、URA3(5-フルオロオロト酸を毒性化合物である5-フルオ
ロウラシルに変換する)又はウイルスチミジンキナーゼ(宿主をガンシクロビル選択に感
受性にする)のような毒素をコードする遺伝子又はプロドラッグを毒性薬物に変換する遺
伝子をコードする酵素をコードする遺伝子がある。更に適用可能なポジティブ選択マーカ
ーは、栄養要求性を補充することができる酵素をコードする遺伝子である。
なネガティブ選択マーカーには、URA3(5-フルオロオロト酸を毒性化合物である5-フルオ
ロウラシルに変換する)又はウイルスチミジンキナーゼ(宿主をガンシクロビル選択に感
受性にする)のような毒素をコードする遺伝子又はプロドラッグを毒性薬物に変換する遺
伝子をコードする酵素をコードする遺伝子がある。更に適用可能なポジティブ選択マーカ
ーは、栄養要求性を補充することができる酵素をコードする遺伝子である。
分子進化の一工程は、好ましくは少なくとも1つの選択工程及び少なくとも1つの突然変
異誘発工程を含む。選択した分子を選択工程の間で「進化」させるため、選択した候補を
好ましくは突然変異誘発し、その結果突然変異を配列に導入して次のラウンドの選択で試
験する。突然変異誘発の好適な方法は当業者には公知であり、特に誤りを起こしやすいPC
R、化学的突然変異誘発、特異的突然変異宿主種の使用、再帰的アンサンブル突然変異誘
発、コンビナトリアルカセット突然変異誘発、及びDNAシャッフル、並びにこれらの方法
の組合わせを含む。
異誘発工程を含む。選択した分子を選択工程の間で「進化」させるため、選択した候補を
好ましくは突然変異誘発し、その結果突然変異を配列に導入して次のラウンドの選択で試
験する。突然変異誘発の好適な方法は当業者には公知であり、特に誤りを起こしやすいPC
R、化学的突然変異誘発、特異的突然変異宿主種の使用、再帰的アンサンブル突然変異誘
発、コンビナトリアルカセット突然変異誘発、及びDNAシャッフル、並びにこれらの方法
の組合わせを含む。
1以上、好ましくは5~50、好ましくは8~30サイクルの共進化を好ましくは実施し、標
的部位に対する活性を有するDNA組換え酵素が進化するまでこれを行う。
的部位に対する活性を有するDNA組換え酵素が進化するまでこれを行う。
本発明のいくつかの実施態様において、共進化工程b)をDNA組換え酵素の既存のライブ
ラリに直接実施することができる。
ラリに直接実施することができる。
好ましい実施態様において、本発明の方法は、工程b)で使用するDNA組換え酵素の2つの
ライブラリを取得するための、以下のさらなる工程を含む。ここで、工程a)は、さらに工
程a1)と呼ぶ。
a2) DNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位となる4つの配列を同定する工程(ここ
で、第1の配列は(a1)に従って選択する)第1の標的部位の第1の部分部位と相同であり、
第2の配列は(a1)に従って選択する)第1の標的部位の第2の部分部位と相同であり、第3
の配列は(a1)に従って選択する)第2の標的部位の第1の部分部位と相同であり、第4の配
列は(a1)に従って選択する)第2の標的部位の第2の部分部位と相同である)。
ライブラリを取得するための、以下のさらなる工程を含む。ここで、工程a)は、さらに工
程a1)と呼ぶ。
a2) DNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位となる4つの配列を同定する工程(ここ
で、第1の配列は(a1)に従って選択する)第1の標的部位の第1の部分部位と相同であり、
第2の配列は(a1)に従って選択する)第1の標的部位の第2の部分部位と相同であり、第3
の配列は(a1)に従って選択する)第2の標的部位の第1の部分部位と相同であり、第4の配
列は(a1)に従って選択する)第2の標的部位の第2の部分部位と相同である)。
選択する工程a1及び同定する工程a2は、好ましくは一工程a)で、例えばSeLOXアルゴリ
ズムのようなコンピュータプログラム((Surendranath, V. らの文献(2010))によって同
時に実施する。好ましくは対象とする部位の上流及び下流の配列をDNA組換え酵素の既知
の標的部位と比較する。各部分部位がDNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位との一
定の相同性を有する標的配列は、a1)に記載の通り選択する。この方法において同定する
公知の標的部位の部分部位は、a2)で言及する部位である。相同性の度合いは好ましくはa
1で言及した通りである。
ズムのようなコンピュータプログラム((Surendranath, V. らの文献(2010))によって同
時に実施する。好ましくは対象とする部位の上流及び下流の配列をDNA組換え酵素の既知
の標的部位と比較する。各部分部位がDNA組換え酵素の既知の標的部位の部分部位との一
定の相同性を有する標的配列は、a1)に記載の通り選択する。この方法において同定する
公知の標的部位の部分部位は、a2)で言及する部位である。相同性の度合いは好ましくはa
1で言及した通りである。
(工程a3):)
この工程において、工程a2)で同定する部分部位及び工程a1)で選択する標的部位の間の
混合物である、中間標的部位を好ましくは作製する。
この工程において、工程a2)で同定する部分部位及び工程a1)で選択する標的部位の間の
混合物である、中間標的部位を好ましくは作製する。
a1)で選択する標的部位とは異なる(a2)で定義した)第1~第4の配列中のヌクレオチド
を決定し、かつ標的部位の対応する部分部位に出現するヌクレオチドが異なる1以上、好
ましくは最大3つのヌクレオチドを置換することにより、好ましくは中間標的部位を作製
する。
を決定し、かつ標的部位の対応する部分部位に出現するヌクレオチドが異なる1以上、好
ましくは最大3つのヌクレオチドを置換することにより、好ましくは中間標的部位を作製
する。
各中間標的部位上のDNA組換え酵素の分離した分子指向性進化についての一実施態様に
おいて、中間標的部位は対称であり、従ってこれらは同一又は逆相補的部分部位を含む。
この実施態様において、好ましくは4つの中間標的部位のセットを作製する―標的部位の
各部分部位について1つの中間標的部位をa1)で選択する。
おいて、中間標的部位は対称であり、従ってこれらは同一又は逆相補的部分部位を含む。
この実施態様において、好ましくは4つの中間標的部位のセットを作製する―標的部位の
各部分部位について1つの中間標的部位をa1)で選択する。
DNA組換え酵素の共進化についての別の実施態様において、好ましくは2つの非対称中間
標的部位のセットを作製する。第1の中間第1標的部位は、(工程a1)で選択する)第1の標
的部位の第1の部分部位中に出現するヌクレオチドによってヌクレオチドが置換される(a
2)で規定する)第1の配列に対応する1つの配列、及び(a1)で選択する)第1の標的部位の
第2の部分部位中に出現するヌクレオチドによってヌクレオチドが置換される(a2)で規定
する)第2の配列に対応する配列を含む。第2の中間標的部位は、(工程a1)で選択する)
第2の標的部位の第1の部分部位中に出現するヌクレオチドによってヌクレオチドが置換さ
れる(a2)で規定する)第3の配列に対応する配列、及び(工程a1)で選択する)第2の標的
部位の第2の部分部位中に出現するヌクレオチドによってヌクレオチドが置換される(a2)
で規定する)第4の配列に対応する配列を含む。
標的部位のセットを作製する。第1の中間第1標的部位は、(工程a1)で選択する)第1の標
的部位の第1の部分部位中に出現するヌクレオチドによってヌクレオチドが置換される(a
2)で規定する)第1の配列に対応する1つの配列、及び(a1)で選択する)第1の標的部位の
第2の部分部位中に出現するヌクレオチドによってヌクレオチドが置換される(a2)で規定
する)第2の配列に対応する配列を含む。第2の中間標的部位は、(工程a1)で選択する)
第2の標的部位の第1の部分部位中に出現するヌクレオチドによってヌクレオチドが置換さ
れる(a2)で規定する)第3の配列に対応する配列、及び(工程a1)で選択する)第2の標的
部位の第2の部分部位中に出現するヌクレオチドによってヌクレオチドが置換される(a2)
で規定する)第4の配列に対応する配列を含む。
(工程a4):)
工程a2)で規定する配列を認識するDNA組換え酵素に対し、第1の中間標的部位及び/又は
第2の中間標的部位を含む核酸を基質として使用して、分子指向性進化法を適用する。
工程a2)で規定する配列を認識するDNA組換え酵素に対し、第1の中間標的部位及び/又は
第2の中間標的部位を含む核酸を基質として使用して、分子指向性進化法を適用する。
一実施態様において、核酸は第1の中間標的部位及び第2の中間標的の両方を含み、DNA
組換え酵素の直接的進化を両方の中間標的部位に対し実施する(直接的共進化)。共進化
は好ましくは工程b)について先に記載の通りに実施する。
組換え酵素の直接的進化を両方の中間標的部位に対し実施する(直接的共進化)。共進化
は好ましくは工程b)について先に記載の通りに実施する。
好ましい実施態様において、分子指向性進化法の第1ラウンドを各中間標的部位につい
てDNA組換え酵素の分離分子指向性進化法(separated molecular directed evolution)
(分離進化法)として実施する(例えば、図8を参照されたい)。さらなる実施態様にお
いて、これらに続き、1以上の共進化工程を行う。
てDNA組換え酵素の分離分子指向性進化法(separated molecular directed evolution)
(分離進化法)として実施する(例えば、図8を参照されたい)。さらなる実施態様にお
いて、これらに続き、1以上の共進化工程を行う。
分子指向性進化法の工程は、好ましくは中間標的部位に対する組換えのポジティブ選択
を行うこと、及び/又は他の標的部位に対する組換えに対しネガティブ選択を行うことを
含む。
を行うこと、及び/又は他の標的部位に対する組換えに対しネガティブ選択を行うことを
含む。
選択した分子を選択工程の間で「進化」させるため、選択した候補を好ましくは突然変
異誘発し、その結果突然変異を配列に導入して次のラウンドの選択で試験する。突然変異
誘発の好適な方法は当業者には公知であり、特に誤りを起こしやすいPCR、化学的突然変
異誘発、特異的突然変異宿主種の使用、再帰的アンサンブル突然変異誘発、コンビナトリ
アルカセット突然変異誘発、及びDNAシャッフル、並びにこれらの方法の組合わせを含む
。
異誘発し、その結果突然変異を配列に導入して次のラウンドの選択で試験する。突然変異
誘発の好適な方法は当業者には公知であり、特に誤りを起こしやすいPCR、化学的突然変
異誘発、特異的突然変異宿主種の使用、再帰的アンサンブル突然変異誘発、コンビナトリ
アルカセット突然変異誘発、及びDNAシャッフル、並びにこれらの方法の組合わせを含む
。
1以上、好ましくは8~40、好ましくは15サイクルの分子指向性進化法を好ましくは実施
し、中間標的部位に対する活性を有するDNA組換え酵素が進化するまでこれを行う。
し、中間標的部位に対する活性を有するDNA組換え酵素が進化するまでこれを行う。
利用する分子指向性進化法は、好ましくは基質に関連したタンパク質の進化、特にWO 2
002044409 A2に記載された通りである。しかしながら、他の指向性進化戦略、例えば継続
的進化(WO2012088381 A2)も適用することができる。
002044409 A2に記載された通りである。しかしながら、他の指向性進化戦略、例えば継続
的進化(WO2012088381 A2)も適用することができる。
続いて好ましくは中間標的部位のさらなるセットを配列を(a1)で選んだ)標的部位の
部分部位にさらに適応させることにより、標的部位の対応する部分部位に出現するヌクレ
オチドの分だけ異なる、好ましくは1以上の、最大3ヌクレオチドを置換することにより作
製する。
部分部位にさらに適応させることにより、標的部位の対応する部分部位に出現するヌクレ
オチドの分だけ異なる、好ましくは1以上の、最大3ヌクレオチドを置換することにより作
製する。
分子指向性進化法の下位工程である中間標的部位のシャッフル及びそのさらなるセット
の作製は、好ましくは中間標的部位が(a1)で選択した)標的部位の部分部位からの部分
部位当たり1~3、好ましくは1又は2ヌクレオチドのみの分だけ差がつくまで実施する。
の作製は、好ましくは中間標的部位が(a1)で選択した)標的部位の部分部位からの部分
部位当たり1~3、好ましくは1又は2ヌクレオチドのみの分だけ差がつくまで実施する。
置換を誘導するDNA組換え酵素(DRiGR)を取得するために好ましい一実施態様において
、工程b)を分子進化法の3つの下位工程において実施する。
、工程b)を分子進化法の3つの下位工程において実施する。
第1の工程において、ライブラリ(複数可)を人工配列を用いずに(従って、ドナーベ
クターを用いずに)先にDRiGDについて記載した通りに進化させ、標的部位に対する少な
くともいく分かの活性を示すリコンビナーゼ、従って少なくとも切除活性を示すDNA組換
え酵素を選択する。この第1工程を好ましくは、最初に中間標的部位の第1のセット、及び
続いて任意に中間標的部位の第2のセット、及び最後に最終標的部位に対して先に記載の
通り実施する。
クターを用いずに)先にDRiGDについて記載した通りに進化させ、標的部位に対する少な
くともいく分かの活性を示すリコンビナーゼ、従って少なくとも切除活性を示すDNA組換
え酵素を選択する。この第1工程を好ましくは、最初に中間標的部位の第1のセット、及び
続いて任意に中間標的部位の第2のセット、及び最後に最終標的部位に対して先に記載の
通り実施する。
第2の工程において、工程i)の結果として得られるDNA組換え酵素のライブラリ(複数可
)を、抗生物質耐性遺伝子のようなポジティブ選択マーカーを有する人工配列を使用して
進化させる。人工配列は、好ましくは複製欠損ドナーベクターである。従って、宿主細胞
において活性を有する複製起点を有さないプラスミド又は線状配列を使用する(図9に例
示されている)。第2の工程は好ましくは最終標的部位に対して実施する。第2の工程にお
いて、(純粋な切除よりも複雑な反応である)DRiGRによって配列を置換することができ
るDNA組換え酵素を選択する。好ましくは5~20サイクル、より好ましくは8~15サイクル
の基質連関分子進化法を実施し、最終標的部位に対する活性を有する酵素を得るまでこれ
を行う。複製欠損ドナーベクターの抗生物質選択マーカーと組み合わせた使用により、第
1の標的部位に対する第1の組換え反応(統合)を第2の標的部位に対する第2の組換え反応
(切除)から分離することが可能となり、これはDRiGR反応の成功に必要である。
)を、抗生物質耐性遺伝子のようなポジティブ選択マーカーを有する人工配列を使用して
進化させる。人工配列は、好ましくは複製欠損ドナーベクターである。従って、宿主細胞
において活性を有する複製起点を有さないプラスミド又は線状配列を使用する(図9に例
示されている)。第2の工程は好ましくは最終標的部位に対して実施する。第2の工程にお
いて、(純粋な切除よりも複雑な反応である)DRiGRによって配列を置換することができ
るDNA組換え酵素を選択する。好ましくは5~20サイクル、より好ましくは8~15サイクル
の基質連関分子進化法を実施し、最終標的部位に対する活性を有する酵素を得るまでこれ
を行う。複製欠損ドナーベクターの抗生物質選択マーカーと組み合わせた使用により、第
1の標的部位に対する第1の組換え反応(統合)を第2の標的部位に対する第2の組換え反応
(切除)から分離することが可能となり、これはDRiGR反応の成功に必要である。
第3の工程において、分子進化法をポジティブ選択マーカーを含まない人工配列を用い
た、工程ii)の結果として得られるDNA組換え酵素のライブラリ(複数可)により実施する
。人工配列は、好ましくは使用した宿主細胞において活性を有する機能的複製起点を担持
するドナーベクターである(図14に例示されている)。第3の工程は好ましくは最終標的
部位に対して実施する。好ましくは5~20サイクル、より好ましくは8~15サイクルの基質
連関分子進化法を実施し、最終標的部位に対する活性を有する酵素を得るまでこれを行う
。この第3の工程において、標的部位1及び標的部位2に対する同等の組換え速度論を有し
、ポジティブ選択マーカーを必要としない、高い置換活性を示すDNA組換え酵素を選択す
る。これは、ポジティブ選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)の存在が不利な選
択肢となる多くの使用(特に、医学的使用、又は改変配列を有する多細胞生物を作製する
場合も)に関して重要な点である。
た、工程ii)の結果として得られるDNA組換え酵素のライブラリ(複数可)により実施する
。人工配列は、好ましくは使用した宿主細胞において活性を有する機能的複製起点を担持
するドナーベクターである(図14に例示されている)。第3の工程は好ましくは最終標的
部位に対して実施する。好ましくは5~20サイクル、より好ましくは8~15サイクルの基質
連関分子進化法を実施し、最終標的部位に対する活性を有する酵素を得るまでこれを行う
。この第3の工程において、標的部位1及び標的部位2に対する同等の組換え速度論を有し
、ポジティブ選択マーカーを必要としない、高い置換活性を示すDNA組換え酵素を選択す
る。これは、ポジティブ選択マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)の存在が不利な選
択肢となる多くの使用(特に、医学的使用、又は改変配列を有する多細胞生物を作製する
場合も)に関して重要な点である。
この3工程の方法は、特に標的部位間に同酵素又は特に2~3つ(又は最大5つさえも)の
異なる制限酵素の1つ又はいくつかの認識部位を含むベクターと組合わせた場合、置換を
誘導する酵素(DRiGR)を選択するのに非常に効率的であることが示されている。
異なる制限酵素の1つ又はいくつかの認識部位を含むベクターと組合わせた場合、置換を
誘導する酵素(DRiGR)を選択するのに非常に効率的であることが示されている。
一般に、この明細書の全体を通して、「ベクター」という用語は、それが連結されてい
る核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには、これらに限定はされない
が、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖の核酸分子;1以上の自由末端を含み、自由末
端を有さない(例えば、環状)の核酸分子;DNA、RNA、又はこれら両方を含む核酸分子;
及び当技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドがある。ベクターの1種に「プラス
ミド」がある。これは例えば標準的分子クローニング技術により追加のDNAセグメントを
その内部に挿入することができる環状二本鎖DNAループを指す。別の種類のベクターにウ
イルスベクターがある。これは、ベクター中にウイルス由来DNA又はRNA配列が存在し、パ
ッケージングしてウイルスとなるものである(例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロ
ウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス―AAV)
。また、ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスが担
持するポリヌクレオチドを含む。あるベクターはそれらが導入された宿主細胞中で自律複
製することができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム型の
哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム型哺乳動物ベクター)は、宿
主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに統合され、それにより宿主ゲノムとともに複
製される。
る核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには、これらに限定はされない
が、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖の核酸分子;1以上の自由末端を含み、自由末
端を有さない(例えば、環状)の核酸分子;DNA、RNA、又はこれら両方を含む核酸分子;
及び当技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドがある。ベクターの1種に「プラス
ミド」がある。これは例えば標準的分子クローニング技術により追加のDNAセグメントを
その内部に挿入することができる環状二本鎖DNAループを指す。別の種類のベクターにウ
イルスベクターがある。これは、ベクター中にウイルス由来DNA又はRNA配列が存在し、パ
ッケージングしてウイルスとなるものである(例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロ
ウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス―AAV)
。また、ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスが担
持するポリヌクレオチドを含む。あるベクターはそれらが導入された宿主細胞中で自律複
製することができる(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム型の
哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム型哺乳動物ベクター)は、宿
主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノムに統合され、それにより宿主ゲノムとともに複
製される。
さらに、あるベクターは、それらが作用可能に連結された遺伝子の発現を導くことがで
きる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。組換えDNA技術に
おいて有用となる一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態をとることが多い。
きる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。組換えDNA技術に
おいて有用となる一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態をとることが多い。
発現ベクターは好ましくはプラスミド、ウイルス、又は人工染色体である。
本発明のもう1つの目的は、ベクター又は方法において使用するベクターである。
好ましい発現ベクターは:
i) 各々DNA組換え酵素の(異なる)ライブラリをコードする1、2、3、又は4つの遺伝子(
ここで、ライブラリをコードする遺伝子は、同じプロモーターの制御下にある)
ii) 好ましくは発現ベクター中にたった1回だけ出現する制限酵素の認識部位(固有の認
識部位)である、ネガティブ選択マーカーを縁取る第1の標的部位及び第2の標的部位を含
む基質核酸、を含む。
i) 各々DNA組換え酵素の(異なる)ライブラリをコードする1、2、3、又は4つの遺伝子(
ここで、ライブラリをコードする遺伝子は、同じプロモーターの制御下にある)
ii) 好ましくは発現ベクター中にたった1回だけ出現する制限酵素の認識部位(固有の認
識部位)である、ネガティブ選択マーカーを縁取る第1の標的部位及び第2の標的部位を含
む基質核酸、を含む。
対象とする部位の欠失を誘導するDNA組換え酵素(DRiGD)を選択するためには、さらな
る基質DNAは必要とされない。発現ベクターの第1の中間標的部位及び第2の中間標的部位
の間での組換えが、単独で引き起こされるためである。
る基質DNAは必要とされない。発現ベクターの第1の中間標的部位及び第2の中間標的部位
の間での組換えが、単独で引き起こされるためである。
所望の配列により、対象とする部位の置換を誘導するDNA組換え酵素(DRiGR)を選択す
るために、第1の中間標的部位及び/又は第2の中間標的部位を含む、好ましくは合成核酸
(好ましくは複製欠損プラスミド)を追加の(ドナー)ベクターとして使用する。好まし
くは、ポジティブ選択マーカーは、第1及び第2の中間標的部位の間にある。従って、第1
及び第2の中間標的部位は、好ましくは抗生物質耐性遺伝子のようなポジティブ選択マー
カーを縁取る。
るために、第1の中間標的部位及び/又は第2の中間標的部位を含む、好ましくは合成核酸
(好ましくは複製欠損プラスミド)を追加の(ドナー)ベクターとして使用する。好まし
くは、ポジティブ選択マーカーは、第1及び第2の中間標的部位の間にある。従って、第1
及び第2の中間標的部位は、好ましくは抗生物質耐性遺伝子のようなポジティブ選択マー
カーを縁取る。
DNA組換え酵素を調製するための本発明の方法であって:
c) ライブラリから工程b)において得られた少なくとも1つのDNA組換え酵素の核酸を単離
する工程;及び好ましくは
d) 工程c)で得られた核酸を好適な送達ベクターにクローニングする工程、をさらに含み
得る。
c) ライブラリから工程b)において得られた少なくとも1つのDNA組換え酵素の核酸を単離
する工程;及び好ましくは
d) 工程c)で得られた核酸を好適な送達ベクターにクローニングする工程、をさらに含み
得る。
また、本発明は本発明の方法によって得られるデザイナーDNA組換え酵素を含む。
提示された発明により、本発明者らは柔軟で欠点のない遺伝子情報の改変を可能にする
組換えベースのゲノム編集の解決策を提供する。この方法を用いると、特にヒト疾患を引
き起こす遺伝的突然変異を置換し、又は所定の遺伝物質を細胞から抹消するDNA組換え酵
素を作製することが可能になる。従って、本発明のDNA組換え酵素を使用して、ヌクレオ
チド配列を改変し、特に突然変異を修復し、又はゲノム由来配列若しくはウイルスによっ
て導入された配列を抹消する。本発明により修復することができる突然変異は、特に点突
然変異、フレームシフト突然変異、欠失、及び挿入を含む。
組換えベースのゲノム編集の解決策を提供する。この方法を用いると、特にヒト疾患を引
き起こす遺伝的突然変異を置換し、又は所定の遺伝物質を細胞から抹消するDNA組換え酵
素を作製することが可能になる。従って、本発明のDNA組換え酵素を使用して、ヌクレオ
チド配列を改変し、特に突然変異を修復し、又はゲノム由来配列若しくはウイルスによっ
て導入された配列を抹消する。本発明により修復することができる突然変異は、特に点突
然変異、フレームシフト突然変異、欠失、及び挿入を含む。
DNA組換え酵素は宿主細胞のゲノム、宿主臓器、又は宿主生物、又はウイルスのような
病原体のゲノムさえも含む、ゲノム中に天然に出現する標的配列を使用することができる
点で有利である。本発明の利点は、宿主DNA修復経路を引き入れることなくDNAの正確な部
位指定的改変を可能とし、それによりランダムな挿入及び欠失(挿入欠失)を誘導するこ
となく機能することである。
病原体のゲノムさえも含む、ゲノム中に天然に出現する標的配列を使用することができる
点で有利である。本発明の利点は、宿主DNA修復経路を引き入れることなくDNAの正確な部
位指定的改変を可能とし、それによりランダムな挿入及び欠失(挿入欠失)を誘導するこ
となく機能することである。
従ってまた、本発明は同一でない天然に出現する標的部位に対して部位特異的組換えを
誘導することによって、ゲノムを改変する方法を含む。方法は、タンパク質自体を送達す
るか、又はそれをコードするヌクレオチド配列を導入し、mRNA又はDNAの鋳型からこれを
発現させることにより、宿主中に本発明のDNA組換え酵素を送達することを含む。
誘導することによって、ゲノムを改変する方法を含む。方法は、タンパク質自体を送達す
るか、又はそれをコードするヌクレオチド配列を導入し、mRNA又はDNAの鋳型からこれを
発現させることにより、宿主中に本発明のDNA組換え酵素を送達することを含む。
先に定義した「天然に出現する」とは、標的部位が人為的に導入されず―同じゲノム中
にネイティブに存在することを意味する。
にネイティブに存在することを意味する。
好適な宿主細胞は、特に造血幹細胞、神経幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、胎児性幹細胞
、臍帯幹細胞、誘導性複能性幹細胞、及び胚性幹細胞のような幹細胞を含む真核生物細胞
である。ヒト胚性幹の場合、好ましくは胚を破壊したものに由来しない細胞が存在する。
さらに、宿主細胞でのヒト生殖細胞系列及びヒト配偶子の改変は、好ましくは除外される
。
、臍帯幹細胞、誘導性複能性幹細胞、及び胚性幹細胞のような幹細胞を含む真核生物細胞
である。ヒト胚性幹の場合、好ましくは胚を破壊したものに由来しない細胞が存在する。
さらに、宿主細胞でのヒト生殖細胞系列及びヒト配偶子の改変は、好ましくは除外される
。
本発明のDNA組換え酵素の送達に好適な宿主臓器は、骨髄、皮膚、筋肉、肝臓、肺、リ
ンパ節、及び脾臓を含む体内の任意の細胞を含む。
ンパ節、及び脾臓を含む体内の任意の細胞を含む。
本発明の方法により、インビトロ(生きた生物の体外)又はインビボで実施することが
できる。インビトロには、単離した細胞及び/又は臓器の操作を含む。
できる。インビトロには、単離した細胞及び/又は臓器の操作を含む。
一態様において、本発明は先に記載の通り、ゲノム中で対象とする配列を置換、又は欠
失させる方法を提供する。
失させる方法を提供する。
一態様において本発明は、対象とする配列(例えば、遺伝子又はエキソン)をノックア
ウトし、又は改変配列(例えば、導入遺伝子)を有する細胞又は(好ましくは非ヒト)多
細胞生物を作製するための、本発明のDNA組換え酵素の(好ましくは、非治療的)使用に
関する。
ウトし、又は改変配列(例えば、導入遺伝子)を有する細胞又は(好ましくは非ヒト)多
細胞生物を作製するための、本発明のDNA組換え酵素の(好ましくは、非治療的)使用に
関する。
この方法において、本発明のDNA組換え酵素又は本発明の酵素をコードする遺伝子(単
量体1つ当たり1つの遺伝子)を送達方法により細胞又は生物に導入する。
量体1つ当たり1つの遺伝子)を送達方法により細胞又は生物に導入する。
本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、ゲノム中の対象とする配列を縁取る2つの同一で
ない標的部位での部位特異的組換えを誘導する。
ない標的部位での部位特異的組換えを誘導する。
対象とする配列(例えば、挿入配列又はウイルス配列)を欠失させるための部位特異的
組換え(DRiGD)を誘導することによって、ゲノムを改変するためには、追加のDNA又はRN
Aを要さない。
組換え(DRiGD)を誘導することによって、ゲノムを改変するためには、追加のDNA又はRN
Aを要さない。
対象とする配列(例えば、点突然変異)を置換するための部位特異的組換え(DRiGR)
を誘導することによって、ゲノムを改変するためには、本発明のDNA組換え酵素に加え、
所望の配列(ドナーDNA)を含む合成配列を宿主にさらに導入する。合成配列は、対象と
する配列と置換する所望の配列(ドナーDNA)を含み、ここで所望の配列は本発明のDNA組
換え酵素によって認識される第1の標的部位及び第2の標的部位に隣接する。
を誘導することによって、ゲノムを改変するためには、本発明のDNA組換え酵素に加え、
所望の配列(ドナーDNA)を含む合成配列を宿主にさらに導入する。合成配列は、対象と
する配列と置換する所望の配列(ドナーDNA)を含み、ここで所望の配列は本発明のDNA組
換え酵素によって認識される第1の標的部位及び第2の標的部位に隣接する。
別の態様において、本発明は生化学シグナル伝達経路関連遺伝子及びポリヌクレオチド
から選択される突然変異した、若しくは改変された疾患関連遺伝子若しくはポリヌクレオ
チド、又は突然変異した、若しくは改変された配列を含む真核生物細胞モデルを作製する
方法を提供する。これらの遺伝子及びポリヌクレオチドの例は、以下の表A~Cに列記する
。
から選択される突然変異した、若しくは改変された疾患関連遺伝子若しくはポリヌクレオ
チド、又は突然変異した、若しくは改変された配列を含む真核生物細胞モデルを作製する
方法を提供する。これらの遺伝子及びポリヌクレオチドの例は、以下の表A~Cに列記する
。
本発明のもう1つの適用は、特に突然変異を導入し、又は好ましくはヒト疾患に対応す
る特定の突然変異を有し、かつ/若しくはヒト化配列を有するヌクレオチド配列を導入し
若しくは置換することによって、ゲノム中の対象とする配列を特異的に改変すること、例
えば真核生物細胞モデル又は動物モデルを作製することである。この方法を用いると、ラ
ンダムな挿入及び欠失(挿入欠失)又は他の望まない遺伝物質の制御の効かない改変を誘
導することなく動物モデルを目的としてこれを作製することが可能となる点で有利である
。いくつかの実施態様において、導入された突然変異は疾患を有し、又は発症するリスク
の増加と関連付けられる。
る特定の突然変異を有し、かつ/若しくはヒト化配列を有するヌクレオチド配列を導入し
若しくは置換することによって、ゲノム中の対象とする配列を特異的に改変すること、例
えば真核生物細胞モデル又は動物モデルを作製することである。この方法を用いると、ラ
ンダムな挿入及び欠失(挿入欠失)又は他の望まない遺伝物質の制御の効かない改変を誘
導することなく動物モデルを目的としてこれを作製することが可能となる点で有利である
。いくつかの実施態様において、導入された突然変異は疾患を有し、又は発症するリスク
の増加と関連付けられる。
好ましい実施態様において、本発明の方法を使用して、生物医学研究に有用な動物モデ
ル、例えばヒト疾患のモデルを作製する。本発明を動物において実施する場合、好ましく
は動物の非治療的使用のために実施する。
ル、例えばヒト疾患のモデルを作製する。本発明を動物において実施する場合、好ましく
は動物の非治療的使用のために実施する。
好適な宿主生物には、無脊椎動物及び脊椎動物、特にウシ科(Bovidae)、キイロショ
ウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、線虫(Caenorhabditis elegans)、アフリ
カツメガエル(Xenopus laevis)、メダカ、ゼブラフィッシュ、ハツカネズミ(Mus musc
ulus)、ドブネズミ(ratus norvegicus)、又はこれらの生物の胚がある。
ウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、線虫(Caenorhabditis elegans)、アフリ
カツメガエル(Xenopus laevis)、メダカ、ゼブラフィッシュ、ハツカネズミ(Mus musc
ulus)、ドブネズミ(ratus norvegicus)、又はこれらの生物の胚がある。
しかしながら、植物及び真菌並びにそれらの細胞も、宿主として使用することができる
。
。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の1以上のベクターを使用して、非ヒト
トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物を生産する。いくつかの実施態様に
おいて、トランスジェニック動物は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、又はウサギであ
る。ある実施態様において、生物又は対象は、植物である。ある実施態様において、生物
又は対象又は植物は、藻類である。トランスジェニック植物及び動物を生産するための方
法は当技術分野で公知であり、一般的に細胞トランスフェクションの方法を用いて開始す
る。トランスジェニック植物、特に穀物及び藻類と同様に、トランスジェニック動物も提
供する。トランスジェニック動物又は植物は、疾患モデルの提供以外の適用において有用
となり得る。これらは、例えば野生型に通常見られるよりも高いタンパク質の発現、糖類
、栄養分、又はビタミンのレベルを通じた食物又は食餌の生産を含み得る。この観点では
、トランスジェニック植物、特に豆類及びジャガイモ、並びに動物、特に家畜などの哺乳
動物(ウシ、ヒツジ、ヤギ、及びブタ)に加え、家禽及び食用昆虫が好ましい。
トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物を生産する。いくつかの実施態様に
おいて、トランスジェニック動物は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、又はウサギであ
る。ある実施態様において、生物又は対象は、植物である。ある実施態様において、生物
又は対象又は植物は、藻類である。トランスジェニック植物及び動物を生産するための方
法は当技術分野で公知であり、一般的に細胞トランスフェクションの方法を用いて開始す
る。トランスジェニック植物、特に穀物及び藻類と同様に、トランスジェニック動物も提
供する。トランスジェニック動物又は植物は、疾患モデルの提供以外の適用において有用
となり得る。これらは、例えば野生型に通常見られるよりも高いタンパク質の発現、糖類
、栄養分、又はビタミンのレベルを通じた食物又は食餌の生産を含み得る。この観点では
、トランスジェニック植物、特に豆類及びジャガイモ、並びに動物、特に家畜などの哺乳
動物(ウシ、ヒツジ、ヤギ、及びブタ)に加え、家禽及び食用昆虫が好ましい。
DNA組換え酵素の宿主への導入及び発現のために、送達ベクターを使用することができ
、あるいは他の送達方法、例えばDNA、mRNA、又はリポソーム若しくはナノ粒子中に封入
されたタンパク質(例えば、Wang Mらの文献、(2016))に記載されている)、又はエクス
ビボでのエレクトロポレーション、又は細胞圧搾物も適用可能である。
、あるいは他の送達方法、例えばDNA、mRNA、又はリポソーム若しくはナノ粒子中に封入
されたタンパク質(例えば、Wang Mらの文献、(2016))に記載されている)、又はエクス
ビボでのエレクトロポレーション、又は細胞圧搾物も適用可能である。
使用する送達方法は、対象とする配列を改変したい宿主、宿主細胞、又は宿主中の標的
組織に応じて決まる。
組織に応じて決まる。
また、使用する送達ベクターの選択は、対象とする配列を改変したい宿主、宿主細胞、
又は宿主中の標的組織に応じて決まる。好適な送達ベクターは当業者に公知であり、プラ
スミド、人工染色体、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、スプマウイル
スベクター、及びアデノウイルスベクターに加え、シャトルベクターを保有するアグロバ
クテリウムがある。また、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルス、並びにこれらのベク
ターの型(特に、アデノ随伴ウイルスベクター)を含む送達ベクターを選択して、特定の
種類の細胞又は組織に標的化することができる点で有利である。
又は宿主中の標的組織に応じて決まる。好適な送達ベクターは当業者に公知であり、プラ
スミド、人工染色体、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、スプマウイル
スベクター、及びアデノウイルスベクターに加え、シャトルベクターを保有するアグロバ
クテリウムがある。また、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルス、並びにこれらのベク
ターの型(特に、アデノ随伴ウイルスベクター)を含む送達ベクターを選択して、特定の
種類の細胞又は組織に標的化することができる点で有利である。
送達ベクターは、好ましくは調節エレメントを含む。「調節エレメント」という用語は
、プロモーター、エンハンサ―、内部リボソーム進入部位(IRES)、及び他の発現制御エ
レメント(例えば、転写終結シグナル、例えばポリアデニル化シグナル及びポリU配列)
を含むことを意図する。いくつかの実施態様において、調節エレメントは細胞、細菌、ウ
イルス、又はハイブリッドプロモーターであり、ここで該プロモーターは好ましくは構成
的又は誘導性プロモーターである。また、プロモーターは好ましくは宿主、宿主細胞、又
は宿主中の標的組織に応じて選択する。また、好適なプロモーターは当業者に公知である
。好ましい構成的プロモーターは、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス、マウス
白血病ウイルス関連レトロウイルス、ホスホグリセロキナーゼ遺伝子、マウス脾臓フォー
カス形成ウイルス、又はヒト伸長因子1αのプロモーターから選択する。
、プロモーター、エンハンサ―、内部リボソーム進入部位(IRES)、及び他の発現制御エ
レメント(例えば、転写終結シグナル、例えばポリアデニル化シグナル及びポリU配列)
を含むことを意図する。いくつかの実施態様において、調節エレメントは細胞、細菌、ウ
イルス、又はハイブリッドプロモーターであり、ここで該プロモーターは好ましくは構成
的又は誘導性プロモーターである。また、プロモーターは好ましくは宿主、宿主細胞、又
は宿主中の標的組織に応じて選択する。また、好適なプロモーターは当業者に公知である
。好ましい構成的プロモーターは、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス、マウス
白血病ウイルス関連レトロウイルス、ホスホグリセロキナーゼ遺伝子、マウス脾臓フォー
カス形成ウイルス、又はヒト伸長因子1αのプロモーターから選択する。
また、対象とする配列の置換(DRiGR)のために、送達ベクターは好ましくは本発明の
デザイナーDNA組換え酵素によって認識される2つの同一でない標的部位を含むドナー配列
を含み、ここで標的部位は対象とする配列と置換する所望の配列(ドナーDNA)を縁取り
、ここで所望の配列は第1の標的部位及び第2の標的部位に隣接する。
デザイナーDNA組換え酵素によって認識される2つの同一でない標的部位を含むドナー配列
を含み、ここで標的部位は対象とする配列と置換する所望の配列(ドナーDNA)を縁取り
、ここで所望の配列は第1の標的部位及び第2の標的部位に隣接する。
あるいは、ドナー配列は分離した核酸分子又はベクター(例えば、複製欠損プラスミド
)上に提供する。
)上に提供する。
また、本発明は本発明のデザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸又はベクターを含
む。好ましい施態様において、本発明のデザイナーDNA組換え酵素の単量体をコードする
核酸は、1つの核酸分子又は1つのベクターである。好ましくはデザイナーDNA組換え酵素
の単量体は、1つのプロモーター又は他の調節エレメントの制御下で発現させる。
む。好ましい施態様において、本発明のデザイナーDNA組換え酵素の単量体をコードする
核酸は、1つの核酸分子又は1つのベクターである。好ましくはデザイナーDNA組換え酵素
の単量体は、1つのプロモーター又は他の調節エレメントの制御下で発現させる。
また、本発明は:
1. 本発明のデザイナーDNA組換え酵素をコードする先に記載の発現ベクター又は送達ベク
ター(ここで、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、ゲノム中で対象とする配列を縁取
る2つの同一でない標的部位で、部位特異的組換えを誘導する)
2. 対象とする配列と置換する所望の配列(ドナーDNA)を縁取る同じ2つの同一でない標
的部位を含むドナー配列である、ヌクレオチド配列(ここで、所望の配列は第1の標的部
位及び第2の標的部位に隣接する)、及びDNA組換え酵素の発現、を有する細胞に形質導入
するための方法を含む。
1. 本発明のデザイナーDNA組換え酵素をコードする先に記載の発現ベクター又は送達ベク
ター(ここで、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、ゲノム中で対象とする配列を縁取
る2つの同一でない標的部位で、部位特異的組換えを誘導する)
2. 対象とする配列と置換する所望の配列(ドナーDNA)を縁取る同じ2つの同一でない標
的部位を含むドナー配列である、ヌクレオチド配列(ここで、所望の配列は第1の標的部
位及び第2の標的部位に隣接する)、及びDNA組換え酵素の発現、を有する細胞に形質導入
するための方法を含む。
ドナー配列は発現ベクター若しくは送達ベクターに配置することができ、又は分離した
核酸、好ましくは複製欠損プラスミドとして提供する。好ましくはドナー配列を細胞当た
り複数のコピーで提供し、標的配列の置換率を増加させる(図3も参照されたい)。
核酸、好ましくは複製欠損プラスミドとして提供する。好ましくはドナー配列を細胞当た
り複数のコピーで提供し、標的配列の置換率を増加させる(図3も参照されたい)。
さらなる態様において、本発明は:
i) 本発明のデザイナーDNA組換え酵素、又は本発明のデザイナーDNA組換え酵素をコー
ドする核酸若しくはベクター(ここで、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、ゲノム中
で対象とする配列を縁取る2つの同一でない標的部位で、部位特異的組換えを誘導する)
ii) 対象とする配列と置換する所望の配列(ドナーDNA)を縁取る同じ2つの同一でない
標的部位を含むドナー配列である、ヌクレオチド配列(ここで、所望の配列は第1の標的
部位及び第2の標的部位に隣接する)、を含むセット又はキットに関する。好ましくはド
ナー配列を細胞当たり複数のコピーで提供し、標的配列の置換率を増加させる(図3も参
照されたい)。
i) 本発明のデザイナーDNA組換え酵素、又は本発明のデザイナーDNA組換え酵素をコー
ドする核酸若しくはベクター(ここで、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、ゲノム中
で対象とする配列を縁取る2つの同一でない標的部位で、部位特異的組換えを誘導する)
ii) 対象とする配列と置換する所望の配列(ドナーDNA)を縁取る同じ2つの同一でない
標的部位を含むドナー配列である、ヌクレオチド配列(ここで、所望の配列は第1の標的
部位及び第2の標的部位に隣接する)、を含むセット又はキットに関する。好ましくはド
ナー配列を細胞当たり複数のコピーで提供し、標的配列の置換率を増加させる(図3も参
照されたい)。
ここでも、ドナー配列は(本発明のデザイナーDNA組換え酵素をコードする)同じベク
ターに配置され、又は分離した核酸、好ましくは複製欠損プラスミドとして提供する。
ターに配置され、又は分離した核酸、好ましくは複製欠損プラスミドとして提供する。
一般的に、本発明の置換(DRiGR)については、ドナー配列上の所望の配列は、好まし
くは対象とする配列に対応する配列であるが、ここで突然変異は野生型配列(遺伝子若し
くはエキソンのようなその部分)又はその機能的バリアント(例えば、サイレント突然変
異若しくは活性を増加させる突然変異)によって置換される。
くは対象とする配列に対応する配列であるが、ここで突然変異は野生型配列(遺伝子若し
くはエキソンのようなその部分)又はその機能的バリアント(例えば、サイレント突然変
異若しくは活性を増加させる突然変異)によって置換される。
本発明のさらに重要な部分は、本発明のDNA組換え酵素、本発明の核酸若しくはベクタ
ー、又は本発明のセット/キットの医学的応用性である。
ー、又は本発明のセット/キットの医学的応用性である。
医学的応用性について、対象とする配列は、疾患を治療するように改変され、又は少な
くとも症状を軽減し、若しくは寿命を延長させる「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチ
ドである。
くとも症状を軽減し、若しくは寿命を延長させる「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチ
ドである。
一態様において、本発明はインビトロ方法に関する。この方法において、本発明は先に
記載の単離された細胞又は臓器に適用する。
記載の単離された細胞又は臓器に適用する。
別の態様において、本発明は、対象、好ましくはヒト又は動物の治療方法であって、本
発明のDNA組換え酵素、本発明のデザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸若しくはベク
ター、又は本発明のセットを適用する工程を含む、前記方法に関する。
発明のDNA組換え酵素、本発明のデザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸若しくはベク
ター、又は本発明のセットを適用する工程を含む、前記方法に関する。
送達方法及びベクターは、好ましくは先に記載の通り選択する。
一実施態様において、治療すべき対象は、対象を疾患に罹患させるヌクレオチド配列(
対象とする配列)、特に遺伝子産物の機能の低下又は機能の喪失を引き起こす突然変異、
例えば血友病を引き起こす第IX因子遺伝子中の突然変異を保有する。本発明のDNA組換え
酵素、それをコードする核酸又はベクター、及び遺伝子の野生型又は他の機能的バリアン
トである所望の配列を担持するドナー配列(又はエキソンのようなその部分)の送達によ
り、遺伝子の突然変異した部分を所望の(機能的)配列によって置換する。部位特異的組
換えを可能にするために、ドナー配列中の所望の配列をDNA組換え酵素の標的部位によっ
て隣接させる。
対象とする配列)、特に遺伝子産物の機能の低下又は機能の喪失を引き起こす突然変異、
例えば血友病を引き起こす第IX因子遺伝子中の突然変異を保有する。本発明のDNA組換え
酵素、それをコードする核酸又はベクター、及び遺伝子の野生型又は他の機能的バリアン
トである所望の配列を担持するドナー配列(又はエキソンのようなその部分)の送達によ
り、遺伝子の突然変異した部分を所望の(機能的)配列によって置換する。部位特異的組
換えを可能にするために、ドナー配列中の所望の配列をDNA組換え酵素の標的部位によっ
て隣接させる。
別の実施態様において、治療すべき対象は、疾患を引き起こすヌクレオチド配列(対象
とする配列)を保有し、阻害によりその症状が低減する。ここで、対象とする配列は、本
発明の方法を適用し、本発明のDNA組換え酵素、それをコードする核酸、又はベクターを
送達することにより、欠失する。ここで、対象とする配列は、特に病原体(細菌、ウイル
ス、又は寄生虫のような微生物)又は癌遺伝子又は別の遺伝子の配列であり、ここでその
活性は疾患を引き起こし、又は(例えばPCSK9をコードする遺伝子のような)その遺伝子
活性の阻害は、症状を低減させることが知られている。
とする配列)を保有し、阻害によりその症状が低減する。ここで、対象とする配列は、本
発明の方法を適用し、本発明のDNA組換え酵素、それをコードする核酸、又はベクターを
送達することにより、欠失する。ここで、対象とする配列は、特に病原体(細菌、ウイル
ス、又は寄生虫のような微生物)又は癌遺伝子又は別の遺伝子の配列であり、ここでその
活性は疾患を引き起こし、又は(例えばPCSK9をコードする遺伝子のような)その遺伝子
活性の阻害は、症状を低減させることが知られている。
さらに本発明は本発明のDNA組換え酵素、本発明のデザイナーDNA組換え酵素をコードす
る核酸若しくはベクター、又は本発明のセット並びに好適な担体を含む医薬組成物を含む
。
る核酸若しくはベクター、又は本発明のセット並びに好適な担体を含む医薬組成物を含む
。
本発明によるDNA組換え酵素によって標的化される対象とする配列は、真核生物細胞に
とって内因の又は外因の任意のポリヌクレオチドとすることができる。例えば、対象とす
る配列は、核、又は真核生物細胞のミトコンドリア、又は宿主細胞のゲノムに統合された
か否かによらず、ウイルスの内にあるポリヌクレオチドとすることができる。対象とする
配列は、遺伝子産物(例えば、タンパク質)をコードする配列又は非コード配列(例えば
、イントロン又は調節ポリヌクレオチド)とすることができる。
とって内因の又は外因の任意のポリヌクレオチドとすることができる。例えば、対象とす
る配列は、核、又は真核生物細胞のミトコンドリア、又は宿主細胞のゲノムに統合された
か否かによらず、ウイルスの内にあるポリヌクレオチドとすることができる。対象とする
配列は、遺伝子産物(例えば、タンパク質)をコードする配列又は非コード配列(例えば
、イントロン又は調節ポリヌクレオチド)とすることができる。
本発明のDNA組換え酵素によって標的化される対象とする配列は、多数の疾患関連遺伝
子及びポリヌクレオチド並びに生化学シグナル伝達経路関連遺伝子及びポリヌクレオチド
を含み得る。
子及びポリヌクレオチド並びに生化学シグナル伝達経路関連遺伝子及びポリヌクレオチド
を含み得る。
「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、疾患に罹患した組織由来の細胞におい
て非疾患対照の組織又は細胞と比較して、転写産物又は翻訳産物を異常なレベルで、又は
異常な形態で生産する任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。疾患関連遺伝子は、異
常に高レベルで発現する遺伝子であり得る;疾患関連遺伝子は、異常に低レベルの発現状
態になる遺伝子であり得る。ここで、発現の変化は疾患の発生及び/又は進行と相関する
。また、疾患関連遺伝子は、突然変異(複数可)又は疾患の病因となる遺伝子(複数可)
に直接寄与し、又はこれと連鎖不平衡にある遺伝的変動を有する遺伝子を指す。転写産物
又は翻訳産物は、公知であっても公知でなくてもよく、そのレベルは正常であっても異常
であってもよい。疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例は、McKusick-Nathans遺伝医
学研究所(Institute of Genetic Medicine)、Johns Hopkins大学(Baltimore, Md.)及
び国立生物技術情報センター(National Center for Biotechnology Information)、国
立医学図書館(National Library of Medicine)(Bethesda, Md.)から入手可能であり
、これらはワールドワイドウェブで利用可能である。
て非疾患対照の組織又は細胞と比較して、転写産物又は翻訳産物を異常なレベルで、又は
異常な形態で生産する任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。疾患関連遺伝子は、異
常に高レベルで発現する遺伝子であり得る;疾患関連遺伝子は、異常に低レベルの発現状
態になる遺伝子であり得る。ここで、発現の変化は疾患の発生及び/又は進行と相関する
。また、疾患関連遺伝子は、突然変異(複数可)又は疾患の病因となる遺伝子(複数可)
に直接寄与し、又はこれと連鎖不平衡にある遺伝的変動を有する遺伝子を指す。転写産物
又は翻訳産物は、公知であっても公知でなくてもよく、そのレベルは正常であっても異常
であってもよい。疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例は、McKusick-Nathans遺伝医
学研究所(Institute of Genetic Medicine)、Johns Hopkins大学(Baltimore, Md.)及
び国立生物技術情報センター(National Center for Biotechnology Information)、国
立医学図書館(National Library of Medicine)(Bethesda, Md.)から入手可能であり
、これらはワールドワイドウェブで利用可能である。
本発明のDNA組換え酵素によって標的化される対象とする配列は、多数の疾患関連遺伝
子及びポリヌクレオチド並びに生化学シグナル伝達経路関連遺伝子及びその内容の全体が
参照により本明細書に組み込まれている米国特許US8697359 B1に列記されているポリヌク
レオチドを含み得る。
子及びポリヌクレオチド並びに生化学シグナル伝達経路関連遺伝子及びその内容の全体が
参照により本明細書に組み込まれている米国特許US8697359 B1に列記されているポリヌク
レオチドを含み得る。
疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例は、表A及びBに列記されている。疾患の具体
的な情報は、McKusick-Nathans遺伝医学研究所、Johns Hopkins大学(Baltimore, Md.)
及び国立生物技術情報センター、国立医学図書館(Bethesda, Md.)から入手可能であり
、これらはワールドワイドウェブで利用可能である。生化学シグナル伝達経路関連遺伝子
及びポリヌクレオチドの例は、表Cに列記されている。
的な情報は、McKusick-Nathans遺伝医学研究所、Johns Hopkins大学(Baltimore, Md.)
及び国立生物技術情報センター、国立医学図書館(Bethesda, Md.)から入手可能であり
、これらはワールドワイドウェブで利用可能である。生化学シグナル伝達経路関連遺伝子
及びポリヌクレオチドの例は、表Cに列記されている。
これらの遺伝子の突然変異及び経路は、機能に影響を及ぼす異常なタンパク質又は異常
な量のタンパク質の生産をもたらし得る。遺伝子のさらなる例において、疾患及びタンパ
ク質は、米国仮出願からの参照により本明細書に組み込まれている。そのような遺伝子、
タンパク質、及び経路は、本発明のDNA組換え酵素の標的となる対象とする配列とし得る
。
な量のタンパク質の生産をもたらし得る。遺伝子のさらなる例において、疾患及びタンパ
ク質は、米国仮出願からの参照により本明細書に組み込まれている。そのような遺伝子、
タンパク質、及び経路は、本発明のDNA組換え酵素の標的となる対象とする配列とし得る
。
また、本発明の実施態様は、遺伝子をノックアウトすること、遺伝子を増幅すること、
及び点突然変異、フレームシフト突然変異、欠失、又は挿入を含む特定の突然変異を修復
することに関する方法及び組成物に関する。
及び点突然変異、フレームシフト突然変異、欠失、又は挿入を含む特定の突然変異を修復
することに関する方法及び組成物に関する。
本発明のさらに別の態様において、本発明を使用して、いくつかの遺伝的突然変異から
生じる視覚上の欠陥を修正することができる。
生じる視覚上の欠陥を修正することができる。
本発明のいくつかのさらなる態様は、国立衛生研究所(National Institutes of Healt
h)のウェブサイトで遺伝的疾患のトピック小区分においてさらに記載されている多種多
様な遺伝的疾患に関連する欠陥を修正することに関する(ウェブサイトはhealth.nih.gov
/topic/GeneticDisordersにある)。遺伝的脳疾患には、これらに限定はされないが、副
腎白質ジストロフィー、脳梁の無形成、アイカルディ症候群、アルパース病、アルツハイ
マー病、バース症候群、バッテン病、CADASIL、小脳変性症、ファブリー病、ゲルストマ
ン・シュトロイスラー・シャインカー病、ハンチントン病及び他のトリプレットリピート
病(Triplet Repeat Disorders)、リー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、
メンケス病、ミトコンドリア筋症、及びNINDS脳梁欠損症を含み得る。これらの疾患は、
国立衛生研究所のウェブサイトで遺伝的脳障害の小区分においてさらに記載されている。
h)のウェブサイトで遺伝的疾患のトピック小区分においてさらに記載されている多種多
様な遺伝的疾患に関連する欠陥を修正することに関する(ウェブサイトはhealth.nih.gov
/topic/GeneticDisordersにある)。遺伝的脳疾患には、これらに限定はされないが、副
腎白質ジストロフィー、脳梁の無形成、アイカルディ症候群、アルパース病、アルツハイ
マー病、バース症候群、バッテン病、CADASIL、小脳変性症、ファブリー病、ゲルストマ
ン・シュトロイスラー・シャインカー病、ハンチントン病及び他のトリプレットリピート
病(Triplet Repeat Disorders)、リー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、
メンケス病、ミトコンドリア筋症、及びNINDS脳梁欠損症を含み得る。これらの疾患は、
国立衛生研究所のウェブサイトで遺伝的脳障害の小区分においてさらに記載されている。
いくつかの実施態様において、状態は新生物であり得る。状態が新生物であるいくつか
の実施態様において、標的とすべき遺伝子は、表Aに列記された遺伝子のいずれかである
(この場合、PTENなどである)。いくつかの実施態様において、状態は加齢性黄斑変性で
あり得る。いくつかの実施態様において、状態は 統合失調症であり得る。いくつかの実
施態様において、状態はトリプレットリピート病(Trinucleotide Repeat Disorder)で
あり得る。いくつかの実施態様において、状態は脆弱X染色体症候群であり得る。いくつ
かの実施態様において、状態はセクレターゼ関連障害であり得る。いくつかの実施態様に
おいて、状態はプリオン関連障害であり得る。いくつかの実施態様において、状態はALS
であり得る。いくつかの実施態様において、状態は薬物中毒であり得る。いくつかの実施
態様において、状態は自閉症であり得る。いくつかの実施態様において、状態はアルツハ
イマー病であり得る。いくつかの実施態様において、状態は炎症であり得る。いくつかの
実施態様において、状態はパーキンソン病であり得る。
の実施態様において、標的とすべき遺伝子は、表Aに列記された遺伝子のいずれかである
(この場合、PTENなどである)。いくつかの実施態様において、状態は加齢性黄斑変性で
あり得る。いくつかの実施態様において、状態は 統合失調症であり得る。いくつかの実
施態様において、状態はトリプレットリピート病(Trinucleotide Repeat Disorder)で
あり得る。いくつかの実施態様において、状態は脆弱X染色体症候群であり得る。いくつ
かの実施態様において、状態はセクレターゼ関連障害であり得る。いくつかの実施態様に
おいて、状態はプリオン関連障害であり得る。いくつかの実施態様において、状態はALS
であり得る。いくつかの実施態様において、状態は薬物中毒であり得る。いくつかの実施
態様において、状態は自閉症であり得る。いくつかの実施態様において、状態はアルツハ
イマー病であり得る。いくつかの実施態様において、状態は炎症であり得る。いくつかの
実施態様において、状態はパーキンソン病であり得る。
パーキンソン病と関連するタンパク質の例には、これらに限定はされないが、α-シヌ
クレイン、DJ-1 、LRRK2、PINK1 、パーキン、UCHL1 、シンフィリン-1、及びNURR1があ
る。
クレイン、DJ-1 、LRRK2、PINK1 、パーキン、UCHL1 、シンフィリン-1、及びNURR1があ
る。
中毒関連タンパク質の例には、例えばABATがあり得る。
炎症関連タンパク質の例には、例えばCcr2遺伝子によってコードされる単球走化性タン
パク質-1(MCP1)、Ccr5遺伝子によってコードされるC-Cケモカイン受容体5型(CCR5)、
Fcgr2b遺伝子によってコードされるIgG受容体IIB(FCGR2b、別名CD32)、Fcer1g によっ
てコードされるFcεR1g(FCER1g)タンパク質があり得る。
パク質-1(MCP1)、Ccr5遺伝子によってコードされるC-Cケモカイン受容体5型(CCR5)、
Fcgr2b遺伝子によってコードされるIgG受容体IIB(FCGR2b、別名CD32)、Fcer1g によっ
てコードされるFcεR1g(FCER1g)タンパク質があり得る。
心血管疾患関連タンパク質の例には、例えば IL1B(インターロイキン1、β)、XDH(
キサンチンデヒドロゲナーゼ)、TP53(腫瘍タンパク質p53)、PTGIS(プロスタグランジ
ン12(プロスタサイクリン)シンターゼ)、MB(ミオグロビン)、IL4(インターロイキ
ン4)、ANGPT1(アンジオタンパク質1)、ABCG8(ATP-結合カセット、サブファミリーG(
WHITE)、メンバー8)、又はCTSK(カテプシンK)があり得る。
キサンチンデヒドロゲナーゼ)、TP53(腫瘍タンパク質p53)、PTGIS(プロスタグランジ
ン12(プロスタサイクリン)シンターゼ)、MB(ミオグロビン)、IL4(インターロイキ
ン4)、ANGPT1(アンジオタンパク質1)、ABCG8(ATP-結合カセット、サブファミリーG(
WHITE)、メンバー8)、又はCTSK(カテプシンK)があり得る。
アルツハイマー病関連タンパク質の例には、例えばVLDLR遺伝子によってコードされる
超低密度リポタンパク質受容体タンパク質(VLDLR)、UBA1遺伝子によってコードされる
ユビキチン様修飾因子活性化酵素1(UBA1)、又はUBA3遺伝子によってコードされるNEDD8
-活性化酵素E1触媒サブユニットタンパク質(UBE1C)があり得る。
超低密度リポタンパク質受容体タンパク質(VLDLR)、UBA1遺伝子によってコードされる
ユビキチン様修飾因子活性化酵素1(UBA1)、又はUBA3遺伝子によってコードされるNEDD8
-活性化酵素E1触媒サブユニットタンパク質(UBE1C)があり得る。
自閉症スペクトラム障害に関連するタンパク質の例には、例えばBZRAP1遺伝子によって
コードされるベンゾジアゼピン受容体(末梢)関連タンパク質(BZRAP1)、AFF2遺伝子に
よってコードされるAF4/FMR2ファミリーメンバー2タンパク質(AFF2)(別名MFR2)、FXR
1遺伝子によってコードされる脆弱X精神遅滞常染色体性ホモログ1タンパク質(FXR1)、
又はFXR2遺伝子によってコードされる脆弱X精神遅滞常染色体性ホモログ2タンパク質(FX
R2)があり得る。
コードされるベンゾジアゼピン受容体(末梢)関連タンパク質(BZRAP1)、AFF2遺伝子に
よってコードされるAF4/FMR2ファミリーメンバー2タンパク質(AFF2)(別名MFR2)、FXR
1遺伝子によってコードされる脆弱X精神遅滞常染色体性ホモログ1タンパク質(FXR1)、
又はFXR2遺伝子によってコードされる脆弱X精神遅滞常染色体性ホモログ2タンパク質(FX
R2)があり得る。
黄斑変性症に関連するタンパク質の例には、例えばABCR遺伝子によってコードされるAT
P結合カセット、サブファミリーA(ABC1)メンバー4タンパク質(ABCA4)、APOE遺伝子に
よってコードされるアポリポタンパク質Eタンパク質(APOE)、又はCCL2遺伝子によって
コードされるケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド2タンパク質(CCL2)があり得る。
P結合カセット、サブファミリーA(ABC1)メンバー4タンパク質(ABCA4)、APOE遺伝子に
よってコードされるアポリポタンパク質Eタンパク質(APOE)、又はCCL2遺伝子によって
コードされるケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド2タンパク質(CCL2)があり得る。
統合失調症に関連するタンパク質の例には、NRG1 、ErbB4、CPLX1 、TPH1 、TPH2、NRX
N1 、GSK3A、BDNF、DISC1 、GSK3B、及びこれらの組合わせがあり得る。
N1 、GSK3A、BDNF、DISC1 、GSK3B、及びこれらの組合わせがあり得る。
腫瘍抑制に関与するタンパク質の例には、例えばATM(毛細血管拡張性運動失調症変異
型)、ATR(毛細血管拡張性運動失調症及びRad3関連)、EGFR(上皮増殖因子受容体)、E
RBB2(v-erb-b2赤芽球性白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ2)、ERBB3(v-erb-b2赤芽球
性白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ3)、ERBB4(v-erb-b2赤芽球性白血病ウイルス性癌
遺伝子ホモログ4)、Notch1、Notch2、Notch 3、又はNotch4があり得る。
型)、ATR(毛細血管拡張性運動失調症及びRad3関連)、EGFR(上皮増殖因子受容体)、E
RBB2(v-erb-b2赤芽球性白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ2)、ERBB3(v-erb-b2赤芽球
性白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ3)、ERBB4(v-erb-b2赤芽球性白血病ウイルス性癌
遺伝子ホモログ4)、Notch1、Notch2、Notch 3、又はNotch4があり得る。
セクレターゼ障害に関連するタンパク質の例には、例えばPSENEN(プレセニリンエンハ
ンサー2ホモログ(線虫(C. elegans))、CTSB(カテプシンB)、PSEN1 (プレセニリン
1)、APP(アミロイドβ(A4)前駆体タンパク質)、APH1B(前咽頭欠陥1ホモログB(線
虫))、PSEN2(プレセニリン2(アルツハイマー病4))、又はBACE1(β-部位APP-切断
酵素1)があり得る。
ンサー2ホモログ(線虫(C. elegans))、CTSB(カテプシンB)、PSEN1 (プレセニリン
1)、APP(アミロイドβ(A4)前駆体タンパク質)、APH1B(前咽頭欠陥1ホモログB(線
虫))、PSEN2(プレセニリン2(アルツハイマー病4))、又はBACE1(β-部位APP-切断
酵素1)があり得る。
筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質の例には、SOD1(スーパーオキシドジスムタ
ーゼ1)、ALS2(筋萎縮性側索硬化症2)、FUS(肉腫内融合)、TARDBP(TAR DNA結合タン
パク質)、VAGFA(血管内皮増殖因子A)、VAGFB(血管内皮増殖因子B)、及びVAGFC(血
管内皮増殖因子C)、並びにこれらの任意の組合わせがあり得る。
ーゼ1)、ALS2(筋萎縮性側索硬化症2)、FUS(肉腫内融合)、TARDBP(TAR DNA結合タン
パク質)、VAGFA(血管内皮増殖因子A)、VAGFB(血管内皮増殖因子B)、及びVAGFC(血
管内皮増殖因子C)、並びにこれらの任意の組合わせがあり得る。
プリオン疾患に関連するタンパク質の例には、SOD1(スーパーオキシドジスムターゼ1
)、ALS2(筋萎縮性側索硬化症2)、FUS(肉腫内融合)、TARDBP(TAR DNA結合タンパク
質)、VAGFA(血管内皮増殖因子A)、VAGFB(血管内皮増殖因子B)、及びVAGFC(血管内
皮増殖因子C)、並びにこれらの任意の組合わせがあり得る。
)、ALS2(筋萎縮性側索硬化症2)、FUS(肉腫内融合)、TARDBP(TAR DNA結合タンパク
質)、VAGFA(血管内皮増殖因子A)、VAGFB(血管内皮増殖因子B)、及びVAGFC(血管内
皮増殖因子C)、並びにこれらの任意の組合わせがあり得る。
プリオン障害における神経変性状態に関するタンパク質の例には、例えばA2M(α-2-マ
クログロブリン)、AATF(アポトーシス拮抗転写調節因子)、ACPP(酸性ホスファターゼ
前立腺型)、ACTA2(アクチンα2大静脈平滑筋型)、ADAM22(ADAMメタロペプチダーゼド
メイン)、ADORA3(アデノシンA3受容体)、又はADRA1D(α-1Dアドレナリン受容体に対
するα-1Dアドレナリン作動性受容体)があり得る。
クログロブリン)、AATF(アポトーシス拮抗転写調節因子)、ACPP(酸性ホスファターゼ
前立腺型)、ACTA2(アクチンα2大静脈平滑筋型)、ADAM22(ADAMメタロペプチダーゼド
メイン)、ADORA3(アデノシンA3受容体)、又はADRA1D(α-1Dアドレナリン受容体に対
するα-1Dアドレナリン作動性受容体)があり得る。
免疫欠損症に関連するタンパク質の例には、例えばA2M [α-2-マクログロブリン]; AAN
AT [アリールアルキルアミンN-アセチルトランスフェラーゼ]; ABCA1 [ATP-結合カセット
、サブファミリーA(ABC1)、メンバー1]; ABCA2 [ATP-結合カセット、サブファミリーA
(ABC1)、メンバー2]; 又はABCA3 [ATP-結合カセット、サブファミリーA(ABC1)、メン
バー3]があり得る。
AT [アリールアルキルアミンN-アセチルトランスフェラーゼ]; ABCA1 [ATP-結合カセット
、サブファミリーA(ABC1)、メンバー1]; ABCA2 [ATP-結合カセット、サブファミリーA
(ABC1)、メンバー2]; 又はABCA3 [ATP-結合カセット、サブファミリーA(ABC1)、メン
バー3]があり得る。
トリプレットリピート病に関連するタンパク質の例には、例えばAR(アンドロゲン受容
体)、FMR1(脆弱X精神遅滞1)、HTT(ハンチンチン)、又はDMPK(筋強直性ジストロフ
ィータンパク質キナーゼ)、FXN(フラタキシン)、ATXN2(アタキシン2)がある。
体)、FMR1(脆弱X精神遅滞1)、HTT(ハンチンチン)、又はDMPK(筋強直性ジストロフ
ィータンパク質キナーゼ)、FXN(フラタキシン)、ATXN2(アタキシン2)がある。
神経伝達障害に関連するタンパク質の例には、例えばSST(ソマトスタチン)、NOS1(
一酸化窒素シンターゼ1(神経型))、ADRA2A(アドレナリン作動性α-2A受容体)、ADRA
2C(アドレナリン作動性α-2C受容体)、TACR1(タキキニン受容体1)、又はHTR2c(5-ヒ
ドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体2C)がある。
一酸化窒素シンターゼ1(神経型))、ADRA2A(アドレナリン作動性α-2A受容体)、ADRA
2C(アドレナリン作動性α-2C受容体)、TACR1(タキキニン受容体1)、又はHTR2c(5-ヒ
ドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体2C)がある。
神経発達関連配列の例には、例えばA2BP1 [アタキシン2-結合タンパク質1], AADAT [ア
ミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ], AANAT [アリールアルキルアミンN-アセチル
トランスフェラーゼ], ABAT [4-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ], ABCA1 [ATP-結
合カセット、サブファミリーA (ABC1)、メンバー1]、又はABCA13 [ATP-結合カセット、サ
ブファミリーA(ABC1)、メンバー13]がある。
ミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ], AANAT [アリールアルキルアミンN-アセチル
トランスフェラーゼ], ABAT [4-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ], ABCA1 [ATP-結
合カセット、サブファミリーA (ABC1)、メンバー1]、又はABCA13 [ATP-結合カセット、サ
ブファミリーA(ABC1)、メンバー13]がある。
本発明により治療可能な好ましい状態のさらなる例は:アイカルディ・グティエール症
候群; アレキサンダー病; アラン・ハーンドン・ダドリー症候群; POLG-関連障害; Alpha
-マンノシドーシス(II型及びIII型); アルストレーム症候群; アンジェルマン症候群;
毛細血管拡張性運動失調症; 神経セロイドリポフスチン症; β-サラセミア; 両側視神経
萎縮症及び(小児性)神経萎縮症1型 ; 網膜芽細胞腫(両側); カナバン病; 脳・眼・顔
・骨格症候群1 [COFS1]; 脳腱黄色腫症; コルネリア・デ・ランゲ症候群; MAPT-関連障害
; 遺伝性プリオン疾患; ドラーベ症候群; 早期発症家族型アルツハイマー病; フリートラ
イヒ運動失調症 [FRDA]; フリンス症候群; フコシドーシス; 福山型先天性筋ジストロフ
ィー;ガラクトシアリドーシス; ゴーシェ病; 器質性酸血症; 血球貪食性リンパ組織球症;
ハッチンソン-ギルフォード早老症候群; ムコリピドーシスII; 小児性遊離シアル酸貯蔵
病; PLA2G6-関連神経変性症; イェルベル・ランゲニールセン症候群; 接合部型表皮水疱
症; ハンチントン病; クラッベ病(小児性); ミトコンドリアDNA-関連リー症候群及びNA
RP; レッシュ・ナイハン症候群; LIS 1 -関連脳回欠損; ロウ症候群; メープルシロップ
尿症; MECP2重複症候群; ATP7A-関連銅輸送障害; LAMA2-関連筋ジストロフィー; アリー
ルスルファターゼA欠損症; ムコ多糖症I型、II型、又はIII型; ペルオキシソーム形成異
常症、ツェルウェーガー症候群スペクトラム; 脳内鉄蓄積障害を伴う神経変性症; 酸性ス
フィンゴミエリナーゼ欠損症; ニーマン・ピック病C型; グリシン脳症; ARX-関連障害;
尿素サイクル異常症; COL1A1/2-関連骨形成不全症; ミトコンドリアDNA欠失症候群; PLP1
-関連障害; ペリー症候群; フェラン-マクダーミド症候群; 糖原病II型(ポンペ病)(小
児性); MAPT-関連障害; MECP2-関連障害; 根性点状軟骨異形成症1型 ; ロバート症候群;
サンドホフ病; シンドラー病1型 ; アデノシンデアミナーゼ欠損症; スミス・レムリ・
オピッツ症候群; 脊髄性筋萎縮症、小児発症型脊髄小脳失調症; ヘキソサミニダーゼA欠
損症; タナトフォリック骨異形成症1型 ; コラーゲンVI型-関連障害; アッシャー症候群I
型; 先天性筋ジストロフィー; ウォルフ・ヒルショルン症候群; リソソーム酸リパーゼ欠
損症; 及び色素性乾皮症から選択され得る。
候群; アレキサンダー病; アラン・ハーンドン・ダドリー症候群; POLG-関連障害; Alpha
-マンノシドーシス(II型及びIII型); アルストレーム症候群; アンジェルマン症候群;
毛細血管拡張性運動失調症; 神経セロイドリポフスチン症; β-サラセミア; 両側視神経
萎縮症及び(小児性)神経萎縮症1型 ; 網膜芽細胞腫(両側); カナバン病; 脳・眼・顔
・骨格症候群1 [COFS1]; 脳腱黄色腫症; コルネリア・デ・ランゲ症候群; MAPT-関連障害
; 遺伝性プリオン疾患; ドラーベ症候群; 早期発症家族型アルツハイマー病; フリートラ
イヒ運動失調症 [FRDA]; フリンス症候群; フコシドーシス; 福山型先天性筋ジストロフ
ィー;ガラクトシアリドーシス; ゴーシェ病; 器質性酸血症; 血球貪食性リンパ組織球症;
ハッチンソン-ギルフォード早老症候群; ムコリピドーシスII; 小児性遊離シアル酸貯蔵
病; PLA2G6-関連神経変性症; イェルベル・ランゲニールセン症候群; 接合部型表皮水疱
症; ハンチントン病; クラッベ病(小児性); ミトコンドリアDNA-関連リー症候群及びNA
RP; レッシュ・ナイハン症候群; LIS 1 -関連脳回欠損; ロウ症候群; メープルシロップ
尿症; MECP2重複症候群; ATP7A-関連銅輸送障害; LAMA2-関連筋ジストロフィー; アリー
ルスルファターゼA欠損症; ムコ多糖症I型、II型、又はIII型; ペルオキシソーム形成異
常症、ツェルウェーガー症候群スペクトラム; 脳内鉄蓄積障害を伴う神経変性症; 酸性ス
フィンゴミエリナーゼ欠損症; ニーマン・ピック病C型; グリシン脳症; ARX-関連障害;
尿素サイクル異常症; COL1A1/2-関連骨形成不全症; ミトコンドリアDNA欠失症候群; PLP1
-関連障害; ペリー症候群; フェラン-マクダーミド症候群; 糖原病II型(ポンペ病)(小
児性); MAPT-関連障害; MECP2-関連障害; 根性点状軟骨異形成症1型 ; ロバート症候群;
サンドホフ病; シンドラー病1型 ; アデノシンデアミナーゼ欠損症; スミス・レムリ・
オピッツ症候群; 脊髄性筋萎縮症、小児発症型脊髄小脳失調症; ヘキソサミニダーゼA欠
損症; タナトフォリック骨異形成症1型 ; コラーゲンVI型-関連障害; アッシャー症候群I
型; 先天性筋ジストロフィー; ウォルフ・ヒルショルン症候群; リソソーム酸リパーゼ欠
損症; 及び色素性乾皮症から選択され得る。
本システムを使用して、対象とする任意のポリヌクレオチド配列を標的化することがで
きることが、想定されることは明らかとなろう。本システムを用いて有益に治療され得る
状態又は疾患のいくつかの例は、先に列記してある。これらの状態と現在関連づけられる
遺伝子の例も、そこに提供する。しかしながら、例示された遺伝子は、網羅するものでは
ない。
きることが、想定されることは明らかとなろう。本システムを用いて有益に治療され得る
状態又は疾患のいくつかの例は、先に列記してある。これらの状態と現在関連づけられる
遺伝子の例も、そこに提供する。しかしながら、例示された遺伝子は、網羅するものでは
ない。
(例F-9:)
DRiGRについての好ましい実施態様において、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、血
友病Bの原因となるF9遺伝子のエキソン8中の突然変異を置換する。エキソン8は重度の形
態の血友病Bにおいて高頻度に突然変異しており、この集団中に出現する突然変異は公知
である(www.factorix.org)。
DRiGRについての好ましい実施態様において、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、血
友病Bの原因となるF9遺伝子のエキソン8中の突然変異を置換する。エキソン8は重度の形
態の血友病Bにおいて高頻度に突然変異しており、この集団中に出現する突然変異は公知
である(www.factorix.org)。
一実施態様において、F9デザイナーDNA組換え酵素は、2つの異なる単量体:配列番号:
1の配列(Rec F9-1)又は配列番号1と少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは95%の
配列同一性を有する配列を有する単量体、及び配列番号:2の配列(Rec F9-2)、又は配
列番号:2と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは9
5%若しくは98%さえもの配列同一性を有する配列を有する単量体を含むヘテロ四量体であ
る。
1の配列(Rec F9-1)又は配列番号1と少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは95%の
配列同一性を有する配列を有する単量体、及び配列番号:2の配列(Rec F9-2)、又は配
列番号:2と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは9
5%若しくは98%さえもの配列同一性を有する配列を有する単量体を含むヘテロ四量体であ
る。
また、本発明の目的は、配列番号:1(Rec F9-1)若しくは配列番号:2(Rec F9-2)の
配列、又は配列番号:1若しくは2と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは90%の配列同
一性、より好ましくは95%若しくは98%さえもの配列同一性を有する配列を含む、デザイナ
ーDNA組換え酵素である。
配列、又は配列番号:1若しくは2と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは90%の配列同
一性、より好ましくは95%若しくは98%さえもの配列同一性を有する配列を含む、デザイナ
ーDNA組換え酵素である。
配列番号:1(Rec F9-1)の配列を有する単量体において、好ましくは以下の位置に以
下のアミノ酸残基を有する:
X17は、任意のアミノ酸であり、好ましくはD又はGである。
X19は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X22は、任意のアミノ酸であり、好ましくはG又はEである。
X30は、小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましくは
V又はAから選択される。
X43は、正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X60は、任意のアミノ酸であり、好ましくはN又はDである。
X68は、任意のアミノ酸であり、好ましくはP又はSである。
X69は正又は負に荷電したアミノ酸であり、好ましくはD、E、K、またはR、より好まし
くはE又はKから選択される
X81は極性アミノ酸であり、好ましくはS、T、C、K、又はR、より好ましくはC又はRから
選択される。
X84は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X89は任意のアミノ酸であり、好ましくはL又はQである。
X93は小さなアミノ酸であり、好ましくはC、S、及びA、より好ましくはC又はAから選択
される。
X140は任意のアミノ酸であり、好ましくはI又はTである。
X166は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X177は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X182は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X183は正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X186は極性アミノ酸であり、好ましくはS又はTである。
X206は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X222は、任意のアミノ酸であり、好ましくはV又はEである。
X225は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X237は極性アミノ酸であり、好ましくはS、T、C、又はY、より好ましくはY又はCから選
択される。
X239は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、V、又はF、より好ましくはF又はIから
選択される。
X249は小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましくはV
又はAから選択される。
X259は任意のアミノ酸であり、好ましくはF又はPである。
X260は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X264は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はDである。
X278は任意のアミノ酸であり、好ましくはL又はQである。
X284は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X318は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はLから選
択される。
X342は任意のアミノ酸であり、好ましくはG又はDである。
下のアミノ酸残基を有する:
X17は、任意のアミノ酸であり、好ましくはD又はGである。
X19は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X22は、任意のアミノ酸であり、好ましくはG又はEである。
X30は、小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましくは
V又はAから選択される。
X43は、正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X60は、任意のアミノ酸であり、好ましくはN又はDである。
X68は、任意のアミノ酸であり、好ましくはP又はSである。
X69は正又は負に荷電したアミノ酸であり、好ましくはD、E、K、またはR、より好まし
くはE又はKから選択される
X81は極性アミノ酸であり、好ましくはS、T、C、K、又はR、より好ましくはC又はRから
選択される。
X84は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X89は任意のアミノ酸であり、好ましくはL又はQである。
X93は小さなアミノ酸であり、好ましくはC、S、及びA、より好ましくはC又はAから選択
される。
X140は任意のアミノ酸であり、好ましくはI又はTである。
X166は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X177は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X182は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X183は正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X186は極性アミノ酸であり、好ましくはS又はTである。
X206は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X222は、任意のアミノ酸であり、好ましくはV又はEである。
X225は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X237は極性アミノ酸であり、好ましくはS、T、C、又はY、より好ましくはY又はCから選
択される。
X239は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、V、又はF、より好ましくはF又はIから
選択される。
X249は小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましくはV
又はAから選択される。
X259は任意のアミノ酸であり、好ましくはF又はPである。
X260は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X264は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はDである。
X278は任意のアミノ酸であり、好ましくはL又はQである。
X284は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X318は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV、より好ましくはI又はLから選
択される。
X342は任意のアミノ酸であり、好ましくはG又はDである。
大文字は、lUPAC命名法の1文字コードを表す。配列番号:1の好ましい配列は、配列番
号:28、配列番号:3、及び配列番号:5の配列、及び配列番号:28、配列番号:3、又は
配列番号:5と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましく
は95%又は98%さえもの配列同一性を有する配列から選択される。
号:28、配列番号:3、及び配列番号:5の配列、及び配列番号:28、配列番号:3、又は
配列番号:5と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましく
は95%又は98%さえもの配列同一性を有する配列から選択される。
配列番号:2(Rec F9-2)の配列を有する単量体において、好ましくは以下の位置に以
下のアミノ酸残基を有する:
X3は任意のアミノ酸であり、好ましくはK又はNである。
X5は任意のアミノ酸であり、好ましくはP又はQである。
X8は任意のアミノ酸であり、好ましくはH又はTである。
X14は、非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV 、より好ましくはI又はLから
選択される。
X16は、小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましくは
V又はAから選択される。
X18は小さなアミノ酸であり、好ましくはA又はGである。
X19は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X20は極性アミノ酸であり、好ましくはS、T、N、又はQ、より好ましくはS又はNから選
択される。
X21は任意のアミノ酸であり、好ましくはD又はGである。
X31は、非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、V、及びF、より好ましくはL又はFか
ら選択される。
X39は正又は負に荷電したアミノ酸であり、好ましくはD、E、K、又はR、より好ましく
はK又はEから選択される
X80は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X84は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X93は、任意のアミノ酸であり、好ましくはC又はAである。
X97は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、V、及びM、より好ましくはL又はMから
選択される。
X125は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X132は正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X182は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X183は正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X186は極性アミノ酸であり、好ましくはT又はSである。
X195は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X206は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X216は、任意のアミノ酸であり、好ましくはG又はRである。
X249は、小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましく
はV又はAから選択される。
X253は任意のアミノ酸であり、好ましくはI又はTである。
X259は、任意のアミノ酸であり、好ましくはP又はSである。
X260は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X264は、非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはV又はI(又
はL)から選択される。
X266は小さなアミノ酸であり、好ましくはA又はGである。
X273は芳香族又はヘテロ芳香族アミノ酸であり、好ましくはH又はYである。
X276は任意のアミノ酸であり、好ましくはK又はQである。
X278は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はDである。
X306は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはL又はIから選
択される。
X325は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはL又はIから選
択される。
下のアミノ酸残基を有する:
X3は任意のアミノ酸であり、好ましくはK又はNである。
X5は任意のアミノ酸であり、好ましくはP又はQである。
X8は任意のアミノ酸であり、好ましくはH又はTである。
X14は、非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、又はV 、より好ましくはI又はLから
選択される。
X16は、小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましくは
V又はAから選択される。
X18は小さなアミノ酸であり、好ましくはA又はGである。
X19は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X20は極性アミノ酸であり、好ましくはS、T、N、又はQ、より好ましくはS又はNから選
択される。
X21は任意のアミノ酸であり、好ましくはD又はGである。
X31は、非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、V、及びF、より好ましくはL又はFか
ら選択される。
X39は正又は負に荷電したアミノ酸であり、好ましくはD、E、K、又はR、より好ましく
はK又はEから選択される
X80は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X84は、任意のアミノ酸であり、好ましくはT又はAである。
X93は、任意のアミノ酸であり、好ましくはC又はAである。
X97は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、V、及びM、より好ましくはL又はMから
選択される。
X125は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X132は正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X182は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X183は正に荷電したアミノ酸であり、好ましくはK又はRである。
X186は極性アミノ酸であり、好ましくはT又はSである。
X195は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはI又はVから選
択される。
X206は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X216は、任意のアミノ酸であり、好ましくはG又はRである。
X249は、小さな非極性アミノ酸であり、好ましくはV、L、I、A、又はG、より好ましく
はV又はAから選択される。
X253は任意のアミノ酸であり、好ましくはI又はTである。
X259は、任意のアミノ酸であり、好ましくはP又はSである。
X260は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はTである。
X264は、非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはV又はI(又
はL)から選択される。
X266は小さなアミノ酸であり、好ましくはA又はGである。
X273は芳香族又はヘテロ芳香族アミノ酸であり、好ましくはH又はYである。
X276は任意のアミノ酸であり、好ましくはK又はQである。
X278は任意のアミノ酸であり、好ましくはA又はDである。
X306は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはL又はIから選
択される。
X325は非極性アミノ酸であり、好ましくはI、L、及びV、より好ましくはL又はIから選
択される。
ここでも、大文字は、lUPAC命名法の1文字コードを表す。
配列番号:2の好ましい配列は、配列番号:29、配列番号:4、及び配列番号:6の配列
、及び配列番号:29、配列番号:4、又は配列番号:6と少なくとも85%の配列同一性、好
ましくは90%の配列同一性、より好ましくは95%又は98%さえもの配列同一性を有する配列
から選択される。
、及び配列番号:29、配列番号:4、又は配列番号:6と少なくとも85%の配列同一性、好
ましくは90%の配列同一性、より好ましくは95%又は98%さえもの配列同一性を有する配列
から選択される。
本発明のF9デザイナーDNA組換え酵素を形成する単量体の好ましい対は、配列番号:28
及び29及び特に配列番号3及び4並びに配列番号:5及び6のアミノ酸配列を有する。
及び29及び特に配列番号3及び4並びに配列番号:5及び6のアミノ酸配列を有する。
別の実施態様において、F9デザイナーDNA組換え酵素は、配列番号:36の配列(Rec F9-
3)又は配列番号:36と少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%、より好ましくは98%
の配列同一性を有する配列を含む。この場合において、F9デザイナーDNA組換え酵素は好
ましくはホモ四量体である。
3)又は配列番号:36と少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%、より好ましくは98%
の配列同一性を有する配列を含む。この場合において、F9デザイナーDNA組換え酵素は好
ましくはホモ四量体である。
これらの配列はヒトゲノム中に存在し、F9遺伝子のエキソン8に隣接する。本発明は、
配列番号:7(loxF9a)及び配列番号:8(loxF9b)から選択される核酸、又は配列番号:
7若しくは配列番号:8との少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列
同一性、より好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列、又はこれらの配列の1
つと逆相補的な核酸配列、及びこれらのDNA組換え酵素、好ましくは本発明のF9デザイナ
ーDNA組換え酵素の標的部位としての使用を含む。一実施態様において、本発明のこれら
の核酸は、30~40ヌクレオチド、好ましくは32~36、より好ましくは34ヌクレオチドの長
さである。
配列番号:7(loxF9a)及び配列番号:8(loxF9b)から選択される核酸、又は配列番号:
7若しくは配列番号:8との少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列
同一性、より好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列、又はこれらの配列の1
つと逆相補的な核酸配列、及びこれらのDNA組換え酵素、好ましくは本発明のF9デザイナ
ーDNA組換え酵素の標的部位としての使用を含む。一実施態様において、本発明のこれら
の核酸は、30~40ヌクレオチド、好ましくは32~36、より好ましくは34ヌクレオチドの長
さである。
また、本発明は本発明のF9デザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸及びベクターを
含む。
含む。
また、本発明は:
1. 本発明のF9デザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸を含む送達ベクター、
2. F9遺伝子のエキソン8又はその機能的突然変異体をコードする配列を縁取るloxF9a及び
LoxF9b部位を含むドナー配列、並びにDNA組換え酵素の発現を用いて細胞に形質導入する
ための方法を含む。
1. 本発明のF9デザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸を含む送達ベクター、
2. F9遺伝子のエキソン8又はその機能的突然変異体をコードする配列を縁取るloxF9a及び
LoxF9b部位を含むドナー配列、並びにDNA組換え酵素の発現を用いて細胞に形質導入する
ための方法を含む。
ドナー配列は発現ベクター若しくは送達ベクターに配置することができ、又は分離した
核酸、好ましくは複製欠損プラスミドとして提供する。好ましくはドナー配列を細胞当た
り複数のコピーで提供し、標的配列の置換率を増加させる(図3及び図11に例示されたも
のも参照されたい)。
核酸、好ましくは複製欠損プラスミドとして提供する。好ましくはドナー配列を細胞当た
り複数のコピーで提供し、標的配列の置換率を増加させる(図3及び図11に例示されたも
のも参照されたい)。
本発明は、細胞中に:
―本発明によるF9デザイナーDNA組換え酵素又はそれをコードし、かつ発現する核酸又は
ベクター、
―loxF9a及びloxF9b標的部位に隣接したF9遺伝子のエキソン8又はその機能的突然変異体
をコードする配列を含むドナー配列
を導入することにより、F9遺伝子の(非機能的又は機能不全)突然変異体エキソン8を置
換する(ここで、F9デザイナーDNA組換え酵素は、部位特異的組換えでドナー配列により
突然変異体エキソン8を含む配列を置換する)ための方法をさらに含む。
―本発明によるF9デザイナーDNA組換え酵素又はそれをコードし、かつ発現する核酸又は
ベクター、
―loxF9a及びloxF9b標的部位に隣接したF9遺伝子のエキソン8又はその機能的突然変異体
をコードする配列を含むドナー配列
を導入することにより、F9遺伝子の(非機能的又は機能不全)突然変異体エキソン8を置
換する(ここで、F9デザイナーDNA組換え酵素は、部位特異的組換えでドナー配列により
突然変異体エキソン8を含む配列を置換する)ための方法をさらに含む。
また、本発明は:
―本発明によるF9デザイナーDNA組換え酵素又はそれをコードする核酸又はベクター、
―loxF9a及びloxF9b標的部位に隣接したF9遺伝子のエキソン8又はその機能的突然変異体
をコードする配列を含むドナー配列を含むキットを含む。
―本発明によるF9デザイナーDNA組換え酵素又はそれをコードする核酸又はベクター、
―loxF9a及びloxF9b標的部位に隣接したF9遺伝子のエキソン8又はその機能的突然変異体
をコードする配列を含むドナー配列を含むキットを含む。
好ましい実施態様において、欠陥のあるF9エキソン8配列を、過活動Padua突然変異(R3
38L)(PMID:23197580)を担持するドナー配列によって置換する。
38L)(PMID:23197580)を担持するドナー配列によって置換する。
先に言及した方法及びキットについての特定の好ましいドナー配列は、配列番号:26(
野生型エキソン8)及び配列番号:27(Padua突然変異を有するエキソン8)から選択され
る。
野生型エキソン8)及び配列番号:27(Padua突然変異を有するエキソン8)から選択され
る。
ドナー配列は、F9デザイナーDNA組換え酵素をコードするベクターに配置することがで
き(例として、図11を参照されたい)、又は分離した核酸、好ましくは複製欠損プラスミ
ドとして提供する。
き(例として、図11を参照されたい)、又は分離した核酸、好ましくは複製欠損プラスミ
ドとして提供する。
好ましくは、ドナー配列は、先に言及した方法及びキットにおいて、標的配列の置換率
を増加させるために(例えばAAVベクターにより)細胞当たり複数のコピーで提供する(
例えば、図11も参照されたい)。
を増加させるために(例えばAAVベクターにより)細胞当たり複数のコピーで提供する(
例えば、図11も参照されたい)。
(例Hex:)
DRiGDについての好ましい実施態様において、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、ヒ
ト第7染色体上の配列を欠失させる。このデザイナーDNA組換え酵素はさらに、Hexデザイ
ナーDNA組換え酵素と呼ばれ、配列番号:40及び配列番号:41の非対称なHex1及びHex2標
的部位を認識する:
DRiGDについての好ましい実施態様において、本発明のデザイナーDNA組換え酵素は、ヒ
ト第7染色体上の配列を欠失させる。このデザイナーDNA組換え酵素はさらに、Hexデザイ
ナーDNA組換え酵素と呼ばれ、配列番号:40及び配列番号:41の非対称なHex1及びHex2標
的部位を認識する:
一実施態様において、デザイナーDNA組換え酵素は、2つの異なる単量体:配列番号:46
の配列(Hex-R-#7)又は配列番号46と少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは95%の
配列同一性を有する配列を有する単量体、及び配列番号:47の配列(Hex-L-#7)、又は配
列番号:47と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは
95%若しくは98%さえもの配列同一性を有する配列を有する単量体を含むヘテロ四量体であ
る。
の配列(Hex-R-#7)又は配列番号46と少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは95%の
配列同一性を有する配列を有する単量体、及び配列番号:47の配列(Hex-L-#7)、又は配
列番号:47と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは
95%若しくは98%さえもの配列同一性を有する配列を有する単量体を含むヘテロ四量体であ
る。
別の実施態様において、デザイナーDNA組換え酵素は、2つの異なる単量体:配列番号:
48の配列(Hex-R-#30)又は配列番号48と少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは95
%の配列同一性を有する配列を有する単量体、及び配列番号:49の配列(Hex-L-#30)、又
は配列番号:49と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好まし
くは95%若しくは98%さえもの配列同一性を有する配列を有する単量体を含むヘテロ四量体
である。
48の配列(Hex-R-#30)又は配列番号48と少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは95
%の配列同一性を有する配列を有する単量体、及び配列番号:49の配列(Hex-L-#30)、又
は配列番号:49と少なくとも80%の配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好まし
くは95%若しくは98%さえもの配列同一性を有する配列を有する単量体を含むヘテロ四量体
である。
また、本発明は本発明のHexデザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸及びベクターを
含む。
含む。
さらなる態様において、本発明は、医療における使用のための、特に先に言及した疾患
関連遺伝子若しくはポリヌクレオチド又は先に言及した生化学シグナル伝達経路関連遺伝
子及びポリヌクレオチドの1つと関連する疾患又は状態の治療のための、本発明のDNA組換
え酵素、本発明の核酸若しくはベクター、または本発明のセット/キットを含む。
関連遺伝子若しくはポリヌクレオチド又は先に言及した生化学シグナル伝達経路関連遺伝
子及びポリヌクレオチドの1つと関連する疾患又は状態の治療のための、本発明のDNA組換
え酵素、本発明の核酸若しくはベクター、または本発明のセット/キットを含む。
同様の態様において、本発明は、本発明のDNA組換え酵素、本発明の核酸若しくはベク
ターを含む先に言及した疾患遺伝子若しくはポリヌクレオチド又は先に言及した生化学シ
グナル伝達経路関連遺伝子及びポリヌクレオチドの1つと関連する疾患又は状態の治療の
ための医薬の調製、あるいは本発明のセット/キット、あるいは本発明の方法の使用を含
む。
ターを含む先に言及した疾患遺伝子若しくはポリヌクレオチド又は先に言及した生化学シ
グナル伝達経路関連遺伝子及びポリヌクレオチドの1つと関連する疾患又は状態の治療の
ための医薬の調製、あるいは本発明のセット/キット、あるいは本発明の方法の使用を含
む。
本開示において、特に特許請求の範囲及び/又は段落において、「含む」、「含んでい
た」、及び「含んでいる」などの用語は、米国特許法におけるこの用語に起源をおく意味
を有し得ることに留意されたい;例えば、これらの用語は「含む」、「含んでいた」、及
び「含んでいる」などを意味し得る;並びに「本質的に~からなっている」及び「本質的
に~からなる」などの用語は、米国特許法におけるこれらの用語に帰着される意味を有す
る。例えば、これらの用語は明記されていない要素を許容するが、発明の基礎的又は新規
の特徴に影響を及ぼす先行技術において見いだされる要素を除外する。これらの及びほか
の実施態様を開示する、又はこれらは、以下の詳細な説明から明らかとなり、かつそれに
包含される。
た」、及び「含んでいる」などの用語は、米国特許法におけるこの用語に起源をおく意味
を有し得ることに留意されたい;例えば、これらの用語は「含む」、「含んでいた」、及
び「含んでいる」などを意味し得る;並びに「本質的に~からなっている」及び「本質的
に~からなる」などの用語は、米国特許法におけるこれらの用語に帰着される意味を有す
る。例えば、これらの用語は明記されていない要素を許容するが、発明の基礎的又は新規
の特徴に影響を及ぼす先行技術において見いだされる要素を除外する。これらの及びほか
の実施態様を開示する、又はこれらは、以下の詳細な説明から明らかとなり、かつそれに
包含される。
さらに、本発明に記載される実施態様は、相互に結合することができる。
本発明は、以下の図面及び非限定的な実施例によって例示する:
本発明の好ましいDNA組換え酵素によって誘導される遺伝子置換(DRiGR)の一般的スキームを示す。DNA組換え酵素の異なる単量体R1~4及びそれらのそれぞれのDNA結合配列loxR1~loxR4(標的部位の部分部位)を示す。ゲノム中の対象とする部位(しかめっ面)を所望の配列(笑顔)により置換する。
デザイナーDNA組換え酵素によって誘導される遺伝子欠失(DRiGD)の一般的スキームを示す。ここでも、DNA組換え酵素の異なる単量体R1~4のそれらのそれぞれのDNA結合配列loxR1~loxR4での結合を、上のスキームに示す。ここで、標的部位は各々同一の8 bpのスペーサーを有する。ここではゲノム中の対象とする部位(しかめっ面)を切りとばす。
ドナーベクターがゲノムDNAに対して過剰にある場合、DNA組換え酵素によって誘導される遺伝子置換は、ドナーベクターDNAによるゲノムDNAの置換に向けて駆動されることを図解する。好ましくは、ドナーベクター、例えばAAVベクターは標的細胞の核内に複数のコピーで存在し、細胞の突然変異を効率的に修復する。
DNA組換え酵素の2つのライブラリを有するソースベクターから開始して、ゲノム中に存在する2つの異なる標的部位(白い三角形はlox1、黒い三角形はlox2)を共同して組換えるように機能する1対のDNA組換え酵素の単量体を生み出す新規指向性進化戦略(Duo-SLiDE DRiGR)を適用することにより、DRiGRのためのDNA組換え酵素を取得する一般的方法を実証する。このシステムにおける単一のリコンビナーゼの発現も、実現性がある(図15を参照されたい)。R1、R2、及びR3は、3つの異なる制限酵素又はそれぞれの制限部位を表す。P1及びP2は、2つの異なるPCRプライマー又はそれぞれのプライマー結合部位を表す。DNA組換え酵素のこれらの単量体を同様に2つの標的部位を担持するDNA鋳型(ここでは、pDonorプラスミド)と共に発現させると、両方の標的部位の組換えによりDNA断片が交換される。DNA断片の挿入によりpDuoSLiDEベクター由来の制限部位が除去されるため、置換を促進させた効果的なリコンビナーゼは制限酵素によるDNAの消化後にPCRによって増幅することができる。このシステムをランダム突然変異誘発と組み合わせて周期的に繰り返すこと及びDNAシャッフルにより、反応を促進する最も効率の高いリコンビナーゼが明らかとなる。宿主中で不活性なpDonor上の複製起点(R6K-ori)を使用することにより、一方の標的部位(例えば、lox1)を通じた統合及び他方の標的部位(例えば、lox2)を通じた切除のプロセスを分離することができる。さらに、統合されたベクターは、カナマイシン含有プレート上での抗生物質による選択により同定することができる。
2つの異なる標的部位を共同して組換えるように機能する2対のDNA組換え酵素の単量体を生み出す新規指向性進化戦略(QuSLiDE DRiGR)を適用することにより、DRiGRのためのDNA組換え酵素を取得する同様の方法を実証する。ここで、各単量体は、DNA組換え酵素の4つのライブラリを有するソースベクターから開始して、ゲノム中に存在する1つの標的部位の1つの部分部位(白い三角形はlox1、黒い三角形はlox2)に導かれる(R1、R2、及びR3並びにP1及びP2は、図4におけるものと同じ意味である)。ドナーベクター上のDNAが野生型対立遺伝子を含み、かつゲノムが疾患を引き起こす突然変異を含む場合、遺伝子の欠陥は細胞中で修復される(図1を参照されたい)。
新規指向性進化戦略(Duo-SLiDE DRiGD)を適用することにより、DNA組換え酵素の2つのライブラリを有するソースベクターから開始して、ゲノム中に存在する2つの異なる標的部位(白い三角形はlox1、黒い三角形はlox2)を共同して組換えるように機能する1対のDNA組換え酵素の単量体を生み出すことにより、DRiGDのためのDNA組換え酵素を取得する一般的方法を実証する(R1、R2、及びR3並びにP1及びP2は、図4におけるものと同じ意味である)。DNA組換え酵素のこれらの単量体を発現させると、pDuoSLiDEベクターの2つのコピーの間での組換えによりpDuoSLiDEベクター由来の制限部位が除去される。欠失を促進する効果的なリコンビナーゼは制限酵素によるDNAの消化後にPCRによって増幅することができる。このシステムをランダム突然変異誘発と組み合わせて周期的に繰り返すこと及びDNAシャッフルにより、反応を促進する最も効率の高いリコンビナーゼが明らかとなる。
2つの異なる標的部位を共同して組換えるように機能する2対のDNA組換え酵素の単量体を生み出す新規指向性進化戦略(QuSLiDE DRiGD)を適用することにより、DRiGDのためのDNA組換え酵素を取得する同様の方法を実証する。ここで、各単量体は、DNA組換え酵素の4つのライブラリを有するソースベクターから開始して、ゲノム中に存在する1つの標的部位の1つの部分部位(白い三角形はlox1、黒い三角形はlox2)に導かれる(R1、R2、及びR3並びにP1及びP2は、図4におけるものと同じ意味である)。この単量体のセットにより、ゲノム中の対象とする部位を欠失させることが可能となる(図2を参照されたい)。
基質と関連するタンパク質の進化(SLiPE)により一方の標的部位に作用するテイラーメイドリコンビナーゼを取得するための、最新の公知の方法を示す(Buchholz F及びStewart AFの文献、2001)。ここで、ベクターは1つのライブラリ及び2つの同一の標的部位を含むのみである(破線柄の三角形)。
Duo-SLiDE DRiGRによるF9遺伝子のエキソン8中の突然変異を置換するための、本発明の適用を示す。図9Aは、F9遺伝子のエキソン8及び隣接する配列の図式提示を示す。2つの選択された標的配列(loxF9a―配列番号:3及びloxF9b―配列番号:4)を三角形で示し(黒及び白)、かつヌクレオチド配列及び染色体位置を示す。図9Bは、2つのリコンビナーゼ単量体F9-1(配列番号:1、3、5、及び28)及びF9-2(配列番号:2、4、6、及び29)を取得するための方法並びに置換反応を図解する。組換え反応が予測した通り起こったことの確認は、DNA配列決定法によって確認した。図9Cは、NdeI及びSacIによる消化の後、pDuoF9(ソース)(レーン1)及びpDuoF9(産物)(レーン2)の制限パターンを実証するアガロースゲルを示す。M=分子マーカー。
DNA組換え酵素のライブラリを所与の標的部位に適応させる例示的な進化プロセスを示す―ここでは、loxF9a及びloxF9b標的部位に適用した。ここで、loxF9a部位(F9A)上の活性を有するDNA組換え酵素を2つの対称な中間部位AL及びARを設計し、20又は17サイクルのSLiPEを実施することにより取得した(図8を参照されたい)。得られたDNA組換え酵素のライブラリを組合わせ、かつシャッフルした後、非対称なloxF9a部位(F9A)で108サイクルのSLiPEを実施した。示された世代サイクルのアガロースゲルを示す。2つの三角形を伴う線は、組換えられていないバンドを示し、1つの三角形を伴う線は、組換えられたバンドのサイズを示す。ゲル写真の下の灰色の三角形は増殖培地に追加したL-アラビノースの量の低下を示す。loxF9b部位(F9B)上の活性を有するDNA組換え酵素を取得するために、2つの対称な中間部位BLS及びBRSの第1のセットを設計し、9サイクルのSLiPEを実施した(図8を参照されたい)。DNA組換え酵素のライブラリをシャッフルした後、対称な中間部位BL(30サイクル)及びBR(22サイクル)の第2のセットに対し再度SLiPEを実施した。最後に、得られたDNA組換え酵素のライブラリを組合わせ、かつシャッフルした後、非対称なloxF9b部位(F9B)で17サイクルのSLIPEを実施した。最後に、loxF9a部位およびloxF9b部位で取得したDNA組換え酵素の2つのライブラリをpDuoF9(ソース)にクローニングした(図9を参照されたい)(示さない)。
治療的設定におけるF9デザイナーDNA組換え酵素の使用を図解し、F9-1及びF9-2の両方のコード配列をF9遺伝子のエキソン8の野生型又はPadua突然変異(R338L)に隣接するloxF9a及びloxF9bを含むドナー配列とともに送達ベクター(例えば、アデノ随伴ウイルスベクター)へクローニングする。そのようなベクターの複数コピーでの標的細胞への送達は、ゲノム中の不活性化突然変異を置換する。
第1染色体上でのヒトPCSK9遺伝子の8 bp反復配列のスクリーニング結果を示す。PCSK9遺伝子のエキソンを太線の長方形で示す。8 bp反復配列は少なくとも150 bpかつ2 kb以下隔てられ、スクリーニングにより得たゲノム中の他のどこにも出現しない34 bpの長さの潜在的標的部位(垂直線によって示す)に存在する。潜在的標的部位の間の対象とする配列を、水平線で示す。
ヒトパピローマウイルス16(HPV16)のゲノムの少なくとも150 bpかつ2 kb以下隔てられ、スクリーニングにより得たヒトゲノム中に出現しない34 bpの潜在的標的部位に存在する8 bp反復配列についての同様のスクリーニング結果を示す。ウイルスタンパク質をコードする配列は、矢印を伴う太線の長方形で示す(記号より大きい)。
ゲノム中に存在する2つの異なる標的部位(白い三角形はlox1、黒い三角形はlox2)を組換えるDNA組換え酵素のライブラリを生み出す新規指向性進化戦略(SLiDE DRiGR 2.0)を適用することにより、実施例3工程3において使用するDRiGRのためのDNA組換え酵素を取得するための、異なる一般的方法を実証する。R1、R2、R3、R4、及びR5は、5つの異なる制限酵素又はそれぞれの制限部位を表す。P3及びP4は、2つの異なるPCRプライマー又はそれぞれのプライマー結合部位を表す。DNA組換え酵素のこのライブラリを同様に2つの標的部位を担持するDNA鋳型(ここでは、pDonor-ex8プラスミド)の存在下で発現させると、両方の標的部位の組換えによりDNA断片が交換される。DNA断片の挿入によりpF9ベクター由来の制限部位が除去されるため、置換を促進させた効果的なリコンビナーゼは制限酵素R1~3及びRecBCDによるDNAの消化後にPCRによって増幅することができる。このシステムをランダム突然変異誘発と組み合わせて周期的に繰り返すこと及びDNAシャッフルにより、DRIGR反応を促進する最も効率の高いリコンビナーゼが明らかとなる。
実施例3工程3において使用する新規指向性進化戦略(SLiDE DRiGR)の工程を強調する。副工程1において、pF9(ソース)及びpDonorで細菌を形質転換する。リコンビナーゼの発現が誘導された場合にのみ、抗生物質に耐性を有するコロニーの増殖を観察することができる。副工程2において、得られたコロニーのプラスミドDNAを制限酵素R1~3を使用して消化する。これにより、DRIGRを受けることに成功したコロニーが富化され、pF9の純粋な調製物(産物)を得る。プラスミド調製物の純度をpDuoF9(産物)の固有の制限パターンを示す酵素XhoI及びXmaIを使用して制限消化することにより実証する。さらに、DNA配列決定法により、pF9(産物)の正確な配列が明らかとなる。
DNA組換え酵素の1又は2つのライブラリを有するソースベクターから開始して、ゲノム中に存在する2つの異なる標的部位(白い三角形はlox1、黒い三角形はlox2)を共同して組換えるように機能する1つ又は1対のDNA組換え酵素の単量体を生み出す新規指向性進化戦略(Duo-SLiDE DRiGR 2.0)を適用することにより、DRiGRのためのDNA組換え酵素を取得する異なる一般的方法を実証する。R1、R2、R3、R4、及びR5は、5つの異なる制限酵素又はそれぞれの制限部位を表す。P3及びP4は、2つの異なるPCRプライマー又はそれぞれのプライマー結合部位を表す。これらのDNA組換え酵素の単量体を同様に2つの標的部位を担持するDNA鋳型(ここでは、高コピー数プラスミドpDonor-ex8)と共に発現させると、両方の標的部位の組換えによりDNA断片が交換される。DNA断片の挿入によりpDuoSLiDEベクター由来の制限部位が除去されるため、置換を促進させた効果的なリコンビナーゼは制限酵素によるDNAの消化後にPCRによって増幅することができる。重要なことに、抗生物質選択マーカーをこのアッセイでは使用しない。このシステムをランダム突然変異誘発と組み合わせて周期的に繰り返すこと及びDNAシャッフルにより、反応を促進する最も効率の高いリコンビナーゼが明らかとなる。
(最新の)Cre、実施例3の工程1の後に得たリコンビナーゼ(R#1)、実施例の工程2の後に得たリコンビナーゼ(3R#7-B5)、及び実施例3の工程3の後に得たリコンビナーゼ(F9-3)間のアラインメントを示す。アラインメントは、進化の後期段階の間にどのようなさらなる突然変異が生じたかを示している。
本発明のDRiGD方法及び工程により例示される本発明の方法の一般的スキームを示す。
DRiGD方法によって例示され、ヒトゲノムに適用される本発明の方法のより詳細なスキームを示す。
DRiGD方法によって例示され、ヒトゲノムに適用される本発明の方法のより詳細なスキームを示す。
実施例5でさらに説明するヒト第7染色体上の標的部位に適用される本発明のDRIGD方法を例示する。A. 標的部位を示す:Hex1及びHex2は切除に使用する標的部位であり―HexL、HexR、HexR1、及びHexR2は、中間標的部位である。B. Hex1及びHex2標的部位の特異的リコンビナーゼの進化を示す。C. 得られた2つのクローン(クローン#7及びクローン#30)の組換え効率を示す。
実施例5で得たリコンビナーゼを使用したプラスミド基質からの配列の正確な切除を示す。
(実施例1:)
DRiGDの有用性を実証するために、本発明者らは少なくとも150 bpにより隔てられたす
べての8 bp反復配列についてヒトゲノムをスクリーニングした:ゲノムから最大2 kbを欠
失させるための範囲内の潜在的標的部位は、ヒトゲノム中のほかのどこにも出現しない8
bpの反復配列の左13 bp及び右13 bpの配列を示す。図12はヒトPCSK9遺伝子中のDNA組換え
酵素の309個全ての考え得る標的部位の結果を示す。図13はヒトパピローマウイルス(HPV
16)中のDNA組換え酵素の176個全ての考え得る標的部位の結果を示す。
DRiGDの有用性を実証するために、本発明者らは少なくとも150 bpにより隔てられたす
べての8 bp反復配列についてヒトゲノムをスクリーニングした:ゲノムから最大2 kbを欠
失させるための範囲内の潜在的標的部位は、ヒトゲノム中のほかのどこにも出現しない8
bpの反復配列の左13 bp及び右13 bpの配列を示す。図12はヒトPCSK9遺伝子中のDNA組換え
酵素の309個全ての考え得る標的部位の結果を示す。図13はヒトパピローマウイルス(HPV
16)中のDNA組換え酵素の176個全ての考え得る標的部位の結果を示す。
(実施例2:)
DRiGR発明の実現可能性を実証するために、本発明者らは共に適用した場合にヒト第IX
因子(F9)遺伝子のエキソン8を置換することができるリコンビナーゼを作製した。この
エキソンは血友病Bに罹患する患者において高い頻度で突然変異を有する。本発明者らの
結果は、適切なドナーベクター及び共同して機能する2つのリコンビナーゼの発現を提供
して、このエキソンを異なる配列に効率的に置換することができることを実証する(図6
、図9、及び図11)。
DRiGR発明の実現可能性を実証するために、本発明者らは共に適用した場合にヒト第IX
因子(F9)遺伝子のエキソン8を置換することができるリコンビナーゼを作製した。この
エキソンは血友病Bに罹患する患者において高い頻度で突然変異を有する。本発明者らの
結果は、適切なドナーベクター及び共同して機能する2つのリコンビナーゼの発現を提供
して、このエキソンを異なる配列に効率的に置換することができることを実証する(図6
、図9、及び図11)。
別途明示されない限り、WO 2008/083931 A1、WO 2011/147590 A1、WO2016034553 A1、
並びにBuchholz F及びStewart AFの刊行物、2001に記載された材料及び方法を使用する。
並びにBuchholz F及びStewart AFの刊行物、2001に記載された材料及び方法を使用する。
標的配列(loxF9a―配列番号:7及びloxF9b―配列番号:8)を事前に同定したDNA組換
え酵素の標的部位(LoxP、LoxH、LoxM7、LoxM5、loxLTR、LoxBTR)の部分部位を有するヒ
トゲノム中の配列を比較することにより選択した:
表中標的部位中の第1(左)及び第2(右)の部分部位に下線を引いた。
え酵素の標的部位(LoxP、LoxH、LoxM7、LoxM5、loxLTR、LoxBTR)の部分部位を有するヒ
トゲノム中の配列を比較することにより選択した:
第1の工程において、2つのリコンビナーゼライブラリを先に記載のSLiDEアプローチを
使用して個別に進化させた(Buchholz及びStewartの文献、2001並びにWO 2002044409 A2
―図8を参照されたい)。手短に説明すると、各ライブラリを中間標的部位(AL、AR、BLS
、BLRS、BL、BR)の組換えに向けて進化させ、最終的に2つの標的部位、loxF9a又はloxF9
bの1つの組換えに到達させた。新たな突然変異を誤りを起こしやすいPCR及びDNAシャッフ
ルにより導入し、かつ選択圧をリコンビナーゼの発現レベルを介してさらに調節した。活
性を有するリコンビナーゼをそれぞれの標的部位を組換えてベクターに由来する標的部位
と隣接した配列を欠失させるそれらの能力によって選択した(図8を参照されたい)。
使用して個別に進化させた(Buchholz及びStewartの文献、2001並びにWO 2002044409 A2
―図8を参照されたい)。手短に説明すると、各ライブラリを中間標的部位(AL、AR、BLS
、BLRS、BL、BR)の組換えに向けて進化させ、最終的に2つの標的部位、loxF9a又はloxF9
bの1つの組換えに到達させた。新たな突然変異を誤りを起こしやすいPCR及びDNAシャッフ
ルにより導入し、かつ選択圧をリコンビナーゼの発現レベルを介してさらに調節した。活
性を有するリコンビナーゼをそれぞれの標的部位を組換えてベクターに由来する標的部位
と隣接した配列を欠失させるそれらの能力によって選択した(図8を参照されたい)。
これら2つのライブラリに由来するリコンビナーゼのコード配列を続いてベクターバッ
クボーンpDuoF9(ソース)(配列番号:21、図9を参照されたい)にクローニングした。
このベクター中2つのリコンビナーゼライブラリを、両酵素の転写を一体に結び付けるオ
ペロン様構造をとる共通の誘導性プロモーターから発現させる。このライブラリのサイズ
は、100,000クローンを超えた。
クボーンpDuoF9(ソース)(配列番号:21、図9を参照されたい)にクローニングした。
このベクター中2つのリコンビナーゼライブラリを、両酵素の転写を一体に結び付けるオ
ペロン様構造をとる共通の誘導性プロモーターから発現させる。このライブラリのサイズ
は、100,000クローンを超えた。
DRiGRを実施するために、50 μlのエレクトロコンピテントな大腸菌(E.coli)XL1-Blu
e細胞を1 ng pDuoF9(ソース)ライブラリで形質転換して、15 μg/mlクロラムフェニコ
ールを含む200 ml LB中一晩増殖させた。翌日、1 mlの一晩培養物を使用して新鮮な培地1
00 mlに接種し、2時間増殖させた。続いて培養物を2×50 mlに分割し、L-アラビノースを
添加して最終濃度を50 μg/mlとし、培養物のうちの1つでリコンビナーゼの発現を誘導し
た。細胞を2.5時間インキュベートした後、氷上に置き、先に記載の通りにエレクトロポ
レーションのために調製した(Sambrook及びRussellの文献、2001)。エレクトロコンピ
テントセルを200 μlの水に再懸濁させ、50 μlの細胞懸濁物をすぐに0.4 ng pDonorの17
00 Vでの形質転換に使用した。続いて細菌をSOC培地中2時間回復させ、その後全懸濁物を
15 μg/mlカナマイシンを含むLB寒天プレートに播いた。
e細胞を1 ng pDuoF9(ソース)ライブラリで形質転換して、15 μg/mlクロラムフェニコ
ールを含む200 ml LB中一晩増殖させた。翌日、1 mlの一晩培養物を使用して新鮮な培地1
00 mlに接種し、2時間増殖させた。続いて培養物を2×50 mlに分割し、L-アラビノースを
添加して最終濃度を50 μg/mlとし、培養物のうちの1つでリコンビナーゼの発現を誘導し
た。細胞を2.5時間インキュベートした後、氷上に置き、先に記載の通りにエレクトロポ
レーションのために調製した(Sambrook及びRussellの文献、2001)。エレクトロコンピ
テントセルを200 μlの水に再懸濁させ、50 μlの細胞懸濁物をすぐに0.4 ng pDonorの17
00 Vでの形質転換に使用した。続いて細菌をSOC培地中2時間回復させ、その後全懸濁物を
15 μg/mlカナマイシンを含むLB寒天プレートに播いた。
誘導していない細胞を播いた場合、コロニーは寒天プレート上で一晩かけても増殖せず
、これによりリコンビナーゼの発現がpDonorベクター(配列番号:22)の統合に必要であ
ることが立証された。誘導した試料からの全ての増殖するコロニーをプールし、15 μg/m
lカナマイシン及び 50 μg ml L-アラビノースを含む220 ml LB培地中で培養し、第2の対
の標的部位を通じて可能な組換えをさせた。
、これによりリコンビナーゼの発現がpDonorベクター(配列番号:22)の統合に必要であ
ることが立証された。誘導した試料からの全ての増殖するコロニーをプールし、15 μg/m
lカナマイシン及び 50 μg ml L-アラビノースを含む220 ml LB培地中で培養し、第2の対
の標的部位を通じて可能な組換えをさせた。
翌日、プラスミドDNAを培養物から単離した。DRiGRを受けることに成功したクローンを
富化させるために、DNAを任意の非pDuoF9(産物)を切断する酵素で消化し―ネガティブ
選択―再度形質転換した。この目的で、500 ngのプラスミド調製物を1 μlのNdeI、AvrII
、及びPspXIの各々で消化した。37℃での3時間のインキュベーションの後、DNAを沈殿さ
せ、50 μl水に再度懸濁させた。このうち1 μlを、50 μlのエレクトロコンピテントな
大腸菌XL1-Blue細胞の形質転換のために使用した。形質転換細胞を15 μg/mlカナマイシ
ンを含む220 ml LB中で増殖させた―ポジティブ選択。
富化させるために、DNAを任意の非pDuoF9(産物)を切断する酵素で消化し―ネガティブ
選択―再度形質転換した。この目的で、500 ngのプラスミド調製物を1 μlのNdeI、AvrII
、及びPspXIの各々で消化した。37℃での3時間のインキュベーションの後、DNAを沈殿さ
せ、50 μl水に再度懸濁させた。このうち1 μlを、50 μlのエレクトロコンピテントな
大腸菌XL1-Blue細胞の形質転換のために使用した。形質転換細胞を15 μg/mlカナマイシ
ンを含む220 ml LB中で増殖させた―ポジティブ選択。
翌日、プラスミドDNAを培養物から単離した。リコンビナーゼライブラリをプライマーP
1及びP2(配列番号:23及び24)を用いたPCRによって増幅させ、PCR産物をカラム上で精
製し、制限酵素SacI及びSbfIを用いる消化に付した。単離したリコンビナーゼライブラリ
を次にpDuoF9(ソース)に再度ライゲーションさせ、さらなるサイクルのDRiGRを開始し
た。3ラウンドのDuo-SLiDE DRIGR(Fig. 10を参照されたい)を実施して、標的部位loxF9
a及びLoxF9bでのDRiGR効率的に実施することができるリコンビナーゼを富化させた。
1及びP2(配列番号:23及び24)を用いたPCRによって増幅させ、PCR産物をカラム上で精
製し、制限酵素SacI及びSbfIを用いる消化に付した。単離したリコンビナーゼライブラリ
を次にpDuoF9(ソース)に再度ライゲーションさせ、さらなるサイクルのDRiGRを開始し
た。3ラウンドのDuo-SLiDE DRIGR(Fig. 10を参照されたい)を実施して、標的部位loxF9
a及びLoxF9bでのDRiGR効率的に実施することができるリコンビナーゼを富化させた。
プラスミドpDuoF9(産物)の配列を、配列番号:25に与える。
この方法により、以下の対のリコンビナーゼ単量体の配列を得た:
Rec F9-1:配列番号:3及びRec F9-2a:配列番号:4
Rec F9-1b:配列番号:5及びRec F9-2b:配列番号:6
Rec F9-1:配列番号:3及びRec F9-2a:配列番号:4
Rec F9-1b:配列番号:5及びRec F9-2b:配列番号:6
(実施例3)
(工程1:)
第1の工程において、2つのリコンビナーゼライブラリを先に記載のSLiDEアプローチを
使用して個別に進化させた(Buchholz及びStewartの文献、2001並びにWO 2002044409 A2
―図8を参照されたい)。手短に説明すると、実施例2に記載の各ライブラリを中間標的部
位(loxF9-AL、AR、BLS、BLRS、BL、BR―実施例2を参照されたい)の組換えに向けて進化
させ、最終的に2つの標的部位、loxF9a又はloxF9bの1つの組換えに到達させた。新たな突
然変異を誤りを起こしやすいPCR及びDNAシャッフルにより導入し、かつ選択圧をリコンビ
ナーゼの発現レベルを介してさらに調節した。活性を有するリコンビナーゼをそれぞれの
標的部位を組換えてベクターに由来する標的部位と隣接した配列を欠失させるそれらの能
力によって選択した(図8を参照されたい)。
(工程1:)
第1の工程において、2つのリコンビナーゼライブラリを先に記載のSLiDEアプローチを
使用して個別に進化させた(Buchholz及びStewartの文献、2001並びにWO 2002044409 A2
―図8を参照されたい)。手短に説明すると、実施例2に記載の各ライブラリを中間標的部
位(loxF9-AL、AR、BLS、BLRS、BL、BR―実施例2を参照されたい)の組換えに向けて進化
させ、最終的に2つの標的部位、loxF9a又はloxF9bの1つの組換えに到達させた。新たな突
然変異を誤りを起こしやすいPCR及びDNAシャッフルにより導入し、かつ選択圧をリコンビ
ナーゼの発現レベルを介してさらに調節した。活性を有するリコンビナーゼをそれぞれの
標的部位を組換えてベクターに由来する標的部位と隣接した配列を欠失させるそれらの能
力によって選択した(図8を参照されたい)。
(工程2:)
第2の工程において、単一のリコンビナーゼライブラリを進化させ、複製欠損pDonorを
用いた選択スキームに従いDRiGRを実施した(図9を参照されたい)。これには、ベクター
バックボーンpF9(ソース)(= pDuoF9、配列番号:21)中の工程1で作製したライブラリ
に由来するリコンビナーゼコード配列のクローニングを伴う。このベクター中1~4つのリ
コンビナーゼライブラリを、両酵素の転写を一体に結び付けるオペロン様構造をとる共通
の誘導性プロモーターから発現させることができる。このライブラリのサイズは、100,00
0クローンを超える。
第2の工程において、単一のリコンビナーゼライブラリを進化させ、複製欠損pDonorを
用いた選択スキームに従いDRiGRを実施した(図9を参照されたい)。これには、ベクター
バックボーンpF9(ソース)(= pDuoF9、配列番号:21)中の工程1で作製したライブラリ
に由来するリコンビナーゼコード配列のクローニングを伴う。このベクター中1~4つのリ
コンビナーゼライブラリを、両酵素の転写を一体に結び付けるオペロン様構造をとる共通
の誘導性プロモーターから発現させることができる。このライブラリのサイズは、100,00
0クローンを超える。
DRiGRを実施するために、50 μlのエレクトロコンピテントな大腸菌XL1-Blue細胞を1 n
g pDuoF9(ソース)ライブラリで形質転換して、15 μg/mlクロラムフェニコールを含む2
00 ml LB培地中一晩増殖させた。翌日、1 mlの一晩培養物を使用して新鮮な培地100 mlに
接種し、2時間増殖させた。続いて培養物を2×50 mlに分割し、L-アラビノースを添加し
て最終濃度を1~200 μg/mlとし、培養物のうちの1つでリコンビナーゼの発現を誘導した
。細胞を2.5時間インキュベートした後、氷上に置き、先に記載の通りにエレクトロポレ
ーションのために調製した(Sambrook及びRussellの文献、2001)。エレクトロコンピテ
ントセルを200 μlの水に再懸濁させ、200 μlの細胞懸濁物をすぐに80 ng pDonorの1700
Vでの形質転換に使用した。続いて細菌をSOC培地中2時間回復させ、その後全懸濁物を使
用して、15 μg/mlクロラムフェニコール、5 μg/mlカナマイシン、及び1~200 μg/ml L
-アラビノースを含む200 ml LB培地に接種した。ライブラリサイズを評価するために、少
量の懸濁物を一部寒天プレート上に播いた。
g pDuoF9(ソース)ライブラリで形質転換して、15 μg/mlクロラムフェニコールを含む2
00 ml LB培地中一晩増殖させた。翌日、1 mlの一晩培養物を使用して新鮮な培地100 mlに
接種し、2時間増殖させた。続いて培養物を2×50 mlに分割し、L-アラビノースを添加し
て最終濃度を1~200 μg/mlとし、培養物のうちの1つでリコンビナーゼの発現を誘導した
。細胞を2.5時間インキュベートした後、氷上に置き、先に記載の通りにエレクトロポレ
ーションのために調製した(Sambrook及びRussellの文献、2001)。エレクトロコンピテ
ントセルを200 μlの水に再懸濁させ、200 μlの細胞懸濁物をすぐに80 ng pDonorの1700
Vでの形質転換に使用した。続いて細菌をSOC培地中2時間回復させ、その後全懸濁物を使
用して、15 μg/mlクロラムフェニコール、5 μg/mlカナマイシン、及び1~200 μg/ml L
-アラビノースを含む200 ml LB培地に接種した。ライブラリサイズを評価するために、少
量の懸濁物を一部寒天プレート上に播いた。
翌日、誘導していない細胞を播いた場合、コロニーは寒天プレート上で増殖しないこと
が確認され、これによりリコンビナーゼの発現がpDonorベクター(配列番号:22)の統合
に必要であることが立証された。プラスミドDNAは、液体培養物から単離した。DRiGRを受
けることに成功したクローンを富化させるために、DNAを任意の非pDuoF9(産物)を切断
する酵素で消化し―ネガティブ選択―再度形質転換した。この目的で、500 ngのプラスミ
ド調製物を1 μlのNdeI、AvrII、PspXI、及びFspIの各々で消化した。37℃での3時間のイ
ンキュベーションの後、DNAを膜フィルター上でのマイクロダイアリシスによってクリー
ンアップした。この消化物のうち3 μlを、50 μlのエレクトロコンピテントな大腸菌XL1
-Blue細胞の形質転換のために使用した。形質転換細胞を15 μg/mlクロラムフェニコール
及び15 μg/mlカナマイシンを含む100 ml LB中で増殖させた―ポジティブ選択。
が確認され、これによりリコンビナーゼの発現がpDonorベクター(配列番号:22)の統合
に必要であることが立証された。プラスミドDNAは、液体培養物から単離した。DRiGRを受
けることに成功したクローンを富化させるために、DNAを任意の非pDuoF9(産物)を切断
する酵素で消化し―ネガティブ選択―再度形質転換した。この目的で、500 ngのプラスミ
ド調製物を1 μlのNdeI、AvrII、PspXI、及びFspIの各々で消化した。37℃での3時間のイ
ンキュベーションの後、DNAを膜フィルター上でのマイクロダイアリシスによってクリー
ンアップした。この消化物のうち3 μlを、50 μlのエレクトロコンピテントな大腸菌XL1
-Blue細胞の形質転換のために使用した。形質転換細胞を15 μg/mlクロラムフェニコール
及び15 μg/mlカナマイシンを含む100 ml LB中で増殖させた―ポジティブ選択。
翌日、プラスミドDNAを培養物から単離し、500 ngのDNAを各々1 μlのNdeI及びAvrIIで
消化した。リコンビナーゼライブラリをプライマーP1#及びP2#(配列番号:30及び31)を
用いた誤りを起こしやすいPCRによって増幅させ、PCR産物をカラム上で精製し、制限酵素
SacIびSbfIを用いる消化に付した。単離したリコンビナーゼライブラリを次にpDuoF9(ソ
ース)に再度ライゲーションさせ、さらなるサイクルのDRiGRを開始した。3及び8サイク
ルの後、DNAシャッフルを先に記載の通り実施した(Buchholz及びStewartの文献、2001)
。11ラウンドのDuo-SLiDE DRIGRを実施して、標的部位loxF9a及びloxF9bでのDRiGRを効率
的に実施することができるリコンビナーゼを富化させた。
消化した。リコンビナーゼライブラリをプライマーP1#及びP2#(配列番号:30及び31)を
用いた誤りを起こしやすいPCRによって増幅させ、PCR産物をカラム上で精製し、制限酵素
SacIびSbfIを用いる消化に付した。単離したリコンビナーゼライブラリを次にpDuoF9(ソ
ース)に再度ライゲーションさせ、さらなるサイクルのDRiGRを開始した。3及び8サイク
ルの後、DNAシャッフルを先に記載の通り実施した(Buchholz及びStewartの文献、2001)
。11ラウンドのDuo-SLiDE DRIGRを実施して、標的部位loxF9a及びloxF9bでのDRiGRを効率
的に実施することができるリコンビナーゼを富化させた。
(工程3:)
第3の工程において、単一のリコンビナーゼライブラリを進化させ、高コピー数プラスミ
ドpDonor-ex8を用い(図14、配列番号:37を参照されたい)、抗生物質による選択及びド
ナーベクターの統合を分割から分離することなく、異なる選択スキームに従って(図14を
参照されたい)、DRiGR 2.0を実施した。これには、ベクターバックボーンpF9(ソース)
(= pDuoF9(ソース)配列番号:21 )中の工程2で作製したライブラリに由来するリコン
ビナーゼコード配列のクローニングを伴う。続いて、ライブラリを既にpDonor-ex8を有す
るエレクトロコンピテント大腸菌XL1-Blue細胞へと形質転換した。形質転換細胞を15 μg
/mlクロラムフェニコール、15 μg/mlカナマイシン、及び1~200 μg/ml L-アラビノース
を含む100 ml LB培地中で増殖させた。このライブラリのサイズは、100,000クローンを超
えた。
第3の工程において、単一のリコンビナーゼライブラリを進化させ、高コピー数プラスミ
ドpDonor-ex8を用い(図14、配列番号:37を参照されたい)、抗生物質による選択及びド
ナーベクターの統合を分割から分離することなく、異なる選択スキームに従って(図14を
参照されたい)、DRiGR 2.0を実施した。これには、ベクターバックボーンpF9(ソース)
(= pDuoF9(ソース)配列番号:21 )中の工程2で作製したライブラリに由来するリコン
ビナーゼコード配列のクローニングを伴う。続いて、ライブラリを既にpDonor-ex8を有す
るエレクトロコンピテント大腸菌XL1-Blue細胞へと形質転換した。形質転換細胞を15 μg
/mlクロラムフェニコール、15 μg/mlカナマイシン、及び1~200 μg/ml L-アラビノース
を含む100 ml LB培地中で増殖させた。このライブラリのサイズは、100,000クローンを超
えた。
翌日、プラスミドDNAを培養物から単離し、1000 ngのDNAを各々1 μlのNdeI、AvrII、P
spXI(制限酵素R1、R2、及びR3―図14及び15を参照されたい)、及びエキソヌクレアーゼ
RecBCDで消化した。リコンビナーゼライブラリをプライマーP3及びP4(配列番号:32及び
33)を用いた誤りを起こしやすいPCRによって増幅させ、PCR産物をカラム上で精製し、制
限酵素SacIびSbfIを用いる消化に付した。続いて、単離したリコンビナーゼライブラリを
pF9(ソース)に再度ライゲーションし、pDonor-ex8を有するエレクトロコンピテント大
腸菌XL1-Blue細胞に形質転換した。形質転換細胞を15 μg/mlクロラムフェニコール、5
μg/mlカナマイシン、及び1~200 μg/ml L-アラビノースを含む100 ml LB培地中で増殖
させた。このようにして、次のサイクルを開始した。3サイクルごとに、DNAシャッフルを
先に記載の通り実施した(Buchholz及びStewartの文献、2001)。11ラウンドのSLiDE DRI
GR(Fig. 14を参照されたい)を実施して、抗生物質による選択をせず、かつドナーベク
ターの統合を分割から分離することなく、標的部位loxF9a及びLoxF9bでのDRiGRを効率的
に実施することができるリコンビナーゼを富化させた。
spXI(制限酵素R1、R2、及びR3―図14及び15を参照されたい)、及びエキソヌクレアーゼ
RecBCDで消化した。リコンビナーゼライブラリをプライマーP3及びP4(配列番号:32及び
33)を用いた誤りを起こしやすいPCRによって増幅させ、PCR産物をカラム上で精製し、制
限酵素SacIびSbfIを用いる消化に付した。続いて、単離したリコンビナーゼライブラリを
pF9(ソース)に再度ライゲーションし、pDonor-ex8を有するエレクトロコンピテント大
腸菌XL1-Blue細胞に形質転換した。形質転換細胞を15 μg/mlクロラムフェニコール、5
μg/mlカナマイシン、及び1~200 μg/ml L-アラビノースを含む100 ml LB培地中で増殖
させた。このようにして、次のサイクルを開始した。3サイクルごとに、DNAシャッフルを
先に記載の通り実施した(Buchholz及びStewartの文献、2001)。11ラウンドのSLiDE DRI
GR(Fig. 14を参照されたい)を実施して、抗生物質による選択をせず、かつドナーベク
ターの統合を分割から分離することなく、標的部位loxF9a及びLoxF9bでのDRiGRを効率的
に実施することができるリコンビナーゼを富化させた。
この方法により、以下のリコンビナーゼ単量体の配列を得た:
工程1の後、R#1(配列番号:34):工程2の後、R#7-B5(配列番号:35)、及び最終工程3
の後、 Rec F9-3(配列番号:36)。
工程1の後、R#1(配列番号:34):工程2の後、R#7-B5(配列番号:35)、及び最終工程3
の後、 Rec F9-3(配列番号:36)。
(実施例4)
治療的設定におけるF9リコンビナーゼを利用するために、F9-1及びF9-2の両方のコード
配列をF9遺伝子のエキソン8の野生型又はPadua突然変異(R338L)に隣接するloxF9a及びl
oxF9aを含むドナー配列とともに送達ベクター(例えば、アデノ随伴ウイルスベクター)
へクローニングする。そのようなベクターの複数コピーでの標的細胞への送達は、ゲノム
中の不活性化突然変異を置換する(図11を参照されたい)。
治療的設定におけるF9リコンビナーゼを利用するために、F9-1及びF9-2の両方のコード
配列をF9遺伝子のエキソン8の野生型又はPadua突然変異(R338L)に隣接するloxF9a及びl
oxF9aを含むドナー配列とともに送達ベクター(例えば、アデノ随伴ウイルスベクター)
へクローニングする。そのようなベクターの複数コピーでの標的細胞への送達は、ゲノム
中の不活性化突然変異を置換する(図11を参照されたい)。
(実施例5)
DRiGDの有用性を実証するため、ヒトゲノムの第7染色体上の特異的DNA配列を切除する
ためのリコンビナーゼを進化させた。
DRiGDの有用性を実証するため、ヒトゲノムの第7染色体上の特異的DNA配列を切除する
ためのリコンビナーゼを進化させた。
第1に、2つの異なるリコンビナーゼライブラリを記載された基質関連指向性進化のプロ
トコル(Buchholz及びStewartの文献、2001及びWO 2002044409 A2―図8を参照されたい)
を使用して進化させた。ライブラリを、最終標的部位Hex1及びHex2の左右の部分部位(He
xL又はHexR)に対して進化させた(図21Aを参照されたい)。HexRについてリコンビナー
ゼライブラリを進化させるため、2つの中間標的部位(HexR1及びHexR2)を使用した(図2
1Bを参照されたい)。進化のプロセスの全体を通じて、新たな突然変異を誤りを起こしや
すいPCR(プライマーP1#及びP2#を使用する)及びDNAシャッフルにより導入し、かつ選択
圧をリコンビナーゼの発現レベルを介してさらに調節した。活性を有するリコンビナーゼ
をそれぞれの標的部位を組換えてベクターに由来する標的部位と隣接した配列を欠失させ
るそれらの能力によって選択した(図8―標準的SLiPE及び図21Bを参照されたい)。
トコル(Buchholz及びStewartの文献、2001及びWO 2002044409 A2―図8を参照されたい)
を使用して進化させた。ライブラリを、最終標的部位Hex1及びHex2の左右の部分部位(He
xL又はHexR)に対して進化させた(図21Aを参照されたい)。HexRについてリコンビナー
ゼライブラリを進化させるため、2つの中間標的部位(HexR1及びHexR2)を使用した(図2
1Bを参照されたい)。進化のプロセスの全体を通じて、新たな突然変異を誤りを起こしや
すいPCR(プライマーP1#及びP2#を使用する)及びDNAシャッフルにより導入し、かつ選択
圧をリコンビナーゼの発現レベルを介してさらに調節した。活性を有するリコンビナーゼ
をそれぞれの標的部位を組換えてベクターに由来する標的部位と隣接した配列を欠失させ
るそれらの能力によって選択した(図8―標準的SLiPE及び図21Bを参照されたい)。
次に、最終標的部位Hex1及びHex2を組換えるために、両方のライブラリ(HexR及びHexL
について得る)を組合わせた。従って、ライブラリ(ライブラリサイズは100,000リコン
ビナーゼよりも大きい)を同じ発現プラスミドにクローニングし、両酵素の転写を一体に
結び付けるオペロン様構造をとる共通の誘導性プロモーターから発現させた(図6のpDUO-
SLiDE DRiGDを参照されたい)。続いて、両方のライブラリを担持するプラスミドをXL-1
blue大腸菌細胞に形質転換した。1 ml SOC培地中1時間細胞を回復させた後、10 μlを15
μg/mlクロラムフェニコールを含むLB寒天プレートに播いた。翌日、32クローンを選択し
、25 μg/mlクロラムフェニコールを含む500 μl LB中で8時間培養した。次に、250 μl
前培養物を25 μg/mlクロラムフェニコールを含む2×5 ml LBに接種するために使用した
。 5 ml培養物のうちの1つにおいて、リコンビナーゼ二量体の発現を誘導するために、1
0μg/ml L-アラビノースを加えた。翌日、プラスミドDNAを単離し、SacI(R2)及びSbfI
(R3)により消化して、誘導試料及び非誘導試料中の組換え効率を評価した。
について得る)を組合わせた。従って、ライブラリ(ライブラリサイズは100,000リコン
ビナーゼよりも大きい)を同じ発現プラスミドにクローニングし、両酵素の転写を一体に
結び付けるオペロン様構造をとる共通の誘導性プロモーターから発現させた(図6のpDUO-
SLiDE DRiGDを参照されたい)。続いて、両方のライブラリを担持するプラスミドをXL-1
blue大腸菌細胞に形質転換した。1 ml SOC培地中1時間細胞を回復させた後、10 μlを15
μg/mlクロラムフェニコールを含むLB寒天プレートに播いた。翌日、32クローンを選択し
、25 μg/mlクロラムフェニコールを含む500 μl LB中で8時間培養した。次に、250 μl
前培養物を25 μg/mlクロラムフェニコールを含む2×5 ml LBに接種するために使用した
。 5 ml培養物のうちの1つにおいて、リコンビナーゼ二量体の発現を誘導するために、1
0μg/ml L-アラビノースを加えた。翌日、プラスミドDNAを単離し、SacI(R2)及びSbfI
(R3)により消化して、誘導試料及び非誘導試料中の組換え効率を評価した。
この方法により、高い効率で切除反応を実施することができる2つのリコンビナーゼの
二量体(クローン#7及びクローン#30)を取得した。正確な切除は、組換えpDUO-SLiDE DR
iGDを配列決定することによって確認された―図22を参照されたい。
二量体(クローン#7及びクローン#30)を取得した。正確な切除は、組換えpDUO-SLiDE DR
iGDを配列決定することによって確認された―図22を参照されたい。
この方法により、以下の対のリコンビナーゼ単量体の配列を得た:
Hex-R-#7:配列番号:46及びHex-L-#7:配列番号:47
Hex-R-#30:配列番号:48及びHex-L-#30:配列番号:49
Hex-R-#7:配列番号:46及びHex-L-#7:配列番号:47
Hex-R-#30:配列番号:48及びHex-L-#30:配列番号:49
引用非特許文献
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
(態様1)
ゲノム中の対象とする配列の部位特異的DNA組換えを誘導することができるDNA組換え酵
素の潜在的標的部位となる配列を同定するための方法であって:
i. 該対象とする配列を含む該ゲノム又はその部分を少なくとも5 bp、最大12 bpの長さ
の潜在的スペーサー配列である2つの配列についてスクリーニングする工程であって、該
潜在的スペーサー配列の一方が該対象とする配列の上流にあり、かつ該潜在的スペーサー
配列の他方が該対象とする配列の下流にあり、かつ該2つの配列が100 kbの最大距離及び1
50 bpの最小距離をとる、前記工程;
ii. 各々の潜在的スペーサー配列について、それらの一方の側の隣接するヌクレオチ
ド、好ましくは10~20ヌクレオチドが、潜在的第1の部分部位を形成すること、及び他方
の側の隣接するヌクレオチド、好ましくは10~20ヌクレオチド、より好ましくは12~15ヌ
クレオチドが、潜在的第2の部分部位を形成することを決定することによって該潜在的標
的部位を同定する工程であって、ここで両方の潜在的部分部位及びそれらの間の該スペー
サー配列により該潜在的標的部位が形成される、前記工程、を含み、
iii. 工程ii.で同定された該潜在的標的部位をさらにスクリーニングして、宿主ゲノ
ム中の(どこにも)出現せず、そのために配列特異的欠失が保証される潜在的標的配列を
選択する、前記方法。
(態様2)
部位特異的DNA組換えを誘導してゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えるこ
とにより、該ゲノム中のヌクレオチド配列を改変することができるデザイナーDNA組換え
酵素を調製するための方法であって:
a) 改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、及
び該改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択
する工程であって、ここで、これら標的部位の配列は同一でなく、各々の標的部位が5~1
2ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチドの第1の部分
部位及び第2の部分部位を含み、態様1記載の工程を工程a)の前に、又はその部分として実
施する、前記工程;
b) a)において基質として選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクタ
ーを使用して、DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリに分子指向性進化法を適用す
る工程を含み、
a)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つ
の該デザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う、前記方法。
(態様3)
前記DNA組換え酵素が欠失に好適であり、かつ前記(潜在的)スペーサー配列が同一で
ある、態様1又は2記載の方法。
(態様4)
前記DNA組換え酵素が置換に好適であり、かつ前記(潜在的)スペーサー配列が同一で
ない、態様1又は2記載の方法。
(態様5)
部位特異的DNA組換えを誘導してゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えるこ
とにより、該ゲノム中のヌクレオチド配列を置換することができるデザイナーDNA組換え
酵素を調製するための方法であって:
a) 改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、及
び該改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択
する工程であって、ここで、これら標的部位の配列は同一でなく、各々の標的部位が5~1
2ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチドの第1の部分
部位及び第2の部分部位を含む、前記工程
b) a)において基質として選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクタ
ーを使用して、DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリに分子指向性進化法を適用す
る工程を含み、
ここで工程bは、ベクター及び合成配列間の組換えを選択するために該第1の標的部位及
び該第2の標的部位を含む該合成配列の存在下実施され、
a)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つ
の該デザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う、前記方法。
(態様6)
前記改変すべきヌクレオチド配列が突然変異、特に点突然変異、フレームシフト突然変
異、欠失、又は挿入を含む配列である、態様1~5のいずれか1項記載の方法。
(態様7)
工程b)で使用する前記ベクターが前記DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリをコ
ードし、かつ前記第1及び第2の標的部位の間にあるネガティブ選択マーカー、より好まし
くは制限酵素の少なくとも1つの固有の認識部位を含む、発現ベクターである、態様1~6
のいずれか1項記載の方法。
(態様8)
前記合成配列が前記第1及び第2の標的部位の間にあるポジティブ選択マーカーを含む、
置換に好適なデザイナーDNA組換え酵素を調製するための態様5~7のいずれか1項記載の方
法。
(態様9)
工程b)を3つの副工程:
i) 前記少なくとも1つのライブラリを人工配列なしで進化させる副工程;
ii) 工程i)の結果として得られる該少なくとも1つのライブラリを、ポジティブ選択マ
ーカーを有する人工配列を使用して進化させる副工程;
iii) 工程ii)の結果として該少なくとも1つのライブラリをポジティブ選択マーカーを
有さない人工配列を用いて得る副工程、で実施する、置換に好適なデザイナーDNA組換え
酵素を調製するための態様5~8のいずれか1項記載の方法。
(態様10)
態様1~9のいずれか1項記載の方法により取得することができる、デザイナーDNA組換え
酵素。
(態様11)
少なくとも2つの異なる単量体を含み、ここで前記酵素が前記ゲノム中に天然に出現す
る2つの標的配列を組換えることにより宿主生物の該ゲノム中での前記部位特異的DNA組換
えを誘導することができ、前記標的部位の配列が同一でなく、好ましくは態様1~9のいず
れか1項記載の方法によって取得することができる、好ましくは態様10記載のデザイナーD
NA組換え酵素。
(態様12)
単量体が配列番号:1(Rec F9-1)による配列、あるいは配列番号1、又は好ましくは配
列番号:28、配列番号:3、若しくは配列番号:5と少なくとも95%の配列同一性、好まし
くは98%の配列同一性を有する配列を含み、かつ単量体が配列番号:2(Rec F9-2)による
配列、あるいは配列番号:2、又は好ましくは配列番号:29、配列番号:4、若しくは配列
番号:6と少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%の配列同一性、より好ましくは98%
の配列同一性を有する配列を含む、態様10又は11記載のデザイナーDNA組換え酵素。
(態様13)
配列番号:1(Rec F9-1)、及び/若しくは配列番号:2(Rec F9-2)、若しくは配列番
号:36(Rec F9-3)、若しくは配列番号:46(Hex-R-#7)、及び/若しくは配列番号:47
(Hex-L-#7)、若しくは配列番号:48(Hex-R-#30)、及び/若しくは配列番号:49(Hex-
L-#30)による配列、配列番号:1及び/若しくは2、若しくは配列番号:36、若しくは配列
番号:46、及び/若しくは配列番号:47、若しくは配列番号:48、及び/若しくは配列番号
:49と、又は好ましくは配列番号:28、29、若しくは3~6から選択される少なくとも1つ
の配列と、少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%の配列同一性、より好ましくは98
%の配列同一性を有する配列を含む、デザイナーDNA組換え酵素。
(態様14)
対象とするヌクレオチド配列を改変するための部位特異的DNA組換えが、第1の標的部位
及び第2の標的部位を組換えることによりゲノム中で誘導され、両方の標的部位が該ゲノ
ム中に天然に出現し、かつそれらが前記デザイナーDNA組換え酵素又は該DNA組換え酵素を
コードする核酸若しくはベクターを導入することにより同一とはならず、ここで該標的部
位が前記対象とする配列を縁取っており、各々の標的部位が5~12ヌクレオチドのスペー
サー配列によって隔てられた10~20ヌクレオチドの第1の部分部位及び第2の部分部位を含
む、医薬における使用のための態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素
、態様9~11のいずれか1項記載のDNA組換え酵素をコードする医薬における使用のための
核酸又はベクター。
(態様15)
両方の標的部位が同一のスペーサー配列を含み、組換えにより前記対象とする配列が欠
失する、態様14記載の医薬における使用のためのデザイナーDNA組換え酵素又は核酸又は
ベクター。
(態様16)
両方の標的部位が同一でないスペーサー配列を含み、さらに所望の配列を縁取る両方の
標的部位を含む合成ドナー配列を提供し、組換えにより前記対象とする配列が該所望の配
列によって置換される、態様14記載の医薬における使用のためのデザイナーDNA組換え酵
素又は核酸又はベクター。
(態様17)
態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸又はベクタ
ー。
(態様18)
配列番号:7(loxF9a)及び配列番号:8(loxF9b)、配列番号:7若しくは8との少なく
とも90%の配列同一性を有する配列、又はこれらに逆相補的な核酸配列から選択される核
酸。
(態様19)
態様17若しくは18記載の核酸若しくはベクターを含む宿主細胞、宿主臓器、若しくは非
ヒト宿主生物、及び/又は態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素。
(態様20)
第1の標的部位及び第2の標的部位を組換えることによりゲノム中の対象とするヌクレオ
チド配列を改変し、ここで両方の標的部位は該ゲノム中に天然に出現し、かつそれらが態
様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様10~13のいずれか1項記
載のDNA組換え酵素をコードする核酸若しくはベクターを導入することにより同一とはな
らない、前記部位特異的DNA組換えを誘導する方法。
(態様21)
そのスペーサー配列が異なる前記第1及び第2の標的部位を選択すること、及び該第1の
標的部位及び該第2の標的部位を含む合成配列をさらに提供することにより前記対象とす
るヌクレオチド配列の置換を誘導し、ここで該第1及び第2の標的部位が所望の配列を縁取
っており、又は同一のスペーサー配列を含む該第1及び第2の標的部位を選択することによ
って該対象とするヌクレオチド配列の欠失を誘導する、態様20記載の方法。
(態様22)
ゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組み換えることによる、部位特異的DNA組換
えにより、該ゲノム中の対象とする配列を置換するためのキットであって:
―態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様17若しくは18記載の
核酸若しくはベクター;
―前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位に隣接する前記対象とする配列と置換する、
所望の配列を含む合成配列、を含む、前記キット。
(態様23)
2つの認識部位の間の部位特異的DNA組換えを触媒する、態様10~13のいずれか1項記載
のデザイナーDNA組換え酵素の使用。
(態様24)
前記対象とする配列をノックアウトされ、又は改変された配列を有する細胞又は多細胞
生物を作製する、態様23記載の使用。
(態様25)
前記標的部位が配列番号:7(loxF9a)及び配列番号:8(loxF9b)と同一であるか、又
はこれらに逆相補的である配列から選択される、態様23記載の使用。
(態様26)
態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様9記載の核酸若しく
はベクターを含む、医薬組成物。
(態様1)
ゲノム中の対象とする配列の部位特異的DNA組換えを誘導することができるDNA組換え酵
素の潜在的標的部位となる配列を同定するための方法であって:
i. 該対象とする配列を含む該ゲノム又はその部分を少なくとも5 bp、最大12 bpの長さ
の潜在的スペーサー配列である2つの配列についてスクリーニングする工程であって、該
潜在的スペーサー配列の一方が該対象とする配列の上流にあり、かつ該潜在的スペーサー
配列の他方が該対象とする配列の下流にあり、かつ該2つの配列が100 kbの最大距離及び1
50 bpの最小距離をとる、前記工程;
ii. 各々の潜在的スペーサー配列について、それらの一方の側の隣接するヌクレオチ
ド、好ましくは10~20ヌクレオチドが、潜在的第1の部分部位を形成すること、及び他方
の側の隣接するヌクレオチド、好ましくは10~20ヌクレオチド、より好ましくは12~15ヌ
クレオチドが、潜在的第2の部分部位を形成することを決定することによって該潜在的標
的部位を同定する工程であって、ここで両方の潜在的部分部位及びそれらの間の該スペー
サー配列により該潜在的標的部位が形成される、前記工程、を含み、
iii. 工程ii.で同定された該潜在的標的部位をさらにスクリーニングして、宿主ゲノ
ム中の(どこにも)出現せず、そのために配列特異的欠失が保証される潜在的標的配列を
選択する、前記方法。
(態様2)
部位特異的DNA組換えを誘導してゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えるこ
とにより、該ゲノム中のヌクレオチド配列を改変することができるデザイナーDNA組換え
酵素を調製するための方法であって:
a) 改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、及
び該改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択
する工程であって、ここで、これら標的部位の配列は同一でなく、各々の標的部位が5~1
2ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチドの第1の部分
部位及び第2の部分部位を含み、態様1記載の工程を工程a)の前に、又はその部分として実
施する、前記工程;
b) a)において基質として選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクタ
ーを使用して、DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリに分子指向性進化法を適用す
る工程を含み、
a)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つ
の該デザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う、前記方法。
(態様3)
前記DNA組換え酵素が欠失に好適であり、かつ前記(潜在的)スペーサー配列が同一で
ある、態様1又は2記載の方法。
(態様4)
前記DNA組換え酵素が置換に好適であり、かつ前記(潜在的)スペーサー配列が同一で
ない、態様1又は2記載の方法。
(態様5)
部位特異的DNA組換えを誘導してゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えるこ
とにより、該ゲノム中のヌクレオチド配列を置換することができるデザイナーDNA組換え
酵素を調製するための方法であって:
a) 改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、及
び該改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択
する工程であって、ここで、これら標的部位の配列は同一でなく、各々の標的部位が5~1
2ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチドの第1の部分
部位及び第2の部分部位を含む、前記工程
b) a)において基質として選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクタ
ーを使用して、DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリに分子指向性進化法を適用す
る工程を含み、
ここで工程bは、ベクター及び合成配列間の組換えを選択するために該第1の標的部位及
び該第2の標的部位を含む該合成配列の存在下実施され、
a)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つ
の該デザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う、前記方法。
(態様6)
前記改変すべきヌクレオチド配列が突然変異、特に点突然変異、フレームシフト突然変
異、欠失、又は挿入を含む配列である、態様1~5のいずれか1項記載の方法。
(態様7)
工程b)で使用する前記ベクターが前記DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリをコ
ードし、かつ前記第1及び第2の標的部位の間にあるネガティブ選択マーカー、より好まし
くは制限酵素の少なくとも1つの固有の認識部位を含む、発現ベクターである、態様1~6
のいずれか1項記載の方法。
(態様8)
前記合成配列が前記第1及び第2の標的部位の間にあるポジティブ選択マーカーを含む、
置換に好適なデザイナーDNA組換え酵素を調製するための態様5~7のいずれか1項記載の方
法。
(態様9)
工程b)を3つの副工程:
i) 前記少なくとも1つのライブラリを人工配列なしで進化させる副工程;
ii) 工程i)の結果として得られる該少なくとも1つのライブラリを、ポジティブ選択マ
ーカーを有する人工配列を使用して進化させる副工程;
iii) 工程ii)の結果として該少なくとも1つのライブラリをポジティブ選択マーカーを
有さない人工配列を用いて得る副工程、で実施する、置換に好適なデザイナーDNA組換え
酵素を調製するための態様5~8のいずれか1項記載の方法。
(態様10)
態様1~9のいずれか1項記載の方法により取得することができる、デザイナーDNA組換え
酵素。
(態様11)
少なくとも2つの異なる単量体を含み、ここで前記酵素が前記ゲノム中に天然に出現す
る2つの標的配列を組換えることにより宿主生物の該ゲノム中での前記部位特異的DNA組換
えを誘導することができ、前記標的部位の配列が同一でなく、好ましくは態様1~9のいず
れか1項記載の方法によって取得することができる、好ましくは態様10記載のデザイナーD
NA組換え酵素。
(態様12)
単量体が配列番号:1(Rec F9-1)による配列、あるいは配列番号1、又は好ましくは配
列番号:28、配列番号:3、若しくは配列番号:5と少なくとも95%の配列同一性、好まし
くは98%の配列同一性を有する配列を含み、かつ単量体が配列番号:2(Rec F9-2)による
配列、あるいは配列番号:2、又は好ましくは配列番号:29、配列番号:4、若しくは配列
番号:6と少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%の配列同一性、より好ましくは98%
の配列同一性を有する配列を含む、態様10又は11記載のデザイナーDNA組換え酵素。
(態様13)
配列番号:1(Rec F9-1)、及び/若しくは配列番号:2(Rec F9-2)、若しくは配列番
号:36(Rec F9-3)、若しくは配列番号:46(Hex-R-#7)、及び/若しくは配列番号:47
(Hex-L-#7)、若しくは配列番号:48(Hex-R-#30)、及び/若しくは配列番号:49(Hex-
L-#30)による配列、配列番号:1及び/若しくは2、若しくは配列番号:36、若しくは配列
番号:46、及び/若しくは配列番号:47、若しくは配列番号:48、及び/若しくは配列番号
:49と、又は好ましくは配列番号:28、29、若しくは3~6から選択される少なくとも1つ
の配列と、少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%の配列同一性、より好ましくは98
%の配列同一性を有する配列を含む、デザイナーDNA組換え酵素。
(態様14)
対象とするヌクレオチド配列を改変するための部位特異的DNA組換えが、第1の標的部位
及び第2の標的部位を組換えることによりゲノム中で誘導され、両方の標的部位が該ゲノ
ム中に天然に出現し、かつそれらが前記デザイナーDNA組換え酵素又は該DNA組換え酵素を
コードする核酸若しくはベクターを導入することにより同一とはならず、ここで該標的部
位が前記対象とする配列を縁取っており、各々の標的部位が5~12ヌクレオチドのスペー
サー配列によって隔てられた10~20ヌクレオチドの第1の部分部位及び第2の部分部位を含
む、医薬における使用のための態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素
、態様9~11のいずれか1項記載のDNA組換え酵素をコードする医薬における使用のための
核酸又はベクター。
(態様15)
両方の標的部位が同一のスペーサー配列を含み、組換えにより前記対象とする配列が欠
失する、態様14記載の医薬における使用のためのデザイナーDNA組換え酵素又は核酸又は
ベクター。
(態様16)
両方の標的部位が同一でないスペーサー配列を含み、さらに所望の配列を縁取る両方の
標的部位を含む合成ドナー配列を提供し、組換えにより前記対象とする配列が該所望の配
列によって置換される、態様14記載の医薬における使用のためのデザイナーDNA組換え酵
素又は核酸又はベクター。
(態様17)
態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸又はベクタ
ー。
(態様18)
配列番号:7(loxF9a)及び配列番号:8(loxF9b)、配列番号:7若しくは8との少なく
とも90%の配列同一性を有する配列、又はこれらに逆相補的な核酸配列から選択される核
酸。
(態様19)
態様17若しくは18記載の核酸若しくはベクターを含む宿主細胞、宿主臓器、若しくは非
ヒト宿主生物、及び/又は態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素。
(態様20)
第1の標的部位及び第2の標的部位を組換えることによりゲノム中の対象とするヌクレオ
チド配列を改変し、ここで両方の標的部位は該ゲノム中に天然に出現し、かつそれらが態
様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様10~13のいずれか1項記
載のDNA組換え酵素をコードする核酸若しくはベクターを導入することにより同一とはな
らない、前記部位特異的DNA組換えを誘導する方法。
(態様21)
そのスペーサー配列が異なる前記第1及び第2の標的部位を選択すること、及び該第1の
標的部位及び該第2の標的部位を含む合成配列をさらに提供することにより前記対象とす
るヌクレオチド配列の置換を誘導し、ここで該第1及び第2の標的部位が所望の配列を縁取
っており、又は同一のスペーサー配列を含む該第1及び第2の標的部位を選択することによ
って該対象とするヌクレオチド配列の欠失を誘導する、態様20記載の方法。
(態様22)
ゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組み換えることによる、部位特異的DNA組換
えにより、該ゲノム中の対象とする配列を置換するためのキットであって:
―態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様17若しくは18記載の
核酸若しくはベクター;
―前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位に隣接する前記対象とする配列と置換する、
所望の配列を含む合成配列、を含む、前記キット。
(態様23)
2つの認識部位の間の部位特異的DNA組換えを触媒する、態様10~13のいずれか1項記載
のデザイナーDNA組換え酵素の使用。
(態様24)
前記対象とする配列をノックアウトされ、又は改変された配列を有する細胞又は多細胞
生物を作製する、態様23記載の使用。
(態様25)
前記標的部位が配列番号:7(loxF9a)及び配列番号:8(loxF9b)と同一であるか、又
はこれらに逆相補的である配列から選択される、態様23記載の使用。
(態様26)
態様10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様9記載の核酸若しく
はベクターを含む、医薬組成物。
Claims (26)
- ゲノム中の対象とする配列の部位特異的DNA組換えを誘導することができるDNA組換え酵
素の潜在的標的部位となる配列を同定するための方法であって:
i. 該対象とする配列を含む該ゲノム又はその部分を少なくとも5 bp、最大12 bpの長さ
の潜在的スペーサー配列である2つの配列についてスクリーニングする工程であって、該
潜在的スペーサー配列の一方が該対象とする配列の上流にあり、かつ該潜在的スペーサー
配列の他方が該対象とする配列の下流にあり、かつ該2つの配列が100 kbの最大距離及び1
50 bpの最小距離をとる、前記工程;
ii. 各々の潜在的スペーサー配列について、それらの一方の側の隣接するヌクレオチ
ド、好ましくは10~20ヌクレオチドが、潜在的第1の部分部位を形成すること、及び他方
の側の隣接するヌクレオチド、好ましくは10~20ヌクレオチド、より好ましくは12~15ヌ
クレオチドが、潜在的第2の部分部位を形成することを決定することによって該潜在的標
的部位を同定する工程であって、ここで両方の潜在的部分部位及びそれらの間の該スペー
サー配列により該潜在的標的部位が形成される、前記工程、を含み、
iii. 工程ii.で同定された該潜在的標的部位をさらにスクリーニングして、宿主ゲノ
ム中の(どこにも)出現せず、そのために配列特異的欠失が保証される潜在的標的配列を
選択する、前記方法。 - 部位特異的DNA組換えを誘導してゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えるこ
とにより、該ゲノム中のヌクレオチド配列を改変することができるデザイナーDNA組換え
酵素を調製するための方法であって:
a) 改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、及
び該改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択
する工程であって、ここで、これら標的部位の配列は同一でなく、各々の標的部位が5~1
2ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチドの第1の部分
部位及び第2の部分部位を含み、請求項1記載の工程を工程a)の前に、又はその部分として
実施する、前記工程;
b) a)において基質として選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクタ
ーを使用して、DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリに分子指向性進化法を適用す
る工程を含み、
a)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つ
の該デザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う、前記方法。 - 前記DNA組換え酵素が欠失に好適であり、かつ前記(潜在的)スペーサー配列が同一で
ある、請求項1又は2記載の方法。 - 前記DNA組換え酵素が置換に好適であり、かつ前記(潜在的)スペーサー配列が同一で
ない、請求項1又は2記載の方法。 - 部位特異的DNA組換えを誘導してゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えるこ
とにより、該ゲノム中のヌクレオチド配列を置換することができるデザイナーDNA組換え
酵素を調製するための方法であって:
a) 改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、及
び該改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択
する工程であって、ここで、これら標的部位の配列は同一でなく、各々の標的部位が5~1
2ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた各々10~20ヌクレオチドの第1の部分
部位及び第2の部分部位を含む、前記工程
b) a)において基質として選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクタ
ーを使用して、DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリに分子指向性進化法を適用す
る工程を含み、
ここで工程bは、ベクター及び合成配列間の組換えを選択するために該第1の標的部位及
び該第2の標的部位を含む該合成配列の存在下実施され、
a)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つ
の該デザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う、前記方法。 - 前記改変すべきヌクレオチド配列が突然変異、特に点突然変異、フレームシフト突然変
異、欠失、又は挿入を含む配列である、請求項1~5のいずれか1項記載の方法。 - 工程b)で使用する前記ベクターが前記DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリをコ
ードし、かつ前記第1及び第2の標的部位の間にあるネガティブ選択マーカー、より好まし
くは制限酵素の少なくとも1つの固有の認識部位を含む、発現ベクターである、請求項1~
6のいずれか1項記載の方法。 - 前記合成配列が前記第1及び第2の標的部位の間にあるポジティブ選択マーカーを含む、
置換に好適なデザイナーDNA組換え酵素を調製するための請求項5~7のいずれか1項記載の
方法。 - 工程b)を3つの副工程:
i) 前記少なくとも1つのライブラリを人工配列なしで進化させる副工程;
ii) 工程i)の結果として得られる該少なくとも1つのライブラリを、ポジティブ選択マ
ーカーを有する人工配列を使用して進化させる副工程;
iii) 工程ii)の結果として該少なくとも1つのライブラリをポジティブ選択マーカーを
有さない人工配列を用いて得る副工程、で実施する、置換に好適なデザイナーDNA組換え
酵素を調製するための請求項5~8のいずれか1項記載の方法。 - 請求項1~9のいずれか1項記載の方法により取得することができる、デザイナーDNA組換
え酵素。 - 少なくとも2つの異なる単量体を含み、ここで前記酵素が前記ゲノム中に天然に出現す
る2つの標的配列を組換えることにより宿主生物の該ゲノム中での前記部位特異的DNA組換
えを誘導することができ、前記標的部位の配列が同一でなく、好ましくは請求項1~9のい
ずれか1項記載の方法によって取得することができる、好ましくは請求項10記載のデザイ
ナーDNA組換え酵素。 - 単量体が配列番号:1(Rec F9-1)による配列、あるいは配列番号1、又は好ましくは配
列番号:28、配列番号:3、若しくは配列番号:5と少なくとも95%の配列同一性、好まし
くは98%の配列同一性を有する配列を含み、かつ単量体が配列番号:2(Rec F9-2)による
配列、あるいは配列番号:2、又は好ましくは配列番号:29、配列番号:4、若しくは配列
番号:6と少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%の配列同一性、より好ましくは98%
の配列同一性を有する配列を含む、請求項10又は11記載のデザイナーDNA組換え酵素。 - 配列番号:1(Rec F9-1)、及び/若しくは配列番号:2(Rec F9-2)、若しくは配列番
号:36(Rec F9-3)、若しくは配列番号:46(Hex-R-#7)、及び/若しくは配列番号:47
(Hex-L-#7)、若しくは配列番号:48(Hex-R-#30)、及び/若しくは配列番号:49(Hex-
L-#30)による配列、配列番号:1及び/若しくは2、若しくは配列番号:36、若しくは配列
番号:46、及び/若しくは配列番号:47、若しくは配列番号:48、及び/若しくは配列番号
:49と、又は好ましくは配列番号:28、29、若しくは3~6から選択される少なくとも1つ
の配列と、少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%の配列同一性、より好ましくは98
%の配列同一性を有する配列を含む、デザイナーDNA組換え酵素。 - 対象とするヌクレオチド配列を改変するための部位特異的DNA組換えが、第1の標的部位
及び第2の標的部位を組換えることによりゲノム中で誘導され、両方の標的部位が該ゲノ
ム中に天然に出現し、かつそれらが前記デザイナーDNA組換え酵素又は該DNA組換え酵素を
コードする核酸若しくはベクターを導入することにより同一とはならず、ここで該標的部
位が前記対象とする配列を縁取っており、各々の標的部位が5~12ヌクレオチドのスペー
サー配列によって隔てられた10~20ヌクレオチドの第1の部分部位及び第2の部分部位を含
む、医薬における使用のための請求項10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵
素、請求項9~11のいずれか1項記載のDNA組換え酵素をコードする医薬における使用のた
めの核酸又はベクター。 - 両方の標的部位が同一のスペーサー配列を含み、組換えにより前記対象とする配列が欠
失する、請求項14記載の医薬における使用のためのデザイナーDNA組換え酵素又は核酸又
はベクター。 - 両方の標的部位が同一でないスペーサー配列を含み、さらに所望の配列を縁取る両方の
標的部位を含む合成ドナー配列を提供し、組換えにより前記対象とする配列が該所望の配
列によって置換される、請求項14記載の医薬における使用のためのデザイナーDNA組換え
酵素又は核酸又はベクター。 - 請求項10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸又はベク
ター。 - 配列番号:7(loxF9a)及び配列番号:8(loxF9b)、配列番号:7若しくは8との少なく
とも90%の配列同一性を有する配列、又はこれらに逆相補的な核酸配列から選択される核
酸。 - 請求項17若しくは18記載の核酸若しくはベクターを含む宿主細胞、宿主臓器、若しくは
非ヒト宿主生物、及び/又は請求項10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素
。 - 第1の標的部位及び第2の標的部位を組換えることによりゲノム中の対象とするヌクレオ
チド配列を改変し、ここで両方の標的部位は該ゲノム中に天然に出現し、かつそれらが請
求項10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は請求項10~13のいずれか1
項記載のDNA組換え酵素をコードする核酸若しくはベクターを導入することにより同一と
はならない、前記部位特異的DNA組換えを誘導する方法。 - そのスペーサー配列が異なる前記第1及び第2の標的部位を選択すること、及び該第1の
標的部位及び該第2の標的部位を含む合成配列をさらに提供することにより前記対象とす
るヌクレオチド配列の置換を誘導し、ここで該第1及び第2の標的部位が所望の配列を縁取
っており、又は同一のスペーサー配列を含む該第1及び第2の標的部位を選択することによ
って該対象とするヌクレオチド配列の欠失を誘導する、請求項20記載の方法。 - ゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組み換えることによる、部位特異的DNA組換
えにより、該ゲノム中の対象とする配列を置換するためのキットであって:
―請求項10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は請求項17若しくは18記
載の核酸若しくはベクター;
―前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位に隣接する前記対象とする配列と置換する、
所望の配列を含む合成配列、を含む、前記キット。 - 2つの認識部位の間の部位特異的DNA組換えを触媒する、請求項10~13のいずれか1項記
載のデザイナーDNA組換え酵素の使用。 - 前記対象とする配列をノックアウトされ、又は改変された配列を有する細胞又は多細胞
生物を作製する、請求項23記載の使用。 - 前記標的部位が配列番号:7(loxF9a)及び配列番号:8(loxF9b)と同一であるか、又
はこれらに逆相補的である配列から選択される、請求項23記載の使用。 - 請求項10~13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は請求項9記載の核酸若
しくはベクターを含む、医薬組成物。
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