JP5514179B2 - 非配列相補性の抗ウイルス性オリゴヌクレオチド - Google Patents

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Description

本発明は、抗ウイルス活性を有するオリゴヌクレオチド、並びにヒト及び動物のウイルスにより起きるウイルス感染、癌遺伝子ウイルスにより起きる癌及び病因がウイルスに基づくそのほかの疾患における治療剤としてのその使用に関する。
以下の議論は、単に読者の理解を助けるために提供されるのであって、議論された情報又は引用された文献のいかなるものも本発明の先行技術を構成することを容認するものではない。
人類を苦しめる多数の重大な感染症はウイルスによって引き起こされる。狂犬病、天然痘、灰白髄炎、肝炎、黄熱病、免疫不全症、及び種々の脳炎を含む、これら多数の疾患は、致命的であることが多い。そのほかの疾患も、呼吸障害及び消化器障害と同様にインフルエンザ、麻疹、おたふく風邪、水痘のように伝染性であり、急性の不快感を生じさせるという点で重要である。風疹やサイトメガロウイルスのようなものは、先天異常を生じさせる。最後に、ヒトや動物で癌を生じさせうる腫瘍ウイルスとして知られるウイルスがある。
ウイルスの中でも、ヘルペスウイルス科は大変興味深い。ヘルペスウイルス科は遍在する部類の十二面体の二本鎖DNAのウイルスである。性状分析された100を超えるヘルペスウイルス（HHV）科のうち8種類だけがヒトに感染する。これらの中で最もよく知られているのは、単純疱疹ウイルス1（HSV-1）、単純疱疹ウイルス２（HSV-2）、帯状疱疹ウイルス（水痘又は帯状疱疹）、サイトメガロウイルス（CMV）及びエプステイン・バーウイルス（EBV）である。ヘルペスウイルスのヒトにおける蔓延は高く、全世界人口の少なくとも1/3が冒され、米国では人口の70〜80%が何らかのヘルペス感染を有する。ヘルペス感染の病態は、通常は口の周りや顔にすぐに直る病変を生じさせるだけであるHSV-1の場合のように、通常危険ではない一方で、これらのウイルスが、さらに危険な症状の原因になりうることも知られており、それは、性器潰瘍及び分泌物から、脳炎（致死率15%）や播種性の感染（致死率40%）を招く可能性がある致命的な感染まで異なる。
ヘルペスウイルスは自然界では播種性が高く、ヒトに対して病原性が高い。たとえば、エプステイン・バーウイルス（EBV）は、小児期後期もしくは青年期又は成人初期で感染性単球増多症を生じさせることが知られている。急性感染性単球増多症の顕著な特徴は、喉の痛み、発熱、頭痛、リンパ節症、扁桃腺肥大及び末梢血における異型のリンパ球分裂である。そのほかの徴候には軽い肝炎、脾臓肥大及び脳炎が挙げられることが多い。EBVはまた、癌：バーキットリンパ腫（BL）及び鼻咽腔癌（NPC）に関係する。赤道アフリカの流行域では、BLは最も一般的な小児悪性腫瘍であり、小児における癌のおよそ80%を占める。NPCは北アメリカの白人ではほどほどに認められるが、中国南部では25〜55歳の年齢で生じる最も一般的な癌の1つである。サイトメガロウイルスと同様に、EBVは、移植後のリンパ増殖性疾患に関係しており、それは、固形臓器又は骨髄の移植後の慢性免疫抑制の致命的な合併症になりうる。
たとえば、中心性網脈絡膜炎又は角結膜炎のような皮膚や眼の感染を含むそのほかの疾患もHSVに関係する。米国では1年におよそ300,000例の眼のHSV感染が診断される。
AIDS（後天性免疫不全症候群）はヒト免疫不全ウイルス（HIV）により引き起こされる。身体の免疫系の細胞を殺す又は損傷することによって、HIVは感染及び特定の癌と闘う身体の能力を漸進的に破壊する。現在、世界中でおよそ4200万人の人々がHIV／AIDSと共に暮らしている。2002年にはHIV/AIDSに関係した原因で総計310万人が死亡した。抗HIV薬物療法の最終的な目標はウイルスが再生して免疫系を損傷するのを妨げることである。HIVに対する過去15年間にわたる闘いで実質的な進歩は遂げられているが、治療は未だに医学をかわしている。今日、内科医は、この疾患を管理するのに3種の異なる薬剤クラスの多数の抗ウイルス剤を有している。通常2又は3種のクラスの薬剤が、HAART（高活性抗レトロウイルス治療）として知られる多様な組み合わせで処方される。HAART療法は通常2つのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を、プロテアーゼ阻害剤又は非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤のいずれかの第3の薬剤と共に含む。臨床試験によって、HAARTは、ウイルス負荷を軽減し、薬剤耐性の可能性をできるだけ抑える最も有効な手段であることが判っている。
HAARTは一般にウイルス負荷として知られる体内のHIVの量を減らすことが示されているが、何万という患者がこの療法で重大な問題に遭遇している。副作用には重篤なものもあり、脂肪代謝の異常、腎臓結石及び心疾患が挙げられる。たとえば、悪心、吐き気及び不眠のようなそのほかの副作用はさほど重篤ではないが、一生、慢性的な薬剤療法を必要とするHIV患者にとっては依然として問題である。
現在認可されている抗HIV剤は、HIVが感染したCD4+T細胞に入り、逆転写酵素又はプロテアーゼいずれかのウイルス酵素の機能を阻止することによって作用する。HIVは再生するためにこれらの酵素を必要としている。しかしながら、HIVは度々突然変異して、耐性になり、逆転写酵素又はプロテアーゼの阻害剤を効かないようにする。いったん耐性が生じると、ウイルス負荷が上昇し、効かない薬剤を別の抗レトロウイルス剤に交換する必要を強いられる。残念ながら、ウイルスがあるクラスの1つの薬剤に耐性になると、そのクラスの別の薬剤の有効性も低くなる。多数の抗HIV剤が類似の様式で作用するので、交差耐性として知られるこの現象が生じる。薬剤の交差耐性の発生は、患者にとって利用できる治療選択肢が減るので極めて望ましくない。
従って、ウイルスが耐性を発現していないほかの作用機序を介して作用する、HIVに対して有効なそのほかの抗ウイルス剤の開発に対して大きなニーズがある。ヨーロッパで新たにHIVと診断された患者の10人に1人が市場にある認可された薬剤の少なくとも1種にすでに耐性であるHIV株に感染しているという最近のデータを考えると、このことは、特に重要になりつつある。
呼吸器多核体ウイルス（RSV）は、上下気道に感染を起こす。それは、マイナス鎖のエンベロープ型RNAウイルスであり、感染性が高い。それは幼年の小児を一般に冒し、幼児の下部気道疾病の最も一般的な原因である。RSVの感染は通常、中程度から重篤な風邪のような症状と関係する。しかしながら、いかなる年齢でも、特に高齢の又は免疫障害のある患者では重篤な下部気道疾患が生じる可能性がある。重篤な感染のある小児は酸素療法、及び特定の症例では機械的人工呼吸を必要とする可能性がある。全米医師会によれば、RSV感染が原因であることが多い、細気管支炎のために入院する小児の数が増えている。RSV感染はまた、骨髄移植センタ-の患者における地域関連型の呼吸器ウイルス感染のおよそ1/3の原因である。高齢集団では、RSV感染は最近では、重篤度においてインフルエンザウイルス感染に非常に類似すると認識されている。
流感としても知られているインフルエンザ（INF）はインフルエンザウイルスにより生じる伝染病である。それはヒトの気道（鼻、喉及び肺）を攻撃する。米国では年に平均約36,000人がインフルエンザで死亡し、年に114,000人がインフルエンザのために入院している。
あらゆる感染性疾患において、所定の療法の有効性は、宿主の免疫応答に依存することが多い。潜在性感染を確立するすべてのヘルペスウイルスの能力により、免疫障害のある患者において再活性化した感染が極めて高い発生率で生じるので、これはヘルペスウイルスに特にあてはまる。腎移植患者では、40〜70%がHSVの潜在感染を再活性化させ、80〜100%がCMV感染を再活性化させる。そのようなウイルスの再活性化は、AIDS患者でも認められる。
B型肝炎ウイルス（HBV）は、ウイルスの肝炎ウイルス科に属するDNAウイルスである。HBVはヒトにおいてB型肝炎を発症させる。世界で20億人が感染していると推定される（3人に1人）。約3億5000万人は慢性的に感染したままであり、毎年、推定100万人がB型肝炎及びその合併症で死亡している。HBVは、生涯にわたる感染、肝硬変、肝癌、肝不全及び死を引き起こす。ウイルスは血液及び体液を介して伝染する。これは、血液と血液の直接的接触、無防備な性交、不潔な針の使用を介して、又、出産過程で感染した女性から新生児へと起こりうる。感染する健常な成人のほとんど（90%）は回復し、将来のB型肝炎感染への防御抗体を作る。少数（5〜10%）がウイルスを始末することができず、慢性の感染を煩うが、幼児の90%及び50%までの幼年小児はウイルスに感染した際、慢性の感染を煩う。α-インターフェロンは、使用する治療剤の最も頻度の多いタイプである。インフルエンザ様の症状、鬱、発疹、そのほかの反応及び血球数の異常を含む重大な副作用がこの治療に関係する。もう1つの治療選択肢には、その使用に関連した多数の副作用を有する3TCが挙げられる。最近2、3年、3TCで治療した患者がHBVの耐性株を発現していることを示す報告の数が増えている。このことは、HBVとHIVを同時感染した患者集団で特に問題である。このウイルスに対する新たな抗ウイルス剤を開発する緊急の必要性が明らかにある。
C型肝炎ウイルス（HCV）の感染は、感染患者数が400万人を超えると思われる米国で最も一般的な血液由来の慢性感染である。この一般的なウイルスの感染は、米国における肝硬変及び肝癌の主な原因であり、今や肝臓移植の主な理由である。感染からの回復は一般的ではなく、感染患者の約85パーセントは慢性のウイルス保有者になり10〜20パーセントは肝硬変を発症する。現在、世界で1億7000万人が慢性保有者であると推定される。疾病対策センタ-によれば、米国だけで毎年、8,000〜10,000人が慢性C型肝炎で死亡し、約1,000人が肝臓移植を受けている。C型肝炎に利用できるワクチンはない。インターフェロンα、又はインターフェロンとリバビリンの併用による長い治療法は約40パーセントの患者にしか有効ではなく、有意な副作用を生じさせる。
今日、ウイルス感染の治療の見通しは一般によくない。一般に、ウイルスに対する治療は平凡な有効性しか有さず、有効投与量の投与の妨げになるか又は長期の治療を妨げる強い副作用と関係している。これらの問題を例示する3つの臨床状況は、ヘルペスウイルス、HIV及びRSVの感染である。
ヘルペスウイルスの場合、診療所での使用が現在認可されている5つの主な治療薬がある：イドクスウリジン、ビダラビン、アシクロビル、フォスカーネット及びガンシクロビルである。限られた有効性を有するが、これらの治療も副作用を伴う。イドクスウリジンで治療を受けた患者の35%でアレルギー反応が報告されており、ビダラビンは患者の15%で胃腸障害を生じさせ、ヌクレオシド類縁体であるアシクロビル、フォスカーネット及びガンシクロビルは宿主細胞でのDNA複製に影響を及ぼす。ガンシクロビルの場合、この薬剤で治療を受けたAIDS患者の40%で好中球減少症及び血小板減少症が報告されている。
HIV感染を治療するために現在利用可能な多数の異なる薬剤があるが、これらはすべて、患者が妥当な生活の質を得るには、多大な補足的投薬を必要とするに十分なほど強力な副作用と関係している。HIVの薬剤耐性株の追加的問題（ヘルペスウイルス科感染にも見られる問題）は通常、治療カクテルの周期的変更を要し、場合によっては感染を極めて治療しにくくする。
乳児でのRSV感染の治療は、新薬開発の緊急の必要性のもう1つの例である。この場合、通常の治療法は、隔離テントの中で微粒子のエアゾールを用いた吸入によるリバビリンの送達である。リバビリンは、穏やかな効果しないだけでなく、その使用は重大な副作用に関係している。加えて、リバビリンには催奇形性が知られているので、薬剤の流出の可能性が病院職員に大きな懸念を抱かせてきた。
開発中の新しく出現する抗ウイルス性薬剤については、以下の3つの特徴、1．改善された有効性、2．軽減された副作用のリスク及び3.突然変異によってウイルスが克服しにくい作用メカニズムを取り入れることが極めて望ましいことは明らかである。
種々のアンチセンス手法によって特定のウイルスを阻害する試みが行われている。
Zamecnikらは、逆転写酵素プライマ-部位及びスプライスドナー／アクセプタ部位を特異的に標的としたONを用いた（Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143, 1986）（Goodchild & Zamecnik, 1989, 米国特許第4,806,463号）
Crooke及び共同研究者らは（Crooke et al., Antimicrob. Agents Chemother., 36:527-532, 1992）HSV-1に対するアンチセンスを記載した。
Draperらは（1993, 米国特許第5,248,670号）Cat配列を有し、HSV-1遺伝子、UL13、UL39、及びUL40にハイブリッド形成する抗HSV活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを報告した。
Keanらは（Biochemistry, 34:14617-14620, 1995）、抗HSV作用剤として、アンチセンスメチルホスホネートリゴマーを調べた。
Peymanらは（Biol. Chem. Hoppe. Seyler, Mar, 376:195-198, 1995）、その抗ウイルス特性について、HSV-1のＩE110及びＵＬ30のmRNAに関する特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを報告した。
IE1、IE2又はDNAポリメラーゼをコードするCMVのmRNAを標的とするオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類縁体が、Andersonら（1997, 米国特許第5,591,720号）により報告された。
Hanecakらは（1999, 米国特許第5,952,490号）、保存されたGカルテット配列及び十分な数の隣接ヌクレオチドを有し、HSV-1のようなウイルスの活性を有意に阻害する修飾オリゴヌクレオチドを記載した。
Jairathらは（Antiviral Res., 33:201-213, 1997）RSVに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを報告した。
Torrenceらは（1999, 米国特許第5,998,602号）、RSVのアンチゲノム鎖（mRNA鎖）の一本鎖部分に相補的なアンチセンスを含む化合物、リンカー及びRNA分解酵素Lのオリゴヌクレオチド活性化剤を報告した。
Qiらは（Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi, 14:253-256, 2000）、コクサッキーウイルスB3におけるアンチセンスPS-ODNを調べたことを報告した。
国際公開公報第9203051号（Roizman and Maxwell）は、HSVウイルスゲノムの肝要な領域又はそのmRNA転写物に相補的であり、抗ウイルス活性を示すメチルホスホネートアンチセンスオリゴマーを記載している。
グアノシン／チミジン又はグアノシン-リッチのホスホロチオエートのオリゴデオキシヌクレオチド（GT-PS-ODN）は抗ウイルス活性を有することが報告されている。論文には、「幾つかの異なるPS含有のGTリッチODN（B106〜140、Ｉ100〜12及びG106〜57）すべて長さは26又は27ntは、36（B106〜96、B106〜97）又は45ntから成るGTリッチODNと同様にHIV-2の力価を下げるのに有効であった(表4）」。（Fennewald et al., Antiviral Res., 26:37-54, 1995）
米国特許第6,184,369号には、高い比率でグアノシン塩基を含有する抗HIV、抗HSV及び抗CMVのオリゴヌクレオチドが記載されている。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは三次構造を有し、この構造は、グアノシン四分子によって安定化される。さらなる態様では、この発明のオリゴヌクレオチド組成物は2つの隣接したデオキシグアノシンの2以上の種類を有する。この特許は、少なくとも2つの位置で少なくとも2つのG残基を包含するGリッチのODNを請求している。
Cohenらは（米国特許第5,264,423号及び同第5,276,019号）HIVの複製の阻害を記載し、さらに詳しくは、正常な生きている細胞の存在下で外来の核酸の複製を妨げるのに使用することができるPS-ODN類縁体を記載している。Cohenらは、ウイルス配列に特異的なアンチセンスPS-ODNの抗ウイルス活性を記載している。彼らはまた14、18、21及び28量体のポリA、ポリT及びポリCのPS-ODNを調べたことを記載し、これらPS-ODNの抗ウイルス効果を示している。
Matsukuraらは（Matsukura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7706-7710, 1987）、上記Cohenらの米国特許に記載された結果を後になって公開した。
Gaoらは（Gao et al., J. Biol. Chem, 264:11521-11526, 1989）、7、15、21及び28ヌクレオチドのサイズにおけるポリA、ポリT及びポリCのPS-ODNを調べることによるPS-ODNによってHSV-2の複製が阻害されることを記載している。
Archambault, Stein及び Cohenは（Archambault et al., Arch. Virol., 139:97109, 1994）28ヌクレオチドのPS-ODNポリCがHSV-1に対して有効ではないことを報告している。
Steinらは（Stein et al., AIDS Res. Hum. Retrovir., 5:639-646, 1989）、一般に21〜28ヌクレオチドの長さの抗HIV-ODNに関する追加データに関する結果を公表した。
Marshallらは（Marshall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6265-6269, 1992）、長さ4〜28ヌクレオチドのホスホロチオエート及びホスホロチオエートポリCオリゴの抗HIV-1効果を記載している。
Stein及びChengは（Stein et al., Science, 261:1004-1012, 1993）、概説論文の中で28ヌクレオチドの非特異的ODNの抗ウイルス活性について言及し、「PSオリゴの抗HIV特性は、非配列特異的な効果によって有意に影響され、すなわち、阻害効果は塩基配列に依存しない」と述べている。
概説論文の中で、Lebedeva及びSteinは（Lebedeva et al., Annul. Rev. Pharmacol., 41:403-419, 2001）、ウイルスタンパク質も含めて、PS-ODNの活性を結合する種々の非特異的タンパク質を報告している。彼らは、「これらの分子は生物学的に極めて活性が高く、相対的に人為物をアンチセンスと間違えやすいことが多い」と述べている。
Reinらは（米国特許第6,316,190号）、融合相手に連結され、抗ウイルス性化合物として使用することができるHIVのヌクレオカプシドに結合するGTリッチのONデコイを報告した。同様に、Campbellらは（Campbell et al., J. Virol., 73:2270-2279, 1999）、HIVのヌクレオカプシドに特異的に結合するが、抗ウイルス活性には関係しないTGTGTモチーフを持つPO-ODNを報告した。
Fengらは（Feng et al., J. Virol., 76:11757-11762, 2002）、組換えHIVのヌクレオカプシドに結合するが、抗HIV活性に関するデータの参照もないA（n）及びTG（n）のPO-ODNを記載した。
抗癌剤、抗ウイルス剤として又はそのほかの疾患を治療するために開発されたアンチセンスODNは通常、長さ、およそ20ヌクレオチドである。概説論文（Stein, CA, J. Clin. Invest., 108:641-644, 2001）では、「アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは最適化されなければならない：アンチセンスオリゴヌクレオチドが長すぎるか又は短かすぎれば、特異性の要素は失われる。現在、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最適な長さは大雑把に16〜20ヌクレオチドであると思われる」と確認されている。同様に、もう1つの概説論文（Crooke, ST., Methods Enzymol., 313:3-45, 2000）では、「RNA及びRNA二本鎖形成に比べて、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、単位当たりおよそ-2.2°低いTmを有する。このことは、インビトロで有効であるには、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは通常、長さ17〜20量体であらねばならない」と述べられている。
Caruthers及び共同研究者らは（Marshall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6265-6269, 1992）、12量体のポリシチジン-PS2-ODN及び14量体のPS2-ODNに関するホスホロジチオエートODNの抗HIV活性を報告した。抗HIV活性について別のサイズは調べなかった。彼らはまた、12、14、20及び28量体のポリシチジンPS2-ODNについてHIV逆転写酵素（RT）の阻害剤を報告した。後になって（Marshall et al., Science,259:1564-1570, 1993）、HIV RTの配列特異的阻害を示す結果を報告した。同じグループは幾つかの特許の中でPS2-ODNに関するデータを公表した。米国特許第5,218,103号及び同第5,684,148号では、PR2-ODNの構造及び合成を記載している。米国特許第5,452,496号、同第5,278,302号、及び同第5,695,979号では15塩基以下のPS2-ODNに関してHIV RTの阻害が記載されている。米国特許第5,750,666号及び同第5,602,244号では、PS2-ODNのアンチセンス活性が記載されている。
本発明は、オリゴヌクレオチド（ON）、たとえば、オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）が、広く適用可能な、非配列相補的抗ウイルス活性を有しうるという発見に関与する。従って、該オリゴヌクレオチドは、抗ウイルス活性を有するために、いかなるウイルス配列とも相補的である必要はないし、特定のヌクレオチド分布を有する必要もない。調製物中、たとえば長さ32以上のヌクレオチドの15μMランダマー調製物中で特定の配列がせいぜい2、3コピーしかないようなランダマーとしてそのようなオリゴヌクレオチドを調製することさえできる。
さらに、本発明者らは、様々な長さのオリゴヌクレオチドが多様な抗ウイルス効果を有し、さらに、最大の抗ウイルス効果を生じさせる抗ウイルス性オリゴヌクレオチドの長さが40〜120ヌクレオチドの範囲であることを発見した。オリゴヌクレオチドの抗ウイルス特性に関する本発見の見地から、本発明は、多数の様々なウイルスに対して活性を有することができ、広域スペクトルの抗ウイルス剤として選択することさえできるオリゴヌクレオチド抗ウイルス剤を提供する。そのような抗ウイルス剤は、現在利用できる抗ウイルス療法の選択肢が限られているという観点から特に有利である。
従って、本発明のON、たとえば、ODNは、ウイルス感染を治療する又は予防するための、腫瘍ウイルス（たとえば、レトロウイルス、パピローマウイルス及びヘルペスウイルス）のようなウイルスによって誘発される腫瘍又は癌を治療する又は予防するための、及びその病因がウイルスに基づくそのほかの疾患を治療する又は予防するための療法において有用である。そのような治療は、たとえば、免疫抑制されたヒト及び動物の患者におけるウイルス感染の予防又は治療を含めて多数のタイプの患者及び治療に適用可能である。
第1の局面では、本発明は、たとえば長さ少なくとも6ヌクレオチドで、抗ウイルス剤としての使用に適合され、オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性が主として非配列相補性の作用機序により生じる少なくとも1つの抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを含む抗ウイルス性オリゴヌクレオチド製剤を提供する。そのような製剤は、たとえば、少なくとも2、3、5、10、50、100以上の異なるオリゴヌクレオチドの混合物を包含することができる。
オリゴヌクレオチド及びそのほかの物質と関連して本明細書で使用する用語「抗ウイルス性」は、ウイルス粒子の産生を阻害すること、すなわち、そうでなければ感染性ウイルス粒子形成物に好適な系において形成される感染性ウイルス粒子の数を減らすことにおけるオリゴヌクレオチド及びそのほかの物質の存在の効果を言う。
用語「抗ウイルス性オリゴヌクレオチド製剤」は、抗ウイルス剤としての使用に適合されているる少なくとも1つの抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを含む調製物を言う。製剤は、オリゴヌクレオチドを含み、インビボで抗ウイルス剤としての使用を妨害しないそのほかの物質を含有することができる。そのようなほかの物質には、希釈剤、賦形剤、キャリア物質及び／又は抗ウイルス性物質を挙げることができるが、それに制約されない。
本明細書で使用する用語「薬学的組成物」は、生理学的に又は薬学的に許容されるキャリア又は賦形剤を含む抗ウイルス性オリゴヌクレオチド製剤を言う。そのような組成物はまた、所望の対象、たとえば、ヒトに投与するのに好適ではない組成物を作らないそのほかの成分を含むことができる。
本発明に関連して、具体的に限定しない限り、「オリゴヌクレオチド（ON）」は、オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）又はオリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチドを意味する。従って、「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（RNA）又はデオキシリボ核酸（DNA）又はその模倣物のオリゴマー又はポリマーを言う。この用語は、天然の核酸塩基、糖及び共有結合のヌクレオシド間（主鎖）結合並びに同様に機能する非天然の部分を有するオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドを包含する。そのような修飾又は置換されたオリゴヌクレオチドは、たとえば、細胞への取り込みの向上、核酸標的への親和性の向上及びヌクレアーゼの存在下での安定性の上昇のような望ましい特性のために、天然の形態よりも好ましいことが多い。使用することができる修飾の例は本明細書に記載される。主鎖及び／又はそのほかの修飾を含むオリゴヌクレオチドをもオリゴヌクレオシドと呼ぶことができる。
抗ウイルス製剤、薬学的組成物又はそのほかの物質と関連して使用される語句「抗ウイルス剤としての使用に適合されている」は、物質が抗ウイルス作用を呈し、ヒト対象のような対象に投与するために、インビボ系においてウイルス産生の阻害に使用するのに不適当にするいかなる成分又は物質を含まないことを示す。
物質の抗ウイルス作用に関連して本明細書で使用される語句「非配列相補性の作用機序」は、抗ウイルス効果を呈するメカニズムが、たとえば、アンチセンス効果のような相補的な核酸配列のハイブリッド形成によらないことを示す。逆に、「配列相補性の作用機序」は、物質の抗ウイルス効果が相補的な核酸配列のハイブリッド形成に関与することを意味する。従って、物質の抗ウイルス活性が「主として配列相補性の作用機序によらない」ことを示すことは、抗ウイルス活性が「主として配列相補性の作用機序によらない」かどうかを決定するために本明細書で提供される4つの試験（実施例10を参照のこと）の少なくとも1つを、オリゴヌクレオチドの活性が満たすことを意味する。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、試験1、試験2、試験3又は試験4を満たし；オリゴヌクレオチドは、2つの試験の組み合わせ、すなわち、試験1と2、試験1と3、試験1と4、試験2と3、試験2と4又は試験3と4を満たし；オリゴヌクレオチドは、3つの試験の組み合わせ、すなわち、試験1と2と3、試験1と2と4、試験1と3と4又は試験2と3と4を満たし；オリゴヌクレオチドはすべての試験、試験1、2、3及び4を満たす。
抗ウイルス物質の投与に関連して本明細書で使用される用語「対象」は、たとえば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ及びネコ；鳥類並びに植物、たとえば果樹を含む高等生物を言う。
関連する局面は、抗ウイルス性オリゴヌクレオチドランダマー製剤に関連し、ランダマーの抗ウイルス活性は主として非配列相補性の作用機序により生じる。そのようなランダマー製剤は、たとえば2、3、5、10以上の様々な長さのランダマーの混合物を包含することができる。
オリゴヌクレオチドの配列に関連して本明細書で使用される用語「ランダム」は、ヘアピンを形成しないように、且つ、回文配列をその中に含有しないように選択される、ウイルスmRNAに相補的ではない配列又はONを特徴付ける。特定のウイルスに対するオリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性に関連して用語「ランダム」が使用される場合、それは、その特定のウイルスのウイルスmRNAへの相補性が存在しないことを意味する。相補性が存在しないということは、たとえば、複数のウイルスについて、特定のウイルスファミリーのウイルスについて、又は感染性ヒトウイルスについて、さらに幅広くてもよい。
本出願では、用語「ランダマー」は、位置毎の揺らぎ（N）、たとえば、NNNNNNNNNNを有する一本鎖DNAを意味するように意図される。各塩基は、このONがランダムに生成された同じサイズの異なる配列の集団として現に存在するような揺らぎとして合成される。
もう1つの局面では、本発明は、標的ウイルスに対して抗ウイルス活性を有するオリゴヌクレオチドを提供し、その際、オリゴヌクレオチドは少なくとも長さ29ヌクレオチド（又は特定の態様では、少なくとも長さ30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110、又は120ヌクレオチド）であり、オリゴヌクレオチドの配列は、標的ウイルスのゲノム配列のいかなる部分にも相補的ではない。
もう1つの局面では、本発明は、標的ウイルスに対して抗ウイルス活性を有する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチド製剤を提供し、その際、オリゴヌクレオチドは少なくとも長さ６ヌクレオチド（又は特定の態様では、少なくとも長さ29、30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110、又は120ヌクレオチド）であり、オリゴヌクレオチドの配列は、標的ウイルスのゲノム核酸配列のいかなる部分にも70%未満の相補性であり、本質的にポリA、ポリC、ポリG、ポリT、Gカルテット又はTGリッチ配列から成らない。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、標的ウイルスのゲノム核酸配列のいかなる部分にも65%、60%、55%、50%、80%、90%、95%又は100%未満の相補性を有する。
本オリゴと関連して使用される用語「TG-リッチ」は、抗ウイルス性オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも70%のT及びGヌクレオチドから成り、もしそのように特定されれば少なくとも80、90又は95%のT及びG、さらに100%のT及びGから成ることを示す。
関連する局面は、本明細書で記載されているような、たとえば、抗ウイルス性オリゴヌクレオチド製剤、並びにそのほかのオリゴヌクレオチド調製物、たとえば、インビトロ使用に好適な調製物に対して記載されているような単離された、精製された又は濃縮された抗ウイルス性オリゴヌクレオチドに関する。
本発明で有用な抗ウイルス性オリゴヌクレオチドは、種々の長さ、たとえば、少なくとも6、10、14、15、20、25、28、29、30、35、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110、120、140、160以上のヌクレオチドのような長さであることができる。同様に、オリゴヌクレオチドは、前に列記した2つの値を範囲の包含的端点としてとることにより画定される範囲、たとえば10〜20、20〜40、30〜50、40〜60、40〜80、60〜120及び80〜120のヌクレオチドの範囲であることができる。特定の態様では、最短の長さ又は長さの範囲を、本抗ウイルス性オリゴヌクレオチドのために本明細書で列記された任意のそのほかのオリゴヌクレオチド規格と組み合わせる。
抗ウイルス性ヌクレオチドは、種々の修飾、たとえば安定化修飾を包含し、したがって、ホスホジエステル結合及び／又は糖及び／又は塩基において少なくとも1つの修飾を包含することができる。たとえば、オリゴヌクレオチドは1以上のホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合及び／又はメチルホスホネート結合；2'-o-メチル修飾、2'-アミノ修飾、2'-フルオロのような2'-ハロ修飾のような糖の2'位での修飾；非環式ヌクレオチド類縁体を包含することができ、少なくとも1つのホスホジエステル結合をも包含することができる。そのほかの修飾も当該技術で既知であり、使用することができる。2'-o-メチル修飾を含有するオリゴでは、現在の結果は、そのようなオリゴは好適な活性を有さないことを示唆しているので、オリゴは全体にわたって2'-o-メチル修飾を有するべきではない。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは全体にわたって修飾された結合を有し、たとえば、ホスホロチオエートを有し；3'-及び／又は5'-キャップを有し；末端3'-5'結合を包含し；オリゴヌクレオチドは、リンカーにより接続される2以上のオリゴヌクレオチド配列から成るコンカテマーであるか、又はそれを包含する。
特定の態様では、オリゴヌクレオチドは1以上のウイルスタンパク質に結合し；オリゴヌクレオチド（又はそのタンパク質の部分、たとえば、少なくとも1/2）の配列はウイルスゲノムに由来し；ウイルスゲノムに由来する配列を持つオリゴヌクレオチドの活性は、同じ長さのランダマーオリゴヌクレオチド又はランダムオリゴヌクレオチドより優位ではなく；オリゴヌクレオチドはウイルス配列に相補的な部分及びウイルス配列に相補的でない部分を包含し；オリゴヌクレオチドの配列はウイルスのパッケージ配列又はアプタマー相互作用に関与するそのほかのウイルス配列に由来し；特に指示されない限り、オリゴヌクレオチドの配列はA（x）、C（x）、G（x）、T（x）、AC（x）、AG（x）、AT（x）、CG（x）、CT（x）、又はGT（x）を包含し、その際、xは2、3、4、5、6、...60...120（特定の態様では、オリゴヌクレオチドは少なくとも長さ29、30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110、又は120のヌクレオチド又は特定した反復配列がまさに特定した少なくとも長さである）であり；オリゴヌクレオチドは一本鎖（RNA又はDNA）であり；オリゴヌクレオチドは二本鎖（RNA又はDNA）であり；オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのGカルテット又はCpG部分を包含し；オリゴヌクレオチドはウイルスmRNAに相補的な部分を包含し、長さが少なくとも29、37又は38のヌクレオチドであり（又は上記で特定したそのほかの長さ）であり；オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの非ワトソン・クリックオリゴヌクレオチド及び／又はもう1つのヌクレオチドとの非ワトソン・クリック結合に参加する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを包含し；オリゴヌクレオチドはランダムオリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドはランダマーであり、又はランダマー部分、たとえば、オリゴヌクレオチドの長さについて上記で特定した長さを有するランダマー部分を包含し；オリゴヌクレオチドは1以上のヌクレオチド残基にてオリゴヌクレオチドの特性を変更する分子に連結又は共役して、たとえば、さらに高い安定性（たとえば、血清中での安定性又は特定の溶液中での安定性）、低い血清相互作用、細胞への高い取り込み、ウイルスタンパク質との高い相互作用、送達のために配合される改善された能力、検出可能なシグナル、改善された薬物動態特性、特異的な組織分布及び／又は低い毒性を提供する。
オリゴヌクレオチドは、たとえば、混合物のような組み合わせにおいても使用することができる。そのような組み合わせ又は混合物は、少なくとも2、4、10、100、1000、10000、100,000、1,000,000以上の異なるオリゴヌクレオチドを包含することができる。そのような組み合わせ又は混合物は、たとえば、異なる配列及び／又は異なる長さ及び／又は異なる修飾及び／又は異なる連結分子又は共役分子であることができる。そのような組み合わせ又は混合物の特定の態様では、複数のオリゴヌクレオチドが最小の長さを有し、又はオリゴヌクレオチドについて上記で特定したような範囲の長さである。そのような組み合わせ又は混合物の特定の態様では、少なくとも1つの、複数の、又はそれぞれのオリゴヌクレオチドが、個々の抗ウイルス性オリゴヌクレオチド（いかなる一貫した組み合わせであることもできる）について本明細書で特定されるそのほかの特性のいずれかを有することもできる。
「ウイルスゲノムに由来する」という語句は、特定の配列がウイルスゲノムヌクレオチド配列又はその相補物（たとえばそのようなウイルスゲノム配列と同一又は相補的である）に少なくとも70%の同一性を有する、又は相当するRNA配列であるヌクレオチド塩基配列を有することを示す。本発明の特定の態様において、用語は、オリゴヌクレオチドが対する特定のウイルスのウイルスゲノム配列又はその相補的配列に、配列が少なくとも70%同一であることを示す。特定の態様では、同一性は、少なくとも80、90、95、98、99又は100%である。
本発明はまた、治療上有効量の、薬学的に許容される、少なくとも長さ6ヌクレオチド（又は本明細書で列記される別の長さ）の抗ウイルス性オリゴヌクレオチド及び薬学的に許容されるキャリアを包含する抗ウイルス性の薬学的組成物も提供し、その際、オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性は、非配列相補性の作用機序によって主として生じる。特定の態様では、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの組み合わせ若しくは混合物は、個々のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの組み合わせ若しくは混合物について、上記で特定したとおりである。特定の態様では、薬学的組成物はヒト又は非ヒト霊長類のような非ヒト動物に投与するために認可される。
特定の態様では、薬学的組成物は、ウイルスが病因の疾患の治療、抑制又は予防に適合され；プリオン病の治療、抑制又は予防に適合され；眼内投与、経口摂取、腸内投与、吸入、皮膚、皮下、筋肉内、腹腔内、くも膜下、気管内若しくは静脈内への注入、又は局所投与による送達に適合されている。特定の態様では、該組成物は、たとえば、特定の細胞又は組織を標的とする送達システム、リポソーム製剤、別の抗ウイルス薬、たとえば非ヌクレオチド抗ウイルス性ポリマー、アンチセンス分子、siRNA、又は小分子薬剤を包含する。
特定の態様では、抗ウイルス性オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド調製物、オリゴヌクレオチド製剤又は抗ウイルス性薬学的組成物は、標的ウイルス（たとえば、本明細書で示すような特定のウイルス又はウイルス群におけるウイルスのいずれか）に対する0.50、0.20、0.10、0.09、0.08、0.07、0.75、0.06、0.05、0.045、0.04、0.035、0.03、0.025、0.02、0.015又は0.01μM以下のIC50を有する。
製剤、薬学的組成物及び予防又は治療の方法の特定の態様では、組成物又は製剤は、ウイルスが病因の疾患の治療、抑制又は予防に適合され；プリオン病の治療、抑制又は予防に適合され；眼内、経口摂取、腸内、吸入、又は皮膚、皮下、筋肉内、又は静脈内への注入による送達から成る群より選択される方式による送達に適合され；さらに、特定の細胞との親和性を高める分子を包含する又はそれに関連することができる送達システムを含み；さらに、少なくとももう1つの抗ウイルス剤を組み合わせて含み；及び／又はさらに、抗ウイルス性ポリマーを組み合わせて含む。
特定のウイルス又はウイルス群を参照して、抗ウイルス性のオリゴヌクレオチド及び製剤に関連して本明細書で使用される用語「標的とする」は、そのウイルス又はウイルス群を阻害するように、オリゴヌクレオチドが選択されることを指す。特定の組織又は細胞の種類に関連して使用されるとき、この用語は、特定の組織の近傍にオリゴヌクレオチドが好ましくは存在する及び／又は好ましくは抗ウイルス効果を呈するようにオリゴヌクレオチド、製剤又は送達システムが選択されることを示す。
本明細書で使用される用語「送達システム」は、本明細書で記載されるようなオリゴヌクレオチドと組み合わせた場合、送達システムの非存在下での量及び持続時間に比べてたとえば、少なくとも20、50又は100%、インビボで意図する位置に接触するオリゴヌクレオチドの量を増やし、及び／又は標的でのその存在の持続時間を延ばし、及び／又は副作用を起こす相互作用を防ぐ又は軽減する成分を言う。
抗ウイルス剤及びそのほかの薬剤又は試験化合物に関連して本明細書で使用される用語「小分子」は、分子の分子量が1500ダルトン以下であることを意味する。場合によっては、分子量は1000、800、600、500又は400ダルトン以下である。
もう1つの局面では、本発明は、標識されたパッケージにおいて少なくとも1つの抗ウイルス性のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド組成物を包含するキットを提供し、その際、オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性は主として非配列相補性の作用機序により生じ、パッケージの標識は少なくとも1つのウイルスに対して抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを使用できることを示す。
特定の態様では、キットは、本明細書で記載されるような少なくとも1つの抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを包含する薬学的組成物を包含し；抗ウイルス性オリゴヌクレオチドは動物におけるインビボでの使用に適合され、及び／又は標識はオリゴヌクレオチド又は組成物が許容可能であり、及び／又は動物での使用について認可され；動物は、たとえば、ヒト、又はウシ、ブタ、反芻動物、ヒツジ又はウマのような非ヒト哺乳類であり；動物は非ヒト動物であり；キットは、たとえば、ヒトのような動物での使用について米国食品医薬品局又は同等の当局のような規制当局に認可される。
もう1つの局面では、本発明は、抗ウイルス剤として使用するための抗ウイルス性オリゴヌクレオチド、たとえば、非配列相補的抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを選択する方法を提供する。方法は、複数の異なるランダムオリゴヌクレオチドを合成すること、感染性ビリオンを産生するウイルスの能力を阻害する活性についてオリゴヌクレオチドを試験すること、及び薬学的に許容されるレベルで、抗ウイルス剤として使用するための活性を有するオリゴヌクレオチドを選択することを含む。
特定の態様では、異なるランダムオリゴヌクレオチドは、異なる長さのランダマーを含み；ランダムオリゴヌクレオチドは複数の最短のオリゴの配列のように、異なる配列を有することができ、又は共通する配列を有することができ；及び／又は異なるランダムオリゴヌクレオチドは少なくとも長さ5ヌクレオチドのランダマー断片を含む複数のオリゴヌクレオチドを含み、又は異なるランダムオリゴヌクレオチドは、異なる長さの複数のランダマーを包含する。特定の系にて、抗ウイルス性オリゴヌクレオチドについてたとえば、本明細書で記載されるようなそのほかのオリゴヌクレオチドを試験することができる。
さらにもう1つの局面では、本発明は、治療を必要とする対象に、治療上有効量の少なくとも1つの、本明細書で記載されているような薬学的に許容されるオリゴヌクレオチド、たとえば、少なくとも長さ6ヌクレオチドの非配列相補的なオリゴヌクレオチド又はそのようなオリゴヌクレオチドを含有する抗ウイルス性の薬学的組成物又は製剤を投与することによる、対象におけるウイルス感染の予防又は治療のための方法を提供する。特定の態様では、ウイルスは、本発明を用いて阻害するのに好適であるとして本明細書に列記されたいかなるものであることもでき；感染はウイルス感染に関連するとして本明細書で示される疾患又は症状に関係し；対象は、本明細書で示されるような対象の種類、たとえば、ヒト、非ヒト動物、非ヒト哺乳類、植物などであり；治療は、ウイルス性疾患又はウイルスが病因の疾患のためであり、たとえば、本明細書の背景の項に記載の疾患のためである。
特定の態様では、本明細書で記載されるような抗ウイルス性オリゴヌクレオチド(又はオリゴヌクレオチド製剤又は薬学的組成物）が投与され；投与は本明細書に記載されるような方法であり；本明細書で記載されるような送達システム又は方法が使用され；ウイルス感染はDNAウイルス又はRNAウイルスのものであり；ウイルスは、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、肝炎ウイルス科、又はパピローマウイルス科であり；ウイルスは、アレナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科又はトガウイルス科であり；ヘルペスウイルス科ウイルスは、EBV、HSV-1、HSV-2、CMV、VZV、HHV-6、HHV-7又はHHV-8であり；ウイルスはHIV-1又はHIV-2であり；ウイルスはRSVであり；ウイルスは、インフルエンザウイルス、たとえばA型インフルエンザであり；ウイルスはHBVであり；ウイルスは天然痘ウイルス又は痘疹ウイルスであり；ウイルスはコロナウイルスであり；ウイルスはSARSウイルスであり；ウイルスは西ナイルウイルスであり；ウイルスはハンタウイルスであり；ウイルスはパラインフルエンザウイルスであり；ウイルスはコクサッキーウイルスであり；ウイルスはライノウイルスであり；ウイルスは黄熱病ウイルスであり；ウイルスはデング熱ウイルスであり；ウイルスはC型肝炎ウイルスであり；ウイルスはエボラウイルスであり；ウイルスはマールブルグウイルスである。
同様に、関連する局面において、本発明は、そのような治療が必要なヒト又は動物に、薬学的に許容される、治療上有効量の、少なくとも1つの、少なくとも長さ6ヌクレオチドのランダムオリゴヌクレオチド（又は本明細書で記載されるようなもう1つの長さ）又はそのようなオリゴヌクレオチドを含有する製剤若しくは薬学的組成物を投与することによる、ヒト又は動物における腫瘍ウイルスによる癌の予防的治療の方法を提供する。
特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、本発明について本明細書で記載されるようなものであり、たとえば、本明細書で記載されるような長さを有し；本明細書で記載されるような投与の方法が使用され；本明細書で記載されるような送達システムが使用される。
用語「治療上の有効量」は、意図する種類の典型的な対象に投与した場合、感染性ウイルス粒子の治療上又は予防上十分な低減を達成するのに十分である量を言う。対象に抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを投与することを含む局面では、通常、オリゴヌクレオチド、製剤又は組成物は治療上の有効量で投与されるべきである。
もう1つの局面では、非配列相補性の相互作用が有効な抗ウイルス活性を生じさせるという発見によって、たとえば1以上のウイルスタンパク質のようなウイルス構成成分へのオリゴヌクレオチドの結合を変更する化合物を同定するためにスクリーニングする方法が提供される（たとえば、感染した宿主生物から抽出する、精製する、又は組換え法により生産する）。たとえば、方法は、試験化合物が1以上のウイルス構成成分へのオリゴヌクレオチドの結合を減らすかどうかを決定することを含むことができる。
本明細書で使用される用語「スクリーニング」は、所望の特性を持つかどうかを決定するために複数の化合物をアッセイすることを言う。複数の化合物はたとえば、少なくとも10、100、1000、10,000以上の試験化合物であることができる。
特定の態様では、多様なアッセイ形式及び検出方法のいずれかを用いて、たとえば、スクリーニングされる化合物の存在下又は非存在下においてオリゴヌクレオチドをウイルス構成成分に接触させ（たとえば、別々の反応において）、化合物に非存在下に比べて、化合物の存在下にてオリゴとウイルス構成成分の結合に差異が生じるかどうかを測定することによって、結合におけるそのような変化を同定することができる。そのような差異の存在は、化合物がランダムオリゴヌクレオチドのウイルス構成成分への結合を変化させることを示している。又は、オリゴヌクレオチドをウイルス構成成分に結合させ、加えた化合物による置換を測定する、又は逆に試験化合物を結合させ、加えたオリゴヌクレオチドによる置換を測定するような、競合置換を使用することができる。
特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、ウイルス性オリゴヌクレオチドについて本明細書で記載されるようなものであり；オリゴヌクレオチドは、少なくとも長さ、6、8、10、15、20、25、29、30、32、34、36、38、40、46、50、60、70、80、90、100、110又は120のヌクレオチドであり、又は抗ウイルス性オリゴヌクレオチドについて本明細書で特定される少なくとももう1つの長さであり、又は前出の値の任意の2つを範囲の包含的端点としてとることによって画定される範囲内であり；試験化合物は小分子であり；試験化合物は、400、500、600、800、1000、1500、2000、2500及び3000ダルトン未満の分子量を有し、又は前出の値の任意の2つを包含的範囲の端点としてとることによって画定される範囲内であり；ウイルスの抽出物又は構成成分は本明細書に列記されるウイルスに由来し；少なくとも100、1000、10,000、20,000、50,000又は100,000の化合物をスクリーニングし；オリゴヌクレオチドは、0.500、0.200、0.100、0.075、0.05、0.045、0.04、0.035、0.03、0.025、0.02、0.015又は0.01μM以下のIC50を有する。
本明細書で使用される用語「ウイルス構成成分」は、ウイルスにコードされた生成物又はウイルス感染の結果感染した宿主細胞により産生される生成物を言う。そのような構成成分には、タンパク質及びそのほかの生体分子を挙げることができる。そのようなウイルス構成成分は、たとえば、ウイルスの培養、感染した宿主生物、たとえば、動物又は植物から得ることができ、又は組換え系（原核生物又は真核生物）においてウイルスの配列、同様に、ウイルスがコードするタンパク質に相当するアミノ酸配列を有する合成タンパク質から産生することができる。用語「ウイルス培養抽出物」は、ウイルス特異的生成物を包含するウイルスにより感染させられた細胞からの抽出物を言う。同様に、「ウイルスタンパク質」は、通常ウイルスにコードされたウイルス特異的タンパク質を言うが、ウイルス感染の結果として宿主の配列により部分的にコードされうるウイルス特異的タンパク質も言う。
関連する局面では、本発明は、前出の方法により同定される抗ウイルス性化合物、たとえば、新規の抗ウイルス性化合物を提供する。
さらなる局面では、本発明は、オリゴヌクレオチドのプールを、たとえば、固定相媒体に結合した少なくとも1つのウイルス構成成分に接触させ、ウイルス構成成分に結合したオリゴヌクレオチドを回収することによってオリゴヌクレオチドのプールから少なくとも1つのウイルス構成成分に結合するオリゴヌクレオチドを精製する方法を提供する。一般に、回収することには、ウイルス構成成分からのオリゴヌクレオチドの置き換えを含む。方法は、回収したオリゴヌクレオチド（すなわち、ウイルスタンパク質に結合したオリゴヌクレオチド）の配列決定及び／又は抗ウイルス活性試験を含むこともできる。
特定の態様では、プールの結合したオリゴヌクレオチドは、たとえば、イオン性の置き換え体を用いて、任意の適当な方法によって固定相媒体から置き換えられ、置き換えられたオリゴヌクレオチドを回収する。通常、種々の置換方法について、オリゴヌクレオチドが高い結合親和性の順に一様に置き換わるように厳密性を高くすること（たとえば、段階的な又は連続的な勾配があるように塩のような置換剤の濃度を高めることによって）によって置換を実施することができる。多くの場合、低い厳密性の洗浄を行って弱く結合したオリゴヌクレオチドを取り除き、置き換わった、さらに強く結合したオリゴヌクレオチドを含有する1以上の分画を回収する。場合によっては、さらに使用するために、非常に強く結合するオリゴヌクレオチド（たとえば、さらに厳密な置換条件による置換で生じた分画におけるオリゴヌクレオチド）を含有する分画を選択することが望ましい。
同様に、本発明は、オリゴヌクレオチドのプールを1以上のウイルスタンパク質に接触させ、ウイルスタンパク質に結合したオリゴヌクレオチドを増幅させて濃縮したオリゴヌクレオチドプールを提供することによる、少なくとも1つのウイルス構成成分に結合するオリゴヌクレオチドのプールからオリゴヌクレオチドを濃縮する方法を提供する。接触及び増幅は、次の回のオリゴヌクレオチドのプールとして前の回の濃縮したオリゴヌクレオチドプールを用いて、複数回、たとえば1、2、3、4、5、10以上の追加回数行うことができる。方法はまた、接触及び増幅の1以上の回数に続いて、濃縮されたオリゴヌクレオチドプールにおけるオリゴヌクレオチドの配列決定及び抗ウイルス活性試験をも含むことができる。
方法は、たとえば、置換剤を用いて、上述のように、種々の技法によりウイルス構成成分（たとえば、固相媒体に結合したウイルスタンパク質）からオリゴヌクレオチドを置換することを含む。上記で示したように、更なる使用、たとえば、結合及び増幅のさらなる回のために、さらに強く結合するオリゴヌクレオチドを選択することは有利でありうる。方法は1以上の濃縮されたオリゴヌクレオチド、たとえば、高親和性オリゴヌクレオチドを選択することをさらに含み、さらに使用することができる。特定の態様では、選択には、関心のある特定のウイルスについて、宿主のゲノム配列（たとえば、ヒト）に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドの排除が包含されうる。そのような排除は、たとえば、配列配置プログラム（たとえば、BLAST検索）を用いて配列データベースにおける特定の宿主に由来する配列とオリゴヌクレオチド配列を比較すること、及び宿主配列と同一の、又は特定のレベルで同一性を持つ配列を有するオリゴヌクレオチドを排除することを含むことができる。そのような宿主相補性配列の排除及び／又は宿主配列に相補的でない1以上のオリゴヌクレオチドの選択は、本発明のそのほかの局面についても実施することができる。
オリゴヌクレオチドを同定する、精製する又は濃縮する、前出の方法では、オリゴヌクレオチドは本明細書に記載されるような種類である。上記の方法は、たとえば、オリゴヌクレオチドのランダマー調製物から、高親和性オリゴヌクレオチドを同定する、精製する又は濃縮するために有利である。
関連する局面では、本発明は、当初のオリゴヌクレオチドプールから抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを同定する、精製する又は濃縮する前出の方法のいずれかの方法を用いて同定される1以上のオリゴヌクレオチドを包含する抗ウイルス性オリゴヌクレオチド調製物に関するものであり、その際、オリゴヌクレオチド調製物中のオリゴヌクレオチドは、当初のオリゴヌクレオチドプールにおけるオリゴヌクレオチドの平均結合親和性よりも、高い、1以上のウイルスタンパク質に対する平均結合親和性を呈する。
特定の態様では、オリゴヌクレオチドの平均結合親和性は、当初のオリゴヌクレオチドプールにおけるオリゴヌクレオチドの平均結合親和性よりも少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍又は100倍高く、又はさらに高く；結合親和性の中央値は、当初のオリゴプールの結合親和性の中央値に比べて、少なくとも2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍又は100倍高く、その際、中央値は真ん中の値を言う。
さらにもう1つの局面では、本発明は、少なくとも1つの抗ウイルス性オリゴヌクレオチド及び少なくとも1つの非ヌクレオチド抗ウイルス性ポリマーを包含する抗ウイルス性ポリマーミックスを提供する。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは抗ウイルス性オリゴヌクレオチドについて本明細書で記載されるようなものであり及び／又は抗ウイルス性ポリマーは本明細書で記載されるようなものであり、又はさもなければ、当該技術で既知であるもの、又は以下に特定するものである。
さらにもう1つの局面では、本発明は、ランダマーが少なくとも長さ6ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドランダマーを提供する。特定の態様では、ランダマーは抗ウイルス性オリゴヌクレオチドについて上記で特定されたような長さを有し；ランダマーは、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を包含し、ランダマーは、少なくとも1つのホスホロジチオエート結合又は本明細書で列記されるようなそのほかの修飾を包含し；ランダマーオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの非ランダマー断片（たとえば、選択されたウイルスの核酸配列に相補的な断片）を包含し、それは、オリゴヌクレオチドについて上記で特定されたような長さを有することができ；ランダマーは、少なくとも5、10、15、20、50、100、200、500又は700μM、1、5、7、10、20、50、100、200、500又は700mM若しくは1Mのランダマーを含有する調製物中若しくは調製物のプール中にあり、又は包含的な端点として前出から2つの異なる値をとることにより画定される範囲内にあり、又は列記された尺度若しくは尺度の範囲の1つで合成される。
同様に、本発明は、少なくとも1つのランダマー、たとえば、上述のようなランダマーを合成することによって抗ウイルス性ランダマーを調製する方法を提供する。
上記で示したように、ウイルス感染又はウイルス感染のリスク又は特定のウイルスへの標的化に関与するいかなる局面についても、特定の態様では、ウイルスは上記で列記されたようなものである。
表現「ヒト及び動物のウイルス」は、限定することなく、一般にDNAウイルス及びRNAウイルスを包含することが意図される。DNAウイルスには、たとえば、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、肝炎ウイルス科、及びパピローマウイルス科が挙げられる。RNAウイルスには、たとえば、アレナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、ラブドウイルス科、レトロウイルス科又はトガウイルス科が挙げられる。
もう1つの分子又は部分と連結する又は共役することによるオリゴヌクレオチドの特性の改変に関連して、特性の改変は、連結した又は共役した分子又は部分のない同一オリゴヌクレオチドに比べて、評価される。
追加の態様は、詳細な説明及び請求の範囲から明らかになるであろう。
HSV-1（KOS株）を用いてVERO細胞で行ったプラーク減少アッセイ。漸増濃度のREP1001（a)、REP2001（b)又はREP3007（c）で感染細胞を処理した。線形回帰から算出したIC50を各グラフに記録した。 PS-ODNのサイズとHSV-1に対するIC50との間の関係。図1のIC50値を図1で試験した各PS-ODNの特異的サイズに対してプロットした。 HSV-1（KOS株）を用いてVERO細胞で行ったプラーク減少アッセイ。漸増濃度のREP2001（a）、REP2002（b）又はREP3003（c）、REP2004（d）、REP2005（e）、REP2006（f）およびアシクロビル（g）で感染細胞を処理した。線形回帰から算出したIC50を各グラフに記録した。 PS-ODNのサイズとHSV-1に対するIC50との間の関係。図3のIC50値を、抗HSV-1活性を示した、図3で試験した各PS-ODNの特異的サイズに対してプロットした。臨床的相関に対する参照のためにアシクロビルのIC50を示す。 HSV-1（KOS株）を用いてVERO細胞で行ったプラーク減少アッセイ。漸増濃度のREP2003（a）、REP2009（b）、REP2010（c）、REP2011（d）、REP2012（e）、REP2004（f）、REP2006（g）、REP2007（h）及びREP2008（i）で感染細胞を処理した。線形回帰から算出したIC50を各グラフに記録した。 アクリルアミドゲル電気泳動で分離した図5で試験したPS-ODNランダマーのUV後影。 PS-ODNランダマーのサイズとHSV-1に対するIC50との間の関係。図5のIC50値を、抗HSV-1活性を示した、図5で試験した各PS-ODNの特異的サイズに対してプロットした。 HSV-1（KOS株）を用いてVERO細胞で行ったプラーク減少アッセイ。未改変ODN、ランダム配列を持つPS-ODN及びHSV-1 IE110の開始コドンを標的とするPS-ODNを漸増濃度で試験した。REP2013（a）、REP2014（b）、REP2015（C）、REP2016（d）、REP2017（e）、REP2018（f）、REP2019（G）、REP2020（h）及びREP2021（i）。線形回帰から算出したIC50を各グラフに記録した。 アクリルアミドゲル電気泳動で分離した図8で試験したPS-ODNランダマーのUV後影。 PS-ODNランダマー、PS-ODNランダム配列、PS-ODN HSV-1 IE110の配列及びHSV-1に対するIC50との間の関係。図8のIC50値を、抗HSV-1活性を示した、図8で試験した各PS-ODNの特異的サイズに対してプロットした。PS-ODNランダマーに対する比較のために、図5からの追加のIC50を含めた。 HSV-1（KOS株）を用いてVERO細胞で行ったプラーク減少アッセイ。オリゴの各末端の4リボース糖に2-o-メチル修飾を有するPS-ODN（REP2024[a]）；オリゴの各末端で4エステル結合にメチルホスホネート修飾を有するODN（REP2026[b]）；及び長さ20塩基のRNA PS-ODN（REP2059[c]）及び長さ30塩基のRNA PS-ODN（REP2060[d]）を漸増濃度にて試験した。線形回帰から算出したIC50を各グラフに記録した。 HSV-2（MS2株）を用いたヒト線維芽細胞で行ったプラーク減少アッセイ。漸増濃度のREP1001（a)、REP2001（b)又はREP3007（c)で感染細胞を処理した。線形回帰から算出したIC50を各グラフに記録した。 PS-ODNのサイズとHSV-2に対するIC50との間の関係。図12のIC50値を図12で試験した各PS-ODNの特異的サイズに対してプロットした。 HSV-2（MS2株）を用いてVERO細胞で行ったプラーク減少アッセイ。漸増濃度のREP2001（a)、REP2002（b)又はREP2003（c)、REP2004（d)、REP2005（e)、REP2006（ｆ)及びアシクロビル（g）で感染細胞を処理した。線形回帰から算出したIC50を各グラフに記録した。 PS-ODNのサイズとHSV-2に対するIC50との間の関係。図14のIC50値を、抗HSV-2活性を示した、図14で試験した各PS-ODNの特異的サイズに対してプロットした。臨床的相関に対する参照のためにアシクロビルのIC50を提供する。 CMV（AD169株）を用いてVERO細胞で行ったプラーク減少アッセイ。漸増濃度のREP2004（a）又はREP2006（b）で感染細胞を処理した。線形回帰から算出したIC50を各グラフに記録した。PS-ODNのサイズとCMVに対するIC50との間の関係を（c）においてプロットした。図（a）及び（b）のIC50値を試験した各PS-ODNの特異的サイズに対してプロットした。 CMV（AD169株）を用いてVERO細胞で行ったプラーク減少アッセイ。3種の臨床的CMV療法を試験した：ガンシクロビル（a）、ホスカルネット（b）及びシドフォビル（c）。また、漸増濃度のREP2003（d)、REP2004（e)、REP2006（f)、及びREP2007（g)にて広い範囲のPS-ODNランダマーのサイズを試験した。最後に自家合成（h）として又市販品（i）としてREP2036（Vitravene）を試験した。線形回帰から算出したIC50を各グラフに記録した。 PS-ODNのサイズとCMVに対するIC50との間の関係。図17のIC50値を、抗CMV活性を示した、図17で試験した各PS-ODNの特異的サイズに対してプロットした。 HIV-1（NL4-3株）を用いてMT4細胞で行ったCPEアッセイ。漸増濃度のREP2004（a）又はREP2006(b）で感染細胞を処理した。線形回帰から算出したIC50を各グラフに記録した。REP2004（c）及びREP2006(d)について、感染していないMT4細胞における細胞障害性特性を示す。 PS-ODNのサイズとHIV-1に対するIC50との間の関係。図1のIC50値を、図1で試験した各PS-ODNの特異的サイズに対してプロットした。 組換え野生型HIV-1NL4-3（CNDO株）を用いて293A細胞で行った複製アッセイ。漸増濃度のアンプレナビル（a）、インジナビル（b）、ロピナビル（c）、サクイナビル（d）、REP2003（e）、REP2004（f）、REP2006（g）及びREP2007（h）で感染細胞を処理した。双方の曲線（黒線及び点線）は、CNDO株に対する用量応答曲線を表す。 図21及び（b）からのIC50値、PS-ODNのサイズとHIV-1に対するIC50との間の関係。（a）のIC50値を、図21で試験した各PS-ODNの特異的サイズに対してプロットした。 組換え型多剤耐性HIV-1（MDRC4株）を用いて293A細胞で行った複製アッセイ。漸増濃度のアンプレナビル（a）、インジナビル（b）、ロピナビル（c）、サクイナビル（d）、REP2003（e）、REP2004（f）、REP2006（g）及びREP2007（h）で感染細胞を処理した。CNDO（野生型）に対する用量応答曲線を点線で、MDRC4（薬剤耐性）に対する用量応答曲線を実線で示す。 （a）組換えHIV-1の野生型（CNDO）株及び薬剤耐性（MDRC4）株の間でのIC50値において倍の増加を示す、図21及び23からのIC50値及び（b）、（a）において算出された倍増加のプロット。 RSV（A2株）を用い、Hep2細胞で行ったCPEアッセイ。漸増濃度のREP2004（a）、REP2006（b）、REP2007（c）又はリバビリン（d）で感染細胞を処理した。線形回帰から算出したIC50を各グラフに記録した。REP2004（e）、REP2006（f)、REP2007（g）又はリバビリン（h）について、感染していないHep2細胞における細胞障害性特性を示す。 PS-ODNのサイズとRSVに対するIC50との間の関係。図25のIC50値を、図25で試験し、抗RSV活性を示す各PS-ODNの特異的サイズに対してプロットした。 コクサッキーウイルスB2（オハイオ1株）を用い、LLC-MK2細胞で行ったCPEアッセイ。漸増濃度のREP2006(a)で感染細胞を処理した。REP2006の細胞障害性特性を（b）に示す。 A）FBSからの20塩基のPS-ODNランダマーのベイトの相互作用と競合するPS-ODNランダマー（REP2003、2004、2006及び2007）の能力を示すFP相互作用アッセイ。ランダマーは大きければ大きいほど効率的に競合する。B）及びC）293A細胞におけるDOTAP及びシトフェクチンによる血清保護及び改善されたREP2006の送達。D）及びE）FPにより測定されるDOTAP又はシトフェクチンによるカプセル封入されたREP2006の血清保護。 蛍光分極による異なるサイズのベイトに対するウイルス溶解物の結合の測定。HSV-1（a）、HIV-1（b）又はRSV（c）からの溶解物における溶解物の結合について、REP2032-FL、REP2003-FL及びREP2004-FLを試験した。 蛍光分極によるウイルス溶解物に対するPS-ODNランダマーの親和性の測定。REP2004-FLをベイトとして用い、漸増濃度のREP2003、REP2004、REP2006又はREP2007によってHSV-1溶解物（a）、HIV-1溶解物（b）又はRSV溶解物（c）との複合体形成物に挑戦した。 REP2004-FLはHIV-1 p24gag及びHIV-1 gp41に結合することができる。蛍光分極によって、漸増量のこれら2つの精製タンパク質と相互作用するREP2004-FLの能力を試験した。 p24及びgp41の結合に対するベイトサイズの影響。蛍光分極によってp24gag及びgp41に結合する能力について、漸増するベイトサイズを調べた。 蛍光分極によって、ウイルス溶解物に結合する二本鎖PS-ODNの能力を試験した。非チオエート化類縁体（2017U）と同様に、一本鎖（ss）及び二本鎖（ds）のホスホロチオエート化REP2017（蛍光標識した）を調製した。HSV-1及びHIV-1のウイルス溶解物への結合についてこれらのベイトを試験した。 250nMのREP2004-FLの存在下293A細胞を4時間インキュベートすることにより蛍光的にタグを付けたPS-ODNの細胞内への送達を測定した。インキュベートに続いて、細胞を溶解し、溶解により細胞から放出された相対的な蛍光を蛍光光度法により測定した。 ウイルス溶解物に結合する異なる配列組成の20量体のPS-ODNの能力を、蛍光分極によって測定した。1μgのHSV-1（a）、HIV-1（b）又はRSV（c）の溶解物の存在下、FITCで3'を標識したPS-ODNをインキュベートした。これらPS-ODNの結合特性は3種類のウイルス溶解物すべてで小さかった（図35を参照のこと）。 未使用の細胞の上清により誘導されるCPEを測定することによるワクシニア感染のVERO細胞からの感染上清におけるウイルス負荷の間接的測定。REP2004、2006及び2007は10μM、シドフォビルは50μMで調べた。 A）HSV-1（KOS株）を用い、VERO細胞で行ったプラーク減少アッセイから生成したIC50値。漸増濃度のREP2006（N40）、REP2028（G40）、REP2029（A40）、REP2030（T40）、及びREP2031（C40）で感染細胞を処理し、IC50値を生成した。B）HSV-1PRAは、以下のIC50値を生成した：N40（REP2006）、AC20（REP2055）、TC20（REP2056）、又はAG20（REP2057）。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、非配列相補的メカニズムによって作用する抗ウイルス性オリゴヌクレオチドの同定及び使用に関するものであり、多数のウイルスに対して、オリゴヌクレオチドが大きければ大きいほど抗ウイルス活性が大きく、抗ウイルス活性は、長さ40ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチドについて通常最適である。
背景の項に記載したように、抗ウイルス活性について多数のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ON）を調べた。しかしながら、そのようなアンチセンスONは配列特異的であり、通常、長さ約16〜20ヌクレオチドである。
実施例1及び2の結果で明らかにしているように、ランダムPS-ODNの抗ウイルス効果は配列特異的ではない。これらの試験で使用されたPS-ODNの体積や濃度を考慮すると、混合物中に特定のランダム配列が1コピ-を超えて存在するのは理論的に不可能である。このことは、これらPS-ODNランダマーではアンチセンス効果がありえないことを意味する。後者の例では、抗ウイルス効果がPS-ODNの配列特異性で起きるのであれば、そのような効果はたった1分子で起きなければならず、それは、可能だとは思えない結果である。たとえば、長さ40塩基のONランダマーについて、集団中における任意の特定の配列は理論的に、全分画のたった1/440又は8.27×10-25により表される1モル＝6.022×1023分子、及び我々が現在行う最大の合成規模が15μMである事実を考えると、可能性のある配列がすべて存在するわけではなく、又、各配列はたった1コピーとして存在する可能性が高い。当然、本発明の教示を適用する当業者は、配列特異的ONを使用することもできようが、本発明で発見された非配列相補的活性を利用することもできる。従って、本発明は非配列相補的ONに制約されないが、ウイルス感染を治療するための配列特異的アンチセンスONに関する先行技術で開示されたものを放棄する。
適用可能なウイルス（たとえば、そのデータが本明細書に記載されているものを含む）に対しては、ランダマーのサイズが大きくなるにつれて、抗ウイルス有効性も大きくなる。現在のホスホロアミダイト系DNAの合成の限界のために、さらに大きなPS-ODN（たとえば、80量体や100量体）は所望のサイズより小さな断片の混入が有意に生じる。さらに大きなオリゴ（80bp及び120bp）で見られるさらに弱い効果（塩基基準当たり）は、これらの集団での完全長のランダマーの濃度が低いことを反映している可能性があり、又、細胞への取り込みの低下を反映している可能性もある。妥当な純度（75%完全長）のさらに大きなランダマー（>40塩基）が合成され、これらODNのいずれかの細胞への取り込みが送達システムにより促進されるのなら、抗ウイルス活性においてはるかに大きな増加を達成することが可能であってもよい。
本発明において、ランダマー（又はそのほかのオリゴヌクレオチド）は、以下を含むが、それに限定されない幾つかのメカニズムによってウイルスの複製を阻止してもよい。1）ビリオンの吸着又は受容体相互作用を妨げるので、感染を妨げる。2）ウイルス構成体をドープするか、又はウイルスゲノムをカプシド（パッキングについてはウイルスDNA又はRNAと競合する）の中にパッキングして欠陥のあるビリオンを生じる。3）パッキング中のカプシド形成を破壊するか、若しくは妨げる、又はカプシドタンパク質のそのほかの構造タンパク質との相互作用を破壊するか、若しくは妨げて、ウイルス放出を阻害するか、又は欠陥のあるビリオンの放出を起こす。4）ウイルスの鍵となる構成成分に結合してその活性を妨げるか、又は低下させる。5）ウイルスの増殖に必要とされる宿主の鍵となる構成成分に結合する。
本ウイルス阻害を達成するメカニズムを限定することなく、上記で示したように、ウイルス複製に対するONの阻害特性を説明しうる及び／又は予想しうる幾つかの可能なメカニズムが存在する。これらのうちの第1は、ONの一般的なアプタマー効果によってONが細胞表面のタンパク質又はウイルスタンパク質に結合し、ウイルスの吸着及び融合を妨げるものである。効果に対するサイズの閾値は、相互作用に必要とされる特定の累積変化の結果であってもよい。
第2の可能なメカニズムは、ONがウイルスのパッケージング及び／又は構成を妨げることによって細胞の中で機能してもよいということである。特定のサイズ閾値を超えるONは、正常なカプシドと核酸との相互作用と競合してもよく、又は妨害してもよく、機能的なウイルスゲノムの新しいウイルスの中へのパッケージングを妨げる。又は、ONは正常なカプシド形成物を妨げてもよく、それは正常なウイルスの出芽を妨げ、ウイルスの安定性を変化させ、又は内部移行時の適切なビリオンの分解を妨げる。
作用のメカニズムは未だ完全にははっきりしないが、アッセイ結果は、臨床的相関物、アシクロビル、ガンシクロビル、リバビリン、及びプロテアーゼ阻害剤に比べて、本ONは、ウイルス阻害においてさらに大きな有効性を呈することを明らかにしている。従って、本発明に係るONは、ウイルス感染を治療するために、又は予防するために使用することができる。治療されるウイルス感染は、ヒト、動物及び植物のウイルスで引き起こされるものである。
広いスペクトルの抗ウイルス活性
上記で議論された結論及び本明細書で報告されるデータに従って、ランダムON及びONランダマーは、ウイルスゲノムの集合及び／又はパッケージング及び／又はカプシド形成が複製に必要な工程であるウイルスとの広いスペクトルの抗ウイルス活性を有すると思われる。従って、この仮説を調べるために、サイズの異なる幾つかのPS-ODNを選択して、種々のウイルス感染の細胞モデルで試験した。多数のそのような試験を実施例において本明細書で記載するが、それには、CMV、HIV-1、RSV、コクサッキーウイルスB2、DHBV、ハンタウイルス、パラインフルエンザウイルス、及びワクシニアウイルスによる試験が含まれ、並びに実施例1及び2に記載されるHSV-1及びHSV-2における試験も含まれる。試験オリゴヌクレオチドには高い活性レベルを呈するものもあったが、DOTAP、リポフェクトアミン又はオリゴフェクトアミンのようなオリゴ送達システムは結果として、特にさらに大きな（40塩基以上）のランダマーと共にさらに大きな有効性を生じた。
広いスペクトルの抗ウイルス活性における結論
様々なウイルスによる有効性試験は、ランダムON及びランダマーが種々の異なるウイルスに対して阻害特性を示すことを明らかにしている。さらに、これらの試験は、小さいランダマーよりも大きいランダマーの方がウイルス阻害についてさらに大きな有効性を示すという結論を指示している。このことは、カプシド形成するウイルスすべてにおけるランダムON又はONランダマーについて共通するサイズ依存性及び／又は電荷依存性のメカニズムを示唆している。
HSV及びCMVは双方ともヘルペスウイルスファミリーの二本鎖DNAウイルスであるが、HIVは、レトロウイルス由来のRNAウイルスであり、又、RSVはパラミクソウイルス由来のRNAウイルスである。ONランダマーが種々の異なるウイルスのウイルス機能を阻害できるという事実を考えると、上述のように列記したメカニズムに限定されることなく、以下のメカニズムが合理的である：A）ON／ONランダマーはアプタマー効果を介してウイルス機能を阻害しており、原形質膜とのウイルスの融合を妨げる；及び／又は、B）ON／ONランダマーはビリオンの集合又はウイルスDNAのカプシド内へのパッケージングを妨げる又はドープして結果として欠陥のあるビリオンを生じる；及び／又は、C）ON／ONランダマーは、ウイルスの集合及び／又はパッケージング及び／又は遺伝子発現に必要とされる宿主のタンパク質又は構成成分を妨害している。
抗ウイルス活性の必要条件
無作為化されたDNA配列がウイルス阻害にとって十分であると思われるので、ホスホロチオエート非存在下で抗ウイルス活性を維持できるかどうか、又、有効性は、ランダム配列又はウイルスゲノムで見い出される特異的配列のいずれの選択によって増強されるかを見るのは興味深い。
従って、ランダマーの抗ウイルス有効性に対するその効果に関してDNA及びRNAの修飾を調べた。ランダマーは非配列相補的メカニズムを介して作用するので、これらの実験は、核酸構成におけるわずかな変化及び抗ウイルス有効性における電荷分布を調べるように設計した。
異なるヌクレオチド／ヌクレオシド修飾を持つODNがHSV-1を阻害できるかどうかを調べるために、実施例に記載するように、HSV-1PRAにおいてREP2024、2026、2059、及び2060を調べた。REP2024（ODNの両端の4塩基上のリボースに2-o-メチル修飾を持つPS-ODN）、REP2026（ODNの両端の４塩基の間の結合にメチルホスホネート修飾を持つPO-ODN）、REP2059（長さ20塩基のRNAPS-ODNランダマー）、及びREP2060（長さ30塩基のRNAPS-ODNランダマー）は抗HSV-1活性を示した（図11を参照のこと）。
後者の例では、抗ウイルス効果がDNAホスホロチオエート主鎖から成るONによってのみ生じるのであれば、そのような効果はたった1つの分子で生じることになる。しかし、そのほかの主鎖及び修飾も陽性の抗ウイルス活性を提供した。当然、本発明の教示を適用する当業者は、異なる化合物ONも使用できる。ホスホロチオエートのような、しかし、それに限定されないONの修飾は、抗ウイルス活性に有益であると思われる。このことは、媒体及び細胞内での双方でのONの必要とされる電荷及び／又はDNAの安定化に対する必要条件によるのが最も可能性が高く、又、PS-ODNのキラル性によってもよい。
化合物REP2026は、分解から保護する両端で未修飾のPOヌクレオチド及び4つのメチルホスホネート結合を含む中心部分を有する一方で、抗ウイルス活性を示した。このことは、分解から保護する一方で抗ウイルス剤としてPO-ODNを使用できることを示している。末端でヌクレオチドを修飾し、及び／又は後に記載するような好適な送達システムを使用することによって、この保護を達成することができる。
一般に、使用されるDNAの配列組成は、ランダマーであれ、ランダム配列であれ、又は特異的なHSV-1配列であれ、全体としての有効性にはほとんど影響しない。しかしながら、中間の長さで、HSV-1配列はランダム配列よりもほとんど3倍強力だった（図10を参照のこと）。このデータは、特異的なアンチセンスが特異的なHSV-1に対して機能的に存在する一方で、本明細書で解明された非アンチセンスのメカニズム（非配列相補的メカニズム）がこの活性の優勢な部分を表してもよいことを示唆している。実際、ONが40塩基に増殖するにつれて、本質的に抗ウイルス活性はすべて非アンチセンス効果に起因しうる。
低毒性ランダマー
ONランダマーを用いた目標の1つは、毒性を下げることである。動物では、異なる配列が、たとえば、一般毒性、血清タンパク質との相互作用及び免疫系との相互作用のような異なる応答を誘発することが知られている（Monteith et al., Toxicol. Sci., 46:365-375,1998）。従って、ONの混合物は、任意の特定の配列のレベルが極めて低いので、毒性効果を下げてもよく、だから、配列又はヌクレオチド組成による有意な相互作用はありそうにない。
薬学的組成物
本発明のONは、ウイルス性疾患を治療するのに（又はその予防に）有用な治療組成物又は製剤の形態であってもよく、ヒト又は非ヒト動物において、及び／又は特定のウイルス又はウイルス群に対して使用するために規制当局により認可されることができる。これらONは、生理学的に及び／又は薬学的に許容されるキャリアとともに組み合わせた場合、薬学的組成物の一部として使用してもよい。キャリアの特性は投与経路に依存してもよい。本発明の薬学的組成物は、そのほかの活性因子及び／又は活性を向上させる作用剤も含有してもよい。
薬学的組成物又は製剤において使用される、又は動物を治療する方法を実践するために使用される本発明のONの投与は、種々の従来の方法、たとえば、眼内、経口摂取、腸内、吸入、又は皮膚、皮下、筋肉内、腹腔内、くも膜下、気管内、又は静脈内への注入において行うことができる。
本発明の薬学的組成物又はオリゴヌクレオチド製剤はさらに、たとえば、限定なしで、リファンピン、リバビリン、プレコナリル、シドフォビル、アシクロビル、ペンシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、ファムシクロビル、フォスカーネット、ビダラビン、アマンタジン、ザナミビル、オセルタミビル、レスキモド、抗プロテアーゼ、HIV融合阻害剤、ヌクレオチドHIV RT阻害剤（たとえば、AZT、ラミブジン、アバカビル）、非ヌクレオチドHIV RT阻害剤、ドコノソル、インターフェロン類、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）及びハイパーリシンのようなウイルス疾患の治療用化学療法剤を含有してもよい。たとえば、本発明のONとの相乗効果を生じるために、そのような追加因子及び／又は作用剤が薬学的組成物に包含されてもよい。
本発明の薬学的組成物又はオリゴヌクレオチド製剤はさらに、たとえば、限定なしで、ポリ陰イオン作用剤、硫酸化多糖類、ヘパリン、硫酸デキストラン、ポリ硫酸ペントサン、硫酸ポリビニルアルコール、アセマナン、ポリヒドロキシカルボキシレート類、硫酸セルロース、スルホン化ベンゼン環又はナフタレン環を含有するポリマー類及びナフタレンスルホネートポリマー、アセチルフタロイルセルロース、ポリ-L-リジン、カプリン酸ナトリウム、陽イオン系両親媒系物質、コール酸のようなポリマーを含有してもよい。ポリマーは場合によっては、ビリオン自体に結合する又は吸着することによって細胞におけるビリオンの侵入に影響を及ぼすことが知られている。抗ウイルス性ポリマーのこの特性は、ビリオンへの結合又は吸着についてONと競合するのに有用であることができ、その結果、細胞外活性に比べて、ONの細胞内活性が高められる。
典型的な送達システム
我々は、蛍光的に標識したランダマーを培養細胞にさらすことによってPS-ODNランダマーの取り込みをモニターし、次いで2回洗浄した後、溶解した細胞の蛍光強度を調べた。送達なし、及び以下の脂質系送達システム：リポフェクトアミン（商標）（インビトロゲン）、ポリフェクト（商標）（キアゲン）及びオリゴフェクトアミン（商標）（インビトロゲン）の1つにおいてカプセル封入した後、250nMのREP2004-FLにさらした細胞への取り込みを調べた。4時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、MPER溶解試薬（プロメガ）を用いて溶解した。送達の有無での同一数のさらした細胞から得た相対蛍光収量を図34に示す。我々は、調べた3種の送達剤の存在下ではすべて、送達なしに比べて、細胞内のPS-ODNの有意な上昇があったことを認めている。
試験結果と一致して、送達システムはONランダマーの抗ウイルス効能を有意に高めることができる。さらに、それらはこれらの化合物を血清との相互作用から保護するように作用し、副作用を減らし、且つ組織及び細胞の分布を最大化する。
PS-ODNは、天然のホスホジエステルよりも内因性のヌクレアーゼに耐性ではあるが、完全には安定ではなく、血液及び組織で緩やかに分解される。PS-オリゴヌクレオチド薬剤の臨床応用における限界は、i.v.投与において補体を活性化するというその性向である。一般に、リポソーム及びそのほかの送達システムは、毒性を減らし、血漿中での停留時間を増やし、超透過性脈管構造を介したキャリアの管外遊出により疾患組織にさらに活性の高い薬剤を送達することによって、ONを含む薬剤の治療指数を高める。さらに、PS-ODNの場合は、脂質のカプセル封入が、循環している間、可能性のあるタンパク質結合部位との相互作用を妨げる（Klimuk et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 292:480-488, 2000）。
本明細書に記載される結果に従って、アプローチは、たとえば、しかし、制約なしで、本明細書に記載されるようなON送達のための親油性分子、極性脂質、リポソーム、単層、二重層、小胞、プログラム可能な膜融合性の小胞、ミセル、シクロデキストリン、PEG、イオン導入、粉末注入、及びナノ粒子（たとえば、PIBCA、PIHCA、PHCA、ゼラチン、PEG-PLA）のような送達システムの使用である。そのような送達システムを使用する目的は、とりわけ、動物及びヒトにおいて活性化合物の毒性を低下させ、細胞への送達を高め、IC50を下げ、薬剤送達の見地から作用の持続時間を増やし、且つ血清タンパク質との非特異的結合からオリゴヌクレオチドを保護することである。
我々は、PS-ODNランダマーの抗ウイルス活性はサイズの増加と共に上昇することを示してきた。さらに、この活性は、ウイルスタンパク質（ウイルス溶解物中の）への親和性の増加と相関している。ホスホロチオエート修飾は、タンパク質-DNA相互作用の親和性を高めることが当該技術で周知であるので、我々は、ウイルス溶解物との相互作用を測定するのに用いたのと同じFP系アッセイを用いて、次第に大きくなるPS-ODNランダマーのウシ胎児血清（FBS）に結合する能力を調べた（図28a）。このアッセイでは、結合（mP値）が飽和する条件下で250μgの熱非働化していないFBSが蛍光的に標識した20塩基のPS-ODNランダマーと複合体形成した。サイズが大きくなっていく非標識PS-ODN（REP2003、REP2004、REP2006及びREP2007）を用いて、標識したベイト（bait）とFBSとの相互作用に競合させた。この試験の結果は、PS-ODNランダマーのサイズが大きくなるにつれて、FBSへの親和性も大きくなることを明瞭に示している。この結果は、最も活性の高い抗ウイルス性PS-ODNは、最も高い親和性データンパク質に結合するものであることを示唆している。
ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの主な治療上の問題の1つは、Kandimalla及び共同研究者らにより記載されたように、主としてタンパク質（具体的には血清タンパク質）との高い相互作用による副作用であることが当該技術で知られている（Kandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2103-2108, 1998）。我々のデータは、血清タンパク質との相互作用を妨げながら、抗ウイルス性ONを細胞に送達可能な好適な送達システムによる実質的な利益を示唆している。
送達システムの利益を明らかにするために、我々は、リポソーム系の2つの異なる送達技術：サイトフェクチン及びDOTAPを試した。我々は、蛍光分光法により標識されたREP2006の細胞内濃度を測定することにより、高濃度（50%）の血清の存在下、PS-ODNランダマーREP2006（サイトフェクチン又はDOTAPのいずれかでカプセル封入されている）の293A細胞への送達を測定した（図28b、cを参照のこと）。これらの結果は、送達により、REP2006の細胞内濃度が高まり、DOTAPの場合、24時間後の細胞内REP2006のレベルは、顕著に増加したことを示している。最後に、我々は、我々のインビトロFP系相互作用アッセイにおいてDOTAP（28d)及びサイトフェクチン（28e)によるREP2006の血清タンパク質相互作用からの保護を測定した。カプセル封入していないREP2006は、血清由来の結合した蛍光オリゴと競合することができたが、REP2006をDOTAP又はサイトフェクチンのいずれかでカプセル封入するとそれは血清の結合に対してもはや競合することはできなかった。これらのデータは、カプセル封入がオリゴを血清との相互作用から保護し、さらに少ない副作用でさらに有効な治療効果を生じることを示唆している。
送達システムを使用することにおけるもう1つの可能性のある利益は、ビリオンの細胞侵入の増加のような異なるメカニズムを介してウイルス感染の増幅を妨げるために、吸着のような、感染性ビリオンとの相互作用からONを保護することである。
もう1つのアプローチは、特異的な細胞との親和性を高める分子に送達システムを会合させることによって細胞特異的な送達を達成することであり、そのような分子は、制約なしで、抗体、受容体、リガンド、ビタミン、ホルモン及びペプチドである。
送達システムに関する追加の選択肢は以下に提供される。
連結されたODN
特定の態様では、本発明のONは、ウイルス複製を阻害するというそれらの能力を危うくすることなく、多数の方法で修飾される。たとえば、ONは1以上のそのヌクレオチド残基にてもう1つの部分と連結されるか、又は共役される。従って、本発明のオリゴヌクレオチドの修飾は、活性を高める、細胞の分布及び細胞の取り込みを高める、特異的に又は非特異的に細胞膜を透過する輸送を増やす、又は分解若しくは排泄に対して保護する、又は有利な特性を提供する1以上の部分又は抱合体にオリゴヌクレオチドを化学的に連結することを含むことができる。そのような有利な特性には、たとえば、さらに低い血清相互作用、さらに高いウイルス-タンパク質相互作用、送達用に配合される能力、検出可能なシグナル、改善された薬物動態特性、及びさらに低い毒性が挙げられる。そのような共役基は第1級又は第2級のヒドロキシル基のような官能基と共有結合することができる。たとえば、共役部分には、ステロイド分子、非芳香族親油性分子、ペプチド、コレステロール、ビスコレステロール、抗体、PEG、タンパク質、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、もう1つのON、又はONの活性及び／又は生物利用性を改善するそのほかの任意の分子を挙げることができる。
さらに詳細には、本発明の典型的な共役基には、干渉物質、リポータ分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、SATE、T-ブチル-SATE、オリゴマーの薬力学的特性を高める基、及びオリゴマーの薬物動態特性を高める基を挙げることができる。典型的な共役基には、コレステロール類、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、蛍光ヌクレオ塩基及び染料を挙げることができる。
本発明に関連して、薬力学的特性を高める基には、オリゴマーの細胞への取り込みを高める基及び／又はオリゴマーの分解耐性を高める基及び／又は血清の相互作用に対して保護する基が挙げられる。本発明に関連して、薬物動態特性を高める基には、オリゴマーの取り込み、分布、代謝又は排泄を改善する基が挙げられる。典型的な共役基は1992年10月23日に出願され、参考として本明細書に組み入れられる国際特許出願PCT/US92/09196号に記載されている。
共役部分には、たとえば、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553-6556, 1989）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 4:1053-1060, 1994）、チオエーテル、たとえば、ヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:306-309, 1992、Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 3, 2765-2770, 1993）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 20:533-538, 1992）、脂肪族鎖、たとえば、ドデカジオール若しくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 10:1111-1118, 1991、Kabanov et al., FEBS Lett., 259:327-330, 1990、Svinarchuk et al., Biochimie, 75, 49-54, 1993）、リン脂質、たとえば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール又はトリエチル-アンモニウム1,2-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36:3651-3654,1995; Shea et al., Nucl. Acids Res.,18:3777-3783,1990）、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides,14:969-973, 1995）、又はアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 36:3651-3654, 1995）、パールミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229-237, 1995）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノカルボニル-オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol Exp. Ther., 277:923-937, 1996）のような脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない。
本オリゴヌクレオチドは、たとえば、限定することなく、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)-(+)-プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5-トリオド安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツール酸塩、セファロプロリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤又は抗生剤のような活性のある薬剤物質に共役してもよい。
典型的なオリゴヌクレオチド抱合体の調製を記載する典型的な米国特許には、たとえば、
Figure 0005514179
が挙げられ、それぞれ参考としてその全体を本明細書に組み入れる。
もう1つのアプローチは、たとえば、s-アセチルチオ-エチル又はs-ピバシロイルチオ-エチルのような酵素的に切断可能な、電荷を中和する付加体による修飾によって親油性プロオリゴヌクレオチドのような抗ウイルス性ONを調製することである（Vives et al., Nucl. Acids Res., 27:4071-4076, 1999）。そのような修飾は、ONの細胞への取り込みを高めることが示されている。
非特異的ONの設計
もう1つのアプローチにおいて、ヒト（又はそのほかの対象生物）のゲノムに対して低い、好ましくはできれば最低の相同性を示す抗ウイルス性ONを設計する。目標は、ヒト又は動物のゲノム配列及びmRNAとの相互作用による毒性が最低を示すONを得ることである。第1工程は、たとえば、手動で、又はさらに通例ではコンピュータプログラムを用いて、無作為方式にてヌクレオチド、A、C、G、Tを並べることにより、ONの所望の長さの配列を製造する。第2の工程は、GenBank及び／又はアンサンブルヒューマンゲノムデータベースのようなヒト配列のライブラリとONの配列を比較する。所望であれば、配列の生成及び比較を繰り返して行い、対象ゲノムとの所望の低い相同性を有する配列を同定することができる。望ましくは、ONの配列は、ゲノム全体とのできるだけ最低の相同性であり、一方、好ましくは自己相互反応をできるだけ抑える。
アンチセンス活性を持つ非特異的ON
もう1つのアプローチでは、抗ウイルス性の非特異的配列部分をアンチセンス配列部分に結合して最終的なONの活性を高める。ONの非特異的部分は本発明に記載されている。アンチセンス部分はウイルスmRNAに相補的である。
Gリッチモチーフ活性を持つ非特異的ON
もう1つのアプローチでは、抗ウイルス性の非特異的配列部分を、最終的なONの活性を改善するモチーフ部分に結合させる。ONの非特異的部分は本発明に記載されている。モチーフ部分は、非限定例として、免疫系の刺激剤として文献に記載されているCpG、Gカルテット、及び／又はCGを挙げることができる。Agrawal et al., Curr. Cancer Drug Targets, 3: 197-209, 2001。
非ワトソン・クリックON
もう1つのアプローチは、1以上の種類の非ワトソン・クリック型ヌクレオチド／ヌクレオシドから構成されるONを使用することである。そのようなONは、PS-ODNに類似する以下の特性の一部を持つPS-ODNを模倣することができる：a）全体の変化；b）単位間の空間；c）鎖の長さ；d）一方の側での負の電荷の蓄積による正味の双極子；e）タンパク質に結合する能力；f）ウイルスタンパク質に結合する能力；g）細胞に侵入する能力；h）許容される治療指数、i）抗ウイルス活性。ONは好ましいホスホロチオエートの主鎖を有するが、それに限定されない。非ワトソン・クリック型ヌクレオチド／ヌクレオシドの例は、Kool, Acc. Chem. Res., 35:936-943, 2002及び合成の脱塩基部位を含有するONを記載しているTakeshita et al., J. Biol. Chem., 262:10171-10179, 1987に記載されている。
抗ウイルス性ポリマー
もう1つのアプローチは、ホスホロチオエートODNの活性を模倣するポリマーを使用することである。文献に記載されているように、幾つかの陰イオン性ポリマーは抗ウイルス性の阻害活性を有することが示された。これらのポリマーは幾つかのクラスに属する：（1）多糖類の硫酸エステル（デキストリン及び硫酸デキストラン；硫酸セルロース）；（2）スルホン化されたベンゼン環又はナフタレン環を含有するポリマー及びスルホン酸ナフタレンポリマー；（3）ポリカルボキシレート（アクリル酸ポリマー）；及びアセチルフタロイルセルロース（Neurath et al., BMC Infect. Dis., 2:27, 2002）及び（4）脱塩基オリゴヌクレオチド（Takeshita et al., J. Biol. Chem., 262:10171-10179, 1987）。非ヌクレオチドの抗ウイルス性ポリマーのそのほかの例は文献に記載されている。本明細書に記載されるポリマーは、本明細書に記載されるPS-ODNを模倣し、PS-ODNに類似する以下の特性を有する：a）鎖の長さ；b）一方の側での負の電荷の蓄積による正味の双極子；c）タンパク質に結合する能力；d）ウイルスタンパク質に結合する能力；e）許容される治療指数、f）抗ウイルス活性。PS-ODNの効果を模倣するために、抗ウイルス性ポリマーは好ましくは、PS-ODNに比較されるように、その単位間で類似の空間を示すポリ陰イオンであってもよい。それは、単独で又は送達システムと組み合わせて、細胞に侵入する能力を有してもよい。
二本鎖PS-ODNの抗ウイルス活性
ランダム配列及びその相補体（PSが修飾されている又はされていないのいずれか）をどこかに記載したように蛍光で標識し、本発明に記載しているように蛍光分極により精製したHSV-1及びHIV-1に結合する能力を調べる。アクリルアミドゲル電気泳動により、ハイブリッド形成を検証した。修飾していないREP2017（2017U）は一本鎖（ss）又は二本鎖（ds）のいずれもHSV-1又はHIV-1の溶解物における結合活性を有さなかった。しかしながら、PS修飾したREP2017は、一本鎖又は二本鎖のいずれかでHSV-1及びHIV-1との相互作用が可能であった（図33を参照のこと）。
本明細書で記載される我々の結果に従って、アプローチは有効な抗ウイルス剤として二本鎖ONを使用することである。好ましくは、そのようなONは、ホスホロチオエート主鎖を有するが、本明細書で一本鎖ONについて記載されるようなその送達及び／又は抗ウイルス活性及び／又は安定性を高めるそのほかの及び／又は修飾も有してもよい。
創薬のためのインビトロアッセイ
蛍光分極に基づいてインビトロアッセイを開発し、PS-ODNのウイルス構成成分、たとえば、ウイルスタンパク質に結合する能力を測定する。タンパク質（又はもう1つの相互作用因子）が蛍光的に標識されたベイトに結合すると、溶液中でベイトの三次元のタンブリングが遅れる。標識されたベイトに由来する励起された光の分極における固有の上昇によってこのタンブリングの遅延を測定する。従って、上昇した分極（大きさのない測定値［mP］として報告される）は増加した結合に相関する。
方法論の1つは、自由度のないリンカー（3'-（6-フルオレセイン）CPG）を用いて、3'でFITC標識したPS-ODNランダマーをベイトとして用いることである。このPS-ODNランダマーをアッセイ緩衝液（10mMのトリス、pH7.2、80mMのNaCl、10mMのEDTA、100mMのb-メルカプトエタノール及び1％ツイーン20）で2nMに希釈する。次いで、このオリゴを適当な相互作用因子と混合する。この場合、我々は、0.5MのKCl及び0.5%トリトンX-100（HSV-1及びHIV-1）又は10mMのトリス、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA及び0.1％のトリトンX-100（RSV）に懸濁した、スクロース勾配で精製した、HSV-1（Maclntyre株）、HIV-1（Mn株）又はRSV（A2株）の溶解物を用いる。ベイトとの相互作用に続いて、種々の非標識のPS-ODNを複合体に暴露して、その複合体からベイトを置き換える能力を評価する。
図29では、我々は、3種類の異なるサイズ：6塩基（REP2032-FL）、10塩基（REP2003-FL）及び20塩基（REP2004-FL）のベイトによる予備試験を示す。HSV-1（図29a）、HIV-1（図29b）及びRSV（図29c）の溶解物と相互作用する能力についてこれらのベイトを調べた。ウイルス溶解物いずれかの存在下で、結合の程度は使用したベイトのサイズに依存し、ウイルス溶解物の存在下で2004-FLがmP（結合）における最も大きなシフトを示した。我々は、このことがPS-ODNランダマーのサイズ依存性の抗ウイルス有効性に類似することに気付いている。次いで、このベイトを用いて、異なるサイズのPS-ODNの溶解物とベイトの相互作用に競合する能力を調べた。
図30では、HSV-1（図30a）、HIV-1（図30b）及びRSV（図30c）の溶解物とREP2004-FLとの相互作用に漸増サイズのPS-ODNを暴露する。調べた各ウイルス溶解物について、我々は、REP2003が溶解物から離れてベイトと競合できないことに気付いている。REP2004（非標識ベイト）競合物により引き出される相対的に弱い競合により示されるようにベイトの相互作用は極めて強かった。しかしながら、競合物PS-ODNのサイズが20塩基を超えて増えるにつれて、ベイトに取って代わるその能力がさらに強くなることが観察された。このことは、PS-ODNランダマーのサイズが増えるにつれて、ウイルス溶解物中のタンパク質構成成分への親和性が増すことを示している。この現象は、HSV-1、HSV-2、CMV、HIV-1及びRSVに対するさらに大きなPS-ODNランダマーの上昇した抗ウイルス活性を映している。
ベイト競合におけるPS-ODNランダマーの有効性及びPS-ODNランダマーの抗ウイルス活性の間の類似性は、このアッセイパラダイムが抗ウイルス活性の良好な予告者であることを示している。このアッセイは行うのに強力で且つ容易であり、極めて安定であり、特異的な標的の同定に基づかないが1以上の構成成分、たとえば、ウイルスタンパク質と相互作用する能力にもとづいて新規の抗ウイルス性分子を同定するために、高い処理能力のスクリーニングを行う上で良好な候補になっている。
所望の供給源、たとえば、コンビナトリアルケミストリにより合成された又は天然物質の精製により単離されたライブラリから新規の化合物をスクリーニングするのに、本明細書に記載された方法を使用する。それを、a）新規のONの適当なサイズ、修飾及び主鎖を決定するのに；b）新規のポリマーを含む新規の分子を調べるのに；c）新規のON又は新規の化合物に対する特定のウイルスの感受性を予測するのに；又はd）特定のウイルスを最大限阻害するための一揃いの化合物を決定するのに用いられる。
大きなサイズのPS-ODNランダマーとの溶解物の大きな親和性は、PS-ODNランダマーの作用の抗ウイルスメカニズムが、ビリオンの感染又は複製の修正のいずれかを妨げる1以上のウイルスタンパク質構成成分との相互作用に基づくことを示唆している。それはまた、この相互作用が、電荷（サイズ）依存性であり、配列に依存していないことを示唆している。これらPS-ODNランダマーは、幾つかの異なるファミリーにまたがって複数のウイルスにわたってサイズ依存性の活性を有するので、我々は、PS-ODNは、共通する、電荷依存性のタンパク質-タンパク質相互作用、タンパク質-DNA/RNA相互作用及び／又は分子-分子相互作用を妨害することを示唆している。これらの相互作用には以下を挙げることができる（これらに限定されない）。
a）カプシド形成中の個々のカプシドサブユニット間の相互作用
b）カプシド／ヌクレオカプシドタンパク質とウイルスゲノムとの間の相互作用
c）出芽中のカプシドと糖タンパク質との間の相互作用
d）感染中の糖タンパク質と受容体との間の相互作用
e）ウイルス複製に関与するそのほかの鍵となるウイルス構成成分間の相互作用
タンパク質-タンパク質相互作用のこれら複数の同時阻害剤は、抗ウイルス性の阻害の新規のメカニズムを代表する。
溶解物に対するPS-ODNの配列組成の効果
我々は、異なる配列のPS-ODNの幾つかのウイルス溶解物と相互作用する能力をモニターした。各場合において、本明細書において前に記載したように20量体のPS-ODNを３’末端にてFITCで標識する。調べたPS-ODNは、A20、G20、T20、C20、AC10、AG10、TC10、TG10、REP2004及びREP2017から成った。これら配列のそれぞれをアッセイ緩衝液で4nMに希釈し1μgのHSV-1、HIV-1又はRSVの溶解物の存在下インキュベートした。蛍光分極によって相互作用を測定した。
調べた配列すべてとの相互作用の特性がウイルス溶解物すべてで似ているということは、結合相互作用の性質は極めて類似していることを示している。均一な組成のPS-ODN（A20、G20、T20、C20）は各溶解物との最も弱い相互作用因子であり、A20は有意な余裕をもってこれらの中で最も弱い相互作用因子であった。調べた残りのPS-ODNについては、各溶解物と一貫して最大の相互作用を示したTG10を除いて、すべて類似した強い相互作用を示した（図35を参照のこと）。
HIV-1におけるPS-ODNランダマーの標的同定
実施例9に記載するように、蛍光分極によって、PS-ODNランダマーの精製したHIV-1タンパク質に結合する能力を調べた。漸増量の精製したHIV-1p24又は精製HIV-1gp41がREP2004-FLと反応した（図31を参照のこと）。我々は、これら双方のタンパク質について、蛍光分極においてタンパク質の濃度依存性のシフトがあるということが、これら双方のタンパク質の相互作用を指してることに気付いている。
REP2032、REP2003、REP2004、REP2006、及びREP2007の蛍光型を用いて、これらのタンパク質に結合するPS-ODNのサイズ範囲の能力を調べた（図32を参照）。我々は、p24について、p24とのサイズ依存性の相互作用がないことは観察したが（図32aを参照のこと）20塩基未満に比べて20塩基を超えるPS-ODNにおいてgp41の結合の増加を見た（図32bを参照のこと）。このことは、PS-ODNの長さが20塩基を超えて増えると、複数コピ-のgp41が個々のランダマーに結合してその分極を増やしうることを示唆している。
このことは、それが、ウイルス合成の間構造タンパク質を隔離するさらに大きなONの能力を明らかにし、新しいビリオン形成への利用性を限定しているので、有意な所見である。
高親和性のオリゴヌクレオチド
もう1つのアプローチは、ウイルスタンパク質のようなウイルス構成成分に対する、ONの標準プールにおける平均親和性よりも高い親和性を有するONを濃縮する又は精製する方法である。従って、方法は1以上のウイルス構成成分に対する高い親和性を示し、たとえば、そのように高い結合親和性に寄与する三次元形状を有する1以上の非配列相補的ONを提供する。理論的根拠は、ONがウイルス構成成分との結合で直鎖分子として作用する一方でそのようなウイルス構成成分との相互作用を高める三次元形状にも折り畳むことができるということである。特定の技術に限定することなく、以下の方法によって高い親和性のONを精製又は濃縮することができる。
高い親和性のON又は複数の高い親和性のONを精製する方法の1つは、ONを結合する親和性マトリクスとしてウイルスタンパク質を結合させた固定相媒体を用い、次いで、漸増する厳密性条件下（たとえば、漸増する濃度の塩又はそのほかのカオトロピック剤、及び／又は漸増する温度及び／又はpHの変化）でそれを溶出することができる。そのような方法はたとえば、以下によって行うことができる。
a）固定相に結合したウイルスタンパク質又は数種のウイルスタンパク質又はウイルス溶解物を有する交換カラムにONのプールを装填すること；
b）たとえば、漸増する塩溶液のような置換剤溶液を使用することによってカラムから結合したONを置換すること（溶出すること）；
c）異なる塩濃度で溶出されたONの分画を回収すること；
d）高い塩濃度で溶出されたONがウイルスタンパク質との高い親和性を有するように、異なる分画から、さらに好ましくは高い塩濃度の分画から溶出されたONをクローニングし、配列決定すること；及び
e）結合アッセイ及び／又はウイルス阻害アッセイ、たとえば本明細書で記載されたような蛍光分極結合アッセイ及び／又は細胞ウイルス阻害アッセイ及び／又は動物ウイルス阻害アッセイにおいて配列決定されたONの活性を調べること。
第2の例では、SELEX方法論（Morris et al., Biochemistry, 95:2902-2907, 1998）に由来する及びそれから改変された方法を用いて、高い親和性のONを精製することができる。そのような方法の実施の1つは以下のように行うことができる。
a）たとえば1014〜1016の異なる配列のような膨大な数の配列を含有する合成ランダムONの集団であるONの出発プールを提供すること。各ON分子は、各末端でのプライマ-結合配列に隣接してランダム配列の断片を含有してポリメラーゼ鎖反応（PCR）を促進する。本質的にすべての分子のヌクレオチド配列が固有なので、集団では膨大な数の構造が試料採取される。これらの構造が、たとえば、所定のウイルス標的分子に結合する能力のような各分子の生化学的特性を決定する；
b）ウイルスタンパク質又は数種のウイルスタンパク質又はウイルス溶解物にONを接触させること；
c）たとえば、元々のゲルシフト及びニトロセルロースろ過のような、結合したONと結合しないONを区分化することができる区分化技術を用いて、ウイルスタンパク質に結合したONを選択すること。これらの方法のいずれかが結合していない種から結合した種を物理的に分離し、最も結合した配列を優先的に回収することができる。また、小さなタンパク質に結合するONを選択するには、標的を固相支持体に結合させ、親和性精製マトリクスとしてその支持体を用いることが望ましい。結合しないそれらの分子は洗い流され、結合したものは遊離した標的とともに溶出され、再び、結合した種と結合しない種を物理的に分離する。
d）ONの隣接配列とハイブリッド形成するプライマ-を用いたPCRを用いて、溶出された結合ONを増幅すること；
e）ウイルスタンパク質への最高の結合親和性を示すONを優先的に回収するために、工程（b）、（c）及び（d）を複数回（すなわち、複数サイクル又は複数回の濃縮及び増幅）繰り返す。数サイクルの濃縮及び増幅の後、集団では所望の生化学的特性を示す配列が優勢である：
f）濃縮サイクル、たとえば、最後のサイクルから選択した1以上のONをクローニングし、配列決定すること；及び
g）アッセイ、たとえば本明細書で記載されたような蛍光分極結合アッセイ及び／又は細胞ウイルス阻害アッセイ及び／又は動物ウイルス阻害アッセイにおいて配列決定されたONの結合及び／又は活性を調べること。
もう1つのアプローチは、スプリット合成方法論の修飾を適用して、Yang et al., Nucl. Acids Res., 30(e132): 1-8, 2002に記載されているように1-ビーズ1-PS-ODN及び1-ビーズ1-PS2-ODNを創製する。ウイルスタンパク質への特異的なビーズの結合及び選択を行うことができる。選択されたビーズのPCRに基づいた同定タグを用いて、双方の核酸塩基の配列決定及びチオエート／ジチオエート結合の位置決めを行うことができる。このアプローチによって、ウイルスタンパク質に結合する強力な抗ウイルス特性を呈するPS-ODN又はPS2-ODNの同定を迅速に且つ都合よく行うことができる。
ウイルスタンパク質に結合する高親和性の具体的配列がいったん決定されると（たとえば、個々の増幅及び配列決定によって）1以上のそのような高親和性の配列を選択し、合成して（たとえば、化学合成又は酵素的合成のいずれか）、薬物動態特性を改善することを含む活性を改善するために修飾されうる高親和性ONの調製を提供する。そのような高親和性ONを本発明では使用することができる。
プリオン病
もう1つのアプローチは、プリオン病の治療、進行の制御又は予防のための本発明の別の態様で使用される。この致死的神経変性疾患は感染性であり、ヒト及び動物の双方を冒す。細胞性プリオンタンパク質、PrPCのスクレイピーアイソフォーム、PrPSCへの構造変化がプリオン病の発症及び進行の必須段階であるとみなされている。プリオン病の神経病理学にはアミロイドポリマーが関係している。
プリオンタンパク質断片と二本鎖核酸とのインキュベートの結果、アミロイド線維形成物を生じる（Nandi et al., J. Mol. Biol., 322:153-161, 2002）。ホスホロチオエート類のようにタンパク質に親和性を有するONは、二本鎖核酸とPrPCとの相互作用と競合させる又はそれを阻害するのに使用され、その結果、アミロイドポリマー形成物を止める。異なるサイズ及び異なる組成のそのようなONを適当な送達形態で用いて、プリオン病に罹った患者を治療することができ、又はリスクの高い状況を予防することができる。そのような干渉するONは、試験ONの存在下で、Nandi et al.,（前記）により記載されたように、アミロイドポリマーの折り畳み変化を測定することによって同定することができる。
想定されるウイルスの病因
もう1つのアプローチは、以下の例で限定することなく記載されるように、想定されるウイルス病因のある疾患又は症状の治療又は予防のための本発明のもう1つの態様で使用される。ウイルスは、ウイルスの一次感染に関係のない疾患及び症状において推定上の原因物質である。たとえば、関節炎はHCV（Olivieri et al., Rheum. Dis. Clin. North Am., 29:111-122, 2003）、パルボウイルスB19、HIV、HSV、CMV、EBV及びVZV（Stahl et al., Clin Rheumatol., 19:281-286, 2000）に関係している。そのほかのウイルスも様々な疾患において役目を担っているとして同定されている。たとえば、パーキンソン病におけるインフルエンザA（Takahashi et al., Jpn. J. Infect. Dis., 52:89-98, 1999）、多発性硬化症におけるコロナウイルス、EBV及びそのほかのウイルス（Talbot et al., Curr Top Microbiol. Immunol., 253, 247-71, 2001）、慢性疲労症候群におけるEBV、CMV及びHSV-６（Lerner et al., Drugs Today, 38:549-561, 2002）、喘息（Walter et al., J. Clin. Invest., 110:165-175, 2002）及びパージェット病におけるパラミクソウイルス、及びGuillain-Barre症候群におけるHBV、HSV及びインフルエンザ。
これらの病因のために、本発明を用いた関連するウイルスの阻害は、相当する疾患若しくは症状、又は疾患の少なくとも症状の一部の進展を遅延させる、減速させる又は防ぐことができる。
オリゴヌクレオチドの修飾及び合成
上記の要約で示したように、修飾したオリゴヌクレオチドは本発明で有用である。そのような修飾されたオリゴヌクレオチドには、たとえば、修飾した主鎖又は非天然のヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。修飾した主鎖を有するオリゴヌクレオチドには、主鎖にリン原子を保持するもの及び主鎖にリン原子を有さないものが挙げられる。
そのような修飾されたオリゴヌクレオチドの主鎖には、たとえば、ホスホロチオエート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、3'-アルキレンホスホネート類、5'-アルキレンホスホネート類及びキラルホスホネート類を含むメチル又はそのほかのアルキルホスホネート類、ホスフィネート類、3'-アミノホスホロアミダイト及びアミノアルキルホスホロアミダイトを含むホスホロアミダイト類、チオノホスホロアミダイト類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、セレノホスフェート類、カルバラニルホスフェート通常の3',5'結合を有するボラノ-ホスフェート類、2',5'結合したこれらの類縁体、並びに1以上のヌクレオチド間結合が、3'〜3'、5'〜5'又は2'〜2'の結合である反転した極性を有するものが挙げられる。反転した極性を有するオリゴヌクレオチドには通常、3'のほとんどのヌクレオチド間結合で単一の3'〜3'結合、すなわち、脱塩基（ヌクレオ塩基を失っている又はそれに代わってヒドロキシル基を有する）である単一の反転ヌクレオシド残基が挙げられる。種々の塩、混合塩及び遊離の酸の形態も挙げられる。
上記で示されるようなリンを含有する結合を持つオリゴヌクレオチドは、たとえば、
Figure 0005514179
に記載されており、参考としてその全体を本明細書に組み入れる。
リン原子を包含しない一部の典型的なオリゴヌクレオチドの主鎖は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオチド間結合、混合へテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオチド間結合、又は1以上の短鎖へテロ原子の又は複素環のヌクレオチド間結合により形成される主鎖を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部が形成される）、シロキサン主鎖、硫化物、スルホキシド及びスルホンの主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチルの主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルの主鎖；リボセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；及び混合されたN、O、S及びCH2の成分部分を有するそのほかのものを有するものが挙げられる。特に有利なのは、1以上の荷電された部分を包含する主鎖結合である。先行するオリゴヌクレオチドの調製を記載する米国特許の例には、
Figure 0005514179
が挙げられ、それぞれ参考としてその全体を本明細書に組み入れる。
修飾されたオリゴヌクレオチドは1以上の置換された糖部分も含有してもよい。たとえば、そのようなオリゴヌクレオチドは、以下の2'修飾：OH；F；O-、S-、又はN-アルキル；O-、S-、又はN-アルケニル；O-、S-、又はN-アルキニル；又はO-アルキル-O-アルキルの1つを包含することができ、その際、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換された又は置換されないC1〜C10のアルキル又はC2〜C10のアルケニル及びアルキニル、あるいは2'-o-（o-カルボラン-1-イル）メチルであってもよい。特定の例は、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)-OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及びO(CH2)nON[CH2)nCH3]2であり、その際、n及びmは1〜10である。そのほかの典型的なオリゴヌクレオチドは、以下の2'修飾：C1〜C10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル又はO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、リポータ基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基の1つを包含する。例には、2'-メトキシエトキシ（2'-O-(2-メトキシエチル) 又は2'-MOEとしても知られる2'-O-CH2CH2OCH3)(Martin et al., Helv. Chim. Acta., 78:486-504, 1995)、すなわち、アルコキシアルコキシ基；2'-ジメチル-アミノキシエトキシ、すなわち、2'-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基；及び2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（2'-O-ジメチルアミノエトキシエチル又は2'-DMAEOEとしても知られる）すなわち、2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2が含まれる。
そのほかの修飾には、2'-ヒドロキシ基が糖環の3'又は4'の炭素に結合し、それによって二環式糖部分を形成するロックされた核酸（LNA）が挙げられる。結合は、2'の酸素原子と4'の炭素原子を架橋するメチレン(-CH2-) 基であることができ、その際、nは1又は2である。LNA及びその調製は、国際公開公報第98/39352号及び同第99/14226号に記載されており、参考としてその全体を本明細書に組み入れる。
そのほかの修飾には、Orum et al., Curr. Opin. Mol. Ther., 3:239-243, 2001に記載されているようなロックされた核酸のようなイオウ-窒素架橋修飾が挙げられる。
そのほかの修飾には、2'-メトキシ(2'-O-CH3)、2'-メトキシエチル(2'-O-CH2-CH3)、2'-アミノプロポキシ(2'-O-CH2CH2CH2NH2)、2'-アリル(2'-CH2-CH=CH2)、2'-O-アリル(2'-O-CH=CH2)及び2'フルオロ(2'-F) が挙げられる。2'修飾は、アラビノ位（上）であっても、リボ（下）位であってもよい。類似の修飾をオリゴヌクレオチドの他の位置で行ってもよく、特に3'末端ヌクレオチド上の糖の3'位又は2'-5'結合オリゴヌクレオチドで、及び5'末端ヌクレオチドの5'位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分として糖模倣体を有してもよい。そのような修飾された糖構造の調製を記載する典型的な米国特許には、たとえば、
Figure 0005514179
が挙げられる。
さらにそのほかの修飾には、リンカーで連結された複数のオリゴヌクレオチドから成るONコンカテマーが挙げられる。リンカーはたとえば、修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチド単位から成ってもよい。場合によっては、リンカーはONコンカテマーに自由度を提供する。そのようなONコンカテマーの使用は、さらに小さなオリゴヌクレオチド基礎単位を連結して所望の長さを得ることにより最終分子を合成する容易な方法を提供することができる。たとえば12個の炭素のリンカー（C12ホスホロアミダイト）を用いて2以上のONコンカテマーを連結し、長さ、安定性及び自由度を提供する。
本明細書で使用されるとき、「未修飾の」又は「天然の」塩基（ヌクレオ塩基）には、プリン塩基のアデニン（A）及びグアニン（G）並びにピリミジン塩基のチミン（T）、シトシン（C）及びウラシル（U）が包含される。オリゴヌクレオチドは、塩基修飾又は塩基置換も包含してもよい。修飾された塩基は、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及びそのほかのアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及びそのほかのアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニル（-C≡C-CH3）ウラシル及びシトシン及びピリミジン塩基のそのほかのアルキル誘導体、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル（偽ウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル及びそのほかの8-置換されたアデニン及びグアニン、5-ハロ、特に、5-ブロモ、5-トリフルオロメチル及びそのほかの5-置換されたウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン及び7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン及び3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンのような合成塩基及び天然塩基を包含してもよい。追加の修飾された塩基には、フェノキサジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(1H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)、置換されたフェノキサジンシチジン（たとえば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4-b][1,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド[3',2'：4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)のようなG-クランプのような三環式ピリミジン類が挙げられる。修飾された塩基にはプリン又はピリミジンが、たとえば、7-デアザアデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジン及び2-ピリドンのようなそのほかの複素環で置き換えたものを挙げてもよい。さらなるヌクレオチドには、米国特許第3,687,808号に記載されたもの、ポリマー科学および技術のコンサイス百科事典（The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering） p858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990 に記載されているもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition,30:613, 1991 に記載されるもの、及びアンチセンス研究と応用（Antisense Research and Applications）15章 Sanghvi Y.S., p289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993 に記載されているものが挙げられる。
もう1つの修飾には、ホスホロジチオエート結合が挙げられる。ホスホロジチオエートODN（PS2-ODN）及びPS-ODNがタンパク質に対して類似の結合親和性を有すること（Tonkinson et al., Antisense Res. Dev., 4:269-278, 1994）（Cheng et al., J. Mol. Recogn., 10:101-107, 1997）は知っているが、及びODNの作用の可能性のあるメカニズムがウイルスタンパク質に結合することであるのは知っているが、本発明で記載される抗ウイルス性ODNにホスホロジチオエートを包含することが望ましい。
ODNを修飾するもう1つのアプローチは、Yu et al., Bioorg. Med. Chem., 8:275-284, 2000及びInagawa et al., FEBS Lett., 25:48-52, 2002に記載されているような立体定義された又は立体濃縮されたODNを製造することである。従来の方法で調製されたODNは、ヌクレオチド間結合に関与するリン原子のまわりの不斉性によるジアステレオマーの混合物から成る。これは、ODNとウイルスタンパク質のようなウイルス構成成分との間の結合の安定性に影響を及ぼす可能性がある。以前のデータは、タンパク質の結合が有意に立体依存性であることを示していた（Yu et al.）。従って、立体定義された又は立体濃縮されたODNを使用することによって、タンパク質の結合特性を改善し、抗ウイルス有効性を改善することができた。
上述のような修飾の組込みを多数の様々な組込みパターン及びレベルで利用することができる。すなわち、オリゴヌクレオチドでの各ヌクレオチド又は結合で特定の修飾が包含される必要はなく、単一のオリゴヌクレオチド又は単一のヌクレオチドにおいてさえ、様々な修飾を組み合わせて利用することができる。
オリゴヌクレオチドの合成
当該技術で既知の方法を用いて、本オリゴヌクレオチドを合成することができる。たとえば、標準のホスホロアミダイト試薬をヨウ素による酸化と共に用いて、自動DNAシンセサイザー（たとえば、Applied Biosystems モデル380B）にて、非置換又は置換のホスホジエステル(P=O)オリゴヌクレオチドを合成することができる。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドについて、ホスフィト結合の段階的チオエート化のために0.2Mの311-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシドのアセトニトリル溶液により標準的な酸化瓶を置き換えることを除いて、ホスホロチオエート(P=S)を合成することができる。チオエート化待機工程を68秒に増やすことができ、その後、キャッピング工程が続く。CPGカラムからの切断及び55℃（18時間）における濃縮水酸化アンモニウム中での脱ブロックの後、2.5容積のエタノールにより、0.5MのNaCl溶液から2回沈殿させることによりオリゴヌクレオチドを精製することができる。
米国特許第5,508,270号に記載されるように、ホスフィネートオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第4,469,863号に記載されるように、アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,610,289号及び同第5,625,050号に記載されるように、3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,256,775号及び同第5,366,878号に記載されるように、ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドを調製することができ；公表されたPCT出願、PCT/US94/00902号及び同PCT/US93/06976（それぞれ国際公開公報第94/17093号及び同第94/02499号として公表）に記載されるように、アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,476,925号に記載されるように、3'-デオキシ-3'-アミノホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,023,243号に記載されるように、ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,130,302号及び同第5,177,198号に記載されるように、ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドを調製することができ；米国特許第5,378,825号、同第5,386,023号、同第5,489,677号、同第5,602,240号及び同第5,610,289号に記載されるように、MMI結合オリゴヌクレオチドとしても同定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオチド、MDII結合オリゴヌクレオチドとしても同定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオチド、及びアミド-3結合オリゴヌクレオチドとしても同定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオチド、及びアミド-４結合オリゴヌクレオ-シドとしても同定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオチド、並びにたとえば別のMMI及びP=O又はP=Sの結合を有する混合主鎖化合物を調製することができ；米国特許第5,264,562号及び同第5,264,564号に記載されるように、ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオチドを調製することができ；並びに米国特許第5,223,618号に記載されるように、エチレンオキシド結合オリゴヌクレオチドを調製することができる。引用した特許及び特許出願はそれぞれ、その全体を参考として本明細書に組み入れられる。
オリゴヌクレオチド製剤及び薬学的組成物
本オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチド製剤又は薬学的組成物に調製することができる。従って、本オリゴヌクレオチドは、そのほかの分子、分子構造又は、たとえば、リポソーム、受容体標的分子、取り込み、分布及び／又は吸収を助けるための経口、経腸、局所又はそのほかの製剤のような化合物の混合物と混合されてもよく、内包されてもよく、共役されてもよく、さもなければ会合されてもよい。そのような取り込み、分布及び／又は吸収を助ける製剤の調製を記載する典型的な米国特許には、たとえば、
Figure 0005514179
が挙げられ、それぞれその全体を参考として本明細書に組み入れられる。
本発明のオリゴヌクレオチド、製剤及び組成物は、ヒトを含む動物に投与する際、生物学的に活性のある代謝産物又はその残余を提供する（直接的に又は間接的に）することが可能である、薬学的に許容される塩、エステル又はそのようなエステルの塩を包含する。従って、たとえば、開示もまた、本発明の化合物のプロドラッグ及び薬学的に許容される塩、そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、及びそのほかの生物等価物に引き付けられる。
用語「プロドラッグ」は、内因性の酵素の作用又はそのほかの化学物質及び／又は条件によって体内又は細胞内で活性形態（すなわち、薬剤）に変換される不活性形態で調製される治療剤を指す。特定の態様では、本オリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、その全体を参考として本明細書に組み入れられる、Gosselinらの国際公開公報第93/24510号及びImbachらの国際公開公報第94/26764号及び米国特許第5,770,713号に開示されている方法に従って、SATE[(S-アセチル-2-チオエチル)ホスフェート]誘導体として調製される。
用語「薬学的に許容される塩」は、本化合物の生理学的に、且つ薬学的に許容される塩、すなわち、母型化合物の所望の生物活性を保持し、且つ、望ましくない毒性効果をそれに付与しない塩を言う。そのような薬学的に許容される塩の多数は既知であり、本発明で使用することができる。
オリゴヌクレオチドについて、薬学的に許容される塩の有用な例には、たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムのような陽イオンと共に形成される塩、スペルミン及びスペルミジンなどのようなポリアミン類；たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などのような無機酸と共に形成される酸付加塩；たとえば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギニン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような有機酸と共に形成される塩；並びに塩素、臭素及びヨウ素のような元素陰イオンから形成される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明はまた、本発明の抗ウイルス性オリゴヌクレオチドを含有する薬学的に許容される組成物及び製剤を包含する。局所治療又は全身性の治療が所望なのかどうか、及び治療すべき場所によって、多数の方法でそのような薬学的に許容される組成物を投与してもよい。たとえば、投与は、局所（眼並びに膣及び直腸への送達を含む粘膜）であってもよく；噴霧器による粉末又はエアゾールの吸入又は吸い込みによる肺へのものであってもよく；気管支内；鼻内；上皮及び経皮；経口；又は非経口であってもよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内の注射又は点滴；あるいはたとえば、くも膜下又は脳室内のような頭蓋内投与が挙げられる。
局所投与用の薬学的に許容される組成物及び製剤には、経皮貼付剤、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、座薬、スプレー、液体及び粉末が挙げられる。従来の薬学的キャリア、水溶液、粉末又は油性の基剤、濃厚剤などが必要であってもよいし、望ましくてもよい。被覆したコンドーム、手袋なども有用である。好ましい局所用製剤には、本発明のオリゴヌクレオチドが、たとえば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、及び界面活性剤のような局所送達剤との混合剤であるようなものが挙げられる。好ましい脂質及びリポソームには、中性の（たとえば、ジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性の（たとえば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG）及び陽イオンの（たとえば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAP及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA）が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、リポソーム内に内包されてもよいし、それとの、特に陽イオンのリポソームとの複合体を形成してもよい。又は、オリゴヌクレオチドは、脂質、特に陽イオン脂質と複合体を形成してもよい。好ましい脂肪酸及びエステル類には、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル 1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、若しくはC1〜10のアルキルエステル（たとえば、イソプロピルミリステ-トIPM）、モノグリセリド、ジグリセリド又はこれらの薬学的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
経口投与用の組成物及び製剤には、粉末又は顆粒、微粒子、ナノ粒子、水若しくは非水性媒体における懸濁液若しくは溶液、カプセル、ジェルカプセル、サック、錠剤又は微小錠剤が挙げられる。濃厚剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましくてもよい。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが1以上の浸透増強剤界面活性剤及びキレート剤と合わせて混合されるものである。典型的な界面活性剤には、脂肪酸及び／又はそのエステル類又は塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。典型的な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（CDCA）、及びウルソデオキシケネデオキシコール酸（UDCA）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。典型的な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリル酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アクリルカルニチン、アクリルコリン、モノグリセリド、ジグリセリド又はこれらの薬学的に許容される塩（たとえば、ナトリウム）が挙げられる。また、好ましいのは、浸透増強剤の併用、たとえば、胆汁酸／塩と併用する脂肪酸／塩である。特に好ましい併用は、ラウリル酸、カプリン酸及びUDCAのナトリウム塩である。さらに典型的な浸透増強剤には、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、スプレー乾燥した粒子を含む顆粒形態で経口的に送達してもよいし、又は複合化して微粒子又はナノ粒子を形成してもよい。オリゴヌクレオチド錯化剤には、ポリアミノ酸；ポリイミン類；ポリアクリレート類；ポリアルキルアクリレート類、ポリオキシエタン類、ポリアルキルシアノアクリレート類；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート類、ポリエチレングリコール（PEG）及びデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート類；DEAE-誘導体化ポリイミン類、ポルラン類、セルロース及びデンプンが挙げられる。特に有利な錯化剤には、キトサン、N-トリメチルキトサン、ポリ-Ｌ-リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（TDAE）、ポリアミノスチレン（たとえば、p-アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、DEAE-メタクリレート、DEAE-ヘキシルアクリレート、DEAE-アクリルアミド、DEAE-アルブミン及びDEAE-デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ(D,L-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸-コ-グリコール酸（PLGA）、アルギネート並びにポリエチレングリコール（PEG）が挙げられる。
非経口、くも膜下又は脳室内の投与のための組成物及び製剤は、緩衝液、希釈液及び、たとえば、浸透増強剤、キャリア化合物及びそのほかの薬学的に許容されるキャリア又は賦形剤に限定されない添加物も含有してもよい、無菌の水溶液を包含してもよい。
本発明の薬学的組成物は、溶液、エマルション、及びリポソーム含有製剤を包含してもよいが、これらに限定されない。これらの組成物は、予備形成された液体、自己乳化する固体及び自己乳化する半固体を含むが、これらに限定されない種々の成分から生成してもよい。
都合良く、単位投与形態で提示してもよい本発明の薬学的製剤は、製薬業界で周知の従来技術に従って調製してもよい。そのような技術は、薬学的キャリア又は賦形剤と共に有効成分を会合させる工程を包含する。一般に、製剤は、有効成分を液体キャリア又は微細に分割した固体キャリア又はその双方と均一且つ密接に会合させ、必要に応じて生成物を振盪することによって調製される。
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ジェルカプセル、液体シロップ、軟ジェル、座薬及び浣腸を含むが、これらに限定されない多数の可能な投与形態に製剤化してもよい。本発明の組成物はまた、水性、非水性又はその混合の媒体中での懸濁液として製剤化されてもよい。水性懸濁液はさらに、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、懸濁液の粘度を高める物質を含有してもよい。懸濁液はまた安定剤も含有してもよい。
本発明の態様の1つでは、薬学的組成物は発泡体として製剤化し、使用する。薬学的発泡体には、エマルション、微細エマルション、クリーム、ゼリー及びリポソームのような剤形が挙げられるが、これらに限定されない。性質では基本的に類似しているものの、これらの剤形は、最終産物の成分及び濃度において異なる。そのような組成物及び製剤の調製は一般に、製薬及び製剤技術の当業者に知られており、本発明の組成物の製剤に適用してもよい。
エマルション
本発明の製剤及び組成物は、エマルションとして調製し、製剤化してもよい。エマルションは、普通、直径0.1μmを超える液滴の形態で、一方の液体が他方に分散された通常、不均質システムである。
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エマルションは、互いに密接に混合され分散された非混和性の液相を含む二相性システムであることが多い。一般に、エマルションは、油中水型（w/o）又は水中油型（o/w）型のいずれかであってもよい。水性相が微細な液滴として大量の油相に細かく分割され、分散されている場合、得られる組成物は油中水（w/o）エマルションと呼ばれる。又は、油相が微細な液滴として大量の水性相に細かく分割され、分散されている場合、得られる組成物は水中油（o/w）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び、水性相、油相に液体として存在する有効薬剤又は分離相としてのそれ自体に加えて、追加の成分を含有してもよい。乳化剤、安定剤、染料及び抗酸化剤のような薬学的な賦形剤も、必要に応じてエマルションに存在してもよい。薬学的エマルションは、たとえば、油中水中油（o/w/o）及び水中油中水（w/o/w）のような二相より多くから構成される複数のエマルションであってもよい。そのような複雑な製剤は、単純な二相性エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。o/wエマルションの個々の油性液滴が小さな水性液滴を内包する複数のエマルションがw/o/wエマルションを構成する。同様に、油性連続相で安定化された水の小球に内包された油性液滴のシステムがo/w/oエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がほとんどないか、全くないことを特徴とする。エマルションの分散された又は不連続の相が、製剤の乳化剤又は粘度の手段を介して、外部の又は連続した相に上手く分散され、この形態で維持されることが多い。エマルション型の軟膏基剤やクリ-ムの場合のように、エマルションのいずれかの相が半固体又は固体であってもよい。エマルションを安定化するそのほかの手段は、エマルションのいずれかの相に組み入れられてもよい乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、おおまかに4つのカテゴリー：合成の界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤及び微細に分散された固体に分類してもよい（Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., Vol.1 p.199, 1988）。
表面活性化剤としても知られる合成界面活性剤は、エマルションの配合において広い適用性が見い出されており、文献で概説されている。
Figure 0005514179
界面活性剤は、通常、両親媒性であり、親水性部分及び疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性の性質と疎水性の性質の比は、親水性／親油性バランス（HLB）と呼ばれ、製剤の調製で界面活性剤を分類し、選択する有益なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質：非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両性イオン性に基づいて異なる部類に分類してもよい（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., Vol.1 p.285, 1988）。
エマルション配合で使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、ハチミツ、ホスファチド、レシチン及びアカシアが挙げられる。吸収基剤は、無水ラノリンや親水性ワセリンのような半固体の一貫性を保持するけれども、水を吸収してw/oエマルションを形成するように親水性特性を持つ。微細に分割された固体も特に、界面活性剤との併用で、及び種々の調製物中で良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物のような極性無機固体、ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モントモリロナイトのような非膨張粘土、コロイド状珪酸アルミニウム及びコロイド状珪酸マグネシウムアルミニウム、色素、及び炭素又はトリステアリン酸グリセリルのような非極性固体が挙げられる。
多種多様な非乳化材料がエマルション製剤に包含され、エマルションの特性に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール類、脂肪エステル類、湿潤剤、親水性コロイド類、防腐剤及び抗酸化剤が挙げられる。
Figure 0005514179
親水性コロイド類又は親水コロイド類には、天然に存在するゴム及び、多糖類のような合成ポリマー類（たとえば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアーゴム、カラヤゴム及びトラガカント）、セルロース誘導体（たとえば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー類（たとえば、カルボマー類、セルロースエーテル類及びカルボキシビニルポリマー類）が挙げられる。これらは水に分散し、又は水中で膨潤し、分散相液滴の回りに強力な表面間の被膜を形成し、内部相の粘度を高めることによってエマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、微生物の増殖を容易に支える炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドのような多数の成分を含有することが多いので、これらエマルションには防腐剤を組み入れることが多い。エマルション製剤に包含され一般に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p-ヒドロキシ安息香酸のエステル類、及びホウ酸が挙げられる。抗酸化剤も一般にエマルション製剤に添加され、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール類、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンのような遊離のラジカルスカベンジャー、又はアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムのような還元剤、並びにクエン酸、酒石酸及びレシチンのような抗酸化共力剤であってもよい。
皮膚、経口及び非経口の経路を介したエマルション製剤の適用並びにその製造方法は、文献に概説されている（Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., Vol.1 p.199, 1988）。容易な製剤化、吸収及び生物利用性の観点からの有効性のために経口送達のためのエマルション製剤は非常に広く使用されている。
Figure 0005514179
鉱物油系の下剤、油溶性ビタミン及び高脂肪栄養剤は、o/wエマルションとして一般に経口で投与される物質のうちである。
本発明の態様の1つでは、オリゴヌクレオチドの組成物がマイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、光学的に単一の等方性で、熱力学的に安定な溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義されてもよい（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., Vol.1 p245, 1988）。通常、先ず、水性の界面活性剤溶液に油を分散し、次いで、十分量の第4の成分、一般的には中間鎖長のアルコールを加えて透明な系を形成することによりマイクロエマルションを調製する。従って、マイクロエマルションは、表面活性化分子の表面間被膜により安定化される2つの非混和性の液の熱力学的に安定な、等方的に透明な分散液としても記載されている（Leung and Shah, in Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., VCH Publishers, New York, p.185-215, 1989）。一般に、油、水、界面活性剤、界面活性剤共力剤及び電解質を含む3〜5つの成分の組み合わせによってマイクロエマルションを調製する。マイクロエマルションが油中水(w/o)型であるか、水中油(o/w)型であるのかは、使用する油及び界面活性剤の特性、及び界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素の尾部の構造及び幾何的詰め込みに依存する（Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., p.271, 1985）。
位相図を利用した現象論的アプローチが鋭意検討され、マイクロエマルションの製剤化方法の包括的な知識が当業者に与えられてきた。
Figure 0005514179
従来のエマルションに比べて、マイクロエマルションは、自然に形成される熱力学的に安定な液滴形成物における水不溶性薬剤の可溶化という利点を提供する。
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤には、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類、ポリグリセロール脂肪酸エステル類、単独又は界面活性剤共力剤との組み合わせで、テトラグリセロールモノラウレート（ML310）、テトラグリセロールモノオレート（MO310）、ヘキサグリセロールモノオレート（PO310）、ヘキサグリセロールペンタオレート（PO500）、デカグリセロールモノカプレート（MCA750）、デカグリセロールモノオレート（MO750）、デカグリセロールセスキオレート（SO750）デカグリセロールデカオレート（DA0750）が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤共力剤は、通常、エタノール、1-プロパノール及び1-ブタノールのような短鎖アルコールであり、界面活性剤分子の間で生じる空隙のために、界面活性剤被膜に浸透し、その結果、無秩序の被膜を創製することによって表面間の流動性を高めるように作用する。しかしながら、マイクロエマルションは、界面活性剤共力剤を使用せずに調製されてもよく、アルコールを含まない自己乳化エマルションの系は当該技術で既知である。水性相は、通常、水、薬剤の水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール類、プロピレングリコール、及びエチレングリコール誘導体であってもよい。油相は、カプテックス300、カプテックス355、カプムールMCM、脂肪酸エステル、中鎖（C8〜C12）モノ、ジ、及びトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化C8〜C10のグリセリド、植物油及びシリコーン油を挙げてもよいが、これらに限定されない。
マイクロエマルションは、薬剤の可溶化及び薬剤の吸収の向上の観点から特に興味深い。脂質系マイクロエマルション（o/w及びw/oの双方）は、ペプチドを含む薬剤の経口の生物利用性を高めることが提案されている（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 11:1385-1390, 1994; Ritschet, Met/i. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 13:205, 1993）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化の改善、酵素的加水分解からの薬剤の保護、膜の流動性及び透過性における界面活性剤が誘発する変化による薬剤吸収の向上の可能性、容易な調製、固形投与形態での容易な経口投与、臨床的効能の改善及び毒性の低下という利点を提供する（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 11:1385, 1994; Ho et al., J. Pharm. Set., 85:138-143, 1996）。その成分を常温で一緒にするとマイクロエマルションが自然に形成してもよいことが多い。熱不安定性の薬剤、ペプチド又はオリゴヌクレオチドを配合する際、これは特に有利であってもよい。マイクロエマルションは、化粧品への適用及び薬学的な適用の双方において有効成分の経皮送達にも有効である。本発明のマイクロエマルション組成物及び製剤は、消化管、膣、口腔及び投与のそのほかの場所におけるオリゴヌクレオチド及び核酸の局所の細胞取り込みを改善すると共に、消化管からのオリゴヌクレオチド及び核酸の全身性の吸収を促進することが期待される。
本発明のマイクロエマルションはまた、製剤の特性を改善し、本発明のオリゴヌクレオチド及び核酸の吸収を高めるソルビタンモノステアレート（グリル3）、ラブラソール、及び浸透増強剤のような追加成分及び添加剤を含有してもよい。本発明の浸透増強剤は、５つの大まかなカテゴリー、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤及び非界面活性剤の1つに属するとして分類することができる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, p. 92, 1991）。
リポソーム
薬剤の製剤化に検討され、使用されているマイクロエマルションに加えて、整理された界面活性剤の構造体が多数ある。これらには、単層、ミセル、二重層及び小胞が挙げられる。小胞は、薬剤送達の作用の特異性及び延長した持続時間を提供する。従って、本明細書で使用されるとき、用語「リポソーム」は、球状の二重層に配置された両親媒性脂質から構成される小胞を言い、すなわち、リポソームは、親油性物質から形成される膜及び水性の内部を有する単層状体又は複層状体である。水性部分は通常、送達されるべき組成物を含有する。無傷の哺乳類の皮膚を横切るために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下、それぞれ直径50nm未満の一連の微細孔を通過するべきである。従って、極めて変形しやすい、且つ、そのような微細孔を通過できるリポソームを使用することが望ましい。リポソームの追加の因子には、脂質表面の変化及びリポソームの水性容積が挙げられる。
リポソームのさらなる利点には、天然のリン脂質から得られるリポソームは生体適合性であり、生分解性であること；リポソームは広範囲の水溶性及び脂溶性の薬剤を組み入れることができること；リポソームはその内部区画にて内包された薬剤を代謝及び分解から保護できること（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., Vol.1 p245, 1988）が挙げられる。
局所投与については、リポソームはそのほかの製剤に対して幾つかの利点を提示するという証拠がある。そのような利点には、投与された薬剤の高い全身性の吸収に関連する副作用を減らすこと、所望の標的にて投与された薬剤の蓄積を増やすこと、皮膚に対して親水性及び疎水性の両方であることが挙げられる。鎮痛剤、抗体、ホルモン及び高分子量のDNAを含む化合物が皮膚に投与され、一般に上部上皮が標的とされる。
リポソームは2つに大別される。陽イオンリポソームは、正に荷電したリポソームであり、負に荷電したDNAと相互作用して安定な複合体を形成する。正に荷電したDNA／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソームに内部移行する。エンドソーム内の酸性pHのために、リポソームは破裂し、細胞の細胞質にその内容物を放出する（Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:980-985, 1987）。
pH感受性又は負に荷電したリポソームは、DNAとの複合体よりもDNAを捕捉する。DNA及び脂質は似たように荷電しているので、複合体形成ではなく相反が生じる。従って、DNAは、これらリポソームの水性内部に捕捉される。pH感受性のリポソームは、たとえば、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養における細胞の単層に送達するのに使用されている（Zhou et al., Journal of Controlled Release, 19:269-274, 1992）。
リポソーム組成物の主要な種類の1つに天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が挙げられる。中性のリポソーム組成物は、たとえば、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）から形成することができる。陰イオンリポソーム組成物は一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、陰イオン膜融合性のリポソームはジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）から主として形成される。もう1つの種類のリポソームは、たとえば、大豆PC及び卵PCのようなホスファチジルコリン（PC）から形成される。もう1つの種類は、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールから形成される。
幾つかの研究によってリポソーム薬剤製剤の皮膚への局所送達が評価されている。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用により、皮膚のヘルペスによる傷を軽減したが、他の手段を介した送達（たとえば、溶液として、又はエマルションとして）は効果がなかった（Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 2:405-410, 1992）。追加の研究により、水性系を用いたインターフェロンの投与に対する、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性を調べ、リポソーム製剤は水性投与より優れていると結論付けた（du Plessis et al., Antiviral Research, 18:259-265, 1992）。
非イオン性のリポソーム系も調べられ、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系で、皮膚への薬剤送達における利便性が確定している。ノバソン（商標）I（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル）及びノバソーム（商標）II（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を用いて、マウスの皮膚の真皮にシクロスポリンAを送達した。結果は、そのような非イオン性リポソーム系が皮膚の異なる層へのシクロスポリンAの沈着を促進する上で有効であることを示した（Hu et al., S.T.P. Pharma Sci., 4:6, 466, 1994）。
リポソームはまた、「立体的に安定化された」リポソームを包含し、その用語は、本明細書で使用されるとき、1以上の特殊化された脂質を含むリポソームを言い、特殊化された脂質はリポソームに組み入れられると、そのような特殊化された脂質を欠くリポソームに比べて循環寿命が長くなる。立体的に安定化されたリポソームの例は、小胞形成する脂質部分の一部がモノシアロガングリオシドGM1のような糖脂質を1以上包含するもの、又はポリエチレングリコール（PEG）部分のような親水性ポリマーの1以上で誘導体化されるものである。特定の理論に束縛されないで、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はPEGで誘導体化された脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについては、これら立体的に安定化されたリポソームの循環寿命の延長は、網内系（RES）の細胞への取り込みの低下によると考えられている（Allen et al., FEBS Lett., 223:42, 1987; Wu et al., Cancer Research 53:3765, 1993）。
1以上の糖脂質を含む種々のリポソームは、Papahadjopoulos et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 507:64, 1987（モノシアロガングリオシドGM1、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトール）；Gabizon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:6949, 1988; Allen et al., 米国特許第4,837,028号及び国際出願公報、国際公開公報第88/04924号（スフィンゴミエリン及びガングリオシドGM1又は硫酸ガラクトセレブロシドエステル）；Webb et al., 米国特許第5,543,152号（スフィンゴミエリン）；Lim et al., 国際公開公報第97/13499号（1,2-sn-ジミリストイルホスファチジルコリン）に報告されている。
1以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含むリポソーム、及び調製方法は、たとえば、Sunamoto et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 53, 2778, 1980（非イオン性界面活性剤、PEG部分を含む2C1215G）；Illum et al., FEBS Lett., 167:79, 1984（ポリマーグリコールによるポリスチレン粒子の親水性被覆）；Sears, 米国特許第4,426,330号及び同第4,534,899号（ポリアルキレングリコール（たとえば、PEG）のカルボキシル基の結合により修飾された合成リン脂質）；Klibanov et al., FEBS Lett., 268, 235, 1990（PEG又はPEGステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（PE）；Blume et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1029:91, 1990（PEGで誘導体化されたリン脂質、たとえば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE）とPEGとの組み合わせから形成されるDSPE-PEG）；Fisher, 欧州特許第EP0445131B1号及び国際公開公報第90/04384号（リポソームの外側表面で共有結合したPEG部分）；Woodle et al., 米国特許第5,013,556号及び同第5,356,633号、及びMartin et al., 米国特許第5,213,804号及び欧州特許第EP0496813B1（1〜20モルパーセントのPEGで誘導体化したPEを含有するリポソーム組成物）；Martin et al., 国際公開公報第91/05545号及び米国特許第5,225,212号及びZalipsky et al., 国際公開公報第94/20073号（多数のそのほかの脂質-ポリマー抱合体を含有するリポソーム）；Choi et al., 国際公開公報第96/10391号（PEGで修飾したセラミド脂質を含むリポソーム）；Miyazaki et al., 米国特許第5,540,935号及びTagawa et al., 米国特許第5,556,948号（その表面で機能部分によりさらに誘導体化することができるPEGを含有するリポソーム）に記載されている。
核酸を含むリポソームは、たとえば、Thierry et al., 国際公開公報第96/40062（高分子量の核酸をリポソームに内包する方法）；Tagawa et al., 米国特許第5,264,221号（タンパク質に結合した、RNAを含有するリポソーム）；Rahman et al., 米国特許第5,665,710号（オリゴデオキシヌクレオチドをリポソームに内包する方法）；Love et al., 国際公開公報第97/04787号（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソーム）に記載されている。
もう1つの種類のリポソームである、トランスファーソームは極めて変形しやすい脂質の凝集体であり、薬剤送達ビヒクルに魅力的である（Cevc et al., Biochim. Biophys. Acta, 1368(2):201-15, 1998）。トランスファーソームは、液滴よりも小さい孔を介して浸透することができる極めて変形しやすい脂質液滴として記載されてもよい。トランスファーソームはそれが使用される環境に適用可能であり、たとえば、それらは、形状適用可能であり、自己修復性であり、分断することなく標的に到達し、自己負荷することが多い。トランスファーソームは、たとえば、標準のリポソーム組成物に表面端活性化剤、通常、界面活性剤を添加することにより作製することができる。
界面活性剤
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソームのような製剤で広く使用されている。天然の及び合成の多数の異なる種類の界面活性剤を分類し、ランク付けする最も共通した方法は、親水性／親油性比（HLB）の使用による。親水性基（「頭部」としても知られる）の性質は、製剤で使用される様々な界面活性剤を分類する最も有用な手段を提供する（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker Inc,, New York, N.Y., p.285, 1988）。
界面活性剤の分子がイオン化されていなければ、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は薬学的製品及び化粧品で広く使用されており、広い範囲のpHにわたって使用でき、典型的なHLB値は、構造によって2〜約18である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシル化エステルのような非イオン性エステル；並びに脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールのような非イオン性アルカノールアミドが挙げられ、エトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこの部類に包含される。ポリオキシエチレン界面活性剤は非イオン性界面活性剤の部類で最もよく使用されるものである。
水に溶解するか、又は分散したとき負の電荷を持つ界面活性剤分子は陰イオン性に分類される。陰イオン性界面活性剤には、石鹸のようなカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルサルフェート及びエトキシル化アルキルサルフェートのような硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートのようなスルホネート、アシルイソチオネート、アシルラウレート及びスルホスクシネート及びホスフェートが挙げられる。アルキルサルフェート及び石鹸が、最もよく使用される陰イオン性界面活性剤である。
水に溶解するか、又は分散したとき正の電荷を持つ界面活性剤分子は陽イオン性に分類される。陽イオン性界面活性剤には、四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが挙げられ、四級アンモニウム塩が最も頻繁に使用される。
正の電荷又は負の電荷のいずれかを持つことができる界面活性剤分子は両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N-アルキルベタイン及びホスファチドが挙げられる。
薬剤製品、製剤及びエマルションにおける界面活性剤の使用は、Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y., p.285, 1988に概説されている。
浸透増強剤
幾つかの態様では、組成物中で又は組成物と共に浸透増強剤を用いて核酸、特にオリゴヌクレオチドの動物皮膚への送達を高める。ほとんどの薬剤はイオン化された形態及び非イオン化の形態の双方で溶液中に存在する。しかしながら、普通、脂溶性又は親油性の薬剤だけが細胞膜を容易に横切る。横切るべき膜が浸透増強剤で処理されていれば、非親油性薬剤であっても細胞膜を横切ることができることが発見されている。非親油性の薬剤が細胞膜を横切るのを助けるのに加えて、浸透増強剤は、親油性薬剤の透過性も高める。
浸透増強剤は、5つの大まかなカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤及び非キレート性非界面活性剤の1つに属するとして分類される（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, p.92, 1991）。これらの部類の浸透増強剤のそれぞれを以下で詳細に説明する。
界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（又は「表面活性化剤」）は、水性溶液に溶解すると溶液の表面張力又は水性溶液と別の液体との界面張力を低下させ、その結果、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収が高められる化学構成要素である。これら浸透増強剤には、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン-20-セチルエーテル（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, p.92, 1991）；並びにFC-43のようなパーフルオロ化合物エマルション（Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 40:252, 1988）が挙げられ、それぞれその全体を参考として本明細書に組み入れる。
脂肪酸：浸透増強剤として作用する種々の脂肪酸及びその誘導体には、たとえば、オレイン酸、ラウリル酸、カプリン酸（n-デカン酸）、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（1-モノオレオイル-rac-グリセロール）、ジラウリン、カープリル酸、アラキドン酸、グリセロール1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのC1〜10アルキルエステル（たとえば、メチル、イソプロピル及びt-ブチル）並びにそれらのモノ-及びジグリセリド（すなわち、オレート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレートなど）が挙げられ、
Figure 0005514179
それぞれその全体を参考として本明細書に組み入れる。
胆汁塩：胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が挙げられる（Brunton, Chapter 38, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therpeutics, 9Th Ed., Hardman et al., Ed., McGraw-Hill, New York, p.934-935, 1996）。種々の天然の胆汁塩及びその合成誘導体が浸透増強剤として作用する。従って、用語、「胆汁塩」は、胆汁の天然に存在するいかなる成分及びそのいかなる合成誘導体も包含する。本発明の胆汁塩には、たとえば、コール酸（又は薬学的に許容されるそのナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、ジヒドロコール酸（ジヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（UDCA）、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム（STDHF）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル（POE）が挙げられる。
Figure 0005514179
キレート剤：本背景では、キレート剤は、それと錯体を形成することにより溶液から金属イオンを除き、その結果粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収が高められる化合物とみなすことができる。本発明での浸透増強剤としてのその使用に関して、性状分析されたDNAヌクレアーゼのほとんどが触媒について二価の金属イオンを必要とし、キレート剤により阻害されるので、キレート剤はDNA分解酵素阻害剤として作用するという追加的な利点を有する（Jarrett, J. Chromatogr., 618:315-339, 1993）。限定することなく、キレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、クエン酸、サリチレート（たとえば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレート及びホモバニレート）、コラーゲンの N-アシル誘導体、ベータジケトンのラウレス-9及びN-アミノアシル誘導体（エナミン）（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, p. 92, 1991; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 7:1-33, 1990; Buur et al., J. Control Rel., 14:43-51, 1990）が挙げられる。
非キレート剤非界面活性剤：本明細書で使用されるとき、非キレート剤非界面活性剤の浸透を増強する化合物は、有意なキレート剤活性及び界面活性剤活性を有さず、消化器系粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を高める化合物である（Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 7:1-33, 1990）。そのような浸透増強剤の例には、不飽和環状尿素1-アルキル及び1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, p. 92, 1991）並びにジクロフェナックナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンのような非ステロイド抗炎症剤（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 39:621-626, 1987）が挙げられる。
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを高める作用剤を本発明の薬学的組成物及びそのほかの組成物及び製剤に添加してもよい。たとえば、リポフェクチン（Junichi et al., 米国特許第5,705,188号）のような陽イオン性脂質、陽イオン性グリセロール誘導体、及びポリリジン（Lollo et al., PCT出願、国際公開公報第97/30731号）のようなポリ陽イオン分子は、オリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みを高めることも知られている。
エチレングリコール及びプロピレングリコールのようなグリコール類、2-ピロールのようなピロール類、アゾン類（azones）、並びにリモネン及びメントンのようなテルペン類を含むそのほかの作用剤を利用して投与された核酸の浸透を高めてもよい。
キャリア
本発明の特定の組成物はまた、製剤中にキャリア化合物を組み入れる。本明細書で使用されるとき、「キャリア化合物」又は「キャリア」は、核酸又はその類縁体を言い、それは不活性（すなわち、それ自体の生物活性を持たない）であるが、たとえば、生物学的に活性のある核酸を分解する又は循環からのその除去を促進することによって生物活性を有する核酸の生物利用性を低下させる生体内の過程によって核酸として認識される。核酸とキャリア化合物の同時投与は、後者の物質が過剰であることが多いが、肝臓、腎臓、又は循環外のそのほかの貯蔵場所で回収される核酸の量の実質的低下を招く。たとえば、肝臓組織におけるホスホロチオエートの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸又は4-アセトアミド-4'イソチオシアノ-スチルベン-2,2-ジスルホン酸と共に同時投与された場合、低下させることができ（Miyao et al., Antisense Res. Dev., 5:115-121, 1995; Takakura et al., Antisense & Nucl Acid Drug Dev., 6:177-183, 1996）、それぞれその全体を参考として本明細書に組み入れる。
賦形剤
キャリア化合物とは対照的に、「薬学的キャリア」又は「賦形剤」は1以上の核酸を動物に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤又はそのほかの任意の薬学的に不活性のビヒクルであり、通常、液体又は固体である。薬学的キャリアは、所定の薬学的組成物の核酸及びそのほかの成分と組み合わせた場合、意図する投与方式の観点から一般的に選択され所望の嵩、濃度等を提供する。典型的な薬学的キャリアには、結合剤（たとえば、予備ゲル化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（たとえば、ラクトース及びそのほかの糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化珪素、ステアリン酸、金属ステアレート、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（たとえば、デンプン、デンプングリコテートナトリウムなど）；並びに湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の組成物を製剤化するのに、核酸と有害に反応しない非経口投与に好適な薬学的に許容される有機又は無機の賦形剤も使用することができる。好適な、薬学的に許容されるキャリアには、水、塩溶液、アルコール類、ポリエチレングリコール類、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘度のあるパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
核酸の局所投与のための製剤には、無菌及び非無菌の水溶液、アルコールのような一般の溶媒中での非水性溶液、又は液体若しくは固体油の基剤における核酸の溶液が挙げられてもよい。溶液は、緩衝液、希釈液及びそのほかの好適な添加剤を含有してもよい。核酸と有害に反応しない非経口投与に好適な薬学的に許容される有機又は無機の賦形剤を使用することができる。
そのほかの薬学的組成物成分
本組成物は、薬学的組成物に従来見い出されるそのほかの成分を、技術で確立した用途レベルで追加的に含有してもよい。従って、たとえば、組成物は、たとえば、かゆみ止め剤、収斂剤、局所麻酔剤又は抗炎症剤のような追加的な、相溶性の、薬学的に活性のある物質を含有してもよく、又は、たとえば、染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、濃厚剤及び安定剤のような、本発明の組成物の種々の投与形態を物理的に製剤化するのに有用な追加の物質を含有してもよい。しかしながら、そのような物質は、添加した際、本発明の組成物の成分の生物活性に過度に干渉すべきではない。製剤を滅菌し、所望であれば、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、たとえば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、香味剤及び／又は芳香族物質などを混合する。
水性懸濁液は、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む懸濁液の粘度を高める物質、及び／又は安定剤を含有してもよい。
本発明の特定の態様は、（a）1以上の抗ウイルス性オリゴヌクレオチド及び（b）異なるメカニズムにより機能する1以上のそのほかの化学療法剤を含有する薬学的組成物を提供する。そのような化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォスファミド、イフォスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメタミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、窒素マスタード、メラファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコフォマイシン、4-ヒドロキシパーオキシシクロホスホロアミド、5-フルオロウラシル（5-FU）、5-フルオロデオキシウリジン（5-FUdR）、メソトレキセート（MTX）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（VP-16）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール（DES）が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、診断と治療のメルクマニュアル、第15版-1206〜1228ペ-ジ（1987年、Berkow et al., ed., Rahway, NJ）を参照のこと。本発明の化合物と共に使用する場合、個々に（たとえば、5-FUとオリゴヌクレオチド）、順に（たとえば、5-FUとオリゴヌクレオチドを一定期間、続いてMTXとオリゴヌクレオチド）又は1以上のそのような化学療法剤と組み合わせて（たとえば、5-FU、MTX及びオリゴヌクレオチド、又は5-FU、放射線療法及びオリゴヌクレオチド）そのような化学療法剤を使用すればよい。抗炎症薬には、非ステロイド性抗炎症薬及びコルチコステロイド類が挙げられるが、これらに限定されず、抗ウイルス剤には、リバビリン、シドフォビル、ビダラビン、アシクロビル及びガンシクロビルが挙げられるが、これらに限定されず、本発明の組成物で組み合わせてもよい。一般に、診断と治療のメルクマニュアル、第15版-2499〜2506ページ、及び46〜49ページ（1987年、Berkow et al., ed., Rahway, NJ）を参照のこと。そのほかの非オリゴヌクレオチドの化学療法剤も本発明の範囲内である2以上の化合物を一緒に又は順に用いてもよい。
実施例1．単純ヘルペスウイルス
単純ヘルペスウイルス（HSV）はヒト集団の有意な割合を冒す。ランダムODN又はODNランダマーはHSVのようなウイルスの感染性を阻害することが本発明で見い出された。VERO細胞（HSV-1（KOS株）及びHSV-2（MS2株）の感染に感受性）におけるHSVの細胞性複製アッセイを用いて、HSVの複製開始点に相補的な一本鎖PS-ODNがHSV-1及びHSV-2の複製を阻害した。驚くべきことに、ヒト（343ARS）及びプラスミド（pBR322／pUC）の開始点に相補的な対照のPS-ODNもウイルスの感染性を阻害した。ランダム配列のPS-ODN及びPS-ODNランダマーによる実験は、ODNのサイズの増加に伴ってウイルス感染の阻害が高まることを実証した。これらのデータは、ONは、ウイルス感染の治療的処置に有用な強力な抗ウイルス剤であることを示している。
本発明者らは、HHVのようなウイルスの広がりを阻止する可能性のあるメカニズムはそのDNAの複製を妨げることであると理論付けた。このことを念頭に置いて、HSV1及びHSV2の複製開始点に相補的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ODN）を感染細胞に導入した。これらのODNは、ウイルスの複製開始点にてDNAの三重体形成を生じ、必要なトランス作用因子の会合及びウイルスDNAの複製を阻止した。驚くべきことに、実験的パーラダイムにおいて、ウイルス感染を阻害するODNの能力はそのサイズ（長さ）が増加するにつれて高まることを示す結果が本明細書で提示される。
HSV-1の阻害
プラーク減少アッセイ（PRA）にてHSV-1を阻害するPS-ODNの能力を測定した。不死化したアフリカミドリザルの腎臓細胞（VERO）を10%のウシ胎児血清をプラスし、ゲンタマイシン、バンコマイシン及びアンフォテレシンBを補完したMEM（最低必須培地）中で、37℃、5% CO2にて培養した。4日間の増殖で集密な単層細胞が得られる密度にて細胞を12穴プレートに播いた。集密に達すると、培地を5%血清と上記の補完物だけを含有するものに代え、次いで、試験化合物の存在下、細胞を90分間、HSV-1（KOS株、総計およそ40〜60PFU）にさらした。ウイルスに暴露したのち、培地を、5%血清、1％ヒト免疫グロブリン、上記の補完物及び試験化合物を含有する新しい「重層する」培地に変更した。感染の3〜4日後、感染培養物のホルマリン固定及びクレシルバイオレット染色に続いて、プラークの計数を行った。
ONはすべて（別に言及したものは除いて）カルガリー大学、コアDNAサービスラボで合成した1又は15μMの合成スケ-ルでON（表1を参照のこと）を調製し、50cmのセファデックスG-25カラムで脱保護し、脱塩した。UVシャドウゲル電気泳動により得られたONを分析し、約95%の完全長、n-1及びn-2オリゴ並びに5%までの短いオリゴ種（これらはランダム欠失を有すると思われる）を含有することを確定した。ランダムなオリゴ合成については、アデニン、グアノシン、シトシン及びチミジンのアミダイトを等モル量にて一緒に混合し、合成の間、ODNの各位置での取り込みの無作為さをできるだけ大きくした。
PS-ODNがHSV-1を阻害できるかどうかを調べるために、HSV-1のPRAにてREP1001、2001及び3007を調べた。このPS-ODNがHSVの複製開始点に向けられているので（他の2つはヒト及びプラスミドの複製開始点に向けられている）のでREP2001だけが何らかの活性を示すと期待された。しかしながら、3つのPS-ODNはすべて抗HSV-1活性を示した（図1を参照のこと）。さらに、抗HSV-1効果の能力は、オリゴのサイズに依存していた（図2を参照のこと）。
抗HSV-1活性に対するPS-ODNのサイズ依存性及び配列非依存性を確認するために、我々は、サイズの異なる（REP2002、2003、2004、2005及び2006）PS-ODNを調べた。各PS-ODNが実際に同じサイズを持つ異なるランダム配列の集団を表すように各塩基を「揺らぎ」（N）として合成することにより配列特異的な効果に関してこれらのPS-ODNを不活性とし、「ランダマー」と称した。HSV-1 PRAにおいてこれらのオリゴを調べた際、我々は10塩基以下のオリゴは検出可能な抗HSV-1活性を有さないが、PS-ODNのサイズが10塩基を超えて増加するにつれて、能力が増加することを見い出した（IC50低下、図3及び4を参照のこと）。我々はまた20塩基を超えるPS-ODNが臨床的に認可されている抗HSV-1薬、アシクロビルより有意に低いIC50値を有することも見い出した（図4を参照のこと）。
PS-ODNの抗HSV-1活性についての有効サイズの範囲を定義するために、我々は10〜120塩基の広い範囲のサイズを網羅するPS-ODNランダマーを調べた（図5及び6を参照のこと）。我々は12塩基以上のオリゴが検出可能な抗HSV-1活性を有し、少なくとも120塩基までのPS-ODNの長さの増大とともに、HSV-1に対する有効性も増加することを発見した。しかしながら、サイズにおける塩基の増大当たりの有効性における増加は、40塩基より大きいPS-ODNでは小さかった（図7を参照のこと）。
非PS-ODNランダマー、ランダム配列のPS-ODN及びHSV-1特異的配列のPS-ODNの有効性を比較するために、我々は10、20及び40塩基のサイズのODNにおけるこれら3種の修飾について調べた（図8及び9を参照のこと）。非修飾ODNランダマーは調べたサイズでは検出可能な抗HSV-1活性は有していなかった（図8a〜cを参照のこと）。ランダム配列及びHSV-1特異的配列のPS-ODNは双方とも、サイズ依存性の抗HSV-1活性を示した（これらの修飾ではいずれも10塩基では活性は認められなかった。図8d及びgを参照のこと）。ランダム配列、HSV-1特異的配列及びランダマーのPS-ODNを比較すると（図10を参照のこと）、長さ20塩基のPS-ODNでは、HSV-1特異的配列による抗HSV-1活性の上昇が示されたが、長さ40塩基では、ランダマーであれ、ランダム配列であれ、HSV-1特異的配列あれ、修飾したものはすべて、HSV-1に対して等しく有効であった。
我々の知る限りでは、PS-ODNのHSV-1に対するIC50が0.059μM及び0.043μMのように低いことを報告したのは、これが初めてである。
実施例2：HSV-2の阻害
PRAにより、PS-ODNのHSV-2を阻害する能力を測定した。不死化したアフリカミドリザルの腎臓細胞（VERO）を10%のウシ胎児血清をプラスし、ゲンタマイシン、バンコマイシン及びアンフォテレシンBを補完したMEM（最低必須培地）中で、37℃、5% CO2にて培養した。4日間の増殖後集密な単層細胞が得られる密度にて細胞を12穴プレートに播いた。集密に達すると、培地を5%血清と上記の補完物だけを含有するものに代え、次いで、試験化合物の存在下、細胞を90分間、HSV-2（MS 2株、総計およそ40〜60PFU）にさらした。ウイルスに暴露したのち、培地を、5%血清、1％ヒト免疫グロブリン、上記の補完物及び試験化合物を含有する新しい「重層する」培地に変更した。感染の3〜4日後、感染培養物のホルマリン固定及びクレシルバイオレット染色に続いて、プラークの計数を行った。
PS-ODNがHSV-2を阻害できるかどうかを調べるために、HSV-2のPRAにてREP1001、2001及び3007を調べた。このPS-ODNがHSV1/2の複製開始点に向けられているので（他の2つはヒト及びプラスミドの複製開始点に向けられている）のでREP2001だけが何らかの活性を示すと期待された。しかしながら、3つのPS-ODNはすべて抗HSV-2活性を示した（図12を参照のこと）。さらに、抗HSV-2効果の能力は、PS-ODNのサイズに依存しており、配列には依存していなかった（図13を参照のこと）。
抗HSV-2活性に対するPS-ODNのサイズ依存性及び配列非依存性を確認するために、我々は、サイズの異なる（REP2001、2002、2003、2004、2005及び2006）PS-ODNを調べた。各PS-ODNが実際に同じサイズを持つ異なるランダム配列の集団を表すように各塩基を「揺らぎ」（N）として合成することにより配列特異的な効果に関してこれらのPS-ODNを不活性とし、「ランダマー」と称した。これらのオリゴをHSV-2 PRAにて調べた際、我々は10塩基以下のオリゴは検出可能な抗HSV-2活性を有さないが、PS-ODNのサイズが10塩基を超えて増加するにつれて、能力が増加することを見い出した（IC50低下、図14及び15を参照のこと）。我々はまた20塩基を超えるPS-ODNが臨床的に認可されている抗HSV-2薬、アシクロビル（商標）より有意に低いIC50値を有することも見い出した（図15を参照のこと）。
我々の知る限りでは、PS-ODNのHSV-2に対するIC50が0.012μMのように低いことを報告したのは、これが初めてである。
非特異的配列組成がONの抗ウイルス活性に影響を有するかどうか確定するために、我々は、HSV-1PRAにおける抗HSV-1活性について、サイズは等しいが配列組成の異なる幾つかのPS-ODNを調べた。調べたPS-ODNは、REP2006（N20）、REP2028（G40）、REP2029（A40）、REP2030（T40）、及びREP2031（C40）であった。HSV-1PRA（図37を参照のこと）で生成したIC50値は、REP2006（N40）が調べたあらゆる配列の中で明らかに活性が最も高く、一方、REP2029（A40）は最も活性が低かった。我々はまた、そのほかすべてのPS-ODNがN40よりも有意に活性が低く、有効性という点で、N40>C40>T40>A40>G40とランク分けされた。
我々はまた2つの異なるヌクレオチドを持つ様々な配列組成を有する様々なPS-ODNの有効性も調べた（図37bを参照のこと）。PS-ODNランダマー（REP2006）は、AC20（REP2055）、TC20（REP2056）、又はAG20（REP2057）よりも、HSV-1に対して有意に有効であり、有効性は、以下：N40>AG>AC>TCのようにランク分けされた。このデータは、抗ウイルス活性は非配列相補性であるが、特定の非特異的配列組成（すなわち、C40及びN40）が最も強力な抗ウイルス活性を有することを示唆している。我々は、固有のタンパク質結合能を保持する一方で、C40、A40、T40及びG40のような配列は、おそらくこれらの配列で形成される何らかの拘束性三次構造のために、高い親和性でわずかなウイルスタンパク質に結合することを示唆する。他方、N40のランダムな性質のために、それは、高い親和性を持って広範囲の抗ウイルスタンパク質に結合する能力を保持し、強力な抗ウイルス活性に寄与する。
実施例3：CMVの阻害
PS-ODNのCMVを阻害する能力を、プラーク減少アッセイ（PRA）により測定した。このアッセイは、CMV（AD169株）をウイルス播種として使用し、ヒト線維芽細胞を宿主細胞として使用する以外、抗HSV-1及び抗HSV-2を調べるのに使用したアッセイと同一である。
抗CMV活性におけるPS-ODNのサイズ依存性及び配列非依存性を調べるために、我々は、サイズの異なるPS-ODNランダマーを調べた（図16a、bを参照のこと）。CMVのPRAにてこれらのPS-ODNを調べた際、我々は、PS-ODNのサイズが増えるにつれて、能力も高まる（IC50の低下、図16cを参照のこと）ことを見い出した。
PS-ODNの抗CMV活性についての有効なサイズの範囲をさらに明らかに解明するために、我々は10〜80塩基の大まかなサイズ範囲を網羅するPS-ODNランダマーを調べた。我々はまた、幾つかの臨床的に認可された小分子のCMV治療剤（ガンシクロビル、ホスカルネット及びシドフォビル）並びにCMV網膜炎の治療用の市販のアンチセンス2種（Vitravene（商標）、カルガリー大学により市販、合成されている）も含めた（図17を参照のこと）。我々は、PS-ODNのサイズの増大が有効性の増加を招くが、この効果は40塩基で飽和することを発見した（図18を参照のこと）。さらに20、40及び80塩基のPS-ODNランダマーは、調べた小さな分子のいずれよりも有意に有効であった（図17）。さらに、40及び80塩基のPS-ODNランダマーはVitravene（商標）よりも有効であった。
我々の知る限りでは、PS-ODNのCMVに対するIC50が0.067μMのように低いことを報告したのは、これが初めてである。
実施例4：HIV-1の阻害
2つの異なるアッセイにより、PS-ODNのHIV-1を阻害する能力を測定した。
細胞変性効果（CPE）
細胞の代謝程度を報告するため、MTTダイを用いて細胞変性効果をモニターする。10%ウシ胎児血清を加え、抗生物質を補完したMEM中で、37℃、5% CO2にて不死化したヒトリンパ球（MT4）を培養する。96穴プレートにて適当な試験化合物を含有する培地に細胞を播き2時間インキュベートする。試験化合物との予備インキュベートの後、HIV-1（NL4-3株）をウエルに加えた（0.0002TCID50／細胞）。6日間の追加のインキュベートの後、MTT変換によりCPEをモニターする。ウイルス播種の非存在下で6日間薬剤をインキュベートすることにより細胞障害性を測定する。MTTの吸収値を％生存率に変換するには、非感染未処置細胞における吸収を100%に設定し、感染未処置細胞の吸収を0%に設定する。
複製アッセイ（RA）
不死化したヒト胎児腎臓細胞（293A）においてHIVの複製能力をモニターする。2種のプラスミドをこれらの細胞に同時形質移入する。一方のプラスミドはルシフェラーゼ発現カセットを介入させたenv遺伝子を有する組換え野生型HIV-1ゲノム（NL4-3）を含有し（CNDO株として同定される）、他方のプラスミドはマウス白血病ウイルス（MLV）に由来するenv遺伝子を含有する。これら2種のプラスミドは、MLVのenv遺伝子に由来するトランスで提供されるタンパク質産物を除いて、HIV-1に由来するすべての成分を有する成熟キメラウイルスを産生するあらゆるタンパク質因子をトランスで提供する。これらの細胞から産生されるビリオンは感染性であり複製するが、env遺伝子を欠くために感染性ビリオンの次世代を産生することはできない。
形質移入の24時間後、これらの細胞をトリプシン処理し、96穴プレートに播く。細胞が付着した後、培地を洗浄し、試験化合物を含有する培地と交換する。さらなる24時間の間にウイルス産生が進む。次いで、上清を回収し、元のままの293A細胞を再び感染させるのに使用する。ルシフェラーゼ遺伝子産物によって感染させた元の細胞を同定する。ルシフェラーゼ陽性細胞の数が、組換えHIV-1による複製及び／又は感染の程度の測定値である。幾つかの異なる部類の抗HIV薬に耐性を誘導することが知られている幾つかの点突然変異を持つHIV-1ゲノムを用いることにより多数の臨床的に認可されている抗HIV薬に対する耐性を調べるのにも、このアッセイが適用される。パーセント阻害は、検出可能なルシフェラーゼ陽性細胞がない場合を100%、感染細胞における陽性細胞の数を0%、未処置細胞を対照に設定する。
抗HIV-1活性におけるPS-ODNのサイズ依存性及び配列非依存性を調べるために、我々は、サイズの異なるPS-ODNランダマーを調べた。HIV-1のCPEアッセイにてこれらのPS-ODNランダマーを調べた際、我々は、PS-ODNのサイズが増えるにつれて、能力も高まる（IC50の低下、図19a、b及び20を参照のこと）ことを見い出した。我々はまた、このアッセイにおいてPS-ODNランダマーが宿主細胞に対して有意な毒性を示さないことに気付いた（図19c、dを参照のこと）。
我々の知る限りでは、PS-ODNのHIV-1に対するIC50が0.011μMのように低いことを報告したのは、これが初めてである。
PS-ODNの抗HIV-1活性についての有効なサイズの範囲をさらに明らかに解明するために、我々は、野生型HIV-1（組換えNL4-3（CNDO））を用いるRAによって10〜80塩基の大まかなサイズ範囲を網羅するPS-ODNランダマーを調べた。さらに、我々は、現在臨床で使用されている4種のプロテアーゼ阻害剤（アプレナビル、インジナビル、ロピナビル及びサキナビル）を調べた。我々は10塩基以上のPS-ODNランダマーが抗HIV-1活性を有し、PS-ODNの長さが増えると共にHIV-1に対する有効性も高まるが、40塩基で飽和することを発見した（図21e〜h及び図22bを参照のこと）。さらに、40塩基及び80塩基のPS-ODNランダマーは、4種の臨床対照と有効性においてほぼ同等であった（図21a〜d及び22aを参照のこと）。
我々の知る限りでは、PS-ODNのHIV-1に対するIC50が0.014μMのように低いことを報告したのは、これが初めてである。
HIVの薬剤耐性株を阻害するPS-ODNの能力を調べるために、我々は、HIV-1のMDRC4株を用いて上記試験を繰り返した。この組換え株は、あらゆる部類：ヌクレオチドRT阻害剤、非ヌクレオチドRT阻害剤、及びプロテアーゼ阻害剤に由来する16の異なる、臨床的に認可された薬剤に有意な耐性を呈する。PS-ODNランダマーはすべて、野生型株に対するのと同様に耐性株に対して機能した（図23e〜hを参照のこと）。しかしながら、4種のうち3種のプロテアーゼ阻害剤が変異株に対する有効性の低下を示したので（図23a〜d及び24を参照のこと）、40塩基及び80塩基のPS-ODNランダマーは今や耐性株に対してこれら薬剤よりも有効である。
実施例5：RSVの阻害
アラマーブルーによるCPEのモニタリング（細胞代謝の間接的測定）によってRSVを阻害するPS-ODNの能力を測定した。5%ウシ胎児血清を加えたMEM中で37℃、5% CO2にてヒト咽頭癌（Hep2）細胞を培養した。5〜6日間の増殖で集密な単層細胞が得られるような密度にて細胞を96穴プレートに播いた。播いた翌日、減らした体積で試験化合物の存在下、細胞にRSV（A2株108.2TCID50/ml）を2時間感染させた。播種に続いて、培地を交換し、試験化合物を補完した。感染の6日後、アラマーブルーの蛍光変換を測定することによりCPEをモニターした。未感染細胞を7日間処理し、これらの細胞におけるアラマーブルー変換を測定することにより、Hep2における試験化合物の毒性をモニターした。未感染、未処理細胞におけるアラマーブルーの読み取りを100%生存率に設定し、感染、未処理細胞における読み取りを0%生存率に設定した。
抗RSV活性におけるPS-ODNのサイズ依存性及び配列非依存性を調べるために、我々は、サイズの異なるPS-ODNランダマーを調べた。さらに、我々は、RSV感染用の臨床的に認可されている治療剤、リバビリン（ビラゾール（商標））を調べた。RSVのCPEアッセイで調べた際、我々は、PS-ODNランダマーのサイズが増すにつれて能力も高まるが、40塩基のサイズで飽和することを見い出した（図25a〜c及び26を参照のこと）。我々はまた20、40及び80塩基のPS-ODNランダマーが、臨床的に認可されている抗RSV薬、リバビリンよりも有意に低いIC50を有することに気付いた（図25a〜d及び26を参照のこと）。PS-ODNランダマーはHep2細胞において毒性を示さなかったが、リバビリンは有意に毒性だった（治療指数＝2.08、図25e〜hを参照のこと）。
我々の知る限りでは、PS-ODNのRSVに対するIC50が0.015μMのように低いことを報告したのは、これが初めてである。
実施例6：コクサッキーウイルスB2の阻害
アラマーブルーによるCPEのモニタリング（細胞代謝の間接的測定）によってCOX B2を阻害するPS-ODNの能力を測定した。5%ウシ胎児血清を加えたMEM中で37℃、5% CO2にてアカゲザル腎臓（LLC-MK2）細胞を培養した。5〜6日間の増殖で集密な単層細胞が得られるような密度にて細胞を96穴プレートに播いた。播いた翌日、減らした体積で試験化合物の存在下、細胞にCOX B2（オハイオ-1株107.8TCID50/ml）を2時間感染させた。播種に続いて、培地を交換し、試験化合物を補完した。感染の6日後、アラマーブルーの蛍光変換を測定することによりCPEをモニターした。未感染細胞を7日間処理し、これらの細胞におけるアラマーブルー変換を測定することにより、LLC-MK2細胞における試験化合物の毒性をモニターした。未感染、未処理細胞におけるアラマーブルーの読み取りを100%生存率に設定し、感染、未処理細胞における読み取りを0%生存率に設定した。
我々は、COX B2のCPEアッセイにおいてREP2006の抗COX B2活性を調べた。我々は、LLC-MK2細胞でやや毒性を示すものの（図27bを参照のこと）、このPS-ODNランダマーはCOX B2の感染から感染したLLC-MK2細胞を部分的に救済できることを見い出した（図27aを参照のこと）。
実施例7：ワクシニアウイルスの阻害
我々は、天然痘ウイルスをはじめとするポックスウイルスに対する我々の化合物の可能性ある有効性の測定法としてワクシニア感染モデルを用いた。アラマーブルーによるCPEのモニタリング（細胞代謝の間接的測定）によってワクシニアを阻害するPS-ODNの能力を測定した。5%ウシ胎児血清を加えたMEM中で37℃、5% CO2にてVERO細胞を培養した。5〜6日間の増殖で集密な単層細胞が得られるような密度にて細胞を96穴プレートに播いた。播いた翌日、減らした体積で試験化合物の存在下、細胞にワクシニア（107.9TCID50/ml）を2時間感染させた。播種に続いて、培地を交換し、試験化合物を補完した（50μMで使用したシドフォビルを除いて、すべて10μMで）。インキュベート後5日目に上清を回収した。1:100に希釈した上清でVERO細胞を再感染させ、再感染後7日間CPEをモニターし、アラマーブルーの蛍光変換を測定することにより上清中のウイルス負荷を決定した。
我々は、サイズの異なる（REP2004、2006及び2007）PS-ODNランダマーを調べた。さらに、我々はワクシニア感染に有効な既知の治療剤、シドフォビル（ビスチド（商標））を調べた。ワクシニアのCPEアッセイで調べた際、我々は、REP2004、2006及び2007による処理はすべて抗ウイルス活性を示した（すなわち、再感染の際、低下したCPEを示す上清を生じた）が、この活性は、シドフォビルで見られるものより弱かった（図36を参照のこと）。
実施例8：DHBV、パラインフルエンザ-3ウイルス及びハンタウイルスの阻害
DHBV、パラインフルエンザ-3ウイルス及びハンタウイルスは測定可能なプラーク又はCPEを容易に生じなかったので、我々は、蛍光フォーカス形成単位（FFFU）の検出を用いてこれらのウイルスにおけるREP2006の有効性を調べた。このアッセイでは、REP2006（最終濃度10μMで）ウイルスと混合し、次いで細胞に吸収させた。吸収の後、感染細胞を7〜14日間さらにインキュベートし、その時点でメタノール固定した。適当なウイルス抗原に対する免疫蛍光顕微鏡によってウイルス複製の領域を検出した。3種のウイルスのそれぞれについて、具体的な実験条件及び結果を以下に記載する：
Figure 0005514179
この当初のデータは10μMでのREP2006がDHBV、パラインフルエンザ-2ウイルス及びハンタウイルスを阻害することにおいて有効であることを示している。我々は、IC50がさらに低くなるであろう予備試験において強力な反応が得られることを期待している。これらのデータは、ハンタウイルス及びB型肝炎ウイルス（DHBVに密接に関係する）のヒトへの感染の治療に対するPS-ODNランダマーの有効性を支持すると共に、始めるべき治療についての確定診断を必要としない、RSV及びパラインフルエンザ-3による小児気管支炎の即時治療に対する理論的根拠を提供する。
実施例9：現在非反応性のウイルス
今日まで、我々は、以下のウイルスシステムで送達システム、薬剤の併用又は化学的修飾を用いずにPS-ODNランダマー（10μMまで）による検出可能な抗ウイルス有効性を観察していない：
Figure 0005514179
現在の試験手順のもとでは、我々は活性を実証しなかった。しかしながら、抗ウイルス活性の欠如は、アッセイの条件下でのPS-ODNの細胞への浸透が小さいためである可能性がある。にもかかわらず、追加の試験を行って、これらウイルスによる有効な結果を達成する。細胞内濃度を上げるためにリポソーム製剤のような送達システムを用いた場合、これらのウイルスがPS-ODNに反応する可能性がある。また、本明細書で記載したように別の抗ウイルス薬との併用で、PS-ODNは、これらのウイルスに対して抗ウイルス有効性を示す可能性がある。これらのウイルスに対してPS-ODNを有効にするのに、細胞内濃度を高めるための化学修飾が有用であってもよい。
我々は、PS-ODNの電荷特性が数種のファミリーに由来するウイルスの阻害に重要であるという良好な証拠を有しているので、ウイルス活性の阻害に関するこの電荷に依存したメカニズムがカプシドに包み込むウイルスすべての活性を阻害する能力を有することを予想している。これに対する必然的結果は、実施例9に列記したウイルスに対する検出される抗ウイルス有効性の欠如は、PS-ODNとこれらウイルスの構造タンパク質の相互作用がこれらウイルスの複製の間、ウイルスタンパク質の相互作用を妨げるほど十分に強くないことを示唆するということである。これらのウイルスに対する有効性を達成する方法の1つは、DNA又は抗ウイルス性ポリマーの荷電特性を変え（たとえば、DNAにおけるホスホロチオエート結合の代わりにホスホロジチオエートを用いる）、ウイルスタンパク質に対するその親和性を高めることである。
実施例10：オリゴヌクレオチドが主として非配列相補性方式の作用によって作用するかどうかを確定する試験
以下に概説する3種の試験のいずれか1つの基準を満たせば、該当するON、たとえば、ODNは、主として非配列相補性方式の作用によって作用するとみなさなければならない。
試験#1-抗ウイルス有効性に対する部分的依存性の効果
本試験は、配列の一部が変質させられた場合の特定のON配列の抗ウイルス活性を測定するのに役立つ。同一化学成分を有するONの変質形が以下に記載されるようにその活性を保持していれば、それは、主として非配列相補性の作用機序で作用していると判断される。以下の規則に従ってONを変質させる：
LON＝元々のONの塩基数
X＝変質させるべきオリゴの各末端における塩基数（但し、元々のONと同一の化学成分を有する）
LONが偶数であれば、そのとき、X＝LON/4
LONが奇数であれば、そのとき、X＝整数（LON/4）+1
各変質塩基は、任意の好適な方法、たとえば、本明細書に記載されているPS-ODNランダマーの合成方法に従って合成されなければならない。
ONが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス又はパラミクソウイルスのファミリーの一員に対する抗ウイルス活性を有するように請求されていれば、そのウイルスファミリーについて、好ましくは示されたウイルス株を用いて本明細書で記載されるアッセイを用いてIC50の生成を行う。ONが上述されていない特定のウイルスファミリーの一員に対して抗ウイルス活性を有するように請求されていれば、そのときは、製薬業界で認可されている抗ウイルス有効性の試験によってIC50値を生成するべきである。最低7つの化合物の濃度を用いて、用量反応曲線の線形範囲での3以上の点によってIC50値を生成するべきである。この試験を用いて、前記ONのIC50をその変質相手と比較するべきである。変質ONのIC50が25塩基以下のONに関する元々のONより2倍未満大きい、又は26塩基以上のONに関する元々のONより10倍未満大きければ（最低3連一組の測定に基づき、標準偏差は平均値の15%を超えない）、そのときは、ONは主として非配列相補性の作用機序で機能すると判断するべきである。
試験#2-ランダマーによる有効性の比較
本試験は、同一ウイルス又はウイルスファミリーにおける、ONの抗ウイルス有効性を同等サイズ及び同一化学成分のランダマーONの抗ウイルス有効性と比較するのに役立つ。
ONが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス又はパラミクソウイルスのファミリーの一員に対する抗ウイルス活性を有するように請求されていれば、そのウイルスファミリーについて、好ましくは示されたウイルス株を用いて本明細書で記載されるアッセイを用いてIC50の生成を行う。ONが上述されていない特定のウイルスファミリーの一員に対して抗ウイルス活性を有するように請求されていれば、そのときは、製薬業界で認可されている抗ウイルス有効性の試験によってIC50値を生成するべきである。最低7つの化合物の濃度を用いて、用量反応曲線の線形範囲での3以上の点によってIC50値を生成するべきである。この試験を用いて、ONのIC50を同等サイズ及び同一化学成分のONランダマーと比較するべきである。変質ONのIC50が25塩基以下のONに関する元々のONより2倍未満大きい、又は26塩基以上のONに関する元々のONより10倍未満大きければ（最低3連一組の測定に基づき、標準偏差は平均値の15%を超えない）、そのときは、ONは主として非配列相補性の作用機序で機能すると判断するべきである。
試験#3-異なるウイルスファミリーにおける有効性の比較
本試験は、そのゲノムがONに相同である標的ウイルスに対するONの有効性をそのゲノムがONに相同ではない第2のウイルスに対するONの有効性と比較するのに役立つ。多くの場合、異なるウイルスは、標的ウイルスのウイルスファミリーよりも異なるウイルスファミリーから選択される。双方のウイルスにおける同一の長さ及び化学成分のランダマーの活性を用い2つのウイルスで得られたONに関するIC50を標準化することにより、標的ウイルスと第2のウイルスにおけるONの相対的活性の比較が達成される。
従って、特定のウイルスに対して抗ウイルス活性を有するように請求されていれば、そのとき、IC50の生成は、ヘルペスウイルス、レトロウイルス又はパラミクソウイルスのファミリーについて本明細書に記載されたアッセイの1つを用いて、又は当該技術で既知のそのほかのアッセイを用いて、このウイルスにおいて決定される。同様に、そのゲノムがONの配列に相同ではないウイルスに関して本明細書で記載されたアッセイの1つを用いて、第2のウイルスに対するONについてIC50の生成を行う。IC50の生成は、ウイルスそれぞれに対する、同等のサイズ及び化学成分のランダマーについて行う2つのウイルスに対するランダマーのIC50有効性を用いて以下のように特定のONに関するIC50値を標準化する：
1. ランダマーのIC50が1になるように第1（相同の）ウイルスにおけるON及びランダマーのIC50に代数変換を適用する。
2. ランダマーのIC50が1になるように第2（非相同の）ウイルスにおけるON及びランダマーのIC50に代数変換を適用する。
3. 非相同のウイルスにおけるONの変換したIC50を相同のウイルスにおけるONの変換したIC50で割ることにより相同ウイルス対非相同ウイルスにおけるONにIC50での倍差を算出する。
長さ25塩基未満のONについては、倍差が2未満であれば、ONは非配列相補性の作用機序で作用していると判断するべきである。長さが25塩基以上のONについては、倍差が10未満であれば、ONは非配列相補性の作用機序で作用していると判断するべきである。
試験#4：異なるウイルスファミリーにおける有効性
本試験は、ONがウイルスゲノムのどの部分とも相同ではないウイルスにおいて前記ONが薬剤様の活性を有するのかどうかを確定するのに役立つ。従って、調べられるONの配列が使用されるべきウイルスのゲノムのいかなる部分とも相同ではないように、ヘルペスウイルス、レトロウイルス又はパラミクソウイルスについて本明細書に記載されるアッセイの1つを用いて、ONを調べるべきである。最低7つのONの濃度を用いて、線形範囲での3以上の点によってIC50値を生成するべきである。得られた用量反応曲線が薬剤様活性を示すのなら（通常、減衰曲線又はS字曲線であることができ、ONの濃度の低下と共に抗ウイルス有効性も低下する）、且つ、前記曲線から生成したIC50が1μM未満であれば、ONは薬剤様活性を有すると判断されるべきである。ONは相補性ではないウイルスにおいてONが薬剤様活性を有すると判断され、よって、相補性配列依存性の活性を有しえないのであれば、それは非配列相補性の作用機序で作用しているとみなされるべきである。
これらの試験で使用される閾値
学問分野にも産業分野にも25塩基より長いアンチセンスONを設計するための科学的根拠も経験的根拠もない。さらに、我々の知る限り25ヌクレオチドより長いONを使用したヒト臨床試験で投与されたON製剤はない。
これらの事実を考えて、我々は2つの異なる閾値を確立したが、それを用いて、主として非配列相補性の作用機序で作用する配列を定義する。25塩基以下のオリゴについては、アンチセンスメカニズムにより主として作用しているとみなされるためには、ONは、同一化学成分のランダマー又は変質ONよりも少なくとも2倍大きい抗ウイルス活性を有さなければならない。ONがランダマーや変質ONより少なくとも2倍良好ではなければ、我々は、半分を超える活性は非アンチセンスの作用機序に起因すると結論付ける。
26以上のONについては、アンチセンスメカニズムにより作用しているとみなされるためには、ONは、同一化学成分のランダマー又は変質ONよりも少なくとも10倍（1ログ）大きい抗ウイルス活性を有さなければならない。この大きな閾値に対する我々の理論的根拠は、アンチセンスのためのONの設計に関する現在の技術状態を考えると26塩基より大きく且つ抗ウイルス活性を有するように請求されるオリゴが本明細書に含有される本発明の知識により設計されたことを前提とすることは合理的であるということである（アンチセンスONの最適な長さは一般に16〜21塩基の間であるとされている）。
上記試験の1〜3で記載された閾値は、暫定値閾値である。具体的に示せば、上述の比較試験1〜3では他の閾値を使用することができる。従って、たとえば、長さ25未満の塩基のON及び／又は長さ25以上の塩基のONについて、具体的に示せば、ONが主として非配列相補性の作用機序で作用するかどうかを決定するための閾値は10倍、8倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1.5倍又は等しいことが可能である。上記試験4で記載された閾値も暫定値閾値である。具体的に示せば、試験4においてONが主として非配列相補性の作用機序で作用するかどうかを決定するための閾値は1μM、0.8μM、0.6μM、0.5μM、0.4μM、0.3μM、0.2μM、又は0.1μM未満のIC50であることができる。同様に、暫定値は上記４試験のいずれか1つを満たせば十分であるが、具体的に示せば、ONは、いずれか2つ（たとえば、試験1と2、1と3、1と4、2と3、2と4及び３と4）、又はいずれか3つ（たとえば1と2と3、1と3と4、及び2と3と4）又は暫定値閾値での試験の4つすべて、又は具体的に示せば、上述のような別の閾値を満たすように求められうる。
ヘルペスウイルスのための抗ウイルスアッセイ
以下のように実施されたプラーク減少アッセイ
HSV-1又はHSV-2について10%の熱非働化ウシ胎児血清、ゲンタマイシン、バンコマイシン及びアンフォテレシンBを補完したMEMの存在下、37℃、5% CO2にてVERO細胞（ATCC#CCL-81）を12穴組織培養用プレートで集密に増殖させた。集密に達した際、5%ウシ胎児血清及び上で詳説した抗生物質を含有し、HSV-1（KOS株、総計40〜60PFU）又はHSV-2（MS2株、総計40〜60PFU）のいずれかを補完した培地に交換した。ウイルス吸収を90分間進行させ、その後、細胞を洗浄し、5%ウシ胎児血清及び1％ヒト免疫グロブリンを含有する新しい「重層」培地に交換した。吸収の3〜4日後、細胞をホルマリン固定し、ホルマリン固定に続いてプラークを計数した。
CMVについては、HSV-1/2アッセイにおいてVERO細胞で特定したようにヒト線維芽細胞を増殖させた。培地成分及び吸収／重層手順は以下の例外を伴うが、同一である。
1．CMV（AD169株、総計40〜60 PFU）を用いて、吸収中、細胞を感染させた。
2．重層培地中1%ヒト免疫グロブリンを4%シープラークアガロースに置き換えた。
ヘルペスウイルスについては、上述のプラークアッセイにて吸収中に適当な宿主細胞及び40〜60PFUのウイルスを用いて、試験を実施すべきである。
この試験は、試験終了時、化合物の非存在下にて同定可能なプラークが存在すれば有効であるにすぎない。
IC50は、未処理の対照に比較して50%のプラークが存在する濃度である。
吸収中及び重層において調べるべき化合物は存在する。
レトロウイルスのための抗ウイルスアッセイ
HIV-1感染細胞の上清におけるすべてのp24の検出は以下のように行った。
化合物の存在下、HIV-1の一次単離物でヒトPBMCを感染させた。次いで、化合物を補完した新鮮な培地で細胞をさらに7日間インキュベートし、その後、市販のp24ELISAキット（BIOMERIEUS又は同等物）を用いて、上清中のp24のレベルを測定した。
この試験は、感染、未処理細胞の組織培養上清にてp24の蓄積があれば有効であるにすぎない。
IC50は、検出可能なp24の量が未処理の対照の存在するp24の50%である濃度である。
調べるべき化合物は、吸収中及び吸収後の培地に存在する。
パラミクソウイルスのための抗ウイルスアッセイ
RSVについては、CPEの測定を以下のように行った：
Hep2細胞を96穴プレートに播き、5%ウシ胎児血清を加えたMEM中で37℃、5% CO2にて一晩増殖させた。翌日2時間の吸収によって細胞にRSV（A2株100μL／ウエル中108.2 TCID50/ml）を感染させた。吸収に続いて培地を交換し、7日間の増殖の後、生細胞によるアラマーブルー染料の蛍光付加体への変換によってCPEを測定した。
本試験は、化合物非存在下の感染細胞におけるCPE測定値（アラマーブルー変換により測定されたとき）が非感染細胞で測定された変換の10%であれば有効であるにすぎない。
IC50の比較の目的で、感染細胞で見られた変換レベルで100% CPEを設定し、非感染細胞で見られた変換で0% CPEを設定した。従って、IC50は、50% CPEを生成する化合物の濃度である。
調べるべき化合物は、吸収中及び吸収後の培地に存在する。
明細書に引用された特許及びそのほかの参考文献はすべて、本発明が関係する当業者の技量のレベルを示しており、いかなる表及び図も含めて、それぞれの参考文献が個々にその全体を参考として本明細書に組み入れたのと同等に、それら全体を参考として組み入れる。
当業者は、本発明が上手く適用されて、言及された結果及び利点並びにその中で固有のものを得ることを容易に十分に理解するであろう。好ましい態様の現在の代表として本明細書に記載された方法、変異及び組成物は典型的なものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。その中の変更及びそのほかの用途が当業者に生じるであろうが、それらは本発明の範囲内に包含され、請求の範囲によって定義されている。
本発明の範囲と精神から逸脱することなく、本明細書で開示された発明に対して種々の置換及び修正を行ってもよいことは当業者には容易に明らかであろう。たとえば、合成条件及びオリゴヌクレオチドの組成物に対して変更を行うことができる。従って、そのような追加的態様は、本発明及び請求の範囲内である。
本明細書で好適に、説明的に記載された本発明を、本明細書で具体的に開示されていないいかなる要素、限定の非存在下で実践してもよい。従って、たとえば、本明細書の各例において、用語「含む」、「本質的に成る」及び「成る」のいかなるものも、ほかの2つの用語のいずれかで置き換えてもよい。採用された用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定の用語ではなく、そのような用語及び表現の使用において、示された及び記載された特徴の同等物、又はその一部を排除する意図はないが、請求された発明の範囲内で様々な改変が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい態様及び任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書の概念の修正及び変更は当業者に頼ってもよく、そのような修正及び変更が、添付のクレームによって定義される本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
さらに、本発明の特徴及び局面がマーカッシュ群又は代替の他の群という点で記載される場合、当業者は、本発明がそれによって、マーカッシュ群又はそのほかの群の個々の一員又は亜群の一員という点で記載されることを理解するであろう。
また、それとは反対に、記載していなければ、様々な数値が態様に対して提供される場合、範囲の端点として任意の2つの異なる値を利用することによって追加の態様が記載される。そのような範囲も記載された本発明の範囲内である。
従って、追加の態様も本発明の範囲内であり、請求の範囲内である。
（表１）オリゴヌクレオチドの説明
Figure 0005514179
Figure 0005514179
Figure 0005514179
選択された略語
ON：オリゴヌクレオチド
ODN：オリゴデオキシヌクレオチド
PS：ホスホロチオエート
PRA：プラーク減少アッセイ
PFU：プラーク形成単位
INFA：インフルエンザAウイルス
HIV：ヒト免疫不全ウイルス（特定していなければ、HIV-1及びHIV-2の双方を含む）
HSV：単純性ヘルペスウイルス（特定していなければ、HSV-2及びHSV-3の双方を含む）
RSV：呼吸器合胞体ウイルス
COX：コクサッキーウイルス
DHBV：アヒルB型肝炎ウイルス

Claims (6)

  1. 完全にホスホロチオエート化されたSEQ ID NO : 23からなるオリゴヌクレオチドを含む、B型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス用オリゴヌクレオチド薬剤。
  2. オリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの5−メチルシトシン塩基をさらに含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド薬剤。
  3. 治療上有効量の請求項１に記載の抗ウイルス用オリゴヌクレオチド薬剤、及び薬学的に許容されるキャリアを含む、B型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス用薬学的組成物。
  4. ウイルスに病因のある疾患の治療、抑制又は予防に適合される、請求項３記載の抗ウイルス用薬学的組成物。
  5. 吸入、皮下注射、及び静脈内注入から成る群より選択される方式による送達に適合される、請求項３記載の抗ウイルス用薬学的組成物。
  6. 少なくとも1つのそのほかの抗ウイルス剤を組み合わせてさらに含む、請求項３記載の抗ウイルス用薬学的組成物。
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