ES2600892T3 - Partículas de administración de tipo virión para moléculas de ARN autorreplicante - Google Patents

Partículas de administración de tipo virión para moléculas de ARN autorreplicante Download PDF

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Christian Mandl
Derek O'hagan
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Abstract

Una partícula sin virión que no comprende una cápside proteica, para la administración in vivo de ARN en una célula de vertebrado, en la que (a) la partícula es un liposoma y comprende un material de administración que encapsula una molécula de ARN autorreplicante que codifica un inmunógeno, en la que el inmunógeno es un polipéptido de superficie y puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito, y (b) el ARN no incluye nucleótidos modificados y, opcionalmente, incluye una caperuza en 5'.

Description

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DESCRIPCION
Partmulas de administracion de tipo virion para moleculas de ARN autorreplicante Campo de la tecnica
La presente invencion esta en el campo de la administracion no vmca de ARN autorreplicante para inmunizacion. Tecnica anterior
La administracion acidos nucleicos para inmunizar animales ha sido un objetivo durante varios anos. Se han probado diversos enfoques, incluyendo el uso de ADN o ARN, de vehmulos de administracion vmcos o no vmcos (o incluso sin vehmulo de administracion, en una vacuna "desnuda"), de vectores replicantes o no replicantes o de vectores vmcos o no vmcos. Zhou y col., (Human Gene Therapy, 1999, vol. 10, no. 16, p. 2719-2724) y Saeki y col., (Human Gene Therapy, 1997, vol. 8, no. 17, p. 2133-2141) usaron liposomas HVJ, que comprendfan una capside proteica. Levine y col., (Nature Immunology, 2004, vol. 5, n.°. 5, pag. 460-464) notifican el empaquetamiento del ARN replicon en viriones. Mockey y col., (Cancer Gene Therapy, 2007, vol. 14, n.° 9, pag. 802-814) y Martinon y col., (European Journal of Immunology, 1993, vol. 23, n.° 7, pag. 1719-1722) libran ARNm pero no ArN autorreplicante. Cannon y col., (DNA and Cell Biology, 2002, vol. 21, n.° 12, pag. 953-961) comunican datos en los que el ARN se empaqueto en viriones, se uso en forma desnuda o se adsorbio a partmulas de oro.
Sigue habiendo una necesidad de mas y mejores vacunas de acido nucleico y, en particular, de formas mejoradas para administrar vacunas de acidos nucleicos.
Divulgacion de la invencion
De acuerdo con la invencion, la inmunizacion con acido nucleico se logra mediante la administracion de un ARN autorreplicante encapsulado dentro de partmula pequena. El ARN codifica un inmunogeno de interes y la partmula puede administrar este ARN simulando la funcion administracion de un virus natural.
Por tanto, la invencion proporciona una partmula sin virion que no comprende una capside proteica, para la administracion in vivo de ARN en una celula de vertebrado, en la que la partmula es un liposoma y comprende un material de administracion que encapsula una molecula de ARN autorreplicante que codifica un inmunogeno, en el que el inmunogeno es un polipeptido de la superficie y puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo contra una bacteria, un virus, un hongo o un parasito, y el ARN no incluye nucleotidos modificados y, opcionalmente, incluye una caperuza en 5'. Estas partmulas son utiles como componentes en composiciones farmaceuticas para la inmunizacion de sujetos contra diversas enfermedades. La combinacion de la utilizacion de una partmula sin virion para administrar un ARN autorreplicante proporciona una manera de provocar una respuesta inmunitaria fuerte y espedfica contra el inmunogeno al tiempo que administra solamente una dosis baja de ARN. Ademas, estas partmulas pueden fabricarse facilmente a una escala comercial.
La partcula
Las partmulas de la invencion son partmulas sin viriones, es decir, no son un virion. Por tanto, la partmula no comprende una capside proteica. Al evitar la necesidad de crear una partmula de la capside, la invencion no requiere una lmea celular de empaquetamiento, permitiendo de este modo un escalado mas facil para la produccion comercial y la reduccion al mmimo riesgo de que se produzcan inadvertidamente virus infecciosos peligrosos.
En lugar de encapsular el ARN en un virion, las partmulas de la invencion se forman a partir de un material de administracion. Diversos materiales son adecuados para formar partmulas que pueden administrar ARN a una celula de vertebrado in vivo. Los materiales de administracion de particular interes son los lfpidos anfffilos que pueden formar liposomas. Cuando la administracion es por liposoma, el ARN debe estar encapsulado.
Por lo tanto, una realizacion de una partfcula de la invencion comprende un liposoma que encapsula una molecula de ARN autorreplicante que codifica un inmunogeno, tal como se define en las reivindicaciones. Las partfculas son, preferiblemente, sustancialmente esfericas.
El ARN esta encapsulado dentro de las partfculas (la partfcula es un liposoma). Esto significa que el ARN dentro de las partfculas esta (como en un virus natural) separado de cualquier medio externo por el material de administracion y se ha descubierto que la encapsulacion protege al ARN de la digestion de la ARNasa. La encapsulacion puede adoptar diversas formas. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion (como en un liposoma unilamelar), el material de administracion forma una capa exterior alrededor de un nucleo acuoso que contiene ARN. Las partfculas pueden incluir algunos ARN externo (por ejemplo, en la superficie de las partfculas), pero al menos la mitad del ARN (y, preferiblemente, todo el) esta encapsulado. La encapsulacion en liposomas es distinta de, por ejemplo, los complejos de lfpido/ARN divulgados en la referencia 1.
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Liposomas
Varios Ifpidos anfifflicos pueden formar bicapas en un ambiente acuoso para encapsular un nucleo acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos ffpidos pueden tener un grupo de cabeza hidrofilo anionico, cationico o zwitterionico. La formacion de liposomas a partir de fosfoffpidos anionicos se remonta a la decada de 1960 y los ffpidos cationicos formadores de liposomas se llevan estudiando desde la decada de 1990. Algunos fosfoffpidos anionicos, mientras que otros son zwitterionicos y otros son cationicos. Entre las clases adecuadas de fosfoffpidos se incluyen, pero no se limitan a, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas, y fosfatidilgliceroles, y algunos fosfoffpidos utiles se enumeran en la tabla 1. Entre los ffpidos cationicos utiles se incluyen, pero no se limitan a, dioleoil trimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-disteariloxi-N, N-dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2- dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DoDmA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2- dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Entre los ffpidos zwitterionicos se incluyen, pero no se limitan a, ffpidos zwitterionicos de acilo y ffpidos zwitterionicos de eter. Ejemplos de ffpidos zwitterionicos utiles son DPPC, DOpC y dodecilfosfocolina. Los ffpidos pueden ser saturados o insaturados. Se prefiere el uso de al menos un ffpido insaturado para preparar liposomas. Un ffpido insaturado tiene dos colas, ambas colas pueden ser insaturadas o puede tener una cola saturada y una cola insaturada.
Las parffculas liposomicas de la invencion pueden formarse a partir de un unico ffpido o de una mezcla de ffpidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de ffpidos anionicos (ii) una mezcla de ffpidos cationicos (iii) una mezcla de ffpidos zwitterionicos (iv) una mezcla de ffpidos anionicos y ffpidos cationicos (v) una mezcla de ffpidos anionicos y ffpidos zwitterionicos (vi) una mezcla de ffpidos zwitterionicos y ffpidos cationicos o (vii) una mezcla de ffpidos anionicos, ffpidos cationicos y ffpidos zwitterionicos. Del mismo modo, una mezcla puede comprender ffpidos tanto saturados como insaturados. Por ejemplo, una mezcla puede comprender DSPC (zwitterionico, saturado), DlinDMA (cationico, insaturado), y/o DMG (anionico, saturado). Cuando se usa una mezcla de ffpidos, no todos de los ffpidos de los componentes en la mezcla tienen que ser anfifflicos, por ejemplo uno o mas ffpidos anfifflicos se pueden mezclar con colesterol.
La parte hidrofila de un ffpido puede estar PEGilada (es decir, modificada mediante union covalente de un polietilenglicol). Esta modificacion puede aumentar la estabilidad y evitar la adsorcion no espedfica de los liposomas. Por ejemplo, los ffpidos se pueden conjugar con PEG usando tecnicas tales como las divulgadas en la referencia 2 y 3. Se pueden utilizar varias longitudes de PEG, por ejemplo, entre 0,5-8 kDa.
En los ejemplos se usa una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol.
Las parffculas de liposomas se suelen dividir en tres grupos: vesfculas multilamelares (VML); vesfculas unilamelares pequenas (VUP); y vesfculas unilamelares grandes (VUG). Las VML tienen multiples bicapas en cada vesfcula, formando varios compartimentos acuosos separados. Las VUP y las VUG tienen una sola bicapa que encapsula un nucleo acuoso; las VUP normalmente tienen un diametro < 50 nm, y las VUG tienen un diametro> 50 nm. Las parffculas liposomicas de la invencion son, idealmente, VUG con un diametro en el intervalo de 50 a 220 nm. Para una composicion que comprende una poblacion de VUG con diferentes diametros: (i) al menos un 80 % en numero debe tener diametros en el intervalo de 20 a 220 nm, (ii) el diametro promedio (Zav, por intensidad) de la poblacion esta, idealmente, en el intervalo de 40-200 nm, y/o (iii) los diametros deben tener un mdice de polidispersidad < 0,2. Se espera que los complejos liposoma/ARN de la referencia 1 tengan un diametro en el intervalo de 600-800 nm y tengan una polidispersidad alta.
Las tecnicas para preparar liposomas adecuados son bien conocidas en la materia, por ejemplo, veanse las referencias 4 a 6. Un procedimiento util se describe en la referencia 7 y consiste en mezclar (i) una solucion etanolica de los ffpidos (ii) una solucion acuosa del acido nucleico y (iii) tampon, seguido de la mezcla, equilibrio, dilucion y purificacion. Los liposomas preferidos de la invencion se pueden obtener mediante este procedimiento de mezcla.
El ARN
Las parffculas de la invencion incluyen una molecula de ARN autorreplicante que (a diferencia del ARNip) codifica un inmunogeno. Despues de la administracion in vivo de las parffculas, el ARN se administra de las parffculas y se traduce dentro de una celula para proporcionar el inmunogeno in situ.
A diferencia de referencia 13, el ARN en las parffculas de la invencion es autorreplicante. Una molecula de RNA autorreplicante (replicon) puede, cuando se administra a una celula de vertebrado, incluso sin ninguna protema, conducir a la produccion de multiples ARN hija mediante transcripcion de sf mismo (a traves de una copia antisentido que se genera a partir de sf mismo). Una molecula de RNA autorreplicante es, por tanto, tfpicamente una molecula de hebra - + que se puede traducir directamente despues de la administracion a una celula, y esta traduccion proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que luego produce transcritos tanto sentido como antisentido a partir del ARN administrado. Por tanto, el RNA administrado conduce a la produccion de multiples ARN hijas. Estos ARN hija, asf como los transcritos subgenomicos colineales, pueden traducirse a sf mismos para proporcionar la expresion in situ de un inmunogeno codificado, o pueden transcribirse para proporcionar mas transcripciones con el mismo sentido que el ARN administrado, que se traducen para proporcionar la expresion in
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situ del inmunogeno. Los resultados globales de esta secuencia de transcripciones es una amplificacion enorme del numero de ARN replicones introducidos y, por tanto, el inmunogeno codificado se convierte en un producto polipeptidico importante de las celulas.
Un sistema adecuado para la consecucion de la autorreplicacion de esta manera es utilizar un replicon basado en alfavirus. Estos replicones son ARN de hebra + - que conducen a la traduccion de una replicasa (o replicasa transcriptasa) despues de la administracion en una celula. La replicasa se traduce como una poliprotema, que se autoescinde para proporcionar un complejo de replicacion que crea copias de hebra -- genomica del ARN administrado de hebra +-. Estros transcritos de hebra -- pueden transcribirse a sf mismos a dar mas copias del ARN parental de hebra +- y, tambien, para dar un transcrito subgenomico que codifica el inmunogeno. Por tanto, la traduccion del transcrito subgenomico conduce a la expresion in situ del inmunogeno por la celula infectada. Replicones de alfavirus adecuados pueden utilizar una replicasa de un virus Sindbis, virus del bosque Semliki una, un virus de la encefalitis equina del este, un virus de la encefalitis equina venezolana, etc. Se pueden usar secuencias de virus silvestres o mutantes, por ejemplo, el mutante atenuado TC83 de VEEV se ha utilizado en replicones [14].
Por tanto, una molecula de RNA autorreplicante preferida codifica (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir el ARN desde la molecula de ARN autorreplicante y (ii) un inmunogeno. La polimerasa puede ser un ejemplo de alfavirus replicasa que comprende, por ejemplo, una o mas de las protemas de alfavirus de nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4.
Considerando que los genomas de alfavirus naturales codifican protemas de virion estructurales ademas de la poliprotema de replicasa no estructural, se prefiere que las moleculas de ARN autorreplicantes de la invencion no codifiquen protemas estructurales de alfavirus. Por tanto, un ARN autorreplicante preferido puede conducir a la produccion de copias de ARN genomico de sf mismo en una celula, pero no para la produccion de viriones que contienen ARN. La incapacidad para producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfavirus de tipo silvestre, la molecula de ARN autorreplicante no puede perpetuarse en forma infecciosa. Las protemas estructurales de alfavirus que son necesarias para la perpetuacion en los virus de tipo silvestre estan ausentes de los ARN autorreplicantes de la invencion y su lugar esta ocupado por gen o genes que codifican el inmunogeno de interes, tal que el transcrito subgenomico codifica el inmunogeno en lugar de las protemas del virion alfavirus estructurales.
Por tanto, una molecula de ARN autorreplicante util con la invencion puede tener dos marcos de lectura abiertos. El primer marco de lectura abierto (5') codifica una replicasa; el segundo marco de lectura abierto (3') codifica un inmunogeno. En algunas realizaciones, el RNA puede tener marcos de lectura abiertos adicionales (por ejemplo aguas abajo), por ejemplo, para codificar mas inmunogenos (vease a continuacion) o para codificar polipeptidos accesorios.
Una molecula de ARN autorreplicante preferida tiene una caperuza en 5' (por ejemplo, una 7-metilguanosina). Esta caperuza puede mejorar la traduccion del ARN in vivo. En algunas realizaciones, la secuencia 5' de la molecula de aRn autorreplicante debe seleccionarse para asegurar la compatibilidad con la replicasa codificada.
Una molecula de RNA autorreplicante puede tener una cola de poli A en 3' Tambien puede incluir una secuencia de reconocimiento de la polimerasa polo A (por ejemplo AAUAAA) cerca de su extremo 3'.
Las moleculas de ARN autorreplicantes pueden tener diferentes longitudes, pero por lo general tienen una longitud de 5000-25000 nucleotidos, por ejemplo, 8000-15000 nucleotidos, o 9000-12000 nucleotidos. Por tanto, el ARN es mas largo de lo que se ve en la administracion de ARNpi.
Las moleculas de ARN autorreplicantes seran tfpicamente de una sola hebra. Los ARN de una sola hebra en general, pueden iniciar un efecto adyuvante mediante la union a TLR7, TLR8, ARN helicasas y/o PKR. El ARN administrado en forma de doble hebra (ARNdc) se puede unir a TLR3, y este receptor tambien puede ser activado por ARNdc que se forma, bien durante la replicacion de un ARN de cadena sencilla o dentro de la estructura secundaria de un ARN de cadena sencilla.
El ARN autorreplicante se pueden preparar convenientemente mediante transcripcion in vitro (TIV). La TIV puede utilizar un molde (ADNc) creado y propagado en forma de plasmido en bacterias o creado sinteticamente (por ejemplo, mediante procedimientos de ingeniena de smtesis genica y/o reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)). Por ejemplo, se puede usar una ARN polimerasa dependiente de ADN (tal como las ARN polimerasas de bacteriofagos T7, T3 o SP6) para transcribir el ARN autorreplicante partir de un molde de ADN. Las reacciones de proteccion y de adicion de poli A se pueden usar segun sea necesario (aunque la poli-A del replicon generalmente se codifica dentro del molde de ADN). Estas ARN polimerasas pueden tener requisitos estrictos para el o los nucleotidos transcritos en 5' y en algunas realizaciones estos requisitos deben coincidir con los requisitos de la replicasa codificada, para garantizar que el ARN transcrito por TIV puede funcionar eficazmente como un sustrato para su replicasa autocodificada.
El ARN incluye nucleotidos no modificados, es decir todos los nucleotidos en el ARN son ribonucleotidos normales de A, C, G y U (con excepcion de cualquier estructura de la caperuza en 5', que puede incluir una 7'- metilguanosina). En algunas realizaciones, el ARN puede incluir una caperuza en 5' comprende una 7'-
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metilguanosina, y los primeros 1, 2 o 3 ribonucleotidos en 5' pueden estar metilados en la posicion 2' de la ribosa.
Un RNA utilizado con la invencion incluye idealmente solo enlaces fosfodiester entre los nucleosidos, pero en algunas realizaciones puede contener enlaces fosforamidato, fosforotioato y/o metilfosfonato.
La cantidad de RNA por partmula puede variar y el numero de moleculas de ARN autorreplicantes individuales por partmula puede depender de las caractensticas de la partmula que se este usando. En general, una partmula puede incluir de 1-500 moleculas de ARN. Para un liposoma, el numero de moleculas de ARN es tfpicamente <5 0 por liposoma, por ejemplo, <20, <10, <5, o 1-4. Para una micropartmula polimerica, el numero de moleculas de ARN dependera del diametro de las partmulas, pero puede ser < 50 por partmula (por ejemplo <20, <10, <5, o 1 a 4) o 50 - 200 por partmula. Idealmente, una partmula incluye menos de 10 especies diferentes de ARN, por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o especies diferentes; mas preferiblemente, una partmula incluye una unica especie de ARN, es decir, todas las moleculas de ARN en la partmula tienen la misma secuencia y la misma longitud.
El inmunogeno
Las moleculas de ARN autorreplicantes que se utilizan con la invencion codifican un inmunogeno polipeptfdico. Despues de la administracion de las partmulas, el inmunogeno se traduce in vivo y puede provocar una respuesta inmunitaria en el receptor contra una bacteria, un virus, un hongo o un parasito (y, en algunas realizaciones, contra un alergeno, y, en otras realizaciones, contra un antfgeno tumoral). La respuesta inmunitaria puede comprender una respuesta de anticuerpos (normalmente incluyendo IgG) y/o una respuesta inmunitaria mediada por celulas. El inmunogeno polipeptfdico tfpicamente provocara una respuesta inmunitaria que reconoce el correspondiente polipeptido bacteriano, vmco, fungico o parasitario (o alergeno o tumor), pero, en algunas realizaciones, el polipeptido puede actuar como un mimotopo para provocar una respuesta inmunitaria que reconoce un sacarido bacteriano, vmco, fungico o parasito. El inmunogeno es un polipeptido de superficie, por ejemplo, una adhesina, una hemaglutinina, una glicoprotema de la envoltura, una glicoprotema de espfcula, etc.
Las moleculas de ARN autorreplicantes pueden codificar un unico inmunogeno polipeptfdico multiples polipeptidos. Multiples inmunogenos se pueden presentar como un unico inmunogeno polipeptfdico (polipeptido de fusion) o como polipeptidos separados. Si los inmunogenos se expresan como polipeptidos separados, uno o mas de estos pueden proporcionarse con un IRES aguas arriba o un elemento promotor vmco adicional. Como alternativa, multiples inmunogenos se pueden expresar a partir de una poliprotema que codifica inmunogenos individuales fusionados a una proteasa autocatalftica corta (por ejemplo, la protema 2A del virus de la enfermedad pie-boca), o como internas.
A diferencia de referencias 1 y 16, el ARN codifica un inmunogeno. Para evitar dudas, la invencion no abarca ARN que codifica una luciferasa de luciernaga o que codifica una protema de fusion de p-galactosidasa de E. coli o que codifica una protema verde fluorescente (GFP). Ademas, el aRn no es ARN total de timo de raton.
En algunas realizaciones, el inmunogeno induce una respuesta inmunitaria contra una de estas bacterias:
Neisseria meningitidis: inmunogenos utiles incluyen, pero no se limitan a, protemas de membrana tales como adhesinas, autotransportadores, toxinas, protemas de adquisicion de hierro, y la protema de union al factor H. Una combinacion de tres polipeptidos utiles se describe en la referencia 17.
Streptococcus pneumoniae: inmunogenos polipeptfdicos utiles se divulgan en la referencia 18. Estos incluyen, pero no se limitan a, la subunidad de pilus RrGb, el precursor beta-N-acetil-hexosaminidasa (spr0057), spr0096, la protema de estres general GSP-781 (spr2021, SP2216), serina/treonina quinasa StkP (SP 1732) y la adhesina de la superficie neumococica PsaA.
Streptococcus pyogenes: inmunogenos utiles incluyen, pero no se limitan a, los polipeptidos divulgados en las referencias 19 y 20.
Moraxella catarrhalis.
Bordetella pertussis: inmunogenos de pertussis utiles incluyen, pero no se limitan a, la toxina o el toxoide pertussis (TP), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina y los aglutinogenos 2 y 3.
Staphylococcus aureus: inmunogenos utiles incluyen, pero no se limitan a, los polipeptidos divulgados en la referencia 21, tales como una hemolisina, esxA, esxB, protema de union a ferricromo-(sta006) y/o la lipoprotema sta011.
Clostridium tetani: el inmunogeno tfpico es el toxoide del tetanos.
Cornynebacterium diphtheriae: el inmunogeno tfpico es el toxoide de la difteria.
Haemophilus influenzae: inmunogenos utiles incluyen, pero no se limitan a, los polipeptidos divulgados en las referencias 22 y 23.
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Streptococcus agalactiae: inmunogenos utiles incluyen, pero no se limitan a, los polipeptidos divulgados en la referencia 19.
Chlamydia trachomatis: inmunogenos utiles incluyen, pero no se limitan a, PepA, LCRE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-como, L7/L12, OmcA, Atos, CT547, Eno, HtrA y murg (por ejemplo, como se divulga en la referencia 24. LcrE [25] y HtrA [26]] son dos inmunogenos preferidos.
Chlamydia pneumoniae: inmunogenos utiles incluyen, pero no se limitan a, los polipeptidos divulgados en la referencia 27.
Helicobacter pylori: los inmunogenos utiles incluyen, pero no se limitan a, CagA, VacA, NAP, y/o ureasa [28].
Escherichia coli: Los inmunogenos utiles incluyen, pero no se limitan a, inmunogenos derivados de E. coli enterotoxigenica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAggEC), se E. coli de adhesion difusa (DAEC), E. coli enteropatogenica (EPEC), E. coli patogenica extraintestinal (ExPEC) y/o E. coli enterohemorragica (EHEC). Las cepas de ExPEC incluyen E. coli uropatogenica (UPEC) y E. coli asociada con meningitis/sepsis (MNEC). Los inmunogenos polipeptfdicos UPEC utiles se divulgan en las referencias 29 y 30. Los inmunogenos MNEC utiles se describen en la referencia 31. Un inmunogeno util para varios tipos de E. coli es ACFD [32].
Bacillus anthracis
Yersinia pestis: inmunogenos utiles incluyen, pero no se limitan a, los polipeptidos divulgados en las referencias 33 y 34.
Staphylococcus epidermis Clostridium perfringens o Clostridium botulinums Legionella pneumophila Coxiella burnetii
Brucella, tales como B.abortus, B.canis, B.melitensis, B.neotomae, B.ovis, B. suis, B. pinnipediae.
Francisella, tales como F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis.
Neisseria gonorrhoeae Treponema pallidum Haemophilus ducreyi
Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium
Staphylococcus saprophyticus
Yersinia enterocolitica
Mycobacterium tuberculosis
Rickettsia
Listeria monocytogenes Vibrio cholerae Salmonella typhi Borrelia burgdorferi Porphyromonas gingivalis Klebsiella
En algunas realizaciones, el inmunogeno induce una respuesta inmunitaria contra una de estos virus:
Ortomixovirus: inmunogenos utiles pueden ser de un virus de la gripe A, B o C, tales como las protemas hemaglutinina, neuraminidasa o M2 de la matriz. Cuando el inmunogeno es una hemaglutinina del virus de la gripe A puede ser de cualquier subtipo, por ejemplo, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16.
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Virus Paramyxoviridae: los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de pneumovirus (por ejemplo, el virus respiratorio sincitial, VRS), Rubulavirus (por ejemplo, virus de las paperas), paramixovirus (por ejemplo, virus parainfluenza), metaneumovirus y morbilivirus (por ejemplo, sarampion).
Poxviridae: inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Ortopoxvirus como Variola vera, incluyendo pero no limitados a, viruela mayor y viruela menor.
Picornavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de picornavirus, tales como enterovirus, rinovirus, heparnavirus, cardiovirus y aftovirus. En una realizacion, el enterovirus es un ejemplo poliovirus, por ejemplo un poliovirus de tipo 1, de tipo 2 y/o de tipo 3. En otra realizacion, el enterovirus es un enterovirus EV71. En otra realizacion, el enterovirus es un virus coxsackie A o B.
Bunyavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Orthobunyavirus, tales como el virus de la encefalitis de California, un Phlebovirus, tal como el virus de la fiebre de Rift Valley, o un Neurovirus, como el virus de la fiebre hemorragica de Crimea-Congo.
Heparnavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de heparnavirus, tales como virus del virus de la hepatitis A (VHA).
Filovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un filovirus, tal como el virus de ebola (incluyendo un virus ebola de Zaire, Costa de Marfil, Reston o Sudan) o un virus de Marburg.
Togavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Togavirus, tales como un Rubivirus, un alfavirus, o un Arterivirus. Esto incluye el virus de la rubeola.
Flavivirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Flavivirus, tales como el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), el virus del dengue (tipos 1, 2, 3 o 4), el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de Kyasanur Forest, el virus de la encefalitis del Nilo occidental, el virus de la encefalitis de San Luis, el virus de la encefalitis rusa de primavera-verano, el virus de la encefalitis Powassan
Pestivirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un pestivirus, tal como la diarrea bovina (vmca BVDV), la peste porcina clasica (CSFV) o la enfermedad de la frontera (BDV).
Hepadnavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de hepadnavirus, tales como el virus de la hepatitis B (VHB). Una composicion puede incluir antfgeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg).
Otros virus de la hepatitis: Una composicion puede incluir un inmunogeno de un virus de hepatitis C, virus de la hepatitis delta, virus de la hepatitis E, o virus de la hepatitis G.
Rhabdovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de rhabdovirus, tales como un Lyssavirus (por ejemplo, un virus de la rabia) y Vesiculovirus (VSV).
Caliciviridae: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Calciviridae, tales como el virus de Norwalk (norovirus), y los virus similares a Norwalk, tales como el virus de Hawai y el virus de montana de nieve.
Coronavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de coronavirus SARS, virus de la bronquitis aviar infecciosa (VBl), virus de la hepatitis de raton (VHR) y virus de la gastroenteritis transmisible porcina (VGET). El inmunogeno de coronavirus puede ser un polipeptido espiga.
Retrovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un oncovirus, un lentivirus (por ejemplo VIH-1 o VIH-2) o una espumavirus.
Reovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un ortoreovirus, un rotavirus, un orbivirus, o un coltivirus.
Parvovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de Parvovirus B19.
Herpesvirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un virus del herpes humano, tales como, a modo de ejemplo unicamente, virus del herpes simple (VHS) (por ejemplo, VHS de tipos 1 y 2), virus de la varicela zoster (VVZ), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), virus del herpes humano 6 (VHH 6), virus del herpes humano 7 (VHH 7), y virus del herpes humano 8 (VHH 8).
Papovavirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de papilomavirus y poliomavirus. El papilomavirus (humana) puede ser de serotipo 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 o 65 por ejemplo, de uno o mas de los serotipos 6, 11, 16 y/o 18.
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Adenovirus: Los inmunogenos vmcos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de adenovirus de serotipo 36 (Ad-36).
En algunas realizaciones, el inmunogeno induce una respuesta inmunitaria contra un virus que infecta a los peces, tales como: virus de la anemia infecciosa del salmon (ISAV), virus de la enfermedad pancreatica del salmon (SPDV), virus de la necrosis pancreatica infecciosa (IPNV), virus del siluro del canal (CCV), virus de la enfermedad de linfocistis del pescado (FLDV), virus de la necrosis hematopoyetica infecciosa (NHI), herpesvirus koi, el virus de tipo picorna del salmon (tambien conocido virus de tipo picorna del salmon atlantico), virus del salmon encerrado (LSV), rotavirus del salmon del atlantico (ASR ), virus de la enfermedad de la fresa de la trucha (TSD), virus del tumor del salmon coho (CSTV) o virus de la septicemia hemorragica (SHV) vmca.
Los inmunogenos fungicos pueden derivar de dermatofitos, incluyendo: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton naegnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, and/or Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi; the less common are Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp y Cladosporium spp.
En algunas realizaciones, el inmunogeno induce una respuesta inmunitaria contra un parasito del genero Plasmodium, tales como P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. Por tanto, la invencion se puede usar para inmunizar contra la malaria. En algunas realizaciones, el inmunogeno induce una respuesta inmunitaria contra un parasito de la familia Caligidae, en particular los de los generos Lepeophtheirus y Caligus por ejemplo el piojo de mar, tales como Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi.
En algunas realizaciones, el inmunogeno induce una respuesta inmunitaria contra: Alergenos del polen (alergenos de polen de arboles, hierbas, malas hierbas y cespedes), alergenos de insectos o aracnidos (inhalados, alergenos de saliva y veneno, por ejemplo alergenos de acaros, alergenos de cucarachas y mosquitos, alergeno de veneno de himenopteros), alergenos de pelo y caspa de animales (de, por ejemplo, perros, gatos, caballos, ratas, ratones, etc.) y alergenos de alimentos (por ejemplo, gliadina). Alergenos importantes de polen de arboles, cespedes y hierbas son los que proceden de los ordenes taxonomicos de Fagales, Oleales, Pinales y platanaceae, incluidos, pero sin limitaciones, abedul (Betula), aliso (Alnus), avellano (Corylus), carpe (Carpinus) y olivo (Olea), cedro (Cryptomeria y Juniperus), platano (Platanus), el orden de Poales, incluidos, entre otros cespedes de los generos Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale y Sorghum, los ordenes de Asterales y Urticales, incluidos, entre otros, hierbas de los generos Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros importantes alergenos de inhalacion son los de acaros del polvo domestico del genero Dermatophagoides y Euroglyphus, acaro de bodega, p, ej., Lepidoglyphys, Glycyphagus y Tyrophagus, los de cucarachas, mosquitos y pulgas, por ejemplo Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, y los de mairnferos tales como perros, gatos y caballos, alergenos de venenos incluidos los que proceden de picaduras o mordeduras de insectos, tales como los del orden taxonomico de los himenopteros, incluidas abejas (Apidae), avispas (Vespidea) y hormigas ( Formicoidae).
En algunas realizaciones, el inmunogeno es un antfgeno tumoral seleccionado de: (a) antfgenos de cancer de testfculos, tales como NY-ESO-1, SSX2, SCP1 asf como polipeptidos de las familias RAGE, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, y MAGE-12 (que se puede utilizar, por ejemplo, para hacer frente a tumores de melanoma, pulmon, cabeza y cuello, CPNMC, mama, gastrointestinal y de vejiga; (b) antfgenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado con varios tumores solidos, por ejemplo, cancer colorrectal, de pulmon, de cabeza y cuello), p21/Ras (asociado con, por ejemplo, melanoma, cancer de pancreas y cancer colorrectal), CDK4 (asociado con, por ejemplo, melanoma), MUM1 (asociado con, por ejemplo, melanoma), caspasa-8 (asociada con, por ejemplo, cancer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cancer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina ( asociada con, por ejemplo, melanoma), TCR (asociado con, por ejemplo, linfoma no Hodgkin de celulas T), BCR-abl (asociado con, por ejemplo, leucemia mielogena cronica), isomerasa de triosafosfato, KIA 0205, CDC-27, y LDLR -FUT; (c) antfgenos sobreexpresados, por ejemplo, galactina 4 (asociada con, por ejemplo, cancer colorrectal), galactina 9 (asociada con, por ejemplo, la enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (asociada con, por ejemplo, leucemia mielogena cronica), WT 1 (asociado
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con, por ejemplo, diversas leucemias), anhidrasa carbonica (asociada con, por ejemplo, cancer renal), aldolasa A (asociada con, por ejemplo, cancer de pulmon), PRAME (asociada con, por ejemplo, melanoma), HER-2/neu ( asociado con, por ejemplo, cancer de mama, de colon, de pulmon y de ovarios), mamaglobina, alfa-fetoprotema (asociada con, por ejemplo, hepatoma), KSA (asociado con, por ejemplo, cancer colorrectal), gastrina (asociada con, por ejemplo, cancer pancreatico y gastrico), protema catalttica de la telomerasa, MUC-1 (asociado con, por ejemplo, cancer de mama y de ovarios), G-250 (asociado con, por ejemplo, carcinoma de celulas renales), p53 (asociado con, por ejemplo, cancer de mama y de colon), y antigeno carcinoembrionario (asociado con, por ejemplo, cancer de mama, cancer de pulmon, y canceres del tracto gastrointestinal tal como cancer colorrectal); (d) antigenos compartidos, por ejemplo, antigenos de diferenciacion de melanoma-melanocitos, tales como MART-1/Melan A, gplOo, MC1R, receptor de la hormona estimulante de melanocitos, tirosinasa, protema 1/TRP1 relacionada con la tirosinasa y protema 2/TRP2 relacionada con la tirosinasa (asociada con, por ejemplo, melanoma); (e) antigenos asociados a la prostata, tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados con, por ejemplo, cancer de prostata; (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados a mieloma y linfomas de celulas B, por ejemplo). En ciertas realizaciones, los inmunogenos de tumores incluyen, pero no se limitan a, p 15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A- PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antigenos del virus de Epstein Barr, EbNa, antigenos del papilomavirus humano (HPV), incluyendo E6 y E7, antigenos del virus de la hepatitis B y C, antigenos del virus linfotropico de celulas T, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17,1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27,29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (protema de union a Mac-2 /protema asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, y similares.
Composiciones farmaceuticas
Las partmulas de la invencion son utiles como componentes en composiciones farmaceuticas para la inmunizacion de sujetos contra diversas enfermedades. Estas composiciones incluiran, tfpicamente un vehmulo farmaceuticamente aceptable ademas de las partmulas. En la referencia 35 se puede encontrar una exhaustiva discusion de vehmulos farmaceuticamente aceptables.
Una composicion farmaceutica de la invencion puede incluir una o mas inmunopotenciadores de molecula pequena. Por ejemplo, la composicion puede incluir un agonista de TLR2 (por ejemplo Pam3CSK4), un agonista de TLR4 (por ejemplo, un fosfato de aminoalquil lucosaminida, tal como E6020), un agonista de TLR7 (por ejemplo, imiquimod), un agonista TLR8 (por ejemplo, resiquimod) y/o un agonista de TLR9 (por ejemplo, IC31). Cualquier agonista idealmente tiene un peso molecular de <2000 Da. Cuando un RNA esta encapsulado, en algunas realizaciones tales agonistas tambien estan encapsulados con el ARN, pero en otras realizaciones no estan encapsulados.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir las partmulas en agua corriente (por ejemplo w.f.i.) o en un tampon, por ejemplo, un tampon fosfato, un tampon Tris, un tampon borato, un tampon succinato, un tampon histidina o un tampon citrato. Normalmente, las sales tampon estaran incluidas en el intervalo de 5-20 mM.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden tener un pH entre 5,0 y 9,5, por ejemplo, entre 6,0 y 8,0.
Las composiciones de la invencion pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro sodico) para dar tonicidad. Una concentracion de 10 ± 2mg/ml de NaCI es tfpica, por ejemplo de aproximadamente 9 mg/ml.
Las composiciones de la invencion pueden incluir quelantes de iones metalicos. Estos pueden prolongar la estabilidad del ARN mediante la eliminacion de iones que pueden acelerar la hidrolisis de fosfodiester. Por tanto, una composicion puede incluir uno o mas de EDTA, EGTA, BAPTA, acido pentetico, etc. Tales quelantes estan presentes, tfpicamente, a entre 10-500 |jM por ejemplo, 0,1 mM. Una sal de citrato, tal como citrato de sodio, tambien puede actuar como un quelante, mientras que tambien ventajosamente proporciona actividad de tamponamiento.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden tener una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo, entre 240 a 360 mOsm/kg, o entre 290 a 310 mOsm/kg.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir uno o mas conservantes, tales como tiomersal o 2- fenoxietanol. Se prefieren composiciones libres de mercurio y se pueden preparar vacunas sin conservantes.
Preferentemente, las composiciones de la invencion son esteriles.
Preferentemente, las composiciones farmaceuticas de la invencion son apirogenas, por ejemplo que contienen < 1 UE (unidad de endotoxina, una medida estandar) por dosis y, preferentemente, < 0,1 UE por dosis.
Preferentemente, las composiciones farmaceuticas de la invencion no tienen gluten.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden preparar en forma de dosis unitaria. En algunas realizaciones, una dosis unitaria puede tener un volumen de entre 0,1-1,0 ml por ejemplo, aproximadamente 0,5 ml.
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Las composiciones se pueden preparar en forma de inyectables, bien como soluciones o suspensiones. La composicion se puede preparar para administracion pulmonar, por ejemplo en forma de un inhalador, usando un atomizador. La composicion se puede preparar para administracion nasal, aural u ocular, por ejemplo en forma de gotas o aerosol. Son tipicos los inyectables para administracion intramuscular.
Las composiciones comprenden una cantidad inmunologicamente eficaz de partfcula, asf como de cualquier otro componente especificado, segun sea necesario. Por “cantidad inmunologicamente eficaz” se quiere decir que la administracion de dicha cantidad a un individuo, bien en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para tratamiento o prevencion. Esta cantidad vana en funcion de la salud y el estado ffsico del individuo que se va a tratar, la edad, el grupo taxonomico del individuo que se va a tratar (p. ej., primate no humano, primate etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de proteccion deseado, la formulacion de la vacuna, la evaluacion del medico encargado del tratamiento de la situacion medica y otros factores relevantes. Cabe esperar que la cantidad entre dentro de un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos de rutina. La partfcula y el contenido de ARN de las composiciones de la invencion se expresara, generalmente, en terminos de la cantidad de ARN por dosis. Una dosis preferida tiene <100 |jg de ARN (por ejemplo, 10 a 100 jg, tal como aproximadamente 10 jg, 25 jg, 50 jg, 75 jg o 100 jg), pero la expresion se puede ver a niveles mucho mas bajos, por ejemplo, <1 jg/dosis, <100 ng/dosis, <10 ng/dosis, <1 ng/dosis, etc.
La invencion tambien proporciona un dispositivo de administracion (por ejemplo, jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dermico, etc.) que contiene una composicion farmaceutica de la invencion. Este dispositivo se puede usar para administrar la composicion a un sujeto vertebrado.
Las partfculas de la invencion no incluyen los ribosomas.
Procedimientos de tratamiento y usos medicos
Al contrario que las partfculas divulgadas en la referencia 16, las partfculas y las composiciones farmaceuticas de la invencion son para su uso in vivo para provocar una respuesta inmunitaria contra un inmunogeno de interes
La invencion proporciona una composicion de partfculas o farmaceutica de la invencion para uso en un procedimiento para producir una respuesta inmunitaria en un vertebrado que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una partfcula o composicion farmaceutica de la invencion. La respuesta inmunitaria es protectora y, preferiblemente, implica anticuerpos y/o inmunidad mediada por celulas. El procedimiento puede provocar una respuesta de refuerzo.
Provocando una respuesta inmunitaria en el vertebrado mediante estos usos y procedimientos, se puede proteger al vertebrado contra varias enfermedades y/o infecciones por ejemplo contra las enfermedades bacterianas y/o vmcas como se ha tratado anteriormente. Las partfculas y las composiciones son inmunogenicas, y son mas preferiblemente, composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo con la invencion pueden ser profilacticas (es decir, para prevenir la infeccion) o terapeuticas (es decir, para tratar la infeccion), pero normalmente seran profilacticas.
El vertebrado es, preferiblemente, un mairnfero, tal como un ser humano o un mairnfero grande veterinaria (por ejemplo, caballos, ganado, ciervos, cabras, cerdos). Cuando la vacuna es para uso profilactico, el ser humano es, preferentemente, un nino (p. ej., un nino pequeno o un lactante) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapeutico, el ser humano es, preferentemente, un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a ninos puede tambien administrarse a adultos, por ejemplo para evaluar la seguridad, la dosificacion, la inmunogenicidad etc.
Las vacunas preparadas de acuerdo con la invencion pueden usarse para tratar tanto ninos como adultos. Por tanto, un paciente humano puede ser de menos de 1 ano de edad, de menos de 5 anos de edad, de 1-5 anos de edad, de 5-15 anos de edad, de 15-55 anos de edad, o de al menos 55 anos de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, de <>50 anos de edad, > 60 anos de edad, y, preferiblemente >65 anos de edad), los jovenes (por ejemplo, de < 5 anos de edad), pacientes hospitalizados, profesionales sanitarios, servicios armados y personal militar, mujeres embarazadas, los pacientes con enfermedades cronicas o inmunodeficientes. No obstante, las vacunas no son adecuadas unicamente para estos grupos, y pueden usarse en una poblacion mas general.
En general, las composiciones de la invencion se administraran directamente a un paciente. La administracion directa se puede conseguir mediante inyeccion parenteral (por ejemplo, por via subcutanea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o en el espacio intersticial de un tejido; al contrario que la referencia 1, la inyeccion intraglosal normalmente no se usa con la presente invencion). Las vfas de administracion alternativas incluyen las vfas rectal, oral (por ejemplo, comprimido, aerosol), bucal, sublingual, vaginal, topica, transdermica o transcutanea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administracion mucosa. La administracion intradermica e intramuscular son dos vfas preferidas. La inyeccion se puede realizar a traves de una aguja (p. ej., una aguja hipodermica) pero, como alternativa, se puede usar la inyeccion sin aguja. Una dosis intramuscular tfpica es de 0,5 ml.
La invencion puede utilizarse para provocar inmunidad sistemica y/o mucosa, preferentemente para provocar una inmunidad sistemica y/o de la mucosa mejorada.
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La dosis puede seguir un calendario de dosis unica o un calendario de multiples dosis. Las multiples dosis pueden usarse en un calendario de inmunizacion primaria y/o en un calendario de inmunizacion de refuerzo. En un calendario de multiples dosis, las diversas dosis pueden administrate por la misma o diferentes vfas, por ejemplo una sensibilizacion parenteral y un refuerzo en la mucosa, una sensibilizacion en la mucosa y un refuerzo parenteral etc. Las multiples dosis se administraran normalmente de al menos 1 semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En una realizacion, se pueden administrar multiples dosis aproximadamente 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas despues del nacimiento, por ejemplo, a una edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, como la frecuencia usada en el Programa de ampliacion de la inmunizacion de la Organizacion Mundial de la Salud ("EPI"). En una realizacion alternativa, se administran dos dosis primarias con aproximadamente dos meses de diferencia, por ejemplo, con aproximadamente 7, 8 o 9 semanas de diferencia, seguidas de una o mas dosis de de refuerzo aproximadamente 6 meses a 1 ano despues de la segunda dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente 6, 8, 10 o 12 meses despues de la segunda dosis primaria. En una realizacion adicional, se administran tres dosis primarias con aproximadamente dos meses de diferencia, por ejemplo, con aproximadamente 7, 8 o 9 semanas de diferencia, seguidas de una o mas dosis de de refuerzo aproximadamente 6 meses a 1 ano despues de la tercera dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente 6, 8, 10 o 12 meses despues de la tercera dosis primaria.
General
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de qmmica, biologfa molecular, inmunologfa y farmacologfa, dentro de la experiencia en la tecnica. Dichas tecnicas se explican por completo en la literatura. Veanse, por ejemplo, las referencias 36-42 etc.
El termino “que comprende" abarca (que incluye” ademas de “constituido por”, por ejemplo una composicion “que comprende” X puede estar constituido solo por X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.
El termino “aproximadamente” en relacion con un valor numerico x es opcional y significa, por ejemplo, x ± 10 %.
La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composicion que esta “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definicion de la invencion.
Las referencias a cargas, cationes, aniones, zwitteriones etc., se toman a un pH de 7.
TLR3 es el receptor 3 de tipo Toll. Es un unico receptor que atraviesa la membrana que desempena un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR3 conocidos incluyen poli(I:C). "TLR3" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su unica ID de HGNC es HGNC: 11849. La secuencia RefSeq para el gen humano del TLR3 es GI:2459625.
TLR7 es el receptor 7 de tipo Toll. Es un unico receptor que atraviesa la membrana que desempena un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR7 conocidos incluyen, por ejemplo, imiquimod. "TlR7" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su ID unica HgnC es HGNC:15631. La secuencia RefSeq para el gen de TLR7 humano es GI: 67944638.
TLR8 es el receptor 8 de tipo Toll. Es un unico receptor que atraviesa la membrana que desempena un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR8 conocidos incluyen, por ejemplo, resiquimod. "TlR8" es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su ID unica HGNC es HGNC:15632. La secuencia RefSeq para el gen de TLR8 humano es GI: 20302165.
El receptor de tipo RIG-I ("RLR"), la familia incluye varias ARN helicasas que desempenan papeles clave en el sistema inmunologico innato [43]. RLR-1 (tambien conocido como RIG-I o el gen I inducible de acido retinoico) tiene dos dominios de reclutamiento de caspasas cerca de su extremo N-terminal. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la helicasa RLR-1 es "DDX58" (por DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) polipeptido de la caja 58) y la unica ID de HGNC es HGNC: 19.102. La secuencia RefSeq para el gen de RLR-1 humano es GI: 77732514. RlR-2 (tambien conocido como MDA5 o gen 5 asociado con la diferenciacion del melanoma) tambien tiene dos dominios de reclutamiento de caspasas cerca de su extremo N-terminal. . El nombre de HGNC aprobado para el gen que codifica la helicasa RLR-2 es "IFIH1" (para interferon inducido con el dominio 1 de la helicasa C 1) y la unica ID de HGNC es HGNC: 18873. La secuencia RefSeq para el gen humano del RLR-2 es GI: 27886567. RlR-3 (tambien conocida como LGP2 o laboratorio de la genetica y fisiologfa 2) no tiene dominios de reclutamiento de caspasas. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la helicasa RLR-3 es "DHX58" (para DExH (Asp-Glu-His-X) polipeptido de la caja 58) y la unica ID de HGNC es HGNC: 29.517. La secuencia RefSeq para el gen RLR-3 humana es GI: 149408121
PKR es una protema quinasa dependiente de ARN de doble cadena. Desempena un papel clave en el sistema inmunologico innato. "EIF2AK2" (para el factor de iniciacion de la traduccion en eucariotas 2-alfa quinasa 2) es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica esta enzima y su ID unica HGNC es HGNC:9437. La secuencia
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RefSeq para el gen de PKR humano es GI: 208431825.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra un gel con ARN tenido. Los carriles muestran (1) marcadores (2) replicon desnudo (3) replicon despues de tratamiento con ARNasa (4) replicon encapsulado en liposoma (5) liposoma despues de tratamiento con ARNasa (6) liposoma tratado con ARNasa despues se sometio a extraccion con fenol/cloroformo.
La Figura 2 es una micrograffa electronica de liposomas.
La figura 3 muestra la expresion proteica (como unidades de luz relativa, ULR) los dfas 1, 3 y 6 despues de la administracion de ARN como un replicon empaquetado en virion (cuadrados), ARN desnudo (triangulos) o como micropartmulas (cftculos).
La figura 4 muestra un gel con ARN tenido. Los carriles muestran (1) marcadores (2) replicon desnudo (3) replicon encapsulado en liposoma (4) liposoma tratado con ARNasa, despues se sometio a extraccion con fenol/cloroformo.
La figura 5 muestra la expresion de protemas los dfas 1, 3 y 6 despues de la administracion de ARN como un replicon empaquetado en viriones (cuadrados), como ARN desnudo (rombos) o en liposomas (+ = 0,1 |jg, x = 1 Mg).
La figura 6 muestra la expresion de protemas los dfas 1, 3 y 6 despues de la administracion de cuatro dosis diferentes de ARN encapsulado en liposomas.
La figura 7 muestra los tftulos de IgG anti-F en los animales que recibieron replicon empaquetado en viriones (VRP o VSRP), 1 jg de ARN desnudo, y 1 jg de ARN encapsulado en liposomas.
La figura 8 muestra los tftulos de IgG anti-F en los animales que recibieron VRP, 1 jg de ARN desnudo y 0,1 g o 1 jg de ARN encapsulado en liposomas.
La figura 9 muestra los tftulos de anticuerpos neutralizantes en animales que recibieron VRP o sea 0,1 g o 1 jg de ARN encapsulado en liposomas.
La figura 10 muestra los niveles de expresion despues de la administracion de un replicon como ARN desnudo (cftculos), ARN encapsulado en liposomas (triangulo y cuadrado), o como un lipoplex (triangulo invertido).
La figura 11 muestra los tftulos de IgG espedficas de F (2 semanas despues de la segunda dosis) despues de la administracion de un replicon como ARN desnudo (0,01-1 jg), ARN encapsulado en liposomas (0,01-10 jg), o empaquetado como un virion (VRP, 106 unidades infecciosas o UI).
La figura 12 muestra los tftulos de IgG espedficas de F (drculos) y tftulos de PRNT (cuadrados) despues de la administracion de un replicon como ARN desnudo (1 jg), ARN encapsulado en liposomas (0,1 o 1 jg), o empaquetado como un virion (VRP, 106 unidades infecciosas o UI). Tambien se muestran los tftulos en los ratones no tratados. Las lrneas continuas muestran las medias geometricas.
La figura 13 muestra la produccion de cito quinas intracelulares despues de la reestimulacion con los peptidos sinteticos que representan los principales epftopos en la protema F, 4 semanas despues de una segunda dosis. El eje Y muestra el % de citocinas de las celulas CD8 + CD4 +.
La figura 14 muestra los tftulos de IgG espedficos de F (media de los tftulos log-10 ± desviacion estandar) en 63 dfas (Figura 14A) y 210 dfas (Figura 14B) despues de la vacunacion de terneros. Las tres lrneas se distinguen facilmente el dfa 63 y son, de abajo a arriba: control negativo de PBS; ARN administrado de liposomas y el producto "Triangulo 4".
La figura 15 muestra los tftulos de IgG anti-VIH en suero en respuesta a ADN desnudo ("ARN") o encapsulado en liposomas ("LNP") ARN, o ADN administrado mediante electroporacion en musculo.
La figura 16 muestra los tftulos de IgG en 13 grupos de ratones. Cada cftculo es un raton individual, y las lrneas continuas muestran las medias geometricas. La lrnea horizontal discontinua es el ftmite de deteccion del ensayo. Los 13 grupos son, de izquierda a derecha, de A a M como se describe a continuacion.
La figura 17 muestra (A) IL-6 y (B) IFNa (pg/ml) administrado por pDC. Hay 4 pares de barras, de izquierda a derecha: control; inmunizados con RNA + DOTAP; inmunizados con RNA + lipofectamina; e inmunizados con ARN en liposomas. En cada par, la barra negra son ratones de tipo silvestre, la gris es mutante rsql.
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Modos para realizar la invencion Replicones de ARN
Varios replicones se utilizan a continuacion. En general estos se basan en un genoma de alfavirus tnbrido con protemas no estructurales del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), una senal de empaquetamiento del virus de Sindbis, y una 3' UTR del virus Sindbis o un mutante de VEEV. El replicon tiene aproximadamente 10 kb de longitud y tiene una cola poli-A.
El ADN plasirndico que codifica replicones de alfavirus (denominados: pT7-mVEEV-FL.RSVF o A317; pT7- mVEEV-SEAP o A306; pSP6-VCR-GFP o A50) sirvieron como molde para la smtesis de ARN in vitro. Los replicones contienen los elementos geneticos de alfavirus necesarios para la replicacion del ARN, pero carecen de los que codifican productos genicos necesarios para el montaje de partmulas; las protemas estructurales en cambio se sustituyen por una protema de interes (ya sea un indicador, tal como SEAP o GFP, o un inmunogeno, tal como la protema F del VRS de longitud completa) y, por tanto, los replicones son incapaces de inducir la generacion de partfculas infecciosas. Un promotor de bacteriofago (T7 o SP6) aguas arriba del ADNc del alfavirus facilita la smtesis del ARN replicon in vitro y un virus de la hepatitis delta ribozima (HDV) inmediatamente aguas abajo de la cola poli
(A) genera el extremo 3' correcto a traves de su actividad de autoescision.
Despues de la linealizacion del ADN plasirndico aguas abajo de la ribozima del HDV con una endonucleasa de restriccion adecuada, los transcritos no iniciados in vitro se sintetizaron usando la ARN polimerasa dependiente de ADN derivada del bacteriofago T7 o SP6. Transcripciones se realizaron durante 2 horas a 37 °C en presencia de 7,5 mM (ARN polimerasa de T7) o 5 mM (ARN polimerasa de SP6) de cada uno de los trifosfatos de nucleosidos (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion). Despues de la transcripcion, el ADN molde se digirio con TURBO ADNasa (Ambion). El ARN replicon se precipito con LiCl y se reconstituyo en agua libre de nucleasa. El ARN sin caperuza se protegio postranscripcionalmente con la enzima de proteccion de vaccinia (VCE) utilizando el Sistema de proteccion ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies) como se indica en el manual del usuario; los replicones protegidos de este modo reciben el prefijo “v”, por ejemplo vA317 es el replicon A317 protegido mediante VCE. El ARN protegido postranscripcionalmente se precipito con LiCl y se reconstituyo en agua libre de nucleasa. La concentracion de las muestras de ARN se determino midiendo DO260nm. La integridad de los transcritos in vitro se confirmo mediante electroforesis en gel de agarosa de desnaturalizacion.
Absorcion de PLG (ejemplo de referenda)
Las micropartmulas se fabricaron utilizando 500 mg de PLG RG503 (relacion molar 50:50 de lactida/glicolido, PM ~ 30 kDa) y 20 mg de DOTAP usando un homogeneizador Omni Macro. La suspension de partmulas se agito a 150 rpm durante la noche y despues se filtro a traves de un filtro esteril de 40 pm para el almacenamiento a 2-8 °C. El ARN autorreplicante fue adsorbido a las partmulas. Para preparar 1 ml de suspension PLG/ARN se anadio el volumen requerido de la suspension de partmulas de PLG a un vial y se anadio agua libre de nucleasa para llevar el volumen a 900 pl. Se anadio, gota a gota, 100 pl de ARN (10 pg/ml) a la suspension de PLG, con agitacion constante. Se incubo PLG/RNA a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para 1 ml de la suspension reconstituida, se anadieron 45 mg de manitol, 15 mg de sacarosa y 250 a 500 pg de PVA. Los viales se congelaron a -80 °C y se liofilizaron.
Para evaluar la adsorcion de ARN, la suspension de 100 pl de partmulas se centrifugo a 10 000 rpm durante 5 minutos y se recogio el sobrenadante. PLG/ARN se reconstituyo con 1 ml de agua libre de nucleasa. A la suspension de partmulas de 100 pl (1p g de ARN), se anadio 1 mg de sulfato de heparina. La mezcla se agito con vortex y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos para la desorcion del ARN. La suspension de partmulas se centrifugo y se recogio el sobrenadante.
Para la estabilidad de ARNasa, la suspension de partmulas de 100 pl se incubo con 6,4 mUA de ARNasa A a temperatura ambiente durante 30 minutos. La ARNasa se inactivo con 0,126 mUA de proteinasa K a 55 °C durante 10 minutos. Se anadio 1 mg de sulfato de heparina para desorber el ARN, seguido de centrifugacion. Las muestras de sobrenadante que contienen ARN se mezclaron con colorante de carga de formaldetndo, se calentaron a 65 °C durante 10 minutos y se analizaron usando un gel desnaturalizante al 1 % (460 ng de ARN cargados por carril).
Para evaluar la expresion, se inmunizo a ratones Balb/c con 1 pg de ARN en 100 pl de volumen de inyeccion intramuscular (50 pl/pata) el dfa 0. Los sueros se recogieron los dfas 1, 3 y 6. La expresion de protemas se determino utilizando un ensayo de quimioluminiscencia. Como se muestra en la Figura 3, la expresion fue mayor cuando el ARN se administro mediante PLG (triangulos) que sin ninguna partmula de administracion (drculos).
Encapsulacion en liposomas
El ARN se encapsula en liposomas preparados por el procedimiento de las referencias 7 y 44. Los liposomas se fabricaron con 10 % de dSpC (zwitterionicos), 40 % de DlinDMA (cationicos), 48 % de colesterol y 2 %de DMG conjugado con PEG (2 kDa de PEG). Estas proporciones se refieren al 5 en moles en el liposoma total.
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DlinDMA (1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano) se sintetizo usando el procedimiento de referencia 2. DSPC (1,2-diastearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) se adquirio en Genzyme. El colesterol se obtuvo en Sigma-Aldrich. DMG conjugada con PEG (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi(polietilenglicol), sal de amonio), DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano, sal de cloruro) y DC-Chol (3p- [N-(N',N'-dimetilaminoetano) carbamoil] clorhidrato de colesterol) eran de Avanti Polar Lipids.
Brevemente, los lfpidos se disolvieron en etanol (2 ml), un replicon de ARN se disolvio en tampon (2 ml, citrato de sodio 100 mM, pH 6) y Estos se mezclaron con 2 ml de tampon, seguido de 1 hora de equilibrado. La mezcla se diluyo con 6 ml de tampon despues se filtro. El producto resultante contema liposomas, con una eficiencia de encapsulacion ~ 95 %.
Por ejemplo, en un procedimiento particular, se prepararon soluciones madre de lfpidos frescas en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DSPC, 27,8 mg de colesterol y 8,07 mg de PEG-DMG y se disolvieron en 7,55 ml de etanol. La solucion madre lipfdica recien preparada se balanceo suavemente a 37 °C durante aproximadamente 15 minutos para formar una mezcla homogenea. Despues, se anadieron 755 pl de la solucion madrea a 1,245 ml de etanol para hacer una solucion madre de lfpidos de trabajo de 2 ml. Se utilizo esta cantidad de lfpidos para formar liposomas con 250 pg de ARN. Tambien se preparo una solucion de 2 ml de ARN de trabajo a partir de una solucion madre de □ 1 pg/pl en 100 mM de tampon citrato 100 mM (pH 6). Tres viales de 20 ml de vidrio (con barras de agitacion) se aclararon con solucion ARNasa Away (Molecular Bioproducts) y se lavaron con abundante agua Milli-Q antes de su uso para la descontaminacion de los viales de ARNasas. Uno de los viales se utilizo para la solucion de trabajo de ARN y los otros para la recogida de las mezclas de lfpidos y de ARN (como se describe mas adelante). Las soluciones de trabajo de lfpidos y de ARN se calentaron a 37 °C durante 10 minutos antes de cargarse en jeringas de cierre de tipo luer de 3 cc. Se cargaron 2 ml de tampon citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cc. Las jeringas que contienen aRn y los lfpidos se conectaron a un mezclador de T (PEEK ™ 500 pm Identificacion de conexiones, Idex Health Science) utilizando tubos de FEP (propileno-etileno fluorado; todos los tubos de FEP utilizados teman un diametro interno de 2 mm y un diametro exterior de 3 mm; obtenido de Idex Health Science). La salida de la mezcladora T era tambien un tubo de FEP. La tercera jeringa que contema el tampon citrato fue conectado a una pieza separada de la tubena. Todas las jeringas se accionaron a continuacion a un caudal de 7 ml/min utilizando una bomba de jeringa. Las salidas de tubos se posicionaron para recoger las mezclas en un vial de vidrio de 20 ml (con agitacion). La barra de agitacion se saco y se dejo que la solucion de etanol/acuosa se equilibrara a temperatura ambiente durante 1 hora. Se cargaron 4 ml de la mezcla en una jeringa de 5 cc, que se conecto a una pieza de tubo de FEP y en otra jeringa de 5 cc conectada a una longitud igual de tubo de FEP, se aislo una cantidad igual de tampon citrato 100 mM (pH 6). Las dos jeringas se accionaron a un caudal de 7 ml/min utilizando la bomba de jeringa y la mezcla final se recogio en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agita). A continuacion, la mezcla obtenida de la segunda etapa de mezcla (liposomas) se paso a traves de una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio anionico al que se unen y se retiran moleculas anionicas, obtenido de Pall Corporation). Antes de utilizar esta membrana para los liposomas, 4 ml de NaOH 1 M, 4 ml de NaCl 1M y 10 ml de tampon citrato 100 mM (pH 6) se hicieron pasar sucesivamente a traves de la misma. Los liposomas se calentaron durante 10 minutos a 37 °C antes de pasar a traves de la membrana. A continuacion, los liposomas se concentraron hasta 2 ml y se dializaron contra 10-15 volumenes de 1X PBS utilizando por filtracion de flujo tangencial antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y las membranas de filtracion de fibra hueca se adquirieron de Spectrum Labs (Rancho Dominguez) y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron membranas de filtracion de polisulfona de fibra hueca con un corte de tamano de poro de 100 kD d y 8 cm2 de area de superficie. Para los experimentos in vitro e in vivo, las formulaciones se diluyeron a la concentracion de ARN requerida con 1X PBS. Otros procedimientos de fabricacion de liposomas se describen a continuacion.
La figura 2 muestra un ejemplo micrograffa electronica de los liposomas preparados por estos procedimientos. Estos liposomas contienen ARN encapsulado que codifica el antfgeno F del VRF de longitud completa. Dispersion de luz dinamica de un lote mostro un diametro medio de 141 nm (por intensidad) o 78 nm (en numero).
El porcentaje de ARN encapsulado y la concentracion de ARN determinaron mediante el kit de reactivos Quant-iT RiboGreen (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. El patron del ARN ribosomico proporcionado en el kit se utilizo para generar una curva estandar. Los liposomas se diluyeron 10 veces o 100 veces en 1X TE del tampon (del kit) antes de la adicion del colorante. Por separado, los liposomas se diluyeron 10 veces o 100 veces en tampon 1X TE que contiene 0,5 % de Triton X antes de la adicion del colorante (para interrumpir los liposomas y, por lo tanto, para analizar el ARN total). A partir de entonces se anadio una cantidad igual del colorante a cada solucion y luego ~ 180 pl de cada solucion despues de la adicion de colorante se cargo por duplicado en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. La fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) se leyo en un lector de microplacas. Todas las formulaciones de liposomas se dosificaron in vivo basado en la cantidad encapsulada de ARN.
La encapsulacion en liposomas se demostro que protegfa el ARN de la digestion de ENASA. Los experimentos utilizaron 3,8 mUA de la ARNasa A por microgramo de ARN, se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La ARNasa se inactiva con proteinasa K a 55 °C durante 10 minutos. Una mezcla 1: 1 v/v de la muestra a 25: 24: 1 v/v/v, fenol: cloroformo:alcohol isoairnlico se anadio para extraer el ARN a partir de los lfpidos en la fase acuosa. Las muestras se mezclaron por agitacion en vortex durante unos segundos y despues se introdujeron en una centnfuga durante 15 minutos a 12 k rpm. La fase acuosa (que contema en ARN) se retiro y se utilizo para analizar el ARN. Antes de la carga (400 ng de ARN por pocillo) todas las muestras se incubaron con medio de carga
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de formaldelddo, se desnaturalizaron durante 10 minutos a 65 °C y se enfriaron a temperature ambiente. Se usaron marcadores Ambion Millennium para aproximar el peso molecular de la construccion de ARN. El gel se paso a 90 V. El gel se tino usando 0,1 % de oro SYBR de acuerdo con las instrucciones del fabricante en agua mediante balanceo a temperature ambiente durante 1 hora. Figura 1 muestra que la ENASA digiere completamente el ARN en ausencia de encapsulacion (carril 3). El ARN es indetectable despues de la encapsulacion (carril 4) y no se ve ningun cambio si estos liposomas son tratados con ARNasa (carril 4). Despues de someter a los liposomas tratados con ARNasa a extraccion con fenol, se ve ARN sin digerir (carril 6). Incluso despues de 1 semana a 4 °C, se pudo ver el ARN sin ninguna fragmentacion (Figura 4, flecha). La expresion de proternas in vivo se mantuvo sin cambios despues de 6 semanas a 4 °C y un ciclo de congelacion-descongelacion. Por lo tanto, el ARN encapsulado en liposomas es estable.
Para evaluar la expresion in vivo del ARN, una enzima indicadora (SEAP; fosfatasa alcalina secretada) estaba codificada en el replicon, en lugar de un inmunogeno. Los niveles de expresion se midieron en sueros diluidos 1:4 en tampon de dilucion 1X Phospha-Light usando un sustrato de fosfatasa alcalina quimioluminiscente. En ratones BALB/c de 8-10 semanas de edad (5/grupo) se inyecto por via intramuscular el dfa 0, 50 jl por pata con dosis de 0,1 |jg o 1 jg de ARN. Lo mismo vector tambien se administro sin los liposomas (en 1X PBS sin ARNasa) a 1 jg. Los replicones empaquetados en viriones tambien se analizaron. Los replicones empaquetados en viriones utilizados en el presente documento (a los que se hace referencia como "VRP") se obtuvieron mediante los procedimientos de la referencia 45, en el que el replicon alfavirus deriva del VEEV mutante o una quimera derivada del genoma de VEEV modificada por ingeniena genetica para que contenga la 3' UTR de virus Sindbis y una senal de empaquetamiento del virus Sindbis (PS), se empaquetaron mediante co-electroporacion en celulas BHK con ARN auxiliares defectuosos que codifican la capside del virus Sindbis y genes de glicoproternas.
Como se muestra en la Figura 5, la encapsulacion aumento los niveles de SEAP en aproximadamente A log a la dosis de 1 jg y la expresion el dfa 6 de una dosis encapsulada de 0,1 jg coincidio con los niveles observados con la dosis de 1 jg sin encapsular. El dfa 3, los niveles de expresion superaron los alcanzados con VRP (cuadrados). Por lo tanto, la expresion aumento cuando el ARN se formulo en los liposomas en relacion con el control de ARN desnudo, incluso a una dosis 10 veces mas baja. La expresion tambien fue mayor en relacion con el control de VRP, pero la cinetica de expresion fue muy diferente (vease la Figura 5). La administracion del ARN con la electroporacion resulto en un aumento de la expresion con respecto al control de ARN desnudo, pero estos niveles fueron mas bajos que con liposomas.
Otros experimentos de SEAP mostraron una respuesta clara a la dosis in vivo, observandose expresion despues de la administracion de tan solo 1 ng de ARN (Figura 6). Otros experimentos que comparan la expresion de replicones encapsulados y desnudos indicaron que 0,01 jg de ARN encapsulado era equivalente a 1 jg de ARN desnudo. A una dosis de 0,5 jg de ARN, el material encapsulado dio una expresion12 veces mas alta el dfa 6; a la dosis de 0,1 jg, los niveles fueron 24 veces mas altos el dfa 6.
En lugar de mirar a los niveles promedio en el grupo, tambien se estudiaron los animales individuales. Mientras que varios animales eran no respondedores a replicones desnudos, la encapsulacion elimino a los no respondedores.
Otros experimentos reemplazaron DlinDMA con DOTAP. Aunque los liposomas de DOTAP dieron una mejor expresion que el replicon desnudo, fueron inferiores a los liposomas de DlinDMA (diferencia de 2 a 3 veces el dfa 1).
Para evaluar la inmunogenicidad in vivo se construyo un replicon para expresar la proterna F de longitud completa del virus respiratorio sincitial (VRS). Este se administro desnudo (1 jg), encapsulado en liposomas (0,1 o 1 jg), o empaquetado en viriones (106 UI; "VRP") los dfas 0 y 21. La figura 7 muestra tftulos anti-F de IgG 2 semanas despues de la segunda dosis, y los liposomas mejoran claramente la inmunogenicidad. La Figura 8 muestra los tftulos de 2 semanas mas tarde, momento en el cual no hubo diferencias estadfsticas entre la ARN encapsulado a 0,1 jg, el ARN encapsulado en 1 jg, o el grupo VRP. Los tftulos de neutralizacion (medidos como la reduccion de placas del 60 %, "PRNT60") no fueron significativamente diferentes en estos tres grupos de 2 semanas despues de la segunda dosis (Figura 9). La figura 12 muestra tftulos de IgG y de PRNT 4 semanas despues de la segunda dosis.
La figura 13 confirma que el RNA provoca una solida respuesta de las celulas T CD8.
En otros experimentos se compararon los tftulos de IgG espedficos de F en ratones tratados con VRP, 0,1 jg de ARN encapsulado en liposomas o 1 0,1 jg de ARN encapsulado en liposomas. Las relaciones de tftulos (VRP: Liposoma) a varios tiempos despues de la segunda dosis fueron las siguientes:
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0,1 ng
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Por tanto, el ARN encapsulado en liposomas induce esencialmente la misma magnitud de la respuesta inmunitaria que la que se ve con la administracion del virion.
Otros experimented mostraron respuestas de IgG espedficas de F superiores con una dosis de 10 |jg, respuestas equivalentes para las dosis de 1 jg y 0,1 jg y una respuesta menor con una dosis de 0,01 jg. La Figura 11 muestra los tttulos de IgG en ratones que recibieron el replicon en forma desnuda a 3 dosis diferentes, en liposomas a 4 dosis diferentes, o como VRP (106 UI) La respuesta observada con 1 jg de ARN encapsulado en liposomas fue estadfsticamente insignificante (ANOVA) en comparacion con VRP, pero la mayor respuesta observada con 10 jg de ARN encapsulado en liposomas fue estadfsticamente significativa (p <0,05) en comparacion con estos grupos.
Otro estudio confirmo que el 0,1 jg de ARN encapsulado en liposomas dio respuestas mucho de IgG anti-F mucho mas altas (15 dfas despues de la segunda dosis) que 0,1 jg de ADN administrado, e incluso era mas inmunogenico que 20 jg de ADN plasirndico que codifica el antfgeno F, administrado por electroporacion (Elgen™ DNA Delivery System, Inovio).
Ratones mostraron pocos signos visuales de angustia (perdida de peso, etc.) despues de recibir el replicon de ARN encapsulado en liposomas, aunque se observo una perdida de peso transitoria de 3-4 % despues de una segunda dosis de 10 jg de ARN. Por el contrario, la administracion de 10 jg de ADN encapsulado en liposomas condujo a una perdida de peso del 8-10 %.
Mecanismo de accion:
Las celulas dendnticas derivadas de la medula osea (pDC) se obtuvieron de ratones de tipo silvestre o de la cepa mutante "ResQ" (rsql). La cepa mutante tiene una mutacion puntual en el amino terminal de su receptor TLR7 que suprime la senalizacion de TLR7 sin afectar a la union del ligando [46]. Las celulas se estimularon con el ARN replicon formulado con DOTAP, lipofectamina 2000 o dentro de un liposoma. Como se muestra en la Figura 17, se indujeron IL-6 e INFa en las celulas WT, pero esta respuesta se anulo casi completamente en ratones mutantes. Estos resultados muestran que se requiere TLR7 para el reconocimiento de ARN en las celulas inmunitarias y que los replicones encapsulados en liposomas pueden causar que las celulas inmunitarias secreten altos niveles tanto de interferones como de citocinas proinflamatorias.
En general, se mostro que los replicones de ARN administrados en liposomas indudan varias citocinas en suero en un plazo de 24 horas desde la inyeccion intramuscular (IFN-a, IP-10 (CXCL-10), IL-6, KC, IL-5, IL-13, MCP-1 y MIP-a), mientras que solo se indujo MIP-1 mediante ARN desnudo y el liposoma solo indujo unicamente IL-6.
Se demostro que el IFN-a contribma a la respuesta inmunitaria al replicon que codifica F de VRS encapsulado en liposomas, ya que un anticuerpo del receptor anti-IFNa redujo los niveles de IgG en suero espedficos de F a una reduccion por 10 veces despues de 2 vacunaciones.
Generalmente se ha observado que los replicones de ARN administrados en liposomas produdan un perfil de subtipo IgG1:IgG2a en ratones, a veces con una relacion de IgG2a/IgG1 mayor que la observada con el ADN sometido a electroporacion o con inmunizaciones con protema/MF59 (es decir, una respuesta inmunitaria de tipo Th1).
Procedimientos de fabricacion de liposomas
En general, se han utilizado ocho procedimientos diferentes para la preparacion de liposomas de acuerdo con la invencion. Estos se denominan en el texto procedimientos (A) a (H) y difieren principalmente en la relacion con las etapas de filtracion y TFF. Los detalles son los siguientes:
(A) Se prepararon soluciones madre de lfpidos frescas en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DSPC, 27,8 mg de colesterol y 8,07 mg de PEG DMG 2000 y se disolvieron en 7,55 ml de etanol. La solucion madre lipfdica recien preparada se balanceo suavemente a 37 °C durante aproximadamente 15 minutos para formar una mezcla homogenea. Despues, se anadieron 755 jl de la solucion madrea a 1,245 ml de etanol para hacer una solucion madre de lfpidos de trabajo de 2 ml. Se utilizo esta cantidad de lfpidos para formar liposomas con 250 jg de ARN. Tambien se preparo una solucion de 2 ml de ARN de trabajo a partir de una solucion madre de □ 1 jg/jl en 100 mM de tampon citrato 100 mM (pH 6). Tres viales de 20 ml de vidrio (con barras de agitacion) se aclararon con solucion ARNasa Away (Molecular Bioproducts, San Diego, CA) y se lavaron con abundante agua Milli-Q antes de su uso para la descontaminacion de los viales de ARNasas. Uno de los viales se utilizo para la solucion de trabajo de ARN y los otros para la recogida de las mezclas de lfpidos y de ARN (como se describe mas adelante). Las soluciones de trabajo de lfpidos y de ARN se calentaron a 37 °C durante 10 minutos antes de cargarse en jeringas de cierre de tipo luer de 3 cc. Se cargaron 2 ml de tampon citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cc. Las jeringas que contienen ARN y los lfpidos se conectaron a un mezclador de T (PEEK ™ 500 jm Identificacion de conexiones, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) utilizando tubos de FEP (propileno-etileno fluorado; todos los tubos de FEP teman un diametro interno de 2 mm y un diametro exterior de 3 mm; suministrado por Idex Health Science). La salida de la mezcladora T era tambien un tubo de FEP. La tercera jeringa que contema el tampon citrato fue conectado a una pieza separada de tubos de FEP. Todas las jeringas se accionaron a continuacion a un caudal de 7 ml/min utilizando una bomba de jeringa. Las salidas de
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tubos se posicionaron para recoger las mezclas en un vial de vidrio de 20 ml (con agitacion). La barra de agitacion se saco y se dejo que la solucion de etanol/acuosa se equilibrara a temperatura ambiente durante 1 hora. Se cargaron 4 ml de la mezcla en una jeringa de 5 cc, que se conecto a una pieza del tubo de FEP y en otra jeringa de 5 cc conectada a una longitud igual de tubo de FEP, se aislo una cantidad igual de tampon citrato 100 mM (pH 6). Las dos jeringas se accionaron a un caudal de 7 ml/min utilizando la bomba de jeringa y la mezcla final se recogio en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agita). A continuacion, la mezcla obtenida de la segunda etapa de mezcla (liposomas) se paso a traves de una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio anionico al que se unen y se retiran moleculas anionicas, obtenido de Pall Corporation, AnnArbor, MI, EE.UU.). Antes de pasar los liposomas, 4 ml de NaOH 1 M, 4 ml de NaCl 1M y 10 ml de tampon citrato 100 mM (pH 6) se hicieron pasar sucesivamente a traves de la membrana Mustang. Los liposomas se calentaron durante 10 minutos a 37 °C antes de pasar a traves de la membrana. A continuacion, los liposomas se concentraron hasta 2 ml y se dializaron contra 10-15 volumenes de 1X PBS utilizando TFF antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y las membranas de filtracion de fibra hueca se adquirieron de Spectrum Labs y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron membranas de filtracion de polisulfona de fibra hueca (numero de parte P/N: X1AB-100-20P) con un corte de tamano de poro de 100 kD d y 8 cm2 de area de superficie. Para los experimentos in vitro e in vivo, las formulaciones se diluyeron a la concentracion de ARN requerida con 1X PBS.
(B) Como procedimiento (A), excepto que, despues del balanceo, se anadieron 226,7pl l de la solucion madre a 1.773 ml de etanol para preparar una solucion madre lipfdica de trabajo de 2 ml, modificando asf la relacion de lfpido: ARN.
(C) Como procedimiento (B), excepto que la filtracion Mustang se omitio, por lo que los liposomas pasaron del vial de vidrio de 20 ml en la dialisis TFF.
(D) Como procedimiento (C), excepto que la TFF utilizo membranas de fibra hueca de polietersulfona (PES) (numero de pieza P-C1-100E-100-01N) con un corte de tamano de poro de 100 kD y 20 cm2 de superficie.
(E) Como procedimiento (D) excepto que se utilizo una membrana de Mustang, como en el procedimiento (A)
(F) Como procedimiento (A), excepto que la filtracion Mustang se omitio, por lo que los liposomas pasaron del vial de vidrio de 20 ml en la dialisis TFF.
(G) como el procedimiento (D), excepto que se preparo una solucion de 4 ml de ARN de trabajo a partir de una solucion madre de □ 1 pg/pl en 100 mM de tampon citrato 100 mM (pH 6). Despues, se prepararon cuatro viales de vidrio de 20 ml de la misma manera. Dos de ellos se utilizaron para la solucion de trabajo de ARN (2 ml en cada vial) y los otros para la recogida de las mezclas de lfpidos y de ARN, como en (C). En lugar de usar el mezclador T, las jeringas que conteman ARN y los lfpidos se conectaron a uMitos Droplet junction Chip (un dispositivo para microfluidos de vidrio obtenida de Syrris, parte numero 3000158) usando tubos de PTFE (diametro interno de 0,07 cm x 0,17 cm de diametro externo) usando un conector de bordes de 4 lados (Syrris). Las bombas de jeringa impulsaron dos corrientes de ARN y una corriente de lfpidos y la mezcla del etanol y la fase acuosa se realizo en la union X (100 pm x 105 pm) del circuito. El caudal de de las tres corrientes se mantuvo a 1,5 ml/min, por lo tanto, la relacion del caudal total de la fase acuosa y la etanolica fue 2:1. . La salida del tubo se posiciono para recoger las mezclas en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agita). La barra de agitacion se saco y se dejo que la solucion de etanol/acuosa se equilibrara a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues, la mezcla se cargo en una jeringa de 5 cc, que estaba equipada con otra pieza del tubo de PTFE; en otra jeringa de 5 cc con una longitud igual de los tubos de PTFE, se cargo un volumen igual de 100 mM de tampon citrato (pH 6). Las dos jeringas se accionaron a un caudal de 3 ml/min utilizando una bomba de jeringa y la mezcla final se recogio en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agita). A continuacion, los liposomas se concentraron hasta 2 ml y se dializaron contra 10-15 volumenes de 1X PBS utilizando TFF como en (D).
(H) Como el procedimiento (A), excepto que los 2 ml de la solucion madre lipfdica de trabajo se hizo mezclando 120,9 pl de la solucion madre de lfpidos con 1879 ml de etanol. Ademas, despues de la mezcla en el mezclador T, los liposomas del vial de 20 ml se cargaron en un casete de dialisis Pierce Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific, de mayor resistencia, capacidad de 0,5-3 ml) y se dializo frente a 400-500 ml de 1X PBS durante la noche a 4 °C en un recipiente de plastico en autoclave antes de recuperar el producto final.
Expresion de BHK
Los liposomas con diferentes lfpidos se incubaron con celulas BHK durante la noche y se evaluaron para determinar la potencia de expresion de protemas. Desde un momento basal con la expresion de lfpidos de RV05 se podna aumentar 18x mediante la adicion de 10 % de 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPyPE) al liposoma, 10x mediante la adicion de 10 % de 18:2 (cis) fosfatidilcolina, y 900x en lugar de utilizar RV01.
En general, los estudios in vivo mostraron que las colas de lfpidos insaturados tienden a mejorar los tftulos de IgG dirigidos contra antfgenos codificados.
Inmunogenicidad del VRS
El replicon autorreplicantes vA317 que codifican la protema F de VRS se administro a ratones BALB/c, 4 u 8 animales por grupo, mediante vacunaciones intramusculares bilaterales (50 pl por pata) los dfas 0 y 21 con el replicon (1 pg) solo o formulado como liposomas con DlinDMA ( "RV01") o DOTAP ( "RV13"). Los liposomas RV01 teman 40 % de DlinDMA, 10 % de DSpC, 48 % de colesterol y 2 % de pEg-DMG, pero con diferentes cantidades de ARN. Los liposomas RV13 teman 40 %de DOTAP, 10 % de DPE, 48 % de colesterol y 2 % de PEG-DMG. Para la
comparacion, el ADN plasmido desnudo (20 pg) que expresan el mismo antigeno F del VRS se administro usando electroporacion o con liposomas RV01 (10) (0,1 pg de ADN). Se utilizaron cuatro ratones como grupo de control intacto.
Los liposomas se prepararon por el procedimiento de (D) o el procedimiento (B). Para algunos liposomas preparados 5 por el procedimiento (D) se utilizo el doble o la mitad de la cantidad de ARN. El diametro promedio Z de partfcula, el mdice de polidispersidad y la eficiencia de la encapsulacion de los liposomas fueron los siguientes:
RV
Zav (nm) pdl % de encapsulacion Preparacion
RV01 (10)
158,6 0,088 90,7 (A)
RV01 (08)
156,8 0,144 88,6 (A)
RV01 (05)
136,5 0,136 99 (B)
RV01 (09)
153,2 0,067 76,7 (A)
RV01 (10)
134,7 0,147 87,8 * (A)
RV13 (02)
128,3 0,179 97 (A)
*Para esta formulacion RV01 (10), el acido nucleico fue ADN no ARN
Se recogio el suero para el analisis de anticuerpos los dfas 14, 36 y 49. Los bazos se recogieron de los ratones el dfa 49 para el analisis de celulas T.
10 Los tttulos de IgG espedficos de F en suero (GMT) fueron los siguientes:
RV
Dia 14 Dia 36
Plasmido de ADN desnudo
439 6712
ARN A317 desnudo
78 2291
RV01 (10)
3020 26170
RV01 (08)
2326 9720
RV01 (05)
5352 54907
RV01 (09)
4428 51316
RV01 (10) ADN
5 13
RV13 (02)
644 3616
La proporcion de celulas T que son positivas para citocinas y espedficas para el peptido RSV F51-66 son las siguientes, lo que muestra solo las cifras que estan estadfsticamente significativamente por encima de cero:
RV
CD4 + CD8- CD4-CD8 +
IFNy
IL2 IL5 TNFa IFNy IL2 IL5 TNFa
Plasmido de ADN desnudo
0,04 0,07 0,10 0,57 0,29 0,66
ARN A317 desnudo
0,04 0,05 0,08 0,57 0,23 0,67
RV01 (10)
0,07 0,10 0,13 1,30 0,59 1,32
RV01 (08)
0,02 0,04 0,06 0,46 0,30 0,51
RV01 (05)
0,08 0,12 0,15 1,90 0,68 1,94
RV01 (09)
0,06 0,08 0,09 1,62 0,67 1,71
RV01 (10) ADN
0,03 0,08
RV13 (02)
0,03 0,04 0,06 1,15 0,41 1,18
15 Por tanto, las formulaciones de liposomas mejoraron de forma significativa la inmunogenicidad con respecto a los controles de ARN desnudo, tal como se determina por el aumento de los tttulos de IgG espedficas de F y las frecuencias de las celulas T. El ADN plasmfdico formulado con liposomas, o administrado desnudo utilizando
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electroporacion, fue significativamente menos inmunogenico que el ARN autorreplicante formulado en liposomas.
Las vacunas de ARN RV01 eran mas inmunogenicas que la vacuna RV13. RV01 tiene una amina terciaria en el grupo de cabeza con un pKa de aproximadamente 5,8, y tambien incluyen colas alquilo insaturado. RV13 tiene colas alquilo insaturado, pero su grupo de cabeza tiene una amina cuaternaria y es muy fuertemente cationico.
Liposomas: requisitos para encapsulacion
Para evaluar si el efecto observado en los grupos de liposomas era debido simplemente a los componentes de liposomas, o estaba relacionad con la encapsulacion, el replicon se administro en forma encapsulada (con dos protocolos de purificacion diferentes, 0,1 |jg de ARN), o se mezclaron con el liposomas despues de su formacion (un "lipoplex" no encapsulado, 0,1 jg de ARN), o ARN desnudo (1 jg). La figura 10 muestra que el lipoplex di los niveles mas bajos de expresion, lo que demuestra que la encapsulacion es esencial para una expresion potente.
Otros experimentos utilizaron tres ARN diferentes: (i) replicon 'vA317' que expresa RSV-F, es decir, la glicoprotema de fusion de superficie de RSV; (ii) replicon 'va17' que expresa GFP; y (iii) 'vA336' con replicacion defectuosa y codifica GFP.
Los ARN se administrados desnudos o con liposomas preparados por el procedimiento (D). Los liposomas vados se hicieron por el procedimiento de (D), pero sin ningun tipo de ARN. Cuatro formulaciones de liposomas teman las siguientes caractensticas:
ARN
Zav del tamano de particula (nm) Polidispersidad Encapsulacion del ARN
vA317
155,7 0,113 86,6 %
vA17
148,4 0,139 92 %
vA336
145,1 0,143 92,9 %
Vado
147,9 0,147 -
Se administro a ratones BALB/c, a 5 animales por grupo, vacunaciones intramusculares bilaterales (50 jl por pata) los dfas 0 y 21 con:
Grupo 1 ARN RSV-F autorreplicante desnudo (vA317, 0,1 jg)
Grupo 2 ARN RSV-F autorreplicante (vA317, 0,1 jg) encapsulado en liposomas Grupo 3 ARN RSV-F autorreplicante (vA317, 0,1 jg) anadido a liposomas vados Grupo 4 Protema de la subunidad F (5 jg)
Se recogio el suero para el analisis de anticuerpos los dfas 14, 35 y 51. Los tttulos sericos de IgG espedficos de F (GMT) se midieron; Si un animal individual tema un tftulo de <25 (ftmite de deteccion), se le asigno un tftulo de 5. Ademas, los bazos se recogieron de los ratones el dfa 51 para el analisis de celulas T, para determinar las celulas que eran de positivas para las citocinas y espedficas del peptido F51-66 del VRS (CD4 +) o para los peptidos F del VRS F85-93 y F249-258 (CD8 +).
Los tftulos de IgG fueron los siguientes en los 10 grupos y en ratones de control no inmunizados
Dia
1 2 3 4 -
14
22 1819 5 5 5
35
290 32533 9 19877 5
51
463 30511 18 20853 5
los tftulos de neutralizacion en suero del CRS el dfa 51 fueron los siguientes:
Dia
1 2 3 4
51
35 50 24 38
Los animales que muestren las celulas esplenicas CD4 + -espedficos de F del VRS el dfa 51 fueron los siguientes, en la que se da un numero (% de celulas positivas) solo si la respuesta estimulada fue estadfstica y
significativamente por encima de cero
Citocina
1 2 3 4
IFN-y
0,04
IL2
0,02 0,06 0,02
IL5
TNFa
0,03 0,05
Los animales que muestren las celulas esplenicas CD8 + -espedficos de F del VRS el dfa 51 fueron los siguientes, en la que se da un numero solo si la respuesta estimulada fue estadfstica y significativamente por encima de cero
Citocina
1 2 3 4
IFN-y
0,37 0,87
IL2
0,11 0,40 0,04
IL5
TNFa
0,29 0,79 0,06
5
Por tanto, la encapsulacion del ARN dentro de los liposomas es necesaria para la alta inmunogenicidad, como una simple mezcla de ARN y los liposomas (grupo 3) no fue inmunogenica (de hecho, menos inmunogenica que el ARN desnudo).
En otros estudios, los ratones recibieron diversas combinaciones de (i) ARN replicon autorreplicante que codifica la 10 protema F del VRS de longitud completa larga (ii) replicon de ARN autorreplicante que codifica GFP (iii) Replicon
ARN que codifica GFP con una inactivacion de nsP4 que elimina la autorreplicacion (iv) protema F del vRs de longitud completa. En total, 13 grupos recibieron:
A
- -
B
0,1 |jg de (i), desnudo -
C
0,1 jg de (i), encapsulado en liposomas -
D
0,1 jg de (i), con liposomas aparte -
E
0,1 jg de (i), desnudo 10 jg de (ii), desnudo
F
0,1 jg de (i), desnudo 10 jg de (iii), desnudo
G
0,1 jg de (i), encapsulado en liposomas 10 jg de (ii), desnudo
H
0,1 jg de (i), encapsulado en liposomas 10 jg de (iii), desnudo
I
0,1 jg de (i), encapsulado en liposomas 1 jg de (ii), encapsulado en liposomas
J
0,1 jg de (i), encapsulado en liposomas 1 jg de (iii), encapsulado en liposomas
C
5 jg de protema F -
L
5 jg de protema F 1 jg de (ii), encapsulado en liposomas
M
5 jg de protema F 1 jg de (iii), encapsulado en liposomas
Resultados en la Figura 16 muestran que las respuestas de IgG espedfica de requirieron encapsulacion en liposoma 15 en lugar de la mera administracion conjunta (comparacion de los grupos C y D). Una comparacion de los grupos K, L y M muestra que el ARN proporciono un efecto adyuvante frente a la protema administrada de forma conjunta, y este efecto se observo con el ARN tanto replicante como no replicante.
Inmunogenicidad del VRS en diferentes cepas de raton
El replicon "vA142" codifica la glicoprotema de fusion (F) de superficie de tipo silvestre de longitud completa del VRS 20 pero con el peptido de fusion eliminado, y el extremo 3' esta formado por escision mediada por ribozima. Se analizo en tres cepas diferentes de raton
Se administro a los ratones Balb/c vacunaciones intramusculares bilaterales (50 |jl por pata) los dfas 0 y 22. Los animales se dividieron en 8 grupos de prueba (5 animales por grupo) y un control intacto (2 animales).
El grupo 1 recibio el replicon desnudo (1 jg).
El grupo 2 recibio 1 jg de replicon administrado en liposomas "RV01 (37)" con 40 % de DlinDMA, 10 % de 5 DSPC, 48 % de Chol, 2 % de DMG conjugado con PEG.
El grupo 3 recibio lo mismo que el grupo 2, pero a 0,1 jg de ARN.
El grupo 4 recibio 1 jg de replicon en liposomas "RV17 (10)" (40 % de RV17 (vease anteriormente), 10 % de DSPC, 49,5 % de colesterol, 0,5 % de PEG-DMG).
El grupo 5 fueron 1 jg de replicon en los liposomas "RV05 (11)" (40 % de lfpidos RV07, 30 % de 18: 2 PE 10 (DLoPE, 28 % de colesterol, 2 % de PEG-DMG).
El grupo 6 recibio 0,1 jg de replicon en los liposomas en “RV17 (10)".
El grupo 7 recibio 5 jg de la protema de la subunidad RSV-F con adyuvante de hidroxido de aluminio.
El grupo 8 eran un control no tratados (2 animales)
Los sueros se recogieron para el analisis de anticuerpos los dfas 14, 35 y 49. Los valores de GMT IgG en suero 15 espedficos de F fueron los siguientes:
Dia
1 2 3 4 5 6 7 8
14
82 2463 1789 2496 1171 1295 1293 5
35
1538 34181 25605 23579 13718 8887 73809 5
El dfa 35, los tttulos de IgG2a (GMT) y IgG1 espedficos de F fueron las siguientes:
IgG
1 2 3 4 5 6 7
igG1
94 6238 4836 7425 8288 1817 78604
IgG2a
5386 77064 59084 33749 14437 17624 24
Los tttulos de anticuerpos neutralizantes en suero del VRS los dfas 35 y 49 fueron los siguientes (los datos son un 60 % de reduccion de los tttulos de neutralizacion de las mezclas de 2-5 ratones, 1 mezcla por grupo).
Dia
1 2 3 4 5 6 7 8
35
< 20 143 20 101 32 30 111 < 20
49
< 20 139 < 20 83 41 32 1009 < 20
20 Los bazos se recogieron el dfa 49 para el analisis de celulas T. Las frecuencias promedio de celulas T positivas para las citocinas espedficas de F (CD4 + o CD8 +) fueron las siguientes, que solo muestran cifras que fueron estadfsticamente significativas por encima de cero (espedficos de los peptidos del VRS F51-66, F164-178, F309- 323 para CD4 + , o para los peptidos F85-93 y F249-258 para CD8 + ):
Grupo
CD4 + CD8- CD4-CD8 +
IFNy
IL2 IL5 TNFa IFNy IL2 IL5 TNFa
1
0,03 0,06 0,08 0,47 0,29 0,48
2
0,05 0,10 0,08 1,35 0,52 1,11
3
0,03 0,07 0,06 0,64 0,31 0,61
4
0,05 0,09 0,07 1,17 0,65 1,09
5
0,03 0,08 0,07 0,65 0,28 0,58
6
0,05 0,07 0,07 0,74 0,36 0,66
7
0,02 0,04 0,04
8
Se inmunizo a los ratones C57BL/6 de la misma manera, pero un 9° grupo recibio VRP (1 x 106 UI) que expresaba la glicoprotema de tipo silvestre de fusion superficial de longitud completa del VRS (delecion del peptido de fusion).
Los sueros se recogieron para el analisis de anticuerpos los dfas 14, 35 y 49 de tftulos IgG espedficos de F (GMT):
Dia
1 2 3 4 5 6 7 8 9
14
1140 2133 1026 2792 3045 1330 2975 5 1101
35
1721 5532 3184 3882 9525 2409 39251 5 12139
El dfa 35, los tftulos de IgG2a (GMT) y IgG1 espedficos de F fueron las siguientes:
IgG
1 2 3 4 5 6 7 8
igG1
66 247 14 328 468 92 56258 79
IgG2a
2170 7685 5055 6161 1573 2944 35 14229
5
Los tftulos de anticuerpos neutralizantes en suero del VRS los dfas 35 y 49 fueron los siguientes (los datos son un 60 % de reduccion de los tftulos de neutralizacion de las mezclas de 2-5 ratones, 1 mezcla por grupo).
Dia
1 2 3 4 5 6 7 8 9
35
< 20 27 29 22 36 < 20 28 < 20 < 20
49
< 20 44 30 23 36 < 20 33 < 20 37
Los bazos se recogieron el dfa 49 para el analisis de celulas T. Las frecuencias Promedio de las celulas T positivas 10 para citocinas (CD8 +) fueron las siguientes, lo que muestra que solo las cifras que eran estadfsticamente significativamente por encima de cero (espedficos para los peptidos de RSV y F85-93 y F249-258):
Grupo
CD4-CD8 +
IFNy
IL2 IL5 TNFa
1
0,42 0,13 0,37
2
1,21 0,37 1,02
3
1,01 0,26 0,77
4
1,26 0,23 0,93
5
2,13 0,70 1,77
6
0,59 0,19 0,49
7
0,10 0,05
8
9
2,83 0,72 2,26
Nueve grupos de ratones C3H/HeN fueron inmunizados de la misma forma. Los tftulos de IgG espedficos de F (GMT) fueron los siguientes:
Dia
1 2 3 4 5 6 7 8 9
14
5 2049 1666 1102 298 984 3519 5 806
35
152 27754 19008 17693 3424 6100 62297 5 17249
15 El dfa 35, los tftulos de IgG2a (GMT) e IgG1 espedficos de F fueron las siguientes:
IgG
1 2 3 4 5 6 7 8
igG1
5 1323 170 211 136 34 83114 189
IgG2a
302 136941 78424 67385 15667 27085 3800 72727
5
10
15
20
25
30
35
40
Los tftulos de anticuerpos neutralizantes en suero del VRS los dfas 35 y 49 fueron los siguientes:
Dia
1 2 3 4 5 6 7 8 9
35
< 20 539 260 65 101 95 443 < 20 595
49
< 20 456 296 35 82 125 1148 < 20 387
Por tanto, tres diferentes ftpidos (RV01, RV05, RV17; pKa 5,8, 5,85, 6,1) se analizaron en tres diferentes cepas puras raton. Para todas las 3 cepas, RV01 fue mas eficaz que RV17; par las cepas BALB/cy C3H, RV05 fue menos eficaz que cualquiera de los dos o RV01 RV17, pero fue mas eficaz en la cepa B6. En todos los casos, sin embargo, los liposomas fueron mas efectivos que dos nanoemulsiones cationicos que se probaron en paralelo.
Inmunogenicidad del CMV
Los liposomas RV01 con DLinDMA como el ftpido cationico se utilizaron para administrar replicones de ARN que codifican las glicoprotemas de citomegalovirus (CMV). El replicon “vA160” codifica las glicoprotemas longitud completa en H y L (gH/gL), mientras que el replicon “vA322” codifica una forma soluble (gHsol/GL). Las dos protemas estan bajo el control de promotores subgenomicos independientes en un unico replicon; la coadministracion de dos vectores separados, uno que codifica gH y uno que codifica gL, no dio buenos resultados-
A ratones BALB/c, 10 por grupo, se les administraron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 pl por pata) los dfas 0, 21 y 42 con VRP que expresa gH/gL (1 x 106 UI), VRP que expresa gHsol/gL (1 x 10 6 Ul) y PBS como los controles. Dos grupos de ensayo recibieron 1 pg de replicon vA160 o vA322 formulado en liposomas (40 % de DlinDMA, 10 % de DSPC, 48 % de Chol, 2 % de PEG-DMG; hechas utilizando el procedimiento de (D), pero con 150 pg de ARN tamano del lote).
Los liposomas vA160 teman un diametro vA160 Zav de 168 nm, un PDI de 0144, y el 87,4% de encapsulacion. Los liposomas vA322 teman un diametro vA160 Zav de 162 nm, un PDI de 0,131 y el 90 % de encapsulacion.
Los sueros se recogieron para el analisis de anticuerpos los dfas 14, 35 y 49 de tftulos IgG espedficos de F (GMT):
Se recogieron los sueros para analisis inmunologicos en el dfa 63 (3wp3). Los tftulos de neutralizacion CMV (el redproco de la dilucion de suero que produce una reduccion del 50 % en el numero de focos de virus por pocillo positivo, respecto a los controles) fueron los siguientes:
gH/gL VRP
gHsol/gL VRP Liposoma gH/gL Liposoma gHsol/gL
4576
2393 4240 10062
El ARN que manifieste una forma de longitud completa o soluble del complejo CMV gH/g produjo tftulos altos de anticuerpos neutralizantes, como se analizo en las celulas epiteliales. Los tftulos promedio provocados por los ARN encapsulados en liposomas eran al menos tan altos como para los correspondientes VRP.
La repeticion de los experimentos confirmo que el replicon era capaz de expresar dos protemas a partir de un solo vector. El replicon de ARN dio un tftulo 3wp3 de 11.457, en comparacion con 5516 con VRP.
Otros experimentos utilizaron diferentes replicones, ademas de vA160. El replicon vA526 expresa el complejo pentamerico del CMV (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) bajo el control de tres promotores subgenomicos: el primero dirige la expresion de gH; el segundo dirige la expresion de unidades gL; el tercero dirige la expresion de la poliprotema UL128-2a-UL130-2a-UL131, que contiene dos sitios de escision 2a entre los tres genes de UL. El replicon vA527 expresa el complejo pentamerico del CMV a traves de tres promotores subgenomicos y dos IRES: El primer promotor subgenomico dirige la expresion de gH; el segundo promotor subgenomico dirige la expresion de gL; el tercer promotor subgenomico dirige la expresion de UL128; UL130 esta bajo el control de un del IRES EMCV; UL131 esta bajo el control de un IRES EV71. Estos tres replicones fueron administrados por liposomas (procedimiento (H), con 150 pg de tamano de lote) o por VRP.
Se administro a ratones BALB/c, 10 grupos de 10 animales, vacunaciones intramusculares bilaterales (50 pl por pata) los dfas 0, 21 y 42 con:
Grupo 1 VRP que expresan gH FL/gL (1 x 106 UI)
Grupo 2 pentamerico, 2a VRP (1 x 105 UI)
Grupo 3 pentamerico, 2a VRP (1 x 106 UI)
Grupo 4 pentamerico, IRES VRP (1 x 105 UI)
5
10
15
20
25
30
Grupo 5 ARN autorreplicante vA160 (1 pg) formulado en liposomas
Grupo 6 ARN autorreplicante vA526 (1 pg) formulado en liposomas
Grupo 7 ARN autorreplicante vA527 (1 pg) formulado en liposomas
Grupo 8 ARN autorreplicante vA160 (1 pg) formulado en una nanoemulsion cationica
Grupo 9 ARN autorreplicante vA526 (1 pg) formulado en una nanoemulsion cationica
Grupo 10 ARN autorreplicante vA527(1 pg) formulado en una nanoemulsion cationica Se recogieron los sueros para analisis inmunologicos los dfas 21 (3wp1), 42 (3wp2) y 63 (3wp3).
Los tttulos de neutralizacion en suero de CMV los dfas 21, 42 y 63 fueron los siguientes
Grupo de vacuna
3wP1 3wp2 3wp3
1
126 6296 26525
2
N/A N/A 6769
3
N/A 3442 7348
4
N/A N/A 2265
5
347 9848 42319
6
179 12210 80000
7
1510 51200 130000
8
N/A N/A 845
9
N/A N/A 228
10
N/A N/A 413
Por lo tanto, el ARN autorreplicante se puede utilizar para expresar multiples antfgenos a partir de un unico vector y para provocar una respuesta inmunitaria potente y espedfica. El replicon puede expresar cinco antfgenos (complejo pentamerico del CmV (GH-GL-UL128-UL130-UL-131) y provocar una respuesta inmunitaria potente. El ARN autorreplicante administrado en liposomas fue capaz de producir tftulos altos de anticuerpos neutralizantes, segun se analizo en celulas epiteliales, en todos los puntos de tiempo analizados (3wp1, 3wp2, 3wp3). Estas respuestas fueron superiores a los VRP correspondientes y a las nanoemulsiones cationicas.
Volumen de administracion
La administracion hidrodinamica emplea la fuerza generada por la rapida inyeccion de un gran volumen de solucion para superar las barreras ffsicas de las membranas celulares que impide la entrada de compuestos grandes e impermeables a la membrana en las celulas. Previamente se ha demostrado que este fenomeno es util para la administracion intracelular de vacunas de ADN
Un volumen de administracion tfpico en raton para inyeccion intramuscular es de 50 pl en la pata trasera, que es un volumen relativamente alto para un musculo de la pata de raton. Por el contrario, una dosis intramuscular humana de ~0,5 ml es relativamente pequena. Si la inmunogenicidad en ratones fuera dependiente del volumen, la eficacia de las vacunas de replicon podna deberse, al menos en parte, a las fuerzas hidrodinamicas, que no sena alentador el uso las mismas vacunas en seres humanos y en animales mas grandes.
El replicon vA317 se administro a ratones BALB/c, 10 por grupo, mediante vacunaciones intramusculares bilaterales (5 o 50 por pata) los dfas 0 y 21:
El grupo 1 recibio el replicon desnudo, 0,2 pg en 50 pl por pata
El grupo 2 recibio el replicon desnudo, 0,2 pg en 5 pl por pata
El grupo 3 recibio replicon formulado en liposomas (0,2 pg, 50 pl por pata)
El grupo 4 recibio replicon formulado en liposomas (0,2 pg, 5 pl por pata)
Los sueros se recogieron para el analisis de anticuerpos los dfas 14, 35 y 49. Los valores de GMT de IgG en suero espedficos de F fueron:
Dia
1 2 3 4
14
42 21 2669 2610
35
241 154 17655 18516
Por lo tanto, la inmunogenicidad del replicon formulado no vario de acuerdo con el volumen administrado, lo que indica que estas vacunas de ARN no se basan en la administracion hidrodinamica para su eficacia.
Cinetica de la expresion
5 Se utilizo un replicon de ARN autorreplicante (“vA311”) que expresa un gen indicador de luciferasa (luc) para el estudio de la cinetica de la expresion de la protema despues de la inyeccion. Los ratones BALB/c, a 5 animales por grupo, recibieron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 pl por pata) el dfa 0 con:
Grupo 1 de ADN de luciferasa que expresa, administrado mediante electroporacion (10 pg)
Grupo 2 ARN autorreplicante (1 pg) formulado en liposomas
10 Grupo 3 ARN autorreplicante (1 pg) formulado en una nanoemulsion cationica
Grupo 4 ARN autorreplicante (1 pg) formulado en una nanoemulsion cationica
Grupo 5 VRP (1 x 106 UI) que expresa luciferasa
Antes de la vacunacion se afeito a los ratones. Se anestesio a los ratones (2 % de isoflurano en oxfgeno), el pelo se elimino primer con una maquina de afeitar electrica y despues con crema qmmica Nair. A continuacion, los datos de 15 bioluminiscencia se adquirieron usando un sistema de formacion de imagines Xenogen IVIS 200 (Caliper Life Sciences los dfas 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63 y 70. Cinco minutos antes de la formacion de imagenes, se inyecto a los ratones por via intraperitoneal con 8 mg/kg de la solucion de luciferina. A continuacion, se anestesio a los animales y se transfirio al sistema de formacion de imagenes. Los tiempos de adquisicion de imagenes se mantuvieron constantes como senal de bioluminiscencia se midio con una camara CCD enfriada.
20 En terminos visuales, se observaron celulas que expresan luciferasa que permaneceran principalmente en el sitio de la inyeccion de ARN, y se realizaron imagines de los animales despues de la eliminacion de quads no mostraron ninguna senal.
En terminos cuantitativos, la expresion de luciferasa se midio como la radiancia promedio durante un penodo de 70 dfas (p //s/cm2/sr), y los resultados fueron los siguientes para los 5 grupos:
Dias
1 2 3 4 5
3
8 CT> CD E + 07 3 33 E + CD O 2 11 E + CD O 9 71 E + CD O 1 CD E + 07
7
1 ,04 E + 00 o 8 14 E + CD O 1 CO 00 E + 07 5 CD 4^ E + 07 1 "3- CD E + 07
14
8 ,16 E + 07 2 91 E + CD O 9 ,22 E + CD O 3 00 E + 07 8 4^ CD E + o cn
21
1 ,27 E + 07 3 13 E + O cn 6 -M CD E + 04 5 07 E + O cn 6 -M CD E + o cn
28
1 CM E + 07 6 37 E + o cn 2 CD CO E + 04 4 CD O E + CO o 2 O O E + CO o
35
1 ,21 E + 07 6 12 E + o cn 2 00 O E + CO O
42
1 4^ CD E + 07 8 70 E + o cn
49
1 ,17 E + 07 2 04 E + o cn
63
9 CT> CD E + CD O 1 CM E + CO o
70
9 ,29 E + CD O
25
El ARN autorreplicante formulado con nanoemulsiones cationicas mostro bioluminiscencia mensurable el dfa 3, que alcanzo su punto maximo el dfa 7 y despues se redujo a niveles de fondo los dfas 28 a 35. Cuando se formulan en liposomas, el ARN mostro bioluminiscencia mensurable el dfa 3, que alcanzo su punto maximo el dfa 7 y se redujo a los niveles de fondo el dfa 63. El ARN administrado usando VRP mostro una bioluminiscencia mejorada el dfa 21, en 30 comparacion con el ARN formulado, pero la expresion se habfa reducido a niveles de fondo para el dfa 28. El ADN sometido a electroporacion mostro el nivel mas alto de la bioluminiscencia en todos los puntos de tiempo medidos y los niveles de bioluminiscencia no se redujeron a niveles de fondo en el plazo de 70 dfas del experimento.
Via de administracion
El ARN encapsulado en liposomas que codifica la gp140 del VIH se administro a los ratones por via intramuscular, intradermica, o subcutanea. Las tres v^as condujeron a niveles de IgG en suero elevados de anticuerpos espedficos del VIH (Figura 15), superando los tftulos observados en respuesta al ADN intramuscular sometido a 5 electroporacion.
Ratas de algodon
Se realizo un estudio en ratas de algodon (Sigmodon hispidis) en lugar de con ratones. A una dosis de 1 |jg de liposomas de encapsulacion, los tftulos de IgG espedficas se multiplicaron por 8,3 en comparacion con el ARN desnudo y los tftulos de PRNT se multiplicaron por r 9,5. La magnitud de la respuesta de anticuerpos fue equivalente 10 a la inducida por 5x106 UI de VRP. Tanto el ARN desnudo como encapsulado en liposomas pudieron proteger a las ratas de algodon de la exposicion al VRS (1 x 105 unidades formadoras de placa), reduciendo la carga vftica pulmonar en al menos 3,5 logs. La encapsulacion aumento la reduccion aproximadamente 2 veces.
Otros trabajos con ratas del algodon utilizaron cuatro replicones diferentes: vA317 expresa VRS-F de longitud completa; vA318 expresa VRS-F truncado (transmembrana y citoplasmico con la cola eliminada); vA142 expresa 15 VRS-F con su peptido de fusion eliminado; vA140 expresa vRS-F truncado tambien sin su peptido. Se administro a las ratas del algodon, de 4 a 8 animales por grupo, vacunaciones intramusculares (100 jl en una pierna los dfas 0 y 21 con los cuatro replicones diferentes a dos dosis (1,0 y 0,1 jg) formulados en liposomas fabricados mediante el procedimiento (D), pero con un tamano de lote del ARN de 150 jg. Los grupos de control recibieron una vacuna de protemas de la subunidad VRS-F (5 jg) con adyuvante con alumbre (8 animales/grupo), Los bree que expresan 20 VRS-F de longitud completa (1 x 106 IU, 8 animales/grupo), o control no tratados (4 animales /grupo). Se recogio el suero para el analisis de anticuerpos los dfas 0, 21 y 34.
Los tftulos de IgG en suero espedficos de F y los tftulos y de anticuerpos neutralizantes en suero del VRS los dfas 21 y 34 fueron los siguientes:
Grupo
IgG, dia 21 IgG, dia 34 NT, dia 21 NT, dia 34
1 jg de vA317
915 2249 115 459
0,1 jg de vA317
343 734 87 95
1 jg de vA31/
335 1861 50 277
0,1 jg de vA31/
129 926 66 239
1 jg de vA142
778 4819 92 211
0,1 jg de vA142
554 2549 78 141
1 jg de vA140
182 919 96 194
0,1 jg de vA140
61 332 29 72
5 jg de subunidad trimerica de F/alumbre
13765 86506 930 4744
1 x 106 UI de VRP-F completo
1877 19179 104 4528
No tratadas antes
5 5 10 15
25 Los cuatro replicones evaluados en este estudio (vA317, vA318, vA142, vA140) fueron inmunogenicos en las ratas de algodon cuando fueron administrados por liposomas, aunque los tftulos de neutralizacion en suero fueron al menos diez veces menores que los inducidos por las vacunas de protema con adyuvante o por VRP. Las vacunas con liposoma/ARN provocaron IgG espedfica de F en suero y anticuerpos neutralizantes del VRS despues de la primera vacunacion, y una segunda vacunacion reforzo la respuesta eficaz. Los tftulos de IgG espedfica de F 30 despues de la segunda vacunacion con 1 jg de replicon fueron de 2 a 3 veces mayores que despues de la segunda vacunacion con 0,1 jg de replicon. Los cuatro replicones provocaron tftulos de anticuerpos comparables, lo que sugiere que el VRS-F de longitud completa y truncado, cada uno con o sin el peptido de fusion, son igualmente inmunogenicos en ratas del algodon.
Mas trabajos realizados con ratas del algodon de nuevo utilizaron los replicones vA317, vA318 y vA142. Se 35 administro a las ratas del algodon, de 2 a 8 animales por grupo, vacunaciones intramusculares (100 jl en una pierna los dfas 0 y 21 con los replicones diferentes a dos dosis (0,1 y 1 jg) encapsulados en liposomas RV01 fabricados mediante el procedimiento (D), pero con un tamano de lote del ARN de 150 jg. Los grupos control recibieron la vacuna de la protema de subunidad VRS-F (5 jg) con adyuvante con alumbre o VRP que expresan VRS-F de longitud completa (1 x 106 UI, 8 animales/grupo). Todos estos animales recibieron una tercera vacunacion (dfa 56) 40 con la vacuna de la protema de la subunidad VRS-F (5 jg) con adyuvante con alumbre. Ademas, hubo un control no tratado (4 animales/grupo). Ademas, a un grupo adicional se aplico se administraron vacunas intramusculares
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bilaterales (50 jl por pata) los dfas 0 y 56 con 1 |jg de ARN vA317 en liposomas, pero no recibio una tercera vacunacion con la vacuna de protema de subunidad.
Se recogio el suero para el analisis de anticuerpos los dfas 0, 21, 35, 56, 70, mas los dfas 14, 28 y 42 para el grupo adicional. Los tftulos de IgG espedficos de F en suero (GMT) fueron los siguientes:
Dia 21 Dia 35 Dia 56 Dia 70
1 jg de vA31/
260 1027 332 14263
0,1 jg de vA31/
95 274 144 2017
1 jg de vA142
483 1847 1124 11168
0,1 jg de vA142
314 871 418 11023
1 jg de vA317
841 4032 1452 13852
1 x 106UI de VRP (F completo)
2075 3938 1596 14574
5 jg de subunidad trimerica de F/alumbre
12685 54526 25846 48864
No tratadas antes
5 5 5 5
Los tftulos de neutralizacion en suero fueron los siguientes (60 % de tftulos de neutralizacion del VRS para 2 grupos de 3-4 animales por grupo, GMT de estas 2 mezclas por grupo):
Dia 21 Dia 35 Dia 56 Dia 70
1 jg de vA31/
58 134 111 6344
0,1 jg de vA31/
41 102 63 6647
1 jg de vA142
77 340 202 5427
0,1 jg de vA142
35 65 56 2223
1 jg de vA317
19 290 200 4189
1 x 106UI de VRP (F completo)
104 1539 558 2876
5 jg de subunidad trimerica de F/alumbre
448 4457 1630 3631
No tratadas antes
10 10 10
Los tftulos sericos y los tftulos neutralizantes para el grupo adicional fueron los siguientes:
Dia
14 21 28 35 42 56 70
IgG
397 561 535 501 405 295 3589
NT
52 82 90 106 80 101 1348
Por tanto, se confirma que los replicones son inmunogenicos en las ratas del algodon, y provocan anticuerpos de tipo IgG espedfica de F y neutralizantes del VRS en suero despues de la primera vacunacion. Una segunda vacunacion reforzo las respuestas de manera efectiva. Los tftulos de IgG espedfica de F despues de la segunda vacunacion con 1,0 jg de replicon fueron de 1,5 a 4 veces mayores que despues de la segunda vacunacion con 0,1 jg de replicon.
La tercera vacunacion (protema el dfa 56) no reforzo los tftulos en las ratas del algodon previamente vacunados con la subunidad trimerica de F + alumbre, pero sf proporciono un gran refuerzo de los tftulos en las ratas del algodon previamente vacunadas con replicon. En la mayona de los casos, los tftulos de neutralizacion en suero de VRS despues de dos vacunaciones con replicon, seguido de refuerzo con protemas fueron iguales o mayores que los tftulos inducidos por dos o tres vacunas de protemas secuenciales.
En este estudio tambien se evaluo la cinetica de la respuesta de anticuerpos a 1,0 jg de vA317. Los tftulos de IgG espedfica de F y los tftulos de neutralizacion del VRS inducidos por una sola vacunacion alcanzaron su punto maximo alrededor del dfa 21 y se mantuvieron durante al menos 56 dfas (descenso del 50-70 % en el tftulo de IgG espedficas de F, pocos cambios en el tftulo de neutralizacion del VRS). Se administro una segunda vacunacion homologa a estos animales el dfa 56 y aumento los tftulos de anticuerpos a un nivel al menos igual al alcanzado cuando la segunda vacunacion se administro el dfa 21.
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Otros experimentos implicaron una exposicion vftica. El replicon vA368 codifica la glicoprotema de fusion de la superficie de tipo silvestre de longitud completa del VRS con el peptido de fusion eliminado, con la expresion impulsada por el IRES EV71. Se administro a las ratas del algodon, 7 por grupo, vacunas intramusculares (100 pm por pata) los dfas 0 y 21 con vA368 en los liposomas preparados por el procedimiento (H), 175 pg de ARN de tamano de lote o con VRP con el mismo replicon. Un grupo de control recibio 5 pg de protema con adyuvante de alumbre y tambien se incluyo un grupo de control no tratados.
Todos los grupos recibieron una exposicion intranasal (por via intranasal) con 1 x 106 de UFP del VRS durante cuatro semanas despues de la inmunizacion final. Se recogio el suero para el analisis de anticuerpos los dfas 0, 21, 35. Los tftulos pulmonares vfticos se midieron 5 dfas despues de la exposicion. Los resultados fueron los siguientes:
Liposoma VRP Protema No tratadas antes
Tftulos de IgG espedficos de F (GMT)
Dia 21
370 1017 28988 5
Dia 35
2636 2002 113843 5
Tftulos neutralizantes (GMT)
Dia 21
47 65 336 10
Dia 35
308 271 5188 10
Carga virica pulmonar (UFP por gramo de pulmon)
Dia 54
422 225 124 694110
Por tanto, la vacuna de ARN redujo carga virica pulmonar en mas de tres log, de aproximadamente 106 UFP/g en las ratas del algodon de control no vacunadas a menos de 103 UFP/g en ratas del algodon vacunadas.
Estudio en mam^feros grandes
Se realizo un estudio de mairftferos grandes en ganado bovino. Los terneros (4-6 semanas de edad, ~60-80 kg, 5 por grupo) fueron inmunizados con 66 pg de replicon vA317 que codifica la protema F del VRS de longitud completa los dfas 0, 21, 86 y 146. Los replicones se formularon dentro de liposomas. Se uso PBS solo como control negativo y una vacuna autorizada se utilizo como control positivo (“Triangulo 4” de Fort Dodge, con virus muertos). Todos los terneros recibieron 15 pg de protema F con adyuvante con la emulsion MF59 el dfa 146. Una vaca fue vacunada por error con la vacuna equivocada en el dfa 86 en lugar del Triangulo 4, por lo que sus datos se excluyeron del dfa 100 en adelante.
Las vacunas de ARN codifico la F del VRS, mientras que la vacuna “Triangulo 4” contiene F del VRS bovino, pero la protema F del VRS esta altamente conservada entre BRSV y HRSV.
Los liposomas se fabricaron mediante el procedimiento de DESDE EL, excepto que se utilizaron 1,5 mg de tamano de lote de ARN.
Los terneros recibieron 2 ml de cada vacuna experimental administrados, por via intramuscular como 2 Xg1 ml en cada lado del cuello. Por el contrario, la vacuna del “Triangulo 4” se administro en una sola dosis de 2 ml en el cuello.
El suero se recogio para el analisis de anticuerpos los dfas 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 181, 188, 195, y 202. Si un animal individual tema un tftulo por debajo del ftmite de deteccion fue asignado un tftulo.
La Figura 14a muestra tftulos de IgG espedficos de F durante los primeros 63 dfas. El replicon de ARN era inmunogenico en las vacas a traves de liposomas, a pesar de que dio tftulos mas bajos que la vacuna autorizada. Todas las vacas vacunadas mostraron anticuerpos espedficos de F despues de la segunda dosis y los tftulos fueron muy estables desde el penodo de 2 a 6 semanas despues de la segunda dosis (y fueron particularmente estables para las vacunas de ARN).
La Figura 14B muestra tftulos de IgG en suero espedficos de F (GMT) durante 210 dfas y los valores medidos hasta 202 dfas fueron los siguientes:
D0 3wp1 D21 2wp2 D35 5wp2 D56 ~9wp2 D86 2wp3 D100 5wp3 D121 8wp3 D146 2wp4 D160 5wp4 D181 8wp4 D202
PBS
5 5 5 5 5 5 5 5 46 98 150
Liposoma
5 5 12 11 20 768 428 74 20774 7022 2353
Triangulo 4
5 5 1784 721 514 3406 2786 336 13376 4775 2133
Los tftulos de anticuerpos neutralizantes en suero de VRS fueron los siguientes:
D0 2wp2 D35 5wp2 D56 2wp3 D100 3wp3 D107 4wp3 D114 8wp3 D146 2wp4 D160 3wp4 D167 4wp4 D174
PBS
12 10 10 14 18 20 14 10 10 10
Liposoma
13 10 10 20 13 17 13 47 26 21
Triangulo 4
12 15 13 39 38 41 13 24 26 15
5 El material utilizado para la segunda dosis de liposomas no estaba recien preparado y el mismo lote de ARN mostro una disminucion de la potencia en un estudio de inmunogenicidad de raton. Por lo tanto es posible que la vacuna pudiera haber sido mas inmunogenica si se hubiera usado material recien preparado para todas las vacunaciones.
Cuando se analizo con el complemento, se detectaron anticuerpos neutralizantes en todas las vacas vacunadas. En este ensayo, todos los terneros vacunados teman buenos tftulos de anticuerpos neutralizantes despues de la 10 segunda vacunacion con ARN. Ademas, la vacuna con ARN produjo tftulos de IgG en suero espedficos de F detectados en algunos terneros despues de la segunda vacunacion y en todos los terneros despues de la tercera.
La VSR-F adyuvada con MF59 fue capaz de reforzar la respuesta de IgG en todos los terneros vacunados previamente y de reforzar los tftulos de neutralizacion independientes del complemento de los terneros vacunados previamente con ARN.
15 La prueba de concepto para las vacunas de ARN en animales grandes es particularmente importante en vista de la perdida en la potencia observada previamente con las vacunas basadas en ADN cuando se pasa de modelos de animales pequenos a modelos de animales mas grandes y seres humanos. Una dosis tfpica para una vacuna de ADN de vaca sena 0,5-1 |ig [47,48] y, por tanto, es muy alentador que las respuestas inmunitarias se indujeron con solamente 66 |jg de ARN
20 Tabla 1: Fosfottpidos utiles
DDPC
DEPA
DEPC
DEPE
DEPG
DLOPC
DLPA
DLPC
DLPE
DLPG
DLPS
DMG
DMPA
DMPC
DMPE
1.2- dioctanoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
1.2- Dierucoil-sn-Glicero-3-fosfato
1.2- eurocoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
1.2- Dierucoil-sn-Glicero-3-fosfatidileranolamina
1.2- Dierucoil-sn-Glicero-3-[fosfatidil-rac-(1-glicerol)
1.2- linoleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
1.2- Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfato
1.2- dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
1.2- dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
1.2- Dilauroil-sn-Glicero-3-[fosfatidil-rac-(1-glicerol)
1.2- dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
1.2- Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfato
1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
1.2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
(continuacion)
DMPG
1,2-miristoil-sn-Glicero-3-[fosfatidil-rac-(1-glicerol)
DMPS
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
DOPA
1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfato
DOPC
1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
DOPE
1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina
DOPG
1,2-Dioleil-sn-Glicero-3-[fosfatidil-rac-(1-glicerol)
DOPS
1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina
DPPA
1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfato
DPPC
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DPPE
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina
DPPG
1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-[fosfatidil-rac-(1-glicerol)
DPPS
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
DPyPE
1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
DSPA
1,2-Diestearoil-sn-Glicero-3-fosfato
DSPC
1,2-Diestearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
DSPE
1,2-Dioestearpil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina
DSPG
1,2-Diestearoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol)
DSPS
1,2-Diestearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina
EPC
PC de huevo
HEPC
PC de huevo hidrogenado
HSPC
PC de soja hidrogenada de pureza alta
HSPC
PC se soja hidrogenada
LYSOPC MIRfSTICO
1 -Miristoil—sn—Glicero—3-fosfatidilcolina
LYSOPC PALMmCO
1-Palmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
LYSOPC ESTEARICO
1-Estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
MPPC de esfingomielina de la leche
1-Miristoil,2-palmitoil-sn-Glicero 3-fosfatidilcolina
MSPC
1-Miristoil,2-estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
PMPC
1-Palmitoil,2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
POPC
1-Palmitoil,2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
POPE
1-Palmitoil-2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilethanolamina
POPG
1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol)]
PSPC
1-Palmitoil,2-estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
SMPC
1-Estearoil,2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
SOPC
1-Estearoil,2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
SPPC
1-Estearoil,2-palmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
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Claims (13)

  1. 5
    10
    15
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    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Una partfcula sin virion que no comprende una capside proteica, para la administracion in vivo de ARN en una celula de vertebrado, en la que (a) la partfcula es un liposoma y comprende un material de administracion que encapsula una molecula de ARN autorreplicante que codifica un inmunogeno, en la que el inmunogeno es un polipeptido de superficie y puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo contra una bacteria, un virus, un hongo o un parasito, y (b) el ARN no incluye nucleotidos modificados y, opcionalmente, incluye una caperuza en 5'.
  2. 2. La partfcula de la reivindicacion 1, en la que el liposoma comprende un lfpido con un grupo de cabeza cationico.
  3. 3. La partfcula de la reivindicacion 1, en la que el liposoma comprende un lfpido con un grupo de cabeza zwitterionico.
  4. 4. La partfcula de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el liposoma tiene un diametro en el intervalo de 50 a 220 nm.
  5. 5. La partfcula de cualquier reivindicacion precedente, en la que la molecula de ARN autorreplicante codifica (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN desde la molecula de ARN autorreplicante y (ii) un inmunogeno.
  6. 6. La partfcula de la reivindicacion 5, en la que la polimerasa es una replicasa de alfavirus.
  7. 7. La partfcula de la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6, en la que la molecula de ARN tiene dos marcos de lectura abiertos, el primero de los cuales codifica una replicasa de alfavirus y el segundo de los cuales codifica el inmunogeno.
  8. 8. La partfcula de la reivindicacion 7, en la que la molecula de ARN tiene marcos de lectura abiertos adicionales, por ejemplo, que codifican inmunogenos adicionales o polipeptidos accesorios.
  9. 9. La partfcula de cualquier reivindicacion precedente, en la que la molecula de ARN tiene 5000-25000 nucleotidos de longitud.
  10. 10. La partfcula de cualquier reivindicacion precedente, en la que el inmunogeno puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo contra:
    (a) una glicoprotema F del virus respiratorio sincitial; (b) un virus que infecta a los peces, tales como el virus de la anemia infecciosa del salmon (ISAV), el virus de la enfermedad pancreatica del salmon (SPDV), el virus de la necrosis pancreatica infecciosa (IPNV), el virus del siluro del canal (CCV), el virus de la enfermedad de linfocistis del pescado (FLDV), el virus de la necrosis hematopoyetica infecciosa (NHI), herpesvirus koi, el virus de tipo picorna del salmon (tambien conocido como virus de tipo picorna del salmon del atlantico), el virus del salmon encerrado (LSV), el rotavirus del salmon del atlantico (AsR), el virus de la enfermedad de la fresa de la trucha (TSD), el virus del tumor del salmon coho (CSTV) y el virus de la septicemia hemorragica (SHV) vmca; (c) ortomixovirus, tales como el virus de la gripe A, B y C; o (d) herpesvirus, tales como el virus del herpes simple (HSV), el virus de la varicela zoster (VZV), el virus de Epstein-Barr (EBV), el citomegalovirus (CMV), el virus del herpes humano 6 (VHH 6), el virus del herpes humano 7 (VHH 7) y el virus del herpes humano 8 (VHH 8).
  11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende una partfcula de cualquier reivindicacion precedente.
  12. 12. Un dispositivo de administracion que contiene la composicion farmaceutica de la reivindicacion 11.
  13. 13. La partfcula de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 11, o el dispositivo de administracion de la reivindicacion 12, para su uso en un procedimiento para producir una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado, que comprende la etapa de administrar al vertebrado una cantidad eficaz de dicha partfcula, o de dicha composicion farmaceutica.
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