JPH06121689A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペ プタイド、抗原、抗体検出系 - Google Patents
非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペ プタイド、抗原、抗体検出系Info
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- JPH06121689A JPH06121689A JP28740291A JP28740291A JPH06121689A JP H06121689 A JPH06121689 A JP H06121689A JP 28740291 A JP28740291 A JP 28740291A JP 28740291 A JP28740291 A JP 28740291A JP H06121689 A JPH06121689 A JP H06121689A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は、非Ａ非Ｂ型（ＮＡＮＢ）肝炎ウイル
スＨＣ−Ｊ６株の全遺伝子配列を解明し、これにもとづ
いてＮＡＮＢ肝炎ウイルスを高感度に検出する方法を提
供することを目的とする。 【構成】本発明は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルス遺伝子の発明
であり、これに関連するポリヌクレオチド、ｃＤＮＡク
ローン、ポリペプタイド、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体の発明であり、また、これらに用いたＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルス検出系の発明である。 【効果】本発明のポリペプタイド、抗体は、ＮＡＮＢ肝
炎を高感度に検出することができ、また関連するポリヌ
クレオチド、ｃＤＮＡクローンは、これらの検出系を製
造することができる。
スＨＣ−Ｊ６株の全遺伝子配列を解明し、これにもとづ
いてＮＡＮＢ肝炎ウイルスを高感度に検出する方法を提
供することを目的とする。 【構成】本発明は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルス遺伝子の発明
であり、これに関連するポリヌクレオチド、ｃＤＮＡク
ローン、ポリペプタイド、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体の発明であり、また、これらに用いたＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルス検出系の発明である。 【効果】本発明のポリペプタイド、抗体は、ＮＡＮＢ肝
炎を高感度に検出することができ、また関連するポリヌ
クレオチド、ｃＤＮＡクローンは、これらの検出系を製
造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス（以下「ＮＡＮＢ肝炎ウイルス」と略記する）遺伝
子、これに関連するポリヌクレオチド、ポリペプタイ
ド、ならびに関連抗原、抗体検出系に関する。
ス（以下「ＮＡＮＢ肝炎ウイルス」と略記する）遺伝
子、これに関連するポリヌクレオチド、ポリペプタイ
ド、ならびに関連抗原、抗体検出系に関する。
【０００２】
【従来の技術】ウイルスに由来する肝炎には、既に病原
体が解明されその診断法や予防法が確立したものとして
Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎がある。これ以外は一括して、非Ａ
非Ｂ型肝炎（以下「ＮＡＮＢ肝炎」という）と呼ばれて
きた。日本における輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎の検出法が
輸血血液のスクリーニングに導入された後は格段に減少
したが、なお、年間推定２８万例が、ＮＡＮＢ肝炎ウイ
ルスにより発症していると考えられてきた。
体が解明されその診断法や予防法が確立したものとして
Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎がある。これ以外は一括して、非Ａ
非Ｂ型肝炎（以下「ＮＡＮＢ肝炎」という）と呼ばれて
きた。日本における輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎の検出法が
輸血血液のスクリーニングに導入された後は格段に減少
したが、なお、年間推定２８万例が、ＮＡＮＢ肝炎ウイ
ルスにより発症していると考えられてきた。
【０００３】近年、ＮＡＮＢ肝炎ウイルス肝炎は、タイ
プ別にＣ型、Ｄ型、Ｅ型と命名され、その病原体につい
ての研究が進展し、撲滅に向けての努力が世界的に進め
られるようになった。輸血後肝炎に関して、１９８８年
アメリカのカイロン社がＣ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣ
Ｖ」と略記する）のＲＮＡウイルスゲノムのクローン化
に成功したと発表し、これを基にＨＣＶ抗体の測定系を
開発した。現在、ＨＣＶ抗体測定系は、輸血血液のスク
リーニングや肝疾患患者の診断に、日本を始めとして各
国で用いられている。このＨＣＶ抗体の測定系はＮＡＮ
Ｂ肝炎との関連性が確かに一部では認められる。しか
し、キャリアや慢性肝炎の捕捉率は約７０％にすぎず、
また急性期の抗体検出ができない等重大な問題点が残さ
れている。したがって、カイロン社の前記開発によって
もＮＡＮＢ肝炎への対処は依然として解決されていな
い。ＮＡＮＢ肝炎の経過は不良であり、水平感染によっ
ても持続感染化（キャリア化）し、慢性肝炎に進展する
ことが確認されている。また、肝硬変、肝がんへ進展す
るケースも多いと予想され、一日も早いウイルス本体の
全貌解明が望まれていた。
プ別にＣ型、Ｄ型、Ｅ型と命名され、その病原体につい
ての研究が進展し、撲滅に向けての努力が世界的に進め
られるようになった。輸血後肝炎に関して、１９８８年
アメリカのカイロン社がＣ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣ
Ｖ」と略記する）のＲＮＡウイルスゲノムのクローン化
に成功したと発表し、これを基にＨＣＶ抗体の測定系を
開発した。現在、ＨＣＶ抗体測定系は、輸血血液のスク
リーニングや肝疾患患者の診断に、日本を始めとして各
国で用いられている。このＨＣＶ抗体の測定系はＮＡＮ
Ｂ肝炎との関連性が確かに一部では認められる。しか
し、キャリアや慢性肝炎の捕捉率は約７０％にすぎず、
また急性期の抗体検出ができない等重大な問題点が残さ
れている。したがって、カイロン社の前記開発によって
もＮＡＮＢ肝炎への対処は依然として解決されていな
い。ＮＡＮＢ肝炎の経過は不良であり、水平感染によっ
ても持続感染化（キャリア化）し、慢性肝炎に進展する
ことが確認されている。また、肝硬変、肝がんへ進展す
るケースも多いと予想され、一日も早いウイルス本体の
全貌解明が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記カイロン社のＨＣ
Ｖ抗体検出キットでは診断できないＮＡＮＢ肝炎が多数
存在することから、日本におけるＮＡＮＢ肝炎ウイルス
ゲノムがカイロン社の解明したＨＣＶゲノムとは必ずし
も一致せず、サブタイプの違いがあると推定された。し
たがって、特異性、感度においてさらに優れたＮＡＮＢ
肝炎診断薬、および有効なワクチンを開発するために
は、サブタイプ別にＮＡＮＢ肝炎ウイルスの遺伝子レベ
ル、アミノ酸レベルでの解析を完成することが待望され
ていた。本発明の目的は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスゲノム
の塩基配列を、全体にわたって完全に解明し、これに基
づいてアミノ酸レベルでの解析を行うこと、ならびにこ
れを用いてＮＡＮＢ肝炎ウイルス関連抗原、抗体の検出
系の確立を図ることである。
Ｖ抗体検出キットでは診断できないＮＡＮＢ肝炎が多数
存在することから、日本におけるＮＡＮＢ肝炎ウイルス
ゲノムがカイロン社の解明したＨＣＶゲノムとは必ずし
も一致せず、サブタイプの違いがあると推定された。し
たがって、特異性、感度においてさらに優れたＮＡＮＢ
肝炎診断薬、および有効なワクチンを開発するために
は、サブタイプ別にＮＡＮＢ肝炎ウイルスの遺伝子レベ
ル、アミノ酸レベルでの解析を完成することが待望され
ていた。本発明の目的は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスゲノム
の塩基配列を、全体にわたって完全に解明し、これに基
づいてアミノ酸レベルでの解析を行うこと、ならびにこ
れを用いてＮＡＮＢ肝炎ウイルス関連抗原、抗体の検出
系の確立を図ることである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＮＡＮＢ
肝炎ウイルスの治療、予防、検査に不可欠なポリヌクレ
オチドを見出すために鋭意研究をつづけ、その結果、ヒ
トおよびチンパンジーキャリアの血清よりＮＡＮＢ肝炎
ウイルスのＲＮＡを単離し、非コード領域を含む遺伝子
領域全体をカバーするｃＤＮＡをクローン化してその全
部の塩基配列を決定し、さらにアミノ酸配列を決定し
た。その結果本発明者らは、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスであ
るＨＣ−Ｊ６ゲノムの遺伝子全体の塩基配列を完全に解
明することに成功した。かかる遺伝子及びアミノ酸レベ
ルでの研究によって本発明は完成された。本発明のＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルス（ＨＣ−Ｊ６ゲノム）は、カイロン社
のＨＣＶゲノムとは別異のものである。
肝炎ウイルスの治療、予防、検査に不可欠なポリヌクレ
オチドを見出すために鋭意研究をつづけ、その結果、ヒ
トおよびチンパンジーキャリアの血清よりＮＡＮＢ肝炎
ウイルスのＲＮＡを単離し、非コード領域を含む遺伝子
領域全体をカバーするｃＤＮＡをクローン化してその全
部の塩基配列を決定し、さらにアミノ酸配列を決定し
た。その結果本発明者らは、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスであ
るＨＣ−Ｊ６ゲノムの遺伝子全体の塩基配列を完全に解
明することに成功した。かかる遺伝子及びアミノ酸レベ
ルでの研究によって本発明は完成された。本発明のＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルス（ＨＣ−Ｊ６ゲノム）は、カイロン社
のＨＣＶゲノムとは別異のものである。
【０００６】本発明は、配列番号１記載の塩基配列を有
する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発明であり、ＲＮ
Ａ５′末端より３４０箇のヌクレオチドからなる非コー
ド領域、これに続く構造蛋白質および非構造蛋白質をコ
ードする領域を含む９０９９箇のヌクレオチド、ならび
に３′末端１０８箇のＵストッチを含む１５０箇のヌク
レオチドからなる、配列番号１記載のウイルス遺伝子の
発明であり、これらと、部分的置換を有する非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス変異株遺伝子の発明である。また、配列番
号２記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドＮ−９５
８９、配列番号３記載の塩基配列を有するｃＤＮＡクロ
ーンＪ６−φ８１、配列番号４記載の塩基配列を有する
ｃＤＮＡクローンＪ６−φ８、これら各ヌクレオチドと
部分的置換を有する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス変異株ヌク
レオチドの発明である。さらに前記遺伝子またはポリヌ
クレオチドにコードされるポリペプタイド、配列番号５
記載のアミノ酸配列を有するポリペプタイドＰ−３０３
３、前記遺伝子、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡクローン
の全部または一部を宿主細胞に組み込み発現させて得た
ポリペプタイド、前記各ポリペプタイドに対するポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体の発明である。
さらに、前記各ポリペプタイドを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎
検出系、前記各抗体を用いた非Ａ非Ｂ型肝炎検出系の発
明である。
する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発明であり、ＲＮ
Ａ５′末端より３４０箇のヌクレオチドからなる非コー
ド領域、これに続く構造蛋白質および非構造蛋白質をコ
ードする領域を含む９０９９箇のヌクレオチド、ならび
に３′末端１０８箇のＵストッチを含む１５０箇のヌク
レオチドからなる、配列番号１記載のウイルス遺伝子の
発明であり、これらと、部分的置換を有する非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス変異株遺伝子の発明である。また、配列番
号２記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドＮ−９５
８９、配列番号３記載の塩基配列を有するｃＤＮＡクロ
ーンＪ６−φ８１、配列番号４記載の塩基配列を有する
ｃＤＮＡクローンＪ６−φ８、これら各ヌクレオチドと
部分的置換を有する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス変異株ヌク
レオチドの発明である。さらに前記遺伝子またはポリヌ
クレオチドにコードされるポリペプタイド、配列番号５
記載のアミノ酸配列を有するポリペプタイドＰ−３０３
３、前記遺伝子、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡクローン
の全部または一部を宿主細胞に組み込み発現させて得た
ポリペプタイド、前記各ポリペプタイドに対するポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体の発明である。
さらに、前記各ポリペプタイドを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎
検出系、前記各抗体を用いた非Ａ非Ｂ型肝炎検出系の発
明である。
【０００７】本発明のＮＡＮＢ肝炎ウイルス遺伝子は次
のようにして得て、その塩基配列を決定した。ヒトおよ
びチンパンジー血漿より得た検体、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−
Ｊ４、ＨＣ−Ｊ６を用いて本研究を進めた。ＨＣ−Ｊ
１、ＨＣ−Ｊ６は日本人供血者由来で、いずれもＨＣＶ
抗体陽性と判定された検体より得た。ＨＣ−Ｊ４はＮＡ
ＮＢ肝炎の感染性を確認したチンパンジーから得た検体
に由来するが、しかしこれはカイロン社の前記のＨＣＶ
抗体では（−）であった。この３種の血漿検体よりＲＮ
Ａを調整し、これらによってＲＮＡの塩基配列を調べ
た。このうちＲＮＡの５′末端側の約２５００、および
３′末側の約１１００の塩基配列については既に本年４
月２６日付特許出願（特願平３−１９１３７６号）なら
びに６月２０日付特許出願においてその一部を開示し
た。本発明者らは、さらに研究を進め、今回ＨＣ−Ｊ６
について、新たに非構造蛋白質をコードする領域のｃＤ
ＮＡクローンの構造も解明し、これによって、ＨＣ−Ｊ
６ゲノムの完全長ＲＮＡ９５８９塩基の配列の研究を完
成させ、本発明を完成させるに至った。
のようにして得て、その塩基配列を決定した。ヒトおよ
びチンパンジー血漿より得た検体、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−
Ｊ４、ＨＣ−Ｊ６を用いて本研究を進めた。ＨＣ−Ｊ
１、ＨＣ−Ｊ６は日本人供血者由来で、いずれもＨＣＶ
抗体陽性と判定された検体より得た。ＨＣ−Ｊ４はＮＡ
ＮＢ肝炎の感染性を確認したチンパンジーから得た検体
に由来するが、しかしこれはカイロン社の前記のＨＣＶ
抗体では（−）であった。この３種の血漿検体よりＲＮ
Ａを調整し、これらによってＲＮＡの塩基配列を調べ
た。このうちＲＮＡの５′末端側の約２５００、および
３′末側の約１１００の塩基配列については既に本年４
月２６日付特許出願（特願平３−１９１３７６号）なら
びに６月２０日付特許出願においてその一部を開示し
た。本発明者らは、さらに研究を進め、今回ＨＣ−Ｊ６
について、新たに非構造蛋白質をコードする領域のｃＤ
ＮＡクローンの構造も解明し、これによって、ＨＣ−Ｊ
６ゲノムの完全長ＲＮＡ９５８９塩基の配列の研究を完
成させ、本発明を完成させるに至った。
【０００８】ＨＣ−Ｊ６ゲノムは、実施例に示すよう
に、５′末端より３４０個のヌクレオドよりなる５′非
コード領域を有し、それに続いて構造蛋白質をコードす
る領域が続き、さらに非構造蛋白質をコードする領域を
有する。他方、３′末端側は、非構造蛋白質をコードす
る領域に続いて１０８塩基のＵ−ストレッチを含む１５
０塩基の非コード領域を有する。５′末端側から３４１
番目のアデニンより始まるコード領域は９０９９塩基の
一本の長いオープンリーディングフレームよりなり、こ
れが３０３３アミノ酸をコードしていることが明らかと
なった。ＨＣＶ、すなわちＣ型肝炎ウイルスはその遺伝
子構造からフラビウイルスに近縁であると考えられてい
るが、本発明のＮＡＮＢ肝炎ウイルス遺伝子のコード領
域も図１に示す如く、Ｃ（コア）、Ｅ（エンベロー
プ）、ＮＳ−１（非構造蛋白−１）、ＮＳ−２（同−
２）、ＮＳ−３（同−３）、ＮＳ−４（同−４）、ＮＳ
−５（同−５）からなると考えられる。
に、５′末端より３４０個のヌクレオドよりなる５′非
コード領域を有し、それに続いて構造蛋白質をコードす
る領域が続き、さらに非構造蛋白質をコードする領域を
有する。他方、３′末端側は、非構造蛋白質をコードす
る領域に続いて１０８塩基のＵ−ストレッチを含む１５
０塩基の非コード領域を有する。５′末端側から３４１
番目のアデニンより始まるコード領域は９０９９塩基の
一本の長いオープンリーディングフレームよりなり、こ
れが３０３３アミノ酸をコードしていることが明らかと
なった。ＨＣＶ、すなわちＣ型肝炎ウイルスはその遺伝
子構造からフラビウイルスに近縁であると考えられてい
るが、本発明のＮＡＮＢ肝炎ウイルス遺伝子のコード領
域も図１に示す如く、Ｃ（コア）、Ｅ（エンベロー
プ）、ＮＳ−１（非構造蛋白−１）、ＮＳ−２（同−
２）、ＮＳ−３（同−３）、ＮＳ−４（同−４）、ＮＳ
−５（同−５）からなると考えられる。
【０００９】本発明のＨＣ−Ｊ６ゲノムは、ヨーロッパ
特許公開第３８８，２３２号（カイロン社）に示された
ＨＣＶゲノムと比較すると、ヌクレオチド配列について
全領域では６７．９％の相同性を、またアミノ酸配列に
ついては全領域で７２．３％の相同性を示すにすぎな
い。領域ごとに個別に相同性を調べると、５′末側非コ
ード領域において塩基配列で９４．４％、コア領域にお
いてアミノ酸配列で９０．１％であり、これらの領域で
は比較的高い相同性を示している。他方、エンベロープ
部分より下流の領域ではＥ、ＮＳ−１、ＮＳ−２、ＮＳ
−３、ＮＳ−４、ＮＳ−５のそれぞれのアミノ酸配列で
６０．４％。７１．１％、５７．８％、８１．１％、７
３．１％、６９．９％、３′末側非コード領域の塩基配
列で２９．６％といずれも低い相同性を示すにすぎず、
結局、ＨＣ−Ｊ６株がカイロン社の発見したＨＣＶ株と
大きく異なることが明らかとなった。
特許公開第３８８，２３２号（カイロン社）に示された
ＨＣＶゲノムと比較すると、ヌクレオチド配列について
全領域では６７．９％の相同性を、またアミノ酸配列に
ついては全領域で７２．３％の相同性を示すにすぎな
い。領域ごとに個別に相同性を調べると、５′末側非コ
ード領域において塩基配列で９４．４％、コア領域にお
いてアミノ酸配列で９０．１％であり、これらの領域で
は比較的高い相同性を示している。他方、エンベロープ
部分より下流の領域ではＥ、ＮＳ−１、ＮＳ−２、ＮＳ
−３、ＮＳ−４、ＮＳ−５のそれぞれのアミノ酸配列で
６０．４％。７１．１％、５７．８％、８１．１％、７
３．１％、６９．９％、３′末側非コード領域の塩基配
列で２９．６％といずれも低い相同性を示すにすぎず、
結局、ＨＣ−Ｊ６株がカイロン社の発見したＨＣＶ株と
大きく異なることが明らかとなった。
【００１０】本発明者ら既に公表した（Ｊａｐａｎ．
Ｊ．ＥＸｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．６０，３，１６７−１
７７）ＨＣ−Ｊ１（アメリカ型）、ＨＣ−Ｊ４（日本
型）株とのアミノ酸配列の比較では、コア領域では９０
％以上の相同性を示すのに対して、エンベロープ領域で
はそれぞれ６０．９％、５３．１％と低い相同性を示す
にすぎなかった。本発明により、ＨＣ−Ｊ６株は、ＨＣ
−Ｊ１株、ＨＣ−Ｊ４株のいずれとも異なる別箇のタイ
プのウイルスであることが明らかとなった。
Ｊ．ＥＸｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．６０，３，１６７−１
７７）ＨＣ−Ｊ１（アメリカ型）、ＨＣ−Ｊ４（日本
型）株とのアミノ酸配列の比較では、コア領域では９０
％以上の相同性を示すのに対して、エンベロープ領域で
はそれぞれ６０．９％、５３．１％と低い相同性を示す
にすぎなかった。本発明により、ＨＣ−Ｊ６株は、ＨＣ
−Ｊ１株、ＨＣ−Ｊ４株のいずれとも異なる別箇のタイ
プのウイルスであることが明らかとなった。
【００１１】
【作用】本発明の遺伝子、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ
クローンは、その全部または一部を大腸菌、枯草菌等の
宿主細胞に組み込んでポリペプタイドを発現させること
ができる。本発明のポリペプタイドは、ＮＡＮＢ型肝炎
の検出系として用いることができ、さらに、これに対す
るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造
することができる。本発明のポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎検出系として用
いることができる。
クローンは、その全部または一部を大腸菌、枯草菌等の
宿主細胞に組み込んでポリペプタイドを発現させること
ができる。本発明のポリペプタイドは、ＮＡＮＢ型肝炎
の検出系として用いることができ、さらに、これに対す
るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造
することができる。本発明のポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎検出系として用
いることができる。
【００１２】
【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００１３】実施例１ （１）ＲＮＡ抽出 日本人供血者の血漿から得た、ＨＣＶ抗体陽性（オーソ
・ダイアグノスティック・システムズ社製、オーソＨＣ
ＶＡｂＥＬＩＳＡキット）と判定された検体ＨＣ−Ｊ
１、ＨＣ−Ｊ６およびＮＡＮＢ肝炎の感染を確認したチ
ンパンジーから得たＨＣＶ抗体（−）の検体ＨＣ−Ｊ４
より、次のようにしてＲＮＡを抽出した。血漿にトリス
塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、６８×１
０３ｒｐｍで１時間遠心した。得られたペレットに２０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／
ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１ｍｇ
／ｍｌのプロテナーゼＫを含むトリス塩酸緩衝液（５０
ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、６０℃で１時間加温し、エ
タノール沈澱を行い、ＲＮＡを得た。
・ダイアグノスティック・システムズ社製、オーソＨＣ
ＶＡｂＥＬＩＳＡキット）と判定された検体ＨＣ−Ｊ
１、ＨＣ−Ｊ６およびＮＡＮＢ肝炎の感染を確認したチ
ンパンジーから得たＨＣＶ抗体（−）の検体ＨＣ−Ｊ４
より、次のようにしてＲＮＡを抽出した。血漿にトリス
塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、６８×１
０３ｒｐｍで１時間遠心した。得られたペレットに２０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／
ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１ｍｇ
／ｍｌのプロテナーゼＫを含むトリス塩酸緩衝液（５０
ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、６０℃で１時間加温し、エ
タノール沈澱を行い、ＲＮＡを得た。
【００１４】（２）ＨＣ−Ｊ１ｃＤＮＡ合成 ＨＣ−Ｊ１血漿より抽出したＲＮＡを７０℃で１分間加
温し、これを鋳型として１０ユニットの逆転写酵素（ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍＰｌｕｓ、
アマシャム社）およびオリゴヌクレオチドプライマー
（２０−ｍｅｒ）２０ｐｍｏｌを加えて、４２℃、１５
時間反応させてｃＤＮＡを得た。プライマーとしては、
ヨーロッパ特許出願公開３１８，２１６号に示されたＨ
ＣＶ塩基配列を参照して合成した＃８（５′−ＧＡＴＧ
ＣＴＴＧＣＧＧＡＡＣＧＣＡＡＴＣＡ−３′）を用い
た。
温し、これを鋳型として１０ユニットの逆転写酵素（ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍＰｌｕｓ、
アマシャム社）およびオリゴヌクレオチドプライマー
（２０−ｍｅｒ）２０ｐｍｏｌを加えて、４２℃、１５
時間反応させてｃＤＮＡを得た。プライマーとしては、
ヨーロッパ特許出願公開３１８，２１６号に示されたＨ
ＣＶ塩基配列を参照して合成した＃８（５′−ＧＡＴＧ
ＣＴＴＧＣＧＧＡＡＣＧＣＡＡＴＣＡ−３′）を用い
た。
【００１５】（３）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅 Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（パーキンエ
ルマー・シータス社）を用いたＳａｉｋｉらの方法（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７−４９１，１９８８）に
より、ＤＮＡサーマイクラー（パーキンエルマー・シー
タス社）にて３５サイクルのｃＤＮＡ増幅を行った。
（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅 Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（パーキンエ
ルマー・シータス社）を用いたＳａｉｋｉらの方法（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７−４９１，１９８８）に
より、ＤＮＡサーマイクラー（パーキンエルマー・シー
タス社）にて３５サイクルのｃＤＮＡ増幅を行った。
【００１６】（４）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４の５′末端側塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーを用いたＨＣ−Ｊ１ゲノムの５′
末端側の塩基配列解析は図２（ＨＣ−Ｊ１）図３（ＨＣ
−Ｊ４）に示すように、ｃＤＮＡをバクテリオファージ
λｇｔ１０に挿入して得たクローンの解析及びｃＤＮＡ
をＰＣＲにて増幅して得られたクローンの解析結果の両
者を併せて決定した。図２および図３はＮＡＮＢ肝炎ウ
イルスゲノムの５′末端を制限酵素切断部位とともに示
し、使用するプライマーの位置も示す。図中、実線はバ
クテリオファージλｇｔ１０のライブラリーによるクロ
ーンで塩基配列を決定した範囲を、点線はＰＣＲによる
クローンで塩基配列を決定した範囲を示す。ＨＣ−Ｊ１
のｎｔ４５４〜２１０９の１６５６塩基はプライマー＃
８から得たｃＤＮＡをλｇｔ１０ファージベクター（ア
マシャム社）に挿入して得られたクローンφ４１により
決定した。つぎにこのシークエンスをもとに合成した、
ｎｔ８２４〜８４３の新しいプライマー＃２５（５′−
ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧ−３′）を
用いて、ＨＣ−Ｊ４のｃＤＮＡライブラリーから順次４
つのｃＤＮＡクローンφ６０、φ６１、φ６６、φ７５
を得て、これらのコンセンサス シークエンスから上流
のｎｔ１８〜８４３の塩基配列を決めた。
ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４の５′末端側塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーを用いたＨＣ−Ｊ１ゲノムの５′
末端側の塩基配列解析は図２（ＨＣ−Ｊ１）図３（ＨＣ
−Ｊ４）に示すように、ｃＤＮＡをバクテリオファージ
λｇｔ１０に挿入して得たクローンの解析及びｃＤＮＡ
をＰＣＲにて増幅して得られたクローンの解析結果の両
者を併せて決定した。図２および図３はＮＡＮＢ肝炎ウ
イルスゲノムの５′末端を制限酵素切断部位とともに示
し、使用するプライマーの位置も示す。図中、実線はバ
クテリオファージλｇｔ１０のライブラリーによるクロ
ーンで塩基配列を決定した範囲を、点線はＰＣＲによる
クローンで塩基配列を決定した範囲を示す。ＨＣ−Ｊ１
のｎｔ４５４〜２１０９の１６５６塩基はプライマー＃
８から得たｃＤＮＡをλｇｔ１０ファージベクター（ア
マシャム社）に挿入して得られたクローンφ４１により
決定した。つぎにこのシークエンスをもとに合成した、
ｎｔ８２４〜８４３の新しいプライマー＃２５（５′−
ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧ−３′）を
用いて、ＨＣ−Ｊ４のｃＤＮＡライブラリーから順次４
つのｃＤＮＡクローンφ６０、φ６１、φ６６、φ７５
を得て、これらのコンセンサス シークエンスから上流
のｎｔ１８〜８４３の塩基配列を決めた。
【００１７】（５）ＨＣ−Ｊ６、５′末端側塩基配列の
決定 ＨＣ−Ｊ６ゲノムの５′末端側の塩基配列は図４に示す
ように、ｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅して得られたクロー
ンの解析結果により決定した。ＨＣ−Ｊ６検体につい
て、抽出したＲＮＡから前記（２）の方法に従って、ｃ
ＤＮＡを抽出し、そのシークエンスを決定した。ｎｔ２
４〜２５５１はＨＣ−Ｊ４の塩基配列を基にしたプライ
マーの組み合わせによるＰＣＲにて得られた各クローン
のコンセンサス シークエンスから決められた。 ｎｔ２４〜８２６ ＃３２（５′−ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣ−３′） ＃１２２（５′−ＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＡＴＴ−３′） クローン；Ｃ９３９７、Ｃ９３８８、Ｃ９７６４ ｎｔ７３２〜１９０７ ＃５０（５′−ＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴ−３′） ＃１２８（５′−ＴＣＧＧＴＣＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣ−３′） クローン；Ｃ９３１６、Ｃ９７５２、Ｃ９７５３ ｎｔ１８６７〜２５９１ ＃１４９（５′−ＴＣＴＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＡ−３′） ＃１４６（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡ−３′） クローン；Ｃ１１６２１、Ｃ１１６２４、Ｃ１１６５５ さらに上流の５′末端側を特定するため、ｎｔ２４６〜
２６５のアンチセンスプライマー＃３６（５′−ＡＡＣ
ＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−３′）を用いて
ｃＤＮＡを合成したのち、ターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフェラーゼによりｃＤＮＡの５′末端に
ｄＡ付加を行い、２段階のｏｎｅ−ｓｉｄｅｄＰＣＲ増
幅を行った。すなわち、１回目はオリゴｄＴプライマー
（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１８８〜２０７のアンチセンス
プライマー＃４８（５′−ＧＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡ
ＡＧＧＡＣＣＣ−３′）を用いて３５サイクルのＰＣＲ
増幅を行い、２回目はそのＰＣＲ産物を鋳型にしてオリ
ゴｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１４０〜１６
０のアンチセンスプライマー＃１０９（２１−ｍｅｒ；
５′−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴ−
３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行った。得られ
たＰＣＲ産物をＭ１３ファージベクターにサブクローニ
ングした。完全長の５′末端配列を有すると考えられる
１３個の独立したクローン、Ｃ９５７７、Ｃ９５７９、
Ｃ９５８１、Ｃ９５８４、Ｃ９５８７、Ｃ９５９０、Ｃ
９５９１、Ｃ９５９５、Ｃ９６０６、Ｃ９６０９、Ｃ９
６１５、Ｃ９６１６、Ｃ９６１９を得、それらのコンセ
ンサス シークエンスからｎｔ１〜２３の塩基配列を決
めた。 （６）ＨＣ−Ｊ６、中央領域塩基配列の決定 ＨＣ−Ｊ６血漿１００ｍｌを原料に、（２）の方法に準
じてλｇｔ１０バクテリオファージにｃＤＮＡライブラ
リーを構築した。プライマーとして、ヨーロッパ特許出
公開３１８，２１６号に示されたＨＣＶ塩基配列を参照
して合成したポリヌクレオチド＃１６２および＃８１を
用い、クローンの選択はプラークハイブリダイゼーショ
ンにより行った。図１に示すように、得られた４個のｃ
ＤＮＡクローンφ２（ｎｔ６９９６〜８７００）、φ６
（ｎｔ６４８５〜８７００）、φ８（ｎｔ６００８〜８
７００）、φ８１（ｎｔ２１９９〜６１６８）を解析
し、得られたコンセンサス シークエンスからｎｔ２５
５２〜８７００の塩基配列を決定した。このうち、クロ
ーンφ８１、φ８はそれぞれ配列番号３、４の塩基配列
を有する。
決定 ＨＣ−Ｊ６ゲノムの５′末端側の塩基配列は図４に示す
ように、ｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅して得られたクロー
ンの解析結果により決定した。ＨＣ−Ｊ６検体につい
て、抽出したＲＮＡから前記（２）の方法に従って、ｃ
ＤＮＡを抽出し、そのシークエンスを決定した。ｎｔ２
４〜２５５１はＨＣ−Ｊ４の塩基配列を基にしたプライ
マーの組み合わせによるＰＣＲにて得られた各クローン
のコンセンサス シークエンスから決められた。 ｎｔ２４〜８２６ ＃３２（５′−ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣ−３′） ＃１２２（５′−ＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＡＴＴ−３′） クローン；Ｃ９３９７、Ｃ９３８８、Ｃ９７６４ ｎｔ７３２〜１９０７ ＃５０（５′−ＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴ−３′） ＃１２８（５′−ＴＣＧＧＴＣＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣ−３′） クローン；Ｃ９３１６、Ｃ９７５２、Ｃ９７５３ ｎｔ１８６７〜２５９１ ＃１４９（５′−ＴＣＴＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＡ−３′） ＃１４６（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡ−３′） クローン；Ｃ１１６２１、Ｃ１１６２４、Ｃ１１６５５ さらに上流の５′末端側を特定するため、ｎｔ２４６〜
２６５のアンチセンスプライマー＃３６（５′−ＡＡＣ
ＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−３′）を用いて
ｃＤＮＡを合成したのち、ターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフェラーゼによりｃＤＮＡの５′末端に
ｄＡ付加を行い、２段階のｏｎｅ−ｓｉｄｅｄＰＣＲ増
幅を行った。すなわち、１回目はオリゴｄＴプライマー
（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１８８〜２０７のアンチセンス
プライマー＃４８（５′−ＧＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡ
ＡＧＧＡＣＣＣ−３′）を用いて３５サイクルのＰＣＲ
増幅を行い、２回目はそのＰＣＲ産物を鋳型にしてオリ
ゴｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１４０〜１６
０のアンチセンスプライマー＃１０９（２１−ｍｅｒ；
５′−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴ−
３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行った。得られ
たＰＣＲ産物をＭ１３ファージベクターにサブクローニ
ングした。完全長の５′末端配列を有すると考えられる
１３個の独立したクローン、Ｃ９５７７、Ｃ９５７９、
Ｃ９５８１、Ｃ９５８４、Ｃ９５８７、Ｃ９５９０、Ｃ
９５９１、Ｃ９５９５、Ｃ９６０６、Ｃ９６０９、Ｃ９
６１５、Ｃ９６１６、Ｃ９６１９を得、それらのコンセ
ンサス シークエンスからｎｔ１〜２３の塩基配列を決
めた。 （６）ＨＣ−Ｊ６、中央領域塩基配列の決定 ＨＣ−Ｊ６血漿１００ｍｌを原料に、（２）の方法に準
じてλｇｔ１０バクテリオファージにｃＤＮＡライブラ
リーを構築した。プライマーとして、ヨーロッパ特許出
公開３１８，２１６号に示されたＨＣＶ塩基配列を参照
して合成したポリヌクレオチド＃１６２および＃８１を
用い、クローンの選択はプラークハイブリダイゼーショ
ンにより行った。図１に示すように、得られた４個のｃ
ＤＮＡクローンφ２（ｎｔ６９９６〜８７００）、φ６
（ｎｔ６４８５〜８７００）、φ８（ｎｔ６００８〜８
７００）、φ８１（ｎｔ２１９９〜６１６８）を解析
し、得られたコンセンサス シークエンスからｎｔ２５
５２〜８７００の塩基配列を決定した。このうち、クロ
ーンφ８１、φ８はそれぞれ配列番号３、４の塩基配列
を有する。
【００１８】（７）ＨＣ−Ｊ６ゲノムの３′末端側の塩
基配列は図５に示すように、ＰＣＲにて増幅して得られ
たクローンの解析結果より決定した。ＨＣ−Ｊ６のｎｔ
８７０１〜９２４１の配列については検体をプライマー
＃８０（５′−ＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣ
ＴＣ−３′）および＃６０（５′−ＧＴＴＣＴＴＡＣＴ
ＧＣＣＣＡＧＴＴＧＡＡ−３′）を用いたＰＣＲにか
け、得られた９３８塩基のクローンＣ９７６０、Ｃ９２
３４、Ｃ９７６１の塩基配列より得られるコンセンサス
シークエンスから決定した。ｎｔ９２４２より下流の
３′末端側塩基配列は以下の方法の従って決定した。す
なわち、各検体より（１）記載の方法に従ってＲＮＡを
抽出し、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてＲＮＡの３′
末端にポリ（Ａ）を付加し、オリゴ（ｄＴ）２０をプラ
イマーとしてｃＤＮＡ合成を行い、得られたｃＤＮＡを
テンプレートとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは第１段階
としてセンスプライマーとして＃９７（５ −ＡＧＴＣ
ＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＴＣＡＴＣＴ−３′）を、アンチ
センスプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）２０を用いて行
った。次に、得られたｃＤＮＡを第２段階ＰＣＲとして
第１段階より下流に相当するセンスプライマー＃９０
（５′−ＧＣＣＧＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＴ−
３′）を、アンチセンスプライマーとしてオリゴ（ｄ
Ｔ）２０を用いて行った。２段階のＰＣＲで得られた増
幅産物にＴ４ＤＮＡポリラーゼを作用させ両端を平滑に
した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにて５′末端を
リン酸化し、Ｍ１３ｍｐ１９ファージベクターのＨｉｎ
ｃＩＩ部位にサブクローニングして塩基配列を決定し
た。こうして得られた１９個のクローン、Ｃ１０３１
１、Ｃ１０３１３、Ｃ１０３１４、Ｃ１０３２０、Ｃ１
０３２２、Ｃ１０３２３、Ｃ１０３２６、Ｃ１０３２
８、Ｃ１０３３０、Ｃ１０３３３、Ｃ１０３３４、Ｃ１
０３３６、Ｃ１０３３７、Ｃ１０３４５、Ｃ１０３４
６、Ｃ１０３４７、Ｃ１０３４９、Ｃ１０３５０、Ｃ１
０３５７から得られるコンセンサス シークエンスより
３′末端側の塩基配列を決定した。以上の解析結果より
ＨＣ−Ｊ６ゲノムに相当するｃＤＮＡ塩基配列を配列番
号２記載のように決定し、またゲノムの完全長ＲＮＡ塩
基配列を配列番号１記載のように決定した。
基配列は図５に示すように、ＰＣＲにて増幅して得られ
たクローンの解析結果より決定した。ＨＣ−Ｊ６のｎｔ
８７０１〜９２４１の配列については検体をプライマー
＃８０（５′−ＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣ
ＴＣ−３′）および＃６０（５′−ＧＴＴＣＴＴＡＣＴ
ＧＣＣＣＡＧＴＴＧＡＡ−３′）を用いたＰＣＲにか
け、得られた９３８塩基のクローンＣ９７６０、Ｃ９２
３４、Ｃ９７６１の塩基配列より得られるコンセンサス
シークエンスから決定した。ｎｔ９２４２より下流の
３′末端側塩基配列は以下の方法の従って決定した。す
なわち、各検体より（１）記載の方法に従ってＲＮＡを
抽出し、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてＲＮＡの３′
末端にポリ（Ａ）を付加し、オリゴ（ｄＴ）２０をプラ
イマーとしてｃＤＮＡ合成を行い、得られたｃＤＮＡを
テンプレートとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは第１段階
としてセンスプライマーとして＃９７（５ −ＡＧＴＣ
ＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＴＣＡＴＣＴ−３′）を、アンチ
センスプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）２０を用いて行
った。次に、得られたｃＤＮＡを第２段階ＰＣＲとして
第１段階より下流に相当するセンスプライマー＃９０
（５′−ＧＣＣＧＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＴ−
３′）を、アンチセンスプライマーとしてオリゴ（ｄ
Ｔ）２０を用いて行った。２段階のＰＣＲで得られた増
幅産物にＴ４ＤＮＡポリラーゼを作用させ両端を平滑に
した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにて５′末端を
リン酸化し、Ｍ１３ｍｐ１９ファージベクターのＨｉｎ
ｃＩＩ部位にサブクローニングして塩基配列を決定し
た。こうして得られた１９個のクローン、Ｃ１０３１
１、Ｃ１０３１３、Ｃ１０３１４、Ｃ１０３２０、Ｃ１
０３２２、Ｃ１０３２３、Ｃ１０３２６、Ｃ１０３２
８、Ｃ１０３３０、Ｃ１０３３３、Ｃ１０３３４、Ｃ１
０３３６、Ｃ１０３３７、Ｃ１０３４５、Ｃ１０３４
６、Ｃ１０３４７、Ｃ１０３４９、Ｃ１０３５０、Ｃ１
０３５７から得られるコンセンサス シークエンスより
３′末端側の塩基配列を決定した。以上の解析結果より
ＨＣ−Ｊ６ゲノムに相当するｃＤＮＡ塩基配列を配列番
号２記載のように決定し、またゲノムの完全長ＲＮＡ塩
基配列を配列番号１記載のように決定した。
【００１９】（８）ＨＣ−Ｊ６、アミノ酸配列の決定 ＨＣ−Ｊ６ゲノムのＲＮＡ塩基配列をもとに、開始コド
ンＡＴＧより始まるコード領域のアミノ酸配列を配列番
号５のように決定した。その結果、ＨＣ−Ｊ６は３０３
３アミノ酸残基からなるポリペプタイド前駆体をコード
する１本の長いオープンリーディングフレームよりなる
ことが明らかになった。
ンＡＴＧより始まるコード領域のアミノ酸配列を配列番
号５のように決定した。その結果、ＨＣ−Ｊ６は３０３
３アミノ酸残基からなるポリペプタイド前駆体をコード
する１本の長いオープンリーディングフレームよりなる
ことが明らかになった。
【００２０】
【発明の効果】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＨＣ
−Ｊ６を単離し、そのウイルス遺伝子の全塩基配列を解
明したことにもとづく発明であって、非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルスを高感度に検出することができ、また、これに必
要なポリペプタイド、ポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体を提供することができる。
−Ｊ６を単離し、そのウイルス遺伝子の全塩基配列を解
明したことにもとづく発明であって、非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルスを高感度に検出することができ、また、これに必
要なポリペプタイド、ポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体を提供することができる。
【図１】は、本発明のＮＡＮＢ肝炎ウイルス遺伝子のコ
ード領域の構造。
ード領域の構造。
【図２】〜
【図４】は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスの５′末端側塩基配
列決定の方法を示す図。
列決定の方法を示す図。
【図２】は、ＨＣ−Ｊ１株。
【図３】は、ＨＣ−Ｊ４株。
【図４】は、ＨＣ−Ｊ６株。
【図６】は、ＨＣ−Ｊ６株ゲノムの３′末端側塩基配列
の決定方法。
の決定方法。
【図１】において、Ｃはコア、Ｅはエンベロープ、ＮＳ
−１は非構造蛋白質−１、ＮＳ−２は同−２、ＮＳ−３
は同−３、ＮＳ−４は同−４、ＮＳ−５は同−５。
−１は非構造蛋白質−１、ＮＳ−２は同−２、ＮＳ−３
は同−３、ＮＳ−４は同−４、ＮＳ−５は同−５。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月１１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイル
ス（以下「ＮＡＮＢ肝炎ウイルス」と略記する）遺伝
子、これに関連するポリヌクレオチド、ポリペプタイ
ド、ならびに関連抗原、抗体検出系に関する。
ス（以下「ＮＡＮＢ肝炎ウイルス」と略記する）遺伝
子、これに関連するポリヌクレオチド、ポリペプタイ
ド、ならびに関連抗原、抗体検出系に関する。
【０００２】
【従来の技術】ウイルスに由来する肝炎には、既に病原
体が解明されその診断法や予防法が確立したものとして
Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎がある。これ以外は一括して、非Ａ
非Ｂ型肝炎（以下「ＮＡＮＢ肝炎」という）と呼ばれて
きた。日本における輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎の検出法が
輸血血液のスクリーニングに導入された後は格段に減少
したが、なお、年間推定２８万例が、ＮＡＮＢ肝炎ウイ
ルスにより発症していると考えられてきた。
体が解明されその診断法や予防法が確立したものとして
Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎がある。これ以外は一括して、非Ａ
非Ｂ型肝炎（以下「ＮＡＮＢ肝炎」という）と呼ばれて
きた。日本における輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎の検出法が
輸血血液のスクリーニングに導入された後は格段に減少
したが、なお、年間推定２８万例が、ＮＡＮＢ肝炎ウイ
ルスにより発症していると考えられてきた。
【０００３】近年、ＮＡＮＢ肝炎ウイルス肝炎は、タイ
プ別にＣ型、Ｄ型、Ｅ型と命名され、その病原体につい
ての研究が進展し、撲滅に向けての努力が世界的に進め
られるようになった。輸血後肝炎に関して、１９８８年
アメリカのカイロン社がＣ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣ
Ｖ」と略記する）のＲＮＡウイルスゲノムのクローン化
に成功したと発表し、これを基にＨＣＶ抗体の測定系を
開発した。現在、ＨＣＶ抗体測定系は、輸血血液のスク
リーニングや肝疾患患者の診断に、日本を始めとして各
国で用いられている。このＨＣＶ抗体の測定系はＮＡＮ
Ｂ肝炎との関連性が確かに一部では認められる。しか
し、キャリアや慢性肝炎の捕捉率は約７０％にすぎず、
また急性期の抗体検出ができない等重大な問題点が残さ
れている。したがって、カイロン社の前記開発によって
もＮＡＮＢ肝炎への対処は依然として解決されていな
い。ＮＡＮＢ肝炎の経過は不良であり、水平感染によっ
ても持続感染化（キャリア化）し、慢性肝炎に進展する
ことが確認されている。また、肝硬変、肝がんへ進展す
るケースも多いと予想され、一日も早いウイルス本体の
全貌解明が望まれていた。
プ別にＣ型、Ｄ型、Ｅ型と命名され、その病原体につい
ての研究が進展し、撲滅に向けての努力が世界的に進め
られるようになった。輸血後肝炎に関して、１９８８年
アメリカのカイロン社がＣ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣ
Ｖ」と略記する）のＲＮＡウイルスゲノムのクローン化
に成功したと発表し、これを基にＨＣＶ抗体の測定系を
開発した。現在、ＨＣＶ抗体測定系は、輸血血液のスク
リーニングや肝疾患患者の診断に、日本を始めとして各
国で用いられている。このＨＣＶ抗体の測定系はＮＡＮ
Ｂ肝炎との関連性が確かに一部では認められる。しか
し、キャリアや慢性肝炎の捕捉率は約７０％にすぎず、
また急性期の抗体検出ができない等重大な問題点が残さ
れている。したがって、カイロン社の前記開発によって
もＮＡＮＢ肝炎への対処は依然として解決されていな
い。ＮＡＮＢ肝炎の経過は不良であり、水平感染によっ
ても持続感染化（キャリア化）し、慢性肝炎に進展する
ことが確認されている。また、肝硬変、肝がんへ進展す
るケースも多いと予想され、一日も早いウイルス本体の
全貌解明が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記カイロン社のＨＣ
Ｖ抗体検出キットでは診断できないＮＡＮＢ肝炎が多数
存在することから、日本におけるＮＡＮＢ肝炎ウイルス
ゲノムがカイロン社の解明したＨＣＶゲノムとは必ずし
も一致せず、サブタイプの違いがあると推定された。し
たがって、特異性、感度においてさらに優れたＮＡＮＢ
肝炎診断薬、および有効なワクチンを開発するために
は、サブタイプ別にＮＡＮＢ肝炎ウイルスの遺伝子レベ
ル、アミノ酸レベルでの解析を完成することが待望され
ていた。本発明の目的は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスゲノム
の塩基配列を、全体にわたって完全に解明し、これに基
づいてアミノ酸レベルでの解析を行うこと、ならびにこ
れを用いてＮＡＮＢ肝炎ウイルス関連抗原、抗体の検出
系の確立を図ることである。
Ｖ抗体検出キットでは診断できないＮＡＮＢ肝炎が多数
存在することから、日本におけるＮＡＮＢ肝炎ウイルス
ゲノムがカイロン社の解明したＨＣＶゲノムとは必ずし
も一致せず、サブタイプの違いがあると推定された。し
たがって、特異性、感度においてさらに優れたＮＡＮＢ
肝炎診断薬、および有効なワクチンを開発するために
は、サブタイプ別にＮＡＮＢ肝炎ウイルスの遺伝子レベ
ル、アミノ酸レベルでの解析を完成することが待望され
ていた。本発明の目的は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスゲノム
の塩基配列を、全体にわたって完全に解明し、これに基
づいてアミノ酸レベルでの解析を行うこと、ならびにこ
れを用いてＮＡＮＢ肝炎ウイルス関連抗原、抗体の検出
系の確立を図ることである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＮＡＮＢ
肝炎ウイルスの治療、予防、検査に不可欠なポリヌクレ
オチドを見出すために鋭意研究をつづけ、その結果、ヒ
トおよびチンパンジーキャリアの血清よりＮＡＮＢ肝炎
ウイルスのＲＮＡを単離し、非コード領域を含む遺伝子
領域全体をカバーするｃＤＮＡをクローン化してその全
部の塩基配列を決定し、さらにアミノ酸配列を決定し
た。その結果本発明者らは、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスであ
るＨＣ−Ｊ６ゲノムの遺伝子全体の塩基配列を完全に解
明することに成功した。かかる遺伝子及びアミノ酸レベ
ルでの研究によって本発明は完成された。本発明のＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルス（ＨＣ−Ｊ６ゲノム）は、カイロン社
のＨＣＶゲノムとは別異のものである。
肝炎ウイルスの治療、予防、検査に不可欠なポリヌクレ
オチドを見出すために鋭意研究をつづけ、その結果、ヒ
トおよびチンパンジーキャリアの血清よりＮＡＮＢ肝炎
ウイルスのＲＮＡを単離し、非コード領域を含む遺伝子
領域全体をカバーするｃＤＮＡをクローン化してその全
部の塩基配列を決定し、さらにアミノ酸配列を決定し
た。その結果本発明者らは、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスであ
るＨＣ−Ｊ６ゲノムの遺伝子全体の塩基配列を完全に解
明することに成功した。かかる遺伝子及びアミノ酸レベ
ルでの研究によって本発明は完成された。本発明のＮＡ
ＮＢ肝炎ウイルス（ＨＣ−Ｊ６ゲノム）は、カイロン社
のＨＣＶゲノムとは別異のものである。
【０００６】本発明は、配列番号１記載の塩基配列を有
する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発明であり、ＲＮ
Ａ５′末端より３４０箇のヌクレオチドからなる非コー
ド領域、これに続く構造蛋白質および非構造蛋白質をコ
ードする領域を含む９０９９箇のヌクレオチド、ならび
に３′末端１０８箇のＵストッチを含む１５０箇のヌク
レオチドからなる、配列番号１記載のウイルス遺伝子の
発明であり、これらと、部分的置換を有する非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス変異株遺伝子の発明である。また、配列番
号２記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドＮ−９５
８９、配列番号３記載の塩基配列を有するｃＤＮＡクロ
ーンＪ６−φ８１、配列番号４記載の塩基配列を有する
ｃＤＮＡクローンＪ６−φ８、これら各ヌクレオチドと
部分的置換を有する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス変異株ヌク
レオチドの発明である。さらに前記遺伝子またはポリヌ
クレオチドにコードされるポリペプタイド、配列番号５
記載のアミノ酸配列を有するポリペプタイドＰ−３０３
３、前記遺伝子、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡクローン
の全部または一部を宿主細胞に組み込み発現させて得た
ポリペプタイド、前記各ポリペプタイドに対するポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体の発明である。
さらに、前記各ポリペプタイドを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎
検出系、前記各抗体を用いた非Ａ非Ｂ型肝炎検出系の発
明である。
する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発明であり、ＲＮ
Ａ５′末端より３４０箇のヌクレオチドからなる非コー
ド領域、これに続く構造蛋白質および非構造蛋白質をコ
ードする領域を含む９０９９箇のヌクレオチド、ならび
に３′末端１０８箇のＵストッチを含む１５０箇のヌク
レオチドからなる、配列番号１記載のウイルス遺伝子の
発明であり、これらと、部分的置換を有する非Ａ非Ｂ型
肝炎ウイルス変異株遺伝子の発明である。また、配列番
号２記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドＮ−９５
８９、配列番号３記載の塩基配列を有するｃＤＮＡクロ
ーンＪ６−φ８１、配列番号４記載の塩基配列を有する
ｃＤＮＡクローンＪ６−φ８、これら各ヌクレオチドと
部分的置換を有する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス変異株ヌク
レオチドの発明である。さらに前記遺伝子またはポリヌ
クレオチドにコードされるポリペプタイド、配列番号５
記載のアミノ酸配列を有するポリペプタイドＰ−３０３
３、前記遺伝子、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡクローン
の全部または一部を宿主細胞に組み込み発現させて得た
ポリペプタイド、前記各ポリペプタイドに対するポリク
ローナル抗体またはモノクローナル抗体の発明である。
さらに、前記各ポリペプタイドを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎
検出系、前記各抗体を用いた非Ａ非Ｂ型肝炎検出系の発
明である。
【０００７】本発明のＮＡＮＢ肝炎ウイルス遺伝子は次
のようにして得て、その塩基配列を決定した。ヒトおよ
びチンパンジー血漿より得た検体、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−
Ｊ４、ＨＣ−Ｊ６を用いて本研究を進めた。ＨＣ−Ｊ
１、ＨＣ−Ｊ６は日本人供血者由来で、いずれもＨＣＶ
抗体陽性と判定された検体より得た。ＨＣ−Ｊ４はＮＡ
ＮＢ肝炎の感染性を確認したチンパンジーから得た検体
に由来するが、しかしこれはカイロン社の前記のＨＣＶ
抗体では（−）であった。この３種の血漿検体よりＲＮ
Ａを調整し、これらによってＲＮＡの塩基配列を調べ
た。このうちＲＮＡの５′末端側の約２５００、および
３′末側の約１１００の塩基配列については既に本年４
月２６日付特許出願（特願平３−１９１３７６号）なら
びに６月２０日付特許出願においてその一部を開示し
た。本発明者らは、さらに研究を進め、今回ＨＣ−Ｊ６
について、新たに非構造蛋白質をコードする領域のｃＤ
ＮＡクローンの構造も解明し、これによって、ＨＣ−Ｊ
６ゲノムの完全長ＲＮＡ９５８９塩基の配列の研究を完
成させ、本発明を完成させるに至った。
のようにして得て、その塩基配列を決定した。ヒトおよ
びチンパンジー血漿より得た検体、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−
Ｊ４、ＨＣ−Ｊ６を用いて本研究を進めた。ＨＣ−Ｊ
１、ＨＣ−Ｊ６は日本人供血者由来で、いずれもＨＣＶ
抗体陽性と判定された検体より得た。ＨＣ−Ｊ４はＮＡ
ＮＢ肝炎の感染性を確認したチンパンジーから得た検体
に由来するが、しかしこれはカイロン社の前記のＨＣＶ
抗体では（−）であった。この３種の血漿検体よりＲＮ
Ａを調整し、これらによってＲＮＡの塩基配列を調べ
た。このうちＲＮＡの５′末端側の約２５００、および
３′末側の約１１００の塩基配列については既に本年４
月２６日付特許出願（特願平３−１９１３７６号）なら
びに６月２０日付特許出願においてその一部を開示し
た。本発明者らは、さらに研究を進め、今回ＨＣ−Ｊ６
について、新たに非構造蛋白質をコードする領域のｃＤ
ＮＡクローンの構造も解明し、これによって、ＨＣ−Ｊ
６ゲノムの完全長ＲＮＡ９５８９塩基の配列の研究を完
成させ、本発明を完成させるに至った。
【０００８】ＨＣ−Ｊ６ゲノムは、実施例に示すよう
に、５′末端より３４０個のヌクレオドよりなる５′非
コード領域を有し、それに続いて構造蛋白質をコードす
る領域が続き、さらに非構造蛋白質をコードする領域を
有する。他方、３′末端側は、非構造蛋白質をコードす
る領域に続いて１０８塩基のＵ−ストレッチを含む１５
０塩基の非コード領域を有する。５′末端側から３４１
番目のアデニンより始まるコード領域は９０９９塩基の
一本の長いオープンリーディングフレームよりなり、こ
れが３０３３アミノ酸をコードしていることが明らかと
なった。ＨＣＶ、すなわちＣ型肝炎ウイルスはその遺伝
子構造からフラビウイルスに近縁であると考えられてい
るが、本発明のＮＡＮＢ肝炎ウイルス遺伝子のコード領
域も図１に示す如く、Ｃ（コア）、Ｅ（エンベロー
プ）、ＮＳ−１（非構造蛋白−１）、ＮＳ−２（同−
２）、ＮＳ−３（同−３）、ＮＳ−４（同−４）、ＮＳ
−５（同−５）からなると考えられる。
に、５′末端より３４０個のヌクレオドよりなる５′非
コード領域を有し、それに続いて構造蛋白質をコードす
る領域が続き、さらに非構造蛋白質をコードする領域を
有する。他方、３′末端側は、非構造蛋白質をコードす
る領域に続いて１０８塩基のＵ−ストレッチを含む１５
０塩基の非コード領域を有する。５′末端側から３４１
番目のアデニンより始まるコード領域は９０９９塩基の
一本の長いオープンリーディングフレームよりなり、こ
れが３０３３アミノ酸をコードしていることが明らかと
なった。ＨＣＶ、すなわちＣ型肝炎ウイルスはその遺伝
子構造からフラビウイルスに近縁であると考えられてい
るが、本発明のＮＡＮＢ肝炎ウイルス遺伝子のコード領
域も図１に示す如く、Ｃ（コア）、Ｅ（エンベロー
プ）、ＮＳ−１（非構造蛋白−１）、ＮＳ−２（同−
２）、ＮＳ−３（同−３）、ＮＳ−４（同−４）、ＮＳ
−５（同−５）からなると考えられる。
【０００９】本発明のＨＣ−Ｊ６ゲノムは、ヨーロッパ
特許公開第３８８，２３２号（カイロン社）に示された
ＨＣＶゲノムと比較すると、ヌクレオチド配列について
全領域では６７．９％の相同性を、またアミノ酸配列に
ついては全領域で７２．３％の相同性を示すにすぎな
い。領域ごとに個別に相同性を調べると、５′末側非コ
ード領域において塩基配列で９４．４％、コア領域にお
いてアミノ酸配列で９０．１％であり、これらの領域で
は比較的高い相同性を示している。他方、エンベロープ
部分より下流の領域ではＥ、ＮＳ−１、ＮＳ−２、ＮＳ
−３、ＮＳ−４、ＮＳ−５のそれぞれのアミノ酸配列で
６０．４％。７１．１％、５７．８％、８１．１％、７
３．１％、６９．９％、３′末側非コード領域の塩基配
列で２９．６％といずれも低い相同性を示すにすぎず、
結局、ＨＣ−Ｊ６株がカイロン社の発見したＨＣＶ株と
大きく異なることが明らかとなった。
特許公開第３８８，２３２号（カイロン社）に示された
ＨＣＶゲノムと比較すると、ヌクレオチド配列について
全領域では６７．９％の相同性を、またアミノ酸配列に
ついては全領域で７２．３％の相同性を示すにすぎな
い。領域ごとに個別に相同性を調べると、５′末側非コ
ード領域において塩基配列で９４．４％、コア領域にお
いてアミノ酸配列で９０．１％であり、これらの領域で
は比較的高い相同性を示している。他方、エンベロープ
部分より下流の領域ではＥ、ＮＳ−１、ＮＳ−２、ＮＳ
−３、ＮＳ−４、ＮＳ−５のそれぞれのアミノ酸配列で
６０．４％。７１．１％、５７．８％、８１．１％、７
３．１％、６９．９％、３′末側非コード領域の塩基配
列で２９．６％といずれも低い相同性を示すにすぎず、
結局、ＨＣ−Ｊ６株がカイロン社の発見したＨＣＶ株と
大きく異なることが明らかとなった。
【００１０】本発明者ら既に公表した（Ｊａｐａｎ．
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．６０，３，１６７−１
７）ＨＣ−Ｊ１（アメリカ型）、ＨＣ−Ｊ４（日本型）
株とのアミノ酸配列の比較では、コア領域では９０％以
上の相同性を示すのに対して、エンベロープ領域ではそ
れぞれ６０．９％、５３．１％と低い相同性を示すにす
ぎなかった。本発明により、ＨＣ−Ｊ６株は、ＨＣ−Ｊ
１株、ＨＣ−Ｊ４株のいずれとも異なる別箇のタイプの
ウイルスであることが明らかとなった。
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．６０，３，１６７−１
７）ＨＣ−Ｊ１（アメリカ型）、ＨＣ−Ｊ４（日本型）
株とのアミノ酸配列の比較では、コア領域では９０％以
上の相同性を示すのに対して、エンベロープ領域ではそ
れぞれ６０．９％、５３．１％と低い相同性を示すにす
ぎなかった。本発明により、ＨＣ−Ｊ６株は、ＨＣ−Ｊ
１株、ＨＣ−Ｊ４株のいずれとも異なる別箇のタイプの
ウイルスであることが明らかとなった。
【００１１】
【作用】本発明の遺伝子、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ
クローンは、その全部または一部を大腸菌、枯草菌等の
宿主細胞に組み込んでポリペプタイドを発現させること
ができる。本発明のポリペプタイドは、ＮＡＮＢ型肝炎
の検出系として用いることができ、さらに、これに対す
るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造
することができる。本発明のポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎検出系として用
いることができる。
クローンは、その全部または一部を大腸菌、枯草菌等の
宿主細胞に組み込んでポリペプタイドを発現させること
ができる。本発明のポリペプタイドは、ＮＡＮＢ型肝炎
の検出系として用いることができ、さらに、これに対す
るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造
することができる。本発明のポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎検出系として用
いることができる。
【００１２】
【実施例】以下、本発明の実施例について述べるが、も
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
とより本発明がこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００１３】実施例１ （１）ＲＮＡ抽出 日本人供血者の血漿から得た、ＨＣＶ抗体陽性（オーソ
・ダイアグノスティック・システムズ社製、オーソＨＣ
ＶＡｂＥＬＩＳＡキット）と判定された検体ＨＣ−Ｊ
１、ＨＣ−Ｊ６およびＮＡＮＢ肝炎の感染を確認したチ
ンパンジーから得たＨＣＶ抗体（−）の検体ＨＣ−Ｊ４
より、次のようにしてＲＮＡを抽出した。血漿にトリス
塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、６８×１
０３ｒｐｍで１時間遠心した。得られたペレットに２０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／
ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１ｍｇ
／ｍｌのプロテナーゼＫを含むトリス塩酸緩衝液（５０
ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、６０℃で１時間加温し、エ
タノール沈澱を行い、ＲＮＡを得た。
・ダイアグノスティック・システムズ社製、オーソＨＣ
ＶＡｂＥＬＩＳＡキット）と判定された検体ＨＣ−Ｊ
１、ＨＣ−Ｊ６およびＮＡＮＢ肝炎の感染を確認したチ
ンパンジーから得たＨＣＶ抗体（−）の検体ＨＣ−Ｊ４
より、次のようにしてＲＮＡを抽出した。血漿にトリス
塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、６８×１
０３ｒｐｍで１時間遠心した。得られたペレットに２０
０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％（ｗ／
ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１ｍｇ
／ｍｌのプロテナーゼＫを含むトリス塩酸緩衝液（５０
ｍＭ、ｐＨ８．０）を加え、６０℃で１時間加温し、エ
タノール沈澱を行い、ＲＮＡを得た。
【００１４】（２）ＨＣ−Ｊ１ｃＤＮＡ合成 ＨＣ−Ｊ１血漿より抽出したＲＮＡを７０℃で１分間加
温し、これを鋳型として１０ユニットの逆転写酵素（ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍＰｌｕｓ、
アマシャム社）およびオリゴヌクレオチドプライマー
（２０−ｍｅｒ）２０ｐｍｏｌを加えて、４２℃、１５
時間反応させてｃＤＮＡを得た。プライマーとしては、
ヨーロッパ特許出願公開３１８，２１６号に示されたＨ
ＣＶ塩基配列を参照して合成した＃８（５′−ＧＡＴＧ
ＣＴＴＧＣＧＧＡＡＣＧＣＡＡＴＣＡ−３′）を用い
た。
温し、これを鋳型として１０ユニットの逆転写酵素（ｃ
ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍＰｌｕｓ、
アマシャム社）およびオリゴヌクレオチドプライマー
（２０−ｍｅｒ）２０ｐｍｏｌを加えて、４２℃、１５
時間反応させてｃＤＮＡを得た。プライマーとしては、
ヨーロッパ特許出願公開３１８，２１６号に示されたＨ
ＣＶ塩基配列を参照して合成した＃８（５′−ＧＡＴＧ
ＣＴＴＧＣＧＧＡＡＣＧＣＡＡＴＣＡ−３′）を用い
た。
【００１５】（３）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅 Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（パーキンエ
ルマー・シータス社）を用いたＳａｉｋｉらの方法（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７−４９１，１９８８）に
より、ＤＮＡサーマイクラー（パーキンエルマー・シー
タス社）にて３５サイクルのｃＤＮＡ増幅を行った。
（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡの増幅 Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（パーキンエ
ルマー・シータス社）を用いたＳａｉｋｉらの方法（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７−４９１，１９８８）に
より、ＤＮＡサーマイクラー（パーキンエルマー・シー
タス社）にて３５サイクルのｃＤＮＡ増幅を行った。
【００１６】（４）ｃＤＮＡライブラリーの構築による
ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４の５′末端側塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーを用いたＨＣ−Ｊ１ゲノムの５′
末端側の塩基配列解析は図２（ＨＣ−Ｊ１）図３（ＨＣ
−Ｊ４）に示すように、ｃＤＮＡをバクテリオファージ
λｇｔ１０に挿入して得たクローンの解析及びｃＤＮＡ
をＰＣＲにて増幅して得られたクローンの解析結果の両
者を併せて決定した。図２および図３はＮＡＮＢ肝炎ウ
イルスゲノムの５′末端を制限酵素切断部位とともに示
し、使用するプライマーの位置も示す。図中、実線はバ
クテリオファージλｇｔ１０のライブラリーによるクロ
ーンで塩基配列を決定した範囲を、点線はＰＣＲによる
クローンで塩基配列を決定した範囲を示す。ＨＣ−Ｊ１
のｎｔ４５４〜２１０９の１６５６塩基はプライマー＃
８から得たｃＤＮＡをλｇｔ１０ファージベクター（ア
マシャム社）に挿入して得られたクローンφ４１により
決定した。つぎにこのシークエンスをもとに合成した、
ｎｔ８２４〜８４３の新しいプライマー＃２５（５′−
ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧ−３′）を
用いて、ＨＣ−Ｊ４のｃＤＮＡライブラリーから順次４
つのｃＤＮＡクローンφ６０、φ６１、φ６６、φ７５
を得て、これらのコンセンサス シークエンスから上流
のｎｔ１８〜８４３の塩基配列を決めた。
ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４の５′末端側塩基配列の決定 ｃＤＮＡライブラリーを用いたＨＣ−Ｊ１ゲノムの５′
末端側の塩基配列解析は図２（ＨＣ−Ｊ１）図３（ＨＣ
−Ｊ４）に示すように、ｃＤＮＡをバクテリオファージ
λｇｔ１０に挿入して得たクローンの解析及びｃＤＮＡ
をＰＣＲにて増幅して得られたクローンの解析結果の両
者を併せて決定した。図２および図３はＮＡＮＢ肝炎ウ
イルスゲノムの５′末端を制限酵素切断部位とともに示
し、使用するプライマーの位置も示す。図中、実線はバ
クテリオファージλｇｔ１０のライブラリーによるクロ
ーンで塩基配列を決定した範囲を、点線はＰＣＲによる
クローンで塩基配列を決定した範囲を示す。ＨＣ−Ｊ１
のｎｔ４５４〜２１０９の１６５６塩基はプライマー＃
８から得たｃＤＮＡをλｇｔ１０ファージベクター（ア
マシャム社）に挿入して得られたクローンφ４１により
決定した。つぎにこのシークエンスをもとに合成した、
ｎｔ８２４〜８４３の新しいプライマー＃２５（５′−
ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＡＣＧ−３′）を
用いて、ＨＣ−Ｊ４のｃＤＮＡライブラリーから順次４
つのｃＤＮＡクローンφ６０、φ６１、φ６６、φ７５
を得て、これらのコンセンサス シークエンスから上流
のｎｔ１８〜８４３の塩基配列を決めた。
【００１７】（５）ＨＣ−Ｊ６、５′末端側塩基配列の
決定 ＨＣ−Ｊ６ゲノムの５′末端側の塩基配列は図４に示す
ように、ｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅して得られたクロー
ンの解析結果により決定した。ＨＣ−Ｊ６検体につい
て、抽出したＲＮＡから前記（２）の方法に従って、ｃ
ＤＮＡを抽出し、そのシークエンスを決定した。ｎｔ２
４〜２５５１はＨＣ−Ｊ４の塩基配列を基にしたプライ
マーの組み合わせによるＰＣＲにて得られた各クローン
のコンセンサス シークエンスから決められた。 ｎｔ２４〜８２６ ＃３２（５′−ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣ−３′） ＃１２２（５′−ＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＡＴＴ−３′） クローン；Ｃ９３９７、Ｃ９３８８、Ｃ９７６４ ｎｔ７３２〜１９０７ ＃５０（５′−ＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴ−３′） ＃１２８（５′−ＴＣＧＧＴＣＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣ−３′） クローン；Ｃ９３１６、Ｃ９７５２、Ｃ９７５３ ｎｔ１８６７〜２５９１ ＃１４９（５′−ＴＣＴＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＡ−３′） ＃１４６（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡ−３′） クローン；Ｃ１１６２１、Ｃ１１６２４、Ｃ１１６５５ さらに上流の５′末端側を特定するため、ｎｔ２４６〜
２６５のアンチセンスプライマー＃３６（５′−ＡＡＣ
ＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−３′）を用いて
ｃＤＮＡを合成したのち、ターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフェラーゼによりｃＤＮＡの５′末端に
ｄＡ付加を行い、２段階のｏｎｅ−ｓｉｄｅｄＰＣＲ増
幅を行った。すなわち、１回目はオリゴｄＴプライマー
（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１８８〜２０７のアンチセンス
プライマー＃４８（５′−ＧＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡ
ＡＧＧＡＣＣＣ−３′）を用いて３５サイクルのＰＣＲ
増幅を行い、２回目はそのＰＣＲ産物を鋳型にしてオリ
ゴｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１４０〜１６
０のアンチセンスプライマー＃１０９（２１−ｍｅｒ；
５′−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴ−
３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行った。得られ
たＰＣＲ産物をＭ１３ファージベクターにサブクローニ
ングした。完全長の５′末端配列を有すると考えられる
１３個の独立したクローン、Ｃ９５７７、Ｃ９５７９、
Ｃ９５８１、Ｃ９５８４、Ｃ９５８７、Ｃ９５９０、Ｃ
９５９１、Ｃ９５９５、Ｃ９６０６、Ｃ９６０９、Ｃ９
６１５、Ｃ９６１６、Ｃ９６１９を得、それらのコンセ
ンサス シークエンスからｎｔ１〜２３の塩基配列を決
めた。 （６）ＨＣ−Ｊ６、中央領域塩基配列の決定 ＨＣ−Ｊ６血漿１００ｍｌを原料に、（２）の方法に準
じてλｇｔ１０バクテリオファージにｃＤＮＡライブラ
リーを構築した。プライマーとして、ヨーロッパ特許出
公開３１８，２１６号に示されたＨＣＶ塩基配列を参照
して合成したポリヌクレオチド＃１６２および＃８１を
用い、クローンの選択はプラークハイブリダイゼーショ
ンにより行った。図１に示すように、得られた４個のｃ
ＤＮＡクローンφ２（ｎｔ６９９６〜８７００）、φ６
（ｎｔ６４８５〜８７００）、φ８（ｎｔ６００８〜８
７００）、φ８１（ｎｔ２１９９〜６１６８）を解析
し、得られたコンセンサス シークエンスからｎｔ２５
５２〜８７００の塩基配列を決定した。このうち、クロ
ーンφ８１、φ８はそれぞれ配列番号３、４の塩基配列
を有する。
決定 ＨＣ−Ｊ６ゲノムの５′末端側の塩基配列は図４に示す
ように、ｃＤＮＡをＰＣＲにて増幅して得られたクロー
ンの解析結果により決定した。ＨＣ−Ｊ６検体につい
て、抽出したＲＮＡから前記（２）の方法に従って、ｃ
ＤＮＡを抽出し、そのシークエンスを決定した。ｎｔ２
４〜２５５１はＨＣ−Ｊ４の塩基配列を基にしたプライ
マーの組み合わせによるＰＣＲにて得られた各クローン
のコンセンサス シークエンスから決められた。 ｎｔ２４〜８２６ ＃３２（５′−ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣ−３′） ＃１２２（５′−ＡＧＧＴＴＣＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＡＴＴ−３′） クローン；Ｃ９３９７、Ｃ９３８８、Ｃ９７６４ ｎｔ７３２〜１９０７ ＃５０（５′−ＧＣＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＡＴ−３′） ＃１２８（５′−ＴＣＧＧＴＣＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣ−３′） クローン；Ｃ９３１６、Ｃ９７５２、Ｃ９７５３ ｎｔ１８６７〜２５９１ ＃１４９（５′−ＴＣＴＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＡ−３′） ＃１４６（５′−ＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡ−３′） クローン；Ｃ１１６２１、Ｃ１１６２４、Ｃ１１６５５ さらに上流の５′末端側を特定するため、ｎｔ２４６〜
２６５のアンチセンスプライマー＃３６（５′−ＡＡＣ
ＡＣＴＡＣＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴ−３′）を用いて
ｃＤＮＡを合成したのち、ターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフェラーゼによりｃＤＮＡの５′末端に
ｄＡ付加を行い、２段階のｏｎｅ−ｓｉｄｅｄＰＣＲ増
幅を行った。すなわち、１回目はオリゴｄＴプライマー
（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１８８〜２０７のアンチセンス
プライマー＃４８（５′−ＧＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡ
ＡＧＧＡＣＣＣ−３′）を用いて３５サイクルのＰＣＲ
増幅を行い、２回目はそのＰＣＲ産物を鋳型にしてオリ
ゴｄＴプライマー（２０−ｍｅｒ）とｎｔ１４０〜１６
０のアンチセンスプライマー＃１０９（２１−ｍｅｒ；
５′−ＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴ−
３′）を用いて３０サイクルのＰＣＲを行った。得られ
たＰＣＲ産物をＭ１３ファージベクターにサブクローニ
ングした。完全長の５′末端配列を有すると考えられる
１３個の独立したクローン、Ｃ９５７７、Ｃ９５７９、
Ｃ９５８１、Ｃ９５８４、Ｃ９５８７、Ｃ９５９０、Ｃ
９５９１、Ｃ９５９５、Ｃ９６０６、Ｃ９６０９、Ｃ９
６１５、Ｃ９６１６、Ｃ９６１９を得、それらのコンセ
ンサス シークエンスからｎｔ１〜２３の塩基配列を決
めた。 （６）ＨＣ−Ｊ６、中央領域塩基配列の決定 ＨＣ−Ｊ６血漿１００ｍｌを原料に、（２）の方法に準
じてλｇｔ１０バクテリオファージにｃＤＮＡライブラ
リーを構築した。プライマーとして、ヨーロッパ特許出
公開３１８，２１６号に示されたＨＣＶ塩基配列を参照
して合成したポリヌクレオチド＃１６２および＃８１を
用い、クローンの選択はプラークハイブリダイゼーショ
ンにより行った。図１に示すように、得られた４個のｃ
ＤＮＡクローンφ２（ｎｔ６９９６〜８７００）、φ６
（ｎｔ６４８５〜８７００）、φ８（ｎｔ６００８〜８
７００）、φ８１（ｎｔ２１９９〜６１６８）を解析
し、得られたコンセンサス シークエンスからｎｔ２５
５２〜８７００の塩基配列を決定した。このうち、クロ
ーンφ８１、φ８はそれぞれ配列番号３、４の塩基配列
を有する。
【００１８】（７）ＨＣ−Ｊ６ゲノムの３′末端側の塩
基配列は図５に示すように、ＰＣＲにて増幅して得られ
たクローンの解析結果より決定した。ＨＣ−Ｊ６のｎｔ
８７０１〜９２４１の配列については検体をプライマー
＃８０（５′−ＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣ
ＴＣ−３′）および＃６０（５′−ＧＴＴＣＴＴＡＣＴ
ＧＣＣＣＡＧＴＴＧＡＡ−３′）を用いたＰＣＲにか
け、得られた９３８塩基のクローンＣ９７６０、Ｃ９２
３４、Ｃ９７６１の塩基配列より得られるコンセンサス
シークエンスから決定した。ｎｔ９２４２より下流の
３′末端側塩基配列は以下の方法の従って決定した。す
なわち、各検体より（１）記載の方法に従ってＲＮＡを
抽出し、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてＲＮＡの３′
末端にポリ（Ａ）を付加し、オリゴ（ｄＴ）２０をプラ
イマーとしてｃＤＮＡ合成を行い、得られたｃＤＮＡを
テンプレートとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは第１段階
としてセンスプライマーとして＃９７（５ −ＡＧＴＣ
ＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＴＣＡＴＣＴ−３′）を、アンチ
センスプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）２０を用いて行
った。次に、得られたｃＤＮＡを第２段階ＰＣＲとして
第１段階より下流に相当するセンスプライマー＃９０
（５′−ＧＣＣＧＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＴ−
３′）を、アンチセンスプライマーとしてオリゴ（ｄ
Ｔ）２０を用いて行った。２段階のＰＣＲで得られた増
幅産物にＴ４ＤＮＡポリラーゼを作用させ両端を平滑に
した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにて５′末端を
リン酸化し、Ｍ１３ｍｐ１９ファージベクターのＨｉｎ
ｃＩＩ部位にサブクローニングして塩基配列を決定し
た。こうして得られた１９個のクローン、Ｃ１０３１
１、Ｃ１０３１３、Ｃ１０３１４、Ｃ１０３２０、Ｃ１
０３２２、Ｃ１０３２３、Ｃ１０３２６、Ｃ１０３２
８、Ｃ１０３３０、Ｃ１０３３３、Ｃ１０３３４、Ｃ１
０３３６、Ｃ１０３３７、Ｃ１０３４５、Ｃ１０３４
６、Ｃ１０３４７、Ｃ１０３４９、Ｃ１０３５０、Ｃ１
０３５７から得られるコンセンサス シークエンスより
３′末端側の塩基配列を決定した。以上の解析結果より
ＨＣ−Ｊ６ゲノムに相当するｃＤＮＡ塩基配列を配列番
号２記載のように決定し、またゲノムの完全長ＲＮＡ塩
基配列を配列番号１記載のように決定した。
基配列は図５に示すように、ＰＣＲにて増幅して得られ
たクローンの解析結果より決定した。ＨＣ−Ｊ６のｎｔ
８７０１〜９２４１の配列については検体をプライマー
＃８０（５′−ＧＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣ
ＴＣ−３′）および＃６０（５′−ＧＴＴＣＴＴＡＣＴ
ＧＣＣＣＡＧＴＴＧＡＡ−３′）を用いたＰＣＲにか
け、得られた９３８塩基のクローンＣ９７６０、Ｃ９２
３４、Ｃ９７６１の塩基配列より得られるコンセンサス
シークエンスから決定した。ｎｔ９２４２より下流の
３′末端側塩基配列は以下の方法の従って決定した。す
なわち、各検体より（１）記載の方法に従ってＲＮＡを
抽出し、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてＲＮＡの３′
末端にポリ（Ａ）を付加し、オリゴ（ｄＴ）２０をプラ
イマーとしてｃＤＮＡ合成を行い、得られたｃＤＮＡを
テンプレートとしてＰＣＲに供した。ＰＣＲは第１段階
としてセンスプライマーとして＃９７（５ −ＡＧＴＣ
ＡＧＧＧＣＧＴＣＣＣＴＣＡＴＣＴ−３′）を、アンチ
センスプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）２０を用いて行
った。次に、得られたｃＤＮＡを第２段階ＰＣＲとして
第１段階より下流に相当するセンスプライマー＃９０
（５′−ＧＣＣＧＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＴ−
３′）を、アンチセンスプライマーとしてオリゴ（ｄ
Ｔ）２０を用いて行った。２段階のＰＣＲで得られた増
幅産物にＴ４ＤＮＡポリラーゼを作用させ両端を平滑に
した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにて５′末端を
リン酸化し、Ｍ１３ｍｐ１９ファージベクターのＨｉｎ
ｃＩＩ部位にサブクローニングして塩基配列を決定し
た。こうして得られた１９個のクローン、Ｃ１０３１
１、Ｃ１０３１３、Ｃ１０３１４、Ｃ１０３２０、Ｃ１
０３２２、Ｃ１０３２３、Ｃ１０３２６、Ｃ１０３２
８、Ｃ１０３３０、Ｃ１０３３３、Ｃ１０３３４、Ｃ１
０３３６、Ｃ１０３３７、Ｃ１０３４５、Ｃ１０３４
６、Ｃ１０３４７、Ｃ１０３４９、Ｃ１０３５０、Ｃ１
０３５７から得られるコンセンサス シークエンスより
３′末端側の塩基配列を決定した。以上の解析結果より
ＨＣ−Ｊ６ゲノムに相当するｃＤＮＡ塩基配列を配列番
号２記載のように決定し、またゲノムの完全長ＲＮＡ塩
基配列を配列番号１記載のように決定した。
【００１９】（８）ＨＣ−Ｊ６、アミノ酸配列の決定 ＨＣ−Ｊ６ゲノムのＲＮＡ塩基配列をもとに、開始コド
ンＡＴＧより始まるコード領域のアミノ酸配列を配列番
号５のように決定した。その結果、ＨＣ−Ｊ６は３０３
３アミノ酸残基からなるポリペプタイド前駆体をコード
する１本の長いオープンリーディングフレームよりなる
ことが明らかになった。
ンＡＴＧより始まるコード領域のアミノ酸配列を配列番
号５のように決定した。その結果、ＨＣ−Ｊ６は３０３
３アミノ酸残基からなるポリペプタイド前駆体をコード
する１本の長いオープンリーディングフレームよりなる
ことが明らかになった。
【００２０】
【発明の効果】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスＨＣ
−Ｊ６を単離し、そのウイルス遺伝子の全塩基配列を解
明したことにもとづく発明であって、非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルスを高感度に検出することができ、また、これに必
要なポリペプタイド、ポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体を提供することができる。
−Ｊ６を単離し、そのウイルス遺伝子の全塩基配列を解
明したことにもとづく発明であって、非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
イルスを高感度に検出することができ、また、これに必
要なポリペプタイド、ポリクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体を提供することができる。
【００２１】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：９５８９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００２２】配列番号：２ 配列の長さ：９５８９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００２３】配列番号：３ 配列の長さ：３９７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００２４】配列番号：４ 配列の長さ：２６９３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列
【００２５】配列番号：５ 配列の長さ：３０３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】は、本発明のＮＡＮＢ肝炎ウイルス遺伝子のコ
ード領域の構造。
ード領域の構造。
【図２】は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスの５′末端側塩基配
列決定の方法を示す図。ＨＣ−Ｊ１株。
列決定の方法を示す図。ＨＣ−Ｊ１株。
【図３】は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスの５′末端側塩基配
列決定の方法を示す図。ＨＣ−Ｊ４株。
列決定の方法を示す図。ＨＣ−Ｊ４株。
【図４】は、ＮＡＮＢ肝炎ウイルスの５′末端側塩基配
列決定の方法を示す図。ＨＣ−Ｊ６株。
列決定の方法を示す図。ＨＣ−Ｊ６株。
【図５】ＨＣ−Ｊ６株ゲノムの３′末端側塩基配列の決
定方法。
定方法。
【符号の説明】 図１において、Ｃはコア、Ｅはエンベロープ、ＮＳ−１
は非構造蛋白質−１、ＮＳ−２は同−２、ＮＳ−３は同
−３、ＮＳ−４は同−４、ＮＳ−５は同−５。
は非構造蛋白質−１、ＮＳ−２は同−２、ＮＳ−３は同
−３、ＮＳ−４は同−４、ＮＳ−５は同−５。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｂ 10/00 Ｍ
Claims (13)
- 【請求項１】配列番号１記載の塩基配列を有する非Ａ非
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子。 - 【請求項２】ＲＮＡ５′末端より３４０箇のヌクレオチ
ドからなる非コード領域、これに続く構造蛋白質および
非構造蛋白質をコードする領域を含む９０９９箇のヌク
レオチド、ならびに３′末端１０８箇のＵストレッチを
含む１５０箇のヌクレオチドからなる、請求項第１項記
載のウイルス遺伝子。 - 【請求項３】請求項第１項または第２項記載の遺伝子と
部分的置換を有する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス変異株遺伝
子。 - 【請求項４】配列番号２記載の塩基配列を有するポリヌ
クレオチドＮ−９５８９。 - 【請求項５】配列番号３記載の塩基配列を有するｃＤＮ
ＡクローンＪ６−φ８１。 - 【請求項６】配列番号４記載の塩基配列を有するｃＤＮ
ＡクローンＪ６−φ８。 - 【請求項７】請求項第４項または第６項記載のヌクレオ
チドと部分的置換を有する非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス変異
株ヌクレオチド。 - 【請求項８】請求項第１項ないし第７項記載の遺伝子ま
たはポリヌクレオチドにコードされるポリペプタイド。 - 【請求項９】配列番号５記載のアミノ酸配列を有するポ
リペプタイドＰ−３０３３。 - 【請求項１０】請求項第１項ないし第７項記載の遺伝
子、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡクローンの全部または
一部を宿主細胞に組込み発現させて得たポリペプタイ
ド。 - 【請求項１１】請求項第８項ないし第１０項記載のポリ
ペプタイドに対するポリクローナル抗体またはモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項１２】請求項第８項ないし第１０項記載のポリ
ペプタイドを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎検出系。 - 【請求項１３】請求項第１１項記載の抗体を用いた非Ａ
非Ｂ型肝炎検出系。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28740291A JPH06121689A (ja) | 1991-08-09 | 1991-08-09 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペ プタイド、抗原、抗体検出系 |
| EP19920306952 EP0532167A3 (en) | 1991-08-09 | 1992-07-30 | Non-a, non-b hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems |
| CA002075611A CA2075611A1 (en) | 1991-08-09 | 1992-08-07 | Non-a, non-b hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody, and detection systems |
| US07/925,695 US5428145A (en) | 1991-08-09 | 1992-08-07 | Non-A, non-B, hepatitis virus genome, polynucleotides, polypeptides, antigen, antibody and detection systems |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28740291A JPH06121689A (ja) | 1991-08-09 | 1991-08-09 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペ プタイド、抗原、抗体検出系 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06121689A true JPH06121689A (ja) | 1994-05-06 |
Family
ID=17716877
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28740291A Pending JPH06121689A (ja) | 1991-08-09 | 1991-08-09 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペ プタイド、抗原、抗体検出系 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06121689A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005028652A1 (ja) * | 2003-09-19 | 2005-03-31 | Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research | 新規hcv株由来の核酸、遺伝子、及び該遺伝子を利用したレプリコン複製細胞 |
| US7659103B2 (en) | 2004-02-20 | 2010-02-09 | Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research | Nucleic acid construct containing fulllength genome of human hepatitis C virus, recombinant fulllength virus genome-replicating cells having the nucleic acid construct transferred thereinto and method of producing hepatitis C virus Particle |
| US7790448B2 (en) | 2003-09-19 | 2010-09-07 | Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research | Nucleic acid and gene derived from novel HCV strain and replicon-replicating cell using said gene |
-
1991
- 1991-08-09 JP JP28740291A patent/JPH06121689A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005028652A1 (ja) * | 2003-09-19 | 2005-03-31 | Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research | 新規hcv株由来の核酸、遺伝子、及び該遺伝子を利用したレプリコン複製細胞 |
| JPWO2005028652A1 (ja) * | 2003-09-19 | 2006-11-30 | 財団法人 東京都医学研究機構 | 新規ｈｃｖ株由来の核酸、遺伝子、及び該遺伝子を利用したレプリコン複製細胞 |
| US7790448B2 (en) | 2003-09-19 | 2010-09-07 | Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research | Nucleic acid and gene derived from novel HCV strain and replicon-replicating cell using said gene |
| JP4573776B2 (ja) * | 2003-09-19 | 2010-11-04 | 財団法人 東京都医学研究機構 | 新規ｈｃｖ株由来の核酸、遺伝子、及び該遺伝子を利用したレプリコン複製細胞 |
| US8022197B2 (en) | 2003-09-19 | 2011-09-20 | Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research | Nucleic acid and gene derived from novel HCV strain and replicon-replicating cell using said gene |
| US7659103B2 (en) | 2004-02-20 | 2010-02-09 | Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research | Nucleic acid construct containing fulllength genome of human hepatitis C virus, recombinant fulllength virus genome-replicating cells having the nucleic acid construct transferred thereinto and method of producing hepatitis C virus Particle |
| US8460912B2 (en) | 2004-02-20 | 2013-06-11 | Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science | Nucleic acid construct containing full length genome of human hepatitis C virus, recombinant full length virus genome-replicating cells having the nucleic acid construct transferred thereinto and method of producing hepatitis C virus particle |
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