KR20170044577A

KR20170044577A - Rna 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제

Info

Publication number: KR20170044577A
Application number: KR1020160098129A
Authority: KR
Inventors: 최병석; 이장현
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2017-04-25
Also published as: KR101881502B1

Abstract

본 발명은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명에 따른 특정 서열과 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 세포주에 처리하면 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시키고 항바이러스 활성을 나타내므로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 항바이러스제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제{ANTIVIRAL AGENT COMPRISING RNA OLIGONUCLEOTIDE}

본 발명은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제에 관한 것이다.

인터페론은 핵이 존재하는 대부분의 세포로부터 유래하는 당단백질로, 바이러스의 복제를 억제하여 항바이러스 성질을 갖는다. 인터페론은 세포 표면 세포막의 특정 수용체와 결합하여 일련의 세포 내 반응과 면역 조절 반응을 나타낸다. 이러한 세포 내 반응에는 특정 효소들의 활성화 유도 등이 있고, 면역 조절 반응으로서는 대식세포의 식세포작용 활성 증가, 표적 세포에 대한 임파구의 세포독성 증가 및 바이러스에 감염된 세포들의 바이러스 증식 억제 등이 있다.

인터페론은 물리화학적 및 기능적 특징에 따라 1형과 2형으로 분류된다. 1형 인터페론에는 인터페론-α, -β, -τ 및 -ω가 있고, 2형 인터페론에는 인터페론-γ가 있다. 이 중 인터페론-β는 분자량이 약 20 kDa이고, 약 20%의 당을 함유하며 166개의 아미노산으로 구성된 단일 사슬의 단백질이다.

현재 재조합 인터페론-β는 인터페론-α와 함께 B형 및 C형 간염 바이러스와 같은 다양한 바이러스에 의해 발생하는 질환의 치료제로 사용되고 있고, 유두종 바이러스에 의한 감염의 재발을 억제하는 면역 증강제(adjuvant)로 사용될 수 있음이 보고되어 있다(Gross G. et al., Dermatology, 1998;196(3):330-4).

한편, 최근 RNA 올리고뉴클레오티드를 사용하여 면역반응을 증가시킴으로써 다양한 질환의 치료에 사용하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 미국 특허공개 제2012/0288476호는 5'-말단에 포스페이트기(phosphate group)가 결합되고, 캡(cap)이 없는 상태의 올리고뉴클레오티드가 1형 인터페론, 인터루킨-18, 인터루킨-1β 등의 발현을 증가시켜 항바이러스제로 사용될 수 있음을 개시하고 있다.

또한, 미국 특허공개 제2012/0121551호는 4개의 뉴클레오티드로 구성된 RNA가 인터페론-α의 활성을 유도하여 면역반응을 촉진함으로써, 질환의 치료 목적으로 사용될 수 있음을 개시하고 있다.

상기 공개된 RNA들은 모두 5'-말단에 트리포스페이트기를 포함한다는 공통점이 있다. 이와 같이 RNA가 이의 5'-말단에 캡이 존재하지 않고, 트리포스페이트기를 포함하면 세포 내의 RIG-I(retinoic acid-inducible gene I) 단백질과 결합하여 인터페론의 발현을 활성화시키는 것이 알려져 있다.

미국 특허공개 제2012/0288476호 미국 특허공개 제2012/0121551호

Gross G. et al., Dermatology, 1998;196(3):330-4

본 발명자들은 인터페론-β 또는 인터페론-β에 의해 발현되는 인터페론 활성인자 56(interferon stimulated gene 56; ISG56)의 발현을 증가시킬 수 있는 물질을 연구하던 중, 기존에 알려진 바와 달리, 5'-말단에 트리포스페이트기가 없어도 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시키고 항바이러스 활성을 나타내어, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 항바이러스제로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃N₄N₅UUUGCN₆-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃N₄N₅UUUGCN₆-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.

본 발명에 따른 특정 서열과 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 세포주에 처리하면 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시키고 항바이러스 활성을 나타내므로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 항바이러스제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드들의 서열 및 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-iav 또는 5'-PPP-iav의 구조를 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드들에 의한 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp에 의한 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC Minimun에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double Bend에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend-BPS에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-Long_Bend의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 웨스턴 블랏(A) 및 플라크 어세이(B)로 확인한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend Short의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 웨스턴 블랏으로 확인한 도면이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend-BPS의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 웨스턴 블랏으로 확인한 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.

본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 8 내지 100개, 8 내지 50개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 10 내지 100개, 10 내지 50개, 10 내지 30개, 20 내지 500개, 20 내지 300개, 10 내지 200개, 10 내지 100개 또는 20 내지 50개의 염기를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서 RNA 올리고뉴클레오티드는 단일가닥으로는 8개 내지 16개, 이중가닥으로는 16개 내지 32개일 수 있다.

상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₁ 내지 N₆은 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 구체적으로는 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N₁은 G, N₂는 C, 그리고 N₃는 G일 수 있고(서열번호 3에 해당), 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₄는 C, N₅는 G, 그리고 N₆은 C일 수 있다(서열번호 4에 해당).

상기 염기서열을 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥을 형성할 때, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 워블 염기쌍(wobble base pair), 즉, 비 왓슨-크릭 염기쌍을 형성한다.

또한, 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 일실시예에서, 나선형 굽힘 구조는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 각각 워블 염기쌍일 때 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U)에서 형성된다.

상기 나선형 굽힘 구조는 이중가닥 RNA가 이루는 평면을 기준으로 10 내지 90도, 구체적으로는, 30 내지 70도, 더욱 구체적으로는 40 내지 50도로 구부러진 형태를 갖는다.

본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의한 분해를 억제하고 생체 내 안정성 향상을 위해, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합(phosphodiester bond) 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형될 수 있다. 본 발명에 따른 구체적인 일실시예에서 상기 변형은 적어도 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합이다.

또한, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.

본 발명의 헤어핀 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는, 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 포스포로티오에이트 결합은 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 모든 뉴클레오티드 또는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 구성하는 뉴클레오티드 사이에 형성될 수 있다.

상기 헤어핀 RNA 구조에서 루프는 4 내지 80개, 4 내지 75개, 4 내지 70개, 4 내지 65개, 4 내지 60개, 4 내지 55개, 4 내지 50개, 4 내지 45개, 4 내지 40개, 4 내지 35개, 4 내지 30개, 4 내지 25개, 4 내지 20개, 4 내지 15개 또는 4 내지 10개의 염기로 이루어질 수 있고, 본 발명에 따른 일실시예에서 상기 루프는 4개, 15개, 16개, 55개, 64개 또는 73개의 염기로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 루프를 구성하는 4개의 염기 서열은 UUCG일 수 있다.

또한, 상기 루프에서 이를 구성하는 일부의 염기서열이 서로 상보적인 경우 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 스템(stem) 구조를 가질 수 있다. 상기 스템 구조는 A 및 U 사이에 왓슨-크릭 염기쌍이 형성된 AU 모티프(motif)를 포함할 수 있다.

상기 AU 모티프는 10 내지 50개, 15 내지 40개, 20 내지 35개, 25 내지 30개의 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 AU 모티프는 26개의 연속된 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 헤어핀 RNA 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 표시되는 염기서열일 수 있다.

또한, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃N₄N₅UUUGCN₆-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.

구체적으로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17로 표시되는 염기서열 2개가 회귀성 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 용어 "회귀성(palindromic) 구조"는 이중가닥을 형성하는 2개의 염기서열이 5'-말단에서 3'-말단의 방향으로 동일한 순서의 염기서열로 구성되는 구조를 나타낸다. 본 발명에서 상기 회귀성 구조는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 3'-말단이 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 5'-말단과 결합하여 단일가닥을 형성하고, 상기 형성된 단일가닥 2개가 서로 상보적으로 결합하여 형성된 이중가닥일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 단일가닥은 서열번호 18로 표시되는 염기서열일 수 있다.

상기 회귀성 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드의 이중가닥에서 나선형 굽힘 구조는 2개일 수 있다.

또한, 상기 회귀성 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 RNA 올리고뉴클레오티드에서 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합은 상술한 바와 같은 다른 결합으로 치환될 수 있다.

또한, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃N₄N₅UUUGCN₆-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.

상기 헤어핀 구조의 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 회귀성 구조를 갖고, 2개의 나선형 굽힘 구조를 가질 수 있다. 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드에서 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합은 상술한 바와 같은 다른 결합으로 치환될 수 있다.

본 발명자들은 이중가닥 RNA 또는 헤어핀 RNA 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하여(도 1), 그 중 5'-OH-iav 또는 5'-PPP-iav가 나선형 굽힘 구조를 갖고(도 2), 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 및 ISG56의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 3 내지 도 8).

또한, 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 나타냄을 확인하였다(도 9 내지 도 11).

따라서, 본 발명에 따른 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 인터페론-β 및 ISG56의 발현을 증가시키고 항바이러스 활성을 나타내므로, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 항바이러스제로 유용하게 사용될 수 있다.

일례로, 본 발명에 따른 항바이러스제는, RNA를 유전자로 갖고 있는 바이러스의 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 RNA 바이러스의 구체적인 예로는, C형 간염 바이러스, 뎅기 바이러스, 급성 호흡기 증후군 바이러스, 메르스 코로나 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 소낭성 구내염 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 등이 있다.

또한, 상기 항바이러스제는 DNA를 유전자로 갖고 있는 바이러스의 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 DNA 바이러스의 구체적인 예로는 B형 간염 바이러스가 있다.

상기 항바이러스제는 항바이러스제 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항바이러스제는 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 항바이러스제는 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항바이러스제의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 항바이러스제에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 항바이러스제에 포함되는 RNA 올리고뉴클레오티드의 유효량은 세포 내 농도가 1 내지 1,000 nM, 구체적으로는 100 내지 500 nM이 되도록 한다. 이때 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명의 항바이러스제는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. RNA 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 제조

인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시킬 수 있는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다.

먼저, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제작하였다. 반면, 서열번호 5 내지 10 및 서열번호 18 내지 20으로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖거나, 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 RNA 올리고뉴클레오티드는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies) 또는 다르마콘(Dharmacon)에 주문제작하였다.

이에 따라, 도 1에 나타난 바와 같이, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-control 및 5'-PPP-control RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 7 또는 8로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Int-NS1 및 5'-OH-Bend-GC RNA 올리고뉴클레오티드를 각각 제작하였다. 또한, 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Cont-GC-8bp RNA 올리고뉴클레오티드, 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Cont-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드 제작하였다. 또한, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Bend-GC-8bp RNA 올리고뉴클레오티드, 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 구성되고, 이들 염기가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하며, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 아울러, 서열번호 18로 표시되는 염기서열 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 19로 표시되는 염기서열로 구성되고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드, 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합의 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 나아가, 서열번호 20으로 표시되는 염기서열로 구성되고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Long_Bend Short RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.

실시예 2. RNA 올리고뉴클레오티드의 구조 확인

상기 실시예 1에서 제조된 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드의 구조를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 상기 실시예 1에서 제작된 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 mM 인산나트륨(pH 6.5), 0.01 mM EDTA, 10 (v/v)% D₂O를 포함하는 완충액에 용해시킨 샘플을 제조하여 당업계에 공지된 방법으로 다양한 분광실험을 하였다. 이때, 2차원 NOE 분광실험(NOESY)은 400, 600 및 800 ㎒의 핵자기공명(NMR) 분광기(Bruker, USA)로 100 및 200 ㎳의 믹싱시간에서 하였다. 또한, 278 K의 온도에서 ¹H-¹⁵H HSQC(heteronuclear single quantum coherence) 분광실험, 125 ㎳ 믹싱시간에서 DQF-COSY(double quantum filtered correlated) 및 TOCSY(homonuclear total correlation) 분광실험, 30 ㎳ 믹싱시간에서 ¹H-³¹P HETCOR(heteronuclear correlation) 및 ¹H-³¹P Hetero-TOCSY 분광실험, 및 80, 150 및 250 ㎳ 믹싱시간에서 NOESY 분광실험을 하였다. 그 외에도, ¹H-¹³C CT-HSQC, HCCH-COSY, 2D HCCH-relayed COSY, 2D HCCH-TOCSY 및 3D HCCH-TOCSY 분광실험들을 하였다.

NMR 분광실험 결과, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드의 염기 수소들과, H1', H2', H3', H4', H5'/H5''들의 NMR 피크들을 정하였다. NOESY 분광실험으로부터 약 563개의 NOE 거리 규정값(distance constraints)들을 구하였고, 거리 규정값들은 거리에 따라 3 내지 4개의 그룹들(예컨대, 1.8 내지 3.4 Å, 1.8 내지 5.0 Å 및 3.8 내지 7.0 Å, 또는 1.8 내지 3.4 Å, 2.5 내지 4.5 Å, 3.5 내지 6.0 Å 및 4.0 내지 7.0Å)로 분류하였다. 비 왓슨-크릭 결합들에 대해서는 수소결합 제한을 두지 않았다. DQF-COSY에서 얻은 ³J_H1' _, _H2' 값으로 δ 이면각(dihedral angle)을 구하였고, 모든 χ 이면각은 -158±15도로 고정하였다. 다른 이면각(예컨대, α, β, γ, ε, ζ)은 RNA의 A형 나선 구조로 제한하였다. 벌지(bulge) 부분은 몇몇 β 및 ε 이면각을 제외하고, 다른 이면각들은 제한하지 않았다. 잔류 쌍극 결합(residual dipolar coupling) 값들을 ±1 ㎐의 정확도로 민감성이 증가된 HSQC 실험으로 측정하였다. 또한, 특이값 분해(singular value decomposition)를 통해 얼라인먼트 텐서(alignment tensor)를 분석한 결과, -8.0 ㎐의 비등방성(anisotropy) 값과 0.32의 롬빅시티(rhombicity) 값을 얻었다. 모든 구조의 계산은 X-PLOR 3.1 및 CNS로 하였다. 100개의 구조를 거리 규정값에 따라 생성하여 3,000 K에서 10 ㎰ 동안 시뮬레이션 후, 50 ㎰ 동안 300 K에서 식히는 담금질 기법(simulated annealing)을 수행하였다. 거리 힘 상수(distance force constant)는 50 ㎉/mol/Å로 유지하였고, 이면각 상수는 20 ㎉/mol/Å에서 400 ㎉/mol/Å로 변화시켰다. 제일 낮은 에너지 상태의 구조들은 300 K에서 20 ㎰로 정제하였고, 마지막 5 ㎰는 제한된 에너지 최적화(restrained energy minimization)를 하였다. 이로부터 얻어진 총 220개의 구조들은 22개의 잔류 쌍극 결합 규정 값들을 추가하여 정제하였고, 이때 잔류 쌍극 결합의 힘 상수 값은 3.0 ㎉/mol을 유지하였다. 최종적으로 32개의 구조를 얻었으며, 이를 Insight II(Biosym Technologies, USA) 및 CURVES 5.2 소프트웨어로 분석하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav RNA 올리고뉴클레오티드는 나선형 굽힘 구조를 형성하고 있었다. 이와 같은 나선형 굽힘 구조는 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav를 구성하는 서열 중, 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'로 표시되는 서열로 구성된 두 개의 단일 가닥이 비 왓슨-크릭 결합을 통해 이중가닥을 형성하며 생성되는 구조로 확인되었다. 따라서, 상기 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'로 표시되는 서열을 포함하는 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Int-NS1, 5'-OH-Bend-GC, 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, 5'-OH-16mer-Double-Bend, 5'-OH-Long_Bend, 5'-OH-Long_Bend-BPS 및 5'-OH-Long_Bend Short RNA 올리고뉴클레오티드도 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 알 수 있었다.

실험예 1. RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 인터페론-β의 발현 확인

상기 실시예 1에서 제조된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드들이 인터페론-β의 발현을 증가시키는지 확인하였다.

1.1. 세포주의 준비

먼저, 100 ㎜ 조직배양 플레이트에 3×10⁶개의 HEK293T 세포(ATCC, USA)를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, 미국)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 7 ㎖에 분주하고, 이를 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 동안 배양하여 세포주를 준비하였다.

1.2. RNA 올리고뉴클레오티드의 처리

상기 실험예 1.1.에서 준비한 세포주에 상기 실시예 1에서 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.

먼저, 상기 배양된 세포에 트립신-EDTA(Gibco, 미국)를 처리하여 세포들을 떼어내고, 이를 계수하여 6-웰(well) 플레이트에 1×10³개가 되도록 분주하였다. 그 후, 이를 37℃, 5% CO₂의 조건에서 42시간 동안 배양하고, 배지를 제거한 뒤, FBS가 포함되지 않은 400 ㎕ OPTI-MEM 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.

RNA 올리고뉴클레오티드의 처리는, 1 μM의 5'-PPP-control, 5'-PPP-iav, 5'-OH-control, 5'-OH-iav, 5'-OH-Int-NS1 및 5'-OH-Bend-GC 각각에 4 ㎕의 리포펙타민 LTX, 및 1.6 ㎕의 플러스-시약을 혼합하여, 이를 200 ㎕씩 세포에 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 다시 37℃, 5% CO₂의 조건에서 4시간 동안 배양하였고, 이때, 양성대조군으로는 RIG-I 리간드로 알려진 폴리(I:C)[poly(I:C)]를, 음성대조군으로는 배지만 처리하였다. 4시간 후, 배지를 제거하고, 10% FBS를 포함하는 2 ㎖의 DMEM 배지를 넣어 37℃, 5% CO₂의 조건에서 2시간을 더 배양하였다.

1.3. 인터페론-β의 발현 확인

상기 서술한 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리한 세포에서 인터페론-β의 발현을 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 RNA를 분리하였다.

먼저, 배지를 제거하고 500 ㎕의 TRI-시약(Ambion, 미국)으로 세포를 회수한 뒤, 모아진 세포에 클로로포름을 넣어 RNA 층을 분리하였다. 여기에 이소프로판올을 첨가하여 펠렛(pellet)을 만들고, 상기 펠렛을 75% 에탄올로 세척 및 건조시킨 뒤, 멸균된 증류수에 녹였다. 이렇게 분리된 RNA에 DNase(Promega, 미국)를 첨가하여 30분 동안 상온에서 처리하여 오염된 DNA를 제거하였고, 정지용액(stop solution)으로 이를 불활성화하였다. 그 후, 슈퍼스크립트 III 역전사효소(Invitrogen, 미국)를 이용하여 50℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.

이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 실시간 PCR은 h-tag DNA 중합효소(solgent, 대한민국), dNTP, 염화테트라에틸암모늄(tetraethylammonium chloride), 에바그린 염료(evagreen dye, Biotium, USA), 및 표적 유전자인 인터페론-β 및 대조 유전자인 GAPDH를 위한 프라이머를 혼합하여 수행하였다. 실시간 PCR은 95℃에서 15분 동안 고정한 후, 95℃ 20초, 60℃ 40초, 및 72℃ 20초를 1회로 총 40회를 반복하였다. 이때, 인터페론-β 및 GAPDH를 표적으로 하는 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.

서열번호	이름	서열
서열번호 11	인터페론-β forward	5'-ggaggacgccgcattgac-3'
서열번호 12	인터페론-β reverse	5'-caatagtctcattccagccagtgc-3'
서열번호 13	GAPDH forward	5'-gcattgccctcaacgaccac-3'
서열번호 14	GAPDH reverse	5'-gaggccatgtgggccatgag-3'
서열번호 15	ISG56 forward	5'-gcctccttgggttcgtctacaa-3'
서열번호 16	ISG56 reverse	5'-tcaaagtcagcagccagtctca-3'

그 결과, 인터페론-β의 발현 변화를 도 3에 그래프로 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라, 5'-말단에 하이드록시기를 갖더라도 나선형 굽힘 구조가 있는 5'-OH-Int-NS1 및 5'-OH-Bend-GC RNA 올리고뉴클레오티드도 인터페론-β의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.

실험예 2. 짧은 길이의 헤어핀 RNA에 의한 인터페론-β의 발현 확인

상기 실험예 1에서 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β의 발현을 증가시키는지 확인하였다. 이때 인터페론-β의 발현에 영향을 미치는 RNA 올리고뉴클레오티드 부분의 확인을 위하여 굽힘 구조를 포함하는 더 짧은 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Bend-GC-8bp를 이용하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다.

단, 이때 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 5'-OH-control을 처리하였고, 양성 대조군은 폴리(I:C)[poly(I:C)]를 처리하였다. 실험군으로 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC의 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였고, 5'-OH-Bend-GC-8bp는 3번 실험을 수행하였다.

그 결과, 인터페론-β의 발현 변화를 도 4에 그래프로 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC를 처리한 경우 유의미한 수준으로 인터페론-β의 발현을 증가시켰음을 확인하였다.

실험예 3. 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56 의 발현 확인

상기 실험예 2에서 확인된 5'-OH-Bend-GC-8bp 헤어핀 RNA에서 루프 부분을 제외한 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 이중나선 RNA인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum을 이용하여 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.

모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-Control을 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.

그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 5에 그래프로 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열이 상보적으로 결합된 최소 길이의 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum이 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.

실험예 4. 포스포로티오에이트 결합 또는 회귀성 구조로 연결된 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56 의 발현 확인

본 발명에서 제작된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되거나(5'-OH-Bend-GC-8bp-PS), 나선형 굽힘 구조를 갖는 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드가 회귀성 구조로 연결되어 2개의 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드(5'-OH-16mer-Double-Bend)가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.

모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않은 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.

그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 6에 그래프로 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 치환하여 세포 내로 주입된 RNA 올리고뉴클레오티드 중 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 대해 저항성을 갖고, 나선형 굽힘 구조를 갖는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.

실험예 5. 긴 길이의 헤어핀 RNA에 의한 ISG56 의 발현 확인

본 발명에서 제작된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, 긴 길이의 헤어핀 RNA 올리고뉴클레오티드(5'-OH-Long_Bend)가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.

모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-iav를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.

그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 7에 그래프로 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 나선형 굽힘 구조를 갖는 긴 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 증가시켰음을 확인하였다.

실험예 6. 부분적으로 포스포로티오에이트 결합을 갖는 긴 길이의 헤어핀 RNA에 의한 ISG56 의 발현 확인

본 발명에서 제작된 나선형 굽힘 구조가 있고 긴 길이의 헤어핀을 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드에서, 이를 형성하는 일부 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, ISG56의 발현 변화를 확인하였다.

모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.

그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 8에 그래프로 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 나선형 굽힘 구조를 가지며, 굽힘 구조를 형성하는 부분의 RNA 폴리뉴클레오티드를 형성하는 결합이 포스포로티오에이트로 치환된 긴 길이의 헤어핀을 갖는 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 유의적으로 증가시켰음을 확인하였다. 구체적으로, 5'-OH-Long_Bend-BPS는 5'-OH-Bend-GC-8bp와 비교하여 약 7배 정도 ISG56의 발현을 증가시켰다.

실험예 7. 포스포로티오에이트 결합을 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 및 긴 길이의 헤어핀 RNA의 항바이러스 활성 확인

본 발명의 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다.

7.1. 인플루엔자 A 바이러스의 준비

인플루엔자 A 바이러스/푸에토리코/8/34(H1N1)(PR8)(ATCC, 미국)를 10일간 배아화된(embryonated) 달걀에 감염시켜, 37℃에서 3일 동안 증폭시켰다. 증폭된 바이러스의 타이터(titer)는 플라크 어세이로 확인하였고, 바이러스를 -70℃에서 보관하였다.

구체적으로, 10% FBS(Gibco, 미국)가 포함된 MEM(minimum essential medium; Hyclone, 미국) 배지를 사용하여 배양한 MDCK(Madin-Darby canine kidney; ATCC, 미국) 세포주를 48-웰 플레이트에 웰 당 5x10⁵ 개의 세포가 되도록 분주하였다. 세포가 웰에 가득 찰 때까지 이를 배양한 뒤, 여기에 무혈청 MEM 배지에 10배로 계열희석(serial dilution)한 인플루엔자 A 바이러스를 100 ㎕ 첨가하여 세포를 감염시켰다. 감염된 세포를 37℃에서 1시간 동안 방치한 뒤, 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 여기에 0.5%의 카복시메틸셀룰로오즈(carboxymethylcellulose; Sigma, 미국) 및 2 ㎍/㎖의 TPCK-트립신(Sigma, 미국)이 첨가된 MEM 배지를 0.2 ㎖ 첨가하였다. 세포를 33℃에서 3일 동안 배양한 뒤, 생성된 플라크를 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 바이러스의 타이터를 결정하였다.

7.2. 항바이러스 활성 확인-(1)

10% FBS가 포함된 RPMI1640(Hyclone, 미국) 배지에서 배양한 A549(ATCC, 미국) 세포주를 웰 당 1x10⁶ 개가 되도록 6-웰 플레이트에 분주하였다. 다음날, 상기 세포에 시험군으로 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 또는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 각각 10, 30 및 100 nM의 농도로 형질감염시켰다. 이때, 음성 대조군으로는 나선형 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 100 nM의 농도로 처리하였고, 양성 대조군으로는 0.1 ㎍/㎖의 폴리 I:C(polyinosine-polycytidylic acid) 또는 2 μM의 오셀타미비르(oseltamivir, OSV-C; Sigma, 미국)를 처리하였다. 형질감염은 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen, 미국)을 사용하여 수행하였다. 24시간 후, 세포 배양액을 제거하고, 상기 실험예 7.1.에서 준비한 인플루엔자 A 바이러스를 0.1 MOI로 감염시켰다. 이를 37℃에서 1시간 동안 방치한 뒤, 배지를 제거하고, 0.1 ㎍/㎖의 TPCK-트립신이 포함된 RPMI1640 배지를 첨가하여 세포를 배양하였다. 배양 1일 후, 웰에 0.3 ㎖의 M-PER 용액(Thermo Scientific, 미국)을 첨가하여 세포를 용해시키고, 세포 용해물을 사용하여 통상의 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.

구체적으로, 세포 용해물에 포함된 단백질을 정량하여, 이를 웰 당 30 ㎍이 되도록 10% SDS-PAGE 젤에 로딩하여 전기영동 하였다. 전기영동 한 단백질을 PVDF 멤브레인(Immobilion-P membrane; Millipore, 미국)으로 옮기고, 5% BSA가 포함된 1xPBS를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 전처리하였다. 이를 1xPBS로 세척한 뒤, 1차 항체를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고, 2차 항체를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이때, 바이러스 NP 단백질의 검출을 위해 항-NP 항체(11675-MM03, Sino Biological, 중국) 및 HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG(Sigma-Aldrich, 미국)를 사용하였다. 한편, 바이러스 NS1 단백질의 검출을 위해 항-NS1 항체(sc-17596, Santa Cruz Biotechnology, 미국) 및 HRP-결합된 당나귀 항-염소 IgG(Sigma-Aldrich, 미국)를 사용하였다. 대조군으로서 β-액틴의 발현 수준을 확인하였는데, 이때, 항-β-액틴 항체(Sigma-Aldrich, 미국) 및 HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG(Sigma-Aldrich, 미국)를 사용하였다. 단백질 밴드는 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce, 미국)를 사용하여 확인하였고, LAS-4000(Fujifilm, 일본) 이미지 분석기로 수득한 결과 이미지를 도 9A에 나타내었다.

그 결과, 도 9A에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 농도의존적으로 인플루엔자 A에 대한 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드는 10 nM의 낮은 농도에서도 양성대조군인 폴리 I:C와 동등한 수준으로 우수한 효과를 나타내었다.

7.3. 항바이러스 활성 확인-(2)

상기 실험예 7.2.와 동일한 방법으로 세포를 준비한 뒤, RNA 올리고뉴클레오티드를 형질감염시켰다. 이때, 음성 대조군으로는 나선형 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 100 nM의 농도로 처리하였고, 양성 대조군으로는 0.1 ㎍/㎖의 폴리 I:C(polyinosine-polycytidylic acid) 또는 10 μM의 오셀타미비르(oseltamivir, OSV-C; Sigma, 미국)를 처리하였다.

형질감염 24시간 후, 세포의 배양액을 제거하였다. 여기에 상기 실험예 7.1.에서 준비한 인플루엔자 A 바이러스를 100배 희석하여 감염시키고, 이를 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 다시 배지를 제거하고, 0.1 ㎍/㎖의 TPCK-트립신이 포함된 RPMI1640 배지를 첨가하여 세포를 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포 배양액을 상기 실험예 7.1.과 동일한 방법으로 MDCK 세포주에 감염시켜 바이러스의 타이터를 결정하였다.

그 결과, 크리스탈 바이올렛으로 염색된 세포의 사진 및 바이러스의 타이터를 도 9B에 나타내었다.

도 9B에서 나타난 바와 같이, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 농도 의존적으로 인플루엔자 A 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 상기 웨스턴 블랏 결과와 마찬가지로 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드는 10 nM의 낮은 농도에서도 양성 대조군인 폴리 I:C와 동등한 수준으로 우수한 효과를 나타내었다.

7.4. 항바이러스 활성 확인-(3)

실험군으로 농도별 5'-OH-Long_Bend 또는 5'-OH-Long_Bend Short RNA 올리고뉴클레오티드를 처리한 것을 제외하고는, 상기 실험예 7.2.와 동일한 방법으로 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성을 확인하였다. 이때, 음성 대조군으로는 나선형 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 100 nM의 농도로 처리하였고, 양성 대조군으로는 100 nM의 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드를 첨가하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드는 10 nM 이상의 농도에서, 5'-OH-Long_Bend Short RNA 올리고뉴클레오티드는 100 nM의 농도에서 바이러스 단백질의 발현을 대조군보다 현저하게 억제함을 확인하였다.

7.5. 항바이러스 활성 확인-(4)

실험군으로 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드를 0.1, 1, 10 또는 100 mM의 농도로 처리한 것을 제외하고는, 상기 실험예 7.2.와 동일한 방법으로 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성을 확인하였다. 이때, 음성 대조군으로는 바이러스만 감염시키거나, 나선형 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp 및 5'-OH-Cont-GC-8bp-PS를 각각 100 nM의 농도로 첨가하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드는 1 nM 이상의 농도에서 바이러스 단백질의 발현을 현저하게 억제함을 확인하였다. 이로부터 나선형 굽힘 구조를 갖는 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드가 항바이러스제의 유효성분으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> ANTIVIRAL AGENT COMPRISING RNA OLIGONUCLEOTIDE <130> FPD/201607-0054 <150> KR 2015/0144306 <151> 2015-10-15 <150> KR 2016/0044080 <151> 2016-04-11 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 1 nguagann 8 <210> 2 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 2 nnuuugcn 8 <210> 3 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 3 gguagacg 8 <210> 4 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 4 cguuugcc 8 <210> 5 <211> 34 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control RNA oligonucleotide <400> 5 gagcagaaac aaggcuucgg ccuuguuucu gcuc 34 <210> 6 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iav RNA oligonucleotide <400> 6 gaguagaaac aaggcuucgg ccugcuuuug cuc 33 <210> 7 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Int-NS1 RNA oligonucleotide <400> 7 aguagaaaca aggguguuuu uuauuauuaa auaagcugaa guguuuggau ccauuauguc 60 uuugucaccc ugcuuuugcu 80 <210> 8 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bend-GC RNA oligonucleotide <400> 8 gguagacgcg cgcguucgcg cgcgcguuug cc 32 <210> 9 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cont-GC-8bp RNA oligonucleotide <400> 9 ggcagacguu cgcgucugcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bend-GC-8bp RNA oligonucleotide <400> 10 gguagacguu cgcguuugcc 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interferon-beta forward primer <400> 11 ggaggacgcc gcattgac 18 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interferon-beta reverse primer <400> 12 caatagtctc attccagcca gtgc 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 13 gcattgccct caacgaccac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 14 gaggccatgt gggccatgag 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG56 forward primer <400> 15 gcctccttgg gttcgtctac aa 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISG56 reverse primer <400> 16 tcaaagtcag cagccagtct ca 22 <210> 17 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 17 nguagannnn uuugcn 16 <210> 18 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide <400> 18 gguagacgcg uuugcc 16 <210> 19 <211> 89 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Long_Bend RNA oligonucleotide <400> 19 gguagacgaa accagauaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaauaauuuu uuuuuuuuuu 60 uuuuuuuuuu uuaucugguu ucguuugcc 89 <210> 20 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Long_Bend Short RNA oligonucleotide <400> 20 gguagacgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaauaauuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 60 uuucguuugc c 71

Claims

RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₁ 내지 N₆는 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N₁은 G, N₂는 C, N₃는 G이고(서열번호 3에 해당), 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₄는 C, N₅는 G, N₆는 C(서열번호 4에 해당)인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제.
제4항에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₁ 내지 N₆는 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제5항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N₁은 G, N₂는 C, N₃는 G이고(서열번호 3에 해당), 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N₄는 C, N₅는 G, N₆는 C(서열번호 4에 해당)인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제4항에 있어서, 상기 루프가 적어도 4개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제7항에 있어서, 상기 루프가 UUCG 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제4항에 있어서, 상기 루프가 4개 내지 80개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제9항에 있어서, 상기 루프가 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 스템(stem) 구조를 갖고, 상기 스템 구조가 AU 염기쌍으로 이루어진 AU 모티프(motif)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제4항에 있어서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃N₄N₅UUUGCN₆-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제.
제12항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N₁ 내지 N₆은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제13항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N₁은 G, N₂는 C, N₃는 G, N₄는 C, N₅는 G, 및 N₆는 C(서열번호 18에 해당)인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N₄N₅UUUGCN₆-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N₁GUAGAN₂N₃N₄N₅UUUGCN₆-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제.
제15항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N₁ 내지 N₆은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제16항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N₁은 G, N₂는 C, N₃는 G, N₄는 C, N₅는 G, 및 N₆는 C(서열번호 18에 해당)인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제15항에 있어서, 상기 루프가 적어도 4개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제18항에 있어서, 상기 루프가 UUCG 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합 및 메틸포스포네이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형된 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항바이러스제는 C형 간염 바이러스, 뎅기 바이러스, 급성 호흡기 증후군 바이러스, 메르스 코로나 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 소낭성 구내염 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, B형 간염 바이러스 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.