JP5086082B2 - C型肝炎ウイルス複製系 - Google Patents
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Description
本発明は、C型肝炎ウイルス培養およびタンパク質発現の分野に属する。
参考文献4の著者らは、21−5細胞がウイルス粒子形成を支持できないのは、宿主細胞因子の欠如が理由であるかもしれないことを示唆した。これとは対照的に、本発明者らは、この不首尾は、HCV構造エンベロープタンパク質E1およびE2を発現できないことによって、少なくとも部分的には説明され得ると考えている。そこで本発明者らは、この不足を克服するために、これらのタンパク質をトランスに補完することを選択した。その結果得られる細胞は、HCV複製をより良く支持することができ、HCV粒子をより良く産生し得る。
本発明の細胞は、HCV生活環およびその複製を支持するためにHCVゲノムを発現させることができ、HCV生活環中に産生されるE1タンパク質およびE2タンパク質とは別個に、E1タンパク質および/またはE2タンパク質を発現させ得る。したがって、ウイルスRNAゲノムから翻訳されたウイルスポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングによるE1およびE2の産生が、別個の非HCV RNAから(例えば細胞性mRNAから)翻訳されるタンパク質によって補完される。
本発明の細胞はHCVゲノムおよび/またはHCVゲノムをコードする核酸を含む。したがって本細胞は、+鎖一本鎖RNAゲノムを含み得るか、または転写されて直接的または間接的に+鎖RNAゲノムを与え得る核酸を含み得る。例えば(本来のHCV生活環はDNA段階を含まないものの)ゲノムのDNAコピーが正しい向きに転写されると、HCVゲノムとして作用し得る(すなわち、HCVポリタンパク質の発現を指示することができ、そしてそのポリタンパク質は、正常なHCV生活環に見られるようにプロセシングされる)RNAが生じる。
本発明の細胞は、E1およびE2の一方または好ましくは両方をコードする核酸を含む。この核酸はHCVゲノムとは別個であり、HCVゲノムをコードするどの核酸とも別個である。しかし、補完的E1およびE2の配列は、好ましくは、HCVポリタンパク質中に見出されるE1配列およびE2配列と同じである。
E1およびE2タンパク質は、本発明に従って発現させた場合、一緒に局在することが見出された。そのため、これらを細胞から共に精製し得る。次に、E1/E2複合体(例えばヘテロ二量体)は、HCV感染を処置および/または予防するためのワクチンなどといった免疫原性組成物において例えば活性成分として使用され得る。
(A.無機物含有組成物)
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した無機物含有組成物には、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩が含まれる。本発明は、水酸化物(例えばオキシ水酸化物)、リン酸塩(例えばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩)、硫酸塩などの無機塩[例えば参考文献17の第8章および第9章を参照されたい]、または異なる無機化合物の混合物を包含し、化合物は任意の適切な形態(例えばゲル、結晶、非晶質など)をとり、吸着が好ましい。無機物含有組成物は、金属塩の粒子として処方され得る[18]。
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン、例えばMF59[参考文献17の第10章;参考文献19も参照されたい](マイクロフルイダイザーを使ってサブミクロン粒子へと処方された5%スクアレン、0.5% Tween80、および0.5% Span85)が挙げられる。完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)も使用され得る。
本発明ではサポニン処方物もアジュバントとして使用し得る。サポニンは、広範囲にわたる植物種の樹皮、葉、幹、根、そしてさらには花にも見出される異種のステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体群である。キラヤ(Quillaia saponaria Molina)の木の樹皮から得られるサポニンはアジュバントとして広く研究されてきた。Smilax ornata(サルサプリラ(sarsaprilla))、Gypsophilla paniculata(ブライダルベール(brides veil))、およびSaponaria officianalis(サボンソウ)由来のサポニンも市販されている。サポニンアジュバント処方物としては、QS21などの精製処方物の他、ISCOMなどの脂質処方物も挙げられる。QS21はStimulonTMとして販売されている。
本発明ではビロゾームおよびウイルス様粒子(VLP)もアジュバントとして使用され得る。これらの構造物は一般に、ウイルスに由来する1以上のタンパク質を含有し、このタンパク質は、必要に応じて、リン脂質と組み合わされるか、またはリン脂質を使って処方される。これらは一般に非病原性、非複製性であり、一般に天然ウイルスゲノムを一切含有しない。ウイルスタンパク質は組換え生産されるか、またはウイルス全体から単離され得る。ビロゾームまたはVLPでの使用に適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルスに由来するタンパク質(HAまたはNAなど)、B型肝炎ウイルスに由来するタンパク質(コアタンパク質またはキャプシドタンパク質など)、E型肝炎ウイルスに由来するタンパク質、麻疹ウイルスに由来するタンパク質、シンドビスウイルスに由来するタンパク質、ロタウイルスに由来するタンパク質、口蹄疫ウイルスに由来するタンパク質、レトロウイルスに由来するタンパク質、ノーウォークウイルスに由来するタンパク質、ヒトパピローマウイルスに由来するタンパク質、HIVに由来するタンパク質、RNAファージに由来するタンパク質、Qβファージに由来するタンパク質(コートタンパク質など)、GAファージに由来するタンパク質、frファージに由来するタンパク質、AP205ファージに由来するタンパク質、およびTyに由来するタンパク質(レトロトランスポゾンTyタンパク質p1など)が挙げられる。VLPは参考文献27〜32でさらに詳しく論じられている。ビロゾームは例えば参考文献33でさらに詳しく論じられている。
本発明での使用に適したアジュバントとしては、腸内細菌リポ多糖(LPS)の無毒性誘導体、リピドA誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドならびにADPリボシル化毒素およびその無毒化誘導体などといった細菌誘導体または微生物誘導体が挙げられる。
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したヒト免疫調節物質としては、インターロイキン(例えばIL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12[66]など)[67]、インターフェロン(例えばインターフェロンγ)、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などのサイトカインが挙げられる。
本発明では生体接着剤および粘膜付着剤もアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア[68]または粘膜付着剤(例えば、ポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体)が挙げられる。本発明ではキトサンおよびその誘導体もアジュバントとして使用し得る[69]。
本発明では微粒子もアジュバントとして使用し得る。生分解性であってかつ無毒性である材料(例えばポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど;ポリ(ラクチド−co−グリコリド)が好ましい)から形成され、そして必要に応じて、(例えばSDSで)負に荷電した表面を持つように処理されるかまたは(例えばCTABなどのカチオン性界面活性剤で)正に荷電した表面を持つように処理された、微粒子(すなわち直径約100nm〜約150μm、より好ましくは直径約200nm〜約30μm、最も好ましくは直径約500nm〜約10μmの粒子)。
アジュバントとしての使用に適したリポソーム処方物の例は、参考文献70〜72に記載されている。
本発明での使用に適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる[73]。そのような処方物には、さらに、オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤[74]、ならびにオクトキシノールなどの少なくとも1つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤[75]が含まれる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは以下の群から選択される:ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(ラウレス9)、ポリオキシエチレン−9−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−8−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−23−ラウリルエーテル。
PCPP製剤は、例えば参考文献76および77に記載されている。
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したムラミルペプチドの例としては、N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、およびN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミンMTP−PE)が挙げられる。
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミクアモド(Imiquamod)およびその同族体(例えば「レシキモド3M」)が挙げられ、それらは参考文献78および79にさらに記述されている。
本発明は、哺乳動物の免疫応答を惹起するための方法であって、その哺乳動物に本発明の薬学的組成物を投与することを包含する方法も提供する。免疫応答は、好ましくは防御であり、好ましくは抗体が関与する。本方法では、HCVに対する初回免疫を既に受けている患者における追加免疫応答を惹起することもできる。
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」および「からなる(consisting)」を包含する。例えば、Xを「含む」組成物は、もっぱらXからなってもよいし、何か他のものを含んでもよい(例えばX+Y)。
(HCVゲノムレプリコン系における糖タンパク質発現の補強)
HCV複製/集合複合体の性質および細胞内区画化を明確にするために、本発明者らは、全長遺伝子型1bレプリコンを保有する21−5細胞におけるHCV構造タンパク質およびHCV非構造タンパク質の局在を調べた[4]。これらの細胞では、ノーザンブロットによって持続的RNA複製が証明され、ウェスタンブロットおよび35S−Met/Cys標識と、それに続く免疫沈降によって、タンパク質発現が証明された。これらの技法を使って、本発明者らは、細胞抽出物におけるコア、NS3、NS5aおよびNS5bの存在を明らかにした。意外なことに、ウェスタンブロット法、代謝標識法、または免疫蛍光解析法では、E1およびE2の発現を検出することができなかった。
この研究では、以下の3つの異なる細胞株を使用した:1)ナイーブHuh7;2)全長レプリコンI389neo/core−3’/5.1を持つHuh−21−5[4]、サブゲノムレプリコンI389neo/NS3−3’を持つHuh−5−15[1]。これらの細胞を、HCVレプリコンを保持する細胞株については、完全DMEM+G418(ジェネティシン;Life Technologies)中で増殖させた(Huh−21−5には250μg/ml;Huh−5−15には750μg/ml)。Huh7細胞および21−5細胞[4]は供給業者から入手した。比較のためにHepG2細胞も使用した。Huh7細胞はHCVに感染していないが、21−5細胞は感染している。
PGK/HCV E1E2p7レンチウイルスベクターを生成させるために、本発明者らは、Tyr164の上流にMet残基が付加され、Ala809の下流に停止コドンが付加されたセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使って、HCV1a遺伝子型のTyr164からAla809までをコードする1935塩基対断片を増幅した。本発明者らは、自己不活化型レンチウイルスベクターpCCLsin.PPT.hPGK.GFP.Wpre[88],[87]の緑色蛍光タンパク質(GFP)を、増幅したE1E2p7断片で置き換えた。
細胞を、24ウェルプレート中の30mmカバースリップ上に、1ウェルあたり5×104細胞の密度でプレーティングした。プレーティングの1日後に、細胞をPBS中で洗浄し、4%ホルムアルデヒドで30分間固定した後、PBS中の0.1% Triton X−100で15分間透過処理した。次に、製造者の指示に従って、細胞をブロッキング溶液(PBS中の0.5%ウシ血清アルブミン)で30分間、前処理し、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。PBS中で3回洗浄した後、AlexaFlourコンジュゲート二次抗体を、1:200の希釈率で、室温で1時間、細胞に加えた。PBSで洗浄した後、カバースリップを蒸留水で洗浄し、DAPI(4’,6’−ジアミジノ−2−フェニルインドール)と共に水性封入媒体Vectashieldで封入した。
さらなる実験により、E1/E2はNS3(図10)およびNS5aとも一緒に局在することが示された。
ほとんどの報告では、HCVタンパク質はER膜またはER由来の膜に会合すると記述されており、一部の研究では、ゴルジ装置またはトランスゴルジ網の関与が指摘されている[89,90,92,98〜100]。本発明者らは、21−5R809細胞におけるE1/E2の位置を、共焦点解析により、これら2つのHCV糖タンパク質とさまざまな細胞区画の既知マーカーとの同時標識によって捉えようとした。
ドット状構造におけるHCV非構造タンパク質、特にNS3およびNS5Aの会合は、サブゲノムレプリコンを保有する細胞で既に報告されている。
細胞を、24ウェルプレート中のカバースリップ上に、1ウェルあたり5×104細胞の密度でプレーティングした。接種の1日後に、リポフェクトアミン2000を製造者の指示に従って使用することにより、細胞をブロモ−UTP(BrUTP)でトランスフェクトした。簡単に述べると、Optimem中の12mM BrUTP 50μlを、50μlのOptimenに希釈した1μlのリポフェクトアミン2000に加えた。室温で20分間インキュベートした後、そのBrUTP−リポフェクトアミン複合体を、アクチノマイシンD(5μg/μl)の存在下で、DMEM完全培地500μl中の細胞に直接加えた。2時間または4時間のインキュベーション後に、細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中の1% Triton X−100で透過処理した。HCVタンパク質を上述のように同定し、一方、新たに合成されたウイルスRNAを、2μg/mlのマウス抗BrUTP抗体を使って検出した。一次抗体を、PBS/BSA 0.5%に200:1に希釈したAlexaFluorコンジュゲート二次抗体で検出した。
HCVタンパク質と会合する細胞内膜の性質をより良く特徴づけるために、本発明者らは、膜画分と細胞質ゾル画分とを分離するための細胞成分分画研究を行なった。
この報文で、本発明者らは、HCV構造タンパク質およびHCV非構造タンパク質の細胞内局在の解析ならびにウイルス出芽機序の研究に役立ち得る新しい細胞系を記載する。本発明者らは、全長遺伝子型1bレプリコンを保有する細胞株におけるE1E2(およびp7)の安定かつ検出可能な発現を樹立し、これら2つの糖タンパク質の局在を、非構造タンパク質、ウイルスRNAおよび細胞内マーカーとの関連で特徴づけた。この系では、2つの糖タンパク質の発現は妥当に持続し続け、予想どおり、E1E2ヘテロ二量体の形成をもたらした。さらにまた、これら2つの糖タンパク質の染色体発現は、これら2つの化学種の遺伝的浮動を防止するので、E1E2の安定性に影響を及ぼし得る変異蓄積が回避される。タンパク質分布には2つのパターン、すなわち他の任意のERマーカー標識に似た「細網状」パターンと、ウイルスタンパク質の局在した蓄積がドット状構造を生成した「斑点状」パターンが観察された。細網状分布の場合、HCVタンパク質は、互いとも、細胞内区域を同定するために用いられる標準的マーカーとも、優先的には一緒に局在しなかった。
Claims (12)
- 細胞であって、
(a)C型肝炎ウイルスゲノム、および/またはC型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸、ならびに
(b)C型肝炎ウイルスタンパク質E1およびE2の一方または両方をコードする核酸を含み
ここで、該C型肝炎ウイルスが複製し、C型肝炎ウイルス生活環の結果として発現されるE1および/またはE2タンパク質に加えて、C型肝炎ウイルスタンパク質E1および/またはE2が発現される、細胞。 - 前記E1および/またはE2が、ウイルス生活環中にHCVゲノムから発現されるHCVポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングから生じるE1/E2とは別個の形態で発現される、請求項1に記載の細胞。
- 前記細胞が、
(a)C型肝炎ウイルスゲノム、および/またはC型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含み、
(b)C型肝炎ウイルスタンパク質E1およびE2を発現し、そして
(c)インビトロ培養で増殖し得る、
請求項1〜2のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記細胞が、以下の2つの核酸:
(a)C型肝炎ウイルスゲノム;ならびに
(b)C型肝炎ウイルスタンパク質E1および/またはE2をコードする核酸
をトランスに含有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記細胞が、以下の2つの核酸:
(a)C型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸;ならびに
(b)C型肝炎ウイルスタンパク質E1および/またはE2をコードする核酸
をトランスに含有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞を調製するための方法であって、
(a)細胞にC型肝炎ウイルスゲノムおよび/またはC型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を導入する工程;
(b)該細胞にC型肝炎ウイルスタンパク質E1およびE2の一方または両方をコードする核酸を導入する工程
を包含する、方法。 - 工程(a)と工程(b)とが別個に行なわれる、請求項6に記載の方法。
- 工程(a)と工程(b)とが同時に行なわれる、請求項6に記載の方法。
- 細胞中でC型肝炎ウイルスを培養するためのインビトロ方法であって、請求項6〜8のいずれか一項に従って細胞を調製する工程、次に(c)得られた細胞を培養する工程を包含する、方法。
- C型肝炎ウイルスのE1タンパク質およびE2タンパク質を調製するための方法であって、
(a)請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程;ならびに
(b)培養した細胞からE1タンパク質およびE2タンパク質を精製する工程
を包含する、方法。 - 前記E1タンパク質および前記E2タンパク質がC型肝炎ウイルス非構造タンパク質のうちの1以上と共に精製される、請求項10に記載の方法。
- 前記E1タンパク質および前記E2タンパク質が複合体の形態にある、請求項10または請求項11に記載の方法。
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