JP5336592B2 - 新規な部位特異的組換え酵素とその認識配列を用いた部位特異的組換え方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規な部位特異的組換え酵素とその認識配列を用いた部位特異的組換え方法等に関する。

部位特異的組換えとは、数百塩基対にも及ぶ長い塩基配列によって起こる相同的組換えとは異なり、特定の短い相同的な塩基配列によってＤＮＡが組換えをする現象である。

部位特異的組換え酵素による部位特異的組換えとしては、ファージ由来のCre/loxP系が有名で、大腸菌からマウスまで広く使用されている。

Cre酵素はP1ファージ由来の３４３個のアミノ酸から成る蛋白質でloxP部位と呼ばれる34bpの特異的な塩基配列を認識し、部位特異的組換えを行うことができる。Cre/loxPの特異的組み換えシステムに関しては多くの知見が蓄積されている（特許文献１及び特許文献２）。loxP部位は13塩基、８塩基、及び13塩基の３つの部分に分けることができ、13塩基の配列は相補的なインバーテッドリピート構造となっている一方、８塩基はloxP部位の向きを決める役割を果たす。Lox511やlox2272と呼ばれる変異型のloxPも多く報告されており、変異型のloxP部位を含めて２個のloxPにはさまれたDNA領域の欠損や置換、逆向きにする等の染色体DNA上の遺伝子構造の改変に幅広く利用されている。

更に、部位特異的組換え酵素による部位特異的組換えシステムの他の例として、酵母プラスミド２μ由来のFlp/FRT系（非特許文献１）及び腸内細菌ファージD6由来のDre/rox系（特許文献３）を挙げることが出来る。

このような部位特異的組換えシステムにおいて、部位特異的組換え酵素を組織特異的、細胞特異的、発現時期特異的、又は誘導型等の各種のプロモーターの制御下で発現させることによって、様々な条件付きノックアウト又はノックイン実験動物を作製することが可能である。

特許第２７２１６６６号公報 米国特許４９５９３１７号明細書 米国特許７４２２８８９号明細書

Broach JR, Guarascio VR, Jayaram M., Cell, 1982 May, 29(1):227-34

異なる配列を認識する制限酵素がそれぞれ利用価値があるように、異なる特異配列を認識する部位特異的組換え酵素を互いに他と組み合わせることにより、様々な実験系を構成することが可能となる。従って、新たな部位特異的組換え酵素を提供することが求められている。

本発明者は上記課題を解決すべく研究の結果、新規の部位特異的組換え酵素とその認識配列を同定し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、以下の各態様に係るものである。
［態様１］
以下のポリペプチドから成る部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
（２）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（３）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（４）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体によって認識されるポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド。
［態様２］
以下の塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（１）配列番号１又は７で示される塩基配列；
（２）塩基配列（１）と相補的な塩基配列から成るポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイズする塩基配列であって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；又は、
（３）塩基配列（１）と７０％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列であって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
［態様３］合成ポリヌクレオチドである、請求１又は２記載のポリヌクレオチド。
［態様４］
態様１ないし３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［態様５］
態様４記載のベクターによって形質転換された細胞。
［態様６］
幹細胞である、態様５記載の細胞。
［態様７］
態様１ないし３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが染色体に導入された、ヒト以外のトランスジェニック動物。
［態様８］
齧歯類である、態様７記載のトランスジェニック動物。
［態様９］
以下のポリペプチドから成る部位特異的組換え酵素：
（１）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
（２）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（３）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（４）配列番号２又は８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体によって認識されるポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド。
［態様１０］
組換え型酵素である、態様９記載の部位特異的組換え酵素。
［態様１１］
態様９又は１０記載の部位特異的組換え酵素を特異的に認識する抗体。
［態様１２］
態様９又は１０記載の部位特異的組換え酵素によって認識される配列であって、以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド：
（１）配列番号３〜５、９〜１１又は１３〜１８のいずれかに示される塩基配列；又は
（２）塩基配列（１）において一個又は数個の塩基が欠失、置換又は挿入された塩基配列。
［態様１３］
態様１２記載の２つのオリゴヌクレオチドの間に標的ＤＮＡ領域を含むベクター。
［態様１４］
態様１３記載のベクターによって形質転換された細胞。
［態様１５］
幹細胞である、態様１４記載の細胞。
［態様１６］
染色体の標的ＤＮＡ領域を挟むように態様１２記載の２つのオリゴヌクレオチドが導入された、ヒト以外のターゲッティング動物。
［態様１７］
齧歯類である、態様１６記載のターゲッティング動物。
［態様１８］
態様７又は８記載のトランスジェニック動物、態様１６又は１７記載のターゲッティング動物の交配によって作製された条件付ノックイン又はノックアウト実験動物。
［態様１９］
齧歯類である、態様１８記載の条件付ノックイン又はノックアウト動物。
［態様２０］
標的ＤＮＡ領域を含むヌクレオチド配列において部位特異的組換え方法であって、
（１）標的ＤＮＡ領域を挟むように態様１２記載の塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを該ヌクレオチド配列に導入し、
（２）該標的ＤＮＡ領域を態様９記載の部位特異的組換え酵素と接触させて、該オリゴヌクレオチド部位において部位特異的組換えを生起させる、ことから成る前記方法。
［態様２１］
態様４記載のベクター及び態様１３記載のベクターが導入された形質転換細胞において生起する、態様２０記載の部位特異的組換え方法。
［態様２２］
態様１８又は１９記載の条件付ノックアウト又は実験動物において行なわれる、態様２１記載の部位特異的組換え方法。
［態様２３］
標的ＤＮＡ領域が蛋白質又はその一部をコードする、態様２１又は２２記載の部位特異的組換え方法。
［態様２４］
部位特異的な標的ＤＮＡ領域の欠損、置換、又は逆向きが起こる、態様２１ないし２３のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法。
［態様２５］
態様２１ないし２４のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法を行なうための部位特異的組換え用キットであって、
（１）態様９記載の部位特異的組換え酵素又は該酵素をコードするポリヌクレオチド、
（２）態様１２記載のオリゴヌクレオチド、を含む該キット。

本発明によって、新規な部位特異的組換え酵素（VCre蛋白質及びSCre蛋白質）及びそれらの認識配列から成る特異的組換えシステム等が提供される。

本発明のVCre酵素及びVloxP部位から成る部位特異的組換えシステムの応用例の概要を示す。 発明のVCre酵素及びVloxP部位から成る部位特異的組換えシステムの応用例の概要を示す。 本発明のVCre蛋白質（Sbjct）とCre蛋白質（Query）とのアミノ酸配列の比較を示す。 実施例１においてプロモーター下流に挿入したアミノ酸配列を示す。ここで、下線部（８アミノ酸）は核移行シグナル、及び、四角枠で囲まれた部分はFLAGタグ（抗体認識用ペプチド）を示す。 本発明のVCre酵素及びVloxP部位から成る部位特異的組換えシステムによる部位特異的組換えの結果を示す電気泳動の写真である。 本発明のVCre酵素はCre酵素の認識配列であるloxP部位を認識しないことを示す電気泳動の写真である。 VloxP、VloxM1、及びVloxM2、並びに、loxP及び各種の変異lox部位の塩基配列を比較したものである。 本発明のSCre酵素及びSloxP部位から成る部位特異的組換えシステムの応用例の概要を示す。 発明のSCre酵素及びSloxP部位から成る部位特異的組換えシステムの応用例の概要を示す。 本発明のSCre蛋白質とCre蛋白質とのアミノ酸配列の比較を示す。 本発明のSCre蛋白質とVCre蛋白質とのアミノ酸配列の比較を示す。 本発明のSCre酵素は、Cre酵素の認識配列であるloxP部位、又は、VCre酵素の認識配列であるVloxP部位のいずれをも認識しないことを示す電気泳動の写真である。 本発明のSCre酵素及びSloxP部位から成る部位特異的組換えシステムによる部位特異的組換えの結果を示す電気泳動の写真である。 SloxP部位及びSlox2272部位の検定用プラスミドの構造を示す。 本発明のSCre酵素、並びに、SloxP部位及び及びSlox2272部位を含む検定用プラスミドから成る部位特異的組換えシステムによる部位特異的組換えの結果を示す電気泳動の写真である。 SloxP, loxP, 及びVloxPの塩基配列を比較したものを示す。 予測した組み換え部位をプロモーターとEGFPの遺伝子の間に２カ所配置したプラスミドを示す。 VCre発現細胞で組み換え後に大腸菌に導入し、それらの大腸菌コロニーからプラスミドを精製して元のプラスミドと大きさを比較した電気泳動の写真である。 VCre依存的に発現したEGFPを示す写真である。 Vlox2272部位を２ヶ所もつ検定用のプラスミドを示す。 VloxP同士、Vlox2272同士は組み換えを起こし、VloxPとVlox2272が組み換わるものは検出されないことを示す電気泳動の写真である。 EGFPとDsRedのカセットの両端に２つの変異部位Vlox43 L 及びVlox43Rを配置した検定用のプラスミドの様子を示す。更に、検定用のプラスミドがＶCreと同時に導入された細胞はEGFPからDsRedに発現が変わっていること示す写真（下）である。 EGFPとDsRedのカセットの両端に２つの変異部位SloxV1L及びSloxV1Rを配置した検定用のプラスミドの様子を示す。更に、検定用のプラスミドがＶCreと同時に導入された細胞はEGFPからDsRedに発現が変わっていること示す写真（下）である。 ＥＳ細胞のゲノム上に導入したVloxPサイトで組み換えを起こすことができるかを調べた実験の結果を示す。 大腸菌でのVCreとSCre部位特異的組み換え酵素の発現プラスミドと組み換えテスト用のプラスミドの模式図。 VCreとCreの大腸菌内での組み換え効率と特異性を示す。 SCreとCreの大腸菌内での組み換え効率と特異性を示す。 ClustalW法により並べたCre, VCre, SCreのアミノ酸配列を示す。アスタリスクはアミノ酸が一致していることを示し、「：」は類似アミノ酸を示す。四角で囲まれているアミノ酸はCreの活性中心のアミノ酸を示す。実線の四角はVCreに導入されたアミノ酸変異部位を示している。Ａ−ＮはCreで明らかになっているアルファへリックスの領域を示す。ＤＮＡに接触していると考えられているアミノ酸は上部に丸を描いてある。 VCreの予想活性中心に変異を導入した場合の組み換え効率を測定した結果を示す。 VCre/VloxPシステムを用いたRMCEの模式図。 VCre/VloxPシステムを用いたRMCEの解析の結果を示す電気泳動の写真（１：コントロールのRMCE反応前のプラスミド。２〜１１：RMCE反応後の各プラスミド）。 VCre/VloxPシステムを用いるBAC改変の模式図。 VCre/VloxPシステムによるBAC改変の結果を示す電気泳動の写真である。 発明のVCre/VloxPシステム及びSCre/SloxPシステムを利用した応用例の概要を示す。 発明のVCre/VloxPシステム及びSCre/SloxPシステムを利用した応用例の概要を示す。 発明のVCre/VloxPシステム及びSCre/SloxPシステムを利用した応用例の概要を示す。 発明のVCre/VloxPシステム及びSCre/SloxPシステムを利用した応用例の概要を示す。 発明のVCre/VloxPシステム及びSCre/SloxPシステムを利用した応用例の概要を示す。

本発明の部位特異的組換え酵素（VCre蛋白質又はSCre蛋白質）は、Cre蛋白質の認識部位であるloxP部位とは異なる塩基配列から成るオリゴヌクレオチドを認識し、以下のポリペプチドからなる。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列（３８０個のアミノ酸）又は配列番号８に示されるアミノ酸配列（３７１個のアミノ酸）から成るポリペプチド；
（２）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（３）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
（４）配列番号２又は配列番号８に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体によって認識されるポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド。

上記の（２）〜（４）に記載されたポリペプチドは配列番号２又は配列番号８で示される本発明の部位特異的組換え酵素蛋白質の変異体（以下、これら変異体も含めて、「部位特異的組換え酵素」ともいう）であり、例えば、以下の配列番号１又は配列番号７に示される塩基配列に基づき、当業者に公知の任意の方法、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。

尚、上記の部位特異的組換え酵素のペプチドを適当な場所で分断し、不活性な２個の蛋白質とそれら再構成され活性を持つようになるスプリット蛋白質ができることは当事者であれば推定できる。

上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの好適例は以下の塩基配列を含むものである。
（１）配列番号１又は配列番号７で示される塩基配列；
（２）塩基配列（１）と相補的な塩基配列から成るポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイズする塩基配列であって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列；又は、
（３）塩基配列（１）と７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。

ここで、ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ，２００１）又はＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７）等の当業者に公知の文献に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。

本明細書において、ポリヌクレオチド間のハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。従って、「ストリンジェントな条件下」とは、具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることが出来る。

尚、配列番号１又は配列番号７に示されたコード領域を含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上である塩基配列を含有するポリヌクレオチド等を挙げることができる。

本発明のポリヌクレオチド（配列番号１）はビブリオ菌プラスミドp0908中に含まれる機能未知の遺伝子（配列番号６）に由来するものである（Hazen et al., Appl. Environ. Microboil., Dec. 2007, p.7703-7710）。又、本発明のポリヌクレオチド（配列番号７）は低温菌であるシュワネラ菌のプラスミドであるShewanella sp. ANA-3 plasmid 1中に含まれる機能未知の遺伝子（配列番号１２）に由来するものである（LOCUS CP000470, 278942bp DNA circular BCT 29-NOV-2007 DEFINITION Shewanella sp. ANA-3 plasmid 1, complete sequence. ACCESSION CP000470 AALH01000000 AALH01000001-AALH01000116）。該ポリヌクレオチドは本明細書に記載された配列情報等に基づき作成可能な適当なプローブ又はプライマーＰＣＲを用いて、コロニーハイブリダイズにより取得したり、プライマーＰＣＲにより増幅して調製することが出来る。尚、ＰＣＲは、例えば、サーマルサイクラーとしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製９６００など一般のサーマルサイクラー、及び、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造製）などの一般の市販品を用いて当業者に公知の適当な反応条件を適宜選択して実施することができる。

従って、このような菌株から調製されたポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ又はそのｍＲＮＡからの逆転写によって調製されたｃＤＮＡであり得る。

更に、本発明のポリヌクレオチドは人工遺伝子として当業者に公知の任意の方法で合成することもできる。例えば、配列番号１又は配列番号７で示される塩基配列を含む本発明のポリヌクレオチドは、本明細書の実施例に記載されているように、上記のビブリオ菌プラスミドp0908又はシュワネラ菌のプラスミドであるShewanella sp. ANA-3 plasmid 1中に含まれている遺伝子の塩基配列（配列番号６又は配列番号１２）に基づき、コドン使用頻度をマウスやヒトの哺乳類型に変更し、かつ遺伝子中から発現抑制に関与すると考えられているCpG配列を除いて人工的にデザインし合成した塩基配列である。

尚、塩基配列間及びアミノ酸配列間の相同性（同一性）は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０及びＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブ部位において利用可能である。

本発明の部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターはプラスミド又はウイルス性ベクター等の当業者に公知の任意の形態であり、当業者に公知の任意の方法で容易に調製することが出来る。こうして得られたベクターには、本発明の部位特異的組換え酵素のコード領域以外に、５’および３’に非コード配列（核移行シグナル、タグ配列、非転写配列、非翻訳配列、プロモーター、エンハンサー、サプレッサー、転写因子結合配列、スプライシング配列、ポリＡ付加配列、ＩＲＥＳ、ｍＲＮＡ安定化・不安定化配列等を含む）が適宜含まれており、発現ベクターとして機能する。

ここで、部位特異的組換え酵素は組織特異的、細胞特異的、発現時期特異的、又は誘導型等の各種のプロモーターの制御下で発現させることができる。

このようなベクターを用いた当業者に公知の任意の方法、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、並びに、エレクトロポレーション及びパーティクルガン等の各種物理的方法によって、適当な宿主細胞を容易に形質転換させることが出来る。

宿主細胞に特に制限はなく、例えば、ヒト、サル及びマウス等を含む哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び、大腸菌等の細菌類を用いることができる。こうして作製された形質転換細胞は当業者に公知の任意の条件で培養し、培養した菌体又はその培養上清等の適当な画分から目的とする本発明の部位特異的組換え酵素を組換え型酵素として容易に調製することが出来る。

従って、本発明は、こうして調製された部位特異的組換え酵素を特異的に認識する抗体にも係るものである。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Fab断片抗体、及びFab’断片抗体等の当業者に公知の任意の形態を有するものを挙げることが出来る。これらは当業者に公知の任意の方法によって容易に製造することができる。

更に、宿主細胞として、受精卵、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、各種組織性幹細胞、及び、人工多能性幹細胞（Induced Pluripotent Stem Cell; iPS）等の様々な種類の未分化の多能性細胞を挙げることが出来る。

本発明の部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、マイクロインジェクション等の当業者に公知の任意の方法によってマウス等の齧歯類である実験動物である宿主動物の受精卵に導入した後、仮親の子宮に移植して、該酵素を発現するトランスジェニック動物を作製することが出来る。

本発明の部位特異的組換え酵素は、以下の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（認識配列：VloxP部位又はSloxP部位）を認識して部位特異的組換えを起こす活性を有する。
（１）配列番号３〜５、９〜１１又は１３〜１８のいずれかに示される塩基配列；又は
（２）塩基配列（１）において一個又は数個の塩基が欠失、置換又は挿入された塩基配列。

上記の認識配列は、Cre酵素に対するloxP部位と同様に、１３塩基、８塩基、及び１３塩基の３つの部分を有しており、１３塩基の配列は相補的なインバーテッドリピート構造となっていることが好ましく、一方、８塩基は認識配列の向きを決める役割を果たしていると考えられる。

具体的には例えば、当業者であれば、Cre/loxPシステムの変異lox部位である、lox511, lox2272, lox2372, lox66、及びlox71に準じて容易に変異VloxP部位又は変異SloxP部位を作製し、部位特異的なDNAの欠損、置換、逆向きにするシステムを構築することができる。従って、このような変異VloxP部位又は変異SloxP部位においては１３塩基の配列は必ずしも相補的なインバーテッドリピート構造となっている必要はない。本発明の認識配列の具体例として、実施例に示された配列番号３〜５、９〜１１、又は１３〜１８に示される塩基配列を挙げることが出来る。

従って、上記の適当なベクター内に、少なくとも２つのこのようなオリゴヌクレオチド（認識配列）で挟まれる標的ＤＮＡ領域を有するベクターを作製し、該ベクターを用いて上記の適当な宿主細胞を形質転換して、少なくとも２つの認識配列に挟まれた標的ＤＮＡ領域が、例えば、細胞質内に導入された該ベクター又は染色体ＤＮＡ内に導入された形質転換細胞を得ることができる。このような宿主細胞に特に制限はなく、例えば、ヒト、サル及びマウス等を含む哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び、大腸菌等の細菌類を用いることができる。

更に、このような２つのオリゴヌクレオチドの間に標的ＤＮＡ領域を含むベクターに加えて、上記の部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチドを有するベクターが同じ宿主細胞に導入され、これらによって二重に形質転換された形質転換細胞も本発明に含まれる。このような形質転換細胞においては、部位特異的組換え酵素が特定の条件下で発現すると、部位特異的組換え反応が起こり標的ＤＮＡ領域を特異的に除去することができる。

本発明の少なくとも２つの認識配列で挟まれた標的ＤＮＡ領域を当業者に公知の遺伝子ターゲッティングによって、例えば、ＥＳ細胞に導入してキメラ動物を得、更に、これと野生型動物を交配することによって、該認識配列で挟まれた標的ＤＮＡ領域が導入された、例えば、マウス等の齧歯類であるターゲッティング動物を作製することが出来る。

以上の部位特異的組換え酵素及び該酵素の認識配列から成る部位特異的組換えシステムにおいて、部位特異的組換え酵素を組織特異的、細胞特異的、発現時期特異的、又は誘導型等の各種のプロモーターの制御下で発現させるトランスジェニック動物及びターゲッティング動物を交配することによって、例えば、マウス等の齧歯類である、様々な条件付きノックアウト又はノックイン実験動物を作製することが可能である。

従って、本発明は、標的ＤＮＡ領域を含むヌクレオチド配列における部位特異的組換え方法であって、
（１）本発明の部位特異的組換え酵素の認識配列である塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを標的ＤＮＡ領域を挟むように該ヌクレオチド配列に導入し、
（２）該標的ＤＮＡ領域を本発明の部位特異的組換え酵素と接触させて、該オリゴヌクレオチド部位において部位特異的組換えを生起させる、ことから成る前記方法に係る。

この方法は、２つの認識配列の間に標的ＤＮＡ領域を含むベクターに加えて、部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチドを有するベクターが導入されて二重に形質転換された上記の形質転換細胞、又は、上記の条件付きノックアウト又はノックイン実験動物内において行なうことが可能である。

既に記載したように、部位特異的組換え酵素の認識配列の向き、又は、変異VloxP部位又は変異SloxP部位等を用いることにより、標的ＤＮＡ領域の欠損、置換、及び逆向きを部位特異的に行うことが出来る。

更に、部位特異的組換え用キットであって、
（１）本発明の部位特異的組換え酵素又は該酵素をコードするポリヌクレオチド、及び、
（２）該酵素の認識配列であるオリゴヌクレオチド、を含む該キットも本発明に含まれる。尚、上記のポリヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドは適当なベクター等に挿入された形態でキットに含まれていても良い。

係るキットには、その構成・使用目的などに応じて、更に当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、本発明の部位特異的組換え酵素に対する抗体、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等を適宜含むことが出来る。

既に記載したように、細胞特異的発現のプロモーターと組み合わせることにより、細胞特異的で部位特異的な遺伝子改変を行うことができる。例えば、Ａ細胞とＢ細胞で発現するプロモーターの下でCre蛋白質を発現させ、Ｂ細胞とＣ細胞で発現するプロモーターのもとで本発明の部位特異的組換え酵素を発現させるようにする。このシステムを用いて、Cre蛋白質が存在しているときにだけ本発明の部位特異的組換え酵素が正常な蛋白質ができるようしておくと、最終的にＢ細胞だけで本発明の部位特異的組換え酵素の組み換えを生じさせることができる。

更に、以下に本発明に係る部位特異的組換え酵素及び該酵素の認識配列から成る部位特異的組換えシステムの応用例を挙げ、これらの概要を図１、図２、図８及び図９、更に、図３４〜３８に示す。

A ウイルスベクターと同時に使用
コンデショナルノックアウトを作製するために、2種類の部位特異的組み換え酵素を用いることが通常であるが、ウイルスベクターで導入する場合にもう１種類必要になる。例えば、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターやレトロウイルスはパッケージングやウイルスゲノムへ移すためにCre/loxPのシステムが既に使用されているが、本発明の部位特異的組換えシステムも同様に使用することができる。

B 一つの遺伝子の２本の染色体のそれぞれをコンデショナルノックアウト
ヒト細胞を扱う場合に、マウスのように交配はできないので２本の染色体をそれぞれ改変する必要が生じる。同じ遺伝子の片側のアレルをそれぞれにコンデショナルノックアウトする場合に使用できる。片側のアレルに突然変異をノックインすることにより、突然変異の効果を調べることも可能となる。

C ダブルコンデショナルノックアウト
遺伝子のファミリーが存在する場合、１つの遺伝子の欠損では効果の出ないことがある。その場合に２つの遺伝子を欠損させることにより遺伝子機能を調べる方法が行われる。このような場合にそれぞれの遺伝子を別の部位特異的組み換え酵素の認識部位でははさむと、片方ずつ順番に欠損させることができる。遺伝子重複により遺伝子ファミリーが生じた場合、遺伝子が近傍に存在することが多いので特に複数種類の組み換え部位を用いられることは有効である。

D RMCE法とコンデショナルKOとの組み合わせ
変異の入ったエクソンをハイスループットで導入するためにRMCE法を用いる一方、もう片側のアレルはコンデショナルノックアウトにする。このようなシステムにすることで、片側のアレルをコンデショナルにノックアウトを行い、もう片側のアレルの変異の効果を調べることができる。

E スプライシングのアクセプターをもつ発現カセットを順次使用するシステム
スプライシングのアクセプターをもつ４種類の発現を並べて、必要に応じて組み換え反応で取り除くことができる。スプライシングドナー部位に最も近いスプライシングアクセプター部位が使用されることから、カセットA,B,C,Dを組み換え酵素依存的に発現させることができる。例えば、このシステムを用いると４種類の突然変異を順次発現させることができる。

F タグの交換
蛋白質のC末端部分のタグを順次変えることができる。薬剤抵抗性遺伝子、蛍光蛋白質、酵素などのタグを組み換え酵素依存的に入れ換えることができる。

G BACやプラスミドのモノマー化
Red/ET組み換え法を用いた時にBACやプラスミドがヘテロなマルチマーになってしまうことが知られている。部位特異的な組み換え酵素を用いて、モノマーに変換することができる。

H ２種類のプロモーターを用いてCre発現の細胞特異性を高める
特異性をコンデショナルノックアウトは細胞特異的なプロモーター制御下のCre蛋白質と組み合わせて行うことが多い。２段階でCre蛋白質が発現するようにすることによりプロモーターAとプロモーターBの両方で働く細胞のみでCre蛋白質を発現させることができる。

以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。尚、以下の実施例における各遺伝子操作の手段・条件等は、特に断わりがない限り、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ， １９９５等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示、及び、内容の一部を構成するものである。

Cre蛋白質のアミノ酸配列を用いて、公共のDNAデータベース（Genbank/EMBL/DDBJ）に対してBlastプログラムを用いて相同性検索を行った結果、９８％以上の相同性を示すごく近縁のファージ由来の蛋白質の他に、３０％程度の弱い相同性を示す蛋白質が見出された。その中の１つは塩堆積物中で見つかったビブリオ菌のプラスミドであるp0908上に存在し、該遺伝子がコードする該蛋白質をVCre蛋白質と名づけた。このVCre蛋白質はCre蛋白質とは29％の相同性を示した（図３）。尚、VCre蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２で示す。

部位特異的組換え酵素システムを実行するにあたり、もうひとつ重要なことはこの推定上の組み換え酵素が認識する特異的な塩基配列を決定することである。本発明のVCre蛋白質とCre蛋白質との相同性は29％と低いことから考えて、認識配列も類似性が低いと推測できる。loxP部位が１３塩基、８塩基、１３塩基の３つの部分に分かれていることから、このような構造をとりうる配列をp0908で予測した。その結果、配列番号５で示される塩基配列を見出し、これを「VloxP部位」と名づけた。VCre蛋白質が新規部位特異的組換え酵素であり、その認識配列がVloxPであることを証明するために、コドンユーセージをマウスやヒトの哺乳類型に変更し、かつ遺伝子中から発現抑制に関与すると考えられているCpG配列を除いたものを人工遺伝子（配列番号１）として合成し、更に、VCre蛋白質のN末端部分に核移行シグナル等を付加し、ヒトHEK293細胞で発現するプロモーター（CAGプロモーター）の下に挿入した。尚、このプロモーター下流に挿入したアミノ酸配列を図４に示す。

一方、VloxP部位を完全なインバーテッドリピート構造とするために、VloxPとそれぞれ一塩基の変異を導入したVloxM1（配列番号３）とVloxM2（配列番号４）を認識配列として検定するためのプラスミドとして、これらの配列を約１ｋｂｐの塩基配列の両端に配置したプラスミドを作製した。VCre蛋白質を発現する上記のプラスミドと２個のVloxPを含む検定用のプラスミドを同時にヒトHEK293細胞へFugene6を用いて形質転換し、１日後に細胞からDNAを抽出した。検定用のプラスミドDNAを大腸菌に形質転換することにより回収し、電気泳動によりサイズを比較した（図５）。レーン１は現時点で３種類のVloxの中で組み換え効率が良いと予備的な結果が得られたVloxM1を含む検定用のプラスミドを用いた結果を示している。図５から、VCre蛋白質で欠損させていないレーン２のプラスミドのサイズより約１kbp短くなっていることが明らかである。このプラスミドのVloxM1付近をDNAシーケンサーで塩基配列を決定した結果、予想通りにVloxM1部位で部位特異的に組み変わっていることが明らかになった。

更に、認識配列であるVloxP, VloxM1, VloxM2又はloxP部位を夫々２個持っている検定用のプラスミドと、VCre酵素又はCre酵素を発現させるプラスミドを組み合わせて、実施例１と同様に同時にヒト HEK293に導入後、一日経った時点でDNAを回収し、夫々の認識配列の外側に位置するプラ イマーでPCRを行なった。その結果、VCreとVloxP, VloxM1又はVloxM2 、及び、 CreとloxPのみで（矢印のように）明確な短いバンドが検出できた（図６）。これは、これらの間でのみ、部位特異的な組み換えが起こったことを意味しており、本発明のVCre酵素はCre酵素の認識配列であるloxP部位は認識しないことが確認された。

尚、VloxP, VloxM1, 及びVloxM2、並びに、loxP及び各種の変異lox部位の塩基配列を図７に示す。

Cre蛋白質のアミノ酸配列を用いて、公共のDNAデーターベース（Genbank/EMBL/DDBJ）に対してBlastプログラムを用いて相同性検索を行った結果、９８％以上の相同性を示すごく近縁のファージ由来の蛋白質の他に、３０％程度の弱い相同性を示す蛋白質が見出された。その中の１つは塩堆積物中で見つかった低温菌であるシュワネラ菌のプラスミドであるShewanella sp. ANA-3 plasmid 1上に存在し、該遺伝子がコードする該蛋白質をSCre蛋白質と名づけた。尚、SCre蛋白質のアミノ酸配列を配列番号８で示す。このSCre蛋白質はCre蛋白質とは３１％の相同性を示した（図１０）。又、SCre蛋白質はVCre蛋白質とは４０％の相同性を示した（図１１）。

部位特異的組換え酵素システムを実行するにあたり、もうひとつ重要なことはこの推定上の組み換え酵素が認識する特異的な塩基配列を決定することである。本発明のSCre蛋白質とCre蛋白質との相同性は31％と低いことから考えて、認識配列も類似性が低いと推測できる。loxP部位が１３塩基、８塩基、１３塩基の３つの部分に分かれていることから、このような構造をとりうる配列を上記のシュワネラ菌のプラスミドであるShewanella sp. ANA-3 plasmid 1中で予測した。その結果、配列番号５で示される塩基配列を見出し、これを「SloxC2部位（４０塩基）」と名づけた。更に、元のプラスミドに含まれているSloxC2の配列の両末端から夫々３塩基を除いたものがSloxP部位（配列番号９：３４塩基）、及び、SloxP配列の中央に含まれる８塩基の中の２塩基を変異させたSlox2272部位（配列番号１０）を作製した。

まず、新規部位特異的組換え酵素であるSCre蛋白質と、上記のCre蛋白質及びVCre蛋白質との間の反応特異性（交差反応の有無）に関して検討した。
上記のSCre蛋白質のコドンユーセージをマウスやヒトの哺乳類型に変更し、かつ遺伝子中から発現抑制に関与すると考えられているCpG配列を除いたものを人工遺伝子（配列番号１）として合成し、更に、SCre蛋白質のN末端部分に核移行シグナル（MVPKKKRK）及び抗体認識用ＦＬＡＧタグ（DYKDDDK）を付加し、ヒトHEK293細胞で発現するプロモーター（CAGプロモーター）の下に挿入した。同様にしてCre蛋白質及びVCre蛋白質を夫々発現するプラスミドを作成した。

一方、SloxP部位、loxP部位、及びVloxP部位を夫々認識配列として検定するためのプラスミドとして、これらの配列を約１ｋｂｐの塩基配列の両端に配置したプラスミドを作製した。以上の各部位特異的組換え酵素蛋白質を発現する上記のプラスミドと夫々２個の各認識配列を含む検定用のプラスミドを同時にヒトHEK293細胞へFugene6を用いて形質転換し、１日後に細胞からDNAを回収し、夫々の認識配列の外側に位置するプラ イマーでPCRを行なった。この結果、その結果、SCreとSloxPのみで（矢印のように）明確な短いバンドが検出でき、SCre蛋白質は、Cre/loxP系又は Vcre/VloxP系のいずれの部位特異的組換え系とも交差反応を起こさないことが確認された（図１２）。

更に、検定用のプラスミドDNAを形質転換した大腸菌から抽出し、電気泳動によりサイズを比較した結果、SCreを作用させた場合（レーン２）では、作用させない場合（レーン１）と比べて検定用プラスミドのサイズが予想通り小さくなったことが確認された（図１３）。

次に、SloxP部位及びSlox2272部位を認識配列として検定するためのプラスミドとして、Bsd （ブラストサイジンS不活化酵素）、EGFP（変異型ＧＦＰ）及び Cm（クロラムフェニコールアセチルトランセフェラーゼ）の各遺伝子を各２か所のSloxP部位及びSlox2272部位で挟むようなに配置した検定用のプラスミドを作製した（図１４）。SCre蛋白質を発現する上記のプラスミドとこの検定用のプラスミドを同時にヒトHEK293細胞へFugene6を用いて形質転換し、１日後に細胞からDNAを抽出した。検定用のプラスミドDNAを大腸菌に形質転換することにより回収し、電気泳動によりサイズを比較した（図１５）。レーン１は検定用のプラスミドのみを形質転換した場合、レーン２〜４は夫々、独立した大腸菌コロニーから精製したプラスミドを用いた結果を示している。図１５から、SCre蛋白質によって、SloxP部位同士及びSlox2272部位同士では部位特異的組み換えが起こるが、SloxP部位及びSlox2272部位の間では部位特異的組み換えが起こらないことが明らかとなった。

尚、SloxP, SloxC2, Slox2272, loxP, 及びVloxPの塩基配列を比較したものを図１６に示す。ここで、比較した２つの塩基配列の間で同じ塩基は下線で示し、又、相補的になっていない塩基はボールド（太い字体）で示した。

更に、VCre/VloxP系に関する追加の実験を行った。
まず、予測した組み換え部位をプロモーターとEGFPの遺伝子の間に２カ所配置したプラスミドを作製した（図１７）。この組み換え部位の間にはストップコドンとポリA付加部位があり、VloxP部位で組み換えが起きると、ストップカセットがぬけてEGFPが発現する。これを用いて、実施例１と同様に、ヒトHEK293細胞に導入して、１日後の細胞からDNAを回収して、組み換えが起こっているかどうかを調べた。

回収したDNAを大腸菌に形質転換した後、コロニーからプラスミドを精製して元のプラスミドと大きさを比較した（図１８）。この結果、VloxP部位で組み換わって、サイズが小さくなっているのがわかる。更にこのプラスミドのVloxP付近をシーケンスで調べてみると、VloxPの部分で組み換えが行われていることが確認できた。更に、予想通りにVCre依存的にEGFPの発現が観察された（図１９）。

Cre/loxP系は、色々な変異部位があることで利便性が向上している。そこで、今回の VCre/VloxPシステムでも更に変異型の認識配列を同定することを試みた。loxP部位の有用な変異部位の一つにlox2272がある。この変異部位はコアの８塩基の２ヶ所に変異が導入されており、lox2272同士では組み換えが起きるが、loxPとlox2272の間では組み換えは起きないことが知られている。lox2272で塩基を置換している部分は偶然にもloxPとVloxPでは共通している。そこでこのように変化させたものをVlox2272（配列番号１３）と名付けて変異部位として使用できるかどうかを確認した。

即ち、この部分にVlox2272部位を２ヶ所もつ検定用のプラスミド（図２０）を作製し、実施例１と同様にVCreで反応をさせてみるとVloxP同士、Vlox2272同士は組み換えを起こし、このようなタイプは検出されるが、VloxPとVlox2272が組み換わるものは検出されないことがわかった（図２１）。この結果から、Vlox2272はlox2272と同様のことができる変異部位であることが明らかになった。

更に、lox66/lox71タイプの変異部位を同定することを試みた。このタイプの変異部位は向かい合った認識部位で反転するが、一度反転すると２重の変異部位ができてしまい、再度反転する効率は著しく下がることが知られている。外側の５塩基がランダムな配列になるようにしたオリゴを用いて、ランダムライブラリーから望ましい変異部位を下記のようにスクリーニングした。外側の５塩基にランダム塩基を含んだ認識部位の間にカナマイシン抵抗性遺伝子を逆向きに配置し、VCre発現プラスミドと同時に実施例１と同様に細胞に導入した後に、プラスミドを回収して大腸菌に形質転換して、カナマイシン抵抗性遺伝子が反転してGSTと融合し、カナマイシン抵抗性を示すプラスミドを選択した。得られたプラスミドのシーケンスを行い配列を確認した。次に、再度反転しにくいクローンを選ぶために、こうして選択したカナマイシン抵抗性プラスミドを何個か混ぜてもう一度VCre発現プラスミドと同時に導入した。再度反転したものはカナマイシン感受性になるため、このようにしてスクリーニングしたクローンをシーケンスして反転しにくい配列を選んだ。

その結果、２つの変異部位Vlox43R（配列番号１４）及びVlox43 L（配列番号１５）が選択された。これらが反転することを確認するために、EGFPとDsRedのカセットの両端に変異部位を配置した（図２２）。この部分のカセットが反転すると発現がEGFPからDsRedに換わることが期待される。VCre発現プラスミドとVlox43Lと Vlox43Rを含む検定用のプラスミドを実施例１と同様に同時にHEK293細胞に発現させた。図２２に示すパネルaとb、cとdは同視野の写真であり、検定用のプラスミドがＶCreと同時に導入された細胞はEGFPからDsRedに発現が変わっていることが明確に示されている。

同様に、SloxP部位に関してもlox66/lox71タイプの変異部位を同定した。SloxPの場合は、 Vlox43L及びVlox43Rの時のようなスクリーニングを行わずlox66とlox71の配列に導入されている塩基置換と似た変異を導入した。反転することを確認するために、EGFPとDsRedのカセットの両端に変異サイトを配置した（図２３）。この部分のカセットが反転すると発現がEGFPからDsRedに換わることが期待される。SCre発現プラスミドとSloxV1R（配列番号１６）及びSloxV1L（配列番号１７）を含む検定用のプラスミドを実施例１と同様に同時にHEK293細胞に発現させた。図２３に示すパネルaとb、cとdは同視野の写真であり、検定用のプラスミドがSCreと同時に導入された細胞はEGFPからDsRedに発現が変わっていることが明確に示されている。

以上のVCre/VloxP系及びSCre/SloxP系における変異部位（下線が変異箇所を示す）の代表例の塩基配列を以下の表１に示す。又、VCre及びSCre蛋白質の間のアミノ酸配列の比較を表２に示す。

更に、ＥＳ細胞のゲノム上に導入したVloxPサイトは組み換えを起こすことができるかを調べた（図２４）。loxPサイトとlox2272サイトを用いたＲＭＣＥ法でLin28発現マウスES細胞の片側の染色体のＣ末端のEGFPタグをDsRedタグと交換した。蛍光顕微鏡によって、細胞内のEGFPの分布（Ｂ，b,e）及びDsRedの分布（Ｂ，c,f）を示した（スケールバー１０μm）。更にもう片側の染色体のLin28遺伝子のエクソン３をVloxPサイト挟んだES細胞を作製した (C)。エレクトロポレーション法でVCre発現プラスミドを導入し、シングルコロニー化したＥＳ細胞をＰＣＲで検定した。ＰＣＲ分析（Ｄ）、サザンハイブリダイゼーション（Ｅ）及びイムノブロット（Ｆ）の結果から、VloxPで挟まれた部分が欠損され、断片が短くなっていることと、その結果として 内在性のLin28蛋白質が消失したことがわかる。

更に、大腸菌でもVCre/VloxPとSCre/SloxPが使用できるかどうかを確認し、変異タンパク質の効率を測定した。更に、BAC改変にも利用できるかどうかを調べた。

heat shockで誘導ができ、３２度でプラスミドが維持できるが３７度でプラスミドが不安定になりプラスミドを除去できるpSIMシステムのプラスミドにVCreとSCreを導入し、発現をさせた。VCreとSCre のDNAは各菌のプラスミドのオリジナルなものではなく、実施例１及び実施例３で作製したマウスとヒトのコドン使用頻度に最適化したDNAを用いた。BACや高コピーのプラスミドと共存できるように、ori１０１のオリジンを使用した。このプラスミドは温度感受性のオリジンであり、熱ショックにより除去することができる。また、温度感受性のcI857のリプレッサーにより制御されており、４２度で発現誘導がかかる。

図２５で示すように、カナマイシン抵抗性のプラスミド上にアンピシリン抵抗性の遺伝子をVloxPサイトではさみ、同じプラスミド上でクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子の両端にloxPサイトを挟んだプラスミドを４２℃で１５分間の誘導後にエレクトロポレーション法で形質転換し、２時間のインキュベート後に各薬剤耐性のプレートにまき、翌日コロニーの増殖の有無を調べた。さらに、確認するためにカナマイシンプレートのコロニーをランダムに１００個選び、アンピシリンとクロラムフェニコールのプレートで育てた。

その結果、アンピシリンのプレートではVCreを発現させた大腸菌は生えてこないが、Cmではすべて生えてくることから、VloxPサイトでは組み換えが起こるがloxPサイトでは全く組み換えが起こらなかったが確認された（図２６）。又、VCreではほぼ９９％組み換えが起こったプラスミドのシーケンスを確認してみると、同じ向きに並べた２個のVloxP間で期待通りに正確に組み換えが起こっていることが明らかになった。一方、VCre等の組み換え酵素を発現しない空ベクターでは全く組み換えが起こらなかった。このように、ＢＡＣ等を含めたプラスミドで部位特異的な組み換えを起こさせる便利なプラスミドを作製した。

SCreも同様に大腸菌内で活性を示すことが明らかになった（図２７）。今回は１３ベースのインバーティッドリピートをパーファクトマッチに戻したSloxM1を用いた。９９％は組み換わっていた。シーケンスでも確認ができた。

CreとSCreとCreのアミノ酸配列を比較してみると、３０％程度しか相同性がないにも関わらず、Creで活性中心と考えられているアミノ酸は良く一致していた（図２８）。３次元予測の結果もCreの構造と一致していた。そこで、VCre酵素もCreと同様のアミノ酸を用いて活性中心を作り出しているかどうかを調べるために、VCreの変異の効果を調べた。

Flpの変異実験の結果から認識サイトのDNAにニックを入れ、ニックの部位でDNAとタンパク質の結合が起こるが、その後の組み換えの反応が起こらない変異が知られている。Cre, VCre, SCreの相同性は非常に低いが一部分で似ている部分が存在するのであるが、Flpの上記の変異の部位はこの相同領域に存在する。そこで、Creから推定される活性中心のチロシン残基とFlpから推定されるヒスチジン残基の変異がVCreでも同様の効果があるかを知るためにH314LとY349Fの変異を導入し、組み換えの活性を調べた。H314LとY349FともにVloxPで組み換えを起こす活性は見いだせなかった（図２９）。Creから推定された活性中心の変異（Y349F）と Flpから推定された認識サイトでニックを入れDNAと共有結合したまま離れない変異（H314L）がVCreでも同様の変異体であることが明らかになった。以上のことから、Creと構造的にも良く似た酵素であることが明らかになった。

loxPの変異と同様の効果があるVloxPとSloxPサイトの変異を見出している。その中の一つのVlox2272はVlox2272同士では組み換えが起きるが、Vlox2272とVloxPとの間では組み換えが起きない。このことを利用して、RMCE法をできるかどうかを確認してみた。

VCre発現大腸菌にpVloxP-Bsn-VloxP-Vlox2272-Cm-Vlox2272のプラスミドとVloxP-amp-Vlox2272のカセットを形質転換した結果（図３０）、amp耐性の大腸菌が得られた。得られたプラスミドをシングルサイトであるSnaBIで切断後、電気泳動を行った（図３１）。シーケンスの結果から正しく組み変っていることがわかった。その結果、RMCE法でカセットは導入できることが明らかになった。更に精製VCre蛋白質を用いても組み換えが起こることが明らかになった。このように、大腸菌の中でＲＭＣＥ法により、プラスミドとカセットのVloxP間の組み換えが起こり、カセット導入が可能であることが明らかになった。

VloxPとVlox2272が２ヶ所あることから、6816bp, 6029bp, 5707bp、4920bpとなる可能性があるが、シーケンスの結果よりすべて小さいタイプであることが確認された。このことは例え最初に内側のVloxPサイトやVlox2272サイトに挿入されたとしても、２回目のVloxP同士やVlox2272同士の組み換えが起こり、最終的には最も短い形になるものと思われる。大腸菌のヒートショックのこの系はタンパク質の誘導とオリ１０１の不安定化が同時に起こるので、一過的にVCreタンパク質が誘導されて、タンパク質の一回のターンオーバーと大腸菌の分裂によるタンパク濃度の希釈される短い時間の間に複数回の部位特異的な組み換えが起こるのだと考えられる。

次にBACの改変には制限酵素サイトを用いないＲｅｄ組み換えシステムをしばしば使用するが、導入した薬剤カセットを除去する用途のためにVCre/VloxPシステムを使用できることを確認した。
pBACe3.6は非常によく使われるBACであるがloxPサイトとlox511サイトをベクター内に持っている。NanogはiPS化の指標として用いられる遺伝子であり、Nanogプロモーターの制御下でマーカー蛋白質や薬剤耐性マーカーを発現させて、iPS化のマーカーとして使用する用途がある。このことからヒトゲノムDNAを含むBACを改変して、Nanogの開始ATGの直下にピューロマイシン抵抗性遺伝子をRed組み換えを用いて改変した後に、Red組み換えのために使用したBsd薬剤耐性カセットをVCre/VloxPを取り除くことにした（図３２）。得られたBACクローンを図３２のＰＣＲプライマー（Ｆ，Ｒ）で増幅した結果、VloxPで挟まれたBsd薬剤選択マーカー遺伝子部分が除かれていることがわかる（図３３）。BACをRed組み換え法を用いて改変するためは薬剤選択マーカー遺伝子部分が必要であるが、細胞やマウス受精卵に導入する時には、薬剤選択マーカー遺伝子部分が邪魔する可能性があるので、取り除く必要が生じる。このように不要となった薬剤選択マーカー遺伝子部分を取り除くために、VCre/VloxPシステムは有効であることが示された。

本発明に係る部位特異的組換え酵素及び該酵素認識配列から成る部位特異的組換えシステムを、既に知られているCre/loxP及び Flp/FRTシステムと組み合わせることにより、様々な実験を行うことができる。例えば、幅広い生物種の培養細胞およびマウスES細胞やヒトiPS細胞でVCre/VloxP又はSCre/SloxPシステムで利用することができる。

本発明の上記システムの応用例として、既に記載した例のほかに、更に、例えば、図３４〜３８に示されるような以下の例を挙げることが出来る。例えば、図３７において示されるように、人工染色体を作製する時に分解用の部位としてSloxP部位を数十カ所導入しておく。また、興味ある遺伝子を人工染色体へ導入部位として使用するために、Cre/loxPの系のlox66/lox71に相当する変異部位を図のようにNeoとPuro遺伝子の直前に VloxP 又はSloxPの変異部位を入れた交換用のプラスミドに導入しておく。これらのことによりVCre又はSCre依存的に興味ある遺伝子を人工染色体に導入することができる。また、人工染色体が不要になった場合には、VCre又はSCre蛋白質を発現させることにより人工染色体を分解、除去するシステムを構築することができる。尚、組み換え酵素依存的に人工染色体を消失させる系は、これらの部位特異的組換え酵素以外の他の組み換え酵素システムでも可能であるので、特にVCre/VloxP及びSCre/SloxPに限定されるものではない。

本発明は大腸菌を含む産業上有用な微生物の染色体DNAの改変に用いられるだけでなく、大腸菌内で維持されるBACクローンの改変に用いることができる。コドンユーセージを大腸菌型に換えることで効率が上がることは、当事者であれば容易に想像できる。更に、コファクターの存在が必要ないことは本明細書の実施例から証明されているので、大腸菌で本発明のVCre蛋白質を発現させ、試験管内で組み換えを起こすことは可能である。

iPSから導入したiPS化因子の遺伝子を特異的に除去することが可能となる。更に、病態モデル動物にも使用することができる。ヒトおよびマウスの人工染色体上の改変や遺伝子導入にも用いることができる。

更に、本発明において、VCreとSCreの活性中心やＤＮＡ認識ドメインはCre蛋白質と同じであり、同じ機構を使用していることが明らかになった。このことからCreで得られている多くの実験結果がVCreやSCreにも使用できるであろう。特にCreの構造解析でえられた、Creのどのアミノ酸が認識サイトのDNA配列と直接相互作用を及ぼすかが分かっているので、その部分のアミノ酸がVCreとSCreのではどのように変化しているかという知見と、認識サイトはどのように変わっているかの知見を検討することは非常に有益であろう。

Claims (14)

1. 以下のポリペプチド：
   （１）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド；
   （２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド；又は、
   （３）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであって、（１）のポリペプチドの部位特異的組換え酵素活性を有するポリペプチド、
   から成る部位特異的組換え酵素によって認識される配列であって、配列番号３〜５、又は１３〜１５のいずれかに示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
2. 請求項１記載の２つのオリゴヌクレオチドの間に標的ＤＮＡ領域を含むベクター。
3. 請求項２記載のベクターによって形質転換された細胞。
4. 幹細胞である、請求項３記載の細胞。
5. 染色体の標的ＤＮＡ領域を挟むように請求項１記載の２つのオリゴヌクレオチドが導入された、ヒト以外のターゲッティング動物。
6. 齧歯類である、請求項５記載のターゲッティング動物。
7. 請求項５又は６記載のターゲッティング動物、及び、請求項１記載の部位特異的組換え酵素をコードするポリヌクレオチドが染色体に導入されたヒト以外のトランスジェニック動物の交配によって作製された条件付ノックイン又はノックアウト実験動物。
8. 齧歯類である、請求項７記載の条件付ノックイン又はノックアウト実験動物。
9. 標的ＤＮＡ領域を含むヌクレオチド配列における部位特異的組換え方法であって、
   （１）標的ＤＮＡ領域を挟むように請求項１記載の塩基配列からなる２つのオリゴヌクレオチドを該ヌクレオチド配列に導入し、
   （２）該標的ＤＮＡ領域を請求項１記載の部位特異的組換え酵素と接触させて、該オリゴヌクレオチド部位において部位特異的組換えを生起させる、ことから成る前記方法。
10. 請求項２記載のベクターが導入された形質転換細胞において生起する、請求項９記載の部位特異的組換え方法。
11. 請求項７又は８記載の条件付ノックイン又はノックアウト実験動物において行なわれる、請求項１０記載の部位特異的組換え方法。
12. 標的ＤＮＡ領域が蛋白質又はその一部をコードする、請求項９ないし１１のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法。
13. 部位特異的な標的ＤＮＡ領域の欠損、置換、又は逆向きが起こる、請求項９ないし１２のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法。
14. 請求項９ないし１３のいずれか一項に記載の部位特異的組換え方法を行なうための部位特異的組換え用キットであって、
    （１）請求項１記載の部位特異的組換え酵素又は該酵素をコードするポリヌクレオチド、及び
    （２）請求項１記載のオリゴヌクレオチド、を含む該キット。