KR101842679B1 - Rna 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 면역 활성제 - Google Patents

Rna 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 면역 활성제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 두 개의 서열이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 및 ISG56의 발현을 증가시킴으로써, 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 면역 활성제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

RNA 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 면역 활성제{RNA OLIGONUCLEOTIDE AND ENHANCER OF IMMUNE SYSTEM COMPRISING THE SAME}
본 발명은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 면역 활성제에 관한 것이다.
인터페론은 핵이 존재하는 대부분의 세포로부터 유래하는 당단백질로, 면역반응을 조절한다. 인터페론은 세포 표면 세포막의 특정 수용체와 결합하여 일련의 세포 내 반응과 면역 조절 반응을 나타낸다. 이러한 세포 내 반응에는 특정 효소들의 활성화 유도 등이 있고, 면역 조절 반응으로는 대식세포의 식세포작용 활성 증가, 표적 세포에 대한 임파구의 세포독성 증가 등이 있다.
인터페론은 물리화학적 및 기능적 특징에 따라 1형과 2형으로 분류된다. 1형 인터페론에는 인터페론-α, -β, -τ 및 -ω가 있고, 2형 인터페론에는 인터페론-γ가 있다. 이 중 인터페론-β는 분자량이 약 20 kDa이고, 약 20%의 당을 함유하며 166개의 아미노산으로 구성된 단일 사슬의 단백질이다.
현재 재조합 인터페론-β는 다양한 질병의 치료제 또는 보조제로 사용되고 있으며, 이를 치료제로 사용하는 대표적인 질병으로는 자가면역 질환인 다발성 경화증이 있다(Airas L. et al., Ann N Y Acad Sci ., 2007, Sep:1110:641-8).
한편, 최근 RNA 올리고뉴클레오티드를 사용하여 면역반응을 증가시키고자 하는 연구가 진행되고 있다. 미국 특허공개 제2012/0288476호는 5'-말단에 포스페이트기(phosphate group)가 결합되고, 캡(cap)이 없는 상태의 올리고뉴클레오티드가 1형 인터페론, 인터루킨-18, 인터루킨-1β 등의 발현을 증가시킬 수 있음을 개시하고 있다.
또한, 미국 특허공개 제2012/0121551호는 4개의 뉴클레오티드로 구성된 RNA가 인터페론-α의 활성을 유도하여 면역반응을 촉진함을 개시하고 있다.
상기 공개된 RNA들은 모두 5'-말단에 트리포스페이트기를 포함한다는 공통점이 있다. 이와 같이 RNA가 이의 5'-말단에 캡이 존재하지 않고, 트리포스페이트기를 포함하면 세포 내의 RIG-I(retinoic acid-inducible gene I) 단백질과 결합하여 인터페론의 발현을 활성화시키는 것이 알려져 있다.
본 발명자들은 인터페론-β 또는 인터페론-β에 의해 발현되는 인터페론 활성인자 56(interferon stimulated gene 56; ISG56)의 발현을 증가시킬 수 있는 물질을 연구하던 중, 기존에 알려진 바와 달리, 5'-말단에 트리포스페이트기가 없어도 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시켜, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 면역 활성제로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
미국 특허공개 제2012/0288476호 미국 특허공개 제2012/0121551호
Airas L. et al., Ann N Y Acad Sci., 2007, Sep:1110:641-8
따라서, 본 발명의 목적은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제를 제공한다.
본 발명에 따른 특정 서열과 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 세포주에 처리하면 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시키므로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 면역 활성제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드들의 서열 및 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-iav 또는 5'-PPP-iav의 구조를 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드에 의해 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp에 의해 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC Minimun에 의해 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double Bend에 의해 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend에 의해 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 8 내지 100개, 8 내지 50개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 10 내지 100개, 10 내지 50개, 10 내지 30개, 20 내지 500개, 20 내지 300개, 10 내지 200개, 10 내지 100개, 20 내지 50개의 염기를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서 RNA 올리고뉴클레오티드는 단일가닥으로는 8개 내지 16개, 이중가닥으로는 16개 내지 32개일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "상보적 결합"은 1개 또는 2개의 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 또는 이중나선을 형성하면서 상보적인 염기 서열들이 쌍(pair)을 이루어 이합체(duplex) 구조를 형성하는 것을 나타낸다. 상보적 결합은 쌍을 이루는 뉴클레오티드 서열 간의 상보성이 왓슨-크릭 결합(Watson-Crick pair)을 이루거나, 일부 비 왓슨-크릭 결합(Non-Watson-Crick base pair)이 존재하여도 형성될 수 있다.
상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 구체적으로는 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, 그리고 N3는 G일 수 있고(서열번호 3에 해당), 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, 그리고 N6은 C일 수 있다(서열번호 4에 해당).
상기 염기서열을 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥을 형성할 때, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 워블 염기쌍(wobble base pair), 즉, 비 왓슨-크릭 염기쌍을 형성한다.
또한, 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 일실시예에서, 나선형 굽힘 구조는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 워블 염기쌍일 때, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U)에서 형성된다.
상기 나선형 굽힘 구조는 이중가닥 RNA가 이루는 평면을 기준으로 10 내지 90도, 구체적으로는, 30 내지 70도, 더욱 구체적으로는 40 내지 50도로 구부러진 형태를 갖는다.
본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의한 분해를 억제하고 생체 내 안정성 향상을 위해, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합(phosphodiester bond) 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형될 수 있다. 본 발명에 따른 구체적인 일실시예에서 상기 변형은 적어도 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 헤어핀 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 RNA 올리고뉴클레오티드에서 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합은 상술한 바와 같은 다른 결합으로 치환될 수 있다.
상기 헤어핀 RNA 구조에서 루프는 4 내지 80개, 4 내지 75개, 4 내지 70개, 4 내지 65개, 4 내지 60개, 4 내지 55개, 4 내지 50개, 4 내지 45개, 4 내지 40개, 4 내지 35개, 4 내지 30개, 4 내지 25개, 4 내지 20개, 4 내지 15개 또는 4 내지 10개의 염기로 이루어질 수 있고, 본 발명에 따른 일실시예에서 상기 루프는 4개, 15개, 16개, 64개 또는 73개의 염기로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 루프에서 이를 구성하는 일부의 염기서열이 서로 상보적인 경우 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 스템(stem) 구조를 가질 수 있다. 상기 스템 구조는 A 및 U 사이에 왓슨-크릭 염기쌍이 형성된 AU 모티프(motif)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 루프를 구성하는 4개의 염기 서열은 UUCG이다.
본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 헤어핀 RNA 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 19로 표시되는 염기서열일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
구체적으로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17로 표시되는 염기서열 2개가 회귀성 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 용어 "회귀성(palindromic) 구조"는 이중가닥을 형성하는 2개의 염기서열이 5'-말단에서 3'-말단의 방향으로 동일한 순서의 염기서열로 구성되는 구조를 나타낸다. 본 발명에서 상기 회귀성 구조는 서열번호 1의 염기서열에서 3'-말단이 서열번호 2의 염기서열에서 5'-말단과 결합하여 단일가닥을 형성하고, 상기 형성된 단일가닥 2개가 서로 상보적으로 결합하여 형성된 이중가닥일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 단일가닥은 서열번호 18로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 회귀성 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드의 이중가닥에서 나선형 굽힘 구조는 2개일 수 있다.
또한, 상기 회귀성 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 RNA 올리고뉴클레오티드에서 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합은 상술한 바와 같은 다른 결합으로 치환될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 헤어핀 구조의 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 회귀성 구조를 갖고, 2개의 나선형 굽힘 구조를 가질 수 있다. 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드에서 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합은 상술한 바와 같은 다른 결합으로 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 체내에서 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시켜, 면역을 강화시킴으로써 면역 활성제로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 면역 활성제는 조성물 총 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역 활성제는 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 면역 활성제는 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 면역 활성제의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 포함된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드의 유효량은 세포내 농도가 1 내지 1,000 nM, 구체적으로는 100 내지 500 nM이 되도록 한다. 이때 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명의 면역 활성제는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
본 발명자들은 이중가닥 RNA 또는 헤어핀 RNA 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하여(도 1), 그 중 5'-OH-iav 또는 5'-PPP-iav가 나선형 굽힘 구조를 갖고(도 2), 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 및 ISG56의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 3 내지 도 7).
따라서, 본 발명에 따른 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 인터페론-β 및 ISG56의 발현을 증가시킴으로써, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 면역 활성제로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. RNA 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 제조
인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시킬 수 있는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다.
먼저, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 구성되고 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제작하였다. 반면, 서열번호 3 내지 10 및 서열번호 18 내지 19의 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖거나, 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 RNA 올리고뉴클레오티드는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies) 또는 다르마콘(Dharmacon)에 주문제작하였다.
이에 따라, 도 1에 나타난 바와 같이, 서열번호 5의 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-control 및 5'-PPP-control RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 6의 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 7 또는 8의 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Int-NS1 및 5'-OH-Bend-GC RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 또한, 서열번호 9의 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Cont-GC-8bp RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 또한, 서열번호 10의 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드, 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 구성되고, 이들 염기가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하며, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 아울러, 서열번호 18의 염기서열 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 나아가, 서열번호 19의 염기서열로 구성되고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.
실시예 2. RNA 올리고뉴클레오티드의 구조 확인
상기 실시예 1에서 제조된 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드의 구조를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 상기 실시예 1에서 제작된 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 mM 인산나트륨(pH 6.5), 0.01 mM EDTA, 10 (v/v)% D2O를 포함하는 완충액에 용해시켜 샘플을 제조하여 당업계에 공지된 방법으로 다양한 분광실험을 하였다. 이때, 2차원 NOE 분광실험(NOESY)은 400, 600 및 800 ㎒의 핵자기공명(NMR) 분광기(Bruker, USA)로 100 및 200 ㎳의 믹싱시간에서 하였다. 또한, 278 K의 온도에서 1H-15H HSQC(heteronuclear single quantum coherence) 분광실험, 125 ㎳ 믹싱시간에서 DQF-COSY(double quantum filtered correlated) 및 TOCSY(homonuclear total correlation) 분광실험, 30 ㎳ 믹싱시간에서 1H-31P HETCOR(heteronuclear correlation) 및 1H-31P Hetero-TOCSY 분광실험, 및 80, 150 및 250 ㎳ 믹싱시간에서 NOESY 분광실험을 하였다. 그 외에도, 1H-13C CT-HSQC, HCCH-COSY, 2D HCCH-relayed COSY, 2D HCCH-TOCSY 및 3D HCCH-TOCSY 분광실험들을 하였다.
NMR 분광실험 결과, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드의 염기 수소들과, H1', H2', H3', H4', H5'/H5''들의 NMR 피크들을 정하였다. NOESY 분광실험으로부터 약 563개의 NOE 거리 규정값(distance constraints)들을 구하였고, 거리 규정값들은 거리에 따라 3 내지 4개의 그룹들(예컨대, 1.8 내지 3.4 Å, 1.8 내지 5.0 Å 및 3.8 내지 7.0 Å, 또는 1.8 내지 3.4 Å, 2.5 내지 4.5 Å, 3.5 내지 6.0 Å 및 4.0 내지 7.0Å)로 분류하였다. 비 왓슨-크릭 결합들에 대해서는 수소결합 제한을 두지 않았다. DQF-COSY에서 얻은 3JH1' , H2' 값으로 δ 이면각(dihedral angle)을 구하였고, 모든 χ 이면각은 -158±15도로 고정하였다. 다른 이면각(예컨대, α, β, γ, ε, ζ)은 RNA의 A형 나선 구조로 제한하였다. 벌지(bulge) 부분은 몇몇 β 및 ε 이면각을 제외하고, 다른 이면각들은 제한하지 않았다. 잔류 쌍극 결합(residual dipolar coupling) 값들을 ±1 ㎐의 정확도로 민감성이 증가된 HSQC 실험으로 측정하였다. 또한, 특이값 분해(singular value decomposition)를 통해 얼라인먼트 텐서(alignment tensor)를 분석한 결과, -8.0 ㎐의 비등방성(anisotropy) 값과 0.32의 롬빅시티(rhombicity) 값을 얻었다. 모든 구조의 계산은 X-PLOR 3.1 및 CNS로 하였다. 100개의 구조를 거리 규정값에 따라 생성하여 3,000 K에서 10 ㎰ 동안 시뮬레이션 후, 50 ㎰ 동안 300 K에서 식히는 담금질 기법(simulated annealing)을 수행하였다. 거리 힘 상수(distance force constant)는 50 ㎉/mol/Å로 유지하였고, 이면각 상수는 20 ㎉/mol/Å에서 400 ㎉/mol/Å로 변화시켰다. 제일 낮은 에너지 상태의 구조들은 300 K에서 20 ㎰로 정제하였고, 마지막 5 ㎰는 제한된 에너지 최적화(restained energy minimization)를 하였다. 이로부터 얻어진 총 220개의 구조들은 22개의 잔류 쌍극 결합 규정값들을 추가하여 정제하였고, 이때 잔류 쌍극 결합의 힘 상수 값은 3.0 ㎉/mol을 유지하였다. 최종적으로 32개의 구조를 얻었으며, 이를 Insight II(Biosym Technologies, USA) 및 CURVES 5.2 소프트웨어로 분석하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav RNA 올리고뉴클레오티드는 나선형 굽힘 구조를 형성하고 있었다. 이와 같은 나선형 굽힘 구조는 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav를 구성하는 서열 중, 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'의 서열로 구성된 두 개의 단일 가닥이 비 왓슨-크릭 결합을 통해 이중가닥을 형성하며 생성되는 구조로 확인되었다. 따라서, 상기 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'의 서열을 포함하는 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Int-NS1, 5'-OH-Bend-GC, 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, 5'-OH-16mer-Double-Bend 및 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드도 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 알 수 있다.
실험예 1. RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 인터페론-β의 발현 확인
상기 실시예 1에서 제조된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드들이 인터페론-β의 발현을 증가시키는지 확인하였다.
1.1. 세포주의 준비
먼저, 100 ㎜ 조직배양 플레이트에 3×106개의 HEK293T 세포(ATCC, USA)를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, 미국)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 7 ㎖에 분주하고, 이를 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하여 세포주를 준비하였다.
1.2. RNA 올리고뉴클레오티드의 처리
상기 실험예 1.1.에서 준비한 세포주에 상기 실시예 1에서 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
먼저, 상기 배양된 세포에 트립신-EDTA(Gibco, 미국)를 처리하여 세포들을 떼어내고, 이를 계수하여 6-웰(well) 플레이트에 1×103개가 되도록 분주하였다. 그 후, 이를 37℃, 5% CO2의 조건에서 42시간 동안 배양하고, 배지를 제거한 뒤, FBS가 포함되지 않은 400 ㎕ OPTI-MEM 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
RNA 올리고뉴클레오티드의 처리는, 1 μM의 5'-PPP-control, 5'-PPP-iav, 5'-OH-control, 5'-OH-iav, 5'-OH-Int-NS1 및 5'-OH-Bend-GC 각각에 4 ㎕의 리포펙타민 LTX, 및 1.6 ㎕의 플러스-시약을 혼합하여, 이를 200 ㎕씩 세포에 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 다시 37℃, 5% CO2의 조건에서 4시간 동안 배양하였고, 이때, 양성대조군으로는 RIG-I 리간드로 알려진 폴리(I:C)[poly(I:C)]를, 음성대조군으로는 배지만 처리하였다. 4시간 후, 배지를 제거하고, 10% FBS를 포함하는 2 ㎖의 DMEM 배지를 넣어 37℃, 5% CO2의 조건에서 2시간을 더 배양하였다.
1.3. 인터페론-β의 발현 확인
상기 서술한 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리한 세포에서 인터페론-β의 발현을 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 RNA를 분리하였다.
먼저, 배지를 제거하고 500 ㎕의 TRI-시약(Ambion, 미국)으로 세포를 회수한 뒤, 모아진 세포에 클로로포름을 넣어 RNA 층을 분리하였다. 여기에 이소프로판올을 첨가하여 펠렛(pellet)을 만든 뒤, 상기 펠렛을 75% 에탄올로 세척하고 건조시킨 뒤, 멸균된 증류수에 녹였다. 이렇게 분리된 RNA에 DNase(Promega, 미국)를 첨가하여 30분 동안 상온에서 처리하여 오염된 DNA를 제거하였고, 정지용액(stop solution)으로 이를 불활성화하였다. 그 후, 슈퍼스크립트 III 역전사효소(Invitrogen, 미국)를 이용하여 50℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.
이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 실시간 PCR은 h-tag DNA 중합효소(solgent, 대한민국), dNTP, 염화테트라에틸암모늄(tetraethylammonium chloride), 에바그린 염료(evagreen dye, Biotium, USA), 및 표적 유전자인 인터페론-β 및 대조 유전자인 GAPDH를 위한 프라이머를 혼합하여 수행하였다. 실시간 PCR은 95℃에서 15분 동안 고정한 후, 95℃ 20초, 60℃ 40초, 및 72℃ 20초를 1회로 총 40회를 반복하였다. 이때, 인터페론-β 및 GAPDH를 표적으로 하는 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 이름 서열
서열번호 11 인터페론-β forward 5'-ggaggacgccgcattgac-3'
서열번호 12 인터페론-β reverse 5'-caatagtctcattccagccagtgc-3'
서열번호 13 GAPDH forward 5'-gcattgccctcaacgaccac-3'
서열번호 14 GAPDH reverse 5'-gaggccatgtgggccatgag-3'
서열번호 15 ISG56 forward 5'-gcctccttgggttcgtctacaa-3'
서열번호 16 ISG56 reverse 5'-tcaaagtcagcagccagtctca-3'
그 결과, 인터페론-β의 발현 변화를 도 3에 그래프로 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라, 5'-말단에 하이드록시기를 갖더라도 굽힘 구조가 있는 RNA 올리고뉴클레오티드도 인터페론-β의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.
실험예 2. 짧은 길이의 헤어핀 RNA에 의한 인터페론-β의 발현 확인
상기 실험예 1에서 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 이때 인터페론-β의 발현에 영향을 미치는 RNA 올리고뉴클레오티드 부분의 확인을 위하여 굽힘 구조를 포함하는 더 짧은 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Bend-GC-8bp를 이용하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다.
단, 이때 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 5'-OH-control을 처리하였고, 양성 대조군은 폴리(I:C)[poly(I:C)]를 처리하였다. 실험군으로 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC의 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였고, 5'-OH-Bend-GC-8bp는 3번 실험을 수행하였다.
그 결과, 인터페론-β의 발현 변화를 도 4에 그래프로 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC를 처리한 경우 유의미한 수준으로 인터페론-β의 발현을 증가시켰다.
실험예 3. 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56 의 발현 확인
상기 실험예 2에서 확인된 5'-OH-Bend-GC-8bp 헤어핀 RNA에서 루프 부분을 제외한 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 이중나선 RNA인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum을 이용하여 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-Control을 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 5에 그래프로 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 염기서열이 상보적으로 결합된 최소 길이의 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum이 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰다.
실험예 4. 포스포로티오에이트 결합 또는 회귀성 구조로 연결된 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56의 발현 확인
본 발명에서 제작된 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되거나, 굽힘 구조를 갖는 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드가 회귀성 구조로 연결되어 2개의 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않은 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 6에 그래프로 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 치환하여 세포 내로 주입된 RNA 올리고뉴클레오티드 중 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 대해 저항성을 갖고, 나선형 굽힘 구조를 갖는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰다.
실험예 5. 긴 길이의 헤어핀 RNA에 의한 ISG56 의 발현 확인
본 발명에서 제작된 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, 긴 길이의 헤어핀 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-iav를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 7에 그래프로 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 나선형 굽힘 구조를 갖는 긴 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 증가시켰다.
따라서, 본 발명의 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 인터페론-β 및 ISG56의 우수한 발현 증가 활성을 나타내어, 면역 활성제로 사용할 수 있다.
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Claims (26)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, N1과 N6가 왓슨-크릭 결합을 형성하며, N2와 N5가 왓슨-크릭 결합을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G이고(서열번호 3에 해당), 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, N6는 C(서열번호 4에 해당)인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  4. 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, N1과 N6가 왓슨-크릭 결합을 형성하며, N2와 N5가 왓슨-크릭 결합을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G이고(서열번호 3에 해당), 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, N6는 C(서열번호 4에 해당)인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  7. 제4항에 있어서, 상기 루프가 적어도 4개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  8. 제4항에 있어서, 상기 루프가 4개 내지 80개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  9. 제4항에 있어서, 상기 루프가 4개 내지 50개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  10. 제7항에 있어서, 상기 루프가 UUCG 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  11. 제4항에 있어서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 19로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합 및 메틸포스포네이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형된 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나선형 굽힘 구조는, 상기 이중가닥에서 서열번호 1의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)와 서열번호 2의 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)가 각각 워블 염기쌍(wobble base pair)일 때 서열번호 1의 네 번째 염기(A) 및 서열번호 2의 다섯 번째 염기(U)에서 형성되는 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제.
  15. 제12항의 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제.
  16. 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, N1과 N6가 왓슨-크릭 결합을 형성하며, N2와 N5가 왓슨-크릭 결합을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G, N4는 C, N5는 G, 및 N6는 C(서열번호 18에 해당)인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  19. 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, N1과 N6가 왓슨-크릭 결합을 형성하며, N2와 N5가 왓슨-크릭 결합을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G, N4는 C, N5는 G, 및 N6는 C(서열번호 18에 해당)인 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  22. 제19항에 있어서, 상기 루프가 적어도 4개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  23. 제22항에 있어서, 상기 루프가 UUCG 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합 및 메틸포스포네이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형된 것을 특징으로 하는, RNA 올리고뉴클레오티드.
  25. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제.
  26. 제24항의 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역 활성제.
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