JP2008521430A - タンパク質デリバリーシステム - Google Patents

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Abstract

本願発明は、形質膜由来の脂質二重層エンベロープを有するウィルス様の粒子(VLP)であって、前記VLPが、エンベロープVLPを形成することができるウィルス構造タンパク質、またはその断片または誘導体、融合性タンパク質、および、組換え標的タンパク質をさらに含むウィルス様粒子に関し、さらに、前記VLPを用いて組換え標的タンパク質を細胞に誘導する方法、前記VLPを用いた治療方法、前記VLPを含む組成物およびキット、前記VLPを製造する方法、そして、前記VLPを製造するためのベクターや宿主細胞も開示されている。

Description

本願発明は、細胞への非遺伝子物質の誘導に関する。
特に、細胞へのタンパク質性物質の誘導に関する。
現在のところ、一般的に、膵嚢胞線維症や癌などの遺伝的疾患または後天的疾患の遺伝子治療には、治療計画を進めるための一つまたは二つの方法が関与している。 第一の方法は、裸出した核酸または非ウィルスベクターを使用するものであって、これは、通常、リポソームでカプセル封入されているか、あるいは脂質が関係している。 第二の方法は、ウィルスベクターを用いるものである。 ウィルスベクターとしては、アデノウィルス(Ad)またはヘルペスウィルス(HSV)のような非組込型のものや、アデノ関連ウィルス(AAV)やレトロウィルス(例えば、MLV)などの組込型のものがある。 AdおよびHSVの場合、治療用遺伝子の発現は、一過的なものでしかない。 組込型ベクターの場合、レトロウィルスまたはAAVでは、長期(理論的には、細胞の生存期間)にわたって発現をする。
これら遺伝子治療は、幾つかの問題点を抱えている。 裸出した核酸またはリポソームが関係した核酸を細胞に送達できる確率は、非常に低い。 レトロウィルスベクターは、宿主ゲノムの腫瘍形成領域を組み込むことができ、この組み込みによって、白血病および／または癌を招く場合がある。 非組込型ベクターの腫瘍形成率は小さいが、それは、治療用遺伝子の一過的な発現を保証するものに過ぎないため、治療効果は一過的なものでしかない。 ウィルスベクターは、必然的に、中和抗体を誘発したり、あるいは、その宿主内にすでに存在している抗体と出会うため、遺伝子送達の効率や形質導入した細胞の寿命を制限することとなる。 複製能力が不完全なものをも含めたすべてのウィルスベクターが、理論的には、複製可能な形態に復帰すること、および／または、同じ宿主内に同時期に存在する同一または類縁ファミリーに属するその他のウィルスを組み換えることができる。 しかしながら、現実的ではないが、未知の複製能力、病原性および増殖能力を具備した新種のウィルスをもたらす可能性はある。 最後に、これらすべての技術は、一般的には、遺伝物質、特に、DNAの受容細胞への送達に関与している。 これら物質の送達は、生物学的リスクと関連しているので、バイオセーフティーを注意深く考慮しなくてはならない。
これら事項に対処すべく、安全かつ効率的な核酸送達用の合成ベクターが開発されている。 ウィルスベクターの免疫学的影響を抑制し、かつ宿主細胞での組込部位を定めるために、ウィルスベクターの修飾が行われる。 幹細胞技術とex vivo遺伝子治療とを併用することも研究されている。
例えば、細胞の分化や組織の成長の過程など、ある特定の遺伝子の一過的な発現が必要とされる事例については、多くの研究がなされている。 例えば、ヒトの肺胞の形成は、出生後に認められる現象であり、これは、肺胞の形成期に認められる幾つかのタイプの侵襲法によって変更することができる。 このような侵襲法として、酸素処置、機械的過換気、細菌またはウィルス感染などがある。 気管支肺異形成症(BPD)は、肺胞の成長に関係する病態であって、早産の乳幼児に呼吸困難を引き起こす主要な合併症である。 肺胞上皮細胞の不正常な増殖および肺胞の微小血管形成の不正常な進展は、BPDの生理学的病態において欠かせない役割を果たす。 肺胞上皮の増殖を刺激し、かつアポトーシスを制御するケラチノサイト増殖因子(KGF)、それに、微小血管形成プロセスを制御する血管内皮細胞増殖因子(VEGF)は、肺胞の正常な成長に関与する二つの主要な因子であり、これら因子の発現は、BPDでは解消に向かうこととなる。 したがって、これら因子は、遺伝子治療における有用な標的であるといえる。 肺胞の成長過程で認められる一過的な性状は、短期間の治療の機会、特に、アデノウィルスのような非組込型ベクターを用いて行われる一過的な導入遺伝子発現に適した機会をもたらす
組織の分化および成長の過程におけるその他の一過的な遺伝子発現の例も同様であって、細胞の遺伝子または成長因子受容体が、細胞周期のある時点で活性化および不活性化されるという二つの現象が認められており、これにより、成長過程が精巧に制御されるに至っている。
単一の遺伝子欠陥が、一過的に発現された単一のタンパク質において認められる多くの事例において、変異遺伝子の野生型対立遺伝子が一過的に発現することで、その遺伝子欠陥によって誘発された病態を全般的に十分な修正ができている。
代替的方法として、本来の構造を有している無欠陥の生体作用性遺伝子産物、ペプチドおよび／またはタンパク質の直接移動がある(Ford et al., Gene Ther. 2001, 8:1-4; Dalkara et al., Mol. Ther. 2004, 9:964-969)。 移動させた物質が、核酸を利用したベクターと同程度で残存することはないものの、一過的な治療期間内だけでも有効性を保持するに十分な時間だけは残存することができる。
治療用タンパク質を細胞に送達することは、核酸を誘導することに関して相応の利点がある。 これらタンパク質として、必要に応じて、適切な翻訳後修飾(例えば、グリコシル化、リン酸化)を施されたものを選択することができ、また、宿主と同じ起源から得ることもできるので、宿主との相性が非常に良好で、しかも、免疫原反応も全く認められない。 これにより、反復投与が可能となる。 上述したように、ウィルスを利用した遺伝子治療での主要な問題点は、ベクターの免疫原性にある。 ベクターが、それ自身にとって好ましくない反応を即座に引き起こすことができるのみならず、ウィルスベクターの反復投与が不要になるまで免疫保護を作用させることもできる。 すべてのウィルスベクターについてではないが、腫瘍形成に治療用タンパク質が関与する可能性は無い。 さらに、治療用タンパク質の送達とは、転写、翻訳および翻訳後修飾、それに、特定の細胞成分(例えば、受容体および細胞表面分子の場合の形質膜、または、核因子を供する細胞核)への細胞内移動／標的化などの細胞の作用系統にバイパスを形成する、ことを意味するものでもある。 これにより、細胞に負荷されるストレスが最小限になると考えられる。
望ましいことではあるが、十分な量のタンパク質を細胞に送達させることは困難を伴うことである。 リポソームを介在させた方法も試されている。 Owais, et al. (Eur. J. Biochem, 2000, Vol.267: 3946-3956)は、受容細胞との融合を促すために、リポソーム内の融合性脂質を利用し、その結果、カプセル封入されたタンパク質の誘導を実現するに至っている。 米国特許第5,631,237号では、受容細胞へのリポソームの融合を促すために、センダイウイルスタンパク質が用いられている。
本願発明は、非遺伝物質を細胞へ送達するための問題に対応するための代替的方法を提供するものである。 特に、本願発明は、膜結合性タンパク質および非膜結合性タンパク質の送達媒体として、ウィルス様粒子(VLP)を活用する。
VLPの構造は、ウィルス粒子に似ているが、ウィルスゲノムは保有していない。 したがって、VLPは、複製することができず、また、病原性も示さない。 通常、この粒子は、ウィルス由来の少なくとも一つのタイプの構造タンパク質を含む。 たいての場合、このタンパク質は、タンパク質からなるキャプシド(例えば、レトロウィルス、アデノウィルスまたはバクテリオファージ構造タンパク質を含むVLP)を形成する。 構築したVLP(例えば、Gagのようなヒト免疫不全ウィルス構造タンパク質を含むVLP)を放出した細胞に由来する脂質二重層で、キャプシドが包まれる場合もある。
通常は、宿主細胞において、その他のウィルス遺伝子からの単離を行う際に、ウィルス構造タンパク質をコードする遺伝子を過剰発現する場合に、VLPは形成される。 細胞質ゾルにおいて、真正のウィルス粒子の構築プロセスと同様にして、これら構造タンパク質を、VLPに組み込む。 当然のことながら、その他のウィルス遺伝子が存在していなくとも、真正なウィルス粒子が形成されることはない。 VLPが形成されると、VLPは宿主細胞から放出されることとなる。 これは、細胞溶解によるものかもしれない。 被膜ウィルスから得たVLPの場合、このプロセスは、宿主細胞からの発芽に端を発して、脂質二重層によってエンベロープVLPの形成に至る。
ここにきて、被膜ウィルス様粒子に、融合性の性質を付与することができ、そして、膜結合性タンパク質および非膜結合性タンパク質の双方を細胞に誘導できることが明らかにされている。
すなわち、本願発明の一実施態様によれば、形質膜由来の脂質二重層エンベロープを有するウィルス様粒子(VLP)であって、当該VLPが；
ａ) エンベロープVLPを形成することができるウィルス構造タンパク質、またはその断片または誘導体、
ｂ) 融合性タンパク質、および
ｃ) 組換え標的タンパク質をさらに含む、ウィルス様粒子が提供される。
「形質膜由来の脂質二重層エンベロープ」の用語は、VLPが放出された宿主細胞の形質膜から得られた脂質二重層を指す。 このエンベロープは、VLPを部分的または全体的に包み込んでいる。 好ましくは、VLPは、エンベロープで完全(または、実質的に完全)に包み込まれている。 この脂質二重層は、宿主細胞の形質膜での組成物に対応する巨大分子組成物を含むことになるであろう。 この二重層は、同一の脂質、タンパク質および炭水化物と同様の性状を有することになるであろう。 これら巨大分子は、膜貫通型受容体および膜貫通型チャンネル(レセプターキナーゼやイオンチャンネルなど)、細胞骨格タンパク質(アクチンなど)、脂質またはタンパク質が結合した炭水化物、リン脂質(ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンなど)、およびコレステロールを含む。 この組成物を複合体とすることで、通常の人工的な二重層調製組成物、例えば、リポソームと区別することができる。 通常、リポソームは、少数の異なるタイプの脂質を含んでいる。 水性溶液とこれら脂質との懸濁液を超音波処理した後に、それらは、自然に形成される。 これらリポソームは、水性溶液の一部をカプセル封入するので、所望の物質を水性溶液に含ませておけば、それらリポソームに所望の物質を取り込ませることも可能となる。 二重層に埋め込まれた膜貫通型タンパク質を用いてリポソームを生産することも可能であるが、リポソームに取り込むことができるタンパク質の数や種類は非常に限られており、このことが技術面での問題点となっている。 それが故に、当業者の視点に立脚すれば、リポソーム二重層の複雑度と、本願発明のVLPの脂質二重層に由来する形質膜の複雑度との違いは明らかであろう。
さらに、通常のリポソーム形成にあっては、非常に不規則かつ均質な構成成分(すなわち、脂質およびタンパク質)の配置が認めらる。 これとは対照的に、本願発明のVLPの脂質二重層の成分は、整然と配置しており、この現象は、かような配置をする性質を形質膜が本質的に有していることに起因するものである。
好ましい実施態様によれば、本願発明のVLPの形質膜由来の脂質二重層は、少なくとも四つ、より好ましくは、少なくとも六つ、最も好ましくは、少なくとも八つの異なるタイプの脂質を含む。 好ましいタイプの脂質は、ホスファチジルセリンである。 好ましくは、本願発明のVLPの脂質二重層は、20％〜60％のホスファチジルセリン、より好ましくは、30％〜50％、そして、最も好ましくは、約40％のホスファチジルセリンを含む。
その他の好ましい実施態様によれば、本願発明のVLPの形質膜由来の脂質二重層は、少なくとも四つ、より好ましくは、少なくとも六つ、最も好ましくは、少なくとも八つの異なるタイプのタンパク質を含む。
「ウィルス様粒子」の用語は、ウィルス粒子に似てはいるが、ウィルスゲノムを欠いているため、自ら複製することができず、また、病原性も示さない構造を指す。 この粒子は、通常、ウィルス由来の少なくとも一つのタイプの構造タンパク質を含む。 好ましくは、一つのタイプの構造タンパク質だけを含む。 最も好ましくは、ウィルスのその他の非構成成分を共存させない。 本願発明のVLPは、形質膜由来の脂質二重層エンベロープを含む。
「ウィルス構造タンパク質」とは、ウィルスのキャプシドタンパク質またはタンパク質コアの全体構造に関係するタンパク質である。 本願発明のウィルス構造タンパク質は、エンベロープVLPを形成可能ないずれのウィルスからも取得することができる。 通常、これらは、自然に被膜ウィルスのタンパク質に由来するものである。 このようなウィルスとして、レトロウィルス科(例えば、HIV、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス)、コロナウィルス科、ヘルペスウィルス科、ヘパドナウィルス科、およびオルトミクソウィルス科(例えば、インフルエンザウィルス)などがあるが、これらに限定されない。 しかしながら、非被膜ウィルスであっても、エンベロープVLPを形成する場合ががあるが、これらも、本願発明に包含される。 非被膜ウィルスとして、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、アデノウイルス科、パピローマウイルス科、および、パルボウイルス科などがある。
好ましい構造タンパク質は、レトロウィルス科Gagタンパク質である。 構造タンパク質として特に好ましいものは、HIV-１gag遺伝子に対応するタンパク質である。 これはすなわち、Gag VLPの生産と構築は非常に効率的であり、また、これらVLPの細胞毒性が小さいことによる。 レンチウィルスHIV-１のgag遺伝子は、構造タンパク質ｐl7マトリックス(MA)、ｐ24キャプシド(CA)、ｐ７ヌクレオキャプシド(NC)およびｐ６の前駆体であるポリプロテインPr55Gagをコードする。 Gagは、HIV-１の成熟した感染ビリオンでの個別のタンパク質に開裂されるが、Gag VLPの方では、必要とされるウィルスプロテアーゼが欠けているので、単一のタンパク質としてGagは残存する。 Gag VLPの形成に関係する機構や、それに関与するタンパク質は、従来技術において頻繁に報告されている(Carriere et al., 1995, J. Virol. 69:2366-2377；WiIk et al., 2001, J. Virol. 75:759-771, 30；US2002/0052040；Chazal and Gerlier, 2003, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 67:226-237；Hong and Boulanger, 1993, J. Virol. 67:2787-2798；Royer et al., 1992. 1. Virol. 66:3230-3235；Spearman et al., 1994, J. Virol. 68: 3232-3242、そして、これらで引用されている文献を参照されたい)。
そして、好ましい実施態様によれば、本願発明は、形質膜由来の脂質二重層エンベロープを有するVLP、すなわち；
ａ) エンベロープVLPを形成可能なHIV-１ Gag、またはその断片または誘導体、
ｂ) 融合性タンパク質、および
ｃ) 組換え標的タンパク質をさらに含む、VLPを提供する。
HIV-１ Gagの場合、「構造タンパク質」の用語は、単一のポリペプチドから複数の構造タンパク質が誘導されるプロタンパク質または構造ポリプロテインの翻訳後開裂によって生成される構造タンパク質を指す。 これらタンパク質は、VLPを形成するにあたって、開裂を経る必要がない。
VLPを形成する性質を保持しているこれら自然界起源の構造タンパク質の断片や誘導体は、本願発明に包含されている。 当業者であれば、VLPを形成する性質を保持している断片や誘導体を特定する方法は理解できるであろう。 例えば、Carriere et al., 1995 J. Virol. 69:2366-2377、および、WiIk et al., 2001 J. Virol. 75:759-77130、そして、これらで引用されている文献(例えば、Facke, et al 1993, J. Virol. 67, 4972-4980)を参照されたい。 これら文献では、VLPを形成する性質を保持しているGagの領域および断片の特定方法が解説されている。 このような手法は、その他のウィルス構造タンパク質に対しても容易に適用することができる。 これら自然界起源の配列の誘導体は、通常は、起源配列に対して、少なくとも40％、好ましくは50％または60％またはそれ以上の配列相同性を示す。 本願発明の目的を達成するために、また、当該技術分野での技術常識に基づいて、「配列相同性」の用語は、配列同一性だけを指すものではなく、電荷や極性などの物理的特性の類似性に基づいて可逆的に利用可能なアミノ酸の使用にまで及ぶ。 同じ物理的特性を示すアミノ酸のグループに由来するアミノ酸を有するシグナル配列でのアミノ酸の置換は、保存的置換であると考えられており、シグナルペプチドの活性に変化を及ぼさない。 よって、すべてのロイシンをイソロイシンに変換して得た誘導体は、出発配列に対して100％の「配列相同性」を有していると考えられる。 好適なグループとして、グリシンおよびアラニン；セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミンおよびシステイン；リジン、アルギニンおよびヒスチジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンなどがある。 最後に述べたグループに属する好適なサブグループとして、ロイシン、バリンおよびイソロイシン；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン；メチオニンおよびロイシンなどがある。 配列相同性の算出は、後述する「配列同一性」の算定方法に従ってもよく、また、上述したような保存的置換として算定することも可能である。
好ましくは、自然界起源のウィルス構造タンパク質の誘導体またはその活性断片は、自然界起源の構造タンパク質またはその一部分に対して、(例えば、可変パムファクター、および、12.0に設定されたgap生成ペナルティーならびに4.0に設定されたgap伸長ペナルティー、それに、２個のアミノ酸についてのウィンドウを具備したFASTA pep-cmpを用いたSWISS-PROTタンパク質配列データバンクによって決定された)少なくとも50％、好ましくは、少なくとも60％または70％、例えば、少なくとも80％の配列同一性を示す。
自然界起源の構造タンパク質、またはその断片または誘導体は、別異のウィルス(例えば、レンチウイルスおよびスプーマウイルス；前出のCarriere et al.,の文献を参照されたい)の種、サブグループ科またはサブファミリーに属する構造タンパク質の一つまたは一つ以上のドメイン、または非ウィルスタンパク質配列と共に融合タンパク質として提供することもできる。
通常、VLPは、複数のコピー数のウィルス構造タンパク質を含んでいる(Briggs, J. A, et al., 2004. Nat. Struct. MoI. Biol. 11:672-675)。 好ましくは、VLPは、少なくとも2000コピー、より好ましくは、少なくとも3000コピー、そして、最も好ましくは、少なくとも4000コピーのウィルス構造タンパク質を含んでいる。
「融合性タンパク質」の用語は、VLPの形質膜由来のエンベロープの受容細胞の細胞膜に対する融合を誘発することができるウィルスタンパク質を指すものである。 VLPのタンパク質成分を細胞質ゾルへ移行させるのは、まさしくこのメカニズムである。 RNAウィルスおよびレトロウィルスのエンベロープ糖タンパク質が、細胞受容体に結合して、この融合性を誘発することは、周知の事項である。 したがって、これらタンパク質は、これらウィルスの感染の原因であるといえる。 その他の融合性タンパク質の例として、インフルエンザヘマグルチニン(HA)、呼吸器多核体ウイルス融合タンパク質(RSVFP)、ダニ媒介性脳炎ウィルス(TBEV)およびデング熱ウイルスのＥタンパク質、セムリキ森林ウィルス(SFV)のＥ１タンパク質、狂犬病ウィルスおよび水疱性口内炎ウィルス(VSV)およびバキュロウィルスgp64のＧタンパク質(Guibinga GH & Friedmann T., 2004, MoI. Ther. 11: 645-651)などがあるが、これらに限定されない。 これらタンパク質の断片または誘導体であって、これらタンパク質と同等の機能を有するものも使用することができる。 同等の機能を奏する断片または誘導体は、野生型タンパク質の融合活性の少なくとも50％、より好ましくは、少なくとも75％、そして、最も好ましくは、少なくとも90％の活性を保持する。
水疱性口内炎ウイルス(VSV-G)に由来するエンベロープ糖タンパク質が、特に好ましい。 VSV-Gの融合活性は強く、また、実質的にすべての哺乳動物の細胞は、その形質膜の糖タンパク質の炭水化物部分を介して、VSV-Gに結合することができる。 理論に基づいた制約を甘受するわけではないが、VSV-Gと細胞表面との間の相互作用に関する分子メカニズムは、接着によるものであって、細胞膜とウィルスエンベロープとの間の膜融合の工程がそれに続くことになる。 このプロセスは、インフルエンザウィルスヘマグルチニンおよび宿主細胞の形質膜に関して、文献にて詳解されている(Hunter, E. 1997. Viral entry and receptors, in Retrovirus. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.)。
すなわち、本願発明の他の実施態様によれば、形質膜由来の脂質二重層エンベロープを有するVLPであって、当該VLPが；
ａ) エンベロープVLPを形成することができるウィルス構造タンパク質、またはその断片または誘導体、
ｂ) エンベロープと受容細胞膜との間の融合を促すことができる水疱性口内炎ウイルス(VSV-G)、またはその断片または誘導体に由来するエンベロープ糖タンパク質、および
ｃ) 組換え標的タンパク質をさらに含む、VLPが提供される。
融合性タンパク質は、ウィルス構造タンパク質に対して異種由来のものである、ことが好ましい。 異種由来という用語は、問題となっているタンパク質の生物学的供給源に加えて、それぞれのタンパク質供給源が、異なる生物学的供給源を有することを指し示している。 例えば、構造タンパク質が、HIV-１構造タンパク質であれば、融合性タンパク質は、HIV-１融合性タンパク質とはならない。
本願発明の特に好ましい実施態様によれば、形質膜由来の脂質二重層エンベロープを有するVLPであって、当該VLPが；
ａ) エンベロープVLPを形成することができるHIV-１ Gag、またはその断片または誘導体、
ｂ) エンベロープと受容細胞膜との間の融合を促すことができる水疱性口内炎ウイルス(VSV-G)、またはその断片または誘導体に由来するエンベロープ糖タンパク質、および
ｃ) 組換え標的タンパク質をさらに含む、VLPが提供される。
上述した自然界起源のタンパク質の一つの断片または誘導体を、融合性タンパク質として用いることができる。 これら自然界起源の配列の誘導体は、起源配列に対して少なくとも40％、好ましくは、50％または60％またはそれ以上、特に、70％または80％またはそれ以上の配列相同性を示すであろう。
好ましくは、自然界起源のウィルス構造タンパク質の誘導体またはその活性断片は、自然界起源の構造タンパク質またはその一部分に対して、(例えば、可変パムファクター、および、12.0に設定されたgap生成ペナルティーならびに4.0に設定されたgap伸長ペナルティー、それに、２個のアミノ酸についてのウィンドウを具備したFASTA pep-cmpを用いたSWISS-PROTタンパク質配列データバンクによって決定された)少なくとも50％、好ましくは、少なくとも60％または70％、例えば、少なくとも80％の配列同一性を示す。
組換えの用語は、標的タンパク質が、組換えコード配列によってコードされることに加えて、標的タンパク質が、VLPを放出した宿主の形質膜由来の脂質二重層エンベロープには通常は存在していない、ことを指し示すものである。
「標的タンパク質」とは、受容細胞に送達されるタンパク質である。 このようなタンパク質として、受容細胞において認められないタンパク質、別異の種に由来するタンパク質、または、受容細胞において認められるタンパク質のクローン体などがある。 本願発明において好適な標的タンパク質とは、受容細胞において認められるのと同様の翻訳後修飾を受けて発現した受容細胞において認められるタンパク質である。 このような修飾として、補酵素グループのグリコシル化や脂質修飾付加、それに、四次構造の形成などがある。 成熟体として認められるタンパク質または受容細胞において認められないタンパク質に対応する野生型タンパク質が、最も好ましい。
この組換え標的タンパク質は、膜タンパク質または非膜タンパク質のいずれであってもよい。 膜タンパク質の例として、膵嚢胞線維症経膜伝達性調節タンパク質(CFTR)のようなイオンチャンネル、PDGF-受容体およびSCF-R受容体(幹細胞因子受容体、またはc-kit、またはCD 117)のような受容体チロシンキナーゼ、アドレナリン受容体のようなＧ-タンパク質結合受容体などがあるが、これらに限定されない。 非膜タンパク質の例として、アクチン、Ras、ERK １/２のような細胞質ゾルタンパク質の他に、ステロイド受容体やヒストンタンパク質のような核タンパク質などがあるが、これらに限定されない。 単一の膜貫通ドメインを有するタンパク質(１型膜タンパク質としても知られている)や、短い細胞質末端を有するタンパク質などが、本願発明のVLPに組み込む上で好ましい膜タンパク質である。 １型膜タンパク質の特に好ましい例として、SCF-R受容体がある。 １型膜タンパク質ではないが、CFTRタンパク質も、本願発明のVLPに組み込む上で特に好ましい膜タンパク質の例として挙げられる。
そして、本願発明の最も好ましい実施態様によれば、形質膜由来の脂質二重層エンベロープを有するVLPであって、当該VLPが；
ａ) 被膜ウィルス様粒子を形成することができるHIV-１ Gag、またはその断片または誘導体、
ｂ) エンベロープと受容細胞膜との間の融合を促すことができる水疱性口内炎ウイルス(VSV-G)、またはその断片または誘導体に由来するエンベロープ糖タンパク質、および
ｃ) 組換えCFTRをさらに含む、VLPが提供される。
上述したように、VSV-Gは、広域融合性タンパク質である。 組織／細胞に対する特異性についての要求に応じて、より特異性に富んだ融合性タンパク質を選択することができる。 あるいは、必要とされる特異性を付与するために、VSV-Gに対して修飾を行うこともできる。 当業者であれば、特異性を付与するためにVSVを加工することができるであろう。 そのための二つの方法を、以下に説明する。
まず、少なくとも一つの特異的な細胞リガンドを、利用可能なVSV-Gの少なくとも一つのループに遺伝子工学的に挿入することができる。 細胞に特異的なリガンドは、標的細胞または標的組織に関する文献から決定することもできるし、あるいは、所望の標的細胞に関するファージの生物的パンニング処理実験から直接的に入手することができる。 この種の技術は、当業者に周知である(Gaden et al., J. Virol. 2004, 78:7227-7247)。
次に、細胞に特異的なリガンドの挿入が、VSV-Gの膜融合機能に対して悪影響を及ぼす場合には、細胞に特異的なリガンドを、HIV-１ EnvGpl60の少なくとも一つの可撓性ループに対して遺伝子工学的に挿入して、次いで、VLPの表面で、VSV-Gを用いて共発現することができる。 組換えアデノウィルスであるAd-EnvGpl60-Lが、使用されてきた。 EnvGpl60は、Gag VLPに容易に取り込むことができるもとの思われる(Wyma et al., 2000 J. Virol. 74:9381-9387 and Yu et al., 1992 J. Virol. 66:4966-4971)。
本願発明の他の実施態様によれば、組換え標的タンパク質を受容細胞に誘導する方法、すなわち；
ａ) 上述したＶＬＰを準備し；および
ｂ) 前記ＶＬＰに対して当該受容細胞を曝す、ことを含む方法が提供される。
上述したように、膜結合タンパク質を、組換え標的タンパク質とすることができる。 形質膜由来の脂質二重層被膜ウィルス様粒子は、形質膜から発芽および摘出するプロセスによって、産生細胞から放出される。 この手法は、頻繁に文献でも紹介されている(Chazal and Gerlier, 前出；Spearman et al, 前出；および、Sakalian and Hunter, 1998 Adv. Exp. Med. Biol. 440:329-339)。 発芽が認められれば、VLPは、宿主細胞の形質膜で被膜される。 したがって、このエンベロープは、宿主細胞が誘導した形質膜タンパク質を含んでいる。 この宿主細胞が、形質膜において組換え膜タンパク質を発現するように加工されておれば、この組換えタンパク質は、形質膜由来の脂質二重層被膜ウィルス様粒子に取り込まれることとなる。 受容細胞への組換え標的膜タンパク質の誘導は、融合性タンパク質によって媒介される膜融合を介して行われる。 この誘導を行うためには、組換え膜タンパク質を保有しているVLPを、受容細胞と共にインキュベーションさえすればよい。
VLPへの標的タンパク質の導入を円滑にするために、組換え標的膜タンパク質(特に、複数の膜貫通ドメインまたは長い細胞質末端を有するタンパク質)を、修飾することができる。 例えば、HIV-１ gp41内のペプチド配列は、これら配列が、膜タンパク質の細胞質ドメインに挿入された際に、HIV-１ Gagを利用したVLPへの膜タンパク質の取り込みを補助することができる(Wyma, DJ. et al., 2000, J. Virol. 74: 9381-9387；Lee S.F. et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 15809-15819)。 VLPへの膜タンパク質の導入を円滑にすることができる修飾例として、活性化Ｔ細胞(LAT)タンパク質のペプチド配列に対応するペプチド配列を、膜タンパク質の細胞質ドメインに挿入する方法もある(Alexander M et al., 2004, J. Virol. 78: 1685-1696)。
そして、好ましい実施態様によれば、本願発明のVLPの組換え標的タンパク質を、VLPへの膜タンパク質の導入を補助する少なくとも一つのペプチド配列で細胞質ドメインが修飾されている膜タンパク質とする。 さらに好ましい実施態様によれば、組換え標的タンパク質を、VLPへの膜タンパク質の導入を補助するHIV-１ gp41またはLATに由来する少なくとも一つのペプチド配列で細胞質ドメインが修飾されている膜タンパク質とする。
VLP膜(「供与膜」)と受容細胞膜(「受容膜」)との融合は、融合性タンパク質によって誘発され、その結果、受容細胞膜に組換え膜タンパク質が移行する。 受容細胞膜への組換え膜タンパク質の膜から膜への直接的な移行にあっては、その至適な生物学的活性や作用効果のために必要な特殊な条件(例えば、形質膜の生物化学的微小環境、推定パートナータンパク質など)を整備すべきである。
膜タンパク質が、形質膜において普段認められていないタンパク質であっても(例えば、タンパク質は、オルガネラ膜で認められるが)、細胞内での当該タンパク質の存在位置に代えて、タンパク質を加工して形質膜に対する標的化を促すことは、当業者が日常的に行っている事項である。
上述したタンパク質送達法は、遺伝子送達を行う上でも有用である。 膜タンパク質は、複合タンパク質である場合が多い。 このCFTRタンパク質も、そのようなタンパク質であると考えられる。 CFTRタンパク質は、Cl-チャンネルとして機能する膜貫通型糖タンパク質であり、また、膵嚢胞線維症(CF)の疾患にも関与している。 CFTRは、複数の膜貫通ドメイン、すなわち、Ｎ-末端およびＣ-末端に対応する調節領域を保有している二つの細胞内細胞質ドメイン(細胞内ドメイン)と、 細胞外ドメインまたは細胞外のドメインを有している。 細胞外ドメインと細胞内ドメインの双方が、それぞれ、グリコシル化およびリン酸化の修飾を翻訳後に受けている。 CFTRの生物学的活性は、異なるタイプの翻訳後修飾と形質膜を必要としており、これら要素のいずれもが、細胞内での厳密な折り畳みと正確な三次元構造、それに、解明されている細胞内経路を必要としている。 さらに、コード配列の長さ(1,400個を超えるアミノ酸残基)が、その上流と下流の調節因子に沿ってクローニングすることを困難にしている。 CFTRタンパク質分子の複雑度を考慮すれば、ウィルスベクターまたは非ウィルスベクターを用いたヒトのcftr遺伝子の調節発現は、この種の問題点に直面するであろう。 このタンパク質を、本願発明のVLPを生産するように加工された好適な宿主細胞で発現することによって、このタンパク質は、適正な形態の膜において好適に発現および修飾されたCFTRとして、VLPに取り込まれる。 したがって、このタンパク質は、最良の形態で投与されることとなる。
非膜結合性タンパク質の誘導を可能にするために、ウィルス構造タンパク質に結合することができるタンパク質を有する融合タンパク質として、この標的タンパク質を発現することによって、これらタンパク質をVLPに取り込む。 例えば、ウィルス構造タンパク質が、HIV-１ Gagであれば、HIV-１のVprタンパク質のＮ-末端またはＣ-末端を用いることができる。 Vprが、GagのＣ-末端ｐ６ドメインと相互作用し、そして、化学量論的比にあるGagとVpr-X(Vprと推定標的タンパク質との融合タンパク質)が、キャプシドに取り込まれていることが示されている(Zhu, et al., 2004 Retrovirology 1:26-31.)。 Vpr-Xは、ｐ６結合内部タンパク質として、Gag粒子のコア内に送達される。
VLPのエンベロープと受容細胞膜とが融合すれば、VLPの内部コアは、細胞質ゾル内で分離する。 そうすると、次いで、構造タンパク質と融合タンパク質(例えば、Gagのｐ６ドメインとVpr-X 融合タンパク質のVpr部分)との間に発生して、融合タンパク質を放出するタンパク質-タンパク質間の相互作用に対して変化が及ぶこととなる。 標的タンパク質に対して融合されるタンパク質本来の性質を活用することができる。 例えば、Vprは、核局在化シグナルを含んでおり、また、通常は、核に送達される。 したがって、Vpr-標識付けしたタンパク質は、核に送達される。 当業者であれば、これら融合タンパク質に相応しい候補物やその性質を理解できるであろう。 また、HIV-１ビリオンの補助タンパク質であるVifも、Gagと相互作用し、そして、Gagで効率的にキャプシド取り込みをすることができる(Bardy et al, 2001 J. Gen. Virol. 82:2719-2733.; Bouyac et al, 1997 J. Virol. 71:9358-9365；および、Huvent et al., 1998 J. Gen. Virol. 79:1069-1081). Vifは、核局在化シグナルを含んでいない。 したがって、送達される組換えタンパク質は、Vifに融合することができ、その結果、Vprが主に標的とする核成分とは異なる細胞成分に対して送達されることとなる。
細胞への誘導は、in vivo、in vitroまたはex vivoで行うことができる。 この細胞を、単離すること、その他の細胞と共に培養すること、または、組織内でin situに適用することもできる。
本願発明の他の実施態様によれば、タンパク質治療方法、すなわち；
ａ) 上述のＶＬＰを準備し；および
ｂ) 組換え標的タンパク質が関係する治療効果を得るに十分な量の当該ＶＬＰに対して細胞を曝す、ことを含む方法が提供される。
通常、タンパク質療法にあっては、細胞へのタンパク質の送達が関与して、治療効果の獲得に至っている。 通常、細胞には、そのような治療用タンパク質などは備わっていない。 これらが欠落しているということは、正常に機能するタンパク質が、十分な量で細胞に備わっていないことを意味する。 つまり、細胞が、それらタンパク質を全く発現していないことを意味するのでなく、それらタンパク質の成熟体を発現することを意味しているのである。 タンパク質を欠いた細胞に、治療的用量のタンパク質を誘導することによって、タンパク質の欠乏に起因する疾患状態を緩和することができる。 このような方法に用いる候補物として、CFTRタンパク質がある。
そして、本願発明の好ましい実施態様によれば、膵嚢胞線維症を治療するためのタンパク質療法が提供される。
あるいは、治療用タンパク質を、タンパク質性医薬とし、そして、治療用タンパク質を欠いた細胞ではなく、依然として治療用タンパク質に曝露することが有益な細胞に対して投与が行われる。
疾患の種類に応じて身体内の異なる部位にVLPを投与する必要があるため、タンパク質療法に用いるVLPの投与形態は、処置する疾患に応じて変わることとなる。 例えば、膵嚢胞線維症の治療にあっては、呼吸器の気道上皮へ投与することになる。 幼児や児童の膵嚢胞線維症患者において初期の内にVLPを処方することは、肺や呼吸器の異常な成長を予防し、そして、この疾患でよく認められる日和見感染に特有の合併症の発生を回避する上でも有用である。
通常は、VLPは、薬学的に許容可能な組成物に取り込んで投与される。
したがって、本願発明は、上述したVLPと共に、少なくとも一つの薬学的に許容可能な 担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。
このような組成物において、VLPは、製剤の0.05重量％〜99重量％、好ましくは、0.1重量％〜10重量％の量で含まれる。
「薬学的に許容可能な」との表現は、構成成分が、組成物でのその他の成分に対して融和性があり、また、投与対象者にとって生理学的に許容可能なものでなくてはならい、ことを意味するものである。 この薬学的組成物は、当該技術分野で周知の方法や、文献で頻繁に報告されている方法によって調製することができる。 したがって、錠剤、丸剤、粉剤、トローチ剤、香粉、カシュ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳濁液、溶液、シロップ剤、煙霧剤(固形媒体または液状媒体)、軟膏、軟質および硬質のゼラチンカプセル、坐剤、注射可能な滅菌溶液、充填済の滅菌粉体などの従来の生薬製剤を製造するために用いられている一つまたは一つ以上の従来の担体、希釈剤および／または賦形剤を、必要に応じて、その他の活性物質と共に、活性成分に取り込ませることができる。 好ましくは、この組成物を、注射または煙霧剤による投与に適した形態にする。
好適な担体、賦形剤、および希釈剤の例として、ラクトース、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水シロップ、水、水/エタノール、水/グリコール、水/ポリエチレン、グリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、メチルパラベン、プロピルパラベン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、または、ハードファットのような脂肪物質、あるいはこれらの好適な組み合わせがある。 この組成物に対して、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、防腐剤、甘味剤、香料などをさらに加えることができる。 本願発明の組成物は、当該技術分野で周知の方法によって患者に投与した後に、その活性成分が、迅速に、持続的に、あるいは、緩効的に放出されるように製剤することもできる。
あるいは、移植または再移植に先駆けて、VLP(または、組成物)を、ex vivoにて投与することができる。 例えば、その一つの事例として、採取を行った患者への再移植に先駆けて、幹細胞に対して成長因子受容体を作用させて、in vitroでのそれらの増殖および成長を可能にすることができる。
幹細胞の培養は、通常は、細胞の分化が停止する約３×lO9個の細胞のレベルに至って初めて安定するので、幹細胞をex vivoで生育することは難しいとされている。 本願発明のタンパク質移動法を用いて、安定期にある幹細胞に成長因子受容体を作用させることによって、これら細胞の増殖は、さらに促されることとなる。 SCF-R受容体(幹細胞因子受容体、またはc-kit、またはCD 117)は、候補物の一つである。 SCF-Rを保有してる本願発明のVLPに対して予め曝露を行った幹細胞を、特異的なリガンド(SCF)で処置することで、これら幹細胞の成長は、改めて刺激されることとなる。 このプロセスを数回にわたって繰り返すことで、肝臓癌のin vivo治療において必要とされる1011個のレベルの幹細胞を得ることができる。 SCFR以外の膜受容体、例えば、EGFRも、幹細胞の増殖を刺激する作用を示す。 あるいは、幹細胞の成長過程での転写活性を介して同じ目的を達成するために、Hox４やテロメラーゼを、VprまたはVifタグを介して細胞間を行き来させることもできる。
その他に、本願発明の細胞内タンパク質誘導方法を用いて、特異的な免疫原性タンパク質(例えば、腫瘍抗原)を、ex vivoにおいて、樹状細胞(DC)に移動させる利用形態もあり、こうすることで、これら抗原は、免疫原性ペプチドへと変化して、そして、クラスII MHC分子によって、細胞表現に発現される。 これら免疫原性ペプチドのクラスII MHCは、処理した樹状細胞が、in vivoにおいて再投与された場合に、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発または再度強制する。
さらにその他のex vivoでの利用形態にあっては、全身投与の際の幹細胞による特異的な臓器への再標的化を確実ならしめるために、患者から単離した幹細胞を、組織特異的な細胞表面分子へと移動させている。
その他の実施態様によれば、本願発明は、治療用途に供するための上述したVLPを提供する。 上述した組成物も、治療用途に利用することができる。 好ましくは、その治療は、タンパク質の欠損が関係する疾患、最も好ましくは、膵嚢胞線維症を処置するために利用される。
その他の実施態様によれば、本願発明は、膵嚢胞線維症の治療用薬剤を製造するための上述したVLPの使用をも企図している。
本願発明のVLPは、ワクチンまたは免疫療法にも使用することができる。 この場合、VLPエンベロープに取り込まれた組換えタンパク質は、免疫原としての作用に着目して選択される。 ワクチンや免疫療法において本願発明のVLPを使用する上での利点として、組換え膜タンパク質での膜リン脂質や近隣タンパク質が、自然界由来のものと同様であるため、正しい翻訳後修飾(例えば、それらのグリコシル化状態)を受けることができ、そして、起源の膜タンパク質と同じ構造を有することが挙げられる。 これらは、ある意味で、免疫原性エピトープを提示し、そして、所望の宿主に投与した際に反応性に富んだ特異的な抗体を生成する上で理想的なパラメーターであると言える。
本願発明のVLPを利用した通常の免疫処置プロトコールでは、まず、所望の可溶性タンパク質が投与され、それに続いて、当該タンパク質を取り込んだVLPを用いた追加免疫処置、そして、免疫原性エピトープを示す合成ペプチドを用いた第二の追加免疫処置が行われる。 処置工程を逆転または反復するなどの変更を、このプロトコールに加えることもできる。 この種のプロトコールは、in vitroの実験用途に供する反応性に富んだ抗体の作成や、医学や獣医学の分野で用いられる診断用キットの製造のために、患者(免疫療法、予防接種)や実験動物に対して適用することができる。
前述した薬学的に許容可能な担体、希釈剤および賦形剤に加えて、ワクチン組成物は、補助剤をさらに含む。 その例として、免疫活性化核酸、ペプチドグリカン、リポポリ多糖、リポテイコ酸、イミダゾキノリン化合物、フラジェリン、リポタンパク質、免疫活性化有機分子、非メチル化CpG含有オリゴヌクレオチド、または、これらの混合物があるが、これらに限定されない。
溶液内の不要な可溶性因子を除去するために、本願発明のVLPを用いることができる。
除去すべき可溶性因子に対する受容体を発現するために、VLPを加工することもできる。 次いで、VLPは、受容体と可溶性因子との複合体の形成を介して、溶液から可溶性因子を分離する。 有効な利用形態として、抗血管形成性癌の生物療法がある。 いくつかの可溶性因子、例えば、VEGF(血管内皮細胞増殖因子)、または、その他の血管形成因子によって、通常は、成長過程の組織での血管新生、特に、腫瘍での血管新生が有効に制御されている。 内皮細胞表面でのVEGFと特異的なその受容体(VEGF-R)との間の相互作用をブロックすることで、腫瘍での血管新生の割合が低レベルになり、また、その際に無酸素症となるので、腫瘍は退縮することとなる。 膜に挿入され、かつ表面が露出したVEGF-R(または、その他の血管形成因子に対する受容体)を保有するVLPは、内皮細胞の表面で発現した同じ受容体と免疫応答を示す。 これらVLPを、腫瘍内への注射にすると、循環しているVEGF(または、その他の血管形成因子)から細胞外成分を除去し、そして、血管新生、ひいては、腫瘍の成長を阻止する。
当業者であれば、in vitro計画へのこれら治療技術の組み込み方は勿論、所望のタンパク質を実験系に持ち込むためのin vitroの研究用ツールとしての本願発明の有用性に容易に気づくであろう。
上述したように、過剰発現した際に、本願発明のVLPは、ウィルス構造タンパク質を構築物を形成し、そして、宿主細胞から発芽する。
そして、本願発明の他の態様によれば、上述したVLPの製造方法、すなわち、in vitro培養細胞内の組換え標的タンパク質と共に、エンベロープVLPを形成することができるウィルス構造タンパク質、または、その断片または誘導体を共発現し、そして、培養培地からVLPを単離することを含む、製造方法が提供される。
宿主細胞としては、いずれの細胞でもよく、好ましくは、真核細胞、さらに好ましくは、哺乳動物細胞が好適に利用できる。 最も好ましくは、細胞の供給源は、VLPの融合対象とされる細胞と同一または適合可能なものとする。 好ましくは、細胞は、安定な細胞培養物とする。
必要に応じて、(ｉ)エンベロープVLPを形成することができるウィルス構造タンパク質、または、その断片または誘導体、(ii)融合性タンパク質、および／または、(iii)組換え標的タンパク質をコードする核酸を、in vitroにて継続的に成長することができる安定な細胞系をもたらす細胞のゲノムに、個別に、一対で、あるいは、一括して、安定裏に組み込むことができる。 このような細胞系は、実質的にVLPまたはその構成成分を好適に発現する。
その他の実施態様によれば、本願発明は；
ａ) エンベロープVLPを形成することができるウィルス構造タンパク質、または、その断片または誘導体をコードする核酸；
ｂ) 融合性タンパク質をコードする核酸；および
ｃ) 組換え標的タンパク質をコードする核酸、を含むin vitro宿主細胞系を提供する。
本願発明のその他の実施態様として；
ａ) エンベロープVLPを形成することができるウィルス構造タンパク質、または、その断片または誘導体をコードする配列；
ｂ) 融合性タンパク質をコードする配列；および
ｃ) 標的タンパク質のコード配列を挿入可能なクローニング部位、を含む核酸ベクターがある。
これらベクターは、本願発明のさらに別の態様を構成するものであって、そこには、標的タンパク質をコードする配列が組み込まれており、当該ベクターの発現産物は、上述したVLPを形成することができる。 このようなベクターは、公知のウィルスベクター(例えば、アデノウィルス、AAV、HSV、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスベクター)、または、非ウィルスベクター(例えば、プラスミドまたは人工酵母染色体)から得ることができる。
好適な実施態様によれば、このベクターは、その配列が有する本来の機能を引き出すことができる以下の箇所、すなわち、複製開始点、選択可能なマーカー、転写開始部位、転写エンハンサー、転写インデューサー、転写制御要素、３'-非翻訳制御配列、５'-非翻訳制御配列、および、標的タンパク産物の検出および／または精製を許容する配列の内の少なくとも一つをさらに含む。 追加すべき特定の配列は、宿主細胞のタイプに応じて選択される。
本願発明のさらに他の実施態様によれば、上述したベクターと(加工された)宿主細胞系とを含むキットが提供される。 あるいは、このキットには、(ａ)エンベロープVLPを形成することができるウィルス構造タンパク質、または、その断片または誘導体をコードする核酸、および、融合性タンパク質をコードする核酸を含むように加工された安定な宿主細胞系；および、(ｂ)標的タンパク質をコードする核酸で結果的に宿主細胞系のトランスフェクションを行う上で好適なベクターを含めることができる。 ある特定の実施態様に関して好適な態様は、すべての態様についても同様に適用される。
その他の実施態様によれば、本願発明は、エンベロープウィルス様粒子および当該ウィルス様粒子のエンベロープ内に存在する組換え膜結合標的タンパク質を形成することができる少なくとも一つのウィルス構造タンパク質、またはその断片または誘導体をさらに含む、形質膜由来の脂質二重層を有するVLPを提供する。
上述してきたウィルス構造タンパク質および膜結合標的タンパク質の一部または全部が、本願発明の本実施態様に対して適用される。
上記の組成物、宿主細胞、製造方法、医薬用途、キットおよびベクターなども、同様にして、本願発明の本実施態様に適用することができる。
本願発明のこの実施態様でのVLPは、とりわけ、予防接種または免疫療法プロトコール、ワクチン組成物、そして、不要な可溶性因子の溶液を解消するために作成されたプロトコールに対して適用可能である。 したがって、融合性VLPに関連して説明してきた本願発明の実施態様は、本願発明の本実施態様のVLPに対しても同様に適用することができる。
本願発明を、以下の実施例に沿ってさらに詳細に説明するが、本願発明が、これら実施例の開示に基づいて限定的に解釈されるべきではない。
実施例１：ＣＦＴＲ-ＧＦＰ ＶＬＰの製造
CFTRタンパク質のＮ末端に位置する緑色蛍光タンパク質(GFP)ドメインを有するCFTRに融合したGFPをコードするキメラ遺伝子を、VLPに組み込んだ。 このGFP部分は、標識付けしたCFTRの迅速な同定を可能にするのみならず、迅速に確定される標識付けしたタンパク質の位置決定までをも可能にする。 融合した遺伝子gfp-cftrを、異なる二つの発現系、すなわち、(i)組換えバキュロウィルスAcMNPV-GFP-CFTRを生成するバキュロウィルスAcMNPV、および、(ii)組換えウィルスAd5-GFP-CFTRを生成する５型アデノウィルス(Ad5)を用いてクローニングした。 このタンパク質が、細胞形質膜に局在化していることがうかがえた。 発現プラスミドを伴った同様のGFP-標識付けした構築物が、標識付けしていないタンパク質CFTRと同じ機能を有していることが報告されている(Haggie et al., 2002, J. Biol. Chem. 277: 16419-16425 および Loffmg-Cueni et al., 2001, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281:C 1889-1897.20)。 Ad5-GFP-CFTRクローンが、CFTR-欠損細胞でのCl-チャンネルの活性を回復させるので、GFP-CFTRクローンは、活性を有し、また、機能的であると考えられていた(Robert et al., 2004, J. Biol. Chem. 279:21160-21168.)。
ネガティブコントロールとして、生物学的に不活性なCFTRの変異体、CFTRΔF508を用いた。
Sf９細胞を、三つの組換えバキュロウィルス、すなわち、AcMNPV-Gag、AcMNPV-VSV-GおよびAcMNPV-GFP-CFTRと共にインキュベーションした。 芽出が認められれば、VSV-GおよびGFP-CFTRを有するGagウィルス様粒子を、当業者に周知の事項であるショ糖-Ｄ2Ｏ勾配を利用した超遠心分離法(Huvent et al., 1998 J. Gen. Virol. 79:1069-1081)を用いて、培養上清から単離することができる。 つまり、感染後の60時間〜72時間の間に、培養培地は回収された。 回収した培養培地を、４℃で、10分間、2,500rpmで遠心分離した。
VLPを含む上清を回収する一方で、細胞ペレットを廃棄した。
ベックマンのSW41型ローターに装着可能に設計された超遠心分離管内に置かれた１mlの20％ショ糖PBSからなるショ糖緩衝剤に対して上清(約11ml)を重層した。 そして、この分離管は、４℃で、１時間、30,000rpmで遠心分離された。 この遠心分離工程によって、大量の培養培地(約60ml)からVLPが濃縮された。 この上清は廃棄したが、ペレットの方は、PBS(200μl/ペレット)で再懸濁した。 再懸濁したペレットを、４℃で、一晩かけて、放置した。 そして、30〜50％ショ糖-Ｄ2Ｏ勾配を利用する第二の遠心分離に供するために、ペレット再懸濁をプールした。
ショ糖勾配(30〜50％ w/v)に供するために、50％ショ糖溶液は、水酸化ナトリウムでpH 7.2にまで緩衝化された重水素水(Ｄ2Ｏ)を用いて調製し、また、30％ショ糖溶液は、10 mM Tris-HCl、pH 7.2、150mM NaCl、5.7mM Na2EDTAを用いて調製した。 この勾配は、ベックマンのSW41型ローターに装着可能に設計された超遠心分離管での勾配ミキサー(10mlの勾配)を用いて作り出される。 VLP(約1.5ml)は、ショ糖勾配上に重層され、次いで、分離管は、４℃で、18時間、28,000rpmで遠心分離された。 遠心分離の最終段階にて、濃乳白色のバンドと淡いバンドが認められた。 濃色のバンドは、Gag粒子に対応しており、その一方で、淡色のバンドは、主にバキュロウィルスから構成されていた。 濃色バンドの真下から注射器と注射針を具備した採取管を挿入し、次いで、濃色バンドの約500μlを抽出することによって、これらVLPは回収された。
抽出したすべてのVLPバンドをプールし、そして、PBSで５倍に希釈した。 次いで、VLPのペレット化を図るために、希釈液を、４℃で、２時間かけて、30,000rpmで遠心分離した。 上清を廃棄してから、VLPを、PBS(200μl/ml)で再懸濁した。 再懸濁したペレットを、４℃で、一晩かけて、放置した。 そして、このVLP調製品の(タンパク質mgでの)定量を行った。
実施例２：透過型電子顕微鏡
図中の凡例で示したウィルスでもってして、細胞を、25の感染の多重度(MOI)で感染させた。 感染をさせてから48時間後に、電子顕微鏡(EM)検査に供するために細胞を回収し、そして、遠心分離によってペレット化を行った。 次いで、細胞ペレットを、2.5％グルタルアルデヒドの0.1Ｍリン酸緩衝液、pH 7.5で固定し、四酸化オスミウム(水で２％に調製したもの)でさらに固定を行い、そして、タンニン酸(水で0.5％に調製したもの)で処理をした。 脱水を行った後に、検体を、Epon(Epon-812, Fulham, Latham, N.Y.)に埋設した。 そこから切片を取得し、次いで、2.6％アルカリ性クエン酸鉛-0.5％酢酸ウラニルの50％エタノールで染色してから、Jeol 1200-EX 電子顕微鏡で検査を行った。
実施例３：走査型電子顕微鏡
ガラス製のカバースリップ上で細胞を生育せしめ、そして、図中の凡例で示したウィルスでもってして、細胞を、25の感染の多重度(MOI)で感染させた。 固定および固定後の手順は、透過型電子顕微鏡についての手順と同様であった。 液体二酸化炭素で細胞を臨界点まで乾燥せしめ、次いで、金でコーティングしてから、Zeiss DSM 950 電子顕微鏡による検査を行った。
実施例４：Gag VLP分析-超遠心分離分析
Sf９細胞の形質膜から放出されたGag VLPの活性を復元し、そして、ショ糖-Ｄ2Ｏ勾配を介した超遠心分離によって分析を行った(Huvent, I. et al., 1998, J. Gen. Virol.79: 1069-1081)。 直線勾配(10mlの全容量、30〜50％w/v)を、ベックマンのSW41ローターを用いて、28,000rpmで、18時間かけて遠心分離した。 50％ショ糖溶液は、水酸化ナトリウムでpH 7.2にまで緩衝化されたＤ2Ｏを用いて調製し、また、30％ショ糖溶液は、10 mM Tris-HCl、pH 7.2、150mM NaCl、5.7mM Na2EDTAを用いて調製した。 チューブの頂端から0.5mlの画分を回収し、そして、これらのタンパク質を、不連続な緩衝系を用いた10％アクリルアミドゲルを利用したSDS-PAGEによって分析を行った(Laemmli, 1970, Nature, 227: 680-685)。
Gag VLP分析-免疫ブロット分析
タンパク質を、上述したようにして電気泳動させ、そして、ニトロセルロース膜(Hybond-ECL、Amersham社)へと電気的に移動させた。 0.05％のTween 20(TBS-T)を含有する５％スキムミルクのTris-緩衝化生理食塩水(20mM Tris-HCl、pH 7.5、150mM NaCl)を用いて、室温下で、１時間かけて、ブロッキング処理を行った後に、抗Gag抗体(実験室で作成されたウサギポリクローナル抗体)、または、抗VSVg抗体(モノクローナル抗VSVg抗体、Sigma社)との反応と、それに続く、アルカリンフォスファターゼで標識した抗IgGの接合によって、GagおよびVSVgタンパク質の検出を行った。 ５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルトルイジンリン酸塩、および、ニトロブルーテトラゾリウム(Euromedex社)を用いてブロットの発色を行った。
実施例５：VLP-媒介タンパク質の移動と免疫蛍光顕微鏡による分析
上述したようにして、ショ糖-D2O勾配からGag VLPを精製した。 次いで、精製したGag VLPを、DMEM培養培地(Invitrogen社)で希釈し、そして、ガラス製のカバースリップ上で成長したA549細胞に対して加えた。 これら細胞を、37℃で、１時間かけて、VLPと共にインキュベーションを行い、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で三度にわたって洗浄を行った。 次に、これら細胞を、２％パラホルムアルデヒドのPBS溶液を用いて、室温下で、10分間かけて固定を行った。 そして、これら細胞を、１％ウシ血清アルブミンのPBS溶液を用いて、室温下で、30分間かけてブロッキング処理を行い、次いで、抗VSVg (１：1000の希釈度)と共に、１時間かけて、インキュベーションした。 これら細胞を、ロダミンを標識付けされたマウス二次抗体(Sigma社)と共に、室温下で、１時間かけて、インキュベーションを行った。 これら細胞を、ディジタルカメラAxioCamを搭載したAxiovert 135型の倒立顕微鏡(Zeiss社)を用いて観察するためにスライド上に載置する以前に、DAPI(４',６-ジアミジノ-２-フェニルインドール；Sigma社)と共にインキュベーションさせた。
対照のSf９細胞(ａ)およびバキュロウィルス感染Sf９細胞(ｂ-ｄ)の電子顕微鏡(ＥＭ)分析は、in vitroにて組換えバキュロウィルスAcMNPV-Gagで感染させた昆虫細胞によるGag媒体の効率的な発芽と量産を実証している。 (ａ、ｂ)、細胞表面の様子を走査型電子顕微鏡で捉えたところ、(ａ)非感染細胞の形質膜の比較的に滑らかな表面が認められたのに対して、(ｂ)Gag-発現細胞の表面では幾つかの認識可能な「泡状体」や(「芽状突起」)が映し出された。 これら芽状突起は、極薄画分で認められたGag VLPに対応している(ｃ、ｄ)。 (ｃ、ｄ)、AcMNP V-Gag-感染細胞の極薄画分を、透過型電子顕微鏡分析で確認したとこと、両者の倍率は互いに異なるものになった。 膜二重層の下部に位置する高電子密度の冠状の物体は、 Gag粒子内のコアを構成するPr55Gagポリタンパク質分子から構成されている。 (ａ)および(ｂ)での寸法表示帯は、500nmを、そして、(ｃ)では、100nmを、さらに、(ｄ)では、１mmを示している。 組換えGag-発現ヒトアデノウィルス、Ad5-Gagで感染させた哺乳動物細胞の透過型電子顕微鏡分析を示す図である。 Gag粒子が、細胞外に放出されている点に留意されたい。 寸法表示帯は、200nmである。 ウィルス性糖タンパク質VSV-Gを用いたGag媒体の変化を示す図である。 Gag 粒子(VLP)についてのSDS-PAGEと免疫ブロット分析である。 精製したGag粒子を、SDSで変性させ、変性ポリアクリルアミドゲル(PAGE)で電気泳動させ、ニトロセルロース膜にタンパク質を移し、そして、モノクローナル抗体(mAb)抗Gagまたは抗体-VSV-Gで検出した。 (Ａ)、VSV-G-で細胞指向性を変化したGag媒体のショ糖-Ｄ2Ｏ傾斜についての超遠心分離分析である。 同時に、ブロットを、抗Gagおよび抗VSV-Gモノクローナル抗体に対して反応させた。 Pr55GagとVSV-G 62-kDaシグナルの共沈降分離が認められたことに留意されたい。 (Ｂ)抗Gag(レーン１)または抗VSV-G(レーン２)モノクローナル抗体を用いて(Ａ)において得られたGag粒子のピークに関する免疫ブロット分析の結果を示すものであって、図中のＭＭは、分子量マーカーである。 レーン１の右側の破線は、自然に生じたGagの開裂産物である。 VSV-Gを用いたGag媒体の変化を電子顕微鏡(ＥＭ)分析で示す図である。 (ａ)、Pr55GagとVSV-Gとを共発現するSf９細胞からのGag粒子の発芽を示している。 (ｂ)、Pr55Gagだけを発現するSf９細胞からのGag粒子の発芽、つまり、対照である。 (ｂ)で示した「滑らかな」Gag粒子と、(ａ)で示した「毛状」のGag粒子との間の膜-エンベロープ粒子の形態に留意されたい。 なお、「毛状」の態様は、図３のウェスターンブロッとによって確認された膜挿入型VSV-G分子においてよく認められる形態である。 非遺伝子を、膜−膜タンパク質へ誘導する原理を示す図である。 図の左上欄には、Pr55Gag、VSV-G糖タンパク質(膜融合性であり、細胞指向性の改変剤である)、および、移動される標的タンパク質(すなわち、GFPで標識付けを行ったCl-チャンネル/CFTR分子(GFP-CFTR))を発現する生産細胞が概略的に記載されている。 構築と発芽、それに、細胞外への放出を行った後に、図の右下欄に記載したように、膜挿入型GFP-CFTR分子を保有するVSV-Gで細胞指向性が変化したGag粒子を、in vitroで、標的細胞と共にインキュベーションする。 VSV-Gは、疑似ウィルス性膜、すなわち、「供与膜」と受容細胞の形質膜(「受容膜」)との間の融合を誘発する。 膜融合が起これば、GFP-CFTRタンパク質と、それを取り囲むマイクロドメインとが、標的細胞の形質膜に向けて移動する。 次いで、その他の細胞表面分子または受容体として機能するGFP-CFTRは、直接的に利用することができ、また、細胞をさらに処理しなくとも、それらの可溶性リガンドに対して影響を及ぼすこととなる。 非遺伝子を、Gag-Vprで媒介した細胞内タンパク質へ誘導する原理を示す図である。 図の左上欄には、Pr55Gag、VSV-G糖タンパク質(膜融合性であり、細胞指向性の改変剤である)、および、移動されるVpr-融合タンパク質(Vpr-X)を発現する生産細胞が概略的に記載されている。 Gag-GagおよびGag-Vpr-Xの(Pr55Gagのｐ６ドメインを介した)相互作用と粒子の構築を行った後に、細胞外への芽出によって放出されたVSV-Gで細胞指向性が変化したGag粒子を、図の右下欄に記載したように、in vitroで、標的細胞と共にインキュベーションする。 VSV-Gは、疑似ウィルス性膜、すなわち、「供与膜」と標的細胞の形質膜(「受容膜」)との間の融合を誘発する。 膜融合の後に、Gag粒子は、標的細胞の細胞質ゾル内部で分離し、そして、Vpr-X融合タンパク質は、Vpr-NLS-媒介経路を介して、核へと移動する。 そのいずれもが、形質膜内に局在しており、かつ膜-エンベロープウィルス様粒子のキャプシドに協同して取り込まれているレトロウィルス性Gagポリプロテインと非レトロウィルス性融合性VSV-G糖タンパク質の共発現によって誘発された昆虫細胞シンシチウムを示す図である。 Ａ) 位相差顕微鏡では、細胞-細胞の融合に先駆けて、「ロゼット」模様が認められている。 Ｂ）電子顕微鏡で認められた巨大多核細胞を図の左側に、そして、通常の単核細胞を図の右側に示している。 ヒトのＡ549細胞へのGFP-CFTRの移動を示す図であり、GFP-CFTRの移動は、VSV-G糖タンパク質を含むGag VLPによって媒介されている。 GFPシグナルは、形質膜において認められており、また、RITCを標識付けした抗-VSV-G-抗体によって可視化したVSV-Gと共に局在している。 DAPIを用いた核の対比染色を、左下の図に示した。

Claims (27)

  1. 形質膜由来の脂質二重層エンベロープを有するウィルス様粒子(ＶＬＰ)であって、当該ＶＬＰが；
    ａ) エンベロープＶＬＰを形成することができるウィルス構造タンパク質、またはその断片または誘導体、
    ｂ) 融合性タンパク質、および
    ｃ) 組換え標的タンパク質をさらに含む、ウィルス様粒子。
  2. 前記形質膜由来の脂質二重層エンベロープが、少なくとも四つ、より好ましくは少なくとも六つ、最も好ましくは少なくとも八つの異なるタイプの脂質を含む請求項１に記載のＶＬＰ。
  3. 前記形質膜由来の脂質二重層エンベロープが、ホスファチジルセリンを含む先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰ。
  4. 前記形質膜由来の脂質二重層エンベロープが、少なくとも四つ、より好ましくは少なくとも六つ、最も好ましくは少なくとも八つの異なるタイプのタンパク質を含む先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰ。
  5. 前記ウィルス構造タンパク質が、レトロウィルス科、コロナウィルス科、ヘルペスウィルス科、ヘパドナウィルス科およびオルトミクソウィルス科からなるグループから選択されるウィルス科に由来するウィルスの構造タンパク質である先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰ。
  6. 前記ウィルス構造タンパク質が、ＨＩＶ-Ｉに由来するウィルスの構造タンパク質である請求項５に記載のＶＬＰ。
  7. 前記ウィルス構造タンパク質が、ＨＩＶ-Ｉ Pr55Gagに由来するウィルスの構造タンパク質である請求項６に記載のＶＬＰ。
  8. 少なくとも2000コピー、より好ましくは3000コピー、そして、最も好ましくは4000コピーのウィルス構造タンパク質を含む先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰ。
  9. 前記融合性タンパク質が、ヘマグルチニン、呼吸器多核体ウィルス融合タンパク質、ダニ媒介性脳炎ウィルスおよびデング熱ウイルスのＥタンパク質、セムリキ森林ウィルスのＥ１タンパク質、狂犬病ウィルスおよび水疱性口内炎ウィルスおよびバキュロウィルスgp64のＧタンパク質、またはこれらと機能的に同等の断片または誘導体からなるグループから選択される先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰ。
  10. 前記融合性タンパク質が、水疱性口内炎ウィルスのＧタンパク質である請求項９に記載のＶＬＰ。
  11. 前記融合性タンパク質が、前記ウィルス構造タンパク質とは異種のタンパク質である先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰ。
  12. 前記組換え標的タンパク質が、膜タンパク質である先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰ。
  13. 前記膜タンパク質が、単一の膜貫通ドメインを有している請求項１２に記載のＶＬＰ。
  14. 前記組換え標的タンパク質が、ＣＦＴＲ、ＳＣＦ-Ｒ、ＥＧＦＲおよびＨｏｘ４からなるグループから選択される請求項１乃至１１のいずれかに記載のＶＬＰ。
  15. 組換え標的タンパク質を受容細胞に誘導する方法であって、当該方法が；
    ａ) 先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰを準備し；および
    ｂ) 当該ＶＬＰに対して当該受容細胞を曝す、ことを含む方法。
  16. タンパク質治療方法であって、当該方法が；
    ａ) 先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰを準備し；および
    ｂ) 組換え標的タンパク質が関係する治療効果を得るに十分な量の当該ＶＬＰに対して細胞を曝す、ことを含む方法。
  17. 前記タンパク質治療が、膵嚢胞線維症を処置するためのものである請求項１６に記載の方法。
  18. 先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰを、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤の少なくとも一つと共に含む薬学的組成物。
  19. 治療用途に供される先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰ。
  20. 膵嚢胞線維症の治療薬剤を製造するための請求項１４に記載のＶＬＰの使用。
  21. 先行するいずれかの請求項に記載のＶＬＰを製造する方法であって、当該方法が、融合性タンパク質との共存下、組換え標的タンパク質との共存下で、in vitroで培養した細胞での、エンベロープＶＬＰを形成することができるウィルス構造タンパク質、またはその断片または誘導体の共発現、および、培養培地からのＶＬＰの単離を含む、ＶＬＰを製造する方法。
  22. 宿主細胞、すなわち；
    ａ) エンベロープＶＬＰを形成することができるウィルス構造タンパク質、またはその断片または誘導体をコードする核酸、
    ｂ) 融合性タンパク質をコードする核酸、および
    ｃ) 組換え標的タンパク質をコードする核酸を含む、in vitro宿主細胞。
  23. 核酸ベクター、すなわち；
    ａ) エンベロープＶＬＰを形成することができるウィルス構造タンパク質、またはその断片または誘導体をコードする配列、
    ｂ) 融合性タンパク質をコードする核酸、および
    ｃ) 標的タンパク質のコード配列を挿入することができるクローニング部位を含む、核酸ベクター。
  24. 複製開始点、選択可能なマーカー、転写開始部位、転写エンハンサー、転写インデューサー、転写制御要素、３'-非翻訳制御配列、５'-非翻訳制御配列、および、標的タンパク質産物の検出および／または精製を許容する配列の少なくとも一つをさらに含む請求項23に記載のベクター。
  25. 請求項２１または２２に記載のベクターおよび宿主細胞系を含むキット。
  26. 以下の要素、すなわち；
    (ａ) エンベロープＶＬＰを形成することができるウィルス構造タンパク質、またはその断片または誘導体をコードする核酸、および融合性タンパク質をコードする核酸を含む安定な宿主細胞系；および
    (ｂ) 標的タンパク質をコードする配列を用いて当該宿主細胞系を結果的にトランスフェクションする上で好適なベクター、を含むキット。
  27. 形質膜由来の脂質二重層エンベロープを有するＶＬＰであって、当該ＶＬＰが、エンベロープＶＬＰを形成することができるウィルス構造タンパク質、またはその断片または誘導体、および、ウィルス様粒子のエンベロープ内に存在する標的タンパク質に結合した組換え膜の少なくとも一つをさらに含むＶＬＰ。
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