JP4573776B2 - 新規hcv株由来の核酸、遺伝子、及び該遺伝子を利用したレプリコン複製細胞 - Google Patents
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Description
(a)配列番号1、配列番号3及び配列番号4に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号2、配列番号5及び配列番号6に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(c)前記(a)又は(b)記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCVタンパクをコードするポリヌクレオチド
(但し、核酸がDNAの場合、配列表の塩基記号「u」は「t」に読み替えるものとする)
本発明はまた、前記核酸を構成する下記(1)〜(6)の核酸も提供する。
(1) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号1で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCVタンパクのうちNS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパクをコードするポリヌクレオチド
(2) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号3で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCV遺伝子の5'非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
(3) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号4で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCV遺伝子の3'非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
(4) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号2で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCVタンパクのうちNS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパクをコードするポリヌクレオチド
(5) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号5で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCV遺伝子の5'非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
(6) 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドからなる核酸:
(a)配列番号6で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつHCV遺伝子の3'非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
(但し、上記(1)〜(6)のいずれについても、核酸がDNAの場合、配列表の塩基記号「u」は「t」に読み替えるものとする)
本発明はまた、前記各核酸からなる遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチドも提供する。
(a)配列番号1、配列番号3及び配列番号4に示される塩基配列を含むRNA
(b)配列番号2、配列番号5及び配列番号6に示される塩基配列を含むRNA
また、前記レプリコンRNAは、さらにIRES配列や、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含んでいてもよい。
(a)配列番号7又は8に示される塩基配列を含むRNA
(b)前記(a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ自律複製能を有するRNA
本発明はまた、前記レプリコンRNAを適当な細胞に導入することにより、レプリコン複製細胞を作製する方法と、該方法によって作製されたレプリコン複製細胞も提供する。該レプリコン複製細胞に用いられる細胞としては、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞が挙げられ、より具体的には、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、又は293細胞が挙げられる。
1.本発明に係るHCV由来の核酸、遺伝子及びレプリコンRNA
C型肝炎ウイルス(HCV)のゲノムは、約9600ヌクレオチドからなる(+)鎖の一本鎖RNAである。このゲノムRNAは、5'非翻訳領域(5'NTR又は5'UTRとも表記する)、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び3'非翻訳領域(3'NTR又は3'UTRとも表記する)からなる。その構造領域にはHCVの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
すなわち、配列番号1又は2で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドはHCVタンパクのうちNS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパクをコードするものであり、配列番号3又は5で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドはHCV遺伝子の5'非翻訳領域をコードするものであり、配列番号4又は6で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドはHCV遺伝子の3'非翻訳領域をコードするものである限り、本発明の核酸あるいは遺伝子に含まれる(「塩基配列を含むポリヌクレオチド」は、「塩基配列を含む塩基配列」とも表示することがある)。
本発明に係るHCV レプリコンRNAは、当業者に公知である任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。限定するものではないが、HCV レプリコンRNAは、例えば、以下のような方法で作製することができる。
上記のようにして作製されたレプリコンRNAを、レプリコンRNAを複製させるべき細胞に導入することにより、レプリコンRNAが持続的に複製される細胞を得ることができる。本明細書では、レプリコンRNAが持続的に増幅される細胞を「レプリコン複製細胞」と称する。
本発明に係るレプリコン複製細胞において複製され生成されたレプリコンRNA(複製レプリコンRNA)には、複製効率を向上させる突然変異が頻繁に生ずる。このような突然変異は適合変異であると思われる。
コロニー形成率 [(Colony forming Unit; CFU)/マイクログラム] = コロニー形成数 [個]/導入したRNA量 [マイクログラム]
こうして算出されたコロニー形成率を、導入したレプリコンRNAの複製効率を示す値とする。すなわち、コロニー形成率が高いほど、そのレプリコンRNAの複製効率は高い。
コロニー形成能=導入したレプリコンRNAのコピー数 [コピー]/コロニー形成数 [個]
本発明に係るレプリコンRNA複製細胞は、例えばC型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には、例えば、被験物質の存在下でレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンRNAの複製を検出し、その被験物質がレプリコンRNAの複製を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、C型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。この場合、得られる培養物中のレプリコンRNAの複製の検出は、レプリコンRNA複製細胞から抽出したRNA中のレプリコンRNAの量又は有無を検出することによるものであってもよいし、培養物中又は該培養物に含まれるレプリコンRNA複製細胞中のタンパク質に含まれるHCVタンパク質の量又は有無を検出するものであってもよい。
(1)HCVの増殖を抑制する物質の探索
HCVの増殖を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にHCVの増殖に影響を及ぼす有機化合物、あるいはHCVゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりHCVの増殖若しくはHCVタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
(2) 細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザイン又はハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質(例えば、単離精製された酵素)等が挙げられる。
(3)HCVに感染した患者の治療のための、新規攻撃標的の同定
例えばHCVウイルス増殖のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質を同定するために、本発明に係るレプリコン複製細胞を使用することができる。
(4) HCVウイルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異の同定
(5) C型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質の製造
本発明を、以下の実施例及び図面に基づいてさらに具体的に説明する。
1.発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したC型肝炎ウイルスJFH-2.1株及びJFH-2.2株のウイルスゲノムの全領域に対応するDNAを、該ウイルス株のゲノム全長cDNAを含むJFH-2.1、及びJFH-2.2クローンから取得し、T7RNAプロモーター配列の合成DNAをそれぞれのクローンの5’端に付加し、プラスミドpUC19プラスミドに挿入した。このようにして構築されたプラスミドDNAを、以下、pJFH-2.1、及びpJFH-2.2と称する。なお、上記JFH-2.1、及びJFH-2.2クローンの作製については、既報(Lehmann et.al., Science, (1999))に従った。
レプリコンRNA合成に用いる鋳型DNAを作製するために、上記のとおり構築した発現ベクターpSGREP-JFH2.1及びpSGREP-JFH2.2を、それぞれ制限酵素XbaIで切断した。次いで、これらのXbaI切断断片のそれぞれ10から20μgを、Mung Bean Nuclease 20U(トータル反応液量 50μl)を用いて30℃で30分間インキュベートして、さらに処理した。Mung Bean Nucleaseは、二本鎖DNA中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記XbaI切断断片をそのまま鋳型として用いてRNA合成を行うと、XbaIの認識配列の一部であるCUGAの4塩基が3'末端に余分に付加されたレプリコンRNAが合成されてしまう。そこで本実施例では、XbaI切断断片をMung Bean NuCleaseで処理することにより、XbaI切断断片からCUGAの4塩基を除去した。この後、XbaI切断断片を含むMung Bean NuClease処理後の溶液について、常法に従ったタンパク質除去処理により、CUGAの4塩基が除去されたXbaI切断断片を精製して、これを鋳型DNAとした。
実施例1で作製した合成レプリコンRNA、rSGREP-JFH2.1、及びrSGREP-JFH2.2のそれぞれについて、レプリコンRNA 0.01ng〜10μgをHuh7細胞から抽出したトータル細胞性RNAと混合して、RNA総量が10μgとなるように調整した。次いで、その混合RNAをエレクトロポレーション法によりHuh7細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったHuh7細胞を培養ディッシュに播種し、16時間から24時間培養した後に、培養ディッシュにG418(ネオマイシン)を様々な濃度で添加した。その後、週に2回培養液を交換しながら培養を継続した。播種時から21日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。その結果、図2に示すように、コロニー形成が確認できた。
配列番号8−人工配列の説明:JFH2.2レプリコンRNA
Claims (8)
- 配列番号1、配列番号3及び配列番号4に示される塩基配列を含むRNAからなるレプリコンRNA。
- さらにIRES配列を含む、請求項1記載のレプリコンRNA。
- さらに選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含む、請求項2記載のレプリコンRNA。
- 配列番号7に示される塩基配列を含むRNAからなるレプリコンRNA。
- 請求項1乃至4のいずれか1項記載のレプリコンRNAを細胞に導入することにより作製された、レプリコン複製細胞。
- 細胞が、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞である、請求項5記載のレプリコン複製細胞。
- 細胞が、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、及び293細胞からなる群より選ばれるいずれかの細胞である、請求項5又は6記載のレプリコン複製細胞。
- 被験物質の存在下で、請求項5乃至7のいずれか1項記載のレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンRNAの複製を検出することを含む、C型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングする方法。
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