KR102223069B1

KR102223069B1 - Rna 올리고뉴클레오티드를 이용한 항암 면역 백신 조성물

Info

Publication number: KR102223069B1
Application number: KR1020190007967A
Authority: KR
Inventors: 최병석; 강석조; 이장현; 민지연
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2019-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2021-03-05
Also published as: KR20200091131A

Abstract

본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 항암 면역 백신 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 항암 면역 백신 조성물은 상기 RNA 올리고뉴클레오티드로 사멸시킨 암세포, 암세포의 세포용해산물 또는 파생물을 포함한다. 본 발명의 항암 면역 백신 조성물은 사멸된 암세포로부터 나온 사이토카인에 의해 면역체계가 활성화함으로써, 부작용이 적고 안정성이 높다.

Description

RNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 항암 면역 백신 조성물{COMPOSITION FOR ANTICANCER IMMUNE VACCINE USING RNA OLIGONUCLEOTIDE}

본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 항암 면역 백신 조성물에 관한 것이다.

인체에는 바이러스의 감염에 대응하기 위해 RIG-I(Retinoic acid inducible gene I)와 같은 핵산 감지 단백질 (nucleic acid sensor)이 존재한다. RIG-I는 침입한 병원체의 RNA를 인식하여 감염된 세포를 사멸시키기 위해 사멸 신호전달체계와 면역체계를 동시에 활성화시킨다. 면역체계는 사멸된 세포에서 나온 사이토카인에 의해 활성화된다. RIG-I의 이러한 성질을 이용하면 RIG-I 활성물질을 암세포에 투여하여 암세포를 사멸시키고, 사멸된 암세포에서 분비된 사이토카인들이 면역체계를 활성화시켜 암을 공격할 수 있다(Peter Duewell et al., Cell Death Differ., 2014, Vol.21, No. 12, 1825-1837).

구체적으로, RIG-I는 바이러스 RNA의 특징적인 구조 즉, 이중나선 구조와 5'-말단의 삼인산(triphosphate)을 선택적으로 결합하여 인식한다. 인플루엔자 바이러스의 RNA 프로모터도 이와 같은 구조를 가지기 때문에 RIG-I에 의해 인식되고, 인체의 면역반응을 활성화한다. 바이러스의 RNA는 RIG-I의 C-말단에 강하게 결합하고, RIG-I의 형태를 변화시켜 면역활성 신호를 전달하게 한다.

또한, 종양 세포에서 제 1형 인터페론 유전자 클러스터(cluster)의 인터페론-α 및 인터페론-β 유전자가 결실되어 있음이 보고된 이후, 인터페론은 종양의 성장에 중요한 인자로 알려져 1980년대부터 항암제로 사용되어 왔다(Jun Yoshida et al., Cancer Sci., 2004, Vol.95, No.11, 858-865). RIG-I는 바이러스의 이중나선 RNA에서 5'-말단에 존재하는 삼인산을 특이적으로 인식하여 인터페론 합성을 유도하여 면역반응을 활성화하므로, RIG-I를 표적으로 하는 항바이러스제, 항암제, 바이러스 백신, 암 백신 개발에 이용되고 있다.

최근 인체의 면역 시스템과 암세포의 상호작용에 대한 이해가 높아짐에 따라 인체의 면역 시스템을 보조하여 항암 효과를 갖는 면역 항암제가 출시되고 있다. 대표적으로 국내 시판이 허가된 여보이(Yerboy), 키트루다(Keytruda), 옵디보 (Opdivo) 등이 있다.

현재의 면역 항암제는 단백질기반 치료제나 세포기반 치료제로서, 단백질기반 치료제들은 대부분 항체들이고, 세포기반 치료제들은 T 세포를 과다발현시키는 방법, 또는 T 세포가 암을 공격하도록 변형하는 방법 등이 있다. 현재의 면역 항암제들은 높은 생산 단가 및 치료 비용 때문에 대다수의 환자들에게 접근성이 낮다. 특히 면역 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor)들 중 하나인 키트루다의 치료률은 33%로 낮다.

Jun Yoshida et al., Cancer Sci., 2004, Vol.95, No.11, 858-865. Peter Duewell et al., Cell Death Differ., 2014, Vol.21, No. 12, 1825-1837.

이에 본 발명자들은 부작용이 적고 효과적인 항암 면역 백신을 개발하기 위해 노력한 결과, RIG-I를 활성화시키는 RNA 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리하여 수득한 전세포 조성물이 암세포의 성장을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리하여 수득된 전세포 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암 면역 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 항암 면역 백신 조성물은 상기 RNA 올리고뉴클레오티드로 사멸시킨 암세포, 암세포의 세포용해산물 또는 파생물을 포함한다. 본 발명의 항암 면역 백신 조성물은 사멸된 암세포로부터 나온 사이토카인에 의해 면역체계가 활성화함으로써, 부작용이 적고 안정성이 높다. 또한, 면역 체계를 활성화시킬 수 있으므로, 다른 항암제들과 같이 사용할 수 있다. 그뿐만 아니라, 상기 항암 면역 백신 조성물은 면역 체계가 암세포를 기억하게 하여, 암의 재발 또는 전이를 효과적으로 차단할 수 있는 항암 면역 백신으로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드들의 서열 및 구조를 나타낸 도면이다.
도 1b는 인터페론-β 발현을 증가시키는 이중나선 굽힘 구조(RNA bend motif)를 갖는 RNA를 나타낸 도면이다. 빨간색 표시상자는 굽힘이 있는 부분이며, 주황색 핵산은 RNA 골격을 포스포로티오에이트로 변형한 부분을 나타낸다.
도 1c는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC에 의한 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 1d는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp에 의한 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 1e는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC Minimum에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 1f는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double Bend에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 1g는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 CBS-1, CBS-1-PS, CBS-4 및 CBS-7의 서열 및 구조를 나타낸 도면이다. 빨간색 표시상자는 굽힘이 있는 부분이며, 주황색 핵산은 RNA 골격을 포스포로티오에이트로 변형한 부분을 나타낸다.
도 2b는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오인 CBS-1, CBS-1-PS, CBS-4 및 CBS-7에 의한 ISG56 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 췌장암세포(Panc02), 간암세포(SNU886) 및 정상세포(HEK293)의 사멸효과를 확인한 도면이다.
도 4는 본 발명의 항암 면역 백신 조성물에 의한 항암효과를 마우스 모델에서 확인하기 위한 실험을 도식화한 도면이다.
도 5는 본 발명의 항암 면역 백신 조성물에 의한 항암효과를 마우스 모델을 통해 확인한 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리하여 수득된 전세포 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암 면역 백신 조성물로서, 상기 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기 i) 내지 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 어느 하나인 것인 항암 면역 백신 조성물을 제공한다.

상기 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 i) 서열번호 1(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

상기 i)의 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₁ 내지 N₆은 독립적으로 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 N₁ 내지 N₆은 독립적으로 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N₁은 G, N₂는 C, 그리고 N₃는 G일 수 있고(서열번호 3에 해당), 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₄는 C, N₅는 G, 그리고 N₆은 C일 수 있다(서열번호 4에 해당).

또한, 상기 i)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 일실시예에서, 나선형 굽힘 구조는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 각각 워블 염기쌍일 때 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U)에서 형성된다.

상기 나선형 굽힘 구조는 이중가닥 RNA가 이루는 평면을 기준으로 10 내지 90도, 구체적으로는, 30 내지 70도, 더욱 구체적으로는 40 내지 50도로 구부러진 형태를 갖는다.

상기 i)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기 [구조식 1]을 가질 수 있다.

[구조식 1]

상기 구조식 1에서,

N₁ 내지 N₆은 독립적으로 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 구체적으로는 G 또는 C일 수 있다. UㆍG 또는 GㆍU는 워블 염기쌍이다.

또한, 상기 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 ii) 서열번호 1(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 1로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

상기 ii)의 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₁ 내지 N₆은 독립적으로 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 N₁ 내지 N₆은 독립적으로 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N₁은 G, N₂는 C, 그리고 N₃는 G일 수 있고(서열번호 3에 해당), 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₄는 C, N₅는 G, 그리고 N₆은 C일 수 있다(서열번호 4에 해당).

또한, 상기 ii)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.

상기 헤어핀 RNA 구조에서 루프는 적어도 4개의 염기로 이루어질 수 있고, 예를 들어, 4 내지 80개, 4 내지 75개, 4 내지 70개, 4 내지 65개, 4 내지 60개, 4 내지 55개, 4 내지 50개, 4 내지 45개, 4 내지 40개, 4 내지 35개, 4 내지 30개, 4 내지 25개, 4 내지 20개, 4 내지 15개 또는 4 내지 10개의 염기로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서 상기 루프는 4개 또는 73개의 염기로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 루프를 구성하는 4개의 염기 서열은 UUCG이다.

또한, 상기 루프에서 이를 구성하는 일부의 염기서열이 서로 상보적인 경우 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 스템(stem) 구조를 가질 수 있다. 상기 스템 구조는 A 및 U 사이에 왓슨-크릭 염기쌍이 형성된 AU 모티프(motif)를 포함할 수 있다.

상기 AU 모티프는 10 내지 50개, 15 내지 40개, 20 내지 35개, 25 내지 30개의 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 AU 모티프는 26개의 연속된 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다.

상기 ii)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기 [구조식 2]를 가질 수 있다.

[구조식 2]

상기 구조식 2에서,

N₁ 내지 N₆은 상기 구조식 1에서 정의한 바와 같으며, L은 루프를 포함한 헤어핀일 수 있다. 구체적으로 L은 UUCG로 표시되는 4개의 염기서열일 수 있다.

나아가, 상기 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 iii) 서열번호 1(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 연결된 서열번호 17(5'-N₁GUAGAN₂N₃N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 17로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

상기 iii)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17로 표시되는 염기서열 2개가 회귀성 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 용어 "회귀성(palindromic) 구조"는 이중가닥을 형성하는 2개의 염기서열이 5'-말단에서 3'-말단의 방향으로 동일한 순서의 염기서열로 구성되는 구조를 나타낸다. 본 발명에서 상기 회귀성 구조는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 3'-말단이 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 5'-말단과 결합하여 단일가닥을 형성하고, 상기 형성된 단일가닥 2개가 서로 상보적으로 결합하여 형성된 이중가닥일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 단일가닥은 서열번호 18로 표시되는 염기서열일 수 있다.

상기 회귀성 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드의 이중가닥에서 나선형 굽힘 구조는 2개일 수 있다.

상기 iii)의 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N₁ 내지 N₆은 독립적으로 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 N₁ 내지 N₆은 독립적으로 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N₁은 G, N₂는 C, 그리고 N₃는 G, N₄는 C, N₅는 G, 그리고 N₆은 C일 수 있다(서열번호 18에 해당).

또한, 상기 iii)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.

상기 iii)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기 [구조식 3]을 가질 수 있다.

[구조식 3]

상기 구조식 3에 있어서,

N₁ 내지 N₆은 상기 구조식 1에서 정의한 바와 같다.

또한, 상기 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 iv) 서열번호 1(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 연결된 서열번호 17(5'-N₁GUAGAN₂N₃N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

상기 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N₁ 내지 N₆은 독립적으로 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 N₁ 내지 N₆은 독립적으로 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N₁은 G, N₂는 C, 그리고 N₃는 G, N₄는 C, N₅는 G, 그리고 N₆은 C일 수 있다(서열번호 18에 해당).

또한, 상기 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.

상기 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기 [구조식 4]를 가질 수 있다.

[구조식 4]

상기 구조식 4에서,

본 발명에 따른 i) 내지 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 엔도뉴클레아제에 의한 분해를 억제하고 생체 내 안정성 향상을 위해, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형될 수 있다. 본 발명에 따른 구체적인 일실시예에서 상기 변형은 적어도 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합이다.

또한, 본 발명에 따른 i) 내지 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드는 8 내지 100개, 8 내지 50개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 10 내지 100개, 10 내지 50개, 10 내지 30개, 20 내지 500개, 20 내지 300개, 10 내지 200개, 10 내지 100개, 20 내지 100개, 20 내지 90개 또는 20 내지 50개의 염기를 가질 수 있다.

본 발명자들은 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS의 RNA 올리고뉴클레오티드가 IFN-β 및 ISG56(Interferon-stimulated gene 56)의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 1d 내지 1f).

또한, 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS에 의한 췌장암세포(Panc02), 간암세포(SNU886) 및 정상세포(HEK293)의 세포 사멸 유도효과를 확인하였다(도 3).

나아가, 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 췌장암세포에 처리하여 수득한 전세포 조성물을 마우스에게 투여한 후, 췌장암세포를 상기 마우스에게 주입하였을 경우 췌장암세포의 증식이 억제됨을 확인하였다(도 5).

따라서, 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 항암 면역 백신 조성물은 항암 면역 활성을 나타냄으로, 이를 유효성분으로 포함하는 항암 면역 백신의 개발 및 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 전세포 조성물은 RNA 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리한 후, 수득한 사멸된 암세포, 상기 암세포의 세포용해산물 또는 이의 파생물을 포함할 수 있다.

상기 암세포의 세포용해산물 또는 파생물은 RNA 올리고뉴클레오티드에 의해 암세포가 분비한 사이토카인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 사이토카인은 IFN-β, IL-12, CXCL-10, IL-6 또는 IFN-γ일 수 있다.

또한, 상기 암세포의 세포용해산물 또는 파생물은 암세포가 발현하는 종양항원을 포함할 수 있다. 종양항원은 종양세포에만 발현하는 종양 특이적 항원이다. 상기 종양항원은 돌연변이에 의한 단백질, 종양 특이적 암유전자 또는 바이러스성 암유전자일 수 있다.

상기 암세포는 췌장암, 간암, 위암, 폐암, 대장암, 직장암, 갑상선암, 식도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 자궁경부암, 유방암, 피부암, 상피암, 뇌암, 중추신경암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있다.

본 발명의 항암 면역 백신 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예를 들어, 부형제, 담체, 희석제, 기타 보조제 등을 1종 이상 포함할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 항암 면역 백신 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 항암 면역 백신 조성물에 포함되는 암세포수를 기준으로 개체의 체중 kg당 1x10⁴ 내지 1x10⁸ 세포수가 될 수 있다. 이때 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명의 항암 면역 백신 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다. 상기 항암 면역 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용하는 용어 '항암 면역 백신'이란, 생체내의 전반적인 면역 반응을 향상시켜 암을 치료하는 비특이적 항암 치료 백신과 종양세포의 특정 항원에 대해 특이적인 면역반응을 유도하는 특이적 항암 치료 백신을 의미한다. 상기 비특이적 항암 치료 백신은 생체 내 면역 반응, 특히 T세포의 활성과 분화에 중요한 면역 보조 자극제를 이용하여 암환자의 전반적인 면역력을 향상시킨다. 상기 특이적 항암 치료 백신은 종양 항원을 기반으로 사용하거나 종양세포 자체를 항원으로 사용하여 종양 세포에 대한 특이적인 면역 반응을 유도한다.

본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. RNA 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 제조

인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시킬 수 있는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다.

먼저, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제작하였다. 반면, 서열번호 5 내지 10 및 서열번호 18로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖거나, 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 RNA 올리고뉴클레오티드는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies) 또는 다르마콘(Dharmacon)에 주문제작하였다.

이에 따라, 도 1a에 나타난 바와 같이, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-control 및 5'-PPP-control RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Bend-GC-8bp RNA 올리고뉴클레오티드 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS를 각각 제작하였다. 또한, 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Bend-GC RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 또한, 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 제작하였다. 또한, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Long-Bend RNA 올리고뉴클레오티드 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드의 말단 8개의 염기가 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Long-Bend-BPS를 제조하였다. 또한, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 구성되고, 이들 염기가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하며, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 아울러, 서열번호 18로 표시되는 염기서열 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.

실시예 2. RNA 올리고뉴클레오티드의 구조 확인

상기 실시예 1에서 제조된 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드의 구조를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 상기 실시예 1에서 제작된 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 mM 인산나트륨(pH 6.5), 0.01 mM EDTA, 10 (v/v)% D2O를 포함하는 완충액에 용해시킨 샘플을 제조하여 당업계에 공지된 방법으로 다양한 분광실험을 하였다. 이때, 2차원 NOE 분광실험(NOESY)은 400, 600 및 800 ㎒의 핵자기공명(NMR) 분광기(Bruker, USA)로 100 및 200 ㎳의 믹싱시간에서 하였다. 또한, 278 K의 온도에서 1H-15H HSQC(heteronuclear single quantum coherence) 분광실험, 125 ㎳ 믹싱시간에서 DQF-COSY(double quantum filtered correlated) 및 TOCSY(homonuclear total correlation) 분광실험, 30 ㎳ 믹싱시간에서 1H-31P HETCOR(heteronuclear correlation) 및 1H-31P Hetero-TOCSY 분광실험, 및 80, 150 및 250 ㎳ 믹싱시간에서 NOESY 분광실험을 하였다. 그 외에도, 1H-13C CT-HSQC, HCCH-COSY, 2D HCCH-relayed COSY, 2D HCCH-TOCSY 및 3D HCCH-TOCSY 분광실험들을 하였다.

NMR 분광실험 결과, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드의 염기 수소들과, H1', H2', H3', H4', H5'/H5''들의 NMR 피크들을 정하였다. NOESY 분광실험으로부터 약 563개의 NOE 거리 규정값(distance constraints)들을 구하였고, 거리 규정값들은 거리에 따라 3 내지 4개의 그룹들(예컨대, 1.8 내지 3.4 Å, 1.8 내지 5.0 Å 및 3.8 내지 7.0 Å, 또는 1.8 내지 3.4 Å, 2.5 내지 4.5 Å, 3.5 내지 6.0 Å 및 4.0 내지 7.0 Å)로 분류하였다. 비 왓슨-크릭 결합들에 대해서는 수소결합 제한을 두지 않았다. DQF-COSY에서 얻은 3JH1', H2' 값으로 δ 이면각(dihedral angle)을 구하였고, 모든 χ 이면각은 -158±15도로 고정하였다. 다른 이면각(예컨대, α, β, γ, ε, ζ)은 RNA의 A형 나선 구조로 제한하였다. 벌지(bulge) 부분은 몇몇 β 및 ε 이면각을 제외하고, 다른 이면각들은 제한하지 않았다. 잔류 쌍극 결합(residual dipolar coupling) 값들을 ±1 ㎐의 정확도로 민감성이 증가된 HSQC 실험으로 측정하였다. 또한, 특이값 분해(singular value decomposition)를 통해 얼라인먼트 텐서(alignment tensor)를 분석한 결과, -8.0 ㎐의 비등방성(anisotropy) 값과 0.32의 롬빅시티(rhombicity) 값을 얻었다. 모든 구조의 계산은 X-PLOR 3.1 및 CNS로 하였다. 100개의 구조를 거리 규정값에 따라 생성하여 3,000 K에서 10 ㎰ 동안 시뮬레이션 후, 50 ㎰ 동안 300 K에서 식히는 담금질 기법(simulated annealing)을 수행하였다. 거리 힘 상수(distance force constant)는 50 ㎉/mol/Å로 유지하였고, 이면각 상수는 20 ㎉/mol/Å에서 400 ㎉/mol/Å로 변화시켰다. 제일 낮은 에너지 상태의 구조들은 300 K에서 20 ㎰로 정제하였고, 마지막 5 ㎰는 제한된 에너지 최적화(restrained energy minimization)를 하였다. 이로부터 얻어진 총 220개의 구조들은 22개의 잔류 쌍극 결합 규정 값들을 추가하여 정제하였고, 이때 잔류 쌍극 결합의 힘 상수 값은 3.0 ㎉/mol을 유지하였다. 최종적으로 32개의 구조를 얻었으며, 이를 Insight II(Biosym Technologies, USA) 및 CURVES 5.2 소프트웨어로 분석하였다.

그 결과 도 1b에 나타난 바와 같이, 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav RNA 올리고뉴클레오티드는 나선형 굽힘 구조를 형성하고 있었다. 이와 같은 나선형 굽힘 구조는 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav를 구성하는 서열 중, 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'로 표시되는 서열로 구성된 두 개의 단일 가닥이 비 왓슨-크릭 결합을 통해 이중가닥을 형성하며 생성되는 구조로 확인되었다. 따라서, 상기 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'로 표시되는 서열을 포함하는 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC, 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, 5'-OH-16mer-Double-Bend, 5'-OH-Long-Bend 및 5'-OH-Long-Bend-BPS 올리고뉴클레오티드도 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 알 수 있었다.

실험예 1. RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 인터페론-β의 발현 확인

상기 실시예 1에서 제조된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드들이 인터페론-β의 발현을 증가시키는지 확인하였다.

실험예 1.1. 세포주의 준비

먼저, 100 ㎜ 조직배양 플레이트에 3x10⁶개의 HEK293T 세포(ATCC, USA)를 10%(v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, 미국)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 7 ㎖에 분주하고, 이를 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 동안 배양하여 세포주를 준비하였다.

실험예 1.2. RNA 올리고뉴클레오티드의 처리

상기 실험예 1.1.에서 준비한 세포주에 상기 실시예 1에서 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.

먼저, 상기 배양된 세포에 트립신-EDTA(Gibco, 미국)를 처리하여 세포들을 떼어내고, 이를 계수하여 6-웰(well) 플레이트에 1x10³개가 되도록 분주하였다. 그 후, 이를 37℃, 5% CO₂의 조건에서 42시간 동안 배양하고, 배지를 제거한 뒤, FBS가 포함되지 않은 400 ㎕ OPTI-MEM 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.

RNA 올리고뉴클레오티드의 처리는, 1 μM의 5'-PPP-control, 5'-PPP-iav, 5'-OH-control, 5'-OH-iav, 5'-OH-Bend-GC 각각에 4 ㎕의 리포펙타민 LTX, 및 1.6 ㎕의 플러스-시약을 혼합하여, 이를 200 ㎕씩 세포에 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 다시 37℃, 5% CO₂의 조건에서 4시간 동안 배양하였고, 이때, 양성대조군으로는 RIG-I 리간드로 알려진 폴리(I:C)[poly(I:C)]를, 음성대조군으로는 배지만 처리하였다. 4시간 후, 배지를 제거하고, 10%(v/v) FBS를 포함하는 2 ㎖의 DMEM 배지를 넣어 37℃, 5% CO₂의 조건에서 2시간을 더 배양하였다.

실험예 1.3. 인터페론-β의 발현 확인

상기 서술한 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리한 세포에서 인터페론-β의 발현을 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 RNA를 분리하였다.

먼저, 배지를 제거하고 500 ㎕의 TRI-시약(Ambion, 미국)으로 세포를 회수한 뒤, 모아진 세포에 클로로포름을 넣어 RNA 층을 분리하였다. 여기에 이소프로판올을 첨가하여 펠렛(pellet)을 만들고, 상기 펠렛을 75% 에탄올로 세척 및 건조시킨 뒤, 멸균된 증류수에 녹였다. 이렇게 분리된 RNA에 DNase(Promega, 미국)를 첨가하여 30분 동안 상온에서 처리하여 오염된 DNA를 제거하였고, 정지용액(stop solution)으로 이를 불활성화하였다. 그 후, 슈퍼스크립트 III 역전사효소(Invitrogen, 미국)를 이용하여 50℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.

이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 실시간 PCR은 h-tag DNA 중합효소(solgent, 대한민국), dNTP, 염화테트라에틸암모늄(tetraethylammonium chloride), 에바그린 염료(evagreen dye, Biotium, USA), 및 표적 유전자인 인터페론-β 및 대조 유전자인 GAPDH를 위한 프라이머를 혼합하여 수행하였다. 실시간 PCR은 95℃에서 15분 동안 고정한 후, 95℃ 20초, 60℃ 40초, 및 72℃ 20초를 1회로 총 40회를 반복하였다. 이때, 인터페론-β 및 GAPDH를 표적으로 하는 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.

서열번호	이름	서열
서열번호 11	인터페론-β forward	5'-ggaggacgccgcattgac-3'
서열번호 12	인터페론-β reverse	5'-caatagtctcattccagccagtgc-3'
서열번호 13	GAPDH forward	5'-gcattgccctcaacgaccac-3'
서열번호 14	GAPDH reverse	5'-gaggccatgtgggccatgag-3'
서열번호 15	ISG56 forward	5'-gcctccttgggttcgtctacaa-3'
서열번호 16	ISG56 reverse	5'-tcaaagtcagcagccagtctca-3'

도 1c에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라, 5'-말단에 하이드록시기를 갖더라도 나선형 굽힘 구조가 있는 5'-OH-Bend-GC RNA 올리고뉴클레오티드도 인터페론-β의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.

실험예 2. 짧은 길이의 헤어핀 RNA에 의한 인터페론-β의 발현 확인

상기 실험예 1에서 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β의 발현을 증가시키는지 확인하였다. 이때 인터페론-β의 발현에 영향을 미치는 RNA 올리고뉴클레오티드 부분의 확인을 위하여 굽힘 구조를 포함하는 더 짧은 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Bend-GC-8bp를 이용하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다.

단, 이때 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 5'-OH-control을 처리하였고, 양성 대조군은 폴리(I:C)[poly(I:C)]를 처리하였다. 실험군으로 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC의 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였고, 5'-OH-Bend-GC-8bp는 3번 실험을 수행하였다.

그 결과, 인터페론-β의 발현 변화를 도 1d에 그래프로 나타내었다.

도 1d에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC를 처리한 경우 유의미한 수준으로 인터페론-β의 발현을 증가시켰음을 확인하였다.

실험예 3. 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56의 발현 확인

상기 실험예 2에서 확인된 5'-OH-Bend-GC-8bp 헤어핀 RNA에서 루프 부분을 제외한 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 이중나선 RNA인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum을 이용하여 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.

모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-Control을 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.

그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 1e에 그래프로 나타내었다.

도 1e에 나타낸 바와 같이 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열이 상보적으로 결합된 최소 길이의 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum이 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.

실험예 4. 포스포로티오에이트 결합 또는 회귀성 구조로 연결된 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56의 발현 확인

본 발명에서 제작된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되거나(5'-OH-Bend-GC-8bp-PS), 나선형 굽힘 구조를 갖는 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드가 회귀성 구조로 연결되어 2개의 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드(5'-OH-16mer-Double-Bend)가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.

모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않은 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.

그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 1f에 그래프로 나타내었다.

도 1f에 나타낸 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 치환하여 세포 내로 주입된 RNA 올리고뉴클레오티드 중 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 대해 저항성을 갖고, 나선형 굽힘 구조를 갖는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.

실험예 5. 긴 길이의 헤어핀 RNA에 의한 ISG56의 발현 확인

본 발명에서 제작된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, 긴 길이의 헤어핀 RNA 올리고뉴클레오티드(5'-OH-Long_Bend)가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.

모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-iav를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.

그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 1g에 그래프로 나타내었다.

도 1g에 나타난 바와 같이, 나선형 굽힘 구조를 갖는 긴 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 증가시켰음을 확인하였다.

실험예 6. RNA 올리고뉴클레오티드의 암세포 사멸 유도 효과 확인

실험예 6.1. 세포주의 준비 및 RNA 올리고뉴클레오티드 처리

먼저, 24-웰 플레이트의 각 웰에, 0.5x10⁵ 개의 Panc02 세포(Prof. Dr. med. Christiane Bruns, Universittsklinikum Magdeburg), SNU886 세포 (Korean Cell Line Bank, Republic of Korea) 또는 정상세포 (HEK293; ATCC, USA) 및 50배 희석시킨 2x 비타민 (Gibco, USA)과 2x NEAA (Non-essential Amino Acid solution; Sigma, USA)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; WELGENE, USA) 배지 300 ㎕를 분주하였다.

한편, 1 ㎍/㎖의 RNA 올리고뉴클레오티드(CBS-1, CBS-7 또는 CBS-13-BPS)와 폴리(I:C)[poly(I:C)] (Invivogen, USA)를 각각 40 ㎕의 OPTI-MEM(Gibco, USA)과 섞어주었다. 그리고, 1 ㎕의 리포펙타민 LTX (Invitrogen, USA) 및 0.6 ㎕의 플러스-시약 (Invitrogen, USA)을 혼합하여, 이를 40 ㎕의 OPTI-MEM (Gibco, USA)에 넣고 상온에서 5분간 반응시켰다. 그 후, 준비된 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 폴리(I:C)[poly(I:C)]의 혼합물 40 ㎕와 리포펙타민-플러스시약의 혼합물 40 ㎕을 각각 혼합하고, 20분간 상온에 두어 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 Poly I:C와 리포펙타민이 서로 결합체를 이룰 수 있도록 하였다.

그 후, 80 ㎕의 RNA 올리고뉴클레오티드-리포펙타민 결합체를 Panc02 세포, SNU886 세포, 또는 HEK293 세포가 들어있는 웰에 투여하였고, 상기 세포를 다시 37℃, 5% CO²의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, 양성대조군으로는 RIG-I 리간드로 알려진 폴리(I:C)[poly(I:C)]를, 음성대조군으로는 배지와 CBS-1만 처리하였다.

실험예 6.2. 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 올리고뉴클레오티드의 암세포 사멸 유도 효과 확인

실험예 6.1과 같이 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 폴리(I:C)[poly(I:C)]를 처리한 세포주를 0.25%(v/v) 트립신-EDTA (Gibco, USA)를 사용해 5 ㎖ 둥근바닥(round-bottom) 튜브에 회수한 뒤, 1500 rpm의 속도로 40℃에서 5분간 스핀-다운(spin-down)하여 상등액을 제거하였다. 그 후, 세포들을 FITC가 결합된 아넥신(Annexin) V (Biolegend, USA)와 7-아미노액티노마이신 D (7-AAD; BD Bioscience, USA)를 포함한 100 ㎕의 1x 결합 버퍼 (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에서 암실에서 15분간 염색하였다. 그 후, 염색된 세포들을 LSRFortessa flow cytometry (BD Bioscience, USA)로 측정하였고, FlowJo software (Treestar, USA)를 통해 측정결과를 분석하였다.

그 결과, 세포사멸에 의해 사멸한 세포의 비율을 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 하이드록시기를 갖고 굽힘 구조가 있는 CBS-7 올리고뉴클레오티드와 CBS-13-BPS 올리고뉴클레오티드가 유의미한 수준으로 췌장암 세포주와 간암세포주의 사멸을 유도한 반면, 정상세포주의 사멸을 유도하지 않았다.

실시예 3. 전세포 조성물에 의한 항암 효과 확인

실시예 3.1. 암세포주 및 마우스 준비

마우스 췌장암 세포인 Panc02 세포(Professor. Christiane Bruns; University Hospital Magdeburg 무상제공)는 10%(v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, 미국), 2x MEM NEAA (Non-essential Amino Acids, Sigma, 미국) 및 2x MEM Vitamin (Sigma, 미국)가 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle' medium)에 배양하였다. 마우스는 C57BL/6J 마우스를 사용하였다.

실시예 3.2. RNA 올리고뉴클레오티드를 이용한 전세포 조성물 제조

먼저, RNA 올리고뉴클레오티드 처리에 앞서, Panc02 세포는 5 개의 100 mm 조직배양 플레이트에 각 2x10⁶개(총 10⁷개)가 되도록 2 ㎖씩 분주하였다. 그 후, 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드는 Panc02 세포에 형질주입 (transfection)에 앞서 95℃에서 5분간 처리하여 변성(denaturation) 시킨 후, 천천히 온도를 낮추어 어닐링(annealing)시켜 준비하였다. RNA 올리고뉴클레오티드의 처리는, 1 ㎍/㎖의 CBS-13-BPS 또는 Poly I:C와 400 ㎕ 리포펙타민 LTX 및 132 ㎕ 플러스-시약을 OPTI-MEM (Gibco, 미국)에 각각 혼합하여 상온에서 5분간 배양하였다 (총 5.5 ㎖). 두 혼합물을 함께 혼합 후, 상온에서 20분간 배양하였다. 그 후, CBS-13-BPS 또는 Poly I:C와 리포펙타민 LTX 및 플러스-시약 혼합물을 플레이트당 1 ㎖씩 떨어뜨려 처리 후, 상기 세포를 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 동안 배양하였다.

24시간 배양 후, CBS-13-BPS 또는 Poly I:C 처리에 의해 세포 사멸 (apoptosis)가 유도된 세포만을 얻어내기 위해, 배지만 얻어내어 그 안의 사멸된 세포의 수를 트리판 블루(trypan blue) 염색을 통해 계산하였다. 얻어진 사멸된 세포는 0.1 ㎖ PBS에 5x10⁵개가 되도록 분주하여 준비하였다.

실시예 3.3. 전세포 조성물 투여에 따른 암세포 증식 억제 확인

실시예 3.2에서 준비된 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 Poly I:C 처리에 의해 유도된 사멸세포를 29 gauge/ 1 ㎖ 주사기를 이용하여 피하주사법 (subcutaneous injection)으로 비 이식부위 (오른쪽 등)에 주입하였다.

일주일 후, C57BL/6J 마우스에 새로운 Panc02 세포를 이식하였다. Panc02 세포를 0.1 ㎖ PBS에 5x10⁵개 세포를 분주하여 준비하였다. C57BL/6J 마우스는 암세포 이식 전, 아이소플루레인(isoflurane, 제품명; 테렐액, 경보제약, 한국)을 이용하여 흡입 마취 후, 이식 부위 (왼쪽 등)의 털을 면도하였다. 준비된 암세포는 29 gauge/ 1 ㎖ 주사기를 이용하여 피하주사법 (subcutaneous injection)으로 주입하였다.

전세포 조성물 투여에 따른 암세포 증식을 확인하기 위해 음성대조군은 PBS 주입하였다. 실험군 1에는 CBS-13-BPS를 처리하여 수득한 전세포 조성물을 투여하였고, 실험군 2에는 Poly I:C를 처리하여 수득한 전세포 조성물을 투여하였다.

모든 대조군 및 실험군은 새로운 암세포 이식한 날로부터 7일 후, 종양 관찰 시기를 기점으로 하여 캘리퍼 (caliper)를 이용하여 종양을 크기를 재었다. 종양의 크기는 종양의 장축 (L)과 단축 (W)을 측정하였다. 종양의 부피 (Volume; V)를 계산함으로써 각 군의 암세포의 증식을 비교하였다. 종양의 부피는 다음의 공식으로 계산하였다. V = (L X W²)/2

그 결과, 전세포 조성물 투여에 따른 암세포 크기 변화를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 하이드록시기를 갖고 굽힘 구조가 있는 CBS-13-BPS 올리고뉴클레오티드에 의해 사멸된 암세포를 투여받은 실험군은 새로운 종양의 생성이 억제되었다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> COMPOSITION FOR ANTICANCER IMMUNE VACCINE USING RNA OLIGONUCLEOTIDE <130> FPD/201901-0026 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 1 nguagann 8 <210> 2 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 2 nnuuugcn 8 <210> 3 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 3 gguagacg 8 <210> 4 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 4 cguuugcc 8 <210> 5 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control RNA oligonucleotide <400> 5 gagcagaaac aaggcuucgg ccuuguuucu gcuc 34 <210> 6 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iav RNA oligonucleotide <400> 6 gaguagaaac aaggcuucgg ccugcuuuug cuc 33 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bend-GC-8bp RNA oligonucleotide <400> 7 gguagacguu cgcguuugcc 20 <210> 8 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bend-GC RNA oligonucleotide <400> 8 gguagacgcg cgcguucgcg cgcgcguuug cc 32 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cont-GC-8bp RNA oligonucleotide <400> 9 ggcagacguu cgcgucugcc 20 <210> 10 <211> 89 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Long_Bend RNA oligonucleotide <400> 10 gguagacgaa accagauaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaauaauuuu uuuuuuuuuu 60 uuuuuuuuuu uuaucugguu ucguuugcc 89 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interferon-beta forward primer <400> 11 ggaggacgcc gcattgac 18 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interferon-beta reverse primer <400> 12 caatagtctc attccagcca gtgc 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 13 gcattgccct caacgaccac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 14 gaggccatgt gggccatgag 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG56 forward primer <400> 15 gcctccttgg gttcgtctac aa 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG56 reverse primer <400> 16 tcaaagtcag cagccagtct ca 22 <210> 17 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 17 nguagannnn uuugcn 16 <210> 18 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 18 gguagacgcg uuugcc 16

Claims

이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리하여 수득된 전세포 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암 면역 백신 조성물로서, 상기 이중나선 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 하기 i) 내지 iv)의 RNA 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 어느 하나인 것인 항암 면역 백신 조성물:
i) 서열번호 1(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드;
ii) 서열번호 1(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 1로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드;
iii) 서열번호 1(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 연결된 서열번호 17(5'-N₁GUAGAN₂N₃N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 17로 표시되는 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드;
iv) 서열번호 1(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드와 서열번호 2(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드가 연결된 서열번호 17(5'-N₁GUAGAN₂N₃N₄N₅UUUGCN₆-3')로 표시되는 올리고뉴클레오티드 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 올리고뉴클레오티드의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드.
제 1항에 있어서,
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₁ 내지 N₆은 독립적으로 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N₁은 G, N₂는 C, N₃는 G이고, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₄는 C, N₅는 G, N₆는 C인 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지는 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 올리고뉴클레오티드에 존재하는 포스포다이에스테르 결합 중 적어도 하나가 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합 및 메틸포스포네이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 결합으로 변형된 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 나선형 굽힘 구조는, 상기 이중가닥에서 서열번호 1의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)와 서열번호 2의 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)가 각각 워블 염기쌍(wobble base pair)일 때 서열번호 1의 네 번째 염기(A) 및 서열번호 2의 다섯 번째 염기(U)에서 형성되는 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 루프가 4개 내지 80개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항암 면역 백신 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 루프가 UUCG로 표시되는 염기서열을 갖는 것인, 항암 면역 백신 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 전세포 조성물은 RNA 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리한 후, 수득한 사멸된 암세포, 상기 암세포의 세포용해산물 또는 이의 파생물을 포함하는 것인, 항암 면역 백신 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 암세포는 췌장암, 간암, 위암, 폐암, 대장암, 직장암, 갑상선암, 식도암, 신장암, 방광암, 전립선압, 자궁경부암, 유방암, 피부암, 상피암, 뇌암, 중추신경암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는 암세포인, 항암 면역 백신 조성물.