EA008940B1 - Антивирусные олигонуклеотиды, не связанные с комплементарностью последовательностей - Google Patents

Антивирусные олигонуклеотиды, не связанные с комплементарностью последовательностей Download PDF

Info

Publication number
EA008940B1
EA008940B1 EA200500487A EA200500487A EA008940B1 EA 008940 B1 EA008940 B1 EA 008940B1 EA 200500487 A EA200500487 A EA 200500487A EA 200500487 A EA200500487 A EA 200500487A EA 008940 B1 EA008940 B1 EA 008940B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
oligonucleotide
composition according
antiviral
virus
nucleotides
Prior art date
Application number
EA200500487A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200500487A1 (ru
Inventor
Эндрю Вайан
Жан-Марк Жюто
Original Assignee
Репликор, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Репликор, Инк. filed Critical Репликор, Инк.
Publication of EA200500487A1 publication Critical patent/EA200500487A1/ru
Publication of EA008940B1 publication Critical patent/EA008940B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C12N2310/3125—Methylphosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Описываются олигонуклеотиды со случайной последовательностью, которые обладают антивирусной активностью, а также их применение в качестве антивирусных средств. Во многих случаях олигонуклеотиды содержат более 40 нуклеотидов в длину. Описаны также способы профилактики или лечения вирусной инфекции у человека или животного и способ профилактического лечения рака, вызванного онковирусами человека или животного. Данные способы в типичном случае предусматривают введение человеку или животному, при необходимости такого лечения, фармакологически приемлемого терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного олигонуклеотида, который функционирует способом, не связанным с комплементарностью последовательностей.

Description

Настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам, обладающим антивирусной активностью, и к их применению в качестве терапевтических средств при вирусных инфекциях, вызванных вирусами человека и животных, и в случаях рака, вызванного онкогенными вирусами, и также при других заболеваниях, этиология которых связана с вирусами.
Предпосылки создания изобретения
Приведенное ниже обсуждение дано исключительно в целях лучшего понимания читателем, и как само описание, так и содержащиеся в нем ссылки не должны рассматриваться как исчерпывающая информация о достигнутом уровне в той области, к которой относится данное изобретение.
Многие значимые инфекционные заболевания, поражающие человечество, вызываются вирусами. Многие из указанных заболеваний, включая бешенство, оспу, полиомиелит, гепатит, желтую лихорадку, иммунодефицит и различные энцефалиты, являются зачастую смертельными. Другие важны в том смысле, что они являются чрезвычайно контагиозными и создают острый дискомфорт, такие как грипп, корь, эпидемический паротит и ветряная оспа, а также респираторные или желудочно-кишечные расстройства. Другие возбудители, вызывающие краснуху, а также цитомегаловирус, могут вызвать наследственные аномалии. И наконец, есть вирусы, такие как онковирусы, которые могут вызывать рак у человека и животного.
Среди вирусов особый интерес вызывает семейство Негрекутбае. Негрекушбае представляет собой широко распространенный класс двадцатигранных вирусов с двухцепочечной ДНК. Из 100 охарактеризованных представителей Негрекутбае (ННУ) только восемь инфицируют людей. Самыми известными среди них являются вирус простого герпеса типа 1 (Негрек К1тр1ех (Н8У-1)), вирус простого герпеса типа 2 (Негрек К1тр1ех (Н8У-2)), Уапсейа хок1ег (вирус, вызывающий ветрянку или опоясывающий лишай), цитомегаловирус (СМУ) и вирус Эпштейна-Барр (ЕВУ). Встречаемость Негрекутбае у человека высока, им поражена по меньшей мере одна треть населения земного шара, а в США 70-80% населения имеют некоторые виды инфекции герпеса. Несмотря на то, что патология герпес-инфекции обычно не вызывает опасений, как в случае Н8У-1, который обычно вызывает лишь недлительные поражения вокруг рта и на других частях лица, известны также такие герпес-вирусы, которые вызывают более опасные симптомы, включающие в себя поражения, начиная от изъязвления половых органов до инфицирования плода, что может приводить к развитию энцефалита (15% смертность) или диссеминированной инфекции (40% смертность).
Вирусы герпеса широко распространены в природе и характеризуются высокой патогенностью для человека. Например, вирус Эпштейна-Барр (ЕВУ), который, как известно, вызывает инфекционный мононуклеоз у детей или подростков или у молодых взрослых людей. Признаками острого инфекционного мононуклеоза являются фарингит, лихорадка, головная боль, лимфаденопатия, увеличение миндалин и атипичные делящиеся лимфоциты в периферической крови. Другие часто встречающиеся проявления включают в себя слабый гепатит, спленомегалию и энцефалит. ЕВУ также ассоциируется с двумя формами рака: лимфома Бэркитта (ЛБ, (ВЬ)) и рак носоглотки (назофарингеальная карцинома, НФК (НРС)). В эндемичных районах экваториальной Африки ЛБ представляет собой наиболее распространенную форму злокачественных заболеваний у детей, которая насчитывает примерно 80% случаев рака у детей. Будучи умеренно распространенной у белых представителей Северной Америки, НФК представляет собой наиболее часто встречающийся вид рака в Южном Китае, поражающий чаще всего людей в возрасте от 25 до 55 лет. ЕВУ, как и цитомегаловирус, также часто ассоциируется с посттрансплантационным лимфопролиферативным заболеванием, которое является потенциально смертельным осложнением хронической иммуносупрессии, возникающей после трансплантации твердого органа или костного мозга.
С Н8У ассоциированы также другие заболевания, включая инфекции кожи и глаз, например, хориоретинит или кератоконъюнктивит. Ежегодно в США диагностируется примерно 300000 случаев Н8У инфекций глаза.
СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) вызывается вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Уничтожая или повреждая клетки иммунной системы организма, ВИЧ в прогрессирующей степени нарушает способность человека бороться с инфекциями и некоторыми видами рака. В настоящее время во всем мире примерно 42 млн людей живут с поражением ВИЧ/СПИД. В 2002 г. по причинам, связанным с ВИЧ/СПИДом, умерло в общей сложности 3,1 млн человек. Главной целью анти-ВИЧ лекарственной терапии является предотвращение репродукции вируса и связанного с этим поражения иммунной системы. Несмотря на то что за последние пятнадцать лет был достигнут существенный прогресс в борьбе против ВИЧ, проблема излечивания все еще не решена медицинской наукой. В настоящее время врачи имеют более десятков антиретровирусных средств, относящихся к трем разным классам лекарственных препаратов для лечения данного заболевания. В типичном случае в рамках терапии, известной как ВААРТ (НААКТ) (высокоактивная антиретровирусная терапия), назначают прием в различных комбинациях лекарственных средств из двух или трех классов. Под ВААРТ в типичном случае подразумевается применение двух нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы в сочетании с третьим лекарственным средством, либо ингибитором протеазы, либо ненуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы. Клинические исследования показали, что ВААРТ является наиболее эффективным средством
- 1 008940 снижения уровня вирусов и минимизации вероятности возникновения лекарственной резистентности.
Несмотря на то что, как было показано, ВААРТ снижает количество ВИЧ в организме, известное как вирусная нагрузка, десятки из сотен пациентов имеют существенные проблемы при проведении такого лечения. Некоторые возникающие побочные эффекты, включая аномалии в метаболизме жиров, камни в почках и заболевания сердца, весьма серьезны. Другие побочные эффекты, такие как тошнота, рвота и бессонница, менее серьезны, хотя также создают проблемы для ВИЧ-пациентов, которые нуждаются в хронической лекарственной терапии в течение всей жизни.
Разрешенные в настоящее время анти-ВИЧ-средства действуют путем поступления в ВИЧинфицированные СИ4+ Т-клетки и блокирования при этом функции вирусного фермента, либо обратной транскриптазы, либо протеазы. Для репродукции ВИЧ нужны оба указанных фермента. Однако ВИЧ часто мутирует и становится резистентным, делая неэффективными такие лекарственные средства, основанные на ингибиторах обратной транскриптазы или протеазы. При возникновении резистентности вирусная нагрузка повышается, что диктует необходимость заменить неэффективное средство другим антиретровирусным средством. Однако, к сожалению, когда вирус становится резистентным к одному лекарственному средству данного класса, то другие средства того же класса также могут стать менее эффективными. Указанное явление, известное как перекрестная резистентность, существует в связи с тем, что многие анти-ВИЧ-средства работают аналогичным образом. Встречаемость перекрестной лекарственной резистентности - очень нежелательное явление, поскольку уменьшается количество доступных вариантов для лечения пациентов.
В этой связи, имеется огромная потребность в разработке других антивирусных средств, эффективных против ВИЧ, которые бы работали посредством других механизмов действия, против которых вирус не развил резистентности. Такой подход становится особенно важным в свете последних данных, показывающих что один из десяти пациентов в Европе, заново диагностированных как ВИЧ-пациент, инфицируется штаммом ВИЧ, который уже является резистентным по меньшей мере к одному из разрешенных лекарственных средств, имеющихся на фармацевтическом рынке.
Респираторно-синцитиальный вирус (КБУ) вызывает инфекции верхних и нижних дыхательных путей. Он представляет собой оболочечный РНК-содержащий вирус с (-)-цепью, который отличается очень высокой вирулентностью. Обычно указанный вирус поражает маленьких детей и является самой частой причиной поражений нижних дыхательных путей у младенцев. Инфекции, вызванные КБУ, обычно сопровождаются симптомами, подобными простуде, которые выражены в степени от умеренной до сильной. Однако тяжелое заболевание нижних дыхательных путей может встречаться в любом возрасте, особенно у пожилых людей или у пациентов с ослабленным иммунитетом. Для детей с тяжелыми инфекциями может потребоваться кислородная терапия и в ряде случаев механическая вентиляция. Согласно данным Американской Медицинской Ассоциации растет число детей, госпитализируемых с бронхиолитом, который часто вызывается К8У-инфекцией. К8У-инфекции также насчитывают примерно одну треть контактных респираторных вирусных инфекций у пациентов в центрах трансплантации костного мозга. У пожилой части населения К8У-инфекция, как было показано в последнее время, очень похожа по тяжести на инфекцию вирусом гриппа.
Грипп (ΙΝΡ), также известный как простуда, представляет собой контагиозное заболевание, которое вызывается вирусом гриппа. Он поражает дыхательные пути человека (нос, горло и легкие). В США в среднем примерно 36000 человек ежегодно умирает от гриппа и 114000 человек нуждаются ежегодно в госпитализации в связи с гриппом.
В случае всех инфекционных заболеваний эффективность проводимой терапии зачастую зависит от иммунного ответа хозяйского организма. Указанное замечание особенно справедливо в случае герпесвирусов, где способность всех вирусов герпеса устанавливать латентные инфекции сказывается на чрезвычайно высокой частоте рецидивирующих инфекций у пациентов со слабым иммунитетом. У реципиентов с трансплантацией почки наблюдается от 40 до 70% случаев реактивации латентных Н8Уинфекций и от 80 до 100% реактивации СМУ-инфекций. Такие случаи вирусной реактивации также отмечаются у пациентов со СПИДом.
Вирус гепатита В (НВУ) является ДНК-содержащим вирусом, который принадлежит семейству вирусов Нерабпаушбае. ΗΒΥ вызывает гепатит В у человека. В настоящее время во всем мире насчитывается примерно 2 миллиарда людей, инфицированных указанным вирусом (1 из 3 человек). Примерно 350 млн людей остаются хроническими носителями инфекции и, по оценкам, 1 млн людей умирают каждый год от гепатита В и его осложнений. НВУ может вызвать длительную инфекцию, цирроз печени, рак печени, печеночную недостаточность и смерть.
Вирус переносится через кровь и жидкости организма. Указанный процесс может иметь место при непосредственном контакте через кровь, в случае незащищенных половых контактов, при использовании нестерильных игл и при передаче от инфицированной женщины новорожденному в процессе родов. Большинство здоровых взрослых (90%) из числа инфицированных выздоравливает, при этом у них образуются защитные антитела против дальнейших инфекций вирусом гепатитом В. Небольшое число (510%) неспособно избавиться от вируса и становится носителем хронических инфекций, тогда как у 90% младенцев и до 50% маленьких детей развиваются хронические инфекции после инфицирования данным
- 2 008940 вирусом. В качестве наиболее распространенного вида лечения используют альфа-интерферон. Значительные побочные эффекты, связанные с таким лечением, включают в себя симптомы типа простуды, депрессию, сыпь и другие реакции, а также аномалии в составе крови. Другой вид лечения связан с препаратом 3ТС, при использовании которого также отмечаются многочисленные побочные эффекты. За последние несколько лет отмечалось растущее число отчетов, указывающих на появление у пациентов, проходивших лечение с использованием 3ТС, резистентных штаммов НВУ. Указанная тенденция вырастает в особенно серьезную проблему для той категории пациентов, которые имеют совместную инфекцию НВУ и Ηΐν. В этой связи, имеется насущная потребность в разработке новых антивирусных средств для борьбы с данным вирусом.
Инфекция вирусом гепатита С (НСУ) представляет собой самую распространенную в Соединенных Штатах хроническую трансфузионную инфекцию, где число инфицированных пациентов превышает 4 млн. Обычно вирусная инфекция является ведущей причиной цирроза и рака печени, и в настоящее время рассматривается как основная причина трансплантации печени у пациентов Соединенных Штатов. Выздоровление от инфекции - редкое явление, и примерно 85% инфицированных пациентов становятся хроническими носителями вируса и у 10-20% развивается цирроз. Установлено, что в настоящее время во всем мире насчитывается 170 млн людей, которые являются хроническими носителями. Согласно данным Центра контроля и профилактики заболеваний, хронический гепатит С вызывает от 8000 до 10000 смертельных случаев и является причиной примерно 1000 случаев трансплантации печени в Соединенных Штатах каждый год. В настоящее время отсутствует доступная вакцина для гепатита С. Длительная терапия с использованием интерферона-альфа или сочетания интерферона с рибовирином эффективна лишь примерно у 40% пациентов и вызывает серьезные побочные эффекты.
В настоящее время ситуацию с лечением вирусных инфекций нельзя назвать удовлетворительной. В основном эффективность лечения вирусных инфекций находится на среднем уровне, что связано с развитием выраженных побочных эффектов, которые либо не позволяют осуществлять введение эффективных доз, либо препятствуют проведению длительного лечения. Три клинических ситуации, которые являются показательными для данной проблемы, связаны с инфекциями вирусами из семейства Негрекушбае, ВИЧ и К8У.
В случае вирусов из семейства Негрекушбае имеется пять основных видов лечения, разрешенных в настоящее время для применения в клинических условиях: лечение с использованием идоксуридина, видарабина, ацикловира, фоскарнета и ганцикловира. Указанные виды лечения, имея ограниченную эффективность, также зачастую сопровождаются развитием выраженных побочных эффектов. Аллергические реакции отмечаются у 35% пациентов, принимающих для лечения идоксуридин, видарабин может привести к нарушениям со стороны желудочно-кишечного тракта у 15% пациентов, тогда как ацикловир, фоскарнет и ганцикловир, будучи нуклеозидными аналогами, поражают репликацию ДНК в хозяйских клетках. В случае ганцикловира отмечается развитие нейтропении и тромбоцитопении у 40% больных СПИДом, принимающих для лечения данное лекарственное средство.
Несмотря на то что в настоящее время разрешено множество различных лекарственных средств для лечения ВИЧ-инфекции, все они сопровождаются развитием побочных эффектов, которые являются достаточно сильными и вызывают необходимость обширной вспомогательной терапии для того, чтобы обеспечить пациентам приемлемое качество жизни. Дополнительная проблема, связанная с резистентностью ВИЧ к лекарственным препаратам (проблема, существующая также в случае инфекции герпесвирусами), обычно требует периодического изменения набора лекарственных средств, применяемых для лечения, что в ряде случаев чрезвычайно осложняет лечение такой инфекции.
Лечение В8У-инфекций у маленьких детей является другим примером, подтверждающим актуальность разработки нового лекарственного средства. В данном случае обычным направлением лечения является доставка рибавирина ингаляцией с использованием аэрозоля в виде мелких частиц, вдыхаемого под отдельным тентом. Однако рибавирин не только характеризуется слабой эффективностью, но его использование сопровождается также значительными побочными эффектами. Кроме того, возможность выделения лекарственного средства вызывает большую озабоченность у персонала больниц в связи с известными тератогенными свойствами рибавирина.
Совершенно очевидно, что для вновь разрабатываемых антивирусных средств чрезвычайно желательно наличие трех основных свойств: 1 - улучшенная эффективность; 2 - сниженный риск побочных эффектов и 3 - механизм действия, который было бы трудно преодолеть за счет вирусной мутации.
Были предприняты некоторые попытки ингибирования конкретных вирусов по методике, связанной с использованием антисмысловых молекул.
Замецник с соавт. (2атесшк е! а1.) использовали ОН, которые специфически достигают сайт праймера обратной транскриптазы и оказывают сплайсинг сайтов донора/акцептора (2атесшк е! а1., (1986), Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 83: 4143), (Сообскйб & 2атесшк (1989), патент США 4806463).
Крук с соавторами (Сгооке е! а1., (1992), АийткгоЬ. Адеик СйетоШег., 36: 527-532) описали антисмысловое соединение против Н8У-1.
Дрэпер с соавт. (Игарег е! а1., (1993)) (патент США 5248670) описали антисмысловые олигонуклеотиды с анти-Н8У-активностью, содержащие последовательность Са! и гибридизующиеся с Н8У-1 генами
- 3 008940 иыз, иьз9 и иь40.
Кин с соавт. (Кеап е! а1., ВюсИеткйу (1995), 34: 14617-14620) протестировали антисмысловые метилфосфонатные олигомеры в качестве анти-Н8У-средств.
Пейман с соавт. (Реутап е! а1., Вю1. СИет. Норре 8еу1ег (1995) Маг; 376: 195-198) опубликовали результаты исследования на наличие антивирусных свойств специфических антисмысловых олигонуклеотидов, направленных против мРНК ΙΕ110 и ИЬ30 Н8У-1.
Олигонуклеотиды или олигонуклеотидные аналоги, воздействующие в качестве мишени на мРНК СМУ, кодирующие ΙΕ1, ΙΕ2 или ДНК-полимеразу, были описаны Андерсоном с соавт. (Апбегкоп е! а1., (1997), патент США 5591720).
Хэнекак с соавт. (Напесак е! а1., (1999) (патент США 5952490)) описали модифицированные олигонуклеотиды, содержащие консервативную С-квартетную последовательность и достаточное количество фланкирующих последовательностей нуклеотидов, которые позволяют в значительной мере ингибировать активность вируса, такого как Н8У-1.
Джайрет с соавт. (1а1га!И е! а1., Ап!Мга1. Век. (1997), 33: 201-213) сообщили об антисмысловых олигонуклеотидах, активных против В8У.
Торренс с соавт. (Тоггепсе е! а1., (1999) (патент США 5998602)) сообщили о соединениях, включающих антисмысловой компонент, комплементарный одноцепочечной части антигеномной цепи В8У (цепь мРНК), линкер и олигонуклеотидный активатор РНКазы Ь.
Ки с соавт. е! а1., 2йопдйиа 8Ы Уап Не Ып СИиапд Втд Ии Хие 2а Ζΐιί (2000), 14: 253-256) опубликовали результаты тестирования антисмысловых Р8-ОДН в вирусе Коксаки В3.
В международной публикации XVО 9203051 (Во1/тап апб Мах^е11) описываются метилфосфонатные антисмысловые олигомеры, которые комплементарны жизненно важным участкам вирусного генома Н8У или транскриптам мРНК, которые демонстрируют антивирусную активность.
Было показано, что фосфоротиоатные гуанозин/тимидиновые или обогащенные гуанозином олигодезоксинуклеотиды (ГТ-Р8-ОДН) обладают антивирусной активностью. В статье отмечается, что несколько разных Р8-содержащих ГТ-обогащенных ОДН (В 106-140, 1100-12 и С106-57), составляющие 26 или 27 нт в длину, были так же эффективны по снижению титра ВИЧ-2, как и ГТ-обогащенные ОДН, состоящие из 36 (В 106-96, В106-97) или 45 нт (табл. 4) (Беппе\\'а1б е! а1., Апйуйак Век. (1995), 26: 37-54).
В патенте США 6184369 описаны анти-ВИЧ, анти-Н8У и анти-СМУ олигонуклеотиды, содержащие высокий процент гуанозиновых оснований. В предпочтительных вариантах олигонуклеотид имеет трехмерную структуру и данная структура стабилизируется гуанозиновыми тетрадами. В другом варианте олигонуклеотидные композиции, описанные в данном изобретении, включают два или более тяжа двух соприкасающихся дезоксигуанозинов. В указанном патенте заявляется С-обогащенный ОДН, который включает в себя по меньшей мере два С-остатка, локализованных по меньшей мере в двух положениях.
Коэн с соавт. (СоИеп е! а1., патенты США 5264423 и 5276019) описывают ингибирование репликации ВИЧ и, более конкретно, аналогами Р8-ОДН, которые могут использоваться для предотвращения репликации чужеродных нуклеиновых кислот в присутствии нормальных живых клеток. Коэн с соавт. описывают антивирусную активность антисмысловых Р8-ОДН, специфичных к вирусной последовательности. Они также привели способ тестирования полиА, полиТ и полиС в Р8-ОДН последовательностях, состоящих из 14, 18, 21 и 28 нуклеотидов и указали на наличие антивирусного эффекта у используемых Р8-ОДН.
Мацукура с соавт. (Ма!кикига е! а1., (1987), Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 84: 7706-7710) позже опубликовали данные, соответствующие результатам, описанным в указанных выше патентах США (СоИеп е! а1.).
Гао с соавт. (Сао е! а1., (1989), 1. Вю1. СИет. 264: 11521-11526) описали ингибирование репликации Н8У-2 под действием Р8-ОДН при проведении тестирования полиА, полиТ и полиС последовательностей Р8-ОДН с размерами, включающими 7, 15, 21 и 28 нуклеотидов.
Аршамбо, Стайн и Коэн (АгсИатЬаи1! е! а1., (1994), АгсИ. У1го1., 139: 97109) показали, что полиС Р8ОДН из 28 нуклеотидов не эффективен против Н8У-1.
Стайн с соавт. (8!еш е! а1., (1989), ΛΙΩ8 Век. Нит. Ве!гоу1г., 5: 639-646) опубликовали результаты, содержащие дополнительные данные об анти-ВИЧ активности ОДН, составляющих 21-28 нуклеотидов в длину.
Маршалл с соавт. (МагкИа11 е! а1., (1992), Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 89: 6265-6269) описали антиВИЧ-1-эффект фосфоротиоатных и фосфоротиоатных полиС олигонуклеотидов, составляющих 4-28 нуклеотидов в длину.
Стайн и Ченг (8!еш & СИепд) (8!еш е! а1., (1993), 8с1епсе 261: 1004-1012) в обзорной статье описали антивирусную активность неспецифичных ОДН из 28 нуклеотидов, отмечая, что анти-ВИЧ-свойства Р8 олигонуклеотидов в значительной мере испытывают воздействие эффектов, неспецифичных к последовательности, что представляет собой ингибирующий эффект, который не зависит от последовательности оснований.
Лебедева и Стайн (БеЬебеуа & 8!еш) (ЬеЬебеуа е! а1., (2001), Аппи1. Веу. РИагтасо1., 41: 403-419) в обзорной статье опубликовали результаты исследования множества Р8-ОДН с неспецифической связы
- 4 008940 вающей активностью в отношении белка, включая вирусные белки. Они заявляют, что указанные молекулы являются биологически высокоактивными и часто относительно легко перепутать артифакт с антисмысловым соединением.
Райн с соавт. (Кеш е! а1., патент США 6316190) описали ОТ-обогащенный имитирующий ОН, присоединенный к компоненту слияния и связанный с нуклеокапсидом ВИЧ, который может использоваться в качестве антивирусного соединения. Аналогично, Кэмпбелл с соавт. (СатрЬе11 е! а1., (1999), 1. νίτοί., 73: 2270-2279) описали РО-ОДН с мотивом ТОТОТ, который связывается специфично с нуклеокапсидом ВИЧ, но при этом они не упомянули об антивирусной активности.
Фенг с соавт. (Реид е! а1., (2002), 1. νίτοί., 76: 11757-11762) описали А(п) и ТО(п) РО-ОДН, связывающиеся с рекомбинантным нуклеокапсидом ВИЧ, однако они также не привели данных или соответствующих ссылок относительно анти-ВИЧ-активности.
Антисмысловые ОДН, разрабатываемые в качестве противораковых средств, антивирусных средств или для лечения других заболеваний, в типичном случае составляют примерно 20 нуклеотидов в длину. В обзорной статье Стайна (81еш, СА, (2001), 1. Сйп. 1пуек1., 108: 641-644) подтверждается, что длина антисмыслового олигонуклеотида должна быть оптимизирована: если антисмысловой олигонуклеотид слишком длинный или слишком короткий, то элемент специфичности теряется. В настоящее время считается, что оптимальной длиной для антисмыслового олигонуклеотида является примерно длина в 16-20 нуклеотидов. Аналогично, в другой обзорной статье (Сгооке, 8Т (2000), Мебюбк Епхуток. 313: 3-45) указывается, что в сравнении с РНК и образованием дуплекса РНК фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды имеют значение Тт примерно на -2,2° ниже в расчете на единицу. Это означает, что для эффективности 1п νίίτο фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды должны составлять в типичном случае от 17 до 20 остатков в длину....
Карутерс с соавт. (СатиНетк) (Магк1а11 е! а1., (1992), Ргос. №111. Асаб. δει. И8А, 89 6265-6269) описали анти-ВИЧ-активность фосфородитиоатных ОДН (Р82-ОДН) для полицитидин-Р82-ОДН из 12 остатков и для Р82-ОДН из 14 остатков. Никакие другие размеры не тестировались на наличие анти-ВИЧактивности. Указанные авторы также сообщили об ингибировании обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ в случае использования полицитидин-Р82-ОДН из 12, 14, 20 и 28 остатков. Позже, Маршал с соавт. (Магк11а1 е! а1., (1993), 8с1епсе, 259: 1564-1570) опубликовали результаты, показывающие специфичное относительно последовательности ингибирование ОТ ВИЧ. Та же группа авторов опубликовала данные по исследованию Р82-ОДН у нескольких пациентов. В патентах США 5218103 и 5684148 описаны структура и синтез Р82-ОДН. В патенте США 5452496, 5278302 и 5695979 описано ингибирование ОТ ВИЧ для Р82-ОДН, который не крупнее, чем 15 оснований в длину. В патентах США 5750666 и 5602244 описана антисмысловая активность Р82-ОДН.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к открытию того факта, что олигонуклеотиды (ОН), например олигодезоксинуклеотиды (ОДН), могут иметь антивирусную активность широкого спектра, не определяемую комплементарностью последовательностей. Таким образом, нет необходимости в том, чтобы олигонуклеотид был комплементарным к любой вирусной последовательности или характеризовался бы конкретным распределением нуклеотидов для того, чтобы проявлять антивирусную активность. Такой олигонуклеотид может быть даже получен в виде рандомера, так что будет представлено наименьшее количество копий каждой конкретной последовательности в препарате, например, в 15 микромолярном рандомерном препарате из 32 или более нуклеотидов в длину.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что олигонуклеотиды разной длины обладают разным антивирусным эффектом и, более того, длина антивирусного олигонуклеотида, в случае выявления максимального антивирусного эффекта, составляет от 40 до 120 нуклеотидов. В свете указанных данных относительно антивирусных свойств олигонуклеотидов настоящее изобретение относится к антивирусным средствам олигонуклеотидной природы, которые могут обладать активностью против множества разных вирусов и которые могут быть даже выбраны для применения в качестве антивирусных средств широкого спектра действия. Такие антивирусные средства в особенности полезны ввиду ограниченных вариантов возможного и доступного в настоящее время антивирусного лечения.
В этой связи ОН, например ОДН, согласно изобретению могут использоваться в терапии и профилактике вирусных инфекций или при лечении или профилактике опухолей или рака, индуцированных вирусами, такими как онковирусы (например, ретровирусы, папилломовирусы, герпес-вирусы), а также при лечении или профилактике других заболеваний, этиология которых связана с вирусами. Такие виды лечения применимы ко многим типам пациентов и курсов лечения, включая в себя, например, профилактику или лечение вирусных инфекций у человека и животных с ослабленным иммунитетом.
В первом аспекте настоящее изобретение относится к антивирусному олигонуклеотидному средству, которое включает в себя по меньшей мере один антивирусный олигонуклеотид, например, длиной по меньшей мере 6 нуклеотидов, адаптированный для применения в качестве антивирусного средства, где антивирусная активность олигонуклеотида осуществляется принципиально по механизму действия, не зависящему от комплементарности последовательностей. Такое средство может включать в себя смесь различных олигонуклеотидов, например, по меньшей мере 2, 3, 5, 10, 50, 100 или более.
- 5 008940
Термин антивирусный в контексте настоящего описания, применительно к олигонуклеотидам или другим материалам, относится к эффекту, определяемому наличием олигонуклеотидов или другого материала, ингибирования продукции вирусных частиц, т.е. снижения числа образованных инфекционных вирусных частиц в системе, пригодной для образования инфекционных вирусных частиц.
Термин антивирусное олигонуклеотидное средство в контексте настоящего описания относится к препарату, который включает в себя по меньшей мере один антивирусный нуклеотид, адаптированный для применения в качестве антивирусного средства. Указанный препарат включает в себя один или несколько олигонуклеотидов и может содержать другие материалы, которые не мешают использованию антивирусного средства ίη νίνο. Такие другие материалы могут включать в себя, без ограничения, разбавители, наполнители, материалы носителя и/или другие антивирусные материалы.
Термин фармацевтическая композиция в контексте настоящего описания относится к антивирусному олигонуклеотидному средству, которое включает в себя физиологически или фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Такие композиции могут также включать в себя другие компоненты, которые не придают композиции свойства, непригодные для введения субъекту, например человеку.
В контексте настоящего описания, если особо не указаны определенные ограничения, термин олигонуклеотид (ОН) означает олигодезоксинуклеотид (ОДН) или олигодезоксирибонуклеотид или олигорибонуклеотид. Таким образом, термин олигонуклеотид относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или к их миметикам. Указанный термин включает в себя олигонуклеотиды, состоящие из природных нуклеотидных оснований, сахаров и ковалентных внутринуклеозидных (скелетных) связей, а также олигонуклеотиды, включающие в себя неприродные части, которые функционируют аналогичным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды являются зачастую более предпочтительными, чем нативные формы, поскольку обладают желательными свойствами, такими, например, как улучшенное поглощение клетками, повышенная аффинность к мишени нуклеиновой кислоте и повышенная стабильность в присутствии нуклеазы. Примеры модификаций, которые могут быть использованы, описаны ниже. Олигонуклеотиды, которые включают в себя внутрискелетные и/или другие модификации, могут также называться олигонуклеозидами.
Фраза адаптирован(а) для применения в качестве антивирусного средства в контексте настоящего описания применительно к антивирусному препарату, фармацевтической композиции или другому материалу означает, что данный материал проявляет антивирусный эффект и не содержит какого-либо компонента или материала, который делает его непригодным для использования с целью ингибирования вирусной продукции в системе ίη νίνο, например, для введения субъекту, такому как человек.
Фраза механизм действия, не связанный с комплементарностью последовательностей в контексте настоящего описания применительно к антивирусному действию материала указывает, что механизм, посредством которого данный материал демонстрирует антивирусный эффект, не определяется гибридизацией комплементарных последовательностей нуклеиновой кислоты, например, за счет антисмыслового эффекта. И наоборот, фраза механизм действия, определяемый комплементарностью последовательностей означает, что антивирусный эффект материала включает гибридизацию комплементарных последовательностей нуклеиновой кислоты. Таким образом, указание на то, что антивирусная активность материала не определяется в первую очередь механизмом действия, основанным на комплементарности последовательностей означает, что активность олигонуклеотида удовлетворяет по меньшей мере одному из 4 тестов, приведенных в данном описании (см. пример 10), для определения, является ли данный механизм действия таким, который преимущественно не связан с комплементарностью последовательностей. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения рассматриваемый олигонуклеотид соответствует критерию теста 1, теста 2, теста 3 или теста 4; рассматриваемый олигонуклеотид соответствует критериям двух тестов, например тестов 1 и 2, тестов 1 и 3, тестов 1 и 4, тестов 2 и 3, тестов 2 и 4 или тестов 3 и 4; рассматриваемый олигонуклеотид соответствует критериям трех тестов, например тестов 1, 2 и 3, тестов 1, 2 и 4, тестов 1, 3 и 4 или тестов 2, 3 и 4; и рассматриваемый олигонуклеотид соответствует критериям всех тестов: 1, 2, 3 и 4.
Термин субъект в контексте настоящего описания применительно к введению антивирусного материала относится к живому высшему организму, включая в себя, например, животных, таких как млекопитающие, например человек, приматы, отличные от человека, быки, свиньи, овцы, лошади, собаки и кошки; птицы; и растения, например фруктовые деревья.
Родственный аспект относится к антивирусному препарату олигонуклеотидного рандомера, где антивирусная активность рандомера реализуется принципиально по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей. Такой препарат рандомера может, например, включать в себя смесь рандомеров разной длины, например, по меньшей мере 2, 3, 5, 10 или более вариантов разной длины.
Термин случайный в контексте настоящего описания применительно к олигонуклеотидным последовательностям используется для характеристики последовательности или ОН, которые не комплементарны вирусной мРНК и которые выбирают таким образом, чтобы не образовались шпильки и что
- 6 008940 бы в них не содержалось палиндромных последовательностей. При использовании термина случайный в контексте антивирусной активности олигонуклеотида относительно конкретного вируса, данный термин означает отсутствие комплементарности к вирусной мРНК такого рассматриваемого вируса. Отсутствие комплементарности может пониматься шире, например, применительно к множеству вирусов, к вирусам из определенного семейства вирусов или к вирусам, вирулентным для человека.
В рамках настоящего изобретения термин рандомер означает одноцепочечную ДНК, включающую в себя нуклеотид по принципу нестрогого соответствия (или по принципу качелей) (Ν) в каждом положении, такую как ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ. Каждое основание синтезируют в соответствии с указанным принципом качелей, так что данный ОН существует фактически в виде популяции различных случайным образом созданных последовательностей одного и того же размера.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду, обладающему антивирусной активностью против вируса-мишени, где указанный олигонуклеотид включает в себя по меньшей мере 29 нуклеотидов в длину (или в конкретных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере 30, 32, 34, 36, 38, 40, 46, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 120 нуклеотидов в длину) и последовательность олигонуклеотида не комплементарна никакой из частей геномной последовательности вируса-мишени.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотидному средству, содержащему по меньшей мере один олигонуклеотид, обладающий антивирусной активностью против вируса-мишени, где указанный олигонуклеотид составляет по меньшей мере 6 нуклеотидов в длину (в конкретных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 46, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 120 нуклеотидов в длину), и последовательность олигонуклеотида менее чем на 70% комплементарна любой из частей последовательности геномной нуклеиновой кислоты вируса-мишени и не состоит по существу из полиА, полиС, полиО, полиТ, О-квартета или ТО-обогащенной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид характеризуется менее чем на 65, 60, 55, 50, 80, 90, 95 или 100% комплементарностью к любой из частей последовательности геномной нуклеиновой кислоты вируса-мишени.
Термин ТО-обогащенный в контексте настоящего описания применительно к описываемым олигонуклеотидам указывает, что последовательность антивирусного олигонуклеотида состоит по меньшей мере на 70% из нуклеотидов Т и О или, в конкретных вариантах, содержит по меньшей мере 80, 90 или 95% Т и О или даже 100%.
Родственный аспект относится к выбранным очищенным или обогащенным антивирусным нуклеотидам, приведенным в настоящем описании, например, таким, которые были описаны применительно к антивирусным олигонуклеотидным препаратам, а также относится к другим олигонуклеотидным препаратам, например препаратам, пригодным для использования ίη νίίτο.
Антивирусные олигонуклеотиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть разной длины, например, могут иметь 6, 10, 14, 15, 20, 25, 28, 29, 30, 35, 38, 40, 46, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 140, 160 или более нуклеотидов в длину. Аналогично, олигонуклеотид может характеризоваться некоторым диапазоном, например, диапазоном, определяемым двумя ранее указанными величинами как конечными точками диапазона, например 10-20, 20-40, 30-50, 40-60, 40-80, 60-120 и 80-120 нуклеотидов. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения минимальная длина или длина диапазона сочетается с любыми другими характеристиками олигонуклеотидов, приведенными в настоящем описании для рассматриваемых антивирусных олигонуклеотидов.
Антивирусный нуклеотид может включать в себя различные модификации, например, стабилизирующие модификации, и может, таким образом, включать в себя по меньшей мере одну модификацию фосфодиэфирной связи и/или на сахарном фрагменте, и/или на основании. Например, олигонуклеотид может включать в себя одну или более фосфоротиоатных связей, фосфородитиоатных связей и/или метилфосфонатных связей; модификаций в 2'-положении сахара, таких как 2'-О-метильные модификации, 2'-аминомодификации, 2'-галогеновые модификации, такие как 2'-фтор; ациклические нуклеотидные аналоги и может также включать в себя по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь. Другие модификации также известны в данной области и могут использоваться. В случае олигонуклеотидов, которые содержат 2'-О-метильные модификации, указанные олигонуклеотиды необязательно включают 2'-Ометильные модификации по всей длине, поскольку, в соответствии с имеющимися результатами, такие олигонуклеотиды не обладают подходящей активностью. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид имеет модифицированные связи по всей длине, например фосфоротиоат; имеет 3'- и/или 5'-кэппирование; включает в себя терминальную 3'-5'-связь; а также олигонуклеотид представляет собой или включает в себя конкатемер, состоящий из двух или более олигонуклеотидных последовательностей, соединенных линкером(ами).
В конкретных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид связывается с одним или более вирусными белками; последовательность олигонуклеотида (или его часть, например, по меньшей мере 1/2) получают из вирусного генома; активность олигонуклеотида вместе с последовательностью, полученной из вирусного генома, не превосходит по данной способности рандомерный олигонуклеотид или случайный олигонуклеотид той же длины; олигонуклеотид включает в себя часть, комплементарную вирусной последовательности, и часть, не комплементарную вирусной последовательности; последова
- 7 008940 тельность олигонуклеотида получают из последовательности вирусной упаковки или другой вирусной последовательности, участвующей в аптамерном взаимодействии; если особо не оговорено иное, последовательность олигонуклеотида включает в себя А(х), С(х), С(х), Т(х), АС(х), АС(х), АТ(х), СС(х), СТ(х) или СТ(х), где х равен 2, 3, 4, 5, 6, ...60...120 (в конкретных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотид включает в себя по меньшей мере 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 46, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 120 нуклеотидов в длину, или длина указанной повторной последовательности является по меньшей мере такой указанной длиной); олигонуклеотид является одноцепочечным (РНК или ДНК); олигонуклеотид является двухцепочечным (РНК или ДНК); олигонуклеотид включает в себя по меньшей мере один Сквартет или СрС-часть; олигонуклеотид включает в себя часть, комплементарную вирусной мРНК, и составляет по меньшей мере 29, 37 или 38 нуклеотидов в длину (или имеет другую длину, указанную выше); олигонуклеотид включает в себя по меньшей мере один олигонуклеотид, не соответствующий модели Уотсона-Крика, и/или по меньшей мере один нуклеотид, который участвует в связывании с другим нуклеотидом, не соответствующим модели Уотсона-Крика; олигонуклеотид является случайным олигонуклеотидом, олигонуклеотид является рандомером или включает в себя рандомерную часть, т.е. рандомерную часть, которая имеет длину, указанную выше в контексте длины олигонуклеотида; олигонуклеотид соединяют или конъюгируют по одному или более нуклеотидных остатков с молекулой, которая модифицирует свойства олигонуклеотида, например, для обеспечения лучшей стабильности (такой как стабильность в сыворотке или стабильность в конкретном растворе), для снижения уровня взаимодействия с сывороткой, для увеличения поглощения клетками, для усиления взаимодействия с вирусным белком, для улучшения свойств, способствующих созданию композиции для доставки, для получения обнаруживаемого сигнала, для улучшения фармакокинетических свойств, для достижения специфического распределения по тканям и/или для снижения токсичности.
Олигонуклеотиды также могут использоваться в сочетании, например, в виде смеси. Такие сочетания или смеси могут включать в себя, например, по меньшей мере 2, 4, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 или более различных олигонуклеотидов.
Такие сочетания или смеси могут включать в себя, например, разные последовательности, и/или последовательности разной длины, и/или разные модификации, и/или разные соединенные или конъюгированные молекулы. В конкретных вариантах таких сочетаний или смесей множество олигонуклеотидов имеет минимальную длину или характеризуется диапазоном длины, указанным выше для олигонуклеотидов. В конкретных вариантах таких сочетаний или смесей по меньшей мере один, множество или каждый из олигонуклеотидов могут обладать любым другим свойством из числа указанных в данном описании для индивидуальных антивирусных олигонуклеотидов (которые могут также находиться в любом согласованном сочетании).
Фраза получен(а) из вирусного генома указывает на то, что конкретная последовательность имеет последовательность нуклеотидных оснований, которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности вирусного генома или его комплемента (например, является такой же или комплементарной данной геномной последовательностью вируса) или является последовательностью соответствующей РНК. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения данный термин указывает на то, что последовательность по меньшей мере на 70% идентична вирусной геномной последовательности конкретного вируса, против которого направлено действие данного олигонуклеотида, или его комплементарной последовательности. В конкретных вариантах идентичность составляет по меньшей мере 80, 90, 95, 98, 99 или 100%.
Настоящее изобретение также относится к антивирусной фармацевтической композиции, которая включает в себя терапевтически эффективное количество фармакологически приемлемого антивирусного олигонуклеотида, имеющего длину по меньшей мере 6 нуклеотидов (или другую длину, указанную выше), где антивирусная активность олигонуклеотида осуществляется принципиально по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей, и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретных вариантах олигонуклеотид или сочетание или смесь олигонуклеотидов соответствуют тому, что было указано выше относительно индивидуальных олигонуклеотидов или сочетаний или смесей олигонуклеотидов. В конкретных вариантах фармацевтические композиции разрешены для введения человеку или животному, отличному от человека, такому как примат, отличный от человека.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции адаптированы для лечения, контроля или профилактики заболевания вирусной этиологии; адаптированы для лечения, контроля или профилактики заболевания приона; адаптированы для доставки путем внутриглазного введения, перорального приема, энтерального введения, ингаляции, кожной, подкожной, внутримышечной, внутрибрюшинной, внутриоболочечной, интратрахеальной или внутривенной инъекции или для местного введения. В конкретных вариантах композиция включает в себя систему доставки, например, направляется в специфические клетки или ткани; липосомную композицию, другое антивирусное средство, например, ненуклеотидный антивирусный полимер, антисмысловую молекулу, 81РНК или малую молекулу лекарственного средства.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения антивирусный олигонуклеотид, олигонуклеотидный препарат, олигонуклеотидное средство и антивирусная фармацевтическая компози
- 8 008940 ция имеют значение ИК50 для вируса-мишени (например, любого конкретного вируса или вирусов из указанных в описании групп вирусов), составляющие 0,50, 0,20, 0,10, 0,09, 0,08, 0,07, 0,75, 0,06, 0,05, 0,045, 0,04, 0,035, 0,03, 0,025, 0,02, 0,015 или 0,01 мкМ или менее.
В конкретных вариантах, относящихся к средствам, фармацевтическим композициям, а также к способам профилактики и лечения, указанные композиция или средство адаптированы для лечения, контроля или профилактики заболевания вирусной этиологии; адаптированы для лечения, контроля или профилактики заболевания приона; адаптированы для доставки способом, выбранным из группы, состоящей из внутриглазного введения, перорального приема, энтерального введения, ингаляции или доставки путем кожной, подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции; а также содержат систему доставки, которая может содержать или может быть ассоциирована с молекулой, повышающей аффинность к специфическим клеткам; а также сочетают в себе по меньшей мере одно другое антивирусное средство; и/или дополнительно сочетают в себе антивирусный полимер.
В контексте настоящего описания применительно к антивирусным олигонуклеотидам и композициям и аналогичным материалам в том, что касается конкретного вируса или группы вирусов, термин мишень указывает, что данный олигонуклеотид отбирается для ингибирования такого вируса или группы вирусов. В контексте конкретного типа ткани или клетки данный термин указывает, что олигонуклеотид, композиция или система доставки выбирается таким образом, что олигонуклеотид преимущественно присутствует и/или преимущественно демонстрирует антивирусный эффект вблизи от конкретной ткани или клеток определенного типа.
В контексте настоящего описания термин система доставки относится к компоненту или компонентам, которые, в сочетании с описанным в данном изобретении олигонуклеотидом, повышают количество олигонуклеотида, который контактирует с целевым сайтом ίη νινο, и/или увеличивают длительность его присутствия в мишени, т.е., например, по меньшей мере на 20, 50 или 100% или даже более в сравнении с количеством и/или длительностью в отсутствие такой системы доставки, и/или препятствуют или снижают взаимодействия, которые вызывают побочные эффекты.
В контексте настоящего описания применительно к антивирусным средствам и другим средствам или исследуемым соединениям термин малая молекула означает, что молекулярная масса молекулы составляет 1500 Да или менее. В некоторых случаях молекулярная масса составляет 1000, 800, 600, 500 или 400 Да или менее.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, который содержит по меньшей мере один антивирусный олигонуклеотид или олигонуклеотидное средство в составе снабженной этикеткой упаковки, где антивирусная активность олигонуклеотида осуществляется по механизму действия, который принципиально не связан с комплементарностью последовательностей, и этикетка на упаковке указывает на то, что антивирусный олигонуклеотид может использоваться по меньшей мере против одного вируса.
В конкретных вариантах набор содержит фармацевтическую композицию, которая включает в себя по меньшей мере один приведенный в описании антивирусный олигонуклеотид; антивирусный олигонуклеотид адаптирован для введения ίη νινο животному и/или этикетка указывает, что олигонуклеотид или композиция приемлемы и/или разрешены для введения животному; указанное животное является млекопитающим, таким как человек, или является млекопитающим, отличным от человека, таким как бык, свинья, представитель грызунов, овца или лошадь; указанное животное представляет собой животное, отличное от человека; набор разрешен официальным Агентством, таким как Управление США по контролю за пищевыми продуктами, лекарственными средствами и косметическими препаратами (Ροοά апб Эгид А6т1Ш81та1юп), или аналогичным регламентирующим органом для введения животному, например, человеку.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу выбора антивирусного олигонуклеотида, например, антивирусного олигонуклеотида, действие которого не связано с комплементарностью последовательностей, для использования в качестве антивирусного средства. Данный способ подразумевает синтез множества различных случайных олигонуклеотидов, тестирование олигонуклеотидов на активность по ингибированию способности вируса продуцировать инфекционные вирионы и отбор олигонуклеотида, обладающего фармацевтически приемлемым уровнем активности, для использования его в качестве антивирусного средства.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения различные случайные олигонуклеотиды включают в себя рандомеры разной длины; случайные олигонуклеотиды могут иметь разные последовательности или могут иметь общую для всех последовательность, такую как последовательность самых коротких олигонуклеотидов в множестве; и/или различные случайные олигонуклеотиды включают в себя множество олигонуклеотидов, содержащих рандомерный сегмент длиной по меньшей мере в 5 нуклеотидов, или различные случайные олигонуклеотиды содержат множество рандомеров разной длины. Другие олигонуклеотиды, например из числа приведенных в настоящем описании в качестве антивирусных олигонуклеотидов, могут тестироваться в определенной системе.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения вирусной инфекции у субъекта путем введения субъекту, при необходимости такого лечения, терапевтиче
- 9 008940 ски эффективного количества по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого олигонуклеотида, приведенного в настоящем описании, например, олигонуклеотида, действующего независимо от комплементарности последовательностей, который содержит по меньшей мере 6 нуклеотидов в длину, или антивирусной фармацевтической композиции или средства, содержащих такой олигонуклеотид. В конкретных вариантах вирус может представлять собой любой из числа перечисленных в настоящем описании в качестве подходящего для ингибирования согласно настоящему изобретению; инфекция относится к заболеванию или состоянию, которое указано в данном описании как связанное с вирусной инфекцией; рассматриваемый субъект является субъектом того типа, который указан в настоящем описании, например, это может быть человек, животное, отличное от человека, млекопитающее, отличное от человека, растение и т.п.; лечение рассматривается применительно к вирусному заболеванию или заболеванию вирусной этиологии, например, представляет собой заболевание, приведенное в разделе, относящемся к предпосылкам создания изобретения.
В конкретных вариантах настоящего изобретения вводят описанный антивирусный олигонуклеотид (или олигонуклеотидное средство или фармацевтическую композицию); введение представляет собой метод, приведенный в настоящем описании; используют систему доставки или способ, приведенный в настоящем описании; вирусная инфекция представляет собой инфекцию ДНК-содержащим вирусом или РНК-содержащим вирусом; вирус представляет собой вирус, относящийся к Рагуоушйае, Рароуаушйае, Лйепоушйае, Негрекушйае, Рохушйае, Нерайпаутйае или РарШошаутйае; вирус, относящийся к Агепаутйае, Вцпуаушйае, Са1аушйае, Согопаутйае, Ейоушйае, Иаутйае, Оййотухоушйае, Рагатухоутйае, Рюотаутйае, Яеоутйае, К.йаЬйоутйае, Ке!гоутйае или Тодаутйае; вирус из Негрекутйае представляет собой ЕВУ, Н8У-1, Н8У-2, СМУ, νζν, ННУ-6, ННУ-7 или ННУ-8; указанный вирус представляет собой ВИЧ-1 или ВИЧ-2; указанный вирус представляет собой К.8У; указанный вирус представляет собой вирус гриппа, например, вирус гриппа А; указанный вирус представляет собой НВУ; указанный вирус представляет собой вирус ветряной оспы или вирус осповакцины; указанный вирус представляет собой коронавирус; указанный вирус представляет собой вирус, вызывающий 8АЯ8; указанный вирус представляет собой вирус лихорадки западного Нила; указанный вирус представляет собой хантавирус; указанный вирус представляет собой вирус парагриппа; указанный вирус представляет собой вирус Коксаки; указанный вирус представляет собой риновирус; указанный вирус представляет собой вирус желтой лихорадки; указанный вирус представляет собой вирус денге; указанный вирус представляет собой вирус гепатита С; указанный вирус представляет собой вирус Эбола; указанный вирус представляет собой вирус Марбург.
Аналогично, в родственном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактического лечения рака, вызываемого онковирусами, у животного и человека путем введения указанному человеку или животному, при необходимости такого лечения, фармакологически приемлемого терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного случайного олигонуклеотида, составляющего в длину по меньшей мере 6 нуклеотидов (или олигонуклеотида другой длины, указанной в настоящем описании), или средства, или фармацевтической композиции, содержащих такой олигонуклеотид.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения приведенный(ые) в описании настоящего изобретения олигонуклеотид(ы), например, имеет(ют) длину, приведенную в описании; при этом используется способ введения, указанный в настоящем описании; а также используется система доставки, указанная в настоящем описании.
Термин терапевтически эффективное количество относится к количеству, которого достаточно для того, чтобы вызвать терапевтически или профилактически значимое снижение продукции инфекционных вирусных частиц при введении типичному субъекту соответствующего типа. В аспектах, включающих введение антивирусного олигонуклеотида субъекту, в типичном случае олигонуклеотид, средство или композиция должны вводиться в терапевтически эффективном количестве.
В другом аспекте факт обнаружения того, что взаимодействия, не основанные на комплементарности последовательностей, создают эффективную антивирусную активность, указывает на способ скрининга для идентификации соединения, которое меняет связывание олигонуклеотида с вирусным компонентом, таким как один или более вирусных белков (например, экстрагированных или очищенных из вирусной культуры или инфицированных хозяйских организмов, или получаемых рекомбинантными методами). Например, такой способ может включать в себя выявление того, снижает ли исследуемое соединение связывание олигонуклеотида с одним или более вирусными компонентами.
В контексте настоящего описания термин скрининг относится к тестированию множества соединений с целью определения того, обладают ли они желательным свойством. Такое множество соединений может представлять собой, например, по меньшей мере 10, 100, 1000, 10000 или более исследуемых соединений.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения может использоваться любое множество аналитических форматов и способов обнаружения для идентификации такого изменения в процессе связывания, например, путем контакта олигонуклеотида с вирусным(ыми) компонентом(ами) в присутствии или в отсутствие соединения(ий), подвергаемого(ых) скринингу (например, в ходе отдельных реакций), с последующим определением того, отличается ли связывание олигонуклеотида с вирус
- 10 008940 ным(ми) компонентом(ами) в присутствии соединения по сравнению с ситуацией, когда исследуемое соединение отсутствует. Наличие такой разницы является показателем того, что данное соединение изменяет характеристики связывания случайного олигонуклеотида с вирусным компонентом.
Альтернативно, может быть использовано конкурентное замещение, при котором олигонуклеотид связывают с вирусным компонентом и определяют замещение добавленным исследуемым соединением, или, наоборот, исследуемое соединение связывают и определяют наличие замещения за счет добавленного олигонуклеотида.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид относится к числу приведенных в настоящем описании вирусных олигонуклеотидов; где указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 6, 8, 10, 15, 20, 25, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 46, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 или 120 нуклеотидов в длину или имеет по меньшей мере другую длину, приведенную в настоящем описании применительно к антивирусным олигонуклеотидам, или описывается диапазоном, определяемым при указании двух предшествующих значений как конечных точек диапазона; исследуемое(ые) соединение(ия) представляет(ют) собой малую(ые) молекулу(ы); исследуемое соединение имеет молекулярную массу менее чем 400, 500, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500 или 3000 Да, или данная величина укладывается в диапазон, определяемый путем указания двух предшествующих значений как конечных точек диапазона; вирусный экстракт или компонент получают из вируса, указанного в настоящем описании; скринингу подвергают по меньшей мере 100, 1000, 10000, 20000, 50000 или 100000 соединений; олигонуклеотид характеризуется значением ИК50, которое равно или менее чем 0,500, 0,200, 0,100, 0,075, 0,05, 0,045, 0,04, 0,035, 0,03, 0,025, 0,02, 0,015 или 0,01 мкМ.
В контексте настоящего описания термин вирусный компонент относится к продукту, кодируемому вирусом или продуцируемому инфицированными хозяйскими клетками в результате вирусной инфекции. Такие компоненты могут включать в себя белки, а также другие биомолекулы. Такие вирусные компоненты могут быть, например, получены из вирусных культур, инфицированных хозяйских организмов, например из животных и растений, или могут быть получены из вирусных последовательностей в рекомбинантных системах (прокариотических или эукариотических), а также из синтетических белков, имеющих аминокислотные последовательности, соответствующие белкам, кодируемым вирусом. Термин экстракт вирусной культуры относится к экстракту клеток, инфицированных вирусом, который включает в себя вирус-специфические продукты. Аналогично, термин вирусный белок относится к вирусспецифическому белку, который обычно кодируется вирусом, но может также кодироваться, по меньшей мере частично, последовательностями хозяйского организма, возникающими вследствие вирусной инфекции.
В родственном аспекте настоящее изобретение относится к антивирусному соединению, идентифицируемому указанным выше способом, например, к новому антивирусному соединению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки олигонуклеотидов, связанных по меньшей мере с одним вирусным компонентом из пула олигонуклеотидов, посредством приведения в контакт пула по меньшей мере с одним вирусным компонентом, например, при связывании со средой стационарной фазы с последующим отбором олигонуклеотидов, которые связались с вирусным(ыми) компонентом(ами). В основном метод сбора включает в себя замещение олигонуклеотида из вирусного(ых) компонента(ов). Метод может также включать в себя секвенирование и/или тестирование антивирусной активности собранных олигонуклеотидов (например, олигонуклеотидов, которые связались с вирусным белком).
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения связанные олигонуклеотиды пула замещают из среды стационарной фазы соответствующим способом, например, с использованием ионного заместителя, и замещенные олигонуклеотиды собирают. В том, что касается различных способов замещения, в типичном случае указанное замещение может осуществляться с использованием методики, основанной на повышении жесткости условий (например, при увеличении концентрации замещающего средства, такой как солевая концентрация, так что в данном случае имеет место ступенчатый или непрерывный градиент), таким образом, что нуклеотиды замещаются в основном в порядке повышения их аффинности связывания. Во многих случаях может применяться методика, основанная на снижении жесткости условий для удаления слабо связанных нуклеотидов, и может быть собрана одна или более фракций, содержащих замещенные более прочно связанные олигонуклеотиды. В некоторых случаях бывает желательно выбрать фракции, которые содержат очень прочно связанные олигонуклеотиды (например, олигонуклеотиды во фракциях, полученных при замещении в условиях более высокой жесткости замещения), для дальнейшего использования.
Аналогично, настоящее изобретение относится к способу обогащения олигонуклеотидов из пула олигонуклеотидов, связанных по меньшей мере с одним вирусным компонентом, путем приведения в контакт пула с одним или более вирусными белками и амплификации олигонуклеотидов, связанных с вирусными белками, с получением пула обогащенных олигонуклеотидов. Контакт и амплификация могут быть проведены при многократном повторении, например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10 или более дополнительных раз с использованием обогащенного олигонуклеотидного пула из предшествующего цикла в качестве пула олигонуклеотидов для следующего цикла. Указанный способ может также вклю
- 11 008940 чать в себя секвенирование и тестирование антивирусной активности олигонуклеотидов в пуле обогащенных олигонуклеотидов после проведения одного или более циклов контакта и амплификации.
Данный способ может включать в себя замещение олигонуклеотидов из вирусного компонента (например, вирусного белка, связанного с твердофазной средой) с использованием любой методики из множества имеющихся, таких как описанные выше методики, например, с использованием замещающего агента. Как указывалось выше, для дальнейшего использования, например, в других циклах связывания и амплификации может быть удобно выбрать более прочно связанные олигонуклеотиды. Данный способ может также включать в себя отбор одного или более обогащенных олигонуклеотидов, например олигонуклеотидов с высокой аффинностью, для дальнейшего использования. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения отбор может включать в себя удаление олигонуклеотидов, которые имеют последовательности, комплементарные последовательностям хозяйского генома (например, человека) в данном представляющем интерес вирусе. Такое удаление может включать в себя сравнение данной(ых) олигонуклеотидной(ых) последовательности(ей) с последовательностями из конкретного организма-хозяина в базе(ах) данных последовательностей, например, с использованием программы сравнения последовательностей (например, программы поиска ВЬАБТ), и удаление тех олигонуклеотидов, которые имеют последовательности, идентичные хозяйской последовательности или имеющие определенную степень идентичности с нею. Удаление таких последовательностей, комплементарных хозяйской последовательности, и/или отбор одного или более олигонуклеотидов, которые не являются комплементарным хозяйским последовательностям, может быть осуществлено в соответствии с другими аспектами настоящего изобретения.
В указанных выше способах идентификации, очистки или обогащения олигонуклеотидов данные олигонуклеотиды могут относиться к любому указанному выше типу. Приведенные выше методы удобны для идентификации, очистки или обогащения высокоаффинных олигонуклеотидов, например, из препарата олигонуклеотидного рандомера.
В родственном аспекте настоящее изобретение относится к антивирусному олигонуклеотидному препарату, который включает в себя один или более олигонуклеотидов, идентифицированных с использованием способа по любому из указанных выше способов идентификации, получения или очистки антивирусных олигонуклеотидов из исходного пула олигонуклеотида, где указанные олигонуклеотиды в олигонуклеотидном препарате проявляют повышенный средний уровень аффинности связывания с одним или более вирусных белков по сравнению со средним значением аффинности связывания олигонуклеотидов в исходном пуле олигонуклеотидов. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения среднее значение аффинности связывания олигонуклеотидов представляет собой величину, которая по меньшей мере в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 50 раз или в 100 раз выше, чем среднее значение аффинности связывания олигонуклеотидов в исходном пуле олигонуклеотидов, или даже более; медианное значение аффинности связывания по меньшей мере в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 50 раз или в 100 раз выше медианного значения аффинности связывания олигонуклеотидов из исходного пула, где термин медианное значение относится к промежуточному срединному значению.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к антивирусной полимерной смеси, которая включает в себя по меньшей мере один антивирусный олигонуклеотид и по меньшей мере один антивирусный полимер ненуклеотидной природы. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения понятие олигонуклеотид соответствует описанию, приведенному в настоящем изобретении для антивирусных олигонуклеотидов, и/или понятие антивирусный полимер соответствует приведенному в данном изобретении описанию или принятым в данной области понятиям или будет далее определен.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к олигонуклеотидному рандомеру, где указанный рандомер составляет в длину по меньшей мере 6 нуклеотидов. В конкретных вариантах рандомер имеет длину, указанную выше для антивирусных олигонуклеотидов; при этом рандомер содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь, рандомер содержит по меньшей мере одну фосфородитиоатную связь или другую модификацию из числа приведенных в настоящем описании; рандомерные олигонуклеотиды содержат по меньшей мере один нерандомерный сегмент (такой как сегмент, комплементарный к последовательности нуклеиновой кислоты выбранного вируса), который имеет длину, указанную выше для олигонуклеотидов; рандомер входит в состав препарата или пула препаратов, содержащих по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 50, 100, 200, 500 или 700 мкмоль, 1, 5, 7, 10, 20, 50, 100, 200, 500 или 700 мкмоль, или 1 моль рандомера, или описывается диапазоном, определяемым указанием любых двух разных значений из указанных выше в качестве конечных точек интервала, или его синтезируют в соответствии с одним из перечисленных выше показателей или интервала показателей.
Аналогично, настоящее изобретение относится к способу получения антивирусных рандомеров путем синтеза по меньшей мере одного рандомера, например рандомера, указанного выше.
Как указывалось выше, для любого аспекта, относящегося к вирусной инфекции или риску развития вирусной инфекции или нацеливанию на конкретный вирус, рассматриваемый в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, вирус соответствует описанному выше вирусу.
Выражение вирусы человека и животного в контексте настоящего описания включает в себя, без
- 12 008940 ограничения, ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы в целом. ДНК-содержащие вирусы включают в себя, например, представителей Ратуоушбае, Рароуаушбае, Лбеиоушбае, Нсгрсчтпбас. Рохушбае, Нерабиаушбае и РарШотаушбае. РНК-содержащие вирусы включают в себя, например, представителей Лгеиаушбае, Вииуаушбае, Са1аушбае, Сотоиаушбае, Ебоушбае, Иаушбае, Оййотухоушбае, Рагатухоушбае, Рюотаушбае, Кеоушбае, КйаЬбоушбае, Кейоушбае или Тодаушбае.
В том, что касается модифицированных характеристик олигонуклеотидов, введенных путем связывания или конъюгирования с другими молекулами или фрагментами, то такие модификации параметров подвергают оценке в сравнении с тем же олигонуклеотидом, но без присоединения или конъюгирования молекулы или фрагмента.
Дополнительные варианты могут быть очевидны из приведенного ниже подробного описания и из прилагаемой формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Тест на снижение бляшкообразования проводят в клетках УЕКО с использованием Н8У-1 (штамм КО8). Инфицированные клетки обрабатывают возрастающими концентрациями КЕР 1001 (а), КЕР 2001 (Ь) или КЕР 3007 (с). Для каждого графика приведены значения ИК50 (1С50), вычисленные на основании уравнения линейной регрессии.
Фиг. 2. Связь между размером Р8-ОДН и значением ИК50 против Н8У-1. Значения ИК50, полученные из фиг. 1, наносят на график против конкретного размера каждого исследуемого Р8-ОДН, приведенного на фиг. 1.
Фиг. 3. Тест на снижение бляшкообразования проводят в клетках УЕКО с использованием Н8У-1 (штамм КО8). Инфицированные клетки обрабатывают возрастающими концентрациями КЕР 2001 (а), КЕР 2002 (Ь) или КЕР 3003 (с), КЕР 2004 (б), КЕР 2005 (е), КЕР 2006 (ί) и ацикловира (д). Для каждого графика приведены значения ИК50, вычисленные на основании уравнения линейной регрессии.
Фиг. 4. Связь между размером Р8-ОДН и значением ИК50 против Н8У-1. Значения ИК50, взятые из фиг. 3, наносят на график против конкретного размера каждого исследуемого Р8-ОДН из фиг. 3, который проявляет анти-Н8У-1-активность. Показано значение ИК50 для ацикловира в качестве клинического варианта сравнения.
Фиг. 5. Тест на снижение бляшкообразования проводят в клетках УЕКО с использованием Н8У-1 (штамм КО8). Исследуют широкий спектр размеров рандомеров Р8-ОДН в возрастающих концентрациях; КЕР 2003 (а), КЕР 2009 (Ь), КЕР 2010 (с), КЕР 2011 (б), КЕР 2012 (е), КЕР 2004 (ί), КЕР 2006 (д), КЕР 2007 (11) и КЕР 2008 (1). Для каждого графика приведены значения ИК50, вычисленные на основании уравнения линейной регрессии.
Фиг. 6. Снимок в УФ рандомеров Р8-ОДН, исследованных и показанных на фиг. 5, после разделения электрофорезом в акриламидном геле.
Фиг. 7. Связь между размером рандомера Р8-ОДН и значением ИК50 против Н8У-1. Значения ИК50, полученные из фиг. 9, наносят на график против конкретного размера каждого исследуемого Р8-ОДН из фиг. 5, который проявляет анти-Н8У-1-активность.
Фиг. 8. Тест на снижение бляшкообразования проводят в клетках УЕКО с использованием Н8У-1 (штамм КО8). Исследуют в возрастающих концентрациях немодифицированные ОДН, Р8-ОДН со случайной последовательностью и Р8-ОДН, нацеленные на стартовый кодон Н8У-1 1Е 110. КЕР 2013 (а), КЕР 2014 (Ь), КЕР 2015 (с), КЕР 2016 (б), КЕР 2017 (е), КЕР 2018 (ί), КЕР 2019 (д), КЕР 2020 (1) и КЕР 2021 (ί). Для каждого графика приведены значения ИК50, вычисленные на основании уравнения линейной регрессии.
Фиг. 9. Снимок в УФ рандомеров Р8-ОДН, исследованных и приведенных на фиг. 8, после разделения электрофорезом в акриламидном геле.
Фиг. 10. Связь между рандомером Р8-ОДН, Р8-ОДН со случайной последовательностью, Р8-ОДНпоследовательностью из Н8У-1 1Е 110 и значением ИК50 против Н8У-1. Значения ИК50, взятые из фиг. 8, наносят на график против конкретного размера каждого исследуемого Р8-ОДН из фиг. 8, который проявляет анти-Н8У-1-активность. Дополнительные значения ИК50 из фиг. 5 включены для целей сравнения с рандомерами Р8-ОДН.
Фиг. 11. Тест на снижение бляшкообразования проводят в клетках УЕКО с использованием Н8У-1 (штамм КО8). Исследуют в возрастающих концентрациях Р8-ОДН, имеющий 2-О-метильные модификации в 4 рибозах на каждом конце олигонуклеотида (КЕР 2024, [а]); ОДН, содержащий метилфосфонатные модификации по 4 сложноэфирным связям на каждом конце олигонуклеотида (КЕР 2026 [Ь]); и Р8ОДН РНК из 20 оснований (КЕР 2059 [с]) и 30 оснований (КЕР 2060 [б]) в длину. Для каждого графика приведены значения ИК50, вычисленные на основании уравнения линейной регрессии.
Фиг. 12. Тест на снижение бляшкообразования проводят в клетках фибробластов человека с использованием Н8У-2 (штамм М82). Инфицированные клетки обрабатывают возрастающими концентрациями КЕР 1001 (а), КЕР 2001 (Ь) и КЕР 3007 (с). Для каждого графика приводят значения ИК50, вычисленные на основании уравнения линейной регрессии.
Фиг. 13. Связь между размером Р8-ОДН и значением ИК50 против Н8У-2. Значение ИК50, взятое из фиг. 12, наносят на график против конкретного размера каждого исследованного Р8-ОДН, приведенного
- 13 008940 на фиг. 12.
Фиг. 14. Тест на снижение бляшкообразования проводят в клетках УЕКО с использованием Н8У-2 (штамм М82). Инфицированные клетки обрабатывают возрастающими концентрациями КЕР 2001 (а), КЕР 2002 (Ь), КЕР 2003 (с), КЕР 2004 (б), КЕР 2005 (е), КЕР 2006 (ί) и ацикловиром (д). Для каждого графика приводят значение ИК50, вычисленное на основании уравнения линейной регрессии.
Фиг. 15. Связь между размером Р8-ОДН и значением ИК50 против Н8У-2. Значение ИК50 из фиг. 14 наносят на график против конкретного размера каждого исследованного Р8-ОДН, приведенного на фиг. 14, который проявляет анти-Н8У-2-активность. Для сравнения приводят значение ИК50 ацикловира, взятого в качестве клинически значимого стандарта.
Фиг. 16. Тест на снижение бляшкообразования проводят в клетках УЕКО с использованием СМУ (штамм АО 169). Инфицированные клетки обрабатывают возрастающими концентрациями КЕР 2004 (а) или КЕР 2006 (Ь). Для каждого графика приводят значение ИК50, вычисленное на основании уравнения линейной регрессии. Связь между размером Р8-ОДН и значением ИК50 против СМУ наносят на график (с). Значение ИК50 из фиг. (а) и (Ь) наносят на график против конкретного размера каждого исследуемого Р8-ОДН.
Фиг. 17. Тест на снижение бляшкообразования проводят в клетках УЕКО с использованием СМУ (штамм ΆΌ169). Исследуют препараты, используемые в трех стратегиях лечения СМУ: ганцикловир (а), фоскарнет (Ь) и цидофовир (с). Исследуют также широкий диапазон размеров рандомеров Р8-ОДН в возрастающих концентрациях: КЕР 2003 (б), КЕР 2004 (е), КЕР 2006 (ί) и КЕР 2007 (д). И наконец, КЕР 2036 (витравен) (Уйтауепе) тестируют в варианте собственного синтеза (11) и в коммерчески доступном варианте (ί). Для каждого графика приводят значения ИК50, вычисленные на основании уравнения линейной регрессии.
Фиг. 18. Связь между размером Р8-ОДН и значением ИК50 против СМУ. Значение ИК50 из фиг. 17 наносят на график против конкретного размера каждого исследованного Р8-ОДН, приведенного на фиг. 17, который проявляет анти-СМУ-активность.
Фиг. 19. Тест на ЦПЭ (СРЕ) проводят в клетках МТ4 с использованием ВИЧ-1 (штамм ЫЬ4-3). Инфицированные клетки обрабатывают возрастающими концентрациями КЕР 2004 (а) или КЕР 2006 (Ь). Для каждого графика приводят значения ИК50, вычисленные на основании уравнения линейной регрессии. Профили цитотоксичности в неинфицированных клетках МТ4 представлены для КЕР 2004 (с) и КЕР 2006 (б).
Фиг. 20. Связь между размером Р8-ОДН и значением ИК50 против ВИЧ-1. Значения ИК50 из фиг. 1 наносят на график против конкретного размера каждого исследованного Р8-ОДН, приведенного на фиг. 1.
Фиг. 21. Тест на репликацию, проведенный в клетках 293А с использованием рекомбинантного варианта дикого типа ВИЧ-1 ΝΕ4-3 (штамм ί,'ΝΩΟ). Инфицированные клетки обрабатывают возрастающими концентрациями ампренавира (а), индинавира (Ь), лопинавира (с), саквинавира (б), КЕР 2003 (е), КЕР 2004 (ί), КЕР 2006 (д) и КЕР 2007 (1). Обе кривые (проведенные черной и пунктирной линией) отражают реакцию штамма СХЭО на дозу препарата.
Фиг. 22. (а) Значения ИК50, взятые из фиг. 21, и (Ь) связь между размером Р8-ОДН и значением ИК50 против рекомбинантного ВИЧ-1. Значения ИК50 из (а) наносят на график против конкретного размера каждого исследованного Р8-ОДН, взятого из фиг. 21.
Фиг. 23. Тест на репликацию, проведенный в клетках 293А с использованием рекомбинантного штамма ВИЧ-1 с множественной резистентностью к лекарственному препарату (штамм МОКС4). Инфицированные клетки обрабатывают возрастающими концентрациями ампренавира (а), индинавира (Ь), лопинавира (с), саквинавира (б), КЕР 2003 (е), КЕР 2004 (ί), КЕР 2006 (д) и КЕР 2007 (1). Кривые, отражающие реакцию варианта СМОО (дикого типа) на дозу, показаны пунктирными линиями, а для МОКС4 (с лекарственной резистентностью) показаны жирными линиями.
Фиг. 24. (а) Значения ИК50 из фиг. 21 и 23, демонстрирующие кратность возрастания значений ИК50 между штаммом дикого типа (СМ1ОО) и штаммом с лекарственной резистентностью (МОКС4) рекомбинантного ВИЧ-1, и (Ь) график, демонстрирующий кратное увеличение значений, вычисленных на основе (а).
Фиг. 25. Тест на ЦПЭ проводят в клетках Нер2 с использованием К8У (штамм А2). Инфицированные клетки обрабатывают возрастающими концентрациями КЕР 2004 (а), КЕР 2006 (Ь), КЕР 2007 (с) или рибавирина (б). Для каждого графика приводят значения ИК50, вычисленные на основании уравнения линейной регрессии. Профили цитотоксичности в неинфицированных клетках Нер2 показаны для КЕР 2004 (е), КЕР 2006 (ί), КЕР 2007 (д) или рибавирина (1).
Фиг. 26. Связь между размером Р8-ОДН и значением ИК50 против К8У. Значения ИК50 из фиг. 25 наносят на график против конкретного размера каждого исследованного Р8-ОДН, приведенного на фиг. 25, который проявляет анти-К8У-активность.
Фиг. 27. Тест на ЦПЭ проводят в клетках ЕЬС-МК2 с использованием вируса Коксаки В2 (штамм ОЫо-1). Инфицированные клетки обрабатывают возрастающими концентрациями КЕР 2006 (а). Показан профиль цитотоксичности для КЕР 2006 в (Ь).
- 14 008940
Фиг. 28. А) Анализ взаимодействия с помощью ФП, демонстрирующий способность рандомеров Р8-ОДН (КЕР 2003, 2004, 2006 и 2007) конкурировать за взаимодействие с затравочным рандомером Р8ОДН в 20 оснований из ФСТ. Показано, что более крупные рандомеры конкурируют более эффективно. В) и С) Защита в сыворотке и улучшенная доставка КЕР 2006 в клетки 293А в присутствии ΌΘΤΑΡ и цитофектина. Ό) и Е) Защита в сыворотке КЕР 2006, инкапсулированного с использованием ЭОТАР или цитофектина при измерении по методу ФП.
Фиг. 29. Определение способности вирусного лизата связываться с затравками различного размера по методу флуоресцентной поляризации. КЕР 2032-ЕЬ, КЕР 2003-ЕЬ и КЕР 2004-ЕЬ используют для исследования способности лизата к связыванию с использованием лизатов, полученных из Н8У-1 (а), ВИЧ1 (Ь) или К8У (с).
Фиг. 30. Определение сродства рандомеров Р8-ОДН к вирусным лизатам по методу флуоресцентной поляризации. С использованием КЕР 2004-ЕЬ в качестве затравки провоцируют образование комплекса с лизатом Н8У-1 (а), с лизатом ВИЧ-1 (Ь) или с лизатом К8У (с) повышающимися концентрациями КЕР 2003, КЕР 2004, КЕР 2006 или КЕР 2007.
Фиг. 31. КЕР 2004-ЕЬ может связываться с ВИЧ-1 р24дад и ВИЧ-1 др41. Способность КЕР 2004-ЕЬ взаимодействовать с повышающимися количествами указанных двух очищенных белков исследуют по методу флуоресцентной поляризации.
Фиг. 32. Влияние размера затравки на связывание с р24 и др41. Затравки возрастающего размера исследуют на их способность связываться с р24дад и др41 по методу флуоресцентной поляризации.
Фиг. 33. Способность двухцепочечных Р8-ОДН связываться с вирусными лизатами исследуют методом флуоресцентной поляризации. Получают как одноцепочечный (55) или двухцепочечный (άδ) фосфоротиоатированный КЕР 2017 (меченный флуоресцентной меткой), так и его нетиоатированный аналог (2017И). Указанные затравки тестируют на их способность связываться с вирусными лизатами Н8У-1 и ВИЧ-1.
Фиг. 34. Доставку Р8-ОДН с флуоресцентным хвостом в клетки измеряют путем инкубации клеток 293А в присутствии 250 нМ КЕР 2004-ЕЬ в течение 4 ч. После инкубации клетки лизируют и с помощью флуорометрии определяют относительную флуоресценцию, высвобождаемую из клеток в результате лизиса.
Фиг. 35. Способность Р8-ОДН с последовательностью из 20 остатков разного состава связываться с вирусными лизатами измеряют методом флуоресцентной поляризации. Р8-ОДН метят на 3'-конце с использованием Е1ТС и инкубируют в присутствии 1 мкг лизатов Н8У-1 (а), ВИЧ-1 (Ь) или К8У (с). Профили связывания указанных Р8-ОДН аналогичны для всех трех вирусных лизатов (см. фиг. 35).
Фиг. 36. Опосредованное определение вирусной нагрузки в инфицированных супернатантах из культуры клеток УЕКО, инфицированных вирусом осповакцины, путем измерения ЦПЭ, индуцированного указанными супернатантами в клетках, не подвергавшихся ранее обработке. КЕР 2004, 2006 и 2007 тестируют в концентрации 10 мкМ, тогда как цидофовир тестируют в концентрации 50 мкМ.
Фиг. 37. (А) Значения ИК50, полученные в тесте на снижение бляшкообразования, проведенном на клетках УЕКО с использованием Н8У-1 (штамм КО8). Инфицированные клетки обрабатывают возрастающими концентрациями КЕР 2006 (N40), КЕР 2028 (640), КЕР 2029 (А40), КЕР 2030 (Т40) и КЕР 2031 (С40) для вычисления значений ИК50 (В). В тесте на снижение уровня бляшкообразования с использованием Н8У-1 получены следующие значения ИК50: N40 (КЕР 2006), АС20 (КЕР 2055), ТС20 (КЕР 2056) или Α620 (КЕР 2057).
Выбранные сокращения
ОН (ОЦ): олигонуклеотид
ОДН (ΌΩΝ): олигодезоксинуклеотид
ФС (Р8): фосфоротиоат
ТСБ (РКА): тест на снижение бляшкообразования
БОЕ (РЕИ): бляшкообразующая единица
ΙΝΕ А: вирус гриппа А
ВИЧ (Н1У): вирус иммунодефицита человека (включает ВИЧ-1 и ВИЧ-2, если особо не оговорено иное)
Н8У: вирус простого герпеса Нсгрсх 51тр1ех (включает Н8У-2 и Н8У-3, если особо не оговорено иное)
К8У: респираторно-синцитиальный вирус
СОХ: вирус Коксаки
ЭНВУ: утиный вирус гепатита В
Подробное описание предпочтительного варианта осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к идентификации и использованию антивирусных олигонуклеотидов, которые действуют по механизму, не связанному с комплементарностью последовательностей, и связано с открытием того факта, что в случае многих вирусов антивирусная активность выше у более крупных олигонуклеотидов и в типичном случае является оптимальной у олигонуклеотидов, содержащих 40 нуклеотидов или более в длину.
- 15 008940
Как указано в предпосылках создания изобретения, было проведено тестирование множества антисмысловых олигонуклеотидов (ОН) на их антивирусную активность. Однако такие антисмысловые ОН обладают специфичностью, связанной с последовательностью, и в типичном случае содержат примерно 16-20 нуклеотидов в длину.
Как показано в результатах примеров 1 и 2, антивирусный эффект случайных Р8-ОДН не имеет специфичности, связанной с последовательностью. Что касается объемов и концентраций использованных в данных тестах Р8-ОДН, то теоретически почти невозможно, чтобы конкретная случайная последовательность присутствовала в количестве более одной копии в смеси. Данный факт означает, что не может быть антисмыслового эффекта в таких Р8-ОДН рандомерах. В последнем примере, если считать, что антивирусный эффект вызывается Р8-ОДН по механизму, имеющему специфичность, связанную с последовательностью, то такой эффект должен вызываться только одной молекулой - результат, который нельзя рассматривать как реальный. Например, в случае рандомера ОН с длиной 40 оснований любая конкретная последовательность в популяции будет теоретически представлять только %40 или 8,27х10-25 часть от общей фракции. Исходя из того, что 1 моль=6,022х1023 молекул и имея в виду тот факт, что самый крупный масштаб синтеза был осуществлен авторами в размере 15 мкмолей, все возможные последовательности также не будут присутствовать, и, кроме того, каждая последовательность присутствует, скорее всего, в виде только одной копии. Разумеется, любой специалист в данной области, применяя описание настоящего изобретения, может также использовать последовательность специфичных ОН, но на основе активности, механизм которой не связан с комплементарностью последовательностей, который раскрыт в настоящем изобретении. Соответственно, настоящее изобретение не ограничивается ОН, действующими независимо от комплементарности последовательностей, но отрицает устоявшиеся в данной области представления относительно применения антисмысловых ОН, имеющих специфичность, связанную с последовательностью, для лечения вирусных инфекций.
Для практически применимых вирусов (включая, например, те, для которых в описании представлены данные) по мере повышения размера рандомера повышается их антивирусный эффект. Следует отметить, что в связи с ограничениями, которые свойственны фосфорамидитному методу синтеза ДНК, применяемому в настоящее время, более крупные Р8-ОДН (например, из 80 и 120 нуклеотидов) имеют значительные примеси фрагментов с длиной, меньшей желательного размера. Более слабый эффект (в расчете на основание), отмечаемый в случае более крупных олигонуклеотидов (80 и 120 пн.) может отражать меньшую концентрацию рандомеров полной длины в указанных популяциях, а также может отражать их сниженное поступление в клетки. Можно достичь более выраженного повышения антивирусной активности, если более крупные рандомеры (>40 оснований) реально достижимой чистоты (75% полной длины) синтезировать или очищать и/или если облегчать поступление в клетки любого из указанных ОДН с помощью соответствующей системы доставки.
В настоящем изобретении рандомеры (или другие олигонуклеотиды) могут блокировать вирусную репликацию по нескольким механизмам, которые включают в себя, без ограничения, следующие: 1 предотвращение адсорбции или взаимодействия с рецептором вирионов, препятствуя таким образом инфекции; 2 - подавление вирусной сборки или упаковки вирусных геномов в капсиды (конкуренция с вирусной ДНК или РНК в процессе упаковки), что приводит к получению дефектных вирионов; 3 - разрушение и предотвращение образования капсидов в ходе упаковки или взаимодействия капсидных белков с другими структурными белками, что приводит к высвобождению вирусов или вызывает высвобождение дефектных вирионов; 4 - связывание с ключевыми вирусными компонентами и предотвращение или снижение их активности; 5 - связывание с ключевыми компонентами хозяйской клетки, необходимыми для вирусной пролиферации.
Не ограничиваясь механизмом, посредством которого достигается ингибирование вируса согласно изобретению, описанное выше, следует указать на несколько возможных механизмов, которые позволяют объяснить и/или прогнозировать ингибирующие способности ОН в отношении вирусной репликации. Первая из них заключается в том, что общий аптамерный эффект ОН, приводящий к присоединению, либо к белку на поверхности клетки, либо к вирусным белкам, препятствует адсорбции вируса и последующему слиянию. Пороговое значение размера для данного эффекта может быть результатом определенного кумулятивного заряда, необходимого для взаимодействия.
Второй возможный механизм заключается в том, что ОН могут функционировать внутри клетки за счет создания препятствий в процессе упаковки и/или сборки вируса. ОН свыше определенного порога размера могут конкурировать или препятствовать нормальному взаимодействию капсид/нуклеиновая кислота, препятствуя упаковке функционального вирусного генома внутри новых вирусов. Альтернативно, ОН могут препятствовать образованию нормального капсида, что, в свою очередь, будет препятствовать нормальному бадингу вирусов, менять вирусную стабильность или препятствовать соответствующей разупаковке вириона при интернализации.
Несмотря на то что механизм действия еще полностью не ясен, результаты тестирования показывают, что ОН согласно изобретению могут демонстрировать более высокую эффективность по ингибированию вируса в сравнении с такими клиническими коррелятами, как ацикловир, ганцикловир, рибави
- 16 008940 рин и ингибиторы протеазы. Таким образом, ОН в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться для лечения или профилактики вирусной инфекции. Вирусные инфекции, подвергаемые такому лечению, могут включать в себя инфекции, вызванные вирусами человека, животного или растения.
Широкий спектр антивирусной активности
В соответствии с обсуждавшимися выше выводами и приведенными в описании материалами следует полагать, что случайные ОН и рандомеры ОН могут обладать широким спектром антивирусной активности в отношении тех вирусов, у которых процесс сборки, и/или упаковки, и/или инкапсидации вирусного генома является необходимой стадией в репликации. В этой связи, для проверки данной гипотезы были исследованы несколько рандомеров Р8-ОДН разного размера после их отбора с использованием клеточных моделей различных вирусных инфекций. Множество таких тестов приведено в настоящем описании в разделе примеров, включая в себя тесты с использованием СМУ, ВИЧ-1, К8У, вируса Коксаки В2, ЭНВУ. хантавируса, вируса парагриппа и вируса осповакцины, а также тесты на Н8У-1 и Н8У-2, описанные в примерах 1 и 2. Несмотря на высокий уровень активности, продемонстрированный для некоторых из перечисленных олигонуклеотидов, система доставки олигонуклеотидов, такая как ΌΟΤΑΡ, липофектамин или олигофектамин, может приводить к достижению значительно более высокой эффективности, особенно в случае более крупных (>40 оснований) рандомеров.
Выводы относительно широкого спектра антивирусной активности
Изучение эффективности в отношении различных вирусов показало, что случайные ОН и рандомеры проявляют ингибирующие свойства в отношении множества различных вирусов. Кроме того, данные исследования подтверждают вывод, согласно которому более крупные рандомеры проявляют повышенную эффективность по подавлению вирусов, чем более мелкие рандомеры. Указанный факт позволяет предположить наличие общего механизма активности, зависимого от размера и/или заряда, как для случайных ОН, так и рандомеров ОН, в случае всех инкапсидированных вирусов.
В то время как и Н8У, и СМУ являются вирусами семейства Негрекутбае с двухцепочечной ДНК, ВИЧ представляет собой РНК-содержащий вирус из Кейоутбае, а К8У является РНК-содержащим вирусом из Рагатухоушбае. В свете того факта, что рандомеры ОН могут ингибировать вирусную функцию у большого числа различных вирусов, то, не ограничиваясь каким-либо конкретным механизмом, следует отметить реальность следующих обсуждавшихся ранее механизмов действия: А) ОН/ОН рандомеры ингибируют вирусную инфекцию через аптамерный эффект, препятствуя вирусному слиянию с плазменной мембраной; и/или В) ОН/ОН-рандомеры препятствуют или подавляют сборку вирионов или упаковку вирусных ДНК в капсиды, что приводит к появлению дефектных вирионов; и/или С) ОН/ОН рандомеры создают препятствия для белков или других компонентов хозяйского организма, которые необходимы для сборки, и/или упаковки, и/или экспрессии гена вируса.
Потребности для достижения антивирусной активности
Поскольку рандомизированная последовательность ДНК, по всей видимости, является достаточной для вирусного ингибирования, было интересно посмотреть, может ли антивирусная активность поддерживаться без фосфоротиоатной модификации, а также, повышается ли эффективность при соответствующем выборе случайной последовательности или специфической последовательности, имеющейся в вирусном геноме.
Соответственно, были исследованы модификации ДНК и РНК с точки зрения их воздействия на антивирусную эффективность рандомеров. Поскольку рандомеры действуют через механизм, не связанный с комплементарностью последовательностей, указанные эксперименты были разработаны для выявления эффекта на антивирусную эффективность небольших изменений в конформации нуклеиновой кислоты и в распределении заряда.
Для определения того, могут ли ОДН с различными нуклеотидными/нуклеозидными модификациями ингибировать Н8У-1, были исследованы КЕР 2024, 2026, 2059 и 2060 в рамках модели снижения бляшкообразования для Н8У-1, как описано в примерах. КЕР 2024 (Р8-ОДН с 2-О-метильной модификацией связи 4 оснований с рибозой на обоих концах ОДН), КЕР 2026 (РО-ОДН с метилфосфонатными модификациями связей между 4 основаниями на обоих концах ОДН), КЕР 2059 (Р8-ОДН рандомер РНК из 20 оснований в длину) и КЕР 2060 (Р8-ОДН рандомер РНК из 30 оснований в длину) продемонстрировали анти-Н8У-1-активность (см. фиг. 11).
Относительно последнего примера следует отметить, что если бы антивирусный эффект могли вызывать только ОН, состоящие из фосфоротиоатного скелета ДНК, то такой эффект должен вызываться всего лишь одной молекулой. Но другие скелетные структуры и модификации также демонстрируют положительную антивирусную активность. Разумеется, любой специалист в данной области при использовании описания настоящего изобретения может также использовать ОН различной химической природы. Модификация ОН, такая как, без ограничения, фосфоротиоатная модификация, является, по всей видимости, благоприятной для антивирусной активности. Это, скорее всего, связано с требуемым зарядом ОН и/или потребностью в стабилизации ДНК, как в средах, так и внутри клеток, и может быть также связано с хиральными свойствами Р8-ОДН.
Соединение КЕР 2026 демонстрирует антивирусную активность, имея центральную часть, вклю
- 17 008940 чающую в себя немодифицированные РО-нуклеотиды и 4 метилфосфонатных связи на обоих концах, защищенных от деградации. Данный факт указывает на то, что РО-ОДН могут использоваться в качестве антивирусных средств, при их защите от деградации. Указанная защита может быть достигнута путем модификации нуклеотидов на концах и/или путем использования соответствующей системы доставки, описанной далее.
В основном состав последовательности используемой ДНК оказывает небольшое воздействие на общую эффективность, независимо от того, что используют рандомер, случайную последовательность или специфическую последовательность Н8У-1. Однако при использовании промежуточной длины Н8У-1-последовательность была почти в 3 раза более мощной, чем случайная последовательность (см. фиг. 10). Такого рода данные позволяют полагать, что в то время как специфическая антисмысловая функция присутствует в специфических последовательностях Н8У, механизм, не связанный с антисмысловым эффектом (механизм, не связанный с комплементарностью последовательностей), описанный в настоящем изобретении, может представлять собой подавляющую часть данной активности. В действительности, как только ОН достигает длины в 40 оснований, по существу, вся антивирусная активность может определяться эффектом, не связанным с антисмысловыми последовательностями.
Сниженная токсичность рандомера
Одной из целей использования ОН рандомера является снижение токсичности. Известно, что разные последовательности могут запускать разные ответные реакции у животных, такие как общая токсичность, взаимодействие с сывороточными белками и взаимодействие с иммунной системой (Μοηΐοίΐΐι с1 а1., (1998), Τοχίοοί. 8ск, 46: 365-375). Смесь ОН может, таким образом, снижать токсические эффекты, поскольку уровень любой конкретной последовательности будет очень низким, так что маловероятно существенное взаимодействие, определяемое последовательностью и/или нуклеотидным составом.
Фармацевтические композиции
ОН согласно изобретению могут быть представлены в виде терапевтической композиции или средства, используемых для лечения (или профилактики) вирусных заболеваний, которые разрешены регламентирующим агентством для применения на человеке или животных, отличных от человека, и/или против конкретного вируса или группы вирусов. Указанные ОН могут использоваться как часть фармацевтической композиции при объединении с физиологически и/или фармацевтически приемлемым носителем. Характеристики носителей могут определяться способом введения. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может также содержать другие активные факторы и/или средства, которые повышают активность.
Введение ОН согласно изобретению, используемых в фармацевтической композиции или средстве, или в практике осуществления способа лечения животного, может проводиться с использованием множества традиционных режимов, таких как внутриглазное введение, пероральное употребление, энтеральное введение, ингаляция или кожная, подкожная, внутримышечная, внутрибрюшинная, внутриоболочечная, интратрахеальная или внутривенная инъекция.
Фармацевтическая композиция или олигонуклеотидное средство согласно изобретению может также содержать другие химиотерапевтические средства, применяемые для лечения вирусных заболеваний, такие как, без ограничения, рифампин, рибавирин, плеконарил, цидофовир, ацикловир, пенцикловир, ганцикловир, валацикловир, фамцикловир, фоскарнет, видарабин, амантадин, занамивир, оселтамивир, ресквимод, антипротеазы, ингибиторы встраивания ВИЧ путем слияния, нуклеотидные ингибиторы ОТ ВИЧ (например, ΑΖΤ, ламивудин, абакавир), ненуклеотидные ингибиторы ОТ ВИЧ, доконозол, интерфероны, бутилированный гидрокситолуол (БГТ) и гиперицин. Такие дополнительные факторы и/или средства могут включаться в фармацевтическую композицию, например, для достижения синергического эффекта с ОН согласно изобретению.
Фармацевтическая композиция или олигонуклеотидное средство согласно изобретению может также включать в себя полимер, такой как, без ограничения, полианионные средства, сульфатированные полисахариды, гепарин, сульфат декстрана, пентозанполисульфат, сульфат поливинилового спирта, ацеманнан, полигидроксикарбоксилаты, сульфат целлюлозы, полимеры, содержащие сульфонированный бензол или нафталиновые кольца и нафталинсульфонатный полимер, ацетилфталоилцеллюлоза, поли-Ьлизин, капрат натрия, катионные амфифилы, холевая кислота. Известно, что полимеры в ряде случаев воздействуют на поступление вирионов в клетки путем связывания вирионов или адсорбции на них. Указанные свойства антивирусных полимеров могут быть полезны при конкурировании с ОН за связывание или адсорбцию на вирион, результатом чего является повышение внутриклеточной активности ОН в сравнении с их внеклеточной активностью.
Примеры системы доставки
Авторы настоящего изобретения отслеживали поступление рандомеров Р8-ОДН при добавлении к культивируемым клеткам меченных флуоресцентной меткой рандомеров и затем, после двух циклов промывки, смотрели интенсивность флуоресценции в лизированных клетках. Клеточное поглощение в клетках, подвергшихся воздействию 250 нМ КЕР 2004-РЬ, оценивают в варианте без системы доставки и после инкапсулирования в одну из приведенных ниже липидных систем доставки: липофектамин™ (Ь1
- 18 008940 роГесЮпбпе™ (ΙηνίίΓο^βη)), полифект™ (Ро1уГес1™ (Ц1адец)) и олигофектамин™ (О1щоГес1атб1е™ (Ιηνί1годсп)). Через 4 ч клетки промывают два раза РВ8 и лизируют с использованием лизирующего реагента МРЕВ (РВОМЕОЛ). На фиг. 34 показана относительная флуоресценция с использованием эквивалентного количества экспонированных клеток при наличии и в отсутствие системы доставки. Авторы обнаружили, что в присутствии трех исследованных систем доставки отмечается значительное увеличение внутриклеточной концентрации Р8-ОДН в сравнении с вариантом отсутствия системы доставки.
В свете результатов указанного тестирования следует отметить, что использование системы доставки может существенно повысить антивирусную эффективность ОН рандомеров.
Дополнительно, они могут служить для защиты указанных соединений от сывороточных взаимодействий, для снижения уровня побочных эффектов и максимизации распределения по тканям и клеткам.
Несмотря на то что Р8-ОДН отличаются большей резистентностью к эндогенным нуклеазам, чем природные фосфодиэфиры, они не полностью стабильны и медленно разрушаются в крови и тканях. Ограничением для клинического применения олигонуклеотидных препаратов на основе Р8 является их тенденция активировать комплемент при в/в введении. В основном липосомы и другие системы доставки повышают терапевтический индекс лекарственных средств, включая ОН, за счет снижения токсичности лекарственного средства, увеличения времени пребывания в плазме и доставки более активного лекарственного средства к пораженной ткани за счет экстравазации носителей через гиперпроницаемую сосудистую сеть. Более того, в случае Р8-ОДН инкапсулирование в липиды препятствует взаимодействию с потенциальными сайтами связывания белка при нахождении в кровотоке (Кйтик с1 а1., (2000), 1. Рбаттасо1. Ехр. Тбег.. 292: 480-488).
В соответствии с приведенными в данном описании результатами, авторами была разработана стратегия на основе использования системы доставки, такой как, без ограничения, липофильные молекулы, полярные липиды, липосомы, монослои, бислои, везикулы, программируемые фузогенные везикулы, мицеллы, циклодекстрины, ПЭГ, лекарственный электрофорез, порошковая инъекция и наночастицы (такие как Р1ВСА, Р1НСА, РНСА, желатин, РЕО-РЬЛ) для доставки ОН по настоящему описанию. Целью использования таких систем доставки является, в числе других, снижение токсичности активного соединения для животных и человека, повышение уровня доставки в клетки, снижение значения ИК50, увеличение длительности действия с момента доставки лекарственного средства и защита олигонуклеотидов от неспецифического связывания с сывороточными белками.
Авторы показали, что антивирусная активность Р8-ОДН рандомеров повышается с увеличением их размера. Кроме того, данная активность коррелирует с повышенным сродством к вирусным белкам (в вирусном лизате). Поскольку в данной области известно, что фосфоротиоатная модификация повышает аффинность при взаимодействии белка-ДНК, авторы исследовали способность Р8-ОДН рандомеров прогрессивно возрастающих размеров связываться с фетальной сывороткой теленка (ФСТ (ЕВ8)) (фиг. 28а) с использованием теста на основе ФП, применяемого для оценки уровня взаимодействия с вирусным лизатом. В данном тесте 250 мкг инактивированного по способу, отличному от нагревания, ФСТ подвергают реакции комплексообразования с меченым флуоресцентной меткой Р8-ОДН рандомером из 20 оснований, в условиях, при которых связывание (значение тР) достигает насыщения. Немеченые рандомеры Р8-ОДН возрастающего размера (ВЕР 2003, ВЕР 2004, ВЕР 2006 и ВЕР 2007) используют для создания конкуренции при взаимодействии ФСТ с меченой затравкой. Результаты указанного теста четко показывают, что по мере повышения размера Р8-ОДН рандомера повышается аффинность к ФСТ. Полученный результат позволяет полагать, что наиболее активными антивирусными Р8-ОДН будут те варианты, которые связываются с наивысшей аффинностью с белками.
В данной области известно, что одной из терапевтических проблем при лечении фосфоротиоатными антисмысловыми олигонуклеотидами является развитие побочных эффектов, которые определяются, прежде всего, повышенным уровнем взаимодействия с белками (конкретно с белками сыворотки), как было описано Кандималла с соавт. (Кап61та11а еί а1., (1998), Вюогд. Меб. Обет. Ьеб., 8: 2103-2108). Полученные авторами данные указывают на возможность достижения существенной пользы в случае применения подходящей системы доставки, способной доставлять антивирусные ОН в клетку и препятствующей взаимодействию с белками сыворотки.
Для демонстрации полезного эффекта данной системы доставки авторы протестировали две различных методики доставки на основе липосом: цитофектина и БОТАР. Авторы измеряли уровень доставки Р8-ОДН рандомера ВЕР 2006 (инкапсулированного с использованием цитофектина или БОТАР) в клетки 293А в присутствии высоких концентраций сыворотки (50%) при измерении внутриклеточной концентрации меченого ВЕР 2006 флуорометрией (фиг. 28Ь, с). Полученные данные показывают, что система доставки повышает внутриклеточную концентрацию ВЕР 2006 и также, в случае применения БОТАР, уровни внутриклеточного ВЕР 2006 через 24 ч заметно повышаются. Наконец, авторы измеряли уровень защиты ВЕР 2006 от взаимодействий с сывороточными белками посредством БОТАР (286) и цитофектина (28е) в тесте на взаимодействие ίη νίίτο с использованием методики ФП. Неинкапсулированный ВЕР 2006 был способен конкурировать за связывание с флуоресцентным олигонуклеотидом из сыворотки, но когда ВЕР 2006 подвергали инкапсулированию с использованием БОТАР или цитофектина, он более не был способен конкурировать за связывание с сывороткой. Приведенные данные позволя
- 19 008940 ют полагать, что инкапсулирование предотвращает взаимодействие олигонуклеотидов с сывороткой и приводит к достижению более эффективного терапевтического воздействия при снижении побочных эффектов.
Другим потенциальным преимуществом использования системы доставки является защита ОН от взаимодействий, таких как адсорбция, с инфекционными вирионами с целью предотвращения амплификации вирусной инфекции через другие механизмы, такие как повышенное проникновение вирионов в клетки.
Другим подходом является осуществление доставки, специфичной для определенных клеток, путем ассоциации системы доставки с молекулой(ами), которая(ые) будет(ут) повышать аффинность к конкретным клеткам, и такие молекулы включают в себя, без ограничения, антитела, лиганды рецепторов, витамины, гормоны и пептиды.
Другие варианты систем доставки приведены ниже.
Связанные ОДН
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данные ОН модифицируют с использованием множества способов, не затрагивая их способность ингибировать вирусную репликацию. Например, ОН подвергают связыванию или конъюгированию, по одному или более их нуклеотидных остатков, с другим фрагментом. Таким образом, модификация олигонуклеотидов согласно изобретению может включать в себя химическое связывание с олигонуклеотидом одного или более фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность, распределение по клеткам или поглощение клеткой, повышают специфический или неспецифический транспорт через клеточные мембраны, защищают от деградации или выделения или обеспечивают достижение других благоприятных характеристик. Такие благоприятные характеристики могут включать в себя, например, сниженный уровень взаимодействия с сывороткой, повышенный уровень взаимодействия с вирусным белком, способность подвергаться обработке в процессе введения в композицию для доставки, обнаруживаемый сигнал, улучшенные фармакокинетические свойства и сниженную токсичность. Такие конъюгированные группы могут ковалентно связываться с функциональными группами, такими как первичные или вторичные гидроксильные группы. Например, конъюгированные фрагменты могут включать в себя стероидную молекулу, неароматическую липофильную молекулу, пептид, холестерин, бис-холестерин, антитело, ПЭГ, белок, водорастворимый витамин, жирорастворимый витамин, другой ОН или любую другую молекулу, повышающую активность и/или биодоступность ОН.
Более детально, репрезентативные конъюгированные группы согласно изобретению могут включать в себя интеркалирующие средства, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, полиэфиры, 8АТЕ, т-бутил-8АТЕ, группы, которые усиливают фармакодинамические свойства олигомеров, и группы, которые усиливают фармакокинетические свойства олигомеров. Типичные конъюгированные группы включают в себя холестерины, липиды, фосфолипиды, биотин, феназин, фолят, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины, флуоресцентные нуклеотидные основания и красители.
Группы, которые усиливают фармакодинамические свойства, в контексте настоящего изобретения включают в себя группы, которые улучшают клеточное поглощение олигомера и/или усиливают устойчивость олигомера к разрушению и/или защищают от взаимодействия с сывороткой. Группы, которые усиливают фармакокинетические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, которые улучшают поглощение, распределение, метаболизм или выделение олигомера. Примеры конъюгатных групп описаны в заявке на Международный патент РСТ/И892/09196, зарегистрированной 23 октября 1992 года, которая включена в настоящее описание полностью в качестве ссылки.
Конъюгатные фрагменты могут включать в себя, без ограничения, липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент (ЬеЩидег е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 1989, 86, 6553-6556), холевую кислоту (Маиойагаи е! а1., Вюогд. Меб. СНет. Бе!.. 1994, 4, 1053-1060), тиоэфир, например, гексил-8тритилтиол (Маиойагаи е! а1., Апп. Ν.Υ. Асаб. 8с1., 1992, 660, 306-309; Маиойагаи е! а1., Вюогд. Меб. СНет. Ье1., 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (ОЬегйаикег е! а1., Νπο1. Ас1бк Век., 1992, 20, 533-538), алифатическую цепь, например, додекандиоловые или ундецильные остатки (8а1кои-Вейтоагак е! а1., ЕМВО 1., 1991, 10, 1111-1118; КаЬаиоу е! а1., БЕВ8 Ьей., 1990, 259, 327-330; 8утагсйик е! а1., ВюсЫт1е, 1993, 75, 49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-рацглицеро-3-Н-фосфонат триэтиламмония (МаиоБагаи е! а1., Те1гаНебгоп Ьей., 1995, 36, 3651-3654; 8Неа е! а1., №с1. Ас1бк Век., 1990, 18, 3777-3783), полиаминную или полиэтиленгликолевую цепь (Маиойагаи е! а1., №1с1еок1бек & №с1еойбек, 1995, 14, 969-973) или адамантануксусную кислоту (Маиойагаи е! а1., Те!гаНебгои Ьей., 1995, 36, 3651-3654); пальмитиловый фрагмент (М1кНга е! а1., ВюсНип. Вюрйук., Ас!а, 1995, 1264, 229-237) или октадециламиновый или гексиламинокарбонил-оксихолестериновый фрагмент (Сгооке е! а1., 1. РНагтасо1. Ехр. ТНег., 1996, 277, 923-937).
Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть также конъюгированы с активными лекарственными веществами, например, без ограничения, с аспирином, варфарином, фенилбутазоном, ибупрофеном, супрофеном, фенбуфеном, кетопрофеном, (8)-(+)-пранопрофеном, карпрофеном, дансилсаркозином, 2,3,5-трийодбензойной кислотой, флуфенамовой кислотой, фолиновой кислотой, бензотиадиазидом,
- 20 008940 хлортиазидом, диазепином, индометацином, барбитуратом, цефалоспорином, сульфанильными препаратами, антидиабетическими, антибактериальными или антибиотическими средствами.
Примеры патентов США, в которых описано получение репрезентативных олигонуклеотидных конъюгатов, включают в себя, например, патенты США № 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717; 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5113802; 5138045; 5414077; 5486603;
5512439; 5573718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335;
4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506;
5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241; 5391723; 5416203; 5451463; 5510475;5512667; 5514785;
5565552;5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки.
Другой подход включает в себя получение антивирусных ОН в виде липофильных проолигонуклеотидов за счет введения модификации, включающей энзиматически расщепляемые заряженные нейтрализующие аддукты, такие как 8-ацетилтиоэтил или 8-пивалоилтиоэтил (У|уек с1 а1., 1999, Νιιοί. Лабк Кек., 27: 4071-4076). Такие модификации, как было показано, повышают поглощение ОН в клетки.
Разработка неспецифических ОН
В рамках другого подхода получают антивирусные ОН, демонстрирующие низкую, предпочтительно минимально возможную, гомологию с геномом человека (или другого выбранного организма). Целью данного подхода является получение ОН, которые будут иметь наименьшую токсичность, которая определяется взаимодействием с одной или более последовательностями генома человека или животного и соответствующими мРНК. Первой стадией является получение последовательности ОН желательной длины, например, путем выстраивания нуклеотидов А, С, С, Т в случайном порядке вручную или, чаще всего, с использованием компьютерной программы. Второй стадией является сравнение последовательности данного ОН с соответствующей информацией из библиотеки последовательностей человека, такой как ГенБанк (СепВапк) и/или база данных по сборке человеческого генома (ЕпкетЬ1е Нитап Се поте Эа1аЬаке). Восстановление и сравнение последовательностей, при желательности, может проводиться многократно для идентификации последовательности или последовательностей, имеющих заданный низкий уровень гомологии с целевым геномом. В желательном варианте последовательность ОН имеет наименьший возможный уровень гомологии с полным геномом, при этом предпочтительно минимизируется процесс аутовзаимодействия.
Неспецифические ОН с активностью, определяемой антисмысловой последовательностью
В рамках другого подхода часть(и) антивирусной неспецифической последовательности связывают с частью(ями) антисмысловой последовательности для повышения активности конечного ОН. Неспецифическая часть ОН описывается в настоящем изобретении. Антисмысловая часть является комплементарной к вирусной мРНК.
Неспецифические ОН с активностью С-обогащенного мотива
В рамках другого подхода часть(и) антивирусной неспецифической последовательности связывают с частью(ями) мотива для повышения активности конечного ОН. Неспецифическая часть ОН описана в настоящем изобретении. Часть мотива может, в качестве не ограничивающего примера, включать СрС, С-квартет и/или СС, которые описаны в литературе как стимуляторы иммунной системы (Адгага1 е1 а1., (2001), Сигг. Сапсег Эгид ТагдеК 3: 197-209).
ОН, не соответствующие модели Уотсона-Крика
Другой подход включает использование ОН, состоящих из одного типа или более типов не канонических нуклеотидов/нуклеозидов, то есть не соответствующих модели Уотсона-Крика. Такие ОН могут имитировать Р8-ОДН, демонстрируя некоторые общие характеристики, близкие к Р8-ОДН: а) суммарный заряд; Ь) наличие пространства между единицами; с) длина, цепи; б) образование результирующего диполя с накоплением отрицательного заряда на одной стороне; е) способность связываться с белками; ί) способность связываться с вирусными белками; д) способность проникать в клетки; й) приемлемый терапевтический индекс; ί) антивирусная активность. Данные ОН имеют предпочтительный фосфоротиоатный скелет, но не ограничиваются указанными рамками. Примеры нуклеотидов/нуклеозидов, не соответствующих модели Уотсона-Крика, описаны в работах Кула и Такешита с соавт. (Коо1, 2002, Асс. Сйет. Кек., 35: 936-943; и Такекйба е1 а1., (1987), 1. Βίο1. Сйет., 262: 10171-10179), где описаны ОДН, содержащие синтетические неосновные сайты.
Антивирусный полимер
Другой подход включает в себя использование полимера, имитирующего активность фосфоротиоатных ОДН. Как описано в литературе, несколько анионных полимеров обладают антивирусной ингибирующей активностью. Указанные полимеры принадлежат к нескольким классам:
(1) сложные сульфатные эфиры полисахаридов (сульфаты декстрина и декстрана; сульфат целлюлозы);
(2) полимеры, содержащие сульфонированные бензольные или нафталиновые кольца или полимеры нафталинсульфоната;
(3) поликарбоксилаты (полимеры акриловой кислоты); и ацетилфталоилцеллюлоза (№игаШ е1 а1., (2002), ВМС 1п1'ес1 Όίκ 2: 27); и
- 21 008940 (4) неосновные олигонуклеотиды (ТакекЬйа е! а1., (1987), 1. Вю1. Скет., 262: 10171-10179).
Другие примеры ненуклеотидных антивирусных полимеров описаны в литературе. Приведенные в настоящем описании полимеры включают в себя имитирующие Р8-ОДН, которые имеют следующие свойства, близкие к Р8-ОДН: а) длина цепи; Ь) образование результирующего диполя с накоплением отрицательного заряда на одной стороне; с) способность связываться с белками; б) способность связываться с вирусными белками; е) приемлемый терапевтический индекс; ί) антивирусная активность. Для целей имитации эффекта Р8-ОДН антивирусный полимер может предпочтительно представлять собой полианион, имеющий аналогичное пространство между своими единицами, как и в случае Р8-ОДН. Он также может обладать способностью проникать в клетки, один или в сочетании с системой доставки.
Антивирусная активность двухцепочечных Р8-ОДН
Случайную последовательность (КЕР 2017) и комплементарную ей последовательность (Р8модифицированную или немодифицированную) подвергают флуоресцентному мечению, как описано в литературе, и исследуют на ее способность связываться с очищенными белками Н8У-1 и ВИЧ-1 по методу флуоресцентной поляризации, описанному в настоящем изобретении. Наличие гибридизации подтверждают электрофорезом в акриламидном геле. Немодифицированный КЕР 2017 (2017И), либо одноцепочечный (кк), либо двухцепочечный (бк), не обладает связывающей активностью ни с Н8У-1, ни с ВИЧ-1 лизатами. Однако Р8-модифицированный КЕР 2017 либо одноцепочечный, либо двухцепочечный, способен к взаимодействию с Н8У-1 и ВИЧ-1 (см. фиг. 33).
В соответствии с приведенными в настоящем описании результатами, выбранный авторами подход основан на использовании двухцепочечных ОН в качестве эффективных антивирусных средств. Преимущественно такие ОН имеют фосфоротиоатный скелет, но могут также иметь другие и/или дополнительные модификации, которые повышают их доставку, и/или антивирусную активность, и/или стабильность, как описано здесь в отношении одноцепочечных ОН.
Тест ίη У1!го на обнаружение лекарственного средства
Разработан тест ίη У1!го на основе флуоресцентной поляризации, который используется для измерения способности Р8-ОДН связываться с вирусными компонентами, например, с вирусными белками. В том случае, когда белок (или другой взаимодействующий агент) связывается с флуоресцентно меченой затравкой, трехмерный процессинг затравки в растворе задерживается. Указанную задержку измеряют по усилению поляризации возбужденного света от меченой затравки. Таким образом, увеличенная поляризация (обозначаемая в виде безразмерного параметра [тР]) коррелирует с повышением уровня связывания.
Одна методика включает в себя использование в качестве затравки Р8-ОДН рандомера, меченого по 3'-концу с помощью Е1ТС при использовании негибкого линкера (3'-(6-флуоресцеин) СРС). Указанный Р8-ОДН рандомер разбавляют до 2 нМ буфером для тестирования (10 мМ Трис, рН 7,2, 80 мМ ЫаС1, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ Ь-меркаптоэтанол и 1% Твин 20). Затем указанный олигонуклеотид смешивают с соответствующим взаимодействующим агентом. В данном случае авторы используют очищенные в градиенте сахарозы лизаты Н8У-1 (штамм Мас1п!уге), ВИЧ-1 (штамм Мп) или К8У (штамм А2), суспендированные в 0,5 М КС1 и 0,5% Тритон-Х-100 (Н8У-1 и ВИЧ-1) или 10 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ ЫаС1, 1 мМ ЭДТА, 0,1 % Тритон-Х-100 (К8У). После взаимодействия с затравкой проводят провокацию комплексов различными немечеными Р8-ОДН для оценки их способности замещать затравку в комплексе.
На фиг. 29 авторами показаны результаты предварительного теста, проведенного с тремя затравками разного размера: 6 (КЕР 2032-ЕЬ), 10 (КЕР 2003-ЕЬ) и 20 оснований (КЕР 2004-ЕЬ). Указанные варианты затравки исследуют на их способность взаимодействовать с лизатами Н8У-1 (фиг. 29а), ВИЧ-1 (фиг. 29Ь) и К8У (фиг. 29с). В присутствии любого из вирусных лизатов степень связывания зависит от размера использованной затравки, при этом вариант 2004-ЕЬ демонстрировал наибольший сдвиг в единицах тР (указывающий на связывание) в присутствии вирусного лизата. Авторы отмечают, что указанный результат соответствует антивирусной эффективности рандомеров Р8-ОДН, реализуемой по механизму, зависимому от их размера. Указанную затравку далее используют для оценки способности Р8ОДН разных размеров создавать конкуренцию в процессе взаимодействия затравки с лизатом.
На фиг. 30 показан результат провокации в ходе взаимодействия КЕР 2004-ЕЬ с лизатами Н8У-1 (фиг. 30а), ВИЧ-1 (фиг. 30Ь) и К8У (фиг. 30с) с использованием Р8-ОДН повышающихся размеров. В случае каждого исследуемого вирусного лизата авторы отмечали, что КЕР 2003 был не способен конкурировать с затравкой в лизате. Взаимодействие с затравкой было очень сильным, на что указывает относительно слабая конкуренция, проявляемая в присутствии конкурентного препарата КЕР 2004 (немеченая затравка). Однако было показано, что при повышении размера конкурентного Р8-ОДН свыше 20 оснований, его способность к замещению затравки становится более сильной. Данные результаты указывают на повышение аффинности к белковым компонентам в вирусном лизате по мере повышения размера Р8-ОДН рандомера. Указанное явление отражает повышенную антивирусную активность более крупных рандомеров Р8-ОДН против Н8У-1, Н8У-2, СМУ, ВИЧ-1 и К8У.
Сходство между эффективностью по конкурированию с затравкой и антивирусной активностью Р8ОДН рандомеров указывает на то, что механизм, лежащий в основе данного теста, является хорошим прогностическим фактором для антивирусной активности. Данный тест является жестким, легко выпол
- 22 008940 няемым и очень стабильным, что делает его хорошим возможным вариантом для использования в крупномасштабных скринингах, осуществляемых с целью идентификации новых антивирусных молекул, основанных не на идентификации их специфической мишени, но на их способности взаимодействовать с одним или более компонентами, например, с вирусными белками.
Приведенную в настоящем описании методику используют для скрининга новых соединений, полученных из желательного источника, например из библиотеки, синтезированной методами комбинаторной химии, или выделенных путем очистки из природных веществ. Указанный способ может использоваться для а) определения соответствующего размера, наличия модификаций и структуры скелетов новых ОН; Ь) тестирования новых молекул, включающих новые полимеры; с) прогнозирования чувствительности конкретного вируса к новым ОН или другим новым соединениям; или б) определения соответствующего варианта соединений, подходящего для максимального ингибирования конкретного вируса.
Факт повышения аффинности лизата при увеличении размеров Р8-ОДН рандомеров позволяет полагать, что механизм антивирусного действия Р8-ОДН рандомеров основан на взаимодействии с одним или более вирусными белковыми компонентами, которые препятствуют либо инфекции, либо корректной репликации вирионов. Указанный эффект также позволяет предположить, что данное взаимодействие зависит от заряда (размера) и не зависит от последовательности. Поскольку указанные Р8-ОДН рандомеры обладают активностью, зависимой от размера, и данный механизм охватывает множество вирусов в разных семействах, авторы полагают, что Р8-ОДН рандомеры препятствуют осуществлению обычных, зависимых от заряда взаимодействий по типу белок-белок, взаимодействий по типу белокДНК/РНК и/или других взаимодействий по типу молекула-молекула. Указанные взаимодействия могут включать в себя (но не ограничиваются приведенным перечнем):
a. Взаимодействие между отдельными субъединицами капсида в ходе образования капсида.
b. Взаимодействие между белком капсида/нуклеокапсида и вирусным геномом.
c. Взаимодействие между капсидом и гликопротеинами в ходе бадинга.
б. Взаимодействие между гликопротеином и его рецептором в процессе инфекции.
е. Взаимодействие между другими ключевыми компонентами вируса, участвующими в вирусной репликации.
Указанные множественные, осуществляемые одновременно процессы ингибирования взаимодействий по типу белок-белок отражают новый механизм ингибирования вирусов.
Влияние состава последовательности Р8-ОДН на лизат
Авторы отслеживают способность разных последовательностей Р8-ОДН взаимодействовать с несколькими вирусными лизатами. В каждом случае Р8-ОДН из 20 остатков подвергают мечению по 3'концу с помощью Р1ТС, как было описано выше. Исследуемые Р8-ОДН состоят из А20, Т20, О20, С20, АС10, АО10, ТС10, ТО10, КЕР 2004 и КЕР 2017. Каждую из указанных последовательностей разбавляют до 4 нМ в буфере для анализа и инкубируют в присутствии 1 мкг лизата Ηδν-1, ВИЧ-1 или Κδν. Взаимодействие измеряют по методу флуоресцентной поляризации.
Профиль взаимодействия с исследуемыми последовательностями аналогичен для всех вирусных лизатов, указывая на то, что природа связывающего взаимодействия очень схожа во всех вариантах. В случае каждого лизата Р8-ОДН одинакового состава (А20, О20, Т20, С20) оказывались самыми слабыми по взаимодействию вариантами с А20, будучи наиболее слабыми по взаимодействию вариантами указанных компонентов с выраженной границей действия. Относительно остальных исследованных Р8-ОДН было показано, что все они проявляют аналогичное сильное взаимодействие, за исключением ТО10, который неизменно демонстрировал наивысший уровень взаимодействия с каждым из лизатов (см. фиг. 35).
Идентификация мишеней для Р8-ОДН рандомеров в ВИЧ-1
Способность Р8-ОДН рандомеров связываться с очищенными белками ВИЧ-1 исследуют методом флуоресцентной поляризации, как описано в примере 9. Возрастающие количества очищенного ВИЧ-1 р24 или очищенного ВИЧ-1 др41 подвергают реакции с КЕР 2004-РЬ (см. фиг. 31). Относительно обоих белков авторы отмечают, что имеется зависимое от концентрации белка изменение уровня флуоресцентной поляризации, указывающее на наличие взаимодействия с обоими указанными белками.
Способность Р8-ОДН рандомеров с размерами в определенном диапазоне связываться с указанными белками была также исследована с использованием флуоресцентных вариантов КЕР 2032, КЕР 2003, КЕР 2004, КЕР 2006 и КЕР 2007 (см. фиг. 32). Авторы обнаружили, что в случае р24 отсутствует зависимое от размера взаимодействие с р24 (см. фиг. 32а), однако, было обнаружено увеличение в связывании с др41 в случае тех Р8-ОДН рандомеров, размер которых превышал 20 оснований, в сравнении с теми, размер которых меньше 20 оснований (см. фиг. 32Ь). Указанный результат позволяет полагать, что при повышении размера Р8-ОДН рандомера свыше 20 оснований, с индивидуальными рандомерами может связываться множество копий др41, что усиливает их поляризацию.
Указанный результат представляет собой весьма важное наблюдение, поскольку демонстрирует потенциал более крупных ОН по секвестрации структурных белков в ходе вирусного синтеза и, соответственно, по ограничению их доступности для формирования новых вирионов.
- 23 008940
Олигонуклеотиды с высокой аффинностью
Другой подход представляет собой способ обогащения или очистки с получением антивирусного(ых) ОН, обладающего(их) большей аффинностью к вирусным компонентам, таким как вирусные белки, чем средняя аффинность ОН в исходном пуле ОН. Таким образом, данный способ позволяет получать один или более ОН, не зависящих от комплементарности последовательностей, которые будут проявлять повышенную аффинность к одному или более вирусным компонентам, т. е. будут обладать трехмерной формой, соответствующей такой повышенной аффинности связывания. Принципом такого подхода является понимание того, что поскольку ОН действуют как линейные молекулы в процессе связывания с вирусными компонентами, они могут также сворачиваться с образованием трехмерной формы, которая может усиливать взаимодействие с такими вирусными компонентами. При этом, без ограничения какойлибо конкретной методикой, следует отметить, что ОН с высокой аффинностью могут быть очищены или обогащены приведенными ниже способами.
Одним из методов очистки высокоаффинного ОН или множества высокоаффинных ОН является метод, включающий в себя использование среды стационарной фазы со связанным(ыми) вирусным(ыми) белком(ами) в качестве аффинной матрицы, функционирующей по связыванию с ОН, которые могут быть далее подвергнуты элюции в условиях повышающейся жесткости, (например, при повышении концентрации соли или другого хаотропного агента и/или при повышении температуры и/или при изменении значения рН). Такая методика может быть, например, осуществлена путем:
a) внесения пула ОН на ионообменную колонку, содержащую вирусный белок или несколько вирусных белков или вирусный лизат, в связанном со стационарной фазой состоянии;
b) замещения (элюции) связанных ОН из колонки, например, при использовании замещающего раствора, такого как раствор с повышенной концентрацией соли;
c) сбора фракций ОН, элюированных при разной концентрации соли;
б) клонирования и секвенирования элюированных ОН из разных фракций, более предпочтительно из фракции(ий), элюированной(ых) при высокой концентрации соли, так что ОН, элюированные при высокой концентрации соли, будут обладать большей аффинностью по связыванию с вирусным(ыми) белком(ами); и
е) тестирования активности секвенированного(ых) ОН, в рамках таких тестов, как тест на связывание и/или вирусное ингибирование, например, с помощью теста на поляризацию-связывание по флуоресцентному методу, приведенного в настоящем описании, и/или теста на ингибирование вируса в клетке, и/или теста на ингибирование вируса в организме животного.
Во втором примере описан метод, основанный и далее модифицированный с использованием в качестве исходной методики БЕЬЕХ (Моглк е1 а1., (1998), ВюсНетМгу. 95: 2902-2907), применяемый для очистки высокоаффинного ОН. Один из вариантов осуществления такого метода может включать в себя:
(a) получение исходного материала из пула ОН, например, сбор синтезированных случайных ОН, содержащих большое число последовательностей, например, от ста триллионов (1014) до десяти квадриллионов (1016) разных последовательностей. Каждая молекула ОН содержит сегмент случайной последовательности, фланкированный на каждом конце праймер-связанными последовательностями для облегчения осуществления полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР). Поскольку нуклеотидные последовательности, по существу, всех молекул являются уникальными, в популяции представлено огромное число структур. Указанные структуры определяют биохимические свойства каждой молекулы, такие как способность связываться с данной вирусной молекулой-мишенью;
(b) приведение ОН в контакт с вирусным белком, или с несколькими вирусными белками, или с вирусным лизатом;
(c) отбор ОН, которые связываются с вирусным(ыми) белком(ами) в рамках одной или более методик распределения, которые позволяют распределять связанные и несвязанные ОН, на основе таких показателей, как сдвиги в нативном геле и фильтрование через нитроцеллюлозу. Любой из указанных методов позволяет физически отделить связанные виды от несвязанных видов, что приводит к преимущественному восстановлению тех последовательностей, которые связаны наилучшим образом. Кроме того, для отбора ОН, которые связываются с небольшим белком, желательно присоединить мишень к твердой подложке и использовать такую подложку в качестве матрицы для аффинной очистки. Те молекулы, которые не связываются, вымываются, а связанные молекулы элюируются в случае использования свободных молекул-мишеней, что вновь позволяет физически отделить связанные и несвязанные виды;
(б) амплификацию элюированных связанных ОН, например, с использованием ПЦР, включающей применение праймеров, гибридизирующихся с обеими фланкирующими последовательностями ОН;
(е) стадии (Ь), (с) и (б) могут проводиться много раз (например, могут быть выполнены множественные циклы или раунды обогащения и амплификации) с целью преимущественного восстановления тех ОН, которые проявляют наивысшую аффинность связывания с вирусным(ыми) белком(ами). После нескольких циклов обогащения и амплификации в популяции преобладают последовательности, которые проявляют желательное биохимическое свойство;
(!) клонирование и секвенирование одного или более ОН, выбранных из варианта, полученного в цикле обогащения (например, последнего такого цикла); и
- 24 008940 (д) тестирование наличия связывания и/или активности секвенированных ОН в тестах, например, в рамках теста на связывание по методу флуоресцентной поляризации, приведенному в настоящем описании, и/или теста на подавление вируса в клетках, и/или теста на подавление вируса в организме животного.
Другой подход основан на внесении модификации в методику синтеза путем расщепления для создания библиотек, построенных на принципе один шарик - один - Р8-ОДН и один шарик - один - Р82ОДН, в соответствии с работой Янга с соавт. (Уапд е! а1., (2002), Ыис1. Ас1бк Кек., 30(е132): 1-8). При этом проводится связывание специфических шариков с вирусными белками с последующим отбором. Секвенирование и по основаниям нуклеиновой кислоты, и по положениям любой тиоатной/дитиоатной связи может быть осуществлено с использованием методики ПЦР для идентификации !ад-метки в выбранных шариках. Данный подход позволяет провести быструю и удобную идентификацию Р8-ОДН или Р82-ОДН, которые связываются с вирусными белками и которые демонстрируют мощные антивирусные свойства.
Как только определяются специфические последовательности, которые связываются с вирусными белками с высокой аффинностью (например, путем амплификации и секвенирования индивидуальных последовательностей), то одна или более таких высокоаффинных последовательностей могут быть отобраны и синтезированы (например, путем химического или ферментативного синтеза) для получения препарата высокоаффинных ОН, которые могут быть далее модифицированы с целью усиления их активности, включая улучшение их фармакокинетических свойств. Такие высокоаффинные ОН могут быть использованы в рамках настоящего изобретения.
Заболевания приона
Другой подход используют в альтернативном варианте осуществления изобретения для лечения, контроля прогрессирования или предупреждения заболевания приона. Указанное смертельное нейродегенеративное заболевание является инфекционным и может поражать и людей, и животных. Считается, что структурные изменения в клеточном белке прионе РгРС в его расщепленную изоформу РгР8С является обязательной стадией возникновения и распространения заболевания приона. Амилоидные полимеры ассоциированы с невропатологией указанного заболевания приона.
Инкубация белкового фрагмента приона и двухцепочечной нуклеиновой кислоты приводит к образованию амилоидных волокон (Ыапб1 е! а1., (2002), 1. Мо1. Вю1., 322: 153-161). ОН, обладающие аффинностью к белкам, таким как фосфоротиоаты, используют для конкуренции или ингибирования взаимодействия двухцепочечной нуклеиновой кислоты с РгРС и, следовательно, для остановки образования амилоидных полимеров. Такие ОН разных размеров и разного состава могут использоваться в соответствующей форме для доставки при лечении пациентов, страдающих от заболевания приона, или с целью профилактики в тех ситуациях, когда имеется высокий риск развития данного заболевания. Такие останавливающие ОН могут быть идентифицированы путем оценки изменений в свернутой структуре амилоидной полимеразы, как описано в работе Нанди с соавт. (Ναηάί е! а1., кирга), в присутствии исследуемых ОН.
Заболевания предположительно вирусной этиологии
Другой подход используют в другом варианте осуществления настоящего изобретения для лечения или профилактики заболеваний или состояний, предположительно вирусной этиологии, как описано, в неограничивающем варианте, в приведенных ниже примерах. Вирусы являются вероятными причинными агентами многих заболеваний и состояний, которые не относятся к первичной вирусной инфекции. Так, например, артрит ассоциирован с НСУ (О1Меп е! а1., (2003), Кйеит. Όίκ. С1т. ΝοΠίι. Ат., 29: 111122), с парвовирусом В19, ВИЧ, Н8У, СМУ, ЕВУ и νζν (8!ай1 е! а1., (2000), Сйп. Кйеита!о1., 19: 281286). Были идентифицированы также другие вирусы, которые играют определенную роль в различных заболеваниях. Так, например, вирус гриппа А играет определенную роль в болезни Паркинсона (Такайакй1 е! а1., (1999), 1рп. 1. 1пГес1. Όίκ., 52: 89-98), коронавирус, ЕВУ и другие вирусы - в развитии рассеянного склероза (Та1йо! е! а1., (2001), Сигг. Тор. Мюгойюй 1ттипо1., 253: 247-71); ЕВУ, СМУ и Н8У-6 - в развитии синдрома хронической усталости (Ъегпег е! а1., (2002), Цгидк Тобау, 38: 549-561); парамиксовирусы - в развитии астмы (\Уа11ег е! а1., (2002), I. Сйп. 1пуек1.. 110: 165-175) и болезни Педжета; а НВУ, Н8У и вирус гриппа - в развитии синдрома Гийена-Барре.
В связи с указанной этиологией, подавление релевантного вируса, согласно настоящему изобретению, может задерживать, замедлять или препятствовать развитию соответствующего заболевания или состояния, или по меньшей мере некоторых симптомов такого заболевания.
Модификации олигонуклеотидов и их синтез
Как указывалось выше в разделе Краткое описание сущности изобретения, в настоящем изобретении используются модифицированные олигонуклеотиды. Такие модифицированные олигонуклеотиды включают в себя, например, олигонуклеотиды, содержащие модифицированный скелет или неприродные внутринуклеозидные связи. Олигонуклеотиды, обладающие модифицированным скелетом, включают в себя такие олигонуклеотиды, которые содержат атом фосфора в своем скелете и те, которые в скелете не содержат атома фосфора.
Такие модифицированные олигонуклеотидные скелеты включают в себя, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, ме
- 25 008940 тильные и другие алкильные фосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты, 5'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры, селенофосфаты, карборанилфосфат и боранофосфаты, содержащие нормальные 3'-5'-связи, их 2'-5'-связанные аналоги, и такие соединения, которые включают инвертированную полярность, где одна или более внутринуклеотидных связей представляют собой 3'-3', 5'-5', 2'-2'-связь. Олигонуклеотиды, содержащие инвертированную полярность, в типичном случае включают одну 3'-3'-связь на 3'-удаленной связке, т.е. один инвертированный нуклеозидный остаток, который может быть неосновным (нуклеотидное основание отсутствует или вместо него содержится гидроксильная группа). Включаются также различные соли, смешанные соли и свободные кислотные формы.
Получение указанных выше олигонуклеотидов с фосфорсодержащими связями описано, например, в патентах США № 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361; 5194599; 5565555; 5527899; 5721218; 5672697 и 5625050, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки.
Некоторые репрезентативные олигонуклеотиды с модифицированным скелетом, который не включает в себя атом фосфора, содержат скелет, образованный посредством короткоцепочечных алкильных или циклоалкильных внутринуклеозидных связей или смешанных гетероатомных и алкильных или циклоалкильных внутринуклеозидных связей или одной или более короткоцепочечных гетероатомных или гетероциклических внутринуклеозидных связей. Указанные скелеты включают в себя такие, которые содержат морфолино-связи (образованные частично за счет сахарной части нуклеозида); силоксановые скелеты; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые скелеты; формацетильные и тиоформацетильные скелеты; метиленформацетильные и тиоформацетильные скелеты; рибоацетильные скелеты; алкенсодержащие скелеты; сульфаматные скелеты; метиленимино и метиленгидразино скелеты; сульфонатные и сульфонамидные скелеты; амидные скелеты и другие, содержащие смешанные Ν, О, 8 и СН2 компоненты в качестве их частей. Особенно полезными в данном контексте являются скелетные связи, которые включают в себя один или более заряженных фрагментов. Примеры патентов США, описывающих получение указанных выше олигонуклеотидов, включают в себя патенты США № 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; 5792608; 5646269 и 5677439, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки.
Модифицированные олигонуклеотиды могут также содержать один или более замещенных сахарных фрагментов. Например, такие олигонуклеотиды могут содержать одну или более из приведенных ниже 2'-модификаций: ОН; Ε; О-, 8- или Ν-алкил; О-, 8- или Ν-алкенил; О-, 8- или Ν-алкинил; или Оалкил-О-алкил, где алкил, алкенил или алкинил могут представлять собой замещенные или незамещенные С1-С10алкил или С2-С30алкенил и -алкинил или 2'-О-(О-карборан-1-ил)метил. Конкретные примеры включают в себя О[(СН2)пО]тСН3, О(СН2)~ОСН3, О(СН2)п1ЧН2, О(СН2)ПСН3, О(С11;)..О\112 и О(СН2)пОН((СН2)пСН3)]2, где η и т равны от 1 до 10. Другие репрезентативные олигонуклеотиды содержат одну из приведенных ниже 2'-модификаций: С3-С30низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, 8Н, 8СН3, ОСН С1, Вг, СН СЕ3, ОСЕ3, 8ОСН3, 8О2СН3, ОNО2, NО2, Ν3, ΝΉ2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, репортерную группу, интеркалирующий агент, группу, используемую для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида, или группу, используемую для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида. Соответствующие примеры включают в себя 2'метоксиэтокси (2'-О-СН2СН2ОСН3 также известную как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Магйп е! а1., Ней. СЫт. Лс1а. 1995, 78, 486-504), например, алкоксиалкоксигруппу; 2'-диметиламинооксиэтокси, например, О(СН2)2ОНСН3)2 группу, также известную как 2'-ЭМЛОЕ, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известную как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-ЭМЛЕОЕ), например, 2'-О-СН2-О-СН2ИСН)2.
Другие модификации включают в себя замкнутые нуклеиновые кислоты (ΕΝΛ), в которых 2'гидроксильная группа присоединена к 3'- или 4'-атому углерода в сахарном кольце, образуя при этом бициклический сахарный фрагмент. Указанная связь может представлять собой метиленовую (-СН2-)группу, соединяющую мостиковой связью 2'-атом кислорода и 4'-атом углерода, где η равно 1 или 2. ΕΝΆ и способы их получения описаны в УО 93/39352 и УО 99/14226, которые включены в настоящее описание полностью в качестве ссылки.
Другие модификации включают в себя модификации мостиковой связи сера-азот, такие как в закрытых нуклеиновых кислотах, описанные в работе Орума с соавт. (Огит е! а1., (2001), Сигг. Орт. Мо1. ТЬег., 3: 239-243).
Другие модификации включают в себя 2'-метокси (2'-О-СН3), 2'-метоксиэтил (2'-О-СН2-СН3), 2'аминопропокси (2'-ОСН2СН2СН2МН2), 2'-аллил (2'-СН2-СН=СН2), 2'-О-аллил (2'-О-СН2-СН=СН2) и 2'фтор (2'-Ε). 2'-Модификация может быть в арабино (верхнем) положении или в рибо (нижнем) положе
- 26 008940 нии. Аналогичные модификации могут быть также введены в другие положения олигонуклеотида, в особенности в 3'-положение сахарного фрагмента на 3'-терминальном нуклеотиде или в 2'-5'-соединенных олигонуклеотидах и в 5'-положение 5'-терминального нуклеотида. Олигонуклеотиды могут также содержать сахарные миметики, такие как циклобутильные фрагменты, вместо пентофуранозильного сахара. Примеры патентов США, в которых описано получение таких модифицированных сахарных структур, включают в себя, например, патенты США № 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; 5792747 и 5700920, каждый из которых включен в настоящее описание полностью в качестве ссылки.
Еще другие модификации включают в себя ОН конкатемер, состоящий из множества олигонуклеотидных последовательностей, присоединенных с помощью линкера(ов). Линкер может, например, состоять из модифицированных нуклеотидных или ненуклеотидных единиц. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения линкер обеспечивает гибкость ОН конкатемеру. Использование таких ОН конкатемеров может обеспечить простой способ синтеза конечной молекулы путем объединения более мелких строительных блоков из олигонуклеотидов с получением продукта желательной длины. Например, может использоваться 12-углеродный линкер (С12 фосфорамидит) для объединения двух или более ОН конкатемеров и обеспечивать достижение определенной длины, стабильности и гибкости.
В контексте настоящего описания термин немодифицированные или природные основания (нуклеотидные основания) включает в себя пуриновые основания: аденин (А) и гуанин (С), и пиримидиновые основания: тимин (Т), цитозин (С) и урацил (И). Олигонуклеотиды могут также включать в себя модификации или замещения в основании. Модифицированные основания включают другие синтетические и природные основания, такие как 5-метилцитозин (5-те-С; 5-МЦ), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2пропильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2тиоцитозин, 5-галогенурацил и -цитозин, 5-пропинил(-С^С-СН3)урацил и -цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиоловые, 8-тиоалкильные, 8-гидроксильные и другие 8замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в особенности 5-бром-, 5-трифторметильные и другие 5замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-Б-аденин, 2-аминоаденин, 8азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные модифицированные основания включают в себя трициклические пиримидины, такие как феноксазинцитидин (1Н-пиримидо[5,4-Ь][1,4]бензоксазин-2(3Н)-он), фенотиазинцитидин (1Н-пиримидо[5,4Ь][1,4]бензотиазин-2(3Н)-он), С-замкнутые структуры, такие как замещенный феноксазинцитидин (например, 9-(2-аминоэтокси)-Н-пиримидо[5,4-Ь][1,4]бензоксазин-2(3Н)-он), карбазолцитидин (2Нпиримидо[4,5-Ь]индол-2-он), пиридоиндолцитидин (Н-пиридо[3',2':4,5]пирроло[2,3-б]пиримидин-2-он). Модифицированные основания могут также включать в себя такие основания, в которых пуриновое или пиримидиновое основание замещено другими гетероциклами, например, 7-деазааденином, 7деазагуанозином, 2-аминопиридином и 2-пиридоном. Другие нуклеотидные основания включают в себя основания, описанные в патенте США № 3687808, а также в литературе (ТИе Сопс1ке Епсус1ореб1а О£ Ро1утег 8с1епсе Апб ЕпдшееЕпд, радек 858-859, КгоксШуЦх. II., еб. ШЕп \νίΕ\· & 8опк, 1990, а также в работе ЕпдНксИ е! а1., Апде^апб!е СИет1е, 1п!егпа!юпа1 Ебйюп, 1991, 30, 613, и основания, раскрытые в работе 8апдИу1, Υ.8., СИар!ег 15, АпЕкепке ВекеагсИ апб АррЕсаЕопк, радек 289-302, Сгооке, 8.Т. апб ЬеЬ1еи, В., еб., СВС Ргекк, 1993).
Другая модификация включает в себя фосфородитиоатные связи. Поскольку известно, что фосфородитиоатные ОДН (Р82-ОДН) и Р8-ОДН имеют близкую аффинность связывания с белками (Топкшкоп е! а1., (1994), АпЕкепке Век. Оеу., 4: 269-278; СИепд е! а1., (1997), 1. Мо1. Весодп., 10: 101-107) и поскольку известно, что возможным механизмом действия ОДН является связывание с вирусными белками, может быть желательно включать в себя фосфородитиоатные связи в антивирусные ОДН, описанные в настоящем изобретении.
Другой подход, используемый для модификации ОДН, связан с получением ОДН со структурой заданной или обогащенной соответствующей стереохимии, описанных, например, в публикации Υυ е! а1., (2000), Вюогд. Меб. СИет., 8: 275-284 и в публикации 1пада^а е! а1., (2002), БЕВ8 Ье!!., 25: 48-52. ОДН, полученные традиционными методами, состоят из смеси диастереомеров, образуемых за счет асимметрии вокруг атома фосфора, входящего во внутринуклеотидную связь. Данный эффект может влиять на стабильность связывания между ОДН и вирусными компонентами, такими как вирусные белки. Полученные ранее данные показывают, что связывание с белком в существенной мере зависит от стереохимии (Υυ е! а1.). Таким образом, с использованием ОДН со структурой заданной или обогащенной соответствующей стереохимии можно улучшить их способность к связыванию с белком и повысить антивирусную эффективность.
Включение модификаций, таких как описанные выше, может быть использовано во многих вариантах разного рода включения и уровня. Иными словами, не обязательно, чтобы конкретная модификация включалась в каждый нуклеотид или каждую связь в олигонуклеотиде, тогда как в одном олигонуклео
- 27 008940 тиде или даже в одном единственном олигонуклеотиде могут использоваться в сочетании разные модификации.
Синтез олигонуклеотидов
Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть синтезированы с использованием известных в данной области методик. Например, незамещенные и замещенные олигонуклеотиды с фосфодиэфирной связью (Р=О) могут быть синтезированы с использованием автоматизированного синтезатора ДНК (например, Лррйеб В1О8у8!ет8, модель 380В) стандартными методами фосфорамидитной химии при окислении йодом. Фосфоротиоаты (Р=8) могут быть синтезированы по методике получения фосфодиэфирных олигонуклеотидов, за исключением того, что используемые для окисления стандартные флаконы заменяют 0,2М раствором 1,1-диоксида 311-1,2-бензодитиол-3-она в ацетонитриле в рамках двухступенчатого процесса тиоатирования фосфитных связей. Стадия тиоатирования может быть продлена до 68 с, и далее за ней следует стадия кэппирования. После выщепления из колонки СРС и деблокирования с использованием концентрированного гидроксида аммония при 55°С (18 ч) олигонуклеотиды могут быть подвергнуты очистке путем двукратного осаждения 2,5 объемами этанола из 0,5М раствора №С1.
Фосфинатные олигонуклеотиды могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в патенте США № 5508270; алкилфосфонатные олигонуклеотиды могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в патенте США № 4469863; 3'-дезокси-3'-метиленфосфонатные олигонуклеотиды могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в патентах США № 5610289 и 5625050; фосфорамидитные олигонуклеотиды могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в патентах США № 5256775 и 5366878; алкилфосфонотиоатные олигонуклеотиды могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в опубликованных РСТ заявках РСТ/и894/00902 и РСТ/и893/06976 (опубликованы как XVО 94/17093 и XVО 94/02499 соответственно); 3'-дезокси-3'аминофосфорамидатные олигонуклеотиды могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в патенте США № 5476925; фосфотриэфирные олигонуклеотиды могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в патенте США № 5023243; боранофосфатные олигонуклеотиды могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в патентах США № 5130302 и 5177198; метиленметилиминосвязанные олигонуклеотиды, также обозначаемые как ММ1-связанные олигонуклеотиды, метилендиметилгидразосвязанные олигонуклеотиды, также обозначаемые как МОП-связанные олигонуклеотиды, и метиленкарбониламиносвязанные олигонуклеотиды, также обозначаемые как амид-3связанные олигонуклеотиды, и метиленаминокарбонилсвязанные олигонуклеотиды, также обозначаемые как амид-4-связанные олигонуклеозиды, а также соединения со смешанным скелетом, включающим, например, чередующиеся ММ1 и Р=О или Р=8 связи, могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в патентах США № 5378825, 5386023, 5489677, 5602240 и 5610289; олигонуклеотиды с присоединенными формацетальными и тиоформацетальными фрагментами могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в патентах США № 5264562 и 5264564; и олигонуклеотиды, связанные с этиленоксидом, могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в патенте США № 5223618. Каждый из цитированных патентов и патентных заявок входит в настоящее описание полностью в качестве ссылки.
Олигонуклеотидные средства и фармацевтические композиции
Описанные в настоящем изобретении олигонуклеотиды могут быть получены в виде олигонуклеотидного средства или фармацевтической композиции. Так, олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть также смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или ассоциированы с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, такими как, например, липосомы, рецепторные молекулы-мишени, пероральные, ректальные, местные или другие средства, способствующие поглощению, распределению и/или абсорбции. Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких средств, способствующих поглощению, распределению и/или абсорбции, включают, например, патенты США № 5108921, 5354844, 5416016, 5459127, 5521291, 5543158, 5547932, 5583020, 5591721, 4426330, 4534899, 5013556, 5108921, 5213804, 5227170, 5264221, 5356633, 5395619, 5416016, 5417978, 5462854, 5469854, 5512295, 5527528, 5534259, 5543152, 5556948, 5580575 и 5595756, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки.
Олигонуклеотиды, средства и композиции согласно изобретению включают в себя любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любое другое соединение, которое при введении животному, включая человека, способно обеспечить (непосредственно или опосредованно) наличие биологически активного метаболита или его остатка. Соответственно, например, настоящее описание также относится к пролекарствам и фармацевтически приемлемым солям соединений согласно изобретению, фармацевтически приемлемым солям таких пролекарств и других биологически эквивалентных соединений.
Термин пролекарство относится к терапевтическому средству, которое получают в неактивной форме и которое превращается в активную форму (например, в лекарство) в организме или в его клетках под воздействием эндогенных ферментов или других химических веществ и/или условий. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения описанные в нем пролекарственные формы олигонуклеотидов получают в виде 8ЛТЕ [(8-ацетил-2-тиоэтил)фосфат] производных по методам, описанным в
- 28 008940 \νθ 93/24510 (6о88е1ш е! а1.) и \УО 94/26764 (1тЬасй е! а1.) и в патенте США № 5770713, которые включены в настоящее описание полностью в качестве ссылки.
Термин фармацевтически приемлемые соли относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений согласно изобретению, т.е. к солям, которые сохраняют желательную биологическую активность исходного соединения и не оказывают нежелательного токсикологического эффекта. Многие такие фармацевтически приемлемые соли известны и могут использоваться в практике осуществления настоящего изобретения.
В том, что касается олигонуклеотидов, полезные примеры фармацевтически приемлемых солей включают в себя, без ограничения, соли, образованные с катионами, такими как натрий, калий, аммоний, магний, кальций, с полиаминами, такими как спермин и спермидин; аддитивные соли кислоты, образованные с использованием неорганических кислот, например, хлористо-водородной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, азотной кислоты и т.п.; соли, образованные с использованием органических кислот, таких как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, танниновая кислота, пальмитиновая кислота, альгиновая кислота, полиглютаминовая кислота, нафталинсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, нафталиндисульфоновая кислота, полигалактуроновая кислота и т.п.; и соли, образованные на основе анионов элементов, таких как хлор, бром и йод.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям и средствам, которые включают в себя антивирусные олигонуклеотиды согласно изобретению. Такие фармацевтические композиции могут вводиться с использованием множества способов, в зависимости от того, какое, местное или системное, лечение является желательным, и от той области, которая подлежит лечению. Так, например, введение может быть местным (включая глазное введение и введение в слизистые оболочки, в том числе вагинальный и ректальный способ доставки), внутрилегочным, например, путем ингаляции или инсуффляции с использованием порошков или аэрозолей, в том числе с помощью небулайзера; внутритрахеальным, интраназальным; эпидермальным и чрескожным; пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает в себя внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, внутриоболочечное или внутрижелудочковое введение.
Фармацевтические композиции и средства для местного введения могут включать в себя чрескожные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Традиционные фармакологические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т. п. могут быть также необходимы или желательны. Покрытые оболочкой презервативы, перчатки и т.п. также могут использоваться. Предпочтительные местные композиции включают в себя такие композиции, в которых олигонуклеотиды согласно изобретению находятся в смеси со средством для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирной кислоты, стероиды, хелатирующие средства и поверхностно-активные вещества. Предпочтительные липиды и липосомы включают в себя нейтральные по заряду (например, диолеилфосфатидилэтаноламин ДОФЭ (ПОРЕ), димиристоилфосфатидилхолин ДМФХ (ПМРС), дистеароилфосфатидилхолин), отрицательно заряженные (димиристоилфосфатидилглицерин ДМФГ (ПМРС)) и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил ДОТАП (ПОТАР) и диолеилфосфатидилэтаноламин (ΌΟΤΜΑ)). Олигонуклеотиды могут быть инкапсулированы в липосомы или могут образовывать комплексы, в частности, с катионными липосомами. Альтернативно, олигонуклеотиды могут быть подвергнуты комплексообразованию с липидами, в частности, с катионными липидами. Предпочтительные жирные кислоты и сложные эфиры включают в себя, без ограничения, арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или С1-10алкиловый сложный эфир (например, изопропилмиристат ИПМ (1РМ)), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль.
Композиции и средства для перорального введения включают в себя порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в водных или неводных средах, капсулы, гель-капсулы, пакетики, таблетки или мини-таблетки. При этом могут быть желательны загустители, вкусовые вещества, разбавители, эмульгаторы, средства, способствующие диспергированию, или связующие вещества. Предпочтительные пероральные композиции включают в себя такие композиции, в которых олигонуклеотиды согласно изобретению вводятся в сочетании с одним или более средствами, усиливающими проникновение, поверхностно-активными веществами или хелатирующими средствами. Примеры поверхностно-активных веществ включают в себя жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, желчные кислоты и/или их соли. Примеры желчных кислот/солей включают в себя хенодезоксихолевую кислоту (ХДХК (СОСА)) и урсодезоксихендезоксихолевую кислоту (УДХК (ИПСА)), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюхолевую кислоту, глихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, тауро-24,25-дигидрофузидат на- 29 008940 трия, гликодигидрофузидат натрия. Примеры жирных кислот включают в себя арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, натриевую). Также предпочтительными являются сочетания усилителей проникновения, например, жирные кислоты/соли в сочетании с желчными кислотами/солями. Особенно предпочтительные сочетания включают в себя натриевую соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и УДХК (ЦОСА). Другие примеры усилителей проникновения включают в себя полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. Олигонуклеотиды согласно изобретению могут доставляться перорально в гранулярной форме, включая распыление высушенных частиц, или в виде комплексов, приводящих к образованию микро- или наночастиц. Средства, образующие комплексы с олигонуклеотидами, включают в себя полиаминокислоты, полиимины, полиакрилаты, полиалкилакрилаты, полиоксэтаны, полиалкилцианоакрилаты, желатины в катионной форме, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (ПЭГ) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; ДЭАЭдериватизированные полиимины, поллуланы, целлюлозы и крахмалы. Особенно благоприятными комплексообразующими средствами являются хитозан, Ν-триметилхитозан, поли-Ь-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен П(ТДАЭ) (Р(ТЭАЕ)). полиаминостирол (например, п-амино-), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианоакрилат), поли(изобутилцианоакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), ДЭАЭметакрилат, ДЭАЭ-гексилакрилат, ДЭАЭ-акриламид, ДЭАЭ-альбумин и ДЭАЭ-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(П,Ь-молочная кислота), сополимер ОЬ-молочной-гликолевой кислоты (ПЛГК) (РЬСА), альгинат и полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Композиции и средства для парентерального, внутриоболочечного или внутрижелудочкового введения могут включать в себя стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие приемлемые добавки, такие как, без ограничения, усилители проникновения, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или наполнители.
Фармацевтические композиции согласно изобретению включают в себя, без ограничения, растворы, эмульсии или липосомные препараты. Указанные композиции могут быть получены на основе множества компонентов, которые включают в себя, без ограничения, предварительно обработанные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества.
Фармацевтические средства согласно изобретению, которые могут быть представлены в удобной для применения стандартной дозированной форме, могут быть получены по традиционным методикам, известным в фармацевтической отрасли. Такие методики включают в себя стадию приведения в контакт активных ингредиентов с фармацевтическим(ими) носителем(ями) или наполнителем(ями). В основном указанные композиции получают посредством равномерного и тщательного приведения в контакт активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями, или обеими формами, с последующим, при необходимости, встряхиванием полученного продукта.
Композиции согласно изобретению могут быть изготовлены с получением любой из многих возможных дозированных форм, таких как, без ограничения, таблетки, капсулы, гель-капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции согласно изобретению могут быть также введены в состав таких форм, как суспензии в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии могут также содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включающие в себя, например, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензия может также содержать стабилизаторы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемые в нем фармацевтические композиции могут быть изготовлены и далее применяться в виде пенных продуктов. Фармацевтические пенки включают в себя композиции, такие как, без ограничения, эмульсии, микроэмульсии, кремы, желе и липосомы. Будучи по природе в основном близкими, данные композиции отличаются по компонентам и по консистенции конечного продукта. Способы получения таких композиций и препаратов в основном известны специалистам в области фармацевтики и изготовлении препаратов и они могут применяться при получении композиций согласно изобретению.
Эмульсии
Средства и композиции согласно изобретению могут быть также приготовлены и сформированы в виде эмульсий. В типичном случае эмульсии представляют собой гетерогенные системы, в которых один жидкий компонент диспергирован в другом в виде капелек, обычно превышающих в диаметре 0,1 мкм (Ιάδοη, ίη Рйагтасеийса1 Эохаде Еогтз, ЫеЬегтаи, К1едег аий Вапкег (Ей5.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, Ν.Υ., νοί. 1, р. 199; ΕοδοΓΓ, ίη Ркагтасеийса1 Эохаде Еогтз, ЫеЬегтаи, К1едег апй Вапкег (Ей5.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, Ν.Υ., νο1. 1, р. 245; В1оск ίη Ркагтасеи!юа1 Эохаде Еогтз, ЫеЬегтаи, К1едег апй Вапкег (Ей5.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, Ν.Υ., νο1. 2, р. 335; ШдисЫ е! а1., ίη Кеттдΐοη'δ Ркагтасеийса1 8с1епсе5, Маск РиЫЫипд Со., ЕахЮп, Ра., 1985, р. 301). Эмульсии чаще всего представляют собой двухфазные системы, включающие две несмешивающихся жидких фазы, тщательно перемешанные и диспергированные друг в друге. В основном эмульсии могут представлять собой вариант
- 30 008940 типа вода-в-масле (в/м) или типа масло-в-воде (м/в). В том случае, когда водная фаза хорошо измельчена и диспергирована в виде мелких капелек в массе масляной фазы, полученную композицию называют эмульсией типа вода-в-масле (в/м). И альтернативно, когда масляная фаза представляет собой измельченный и диспергированный в виде мелких капелек компонент в массе водной фазы, то полученную композицию называют эмульсией типа масло-в-воде (м/в). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты, вдобавок к диспергированным фазам, и активное вещество, которое может присутствовать в виде раствора либо в водной фазе, либо в масляной фазе, либо оно может само представлять собой отдельную фазу. Фармацевтические наполнители, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты, также могут присутствовать в эмульсиях, при необходимости. Фармацевтические эмульсии могут также представлять собой множественные эмульсии, которые включают в себя более чем две фазы, такие как, например, в случае эмульсий типа масло-в-воде-в-масле (м/в/м) и вода-в-масле-в-воде (в/м/в). Такие сложные препараты зачастую обеспечивают достижение определенных полезных свойств, которые не имеют более простые бинарные эмульсии. Множественные эмульсии, в которых индивидуальные масляные капельки в эмульсии типа м/в заключают мелкие капельки воды, представляют вариант эмульсии типа в/м/в. Аналогично, система масляных капелек, заключенных в глобулах воды, стабилизированная в масляной непрерывной фазе, дает эмульсию типа м/в/м.
Для эмульсий характерна небольшая термодинамическая стабильность или ее отсутствие. Зачастую диспергированную или прерывистую фазу эмульсии хорошо диспергируют во внешней или непрерывной фазе и поддерживают в данной форме за счет использования эмульгаторов или достижения определенной вязкости в композиции. Любая из фаз эмульсии может быть твердой или полутвердой, как в случае основ эмульсионного типа для мазей и кремов. Другие средства стабилизации эмульсий включают в себя использование эмульгаторов, которые могут быть введены в любую фазу эмульсии. Эмульгаторы могут быть распределены на четыре крупных категории: синтетические поверхностно-активные вещества, природные эмульгаторы, основания, способствующие абсорбции, и мелкодиспергированные твердые вещества (Ιάκοη, ίη Р1агтасеийса1 Όοδαβο Ροπηκ, ЫеЬегтап, Кгедег апб Вапкег (Εάκ.), 1988, Магсе1 Эскксг, 1пс., Νο\ν ΥοιΈ Ν.Υ., νοί. 1, р. 199).
Синтетические сурфактанты, известные также как поверхностно-активные вещества, нашли широкое применение при получении эмульсий, диапазон которого широко освещается в литературе (Ктедег, ίη Р11агтасеиРса1 ^οκаде Ροπηκ, МеЬети-т, Кгедег аиб Ванкег (Εάκ.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν ΥοιΈ Ν.Υ., νοί. 1, р. 285; Ιάκοη, ίη Р11агтасеиРса1 ^οκаде Ροπηκ, МеЬети-т, Шедег ηηά Ваакег (Εάκ.), Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν ΥοιΈ Ν.Υ., 1988, νο1. 1, р. 199). Сурфактанты в типичном случае представляют собой амфифильные вещества и включают в себя гидрофильную и гидрофобную часть. Коэффициент отношения количества гидрофильного компонента к гидрофобному в сурфактанте получил название гидрофильного/липофильного баланса (ГЛБ, (НЬВ)), который является важным инструментом для классификации и подбора поверхностно-активных веществ при изготовлении препаратов. Поверхностно-активные вещества могут быть классифицированы на различные классы в зависимости от природы гидрофильной группы: неионные, анионные, катионные и амфотерные (Шедег, ίη Р11агтасеиРса1 ^οκаде Ροπηκ, Ь1еЬегтащ Кгедег ηηά Ваг1кег (Εάκ.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν ΥοιΈ Ν.Υ., νο1. 1, р. 285).
Природные эмульгаторы, используемые в эмульсионных препаратах, включают в себя ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и аравийскую камедь. Способствующие абсорбции основания обладают гидрофильными свойствами, так что они могут впитывать воду, что приводит к образованию эмульсий типа в/м, которые все еще сохраняют свою полутвердую консистенцию, как, например, безводный ланолин и гидрофильный вазелин. Тонкоизмельченные твердые вещества также используются в качестве хороших эмульгаторов, особенно в сочетании с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Указанные вещества включают в себя полярные неорганические твердые материалы, такие как гидроксиды тяжелого металла, ненабухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный алюмосиликат магния, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как уголь или глицерилтристеарат.
В эмульсионные препараты включают также большое множество неэмульгирующих материалов, которые вносят определенный вклад в свойства эмульсий. Указанные материалы включают в себя жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, сложные эфиры жирных кислот, смачивающие вещества, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (В^ск, ίη Р1агтасеийса1 ^οκаде Ροπηκ, Ь1еЬета^ Ктедег ηηά Вавкег (Εάκ.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν ΥοιΈ Ν.Υ., νο1. 1, р. 335; Ιάκοη, ίη Р1агтасеиРса1 ^οκаде Ροπηκ, МеЬети-т, Кгедег ηηά Ваг1кег (Εάκ.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν ΥοιΈ Ν.Υ., νο1. 1, р. 199).
Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают в себя природные камеди и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, аравийская камедь, агар, альгиновая кислота, каррагенан, гуаровая камедь, камедь карайя и трагакант), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлоза и карбоксипропилцеллюлоза) и синтетические полимеры (например, карбомеры, эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Указанные материалы диспергируют или подвергают набуханию в воде с получением коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсию за счет образования сильных межповерхностных пленок вокруг фазы диспергированных капелек и за счет повышения вязкости
- 31 008940 внешней фазы.
Поскольку эмульсии зачастую содержат множество ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфатиды, которые могут легко поддерживать рост микробов, указанные препараты часто включают в себя консерванты. Обычно используемые для введения в эмульсионные композиции консерванты включают в себя метилпарабен, пропилпарабен, четвертичные соли аммония, хлорид бензалкония, сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты и борную кислоту. Антиоксиданты также обычно добавляют к эмульсионным препаратам для предотвращения порчи препарата. Используемые антиоксиданты могут представлять собой раскислители свободных радикалов, такие как токоферолы, алкилгаллаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол или восстановители, такие как аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, а также антиоксидантные синергисты, такие как лимонная кислота, винная кислота и лецитин.
Использование эмульсионных препаратов путем кожного, перорального и парентерального режимов введения и способы их производства описаны в литературе (1бкоп, ίη РДагтасеийса1 Эокаде Еогтк, ЫеЬегтап, К1едег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег. 1пс., №\ν Уогк, Ν.Υ., νοί. 1, р. 199). Эмульсионные препараты для пероральной доставки широко использовались в связи с легкостью их изготовления и эффективностью, определяемой абсорбцией и биодоступностью (Кокой; ш Р11агтасеиНса1 Эокаде Еогтк, Ь1еЬегтап, К1едег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Υο^к, Ν.Υ., νο1. 1, р. 245; 1бкоп, ш РЬагтасеийса1 Эокаде Еогтк, Ь1еЬегтап, К1едег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Υο^к, Ν.Υ., νο1. 1, р. 199). Слабительные средства на основе минерального масла, маслорастворимые витамины и питательные препараты с высоким содержанием жира входят в число тех материалов, которые обычно вводят перорально в виде эмульсий типа м/в.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиции олигонуклеотидов изготавливают в форме микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система, включающая воду, масло и амфифильный компонент, которая представляет собой один оптически изотропный и термодинамически стабильный жидкий раствор (Кокой, ш РДагтасеийса1 Эокаде Еогтк, Ь1еЬегтап, К1едег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Υο^к. Ν.Υ., νο1. 1, р. 245). В типичном случае микроэмульсии представляют собой системы, которые получают при диспергировании вначале масла в водном растворе поверхностно-активного вещества с последующим добавлением достаточного количества четвертого компонента, обычно спирта с цепью промежуточной длины с образованием прозрачной системы. В этой связи, микроэмульсии были также описаны как термодинамически стабильные, изотропно прозрачные дисперсии двух несмешивающихся жидкостей, которые стабилизируются за счет межповерхностных пленок в молекулах поверхностно-активных веществ (Ъеипд апб 8ДаЬ, т: Соп1го11еб Ке1еаке ой Эгидк: Ро1утегк апб Аддгеда1е 8ук1етк, Кокойй, М., Еб., 1989, УСН РиЬйкДега, №\ν Уогк, радек 185-215). Микроэмульсии обычно изготавливают путем объединения от трех до пяти компонентов, которые включают в себя масло, воду, поверхностно-активное вещество, вспомогательное поверхностно-активное вещество и электролит. Микроэмульсия, независимо от того, к какому типу она принадлежит: вода-в-масле (в/м) или масло-в-воде (м/в), зависит от свойств используемого масла и поверхностно-активного вещества, а также от структуры и геометрической упаковки полярных головок и углеводородных хвостов молекул поверхностно-активного вещества (8с1юИ ш Кешшдйоп'к РДагтасеийса1 8аепсек, Маск РиЬйкЫпд Со., ЕакЮп, Ра., 1985, р. 271).
Широкое применение для исследования феноменологического подхода с использованием фазовых диаграмм привело к пониманию, важного для специалистов в данной области, того, как следует изготавливать микроэмульсии (Кокойй, ш РДагтасеийса1 Эокаде Еогтк, Ь1еЬегтап, К1едег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Υο^к, Ν.Υ., νο1. 1, р. 245; В1оск, т РДагтасеийса1 Эокаде Еогтк, Ь1еЬегтап, К1едег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Υο^к. Ν.Υ., νο1. 1, р. 335). В сравнении с традиционными эмульсиями, микроэмульсии имеют преимущество, определяемое возможностью солюбилизации водонерастворимых лекарственных компонентов в препарате термодинамически стабильных капелек, которые образуются спонтанно.
Поверхностно-активные вещества, используемые при изготовлении микроэмульсий, включают в себя, без ограничения, ионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества, Бридж 96, полиоксиэтиленолеиловые эфиры, сложные эфиры полиглицерина и жирной кислоты, тетраглицеролмонолаурат (МЬ310), тетраглицеролмоноолеат (МО310), гексаглицеролмоноолеат (РО310), гексаглицеролпентаолеат (РО500), декаглицеролмонокапрат (МСА750), декаглицеролмоноолеат (МО750), декаглицеролсеквиолеат (8Θ750), декаглицеролдекаолеат (ΌΑ0750), сами по себе или в сочетании с сопутствующими поверхностно-активными веществами. Сопутствующее поверхностно-активное вещество, обычно имеющее вид короткоцепочечного спирта, такого как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для повышения межповерхностной текучести за счет проникновения в пленку поверхностноактивного вещества и разупорядочения впоследствии структуры пленки за счет образования свободного пространства между молекулами поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии могут быть изготовлены и без использования сопутствующих поверхностно-активных веществ и в данной области известны не содержащие спирта самоэмульгирующиеся микроэмульсионные системы. Водная фаза может в типичном случае представлять собой, без ограничения, воду, водный раствор лекарственного сред
- 32 008940 ства, глицерин, ПЭГ300, ПЭГ400, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляная фаза может включать в себя, без ограничения, материалы, такие как Каптекс 300 (Сар!ех 300), Каптекс 355 (Сар!ех 355), Капмул МСМ (Сарти1 МСМ), сложные эфиры жирных кислот, среднецепочечные (С8-С12) моно-, ди- и триглицериды, сложные полиоксиэтилированные глицериловые эфиры жирных кислот, жирные спирты, полигликолевые глицериды, насыщенные полигликолевые С8-С10 глицериды, растительные масла и силиконовое масло.
Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения возможностей солюбилизации лекарственного средства и повышенного всасывания лекарственных средств. Микроэмульсии липидного характера (как типа м/в, так и в/м) были предложены для улучшения пероральной биодоступности лекарственных средств, включая пептиды (Сопк1ап1йнбек е! а1., Р1агтасеи!1са1 Кекеагсй, 1994, 11, 1385-1390; КПксйеГ Ме1/|. Ртб. Ехр. С1т. Рйагтасо1., 1993, 13, 205). Микроэмульсии имеют преимущества, связанные с улучшенной солюбилизацией лекарственного средства, защитой лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможным усилением всасывания лекарственного средства, связанным с индуцированными поверхностно-активным веществом изменениями в мембранной подвижности и проницаемости, легкостью получения, простотой перорального введения в сравнении с твердыми дозированными формами, повышенной клинической эффективностью и сниженной токсичностью (Сопк!апйшбек е! а1., Рйагтасеийса1 Кекеагсй, 1994, 11, 1385; Но е! а1., 1. Рйагт. §е!., 1996, 85, 138-143). Микроэмульсии зачастую могут образовываться спонтанно при приведении в контакт компонентов при температуре окружающей среды. Они, в частности, могут быть особенно удобными при изготовлении препаратов термолабильных лекарственных средств, пептидов или олигонуклеотидов. Микроэмульсии могут быть также эффективными при чрескожной доставке активных компонентов, как в случае косметического, так и фармацевтического применения. Ожидается, что микроэмульсионные композиции и препараты согласно изобретению будут облегчать повышенное системное всасывание олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также улучшать локальное клеточное поглощение олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот в пределах желудочно-кишечного тракта, влагалища, трансбуккальной полости и в других областях их введения.
Микроэмульсии согласно изобретению могут также содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как сорбитанмоностеарат (ОгШ 3), лабразол (ЪаЬгако1) и усилители проникновения, для улучшения свойств композиции и для повышения уровня всасывания олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот согласно изобретению. Усилители проникновения, используемые в микроэмульсиях согласно изобретению, могут быть отнесены к одной из пяти крупных категорий: поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатирующие и не поверхностноактивные вещества (Ьее е! а1., СгШса1 Ке\зе\\'к ш Тйегареийс Эгид Саглег §ук!етк, 1991, р. 92).
Липосомы
Имеется множество организованных структур с поверхностно-активными веществами, кроме микроэмульсий, которые исследовались и использовались для создания композиций лекарственных средств. Указанные структуры включают в себя монослои, мицеллы, бислои и везикулы. Везикулы имеют преимущество, связанное со специфичностью и более длительным периодом их действия, для доставки лекарственного средства. Таким образом, в контексте настоящего описания термин липосома относится к везикуле, состоящей из амфифильных липидов, организованных в виде сферического(их) бислоя или бислоев, т.е. липосомы представляют собой однослойные или многослойные везикулы, которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала, и водный внутренний компонент. Водная часть в типичном случае включает в себя доставляемую композицию. Для того чтобы пересечь интактную кожу млекопитающего, липидные везикулы должны пройти через серию тонких пор, каждая из которых имеет диаметр менее 50 нм, под воздействием соответствующего чрескожного ингредиента. В этой связи желательно использовать липосому, которая обладает высокой деформируемостью и способностью проходить через такие тонкие поры. Дополнительный фактор, влияющий на липосому, включает заряд поверхностных липидов и водный объем липосом.
Другие преимущества липосом включают в себя следующее: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, являются биосовместимыми и биодеградируемыми компонентами; липосомы могут включать в себя широкий перечень водо- и липидорастворимых лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные лекарственные средства в их внутренних отсеках от метаболических превращений и деградации (Кокой; ш Рйагтасеийса1 Эокаде Рогтк, ЫеЬегтап, К1едег апб Вапкег (Ебк.), 1988, Магсе1 Оеккег, 1пс., Ыете Уогк, Ν.Υ., νο1. 1, р. 245).
Что касается местного введения, то доказано, что липосомы имеют ряд преимуществ в сравнении с другими препаратами. Такие преимущества включают в себя сниженный уровень побочных эффектов, связанный с высоким системным всасыванием введенного лекарственного средства, повышенное накопление введенного лекарственного средства в соответствующей мишени и их способность доставлять в кожу широкий перечень лекарственных средств, как гидрофильной, так и гидрофобной природы. Введение в кожу соединений, включающих в себя анальгетики, антитела, гормоны и высокомолекулярные ДНК, в основном приводит к достижению ими лишь верхнего слоя эпидермиса.
Липосомы подразделяются на два крупных класса. Катионные липосомы представляют собой по
- 33 008940 ложительно заряженные липосомы, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Положительно заряженный комплекс ДНК/липосомы связывается с отрицательно заряженной поверхностью клетки и интернализуется в эндосоме. В связи с кислотным рН внутри эндосомы, липосомы разрушаются, высвобождая содержимое в цитоплазму клетки (^апд е1 а1., Вюсйет. Вюрйук. Кек. Соттип., 1987, 147, 980-985).
Липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно заряженными, легче захватываются ДНК, чем их комплекс. Поскольку и ДНК, и липид характеризуются близким зарядом, имеет место скорее отталкивание, чем образование комплекса. ДНК, таким образом, захватывается водной внутренней частью данных липосом. рН-чувствительные липосомы используют, например, для доставки ДНК, содержащей ген, кодирующий тимидинкиназу, в монослои в культуре клеток (2йои е1 а1., 1оигпа1 о! Сойго11еб Ке1еаке, 1992, 19, 269-274).
Один основной тип липосомальных композиций включает в себя фосфолипиды, отличные от природного фосфатидилхолина. Нейтральные липосомные композиции, например, могут быть сформированы из димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ (ИМРС)) или дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ (ЭРРС)). Анионные липосомные композиции в основном формируются из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионные фузогенные липосомы образуются преимущественно из диолеоилфосфатидилэтаноламина (ДОФЭ (ЭОРЕ)). Другой тип липосомной композиции образуется из фосфатидилхолина (ФХ (РС)), такого как, например, соевый ФХ и яичный ФХ. Другой тип образуется из смеси фосфолипида, и/или фосфатидилхолина, и/или холестерина.
Было проведено несколько исследований для оценки результатов местной доставки липосомальных лекарственных композиций в кожу. Нанесение липосом, содержащих интерферон, на кожу морских свинок приводит к снижению герпетических поражений кожи, тогда как доставка интерферона другими способами (например, в виде раствора или эмульсии) была неэффективной (ХУеюег е1 а1., 1оигпа1 о! Эгид Тагдейпд, 1992, 2, 405-410). Далее, дополнительные исследования по оценке эффективности интерферона, вводимого в составе липосомной композиции, и в варианте введения интерферона в водной системе, привели к выводу о том, что липосомальный препарат дает лучшие результаты, чем вариант его водного введения (би Р1екк1к е1 а1., Лп1Мга1 Кекеагсй, 1992, 18, 259-265).
Неионные липосомальные системы также исследовались с целью определения их способности доставлять лекарственное средство в кожу, в частности, исследовались системы, включающие в себя неионное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомальные средства, включающие новазон™ I (Ыоуакопе™ I) (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и новазом™ II (Ыоуакоте™ II) (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) используют для доставки циклоспорина А в дерму мышей. Результаты показывают, что такие неионные липосомальные системы эффективны в плане облегчения отложения циклоспорина А в разных слоях кожи (Ни е! а1., Б.Т.Р. Рйагта. Бск, 1994, 4, 6, 466).
Липосомы включают в себя также стерически стабилизированные липосомы, где данный термин в контексте настоящего описания обозначает липосомы, включающие в себя один или более специализированных липидов, которые в случае включения в липосомы приводят к увеличению времени пребывания в кровотоке в сравнении с липосомами, не содержащими таких специализированных липидов. Примеры стерически стабилизированных липосом включают в себя такие липиды, в которых часть везикулообразующего липидного фрагмента липосомы включает в себя один или более гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид СМ1 или его дериватизированный вариант, полученный с использованием одного или более гидрофильных полимеров, такого как полиэтиленгликолевый (ПЭГ) фрагмент. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, следует понимать, что в случае стерически стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, спингомиелин или ПЭГ-дериватизированные липиды, увеличение времени пребывания в кровотоке таких стерически стабилизированных липосом связано со сниженным поглощением в клетках ретикулоэндотелиальной системы (РЭС (КЕБ)) (А11еп е1 а1., ГЕВБ йен.. 1987, 223, 42; \\'и е1 а1., Сапсег Кекеагсй, 1993, 53, 3765).
Различные липосомы, которые содержат один или более гликолипидов, описаны в литературе (Рара11аб)орои1о8 е1 а1., Апп. Ν.Υ. Асаб. Бей, 1987, 507, 64) (моносиалоганглиозид СМ1, галактоцереброзидсульфат и фосфатидилинозит); (СаЫхоп е1 а1., Ргос. №И. Асаб. Бск ИБА, 1988, 85, 6949; А11еп е1 а1., патент США № 4837028 и публикация по заявке на Международный патент \УО 88/04924 (сфингомиелин и ганглиозид СМ1 или сложный эфир галактоцереброзидсульфата); \УеЬЬ е1 а1., патент США № 5543152 (сфингомиелин); (Ыт е1 а1., \¥О 97/13499 (1,2-кп-димиристоилфосфатидилхолин)).
Липосомы, которые содержат липиды, дериватизированные с использованием одного или более гидрофильных полимеров, а также способы их получения описаны в литературе (см., например, Бипашо1о е1 а1., Ви11. Сйет. Бос. 1рп., 1980, 53, 2778) (неионный детергент 2С12156, который содержит ПЭГфрагмент); (Шит е1 а1., ГЕВБ Ьей., 1984, 167, 79) (гидрофильное покрытие полистироловых частиц полимерными гликолями); Беагк, патенты США № 4426330 и 4534899 (синтетические фосфолипиды, модифицированные за счет присоединения карбоновых групп к полиалкиленгликолям (например, к ПЭГ)); (КйЬаиоу е1 а1., ГЕВБ Ьей., 1990, 268, 235 (фосфатидилэтаноламин (ФЭ), дериватизированный с исполь- 34 008940 зованием ПЭГ или ПЭГ-стеарата); (В1ите е! а1., ВюсЫтка е! ВкрНукка Лс1а. 1990, 1029, 91) (ПЭГдериватизированные фосфолипиды, например, ДСФЭ-ПЭГ (Э8РЕ-РЕС), образованные на основе сочетания дистеароилфосфатидилэтаноламина (ДСФЭ (Э8РЕ) и ПЭГ); Е1кйег, Европейский патент № ЕР 0445131 В1 и \νϋ 90/04384 (ковалентно присоединенные ПЭГ-фрагменты на наружной поверхности липосом); Хооб1е е! а1., патенты США № 5013556 и 5356633 и Майш е! а1., патент США № 5213804 и Европейский патент № ЕР 0496813 В1 (липосомные композиции, содержащие 1-20 мол.% ПЭГдериватизированного ФЭ); Майш е! а1., νθ 91/05545 и патент США № 5225212 и 2айркку е! а1., νθ 94/20073 (липосомы, содержащие множество других липид-полимерных конъюгатов); С.'1ю1 е! а1., νθ 96/10391 (липосомы, включающие ПЭГ-модифицированные церамидные липиды); М|уахак| е! а1., патент США № 5540935 и Тада^а е! а1., патент США № 5556948 (ПЭГ-содержащие липосомы, которые могут быть далее дериватизированы с использованием функциональных фрагментов на своих поверхностях).
Липосомы, которые содержат нуклеиновые кислоты, также описаны (см., например, ТЫеггу е! а1., νθ 96/40062 (способы инкапсулирования высокомолекулярных нуклеиновых кислот в липосомы)); Тада^а е! а1., патент США № 5264221 (связанные с белком липосомы, содержащие РНК); Кайтап е! а1., патент США № 5665710 (способы инкапсулирования олигодезоксинуклеотидов в липосомы); Ьоуе е! а1., νθ 97/04787 (липосомы, которые включают антисмысловые олигонуклеотиды).
Другой тип липосом, трансферосомы, представляют собой высокодеформирующиеся липидные агрегированные структуры, которые обладают свойствами, удобными для использования их в качестве проводников для доставки лекарственного средства. (Сеус е! а1., 1998, ВюсЫт. ВкрНук. Ас!а, 1368(2): 201-15). Трансферосомы можно определить как липидные капельки, которые обладают настолько высокой способностью к деформации, что могут проникать через поры, размеры которых меньше, чем капелька. Трансферосомы адаптируются к окружающей среде, в которой их используют, т.е. они обладают адаптивной формой, способностью к самовосстановлению, часто достигают своих мишеней без фрагментирования и зачастую способны сами осаждаться в соответствующих сайтах. Трансферосомы могут быть получены, например, путем добавления активаторов, действующих на концах поверхности, обычно поверхностно-активных веществ, к стандартным липосомным композициям.
Поверхностно-активные вещества
Поверхностно-активные вещества широко используются в композициях, таких как эмульсии (включая микроэмульсии) или липосомы. Самым распространенным способом классификации и ранжирования свойств большого числа разнообразных типов поверхностно-активных веществ, как природных, так и синтетического происхождения, является использование параметра гидрофильный/липофильный баланс (ГЛБ (НЬВ)). Природа гидрофильной группы (также известной как головка) обеспечивает наиболее полезные варианты классификации различных используемых в препаратах поверхностно-активных веществ (К1едег, ш Рйагтасеийса1 Эокаде Еогтк, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Уогк, Ν.Υ., 1988, р. 285).
Если молекула поверхностно-активного вещества не ионизирована, ее относят к классу неионных поверхностно-активных веществ. Неионные поверхностно-активные вещества широко используются в фармацевтических и косметических продуктах и применимы в широком диапазоне значений рН при типичных значениях ГЛБ от 2 до примерно 18, в зависимости от структуры. Неионные поверхностноактивные вещества включают в себя неионные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, глицериловые сложные эфиры, полиглицериловые сложные эфиры, сорбитановые сложные эфиры, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры; а также неионные алканоламиды и простые эфиры, такие как этоксилаты жирного спирта, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блок-сополимеры, которые также включаются в данный класс. Полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества являются чаще всего используемыми представителями класса неионных поверхностно-активных веществ.
Молекулы поверхностно-активных веществ, которые имеют отрицательный заряд при растворении или диспергировании в воде, относятся к анионным поверхностно-активным веществам. Анионные поверхностно-активные вещества включают в себя карбоксилаты, такие как мыла, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизотионаты, ациллаураты и сульфосукцинаты, а также фосфаты. Алкилсульфаты и мыла являются чаще всего используемыми анионными поверхностно-активными веществами.
Молекулы поверхностно-активных веществ, которые имеют положительный заряд при растворении или диспергировании в воде, относятся к катионным поверхностно-активным веществам. Катионные поверхностно-активные вещества включают в себя соли четвертичного аммония и этоксилированные амины, при этом соли четвертичного аммония используют чаще всего.
Молекулы поверхностно-активных веществ, которые имеют либо положительный, либо отрицательный заряд, относятся к амфотерным поверхностно-активным веществам. Амфотерные поверхностноактивные вещества включают в себя производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, Νалкилбетаины и фосфатиды.
Использование поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, средствах и эмульсиях описано в литературе (см. обзор К1едег, ίπ Рйагтасеийса1 Эокаде Еогтк, Магсе1 Эеккег, 1пс., №\ν Υο^к,
- 35 008940
Ν.Υ., 1988, р. 285).
Усилители проникновения
В некоторых вариантах усилители проникновения используют в составе композиции или при объединении с ней для повышения уровня доставки нуклеиновых кислот, в частности олигонуклеотидов, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствует в растворе как в ионизированной, так и в неионизированной формах. Однако обычно лишь липидорастворимые или липофильные средства легко проходят через клеточные мембраны. Было показано, что даже нелипофильные лекарственные средства могут проходить через клеточные мембраны, если мембрану, через которую предстоит пройти лекарственному средству, обработать усилителем проникновения. Способствуя диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны, усилители проникновения, кроме того, также увеличивают проникающую способность липофильных лекарственных средств.
Усилители проникновения могут быть классифицированы как средства, принадлежащие к одной из пяти широких категорий, т.е. поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, желчные кислоты, хелатирующие средства и нехелатирующие средства и не поверхностно-активные вещества (Ьее е! а1., Сп11са1 Кеу1е^5 ίη ТйегареиБс Эгид Сатег ЗуЧетк, 1991, р. 92). Усилители проникновения из каждого из указанных классов описаны ниже более подробно.
Поверхностно-активные вещества.
В контексте настоящего описания поверхностно-активные вещества (или сурфактанты) представляют собой химические соединения, которые при растворении в водном растворе снижают поверхностное натяжение раствора или межповерхностное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, что приводит к повышению уровня абсорбции олигонуклеотидов через слизистую оболочку. Данные усилители проникновения включают в себя, например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (Ьее е! а1., Сг111са1 Кеу1е^5 ίη Тйегареийс Эгид Сатег ЗуЧепъ, 1991, р. 92) и перфторхимические эмульсии, такие как БС-43 (Такайакй! е! а1., ί. Рйагт. РйагтасоЕ 1988, 40, 252), где указанные работы включены в настоящее описание полностью в качестве ссылки.
Жирные кислоты.
Различные жирные кислоты и их производные, которые действуют как усилители проникновения, включают в себя, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту (ндекановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-рац-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерин-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2он, ацилкарнитины, ацилхолины, С1-10алкиловые сложные эфиры (например, метиловый, изопропиловый и т-бутиловый) и их моно- и диглицериды (например, олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.п.) (Ьее е! а1., Сг111са1 Кеу1е^5 ίη Тйегареийс Эгид Сатег ЗуЧепъ, 1991, р. 92; МигапЦЫ е! а1., Сг111са1 Кеу1е^5 ίη Тйегареийс Эгид Сатег ЗуЧетк, 1990, 7, 1-33; Е1 Нагш е! а1., ί. Рйагт. Рйагтасо1., 1992, 44, 651-654), где каждая из приведенных работ включена в настоящее описание полностью в качестве ссылки.
Соли желчных кислот.
Физиологическая роль желчи включает в себя облегчение диспергирования и всасывания липидов и жирорастворимых витаминов (Вгип1оп, Сйар!ег 38 ίη: Сообтаη & СПтап'к, Тйе Рйагтасо1одюа1 Ва515 ок Тйегареийск, 91й Еб., Нагбтап е! а1., Ебк., МсСга\\-НПк №\ν Υо^к, 1996, рр. 934-935). Различные природные желчные кислоты и их синтетические производные действуют как усилители проникновения. Таким образом, термин соли желчных кислот включает в себя любые природные компоненты желчи, а также любые их синтетические производные. Соли желчных кислот согласно изобретению включают в себя, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюхолевую кислоту (глюхолат натрия), глихолевую кислоту (глихолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (УДХК (ИОСА)), тауро-24,25-дигидрофузидат натрия (НТДГФ (8ТОНЕ)), гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (ПОЭ (РОЕ)) (Ьее е! а1., Сг111са1 Кеу1е\\ъ ίη ТйегареиЦс Эгид Сатег ЗуЧетк, 1991, р. 92; 8тпуагб, Сйар!ег 39 Ιη: Кеттд1оп'8 Рйагтасеи1юа1 Заепсек, 181й Еб., Сеппаго е! а1., Маск РиЬЩЫпд Со., ЕаЧоп, Ра., 1990, радек 782-783; МигапНЫ, Сгй1са1 Кеу1е\\ъ ίη ТйегареиБс Эгид Сатег ЗуЧетк, 1990, 7, 1-33; Υататоΐо е! а1., I. Рйагт. Ехр. Тйег., 1992, 263, 25; Υата5й^ιа е! а1., I. Рйагт. 8ск, 1990, 79, 579-583).
Хелатирующие средства.
В контексте настоящего описания хелатирующие средства могут рассматриваться как соединения, которые удаляют ионы металлов за счет образования комплексов с ними, что приводит к повышению уровня всасывания олигонуклеотидов через слизистую оболочку. Относительно использования в качестве усилителей проникновения в настоящем изобретении следует отметить, что хелатирующие средства вносят дополнительное преимущество, определяемое тем, что они служат в качестве ингибиторов ДНК
- 36 008940 азы, поскольку известные ДНК-нуклеазы в большинстве своем требуют наличия двухвалентных ионов металла для катализа и, в этой связи, могут ингибироваться хелатирующими средствами (1агге!!, 1. СЬгота!одг., 1993, 618, 315-339). Хелатирующие средства, без ограничения, включают в себя этилендиаминтетраацетат динатрия (ЭДТА), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5метоксисалицилат и гомованилат), Ν-ацильные производные коллагена, лаурет-9 и Ν-аминоацильные производные бета-дикетонов (энамины) (Ьее е! а1., СпЦса1 Кеу1е^к ίη ТЬегареийс Эгид Сатег 8ук!етк, 1991, р. 92; МигашкЫ, Сг111са1 Кеу1е^к ίη ТЬегареийс Эгид Сатег 8ук!етк, 1990, 7, 1-33; Вииг е! а1., 1 Соп1го1. Ке1., 1990, 14, 43-51).
Нехелатирующие средства и не относящиеся к поверхностно-активным веществам.
В контексте настоящего описания усилители проникновения, которые не относятся ни к хелатирующим средствам, ни к поверхностно-активным веществам, представляют собой такие соединения, которые не демонстрируют выраженной активности, свойственной хелатирующим средствам или сурфактантам, но которые тем не менее способны усиливать всасывание олигонуклеотидов через слизистую оболочку кишечника (МигашкЫ, Сп!1са1 Кеу1е^к ίη ТЬегареийс Эгид Сатег 8ук!етк, 1990, 7, 1-33). Примеры таких усилителей проникновения включают в себя ненасыщенные циклические мочевины, 1алкил- и 1-алкенилазацикло-алканоновые производные (Ьее е! а1., Сп!юа1 Кеу1е^к ίη ТЬегареийс Эгид Сатег 8ук!етк, 1991, р. 92); и нестероидные противовоспалительные средства, такие как натрийдиклофенак, индометацин и фенилбутазон (УатакЬДа е! а1., 1 РЬагт. РЬагтасо1. 1987, 39, 621-626).
К фармацевтическим и другим композициям и средствам согласно изобретению могут быть также добавлены агенты, которые усиливают поглощение олигонуклеотидов на клеточном уровне. Например, известно, что катионные липиды, такие как липофектин (ШЫсЫ е! а1., патент США № 5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Ьо11о е! а1., заявка на РСТ патент νΟ 97/30731), усиливают поглощение олигонуклеотидов клетками.
Другие средства также могут использоваться для повышения уровня проникновения введенных нуклеиновых кислот, которые включают в себя гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.
Носители
Некоторые композиции согласно изобретению включают в свой состав также соединения, выполняющие функцию носителя. В контексте настоящего описания термин соединение-носитель или носитель может относиться к нуклеиновой кислоте или ее аналогу, где данный носитель является инертным (т.е. не обладает биологической активностью рег ке), но распознается как нуклеиновая кислота, при соответствующем снижении биодоступности нуклеиновой кислоты, обладающей активностью, в протекающих ίη у1уо процессах, направленных, например, на деградацию биологически активной нуклеиновой кислоты или ускорение ее удаления из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, часто при избытке последнего вещества, может привести к значительному снижению количества нуклеиновой кислоты, обнаруживаемой в печени, почке или других резервуаров вне кровотока. Так, например, выход частично фосфоротиоатированного олигонуклеотида в ткани печени может быть снижен при совместном введении с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидо-4'-изотиоциано-стилбен-2,2-дисульфоновой кислотой (М1уао е! а1., АпЦкенке Кек. Оеу., 1995, 5, 115-121; Такакига е! а1., Айкеше & №с1. Ас1б Эгид Оеу., 1996, 6, 177-183), где каждая из приведенных работ включена в настоящее описание полностью в качестве ссылки.
Наполнители
В отличие от термина соединение-носитель понятие фармацевтический носитель или наполнитель относится к фармацевтически приемлемому растворителю, средству, способствующему суспендированию, или другому фармакологически инертному переносчику, используемому для доставки одной или более нуклеиновых кислот в организм животного, и который представляет собой в типичном случае жидкость или твердое вещество. Фармацевтический носитель выбирают в основном для создания желательного объема, консистенции и т.п. при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами в данной фармацевтической композиции в условиях предполагаемого режима введения. Типичные фармацевтические носители включают в себя, без ограничения, связующие вещества (например, предварительно желированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.п.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или гидрофосфат кальция и т.п.); замасливатели (например, стеарат магния, тальк, силикагель, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрогенезированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.п.); средства, способствующие разложению (например, крахмал, натрий-крахмал-гликолят и т.п.); и смачивающие вещества (например, лаурилсульфат натрия и т.п.).
Фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, пригодные для непарентерального введения, которые не демонстрируют вредного взаимодействия с нуклеиновыми кислотами, также могут использоваться при получении композиций согласно изобретению. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают в себя, без ограничения, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремневую кислоту, вязкий пара
- 37 008940 фин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т. п.
Препараты для местного введения нуклеиновых кислот могут включать в себя стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в обычных растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Растворы могут также содержать буферы, разбавители и другие приемлемые добавки. Могут также использоваться фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, пригодные для непарентерального введения, которые не демонстрируют вредного взаимодействия с нуклеиновыми кислотами.
Другие компоненты фармацевтических композиций
Композиции согласно изобретению дополнительно могут содержать другие компоненты, традиционно включаемые в состав фармацевтических композиций, в количествах, установленных в данной области техники. Так, например, композиции могут содержать дополнительный совместимый фармацевтически активный материал, такой как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или могут содержать дополнительные материалы, используемые при создании различных дозированных форм физическими методами из композиций согласно изобретению, такие как красители, вкусовые вещества, консерванты, антиоксиданты, глушители, загустители и стабилизаторы. Однако такие материалы при добавлении не должны вступать в неблагоприятное взаимодействие с биологической активностью компонентов композиции согласно изобретению. Препараты могут быть подвергнуты стерилизации и, при желании, могут быть смешаны со вспомогательными средствами, например, с замасливателями, консервантами, стабилизаторами, смачивающими веществами, эмульгаторами, солями, влияющими на осмотическое давление, буферами, красителями, вкусовыми веществами и/или ароматическими веществами, которые не вступают в неблагоприятное взаимодействие с нуклеиновой(ими) кислотой(ами) в препарате.
Водные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, и которые включают в себя, например, натрий карбоксиметилцеллюлозу, сорбит, и/или декстран, и/или стабилизаторы.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются фармацевтические композиции, содержащие (а) один или более антивирусных олигонуклеотидов и (Ь) одно или более других химиотерапевтических средств, которые функционируют по другому механизму. Примеры таких химиотерапевтических средств включают в себя, без ограничения, даунорубицин, дауномицин, дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, эзорубицин, блеомицин, мафосфамид, ифосфамид, цитозин-арабонозид, бис-хлорэтилнитрозомочевину, бисульфан, митомицин С, актиномицин Ό, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилметамин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексилнитрозомочевину, азотные горчичные средства, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-азацитидин, гидроксимочевину, дезоксикоформицин, 4-гидроксипероксициклофосфорамид, 5фторурацил, (5-ФУ (5-ЕИ)), 5-фтордезоксиуридин (5-ФдУ (5-ЕИбВ)), метотрексат (МТХ), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид (УР-16), триметрексат, иринотекан, топотекан, гемцитабин, тенипозид, цисплатину и диэтилстилбестрол (ДЭС (БЕ8)). (См. по основным аспектам: Тбе Мегск Маша1 оГ Οίηβηοδίδ апб Тбегару, 15(6 Еб. 1987, рр. 1206-1228, Веткой еί а1., ебк., Ваб^ау, Ν1). В случае использования с соединениями согласно изобретению, такие химиотерапевтические средства могут применяться в виде отдельных средств (например, 5-ФУ и олигонуклеотид), последовательно (например, 5-ФУ и олигонуклеотид в течение определенного периода времени, после чего проводят введение МТХ и олигонуклеотида) или в сочетании с одним или более другими такими химиотерапевтическими средствами (например, 5-ФУ, МТХ и олигонуклеотид, или 5-ФУ, лучевая терапия и олигонуклеотид). Противовоспалительные средства, включающие в себя, без ограничения, нестероидные противовоспалительные средства и кортикостероиды, а также антивирусные средства, включающие в себя, без ограничения, рибавирин, цидофовир, видарабин, ацикловир и ганцикловир, могут быть также объединены в композициях согласно изобретению. (См. по основным аспектам: Тбе Мегск Магша1 оГ Οίηβηοδίδ аиб Тбегару, 15(6 Еб., Веткой е( а1., ебк., Вабгау, 1987, ΝΕ, 2499-2506 и 46-49, соответственно). Другие химиотерапевтические средства олигонуклеотидной природы также входят в область настоящего изобретения. Два или более объединенных соединения могут использоваться вместе или последовательно.
Примеры
Пример 1. Вирус простого герпеса (Негрек 81тр1ех).
Вирусом простого герпеса (Н8У) поражена значительная часть населения мира. В настоящем изобретении было обнаружено, что случайные ОДН или ОДН рандомеры ингибируют инфекционность вирусов, таких как Н8У. С использованием тестов на репликацию Н8У в клетках УЕВО (чувствительных к Н8У-1 (штамм КО8) и Н8У-2 (штамм М82) инфекции) было показано, что одноцепочечный Р8-ОДН, комплементарный к ориджину репликации Н8У, ингибирует репликацию Н8У-1 и Н8У-2. Было неожиданно обнаружено, что контролирующие Р8-ОДН, комплементарные к человеческому (343 АВ8) и плазмидному (рВВ322/рИС) ориджинам репликации, также ингибируют вирусную инфекционность. Эксперименты со случайными последовательностями Р8-ОДН и Р8-ОДН рандомерами показали, что ингибирование вирусной инфекции повышается с увеличением размера Р8-ОДН. Приведенные данные указы
- 38 008940 вают на то, что ОН являются мощными антивирусными средствами, которые могут использоваться для лечения в терапевтическом режиме вирусных инфекций.
Авторы настоящего изобретения высказали гипотезу, согласно которой потенциальным механизмом блокирования распространения вирусов, таких как ННУ, является предотвращение репликации ДНК. В свете такого подхода, в инфицированные клетки следует вводить фосфоротиоатные олигонуклеотиды (ОДН), комплементарные к ориджину репликации Н8У-1 и Н8У-2. Указанные ОДН будут вызывать образование трехцепочечной ДНК на вирусном ориджине репликации, блокируя тем самым ассоциацию необходимых транс-активных факторов и репликацию вирусной ДНК. Неожиданные результаты, которые были получены в данных экспериментах и приведены в настоящем описании, показывают, что в рамках данного экспериментального подхода, мощность ОДН по ингибированию вирусной инфекции повышается по мере увеличения их размера (длины).
Ингибирование Н8У-1
Способность Р8-ОДН ингибировать Н8У-1 измеряют в тесте на снижение бляшкообразования (ТСБ (РВА)). Иммортализованные клетки почки африканской зеленой мартышки (УЕВО) культивируют при 37°С в среде МЕМ при 5% содержании СО2 (минимальная эссенциальная среда) с 10% фетальной сыворотки теленка и с добавкой гентамицина, ванкомицина и амфотерицина В. Клетки высевают в 12ячеечные планшеты с плотностью, которая приводит к получению сливающихся монослоев клеток через 4 дня выращивания. После достижения состояния слияния среды заменяют на новые, содержащие только 5% сыворотки, плюс указанные выше добавки и клетки подвергают воздействию Н8У-1 (штамм КО8 в общем количестве примерно 40-60 КОЕ) в присутствии исследуемого соединения в течение 90 мин. После экспозиции с вирусом среды заменяют на новые наслаиваемые среды, содержащие 5% сыворотки, 1% иммуноглобулинов человека, указанные выше добавки и исследуемые соединения. Через 3-4 дня после инфекции подсчитывают количество бляшек после фиксации формалином и окрашивания инфицированных культур крезилом фиолетовым.
Все ОН (за исключением указанных особо случаев) синтезируют в лаборатории Университета Калгари (Ишуегкйу о£ Са1дагу Соге ΩΝΛ 8егуюек 1аЬ). ОН (см. табл. 1) получают в процессе синтеза в небольших масштабах, включающих 1-15 мкмоль, подвергают защите и обессоливанию на колонке длиной 50 нм с сефадексом (8ерНабех С-25). Полученные ОН анализируют методом гель-электрофореза при УФэкранировании и выявляют наличие ~95% видов олигонуклеотидов полной длины, н-1 и н-2 видов и до 5% более коротких видов олигонуклеотидов (которые, как считается, имеют случайные делеции). В случае синтеза случайных олигонуклеотидов смешивают в эквимолярных количествах амидиты аденина, гуанозина, цитозина и тимидина для максимизации случайности включения в каждое положение ОДН в ходе синтеза.
Для определения способности Р8-ОДН ингибировать Н8У-1 в тесте на снижение бляшкообразования под действием Н8У-1 исследуют ВЕР 1001, 2001 и 3007. Ожидалось, что только ВЕР 2001 будет демонстрировать какую-либо активность, поскольку данный Р8-ОДН направлен против ориджина репликации Н8У (два других направлены против ориджинов репликации в человеческих молекулах и плазмидах). Однако все три Р8-ОДН продемонстрировали анти-Н8У-1 активность (см. фиг. 1). Более того, мощность анти-Н8У-1-эффекта зависит от размера олигонуклеотида (см. фиг. 2).
Для подтверждения наличия зависимости анти-Н8У-1-активности от размера Р8-ОДН и независимости от состава соответствующей последовательности, авторы исследовали Р8-ОДН, которые варьируют по размеру (ВЕР 2002, 2003, 2004, 2005 и 2006). Указанные Р8-ОДН считаются инертными с точки зрения специфических эффектов состава последовательности, что достигается за счет синтеза каждого основания (Ν) по принципу нестрогого соответствия (или по принципу качелей), так что каждый Р8ОДН фактически отражает популяцию разных случайных последовательностей одного и того же размера, и указанные Р8-ОДН были названы термином рандомеры. При исследовании указанных олигонуклеотидов в тесте на Н8У-1 по снижению бляшкообразования, авторы обнаружили, что олигонуклеотиды из 10 оснований или менее не демонстрируют обнаруживаемой анти-Н8У-1-активности, но при повышении размера Р8-ОДН свыше 10 оснований эффективность также возрастает (ИК50 снижается, см. фиг. 3 и 4). Авторы также отмечают, что Р8-ОДН с размером более 20 оснований имеют значения ИК50 существенно ниже, чем клинически применяемый анти-Н8У-1-препарат, такой как ацикловир (см. фиг. 4).
Для лучшего определения диапазона эффективных размеров Р8-ОДН в качестве средств с антиН8У-1-активностью, авторы исследовали Р8-ОДН рандомеры в широком диапазоне размеров от 10 до 120 оснований (см. фиг. 5 и 6). Авторы обнаружили, что олигонуклеотиды из 12 оснований и более обладают заметной анти-Н8У-1-активностью, и что эффективность против Н8У-1 повышается при увеличении длины Р8-ОДН рандомера до 120 оснований. Однако повышение эффективности в расчете на одно основание при увеличении размера становится меньше в Р8-ОДН рандомерах с размером более чем 40 оснований (см. фиг. 7).
Для сравнения эффективности не-Р8-ОДН рандомеров, Р8-ОДН со случайной последовательностью и Р8-ОДН со специфичной для Н8У-1-последовательностью авторы исследовали три указанных типа модификаций ОДН с размерами 10, 20 и 40 оснований (см. фиг. 8 и 9). Немодифицированные ОДН рандомеры не демонстрируют заметной анти-Н8У-1-активности в исследованных размерах (см. фиг. 8а-с).
- 39 008940
Тогда как и случайная последовательность, и специфичная для Н8У-1-последовательность Р8-ОДН демонстрируют наличие зависимости анти-Н8У-1-активности от размера Р8-ОДН (никакой активности не обнаруживается при длине 10 оснований ни для одной из модификаций, см. фиг. 86 и д). Сравнение случайной последовательности, специфичной для Н8У-1-последовательности и рандомера Р8-ОДН (см. фиг. 10) показывает, что в случае Р8-ОДН из 20 оснований в длину отмечается усиление анти-Н8У-1активности для специфичной к Н8У-1-последовательности, но при длине 40 оснований все модификации, независимо от того, какая это последовательность: рандомер, случайная последовательность, или специфичная к Н8У-1 последовательность, были одинаково эффективными против Н8У-1.
Насколько известно авторам, впервые для Р8-ОДН были показаны столь низкие значения ИК50 против Н8У-1, как 0,059 и 0,043 мкМ.
Пример 2. Ингибирование Н8У-2.
Способность Р8-ОДН ингибировать Н8У-2 определяют в тесте на снижение бляшкообразования. Иммортализованные клетки почки африканской зеленой мартышки (УЕКО) культивируют при 37°С в среде МЕМ с 5% содержанием СО2 и 10% фетальной сывороткой теленка с добавкой гентамицина, ванкомицина и амфотерицина В. Клетки высевают в 12-ячеечные планшеты с плотностью, которая приводит к получению сливающихся монослоев клеток через 4 дня выращивания. После достижения состояния слияния среды заменяют на новые, содержащие только 5% сыворотки, плюс указанные выше добавки, и затем клетки подвергают воздействию Н8У-2 (штамм М82 в общем количестве примерно 40-60 КОЕ) в присутствии исследуемого соединения в течение 90 мин. После экспозиции с вирусом среды заменяют на новые наслаиваемые среды, содержащие 5% сыворотки, 1% человеческих иммуноглобулинов, указанные выше добавки и исследуемое соединение. Подсчет бляшек производят через 3-4 дня после инфекции после фиксации формалином и окрашивания инфицированных культур крезилом фиолетовым.
Для определения того, могут ли Р8-ОДН ингибировать Н8У-2, авторы исследовали КЕР 1001, 2001 и 3007 в тесте на Н8У-2 по снижению бляшкообразования. Ожидалось, что только КЕР 2001 будет демонстрировать какую-либо активность, поскольку данный Р8-ОДН направлен против ориджина репликации Н8У-1/2 (два других направлены против ориджинов репликации в человеческих молекулах и плазмидах), однако все три Р8-ОДН продемонстрировали анти-Н8У-2-активность (см. фиг. 12). Более того, мощность анти-Н8У-2-эффекта зависит от размера Р8-ОДН и не зависит от самой последовательности (см. фиг. 13).
Для подтверждения наличия зависимости анти-Н8У-2-активности от размера Р8-ОДН и независимости от состава соответствующей последовательности, авторы исследовали Р8-ОДН, которые варьируют по размеру (КЕР 2001, 2002, 2003, 2004, 2005 и 2006). Указанные Р8-ОДН считаются инертными с точки зрения специфических эффектов состава последовательности, что достигается за счет синтеза каждого основания (Ν) по принципу нестрогого соответствия (или по принципу качелей), так что каждый Р8-ОДН фактически отражает популяцию разных случайных последовательностей одного и того же размера, и указанные Р8-ОДН были названы термином рандомеры. При исследовании указанных олигонуклеотидов в тесте на Н8У-2 по снижению бляшкообразования, авторы обнаружили, что олигонуклеотиды из 10 оснований или менее не демонстрируют обнаруживаемой анти-Н8У-2-активности, но при повышении размера Р8-ОДН свыше 10 оснований эффективность также возрастает (ИК50 снижается, см. фиг. 14 и 15). Авторы также отмечают, что Р8-ОДН с размером более 20 оснований имеют значения ИК50 существенно ниже, чем клинически применяемый анти-Н8У-2-препарат, такой как ацикловир™ (см. фиг. 15).
Насколько известно авторам, впервые для Р8-ОДН было показано столь низкое значение ИК50 против Н8У-2, как 0,012 мкМ.
Для определения того, будет ли состав неспецифичной последовательности оказывать эффект на антивирусную активность ОН, несколько Р8-ОДН эквивалентного размера, но варьирующих по составу своих последовательностей, исследовали на анти-Н8У-1-активность в тесте на Н8У-1 по снижению бляшкообразования. Исследуемые Р8-ОДН включали КЕР 2006 (N20), КЕР 2028 (640), КЕР 2029 (А40), КЕР 2030 (Т40) и КЕР 2031 (С40). Значения ИК50, полученные в тесте на Н8У-1 по снижению бляшкообразования (см. фиг. 37), показывают, что КЕР 2006 (N40) был явно самым активным из всех исследуемых последовательностей, тогда как КЕР 2029 (А40) был наименее активным. Авторы также отмечают, что все другие Р8-ОДН были значительно менее активны чем N40, и эффективность убывала в следующем порядке: Ш0>С’40>Т40>А40>>640.
Авторы также исследовали эффективность различных Р8-ОДН, имеющих последовательности, варьирующие по двум отличающимся нуклеотидам (см. фиг. 37Ь). Р8-ОДН рандомер (КЕР 2006) был значительно более эффективным против Н8У-1, чем АС20 (КЕР 2055), ТС20 (КЕР 2056) или А620 (КЕР 2057), и их эффективность снижалась в следующем порядке: Ш0>А6>АОТС'. Приведенные данные позволяют полагать, что несмотря на то, что антивирусный эффект не зависит от комплементарности последовательностей, состав некоторых неспецифических последовательностей (например, С40 и N40) характеризуется наиболее мощной антивирусной активностью. Авторы также предположили, что указанное явление может быть объяснено тем фактом, что, сохраняя присущую им способность связываться
- 40 008940 с белками, последовательности, такие как С40, А40, Т40 и 040, связывают меньше вирусных белков с высокой аффинностью, вероятно, в связи с наличием некоторых особенностей третичной структуры, образуемой указанными последовательностями. С другой стороны, в связи со случайной природой Ν40, указанная последовательность сохраняет свою способность связываться с высокой аффинностью с большим числом антивирусных белков, что вносит вклад в его жесткую антивирусную активность.
Пример 3. Ингибирование СМУ.
Способность Р8-ОДН ингибировать СМУ определяют в тесте на снижение бляшкообразования (ТСБ (РКА)). Указанный тест идентичен тесту, используемому для тестирования анти-Н8У-1 и антиН8У-2-активности, за исключением того, что используют СМУ (штамм АЭ169) в качестве вирусного инокулята и в качестве хозяйских клеток используют человеческие фибробласты.
Для исследования наличия зависимости СМУ-активности от размера Р8-ОДН и независимости от самой последовательности, авторы исследовали Р8-ОДН рандомеры, варьирующие по размеру (см. фиг. 16а,Ь). При исследовании данных Р8-ОДН в тесте на СМУ по снижению бляшкообразования, авторами было показано, что по мере повышения размера Р8-ОДН их эффективность также возрастает (ИК50 снижается, см. фиг. 16с).
Для того чтобы более четко определить диапазон эффективных размеров Р8-ОДН для достижения анти-СМУ-активности, авторы исследовали Р8-ОДН рандомеры с использованием широкого диапазона размеров от 10 до 80 оснований. В данный тест были также включены несколько клинически применяемых для лечения СМУ небольших молекул (ганцикловир, фоскарнет и цидофовир), а. также 2 варианта имеющегося на фармацевтическом рынке препарата антисмыслового действия для лечения ретинита, вызванного СМУ (витравен™ (Уйгауепе™), синтезированный в Университете Калгари и коммерчески доступный) (см. фиг. 17). Авторы показали, что по мере повышения размера Р8-ОДН отмечается повышение эффективности, и насыщение эффекта наступает при наличии 40 оснований (см. фиг. 18). Кроме того, все Р8-ОДН рандомеры с 20, 40 и 80 основаниями значительно более эффективны, чем любая из малых исследованных молекул, применяемых для лечения (см. фиг. 17). Дополнительно было показано, что Р8-ОДН рандомеры, включающие в себя 40 и 80 оснований, более эффективны, чем Витравен™.
Насколько известно авторам, впервые для Р8-ОДН было показано столь низкое значение ИК50 против СМУ, как 0,067 мкМ.
Пример 4. Ингибирование ВИЧ-1.
Способность Р8-ОДН рандомеров ингибировать ВИЧ-1 определяют в двух разных тестах.
Цитопатический эффект (ЦПЭ).
Цитопатический эффект отслеживают с использованием красителя МТТ для оценки уровня клеточного метаболизма. Иммортализованные человеческие лимфоциты (МТ4) культивируют при 37°С в среде МЕМ с содержанием 5% СО2, 10% фетальной сыворотки теленка и с добавкой антибиотиков. Клетки высевают в 96-ячеечные планшеты в средах, содержащих соответствующее исследуемое соединение, и инкубируют в течение 2 ч. После предварительной инкубации с исследуемым соединением ВИЧ-1 (штамм ΝΓ 4-3) вносят в ячейки (0,0002 ТСГО50/ячейку (СЦПД50/ячейку)). После 6 дней дополнительной инкубации ЦПЭ оценивают по превращению красителя МТТ. Цитотоксичность измеряют при инкубации лекарственных средств в течение 6 дней в отсутствие вирусного инокулята. Для преобразования значений величины поглощения МТТ в % выживаемости, величину поглощения неинфицированных необработанных клеток принимают за 100%, а величину поглощения инфицированных необработанных клеток принимают за 0%.
Тест на репликацию (ТР).
Способность ВИЧ реплицироваться отслеживают в иммортализованных клетках эмбриональной почки человека (293А). Указанные клетки подвергают совместной трансфекции с использованием двух плазмид. Одна плазмида содержит рекомбинантный геном ВИЧ-1 дикого типа (ΝΣ 4-3), включающий ген епу, разрушенный кассетой экспрессии люциферазы (определенный как штамм СМОО), другая плазмида содержит ген епу из вируса мышиного лейкоза (МЬУ). Обе указанных плазмиды обеспечивают всеми транс-активными белковыми факторами, необходимыми для получения зрелого химерного вируса, который содержит все компоненты из ВИЧ-1, кроме белковых продуктов, обеспечиваемых в трансактивной форме за счет епу гена из МЬУ. Вирионы, получаемые из указанных клеток, являются инфекционными, способными к репликации, но они не могут продуцировать другую генерацию инфекционных вирионов, потому что не содержат продуктов гена епу.
Через 24 ч после трансфекции клетки подвергают обработке трипсином и вносят в 96-ячеечные планшеты. После прилипания клеток среды отбирают и заменяют средами, содержащими исследуемое соединение. Оставляют еще на 24 ч для вирусной продукции. Затем супернатант собирают и используют для повторной инфекции не подвергавшихся обработке клеток 293А. Клетки, которые были инфицированы, из числа не подвергавшихся обработке, идентифицируют с помощью продукта люциферазного гена. Число клеток, положительных по люциферазе, является мерой уровня репликации и/или инфекции рекомбинантным ВИЧ-1. Указанный тест также адаптирован для исследования резистентности ко многим клинически применяемым анти-ВИЧ-1-средствам путем использования генома ВИЧ-1 с нескольки
- 41 008940 ми точечными мутациями, в отношении которых известно, что они индуцируют резистентность к ряду анти-ВИЧ-1-препаратов разных классов. Процент ингибирования принимается за 100% в случае отсутствия обнаруживаемых положительных по люциферазе клеток и за 0% для числа положительных клеток в инфицированных необработанных контролях.
Для исследования зависимости анти-ВИЧ-1-активности от размера Р8-ОДН и независимости от самой последовательности, авторы исследовали Р8-ОДН рандомеры, варьирующие по размеру. При тестировании данных Р8-ОДН рандомеров в рамках теста ЦПЭ на ВИЧ-1, авторы обнаружили, что по мере увеличения размеров Р8-ОДН, эффективность их также повышается (ИК50 снижается, см. фиг. 19а,Ь и 20). Авторы также отмечают, что Р8-ОДН рандомеры не демонстрируют существенной токсичности в отношении хозяйских клеток в данном тесте (см. фиг. 19с,й).
Насколько известно авторам, впервые для Р8-ОДН было показано столь низкое значение ИК50 против ВИЧ-1, как 0,011 мкМ.
Для более четкого определения диапазона эффективных размеров Р8-ОДН для анти-ВИЧ-1активности, авторы исследовали большое число Р8-ОДН рандомеров в широком диапазоне размеров от 10 до 80 оснований в тесте на репликацию с использованием ВИЧ-1 дикого типа (рекомбинантный ΝΣ 43 (С'АОО)). Дополнительно, авторы исследовали четыре ингибитора протеазы, которые в настоящее время используются в клинике (апренавир, индинавир, лопинавир и саквинавир). Авторами было обнаружено, что Р8-ОДН рандомеры, содержащие 10 оснований и более, обладают анти-ВИЧ-1-активностью и эффективность против ВИЧ-1 повышается с повышением длины Р8-ОДН рандомеров, но при длине 40 оснований наступает состояние насыщения (см. фиг. 21е-11 и 22Ь). Кроме того, Р8-ОДН рандомеры из 40 и 80 оснований были практически эквивалентны по эффективности четырем клиническим контролям (см. фиг. 21а-й и 22а).
Насколько известно авторам, впервые для Р8-ОДН было показано столь низкое значение ИК50 против ВИЧ-1, как 0,014 мкМ.
Для исследования способности Р8-ОДН рандомеров подавлять резистентный к лекарственному средству штамм ВИЧ, авторы повторили указанный выше тест с использованием рекомбинантного штамма ВИЧ-1 МОК.С4. Указанный рекомбинантный штамм демонстрирует существенную резистентность по меньшей мере к 16 различным клинически применяемым лекарственным средствам из разных классов: нуклеотидные ингибиторы ОТ, ненуклеотидные ингибиторы ОТ и ингибиторы протеазы. Все Р8-ОДН рандомеры действуют против резистентного штамма так же, как они действуют против штамма дикого типа (см. фиг. 23е-11). Однако три из четырех ингибиторов протеазы демонстрируют снижение их эффективности против мутантного штамма (см. фиг. 23а-й и 24), так что Р8-ОДН рандомеры из 40 и 80 оснований являются в настоящее время более мощными средствами против резистентного штамма, чем данные лекарственные средства.
Пример 5. Ингибирование К.8У.
Способность Р8-ОДН ингибировать Я8У определяют в рамках теста на ЦПЭ с использованием красителя аламара синего (опосредованный показатель уровня клеточного метаболизма). Клетки рака гортани человека (Нер2) культивируют при 37°С в среде МЕМ с содержанием 5% СО2 и 5% фетальной сыворотки теленка. Клетки высевают в 96-ячеечные планшеты с плотностью, которая приводит к получению монослоя сливающихся клеток через 5-6 дней выращивания. На следующий день после внесения в планшеты клетки инфицируют К.8У (штамм А2, 108,2 ТСШ50/мл (СЦПД50/мл)) в присутствии исследуемого соединения в сниженном объеме в течение 2 ч. После инокуляции среды заменяют и добавляют исследуемое соединение. Через 6 дней после инфекции отслеживают ЦПЭ путем измерения уровня превращения флуоресцентного красителя аламара синего. Токсичность исследуемых соединений для клеток Нер2 оценивают при обработке неинфицированных клеток в течение 7 дней с последующим измерением уровня превращения аламара синего в указанных клетках. Уровень превращения аламара синего в неинфицированных необработанных клетках принимают за 100% выживаемости, и уровень в инфицированных необработанных клетках принимают за 0% выживаемости.
Для подтверждения наличия зависимости анти-Я8У-активности от размера Р8-ОДН и независимости от самой последовательности, авторы исследовали Р8-ОДН рандомеры, варьирующие по размеру. Кроме того, в тестирование был включен препарат, применяемый в клинических условиях для лечения Я8У-инфекции, рибавирин (виразол™ (У|гахо1е™)). При исследовании в тесте на ЦПЭ Я8У авторы обнаружили, что по мере увеличения размера Р8-ОДН рандомера эффективность также возрастает, но при достижении размера 40 оснований наступает состояние насыщения (см. фиг. 25а-с и 26). Авторы также отмечают, что Р8-ОДН рандомеры, включающие 20, 40 и 80 оснований, имеют значения ИК50, которые значительно ниже, чем у клинически применяемого анти-Я8У-препарата рибавирина (см. фиг. 25а-й и 26). Р8-ОДН рандомеры не демонстрируют токсичности в клетках Нер2, тогда как рибавирин характеризуется значительной токсичностью (терапевтический индекс = 2,08, см. фиг. 25е-11).
Насколько известно авторам, впервые для Р8-ОДН было показано столь низкое значение ИК50 против Я8У-1, как 0,015 мкМ.
- 42 008940
Пример 6. Ингибирование вируса Коксаки В2.
Способность Р8-ОДН рандомеров ингибировать СОХ В2 определяют в рамках теста на ЦПЭ с использованием красителя аламара синего (опосредованный показатель уровня клеточного метаболизма). Клетки почки макаки Резус (ЬЬС-МК2) культивируют при 37°С в среде МЕМ с содержанием 5% СО2 и 5% фетальной сыворотки теленка. Клетки высевают в 96-ячеечные планшеты с плотностью, которая приводит к получению монослоя сливающихся клеток через 5-6 дней выращивания. На следующий день после внесения в ячейки клетки инфицируют СОХ В2 (штамм ОЫо-1, 107,8 ТСГО50/мл (СЦПД50/мл)) в присутствии исследуемого соединения в сниженном объеме в течение 2 ч. После инокуляции среды заменяют и вводят исследуемое соединение. Через 6 дней после инфекции определяют ЦПЭ путем измерения по флуоресцентному методу уровня превращения аламара синего. Токсичность исследуемого соединения для клеток ЬЬС-МК2 оценивают при обработке инфицированных клеток в течение 7 дней с последующим измерением уровня превращения аламара синего в указанных клетках. Уровень аламара синего в неинфицированных необработанных клетках принимают за 100% выживания, тогда как его уровень в инфицированных необработанных клетках принимают за 0% выживания.
Авторы исследовали анти-СОХ В2-активность КЕР 2006 в тесте на СОХ В2 по методу определения ЦПЭ. Было показано, что Р8-ОДН рандомер, демонстрируя небольшую токсичность для клеток ЬЬСМК2 (см. фиг. 27Ь), был способен частично спасать инфицированные клетки ЬЬС-МК2 от СОХ В2 инфекции (см. фиг. 27а).
Пример 7. Ингибирование вируса оспы.
Авторы использовали инфекцию вируса оспы как модель для определения потенциальной эффективности соединений согласно изобретению против поксвирусов, включая вирус оспы. Способность Р8ОДН рандомеров ингибировать вирус оспы определяют путем оценки ЦПЭ в тесте с использованием красителя аламара синего (опосредованный показатель уровня клеточного метаболизма). Клетки УЕКО культивируют при 37°С в среде МЕМ с содержанием 5% СО2 и 5% фетальной сыворотки теленка. Клетки высевают в 96-ячеечные планшеты с плотностью, которая приводит к получению монослоя сливающихся клеток через 5-6 дней выращивания. На следующий день после внесения в планшет клетки инфицируют вирусом оспы (107,9 ТСГО50/мл (СЦПД50/мл)) в присутствии исследуемого соединения в сниженном объеме в течение 2 ч. После инокуляции среды заменяют и вводят исследуемые соединения (все в количестве 10 мкМ, за исключением цидофовира, который используют в количестве 50 мкМ). Через пять дней после инфекции собирают супернатанты. Вирусную нагрузку в супернатанте определяют при повторной инфекции клеток УЕКО супернатантом, разбавленным в соотношении 1:100, с оценкой ЦПЭ через 7 дней после повторной инфекции путем измерения по флуоресцентному методу уровня превращения аламара синего.
Авторы исследовали Р8-ОДН рандомеры, варьирующие по размеру (КЕР 2004, 2006 и 2007). Кроме того, в тест был включен известный как эффективный препарат, применяемый для лечения инфекции вирусом осповакцины цидофовир (вистид™ (У18кбе™)). В рамках теста на вирус осповакцины по методу ЦПЭ авторы обнаружили, что лечение с использованием всех исследованных средств, КЕР 2004, 2006 и 2007, оказывает антивирусную активность (т.е. супернатанты демонстрируют сниженный ЦПЭ при повторной инфекции), но данная активность была слабее, чем в случае применения цидофовира (см. фиг. 36).
Пример 8. Ингибирование ЭНВУ, вируса парагриппа-3 и хантавируса.
Поскольку ОНВУ, вирус парагриппа-3 и хантавирус не могут быть достаточно просто определены по уровню бляшкообразования или в тесте на ЦПЭ, авторы исследовали эффективность КЕР 2006 для данных вирусов с использованием интенсивности флуоресценции бляшкообразующих единиц (Ф-БОЕ (РРРИ)). В данном тесте КЕР 2006 (в конечной концентрации 10 мкМ) смешивают с вирусом, который затем адсорбируется на эти клетки. После адсорбции инфицированные клетки оставляют для инкубации еще в течение 7-14 дней, после чего проводят фиксацию метанолом. Участки вирусной репликации выявляют методом иммунофлуоресцентной микроскопии против соответствующего вирусного антигена. Для каждого из трех исследованных вирусов были использованы специфические экспериментальные условия и полученные результаты приведены ниже.
- 43 008940
Вирус Клетки организма хозяина Антитела для выявления методом Ф-БОЕ Уровень Ф-БОЕ (без лекарственного средства) Уровень Ф-БОЕ (10 мкМ КЕР 2006)
ЦНВУ (суррога тный НВУ) Первичные гепатоциты утки Мышиный анти-ЭНВУ 1дС 163+/-38,5 0
Вирус парагрип па-3 Клетки ЬЪС-МК2 Мышиный ЭНТИ-Р13 1дС 288+/-126 0
Хантавир ус (штамм Ргозресб ΗΪ11) Клетки УЕКО Е6 Мышиный 1дС против нуклеопротеина ЗгпЦотЬге 232,3+/-38,17 0
Первоначальные результаты показывают, что в количестве 10 мкМ КЕР 2006 эффективен по ингибированию ЭНВУ, вируса парагриппа-2 и хантавируса. Авторы ожидали, что ввиду жесткой реакции, выявленной в первоначальном тесте, значения ИК50 будут ниже. Приведенные данные подтверждают предположение об эффективности Р8-ОДН рандомеров при лечении инфекций человека, вызванных хантавирусом и вирусом гепатита В (вирус, близко родственный ЭНВУ), а также дают инструмент для интенсивного лечения детского бронхиолита, вызванного К8У и вирусом парагриппа-3, в случае которого не будет уже потребности в дифференциальной диагностике для выбора стратегии лечения.
Пример 9. Известные в настоящее время неотзывчивые вирусы.
К настоящему времени не наблюдалось выраженной антивирусной эффективности при использовании Р8-ОДН рандомеров (в количестве до 10 мкМ) без использования системы доставки, сочетания лекарственных средств или химической модификации в следующих вирусных системах:
Вирус Штамм Клетки организма хозяина Принцип тестирования
Вирус гриппа А Η3Ν2 Клетки МОСК Снижение числа бляшек
Коронавирус (суррогатный вирус, вызывающий ЗАКЗ) МНУ2 (мышиный) МНУ-А59 (мышиный) НСоУ-ОС43 (человеческий) Клетки ЦСТС-1496 Клетки ОВТ Клетки НВТ-18 Снижение числа бляшек
ВУОУ (суррогатный НСУ) н.и. Клетки ВТ Оценка ЦПЭ по красителю аламару синему
Риновирус НОР Клетки НеЬа Оценка ЦПЭ по красителю аламару синему
Аденовирус Человеческий Αά5 Клетки 293А Снижение числа бляшек
В рамках использованных процедур тестирования авторы не смогли продемонстрировать искомой активности. Однако отсутствие антивирусной активности может быть связано со сниженным поступлением Р8-ОДН в клетки в данных условиях анализа. Тем не менее, в настоящее время проводятся дополнительные исследования с целью достижения эффективных результатов также для данных вирусов. Указанные вирусы могут реагировать на Р8-ОДН при использовании системы доставки, такой как липосомальная композиция, с целью повышения их внутриклеточной концентрации. Сочетание Р8-ОДН с другим антивирусным лекарственным средством, таким как описанное выше, также может демонстрировать антивирусную эффективность для данных вирусов. Может быть также полезна химическая модификация для повышения внутриклеточной концентрации с тем, чтобы сделать Р8-ОДН активными против данных вирусов.
Поскольку было получено достаточно доказательств того, что показатели, определяемые зарядом
Р8-ОДН, важны для ингибирования вирусов, принадлежащих к разным семействам, авторы ожидают, что данный механизм зависимости от заряда, действующий при ингибировании вирусной активности, обладает потенциалом по подавлению активности всех инкапсидированных вирусов. При таком подходе к пониманию явлений, отсутствие выявляемой антивирусной эффективности против вирусов, перечисленных в примере 9, позволяет предположить, что взаимодействие между Р8-ОДН и структурными белками данных вирусов недостаточно сильное для предупреждения взаимодействия вирусных белков в
- 44 008940 процессе репликации данных вирусов. Одним из способов достижения эффективности против таких вирусов является изменение заряженности ДНК или антивирусного полимера (например, посредством замены фосфоротиоатных связей в ДНК фосфородитиоатными) с тем, чтобы повысить их аффинность к вирусным белкам.
Пример 10. Тест для определения, действует ли олигонуклеотид преимущественно по механизму активности, не связанному с комплементарностью последовательностей.
ОН, например, рассматриваемый ОДН, будет считаться как действующий преимущественно по механизму активности, не связанному с комплементарностью последовательностей, если он удовлетворяет критерию одного из трех приведенных ниже тестов.
Тест №1 - Эффект частичной вырожденности на антивирусную эффективность
Данный тест служит для определения антивирусной активности конкретной последовательности ОН, когда часть его последовательности становится вырожденной. Если вырожденный вариант ОН, имеющий тот же химический состав, сохраняет свою активность, как указано ниже, то следует полагать, что он функционирует преимущественно по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей. ОН создаются вырожденными по следующему правилу:
Е,..· = количество оснований в исходном ОН
X = количество оснований на каждом конце олигонуклеотида, подлежащего модификации вырожденности (но который будет иметь тот же химический состав, что и исходный ОН)
Если ЬО. четный, то X = БО.-/4
Если Б,,..· нечетный, то X = целое число (БОк/4)+1.
Каждое вырожденное основание будет синтезироваться в соответствии с подходящей методикой, т.е. по приведенной в настоящем описании методике синтеза Р8-ОДН рандомеров.
Если заявленный ОН имеет антивирусную активность против представителя семейства Негрекушбае, Ве!гоушбае или Рагатухоушбае, то значение показателя ИК50 получают с помощью описанного теста для данного семейства вирусов, предпочтительно с использованием указанных вирусных штаммов. Если заявленный ОН обладает антивирусной активностью против представителя конкретного семейства вирусов, не указанного выше, то значение показателя ИК50 получают в соответствии с тестом на антивирусную эффективность, применяемым в фармацевтической отрасли. Значения показателя ИК50 получают с использованием минимум семи концентраций соединения, при оценке трех или более точек в линейном диапазоне на кривой доза-ответ. С использованием данного теста значение показателя ИК50 для данного ОН сравнивают с его вырожденным вариантом. Если значение показателя ИК50 для вырожденного ОН менее чем в 2 раза превосходит показатель для исходного ОН, когда ОН состоит из 25 и менее оснований, или менее чем в 10 раз превосходит данный показатель для исходного ОН, когда ОН состоит из 26 и более оснований (по результатам минимум трехкратных измерений, когда стандартное отклонение не превышает 15% от среднего значения), то данный ОН рассматривается как действующий преимущественно по механизму активности, не связанному с комплементарностью последовательностей.
Тест №2 - Сравнение эффективности с рандомером
Данный тест служит для сравнения антивирусной эффективности ОН с антивирусной эффективностью случайного ОН эквивалентного размера и того же химического состава в отношении того же вируса или семейства вирусов.
Если заявленный ОН обладает антивирусной активностью против представителя семейства Негрекушбае, ВеЕоушбае или Рагатухоушбае, то значение показателя ИК50 получают при проведении описанного в настоящем изобретении теста для данного семейства вирусов, предпочтительно с использованием указанных вирусных штаммов. Если заявленный ОН обладает антивирусной активностью против представителя конкретного семейства вирусов, не указанного выше, то значение показателя ИК50 получают в соответствии с тестом на антивирусную эффективность, применяемым в фармацевтической отрасли. Значение показателя ИК50 получают с использованием минимум семи концентраций соединений, при оценке трех или более точек в линейном диапазоне на кривой доза-ответ. С использованием данного теста значение показателя ИК50 для данного ОН сравнивают с соответствующим значением для ОН рандомера эквивалентного размера и того же химического состава. Если значение показателя ИК50 для вырожденного ОН менее чем в 2 раза превосходит показатель для исходного ОН, когда ОН состоит из 25 и менее оснований, или менее чем в 10 раз превосходит данный показатель для исходного ОН, когда ОН состоит из 26 и более оснований (по результатам минимум трехкратных измерений, когда стандартное отклонение не превышает 15% от среднего значения), то данный ОН рассматривается как действующий преимущественно по механизму активности, не связанному с комплементарностью последовательностей.
Тест №3 - Сравнение эффективности в отношении другого семейства вирусов
Данный тест служит для сравнения эффективности ОН против целевого вируса, геном которого гомологичен данному ОН, с эффективностью ОН против второго вируса, геном которого не гомологичен данному ОН. Во многих случаях указанный другой вирус выбирают из семейства вирусов, отличного от того вирусного семейства, к которому принадлежит данный целевой вирус (вирус-мишень). Сравнение уровня активности ОН в отношении целевого вируса и второго вируса проводят на основе определения активности рандомера той же длины и того же химического состава относительно обоих вирусов для
- 45 008940 нормализации значений показателя ИК50 для ОН, получаемых при оценке двух вирусов.
Таким образом, если заявленный ОН обладает антивирусной активностью против определенного вируса, то вычисление значения показателя ИК50 проводят в отношении данного вируса с использованием одного из приведенных в настоящем описании тестов для представителей семейств Негрекушбае, Ке!гоушбае или Рагатухоушбае или с использованием другого известного в данной области теста. Аналогично, определение значения показателя ИК50 проводят для ОН против второго вируса с использованием одного из приведенных в настоящем описании тестов для того вируса, геном которого не гомологичен последовательности данного ОН. Определение значения показателя ИК50 проводят для рандомера эквивалентного размера и того же химического состава при исследовании относительно каждого из вирусов. Используют значения показателя ИК50, характеризующие эффективность рандомера против двух вирусов, с целью нормализации показателей ИК50 для конкретного ОН следующим образом:
1) преобразуют алгебраически значение ИК50 для ОН и рандомера относительно первого (гомологичного) вируса так, чтобы значение показателя ИК50 для рандомера стало равным 1;
2) преобразуют алгебраически значение ИК50 для ОН и рандомера относительно второго (не гомологичного) вируса так, чтобы значение ИК50 для рандомера стало равным 1;
3) коэффициент, определяющий кратность значений ИК50 для ОН в случае гомологичного вируса относительно негомологичного вируса, вычисляют при делении преобразованного значения ИК50 для ОН относительно негомологичного вируса на значение ИК50 для ОН относительно гомологичного вируса.
В случае ОН, имеющего длину менее 25 оснований, данный ОН будет рассматриваться как функционирующий по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей, если указанный выше коэффициент меньше 2. В случае ОН, имеющего длину из 25 оснований или более, такой ОН будет рассматриваться как функционирующий по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей, если данный коэффициент меньше 10.
Тест №4 - Эффективность для другого семейства вирусов
Данный тест служит для определения того, обладает ли данный ОН активностью, подобной лекарственному средству, в отношении вируса, когда последовательность указанного ОН не гомологична любой из частей вирусного генома. Таким образом, данный ОН будет анализироваться с использованием одного из приведенных в описании тестов для представителей семейств Негрекушбае, Кебоушбае или Рагатухоу1ббае так, чтобы последовательность исследуемого ОН была не гомологична любой из частей генома используемого вируса. Значения показателя ИК50 определяют с использованием минимум семи концентраций ОН при оценке трех или более точек в линейном диапазоне. Если полученная кривая доза-ответ указывает на наличие активности, подобной лекарственному средству (что в типичном случае отмечается как впадина или наличие сигмоидной кривой, указывающих на снижение антивирусной эффективности при снижении концентраций ОН) и значение показателя ИК50, получаемое в соответствии с указанной кривой, составляет менее 1 мкМ, то данный ОН будет рассматриваться как обладающий активностью, подобной лекарственному средству. Если ОН рассматривается как обладающий активностью, подобной лекарственному средству, относительно вируса, к которому ОН не комплементарен и, таким образом, не может иметь активности, зависимой от комплементарности последовательностей, то следует полагать, что он функционирует по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей.
Пороговые значения, использованные в данных тестах.
В настоящее время отсутствуют научные или эмпирические данные ни в академической сфере, ни в промышленной отрасли, для создания антисмысловых ОН, длина которых превышала бы 25 оснований. Кроме того, насколько известно авторам, никогда еще не было препарата ОН, разрешенного для испытания на людях, который бы содержал ОН с длиной более 25 нуклеотидов.
В свете данных фактов авторы установили два различных пороговых значения, которые были использованы для определения последовательности, как функционирующей преимущественно по механизму действия, не связанному с комплементарностью оснований. В случае олигонуклеотидов, включающих 25 оснований и менее, данный ОН должен обладать антивирусной активностью, которая превосходит по меньшей мере в 2 раза активность рандомера или вырожденного ОН того же химического состава, с тем, чтобы он рассматривался как действующий преимущественно по антисмысловому механизму. Если антисмысловой ОН не действует по меньшей мере в два раза лучше, чем рандомер или вырожденный ОН, то следует констатировать, что более половины его активности определяется действием, не связанным с антисмысловым механизмом.
В случае ОН, включающих 26 оснований и более, данный ОН должен обладать антивирусной активностью, которая по меньшей мере в 10 раз (1 1од) превышает активность рандомера или вырожденного ОН того же химического состава с тем, чтобы он рассматривался как действующий по антисмысловому механизму. Выбор авторами такого крупного порогового значения определяется тем, что в связи с современным состоянием достижений в данной области по разработке ОН антисмыслового действия следует полагать, что олигонуклеотиды, которые составляют 26 оснований в длину и более и которые заявляются как обладающие антивирусной активностью, разрабатываются на основании описанного подхода согласно изобретению (оптимальная длина применяемых антисмысловых ОН составляет в ос- 46 008940 новном от 16 до 21 основания).
Описанные в приведенных выше тестах 1-3 пороговые значения являются заданными параметрами. Если конкретно указано иное, то могут использоваться другие пороговые значения, отличные от значений, приведенных выше в тестах 1-3. Так, например, для ОН, включающих в длину менее 25 оснований, и/или для ОН, включающих в длину 25 и более оснований, если есть конкретное указание, пороговое значение для определения того, действует ли данный ОН принципиально по механизму активности, не связанному с комплементарностью последовательностей, может представлять собой любое значение из приведенного перечня: 10-, 8-, 6-, 5-, 4-, 3-, 2-, 1,5-кратное или равное значение. Пороговое значение, указанное в тесте 4, также является заданным показателем. Однако, если есть особое указание, то пороговое значение для определения того, будет ли данный ОН функционировать преимущественно по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей, согласно тесту 4, может представлять собой значение ИК50 менее чем 1, 0,8, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 или 0,1 мкМ. Аналогично, хотя заданным параметром является также достаточность соответствия любому одному критерию из указанных выше 4 тестов, если конкретно указано иное, то для ОН может требоваться соответствие любым двум (например, критериям тестов 1 и 2, 1 и 3, 1 и 4, 2 и 3, 2 и 4, и 3 и 4) или любым трем (например, тестам 1 и 2 и 3, 1 и 3 и 4, и 2 и 3 и 4) или критериям всех 4 тестов в качестве заданного порогового значения, или, если особо оговорено иное, может быть использовано другое значение порогового уровня.
Тест на антивирусную активность против НегреМпбае
Тест на снижение бляшкообразования проводят следующим образом.
Для Ηδν-1 или Ηδν-2 клетки УЕКО (АТСС# ССЬ-81) выращивают до слияния в 12-ячеечных планшетах, применяемых для культивирования тканей (NυNС или эквивалентные планшеты) при 37°С и при наличии 5% СО2 в среде МЕМ с добавкой 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка, а также гентамицина, ванкомицина и амфотерицина В. Как только клетки достигают состояния слияния, среды заменяют на новые среды, содержащие 5% фетальной сыворотки теленка и антибиотики, указанные выше, с введением Ηδν-1 (штамм КО8, 40-60 КОЕ всего) или Ηδν-2 (штамм М82, 40-60 КОЕ всего). Адсорбцию вирусов проводят в течение 90 мин, после чего клетки промывают и среды замещают новой наслаиваемой средой, которая содержит 5% фетальной сыворотки теленка и 1% человеческих иммуноглобулинов. Через 3-4 дня после адсорбции клетки фиксируют формалином и подсчитывают количество бляшек после фиксации формалином.
В случае СМV выращивают клетки фибробластов человека в условиях, указанных для клеток УЕКО в тесте на Ηδν-1/2. Компоненты среды и процедуры адсорбции/наслаивания идентичны указанным выше за рядом следующих исключений:
1. СМУ (штамм АО169, 40-60 КОЕ всего) используют для инфекции клеток в ходе адсорбции.
2. В наслаиваемой среде 1% человеческих иммуноглобулинов заменяют 4% легкоплавкой агарозы.
В случае других представителей Ηе^рекν^^^бае определение проводят в тесте на снижение бляшкообразования, описанном выше, с использованием соответствующих хозяйских клеток и вируса в количестве 40-60 КОЕ в ходе адсорбции.
Данный тест рассматривается как пригодный для оценки, если к концу тестирования имеются идентифицируемые бляшки в отсутствие соединения.
Значение ИК50 представляет собой концентрацию, при которой обнаруживается 50% бляшек в сравнении с необработанным контролем.
Исследуемое соединение присутствует на стадии адсорбции и в наслаиваемой среде.
Антивирусный тест против КеЕ^шбае
Определение общего количества р24 в супернатанте ВИЧ-1-инфицированных клеток проводят следующим образом.
Человеческие МНКПК (РВМС) инфицируют первичным изолятом ВИЧ-1 в присутствии исследуемого соединения. Затем клетки инкубируют еще в течение 7 дней в свежей среде с добавкой соединения, после чего определяют уровень р24 в супернатанте с использованием коммерческого набора для определения р24 методом ЕБКА (В1ОМЕК1ЕИХ или эквивалентный набор).
Данный тест рассматривается как пригодный для оценки, если имеется накопление р24 в супернатанте культур ткани инфицированных необработанных клеток.
Значение ИК50 представляет собой концентрацию, при которой выявляемое количество р24 составляет 50% от р24, присутствующего в необработанном контроле.
Соединение, подлежащее тестированию, присутствует на стадии адсорбции и в средах после адсорбции.
Антивирусный тест против Ра^атуxον^^^бае
В случае Ε,δν оценку ЦПЭ проводят следующим образом.
Клетки Нер2 помещают в ячейки 96-ячеечных планшетов и растят в течение ночи в среде МЕМ с добавкой 5% фетальной сыворотки теленка при 37°С и при содержании 5% СО2. На следующий день клетки инфицируют Ε,δν (штамм А2, 108,2 ТСШ50/мл (СЦПД50/мл) в количестве 100 мкл/ячейку) и про
- 47 008940 водят адсорбцию в течение 2 ч. По окончании адсорбции среды заменяют и после 7 дней выращивания оценивают ЦПЭ по превращению красителя аламара синего в свой флуоресцентный аддукт под действием живых клеток.
Данный тест рассматривается как пригодный для оценки, если уровень ЦПЭ (по количеству превращенного аламара синего) в инфицированных клетках в отсутствие соединения составляет 10% от уровня его превращения в неинфицированных клетках.
Для сравнения значений ИК50 уровень ЦПЭ в инфицированных клетках принимают за 100%, тогда как его уровень, отмечаемый в неинфицированных клетках, принимают за 0% ЦПЭ. В этом случае ИК50 представляет собой концентрацию соединения, которая приводит к 50% ЦПЭ.
Соединение, подлежащее тестированию, присутствует на стадии адсорбции и в средах после адсорбции.
Все патенты и другие цитированные в описании ссылки являются показательными для характеристики достигнутого уровня в той области, к которой относится изобретение, и включены в настоящее описание полностью в качестве ссылок, в том числе таблицы и чертежи, в той мере, которая была бы необходима в случае включения данной ссылки полностью и в индивидуальном порядке.
Каждый специалист в данной области поймет, что настоящее изобретение можно легко адаптировать для достижения указанных целей и преимуществ, а также осуществить его в описанных вариантах. Способы, варианты и композиции, описанные в настоящем изобретении, являются репрезентативными для предпочтительных вариантов и иллюстративными и не рассматриваются как ограничивающие область настоящего изобретения. Изменения и другие варианты применения, которые смогут внести специалисты в данной области и которые соответствуют принципам настоящего изобретения, охватываются областью формулы изобретения.
Для специалиста в настоящей области вполне очевидно, что в данное изобретение могут быть внесены замещения или модификации без отступления от области и принципов настоящего изобретения. Например, могут быть внесены вариации в условия синтеза и в композиции олигонуклеотидов. Таким образом, указанные дополнительные варианты также входят в область настоящего изобретения и прилагаемой формулы изобретения.
Настоящее изобретение, описанное в иллюстративном варианте, может быть осуществлено в отсутствие одного или нескольких элементов, одного или нескольких ограничений, которые конкретно не раскрываются в данном описании. Так, например, в каждом случае любой из терминов включающий в себя, состоящий по существу из и состоящий из может быть заменен любым из двух других терминов. Используемые термины и выражения имеют описательное, но не ограничительное, значение и отсутствует какое-либо намерение относительно того, чтобы использование таких терминов и выражений рассматривалось в плане исключения каких-либо эквивалентов показанных и описанных свойств или их частей, но следует понимать, что возможны различные модификации в области заявленного изобретения. Таким образом, следует понимать, что, несмотря на то, что настоящее изобретение было конкретно описано с помощью предпочтительных вариантов и необязательных особенностей, специалистами в данной области могут быть внесены модификации и вариации в изложенную концепцию и такие модификации и вариации рассматриваются как охватываемые областью настоящего изобретения и определяемые прилагаемой формулой изобретения.
Кроме того, в том случае, когда особенности или аспекты настоящего изобретения описываются в терминах группы Маркуша или другой группировки альтернатив, специалисты в данной области поймут, что настоящее изобретение, тем самым, также описывается в терминах любого отдельного представителя или любой подгруппы членов группы Маркуша или другой группы.
Кроме того, если особо не оговорено иное, в том случае, когда для описания вариантов используются различные числовые значения, дополнительные варианты описаны с помощью 2 разных значений, взятых в качестве крайних точек диапазона. Такие диапазоны также входят в область описываемого изобретения.
Таким образом, дополнительные варианты также входят в область настоящего изобретения и в область прилагаемой формулы изобретения.
- 48 008940
Таблица 1
Описание олигонуклеотидов
КЕР 1001 послед. РЗ
20-членная из автономно реплицирующейся последовательности человека ТТСАТАААТАВТАСТАС6АС
КЕР 2001 послед. РЗ
22-членная из ориджина репликации НЗ\/-1
ВААВС0ТТС6САСТТС5ТСССА
КЕР 3007 послед. РЗ
16-членная из ориджина репликации р11С19/рВК322
СТТеСССТАТТСССАА
КЕР 2002 послед. РЗ
5-членный рандомер N N N N N
КЕР 2032 послед. РЗ
6-членный рандомер N NN NN N
КЕР 2003 послед. РЗ
10-чпенный рандомер
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ
КЕР 2009 послед. РЗ
12-членный рандомер ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ
КЕР 2010 послед. РЗ
14-членный рандомер
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ
КЕР 2011 послед.
Р8
16-членный рандомер
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ
КЕР 2012 послед. РЗ
18-чпенный рандомер
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ
КЕР 2004 послед. РЗ
20-членный рандомер
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ
КЕР 2005 послед. РЗ
30-членный рандомер
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ
КЕР 2006 послед. РЗ
40-членный рандомер
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ
КЕР 2007 послед. РЗ
80-членный рандомер
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ» послед. РЗ
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ»
КЕР 2008 послед. РЗ послед. РЗ
120-членный рандомер
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ»
ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝι»
- 49 008940
КЕР 2013 10-членный рандомер послед., ΝΚ N N Н И N NN N без модификации
КЕР 2014 20-членный рандомер послед., ΜΚννΝΝΝΝ«ΝΝΗΝΝ«ΜΙ/«Μ« без модификации
КЕР 2015 40-членный рандомер послед., νΝΝΝΗΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΗΝΝΗΝΝΝΝΝΗΚΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ без модификации
КЕР 2016 послед. РЗ
10-членкая случайная последовательность ТСССААСАСС
НЕТ 2017 20-членная случайная последовательность послед. АСАССТСССААСАССАТААС
РЗ ....................
КЕР 2018 40-членная случайная последовательность послед. СТАСАСАСАТАСАССТСССААбАССАТААСАСТАСАСАТА
РЗ ........................................
10-членная последовательность, центрированная вокруг старт-кодон а белка Н5У-1ΙΕ110 белка КЕР 2019 (ΝΟΒΙ код доступа #Х04614) послед. с с с с с|д тевЯ РЗ ..........
20-членная последовательность, центрированная вокруг старт-кодон а белка НЗУ-11Е110 белка
КЕР 2020 (ΝΟΒΙ код доступа 3X04614) послед. ТАСС А С С сс сУтТГб Α,$~6 О Уц рз .............. ГГ’...
40-членная последовательность, центрированная вокруг старт-кодона белка НЗУ-11Е110 белка КЕР 2021 <ЫСВ1 код доступа #Х04614) послед. тссасссссатассасссс с№ т д ά д а.с с~с~Е~5У <Ге~ссЧПГ5Т51 РЗ ........................................
КЕР 2024 послед. Р8 деыв Двучленный рандомер ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΗΚΝΗΚΚΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΙΙΝΝΝ ··»« ♦ · ♦ »
КЕР 2026 40-членный рандомер
ПОСПед. ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΚΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ
РОЙ » · · · * « · ·
21-членная коммерчески доступная антисмысловая последовательность против СМУ (витравин/фомвирисен), КЕР 2036 синтезированный собственными силами послед. ссст Τ τ С СТСТТС Т ТС ТТ СС с РЗ
КЕР 2036 © послед.
Р8
21-членная коммерчески доступная антисмысловая последовательность против СМУ (витравин/фомвирисен), коммерчески доступный продукт (сСМР) ссстттсстсттсттсттссс
Д20 20-членная послед. АААААААААААААААААААА -РГТС
РЗ ....................
020 20-членная послед. СССбСВбССбССССССббСС -НТС
РЗ ....................
С20 20-членная послед. СССССССССССССССССССС -Г1ТС
РЗ ....................
-50008940
Т20 послед. РЗ 20-членная ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ -ЯТС
АСЮ послед. РЗ 20-членная АСАСАСАСАСАСАСАСАСАС -ЯТС
АСЮ послед. РЗ 20-членная А6А6АВАВА6АВАВА6А6А6 -ЯТС
ТС1О послед. РЗ 20-членная ТСТСТСТСТСТСТСТСТСТС -ЯТС
Т610 послед. РЗ 20-членная τβτβτβτβτβτβτβτβτβτβ -ятс
КЕР 2029 послед. РЗ 40-членная ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ
КЕР 2028 послед. РЗ 40-членная ббо<э(зсвесв0совб<зссе<збсбевавссевсббсесбсе
КЕР 2031 послед. РЗ 40-членная сссссссссссссссссссссссссссссссссссссссс
КЕР 2030 послед. РЗ 40-членная тттттттттттттттттттттттттттттттттттттттт
КЕР 2055 послед. РЗ 40-членная АСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАС
КЕР 2056 послед. РЗ 40-членная тстстстстстстстстстстстстстстстстстстстс
КЕР 2057 послед. РЗ 40-членная ΑΒΑΒΑΒΑΒΑΒΑΒΑΘΑΒΑΒΑΒΑΒΑΒΑΒΑΒΑΒΑΒΑΟΑΒΑΒΑΒ
КЕР 2059 послед. РЗ 20-членный РНК-содержащий рандомер ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ
КЕР 2060 послед. РЗ 30-членный РНК-содержащий рандомер ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (77)

1. Антивирусная олигонуклеотидная композиция, содержащая по меньшей мере один антивирусный олигонуклеотид, отличающаяся тем, что антивирусная активность указанного олигонуклеотида осуществляется в принципе по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей.
2. Композиция антивирусного олигонуклеотида по п.1, содержащая смесь по меньшей мере двух разных антивирусных олигонуклеотидов.
3. Композиция антивирусного олигонуклеотидного рандомера, содержащая по меньшей мере один антивирусный олигонуклеотидный рандомер, отличающаяся тем, что антивирусная активность указанного рандомера осуществляется в принципе по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей.
4. Композиция антивирусного олигонуклеотидного рандомера по п.3, содержащая смесь по меньшей мере двух антивирусных рандомеров разной длины.
5. Олигонуклеотидная композиция, обладающая антивирусной активностью против целевого вируса, содержащая по меньшей мере один антивирусный олигонуклеотид, где указанный олигонуклеотид составляет по меньшей мере 29 нуклеотидов в длину и где последовательность указанного олигонуклеотида не комплементарна любой из частей геномной последовательности указанного целевого вируса.
- 51 008940
6. Олигонуклеотидная композиция, обладающая антивирусной активностью против целевого вируса, содержащая по меньшей мере один антивирусный олигонуклеотид, где указанный олигонуклеотид составляет по меньшей мере 6 нуклеотидов в длину и где последовательность указанного олигонуклеотида не комплементарна любой из частей геномной последовательности указанного целевого вируса и не состоит, по существу, из полиА, полиС, полиС, полиТ, С-квартета или С-обогащенной последовательно- сти.
7. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что указанная зиция имеет значение ИК50 для целевого вируса, составляющее 0,10 мкМ или менее.
8. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что указанная зиция имеет значение ИК50 для целевого вируса, составляющее 0,05 мкМ или менее.
9. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что указанная зиция имеет значение ИК50 для целевого вируса, составляющее 0,025 мкМ или менее.
10. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что указанная композиция имеет значение ИК50 для целевого вируса, составляющее 0,015 мкМ или менее.
тем, компокомпокомпо-
11. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-10, указанного олигонуклеотида является ДНК-содержащий вирус.
12. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-10, указанного олигонуклеотида является РНК-содержащий вирус.
13. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-10, отличающаяся отличающаяся тем, что что что мишенью мишенью мишенью для для для тем,
Н8У-1, Н8У-2, СМУ, отличающаяся указанного олигонуклеотида является представитель семейства Негрекушбае, представитель семейства Нерабтушбае, НВУ, представитель семейства Рагуоушбае, представитель семейства Рохушбае, представитель семейства РарШотаушбае, представитель семейства Абеηоν^^^бае, представитель семейства Кейоушбае, ВИЧ-1, ВИЧ-2, представитель семейства Рагатухоутбае, К8У, вирус парагриппа, представитель семейства Виηуаν^^^бае, хантавирус, представитель семейства Р1согηаν^^^бае, вирус Коксаки, риновирус, представитель семейства Е1ау1ушбае, вирус желтой лихорадки, вирус денге, вирус лихорадки Западного Нила, вирус гепатита С, представитель семейства Ейоушбае, вирус Эбола, вирус Марбург, представитель семейства Оййотухоушбае, вирус гриппа, представитель семейства Тодаушбае, представитель семейства Со^оηаν^^^бае, представитель семейства Кеоушбае, представитель семейства КЪаЬбоушбае, представитель семейства А^еηаν^^^бае, представитель семейства Са1сгутбае.
14. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-4 и 6-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 6 нуклеотидов в длину.
15. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-4 и 6-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 10 нуклеотидов в длину.
16. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-4 и 6-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 20 нуклеотидов в длину.
17. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 29 нуклеотидов в длину.
18. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 32 нуклеотида в длину.
19. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 34 нуклеотида в длину.
20. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 36 нуклеотидов в длину.
21. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 38 нуклеотидов в длину.
22. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 40 нуклеотидов в длину.
23. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 46 нуклеотидов в длину.
24. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 50 нуклеотидов в длину.
25. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 80 нуклеотидов в длину.
26. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-13, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 120 нуклеотидов в длину.
27. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-26, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь.
28. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-26, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модификацию в своей химической структуре.
29. Олигонуклеотидная композиция по пп.1-26, отличающаяся тем, что каждый указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь и необязательно систему доставки,
- 52 008940 которая необязательно является липосомной системой доставки, по меньшей мере одну 2'-О-метильную модификацию в рибозном фрагменте, по меньшей мере одну 2'-модификацию в рибозном фрагменте, по меньшей мере одну метилфосфонатную связь или по меньшей мере одну фосфородитиоатную связь и необязательно систему доставки, которая необязательно является липосомной системой доставки.
30. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-26, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид представляет собой конкатемер, состоящий из двух или более олигонуклеотидных последовательностей, соединенных линкером.
31. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-26, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид связывают или конъюгируют по одному или более нуклеотидным остаткам с молекулой, модифицирующей свойства олигонуклеотида, с достижением одного или более свойств, выбранных из группы, состоящей из повышенной стабильности, сниженного уровня взаимодействия с сывороткой, усиленного поглощения клетками, повышенного уровня взаимодействия с вирусным белком, улучшенной способности включения в состав композиции для доставки, наличия обнаруживаемого сигнала, более высокой антивирусной активности, улучшенных фармакокинетических свойств, специфического тканевого распределения, сниженной токсичности.
32. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-26, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид является двухцепочечным.
33. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-26, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид является двухцепочечным или одноцепочечным и содержит по меньшей мере одно основание, которое способно гибридизоваться в ходе взаимодействий, не соответствующих модели УотсонаКрика.
34. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-33, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну часть с С-квартетным мотивом или СрС-мотивом.
35. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-4 и 7-33, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит часть, комплементарную вирусной мРНК.
36. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-33, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид связывается с одним или более вирусными компонентами.
37. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-33, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид взаимодействует с одним или более компонентами хозяйской клетки, где указанное взаимодействие приводит к ингибированию вирусной активности или продукции.
38. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-4 и 7-33, отличающаяся тем, что по меньшей мере часть последовательности указанного олигонуклеотида получают из вирусного генома.
39. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-4 и 7-33, отличающаяся тем, что по меньшей мере часть последовательности указанного олигонуклеотида получают из вирусного генома, и она обладает антивирусной активностью, которая преимущественно осуществляется по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей.
40. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-4 и 7-33, отличающаяся тем, что по меньшей мере часть последовательности указанного олигонуклеотида получают из последовательности вирусной упаковки или другой вирусной последовательности, участвующей в аптамерном взаимодействии.
41. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-33, отличающаяся тем, что по меньшей мере часть последовательности указанного олигонуклеотида участвует в аптамерном взаимодействии с вирусным компонентом, или с компонентом хозяйской клетки, или с ними обоими.
42. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-33, отличающаяся тем, что по меньшей мере часть последовательности указанного олигонуклеотида содержит полиА, полиС, полиС, полиТ, полиАС, полиАС. полиАТ, полиСС, полиСТ или полиСТ.
43. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1-33, отличающаяся тем, что по меньшей мере часть последовательности указанного олигонуклеотида содержит две или более повторяющихся последовательностей.
44. Олигонуклеотидная композиция по любому из пп.1 и 5-43, содержащая смесь по меньшей мере двух разных антивирусных олигонуклеотидов.
45. Олигонуклеотидная композиция по п.44, содержащая смесь по меньшей мере 10 разных антивирусных олигонуклеотидов.
46. Олигонуклеотидная композиция по п.44, содержащая смесь по меньшей мере 100 разных антивирусных олигонуклеотидов.
47. Олигонуклеотидная композиция по п.44, содержащая смесь по меньшей мере 1000 разных антивирусных олигонуклеотидов.
48. Олигонуклеотидная композиция по п.44, содержащая смесь по меньшей мере 106 разных антивирусных олигонуклеотидов.
49. Олигонуклеотидная композиция по п.44, отличающаяся тем, что множество указанных разных олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 6 нуклеотидов в длину.
50. Олигонуклеотидная композиция по п.44, отличающаяся тем, что множество указанных разных олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 10 нуклеотидов в длину.
- 53 008940 множество указанных разных
51. Олигонуклеотидная композиция по п.44, отличающаяся тем, что олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 20 нуклеотидов в длину.
52. Олигонуклеотидная композиция по п.44, отличающаяся тем, что олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 29 нуклеотидов в длину.
53. Олигонуклеотидная композиция по п.44, отличающаяся тем, что олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 32 нуклеотида в длину.
54. Олигонуклеотидная композиция по п.44, отличающаяся тем, что олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 34 нуклеотида в длину.
55. Олигонуклеотидная композиция по п.44, отличающаяся тем, что олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 36 нуклеотидов в длину.
56. Олигонуклеотидная композиция по п.44, отличающаяся тем, что олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 38 нуклеотидов в длину.
57. Олигонуклеотидная композиция по п.44, отличающаяся тем, что олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 40 нуклеотидов в длину.
58. Олигонуклеотидная композиция по п.47, отличающаяся тем, что олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 50 нуклеотидов в длину.
59. Олигонуклеотидная композиция по п.47, отличающаяся тем, что олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 80 нуклеотидов в длину.
60. Олигонуклеотидная композиция по п.47, отличающаяся тем, что олигонуклеотидов содержит по меньшей мере 120 нуклеотидов в длину.
61. Антивирусная фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного фармакологически приемлемого антивирусного олигонуклеотида по любому из пп.1-60, где антивирусная активность указанного олигонуклеотида осуществляется принципиально по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей, и фармацевтически приемлемый носитель.
62. Антивирусная фармацевтическая композиция по п.61, адаптированная для лечения, контроля или профилактики заболевания вирусной этиологии.
63. Антивирусная фармацевтическая композиция по п.61, адаптированная для лечения, контроля или профилактики болезни приона.
64. Антивирусная фармацевтическая композиция по п.61, адаптированная для доставки способом, выбранным из группы, состоящей из внутриглазного введения, перорального введения, энтерального введения, ингаляции, внутрикожной инъекции, подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутриоболочечной инъекции, внутритрахеальной инъекции и внутривенной множество множество множество множество множество множество множество множество множество указанных разных указанных разных указанных разных указанных разных указанных разных указанных разных указанных разных указанных разных указанных разных инъекции.
65. Антивирусная фармацевтическая композиция по п.61, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно содержит систему доставки.
66. Антивирусная фармацевтическая композиция по п.61, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно содержит липосомный препарат.
67. Антивирусная фармацевтическая композиция по п.65 или 66, отличающаяся тем, что указанная система доставки или липосомный препарат нацелены на специфические клетки или специфические тка ни.
68. Антивирусная фармацевтическая композиция по п.61, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно сочетает в себе по меньшей мере одно другое антивирусное лекарственное средство.
69. Антивирусная фармацевтическая композиция по п.61, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно сочетает в себе ненуклеотидный антивирусный полимер.
70. Набор, содержащий по меньшей мере один антивирусный олигонуклеотид или антивирусное олигонуклеотидное средство по любому из пп.1-61 в снабженной этикеткой упаковке, где антивирусная активность указанного олигонуклеотида осуществляется принципиально по механизму действия, не связанному с комплементарностью последовательностей, и на этикетке на указанной упаковке указано, что данный антивирусный олигонуклеотид может быть использован по меньшей мере против одного вируса.
71. Набор по п.70, отличающийся тем, что указанный набор содержит смесь по меньшей мере двух разных антивирусных олигонуклеотидов.
72. Набор по п.70, отличающийся тем, что указанный набор разрешен регламентирующим агентством для применения на человеке.
73. Набор по п.70, отличающийся тем, что указанный набор разрешен регламентирующим агентством для применения по меньшей мере на одном животном, отличном от человека.
74. Способ профилактики или лечения вирусной инфекции у субъекта, подразумевающий введение субъекту, при необходимости такого лечения, терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного фармакологически приемлемого олигонуклеотида по любому из пп.1-62.
75. Способ по п.74, отличающийся тем, что указанный субъект является человеком, животным или растением.
- 54 008940
76. Способ профилактического лечения рака, вызванного онковирусами, у человека или животного, отличного от человека, подразумевающий введение человеку или животному, отличному от человека, при необходимости такого лечения, фармакологически приемлемого терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного олигонуклеотида по любому из пп.1-61.
77. Способ по п.76, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид вводят человеку.
EA200500487A 2002-09-13 2003-09-11 Антивирусные олигонуклеотиды, не связанные с комплементарностью последовательностей EA008940B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41026402P 2002-09-13 2002-09-13
US43093402P 2002-12-05 2002-12-05
PCT/IB2003/004573 WO2004024919A1 (en) 2002-09-13 2003-09-11 Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200500487A1 EA200500487A1 (ru) 2005-10-27
EA008940B1 true EA008940B1 (ru) 2007-10-26

Family

ID=31997929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200500487A EA008940B1 (ru) 2002-09-13 2003-09-11 Антивирусные олигонуклеотиды, не связанные с комплементарностью последовательностей

Country Status (12)

Country Link
US (13) US20040162254A1 (ru)
EP (2) EP1537208A1 (ru)
JP (4) JP2005538186A (ru)
KR (1) KR101360955B1 (ru)
CN (1) CN1694959B (ru)
AU (1) AU2003267785C1 (ru)
BR (1) BR0314236A (ru)
CA (1) CA2498777C (ru)
EA (1) EA008940B1 (ru)
MX (1) MXPA05002791A (ru)
NZ (1) NZ538719A (ru)
WO (1) WO2004024919A1 (ru)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9394333B2 (en) 2008-12-02 2016-07-19 Wave Life Sciences Japan Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
RU2612521C2 (ru) * 2009-07-06 2017-03-09 Онтории, Инк. Новые пролекарства нуклеиновых кислот и способы их применения
US9598458B2 (en) 2012-07-13 2017-03-21 Wave Life Sciences Japan, Inc. Asymmetric auxiliary group
US9605019B2 (en) 2011-07-19 2017-03-28 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
US9617547B2 (en) 2012-07-13 2017-04-11 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
US9982257B2 (en) 2012-07-13 2018-05-29 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries
RU2760439C1 (ru) * 2021-04-30 2021-11-25 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к филовирусам: Ebolavirus и/или Marburgvirus, способ использования иммунобиологического средства

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1537208A1 (en) * 2002-09-13 2005-06-08 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
US20050196382A1 (en) * 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
WO2005013905A2 (en) * 2003-08-07 2005-02-17 Avi Biopharma, Inc. SENSE ANTIVIRAL COMPOUND AND METHOD FOR TREATING ssRNA VIRAL INFECTION
US20070123480A1 (en) * 2003-09-11 2007-05-31 Replicor Inc. Oligonucleotides targeting prion diseases
AU2004271807A1 (en) * 2003-09-11 2005-03-24 Replicor, Inc. Oligonucleotides targeting prion diseases
US20050222068A1 (en) * 2003-10-23 2005-10-06 Mourich Dan V Method and antisense composition for selective inhibition of HIV infection in hematopoietic cells
DE10361502A1 (de) * 2003-12-23 2005-07-28 Phenion Gmbh & Co. Kg Kosmetische oder pharmazeutische Zubereitungen enthaltend Superstruktur-bildende Nukleinsäure-Sequenzen
WO2005115444A2 (en) 2004-04-14 2005-12-08 Avirid, Inc. Compositions with modified nucleases targeted to viral nucleic acids and methods of use for prevention and treatment of viral diseases
WO2006088490A2 (en) 2004-06-30 2006-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
DE102004038535B4 (de) * 2004-08-06 2012-10-04 Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Zelluläre Einschleusung von Nukleinsäurewirkstoffen
US8129352B2 (en) 2004-09-16 2012-03-06 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection
WO2006042418A1 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Replicor Inc. Antiviral oligonucleotides
US8357664B2 (en) 2004-10-26 2013-01-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection
US7524829B2 (en) * 2004-11-01 2009-04-28 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
US20060240032A1 (en) * 2005-03-31 2006-10-26 Hinrichs David J Immunomodulating compositions and methods for use in the treatment of human autoimmune diseases
WO2006119619A1 (en) * 2005-05-06 2006-11-16 Replicor Inc. Oligonucleotides inhibiting cell proliferation
WO2006119643A1 (en) * 2005-05-12 2006-11-16 Replicor Inc. Anti-ocular angiogenesis molecules and their uses
WO2006122409A1 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Replicor Inc. Antimicrobial molecules and their uses
US7897583B2 (en) * 2005-05-24 2011-03-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to PTPRU
EP1913141A2 (en) * 2005-06-03 2008-04-23 The CBR Institute for Biomedical Research, Inc. Sirna microbicides for preventing and treating viral diseases
WO2006130949A1 (en) * 2005-06-08 2006-12-14 Replicor Inc. Anti amyloid-related disease molecules and their uses
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
WO2007022642A2 (en) * 2005-08-25 2007-03-01 Replicor Inc. Anti-inflammatory molecules and their uses
US8524676B2 (en) * 2005-09-08 2013-09-03 Sarepta Therapeutics, Inc. Method for treating enterovirus or rhinovirus infection using antisense antiviral compounds
EP1937278B1 (en) * 2005-09-08 2012-07-25 AVI BioPharma, Inc. Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection
CA2624686A1 (en) * 2005-09-29 2007-04-05 Replicor Inc. Therapeutic molecules and their uses
US8501704B2 (en) 2005-11-08 2013-08-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunosuppression compound and treatment method
HUE036995T2 (hu) * 2006-05-10 2018-08-28 Sarepta Therapeutics Inc Az alegységek között kationos kötéssel rendelkezõ oligonukleotid analógok
US8785407B2 (en) * 2006-05-10 2014-07-22 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection
EP2049682A2 (en) * 2006-07-31 2009-04-22 Illumina Cambridge Limited Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers
EP2087115B1 (en) * 2006-09-27 2012-11-21 Novarx Blocking of gene expression in eukaryotic cells
US20080268022A1 (en) * 2007-02-23 2008-10-30 Mccabe R Tyler Mehtods for treating and preventing ailments caused by human papillomavirus
CN101679021B (zh) 2007-03-02 2014-04-30 伊利诺伊大学评议会 药物颗粒送递
US8222225B2 (en) * 2008-05-21 2012-07-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating pneumoconiosis with oligodeoxynucleotides
US8053422B2 (en) * 2008-12-04 2011-11-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anti-cancer oligodeoxynucleotides
US8592386B2 (en) * 2008-12-17 2013-11-26 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense compositions and methods for modulating contact hypersensitivity or contact dermatitis
BRPI1009842B8 (pt) 2009-03-25 2021-05-25 Univ Texas uso de agonista de tlr9 e agonista de tlr2/6 na preparação de uma composição farmacêutica para tratamento, inibição ou atenuação de uma infecção microbiana, bem como composição farmaceuticamente aceitável compreendendo os referidos agonistas
US20120263740A1 (en) * 2009-06-23 2012-10-18 University Of Miami Aptamer-targeted sirna to inhibit nonsense mediated decay
FR2947839A1 (fr) * 2009-07-09 2011-01-14 Centre Nat Rech Scient Nouveaux agents antibacteriens
KR101944119B1 (ko) 2009-11-13 2019-01-30 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 안티센스 항바이러스 화합물 및 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 방법
KR101300410B1 (ko) * 2010-01-19 2013-08-26 울산대학교 산학협력단 엔테로바이러스 ７０ 및 콕싸키바이러스 Ａ２４ 모두 동시에 항바이러스 활성을 갖는 ｓｉＲＮＡ 및 이를 함유하는 급성 출혈성 결막염 치료 및 예방용 약학조성물
WO2011097607A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 Southern Research Institute Anti-viral treatment and assay to screen for anti-viral agent
US8759309B2 (en) * 2010-03-16 2014-06-24 Immunom Technologies, Inc. Polynucleotides that stimulate neutrophils
WO2011150408A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Avi Biopharma, Inc. Oligonucleotide analogues having modified intersubunit linkages and/or terminal groups
SI4005592T1 (sl) 2010-07-06 2023-03-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Virionom podobni dostavni delci za samopodvojene molekule RNA
SI3243526T1 (sl) 2010-07-06 2020-02-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Dostava RNA za sprožitev večih imunskih poti
BR112013000244A2 (pt) 2010-07-06 2016-05-17 Novartis Ag lipossomas com lipídeos apresentando pka vantajoso para administração de rna
EP2591114B1 (en) 2010-07-06 2016-06-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunisation of large mammals with low doses of rna
US8198429B2 (en) 2010-08-09 2012-06-12 Avi Biopharma, Inc. Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection
AU2011296062A1 (en) 2010-08-31 2013-04-04 Novartis Ag Small liposomes for delivery of immunogen-encoding RNA
ES2938866T3 (es) * 2010-08-31 2023-04-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomas pegilados para la administración de ARN que codifica para inmunógeno
WO2012031243A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Avi Biopharma, Inc. dsRNA MOLECULES COMPRISING OLIGONUCLEOTIDE ANALOGS HAVING MODIFIED INTERSUBUNIT LINKAGES AND/OR TERMINAL GROUPS
ES2716243T3 (es) 2010-10-11 2019-06-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Plataformas de suministro de antígenos
EP3854413A1 (en) 2011-07-06 2021-07-28 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
WO2013040577A1 (en) * 2011-09-16 2013-03-21 The Research Foundation Of State University Of New York Aptamers resistant to nucleocapsid degradation
US9278987B2 (en) 2011-11-18 2016-03-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Functionally-modified oligonucleotides and subunits thereof
RU2501862C1 (ru) * 2012-04-16 2013-12-20 ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук Способ получения терапевтического агента для лечения клещевого энцефалита
CA2873779A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics Inc. Compositions and methods for modulating mecp2 expression
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
BR112014028654A2 (pt) * 2012-05-18 2017-10-10 Replicor Inc composições de complexo de quelato de oligonucleotídeo-polipeptídeo e métodos
AR091065A1 (es) * 2012-05-18 2014-12-30 Replicor Inc Una formulacion farmaceutica que comprende un quelato de oligonucleotidos antiviral para el tratamiento de una infeccion antiviral
WO2014032176A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 Replicor Inc. Methods for the treatment of hepatitis b and hepatitis d infections
EA039949B1 (ru) * 2012-09-21 2022-03-31 Репликор Инк. Способы лечения инфекций вирусом гепатита в и гепатита d
US9315464B1 (en) 2013-01-31 2016-04-19 Nant Holdings Ip, Llc Small molecule inhibitors of influenza A RNA-dependent RNA polymerase
CA2921021C (en) * 2013-08-15 2022-12-13 Antivirus Therapeutics Methods and compositions for increasing the effectiveness of antiviral agents
WO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
EP3095461A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
PT3094728T (pt) 2014-01-16 2022-05-19 Wave Life Sciences Ltd Desenho quiral
EP3166615B1 (en) 2014-07-10 2023-08-09 Replicor Inc. Chelated phosphorotiotated nucleic acid polymers for use in combination with a hbv polymerase inhibitor for the treatment of hepatitis b and hepatitis d virus infections
WO2016030863A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Compounds and methods for treating viral infections
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
US20180036334A1 (en) * 2015-02-13 2018-02-08 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Rna containing compositions and methods of their use
US11020417B2 (en) 2015-06-04 2021-06-01 Sarepta Therapeutics, Inc Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions
US11207461B2 (en) 2015-07-30 2021-12-28 Anoop U. R Drug delivery system and method for controlled and continuous delivery of drugs into the brain by bypassing the blood brain barrier
KR101842679B1 (ko) 2015-10-15 2018-03-28 한국과학기술원 Rna 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 면역 활성제
KR101881502B1 (ko) * 2015-10-15 2018-07-25 한국과학기술원 Rna 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제
WO2017065405A1 (ko) * 2015-10-15 2017-04-20 한국과학기술원 Rna 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제
WO2019006122A1 (en) * 2017-06-28 2019-01-03 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education HOT EXTRUSION FOR VAGINAL FILM PHARMACEUTICAL PRODUCTS
WO2019046664A1 (en) * 2017-08-30 2019-03-07 Applied Biological Laboratories, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR PROTECTING AGENTS FROM PATHOGENS AND IRRITANTS
GB201714330D0 (en) 2017-09-06 2017-10-18 Järver Peter Oligonucleotides
MX2021000314A (es) * 2018-07-09 2021-03-25 Tyme Inc Formulaciones reductoras de tumores y metodos de uso de las mismas.
US11166976B2 (en) 2018-11-08 2021-11-09 Aligos Therapeutics, Inc. S-antigen transport inhibiting oligonucleotide polymers and methods
AU2020323881A1 (en) * 2019-07-26 2022-03-03 Becton, Dickinson And Company Buffer compositions for reducing aggregation
WO2022133230A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hepatitis b virus infection
WO2022152869A1 (en) 2021-01-15 2022-07-21 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Use of oligonucleotides for individuals with hepatic impairment
WO2022229350A2 (en) 2021-04-30 2022-11-03 Tirmed Pharma Ab Single-stranded oligonucleotides for use in the medical treatment and/or prophylaxis of virus infections
WO2023281434A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Use of oligonucleotides for individuals with renal impairment

Family Cites Families (227)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1263479A (en) * 1969-02-05 1972-02-09 Albright & Wilson Distillation apparatus
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3678808A (en) * 1970-12-09 1972-07-25 Omark Industries Inc Energy dissipating mechanisms
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
ATE151286T1 (de) * 1983-11-14 1997-04-15 Columbia Lab Inc Bioadhäsive mittel
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5023252A (en) * 1985-12-04 1991-06-11 Conrex Pharmaceutical Corporation Transdermal and trans-membrane delivery of drugs
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
US4806463A (en) 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US20030191078A1 (en) * 1986-05-23 2003-10-09 Hybridon, Inc. Inhibition of infectious agents by exogenous oligonucleotides
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
DE68929361T2 (de) 1988-04-27 2002-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc Oligoribonukleotid-Derivate und Verwendung davon als Antiviral Arzneimittel
US5602244A (en) 1988-05-26 1997-02-11 Competitive Technologies, Inc. Polynucleotide phosphorodithioate compounds
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5750666A (en) 1988-05-26 1998-05-12 Competitve Technologies, Inc. Polynucleotide phosphorodithioate compounds
US5218103A (en) 1988-05-26 1993-06-08 University Patents, Inc. Nucleoside thiophosphoramidites
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5000000A (en) * 1988-08-31 1991-03-19 University Of Florida Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
GB8824593D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Liposomes
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5227170A (en) 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
WO1991006556A1 (en) 1989-10-24 1991-05-16 Gilead Sciences, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5514788A (en) * 1993-05-17 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5591623A (en) * 1990-08-14 1997-01-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5248670A (en) 1990-02-26 1993-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides for inhibiting herpesviruses
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
JP3047984B2 (ja) * 1990-04-18 2000-06-05 株式会社日立製作所 電気掃除機
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5665710A (en) 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp., Bothell, Wash. Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
HU217036B (hu) 1990-08-03 1999-11-29 Sanofi Eljárás génexpresszió gátlására alkalmas vegyületek előállítására
CA2089476A1 (en) 1990-08-15 1992-02-16 Bernard Roizman Inhibition of herpesviridae infection by antisense oligonucleotides
US6153595A (en) * 1990-08-16 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals Inc. Composition and method for treatment of CMV infections
ATE154947T1 (de) 1990-08-16 1997-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc Oligonukleotide zur modulation der effekte von cytomegalovirusinfektionen
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
EP0549686A4 (en) 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
WO1992008728A1 (en) 1990-11-08 1992-05-29 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5698391A (en) * 1991-08-23 1997-12-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthetic unrandomization of oligomer fragments
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
EP0644889A4 (en) * 1991-12-24 1996-01-10 Isis Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATION OF -g (b) -AMYLOID.
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5624050A (en) * 1992-03-25 1997-04-29 Haas; Philip C. Lid and structural arrangement for recycling and refuse receptacles
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5276302A (en) * 1992-05-18 1994-01-04 Mitsubishi Denki K.K. EDM apparatus current efficiency control technique
FR2692265B1 (fr) 1992-05-25 1996-11-08 Centre Nat Rech Scient Composes biologiquement actifs de type phosphotriesters.
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5607691A (en) * 1992-06-12 1997-03-04 Affymax Technologies N.V. Compositions and methods for enhanced drug delivery
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) * 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US6346614B1 (en) * 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
TW244371B (ru) * 1992-07-23 1995-04-01 Tri Clover Inc
RU95104940A (ru) 1992-07-27 1997-01-10 Хайбрайдон Способ введения в олигонуклеотид алкилфосфонотиоатной или арилфосфонотиоатной межнуклеотидной связи, способ получения олигонуклеотида, олигонуклеотиды, способ ингибирования генной экспрессии, способ лечения
US5523389A (en) * 1992-09-29 1996-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of human immunodeficiency virus
US5583020A (en) 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
CA2154578A1 (en) 1993-01-25 1994-08-04 Ekambar R. Kandimalla Oligonucleotide alkylphosphonates and alkylphosphonothioates
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
CA2156289C (en) 1993-02-19 2006-01-03 Junichi Yano Drug composition containing nucleic acid copolymer
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
GB9304620D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
HU9501974D0 (en) 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5462854A (en) 1993-04-19 1995-10-31 Beckman Instruments, Inc. Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes
US5567604A (en) 1993-04-23 1996-10-22 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides
FR2705099B1 (fr) 1993-05-12 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation.
BR9301831A (pt) 1993-05-13 1994-11-29 Polibrasil S A Ind E Comercio Polipropileno de elevada resistência em fusão, artigo moldado e processo contínuo para produção de polipropileno de elevada resistência em fusão.
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5417978A (en) 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
DE4331670A1 (de) * 1993-09-17 1995-03-23 Hoechst Ag Neue Antisense-Oligonucleotide gegen HSV-1 sowie deren Herstellung
CA2171553A1 (en) * 1993-09-28 1995-04-06 Charles A. Marotta Using antisense oligonucleotides to modulate nerve growth and to reverse .beta./a4 amyloid-induced morphology
US5356023A (en) * 1993-11-04 1994-10-18 Ultra Pac, Inc. Rose box with interchangeable lid and base
US6060456A (en) * 1993-11-16 2000-05-09 Genta Incorporated Chimeric oligonucleoside compounds
US5540935A (en) 1993-12-06 1996-07-30 Nof Corporation Reactive vesicle and functional substance-fixed vesicle
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5452496A (en) 1994-02-03 1995-09-26 Schuller International, Inc. Vacuum assisted accumulator and process of collecting microfiber
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
FR2722506B1 (fr) * 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US6608035B1 (en) * 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
DE19502912A1 (de) * 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5756122A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
JPH11511128A (ja) 1995-08-01 1999-09-28 ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト リポソームオリゴヌクレオチド組成物
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
EP0862653B1 (en) * 1995-10-26 2002-01-16 Winnacker, Ernst-Ludwig, Prof. NUCLEIC ACID MOLECULES CAPABLE OF DISTINGUISHING THE ISOFORMS PrPc AND PrPSc OF PRION PROTEINS AND PROCESSES FOR THEIR PRODUCTION
US5998602A (en) 1996-02-15 1999-12-07 The Cleveland Clinic Fouindation And Government RNase L activators and antisense oligonucleotides effective to treat RSV infections
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
ATE383172T1 (de) 1996-05-20 2008-01-15 Us Gov Health & Human Serv Oligonukleotide welche spezifisch retrovirale nukleokapsid-proteine binden
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6133246A (en) * 1997-08-13 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
EP2341058A3 (en) 1997-09-12 2011-11-23 Exiqon A/S Oligonucleotide Analogues
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
ATE332371T1 (de) * 1999-07-02 2006-07-15 Invitrogen Corp Zusammensetzungen und verfahren zu höhere empfindlichkeit und spezifität von nukleinsäuresynthese
DE60022665T2 (de) * 1999-09-25 2006-06-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunstimulierende nukeinsäuren
US6746054B2 (en) 1999-10-14 2004-06-08 Siemens Automotive Inc. Connection formed by engagement of a tube and a valve surface
US6849610B1 (en) * 1999-11-24 2005-02-01 The Regents Of The University Of California Polynucleotide ligands as anti-viral agents
AU2001249622B2 (en) 2000-03-30 2007-06-07 Massachusetts Institute Of Technology RNA sequence-specific mediators of RNA interference
GB0012054D0 (en) * 2000-05-18 2000-07-12 Isis Innovation Ligands
KR20020069627A (ko) 2001-02-27 2002-09-05 동부한농화학 주식회사 육환의 아자슈거를 가진 뉴클레오타이드 유도체를 포함한포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 및 이들의에이즈 치료제로서의 새로운 용도
WO2003013425A2 (en) * 2001-07-26 2003-02-20 University Of Utah Research Foundation In vitro assays for inhibitors of hiv capsid conformational changes and for hiv capsid formation
AU2003223619A1 (en) 2002-05-13 2003-12-02 Salus Therapeutics Antiviral phosphorothioate oligonucleotides
WO2003099840A1 (en) * 2002-05-24 2003-12-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having modified nucleoside units
US6797319B2 (en) * 2002-05-31 2004-09-28 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Application of foam to tissue products using a liquid permeable partition
US20030232435A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-18 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of amyloid beta protein precursor expression
JP2005533823A (ja) 2002-06-27 2005-11-10 エスビー・ファルムコ・プエルト・リコ・インコーポレイテッド リン酸カルベジロール塩および／またはその溶媒和物、対応する組成物、および／または治療方法
US20040242897A1 (en) * 2002-07-31 2004-12-02 Guzaev Andrei P. Universal support media for synthesis of oligomeric compounds
EP1537208A1 (en) * 2002-09-13 2005-06-08 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
US8935416B2 (en) 2006-04-21 2015-01-13 Fortinet, Inc. Method, apparatus, signals and medium for enforcing compliance with a policy on a client computer
US9209196B2 (en) 2011-11-30 2015-12-08 Sharp Kabushiki Kaisha Memory circuit, method of driving the same, nonvolatile storage device using the same, and liquid crystal display device
US9400902B2 (en) 2012-05-22 2016-07-26 Trimble Navigation Limited Multi-modal entity tracking and display

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARCHAMBAULT D. ET AL.: "Phosphorothioate oligonucleotides inhibit the replication of lentiviruses and type D retroviruses, but not that of type C retroviruses" ARCHIVES OF VIROLOGY, vol. 139, no. 1-2, 1994, pages 97-109, XP009024619, ISSN: 0304-8608, cited in the application, the whole document *
LAVIGNE CAROLE ET AL.: "Is antisense an appropriate nomenclature or design for oligodeoxynucleotides aimed at the inhibition of HIV-1 replication?" AAPS PHARMSCI ÔÇÿELECTRONIC RESOURCE! UNITED STATES 2002, vol. 4, no. 2, 2002, page E9, XP001157195, ISSN: 1522-1059, the whole document *
MATSUKURA MAKOTO ET AL.: "Antisense phosphorothioates as antivirals against human immunodeficiency virus (HIV) and hepatitis B virus (HBV)", TOXICOLOGY LETTERS (SHANNON), vol. 82-83, no. SPEC. ISSUE, 1995, pages 435-438, XP002268359, ISSN: 0378-4274, cited in the application, the whole document *
MIYANO-KUROSAKI NAOKO ET AL.: "Inhibition of HTLV-I induction and virus-induced syncytia formation by oligodeoxynucleotides", VIRUS GENES, vol. 12, no. 3, 1996, pages 205-217, XP009024620, ISSN: 0920-8569, the whole document *
PAN WEIHUA ET AL.: "Isolation of virus-neutralizing RNAs from a large pool of random sequences", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES, vol. 92, no. 25, 1995, pages 11509-11513, XP002268358, 1995, ISSN: 0027-8424, the whole document *
STEIN C.A. ET AL.: "PHOSPHOROTHIOATE OLIGODEOXYNUCLEOTIDES ARE POTENT SEQUENCE NONSPECIFIC INHIBITORS OF DE NOVO INFECTION BY HIV", AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, vol. 5, no. 6, 1989, pages 639-646, XP009024621, ISSN: 0889-2229, cited in the application, the whole document *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9394333B2 (en) 2008-12-02 2016-07-19 Wave Life Sciences Japan Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
US9695211B2 (en) 2008-12-02 2017-07-04 Wave Life Sciences Japan, Inc. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
RU2612521C2 (ru) * 2009-07-06 2017-03-09 Онтории, Инк. Новые пролекарства нуклеиновых кислот и способы их применения
US9744183B2 (en) 2009-07-06 2017-08-29 Wave Life Sciences Ltd. Nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
US10428019B2 (en) 2010-09-24 2019-10-01 Wave Life Sciences Ltd. Chiral auxiliaries
US9605019B2 (en) 2011-07-19 2017-03-28 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
US9598458B2 (en) 2012-07-13 2017-03-21 Wave Life Sciences Japan, Inc. Asymmetric auxiliary group
US9617547B2 (en) 2012-07-13 2017-04-11 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
US9982257B2 (en) 2012-07-13 2018-05-29 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
US10167309B2 (en) 2012-07-13 2019-01-01 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
US10590413B2 (en) 2012-07-13 2020-03-17 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
RU2760439C1 (ru) * 2021-04-30 2021-11-25 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к филовирусам: Ebolavirus и/или Marburgvirus, способ использования иммунобиологического средства

Also Published As

Publication number Publication date
US20090156527A1 (en) 2009-06-18
US20040229828A1 (en) 2004-11-18
US20040162253A1 (en) 2004-08-19
JP2005538186A (ja) 2005-12-15
NZ538719A (en) 2008-05-30
EP1537208A1 (en) 2005-06-08
EP2330194A2 (en) 2011-06-08
MXPA05002791A (es) 2005-12-05
JP5514179B2 (ja) 2014-06-04
US20100173980A1 (en) 2010-07-08
AU2003267785B2 (en) 2009-05-07
CA2498777C (en) 2015-01-13
EP2330194A3 (en) 2011-10-12
US20040170959A1 (en) 2004-09-02
US20090099110A1 (en) 2009-04-16
EA200500487A1 (ru) 2005-10-27
JP5796024B2 (ja) 2015-10-21
BR0314236A (pt) 2005-08-09
US8008269B2 (en) 2011-08-30
US20090042827A1 (en) 2009-02-12
JP2015178532A (ja) 2015-10-08
AU2003267785A1 (en) 2004-04-30
WO2004024919A1 (en) 2004-03-25
US20040171568A1 (en) 2004-09-02
US20060135458A1 (en) 2006-06-22
US20040162254A1 (en) 2004-08-19
AU2003267785C1 (en) 2009-12-24
KR101360955B1 (ko) 2014-02-10
US8008270B2 (en) 2011-08-30
JP2012082203A (ja) 2012-04-26
US7358068B2 (en) 2008-04-15
CN1694959B (zh) 2013-09-18
CA2498777A1 (en) 2004-03-25
US20120184601A1 (en) 2012-07-19
US20050176661A1 (en) 2005-08-11
KR20050084693A (ko) 2005-08-26
US20050153912A1 (en) 2005-07-14
JP2013121963A (ja) 2013-06-20
US8067385B2 (en) 2011-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA008940B1 (ru) Антивирусные олигонуклеотиды, не связанные с комплементарностью последовательностей
CA2584207A1 (en) Antiviral oligonucleotides
US20100172965A1 (en) Antiviral oligonucleotides targeting viral families
CN101084232A (zh) 抗病毒寡核苷酸
US10036020B2 (en) Compositions and methods for inhibiting JC virus (JCV)
WO2023183820A2 (en) Respiratory tract infection therapeutics against covid-19

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU