KR20050084693A - 비서열 상보적 항바이러스 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

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Abstract

항바이러스 활성을 가진 무작위 서열 올리고뉴클레오티드가 항바이러스 물질로써의 용도와 함께 기재되어 있다. 많은 경우에 올리고뉴클레오티드의 길이는 40뉴클레오티드보다 더 크다. 인간과 동물에서 바이러스의 감염의 예방과 치료를 위한 방법 및 인간 또는 동물의 암바이러스에 의한 암 예방 치료방법 또한 기술되어 있다. 상기 방법은. 그러한 치료 시 인간이나 동물에게 서열 상보적인 작용방식으로 작용하지 않는 약리학적으로 허용가능한, 치료적으로 유효한 양의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것과 관련되어 있다.

Description

비서열 상보적 항바이러스 올리고뉴클레오티드{non-sequence complementary antiviral oligonucleotides}
[0001] 본 발명은 항바이러스 활성을 가지는 올리고뉴클레오타이드 및 인간 및 동물 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 감염, 암유전자(oncogene) 바이러스에 의해 야기되는 암 및 병인이 바이러스에 기본을 둔 다른 질병에서 치료제로서의 용도에 관한 것이다.
[0002] 하기의 논의는 단지 읽는 사람의 이해를 돕기 위하여 제공되며, 논의된 정보 또는 인용된 참조문헌 중 어느 것도 본 발명의 종래 기술을 구성하는 것을 허가하지 않는다.
[0003] 인류를 괴롭히는 많은 중요한 감염성 질병들이 바이러스에 의해 야기된다. 공수병, 천연두, 척수성 소아마비, 간염, 황열, 면역 결핍 및 다양한 뇌 질병들을 포함하는 다수의 이들 질병들은 빈번하게 죽음을 초래한다. 다른 것들은 그것들이 접촉전염성이 매우 높으며, 호흡기 또는 소화기관 장애 뿐만 아니라 독감, 홍역, 유행성 이하선염 및 수두 등과 같은 심각한 불편을 일으킨다는 점에서 의미가 있다. 풍진 및 거대세포바이러스(cytomegalovirus, CMV) 같은 다른 것들은 선천적인 이상을 야기할 수 있다. 마지막으로 암바이러스(oncoviruses)로 알려진 바이러스들이 있는데 이들은 인간과 동물들에서 암을 유발할 수 있다.
[0004] 바이러스 중, 헤르페스바이러스과(Herpesviridae, HHV)는 매우 흥미롭다. HHV는 다면체형(icoshedral) 이중 가닥 DNA 바이러스의 흔한 부류(class)이다. 100가지 이상의 특징이 밝혀진 헤르페스 바이러스의 구성원 중에서 단 8종이 인간을 감염시킨다. 이들 중 가장 잘 알려진 것은 HSV-1(Herpes simplex type 1), HSV-2(Herpes simplex type 2), 베리셀라 조스터(수두 또는 대상포진(shingles)), 거대세포바이러스 및 엡슈타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV)가 있다. 인간에게서 HHV의 우세(prevalence)는 전세계 인구의 3분의 1 이상을 감염시켜, 높은 편이다; 그리고, 미국에서는 인구의 70-80%가 일종의 헤르페스 감염을 가진다. 보통 입과 얼굴 주변에 단지 짧은 시간 병변을 야기하는 HSV-1의 경우에서 처럼 헤르페스 감염의 병리(pathology)는 대개는 위험하지 않지만, 이들 바이러스는 또한 생식기 궤양으로부터, 뇌염(15% 사망률) 또는 미만성 감염(disseminated infection, 40% 사망률)에 이를 수 있는 태아 감염에 이르기까지 다양한 더 위험한 증상의 원인으로 알려져 있다.
[0005] 헤르페스 바이러스는 자연에 고도로 유포되어 있고, 남자에게 고도로 병의 원인이 된다. 예를 들어 EBV는 후기 유년기 또는 청소년기 또는 젊은 성인에서 전염성 단핵 세포 증가증(mononucleosis)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 급성 전염성 단핵 세포 증가증의 특징은 인후염(sore throat), 발열, 두통, 림프절병증(lymphadenopathy), 편도선 비대 및 말초 혈액에서의 비정형적 림프구 분할이다. 다른 징후들은 가벼운 간염, 비장비대(splenomegaly) 및 뇌염을 빈번하게 포함한다. EBV는 또한 두가지 형태의 암과 연관되어 있다: 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma, BL) 및 코인두암(nasopharyngeal carcinoma, NPC). 적도 아프리카의 풍토 지역에서, BL은 소아암의 약 80%의 원인으로 가장 흔한 유년기 악성 종양이다. NPC는 북 아프리카 코카시안들에서 적당히 관찰되는 반면, 중국 남부에서 25 내지 55세 연령대에 발생하는 가장 흔한 암들 중 하나이다. CMV처럼 EBV는 또한 고형 기관 또는 골수 이식에 따른 만성 면역 억제의 잠재적 치사 합병증인 이식 후 림프세포 증식병(lymphoproliferative disease)과 연관되어있다.
[0006] 피부 및 눈 감염, 예를 들어 맥락망막염(chorioretinitis) 또는 각막결막염(keratoconjunctivitis)을 포함하는 다른 질병들이 또한 HSV와 연관되어 있다. 약 300,000 케이스의 눈의 HSV 감염이 매년 미국에서 진단된다.
[0007]AIDS(acquired immunodeficiency syndrome, 후천성 면역 결핍 증후군)은 HIV(human immunodeficiency virus, 인간 면역 결핍 바이러스)에 의해 야기된다. 신체의 면역 시스템의 세포들을 죽이거나 손상시킴으로써, HIV는 감염 및 암과 싸울 수 있는 신체의 능력을 점진적으로 파괴한다. 현재 전세계적으로 약 4 천2 백만 명이 HIV/AIDS를 가지고 살고 있다. 2002년에 총 3백만 천명의 사람들이 HIV/AIDS에 관련된 원인으로 사망하였다. 항-HIV 약물 치료요법의 궁극적인 목표는 상기 바이러스가 복제하고 면역시스템을 손상시키는 것을 방지하는 것이다. 지난 15년동안 HIV에 대항하여 많은 진전이 있었으나 여전히 현대의학으로서는 치료할 수 없다. 오늘날 의사들은 상기 질병을 다루기 위해 3가지 다른 약물 분류(class)의 12가지가 넘는 항레트로바이러스 작용제(antiretroviral agents)를 사용한다. 전형적으로, 둘 또는 3가지 분류 유래의 약물들이 HAART(Highly Active AntiRetroviral Treatment, 고 활성 항레트로바이러스 치료법)로 알려진 다양한 조합으로 처방된다. HAART 치료요법은 전형적으로 단백질 분해효소 억제제 또는 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제 중 하나인, 제 3의 약물과 함께 두가지 뉴클레오시드 역전사 효소 억제제 약물을 포함한다. 임상 연구는 HAART가 바이러스 부하(viral load)를 감소시키고, 약물 내성의 가능성을 최소화하는 데에 가장 효과적인 수단임을 보여주었다.
[0008] HAART는 신체에서 보통 바이러스 부하로 알려진 HIV의 양을 감소시키는 것으로 나타났으나, 수천명의 환자들이 이 치료법으로 심각한 문제들에 직면한다. 어떤 부작용은 심각하며 비정상적 지방 대사, 신장석(kidney stones), 심장병을 포함한다. 구역질, 구토, 불면증 같은 다른 부작용들은 덜 심각하나 일생동안 만성 약물 치료를 필요로 하는 HIV 환자에게 여전히 문제가 된다.
[0009] 현재 승인된 항-HIV 약물들은 HIV에 감염된 CD4+ T 세포에 들어가 바이러스 효소인 역전사 효소 또는 단백질 분해 효소의 기능을 차단함으로써 작용한다. HIV는 복제하기 위하여 이들 효소 두 가지 모두를 필요로 한다. 그러나, HIV는 빈번하게 돌연변이를 일으켜, 역전사 효소 또는 단백질 분해효소 억제제 약물들을 효과가 없게 만들어 내성을 가지게 된다. 일단 내성이 생기면, 바이러스 부하가 증가하여 상기 항레트로바이러스 작용제항레트로바이러스 작용제로 바꾸어야 한다. 불행히도 바이러스가 한 분류내의 한가지 약물에서 내성을 가지게 되면 그 분류내 다른 약물들도 덜 효과적으로 될 수 있다. 이러한 현상은 교차-내성(cross-resistance)으로 알려져 있는데, 이것은 많은 항-HIV약물들이 유사한 방식으로 작용하기 때문에 일어난다. 약물 교차 내성의 발생은 환자들에게 사용할 수 있다. 다수의 치료 선택권을 감소시키므로 매우 바람직하지 못하다.
[0010] 따라서, 바이러스가 내성을 발달시키지 못하도록 다른 작용 기전을 통하여 작용하여 HIV에 대항하는 효과적인 다른 항바이러스성 작용제들 개발에 대한 많은 요구가 있다. 이는 최근 유럽에서 HIV로 진단받은 10명중 한명이 시중에 승인된 약물 중 하나 이상에 이미 내성이 있는 HIV 균주에 감염되어있다는 최근 자료에 비추어 볼때 특히 중요해지고 있다.
[0011] 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus, RSV)는 상 및 하 호흡기관 감염을 유발한다. 상기 바이러스는 네가티브-센스 외피보유 RNA 바이러스이며, 감염성이 매우 높다. 이는 보통 어린 아이들을 감염시키며 유아에서 하부 호흡기관 질환의 가장 흔한 원인이다. RSV 감염은 보통 감기 같은 중등증 내지 중증(moderate-to-severe) 증상과 연관되어있다. 그러나, 중증 하부 호흡기관 질병은 어느 연령에서도 발생할 수 있으며, 특히 노인층 또는 면역 손상 환자들에서 발생할 수 있다. 중증의 감염된 어린이들은 산소 치료법 및 특정한 경우에서는 기계적인 환기를 필요로 할 수도 있다. 미국 의학 협회에 따르면, 점점 더 많은 수의 어린이들이 세기관지염(bronchiolitis)으로 입원하는데 이는 종종 RSV 감염에 의해 야기된다. RSV 감염은 또한 골수 이식 센터에서 환자들의 지역사회-연관 호흡기 바이러스 감염의 약 3분의1에 대한 원인이 된다. 노년층 집단에서 RSV 감염은 최근 심각성에서 독감 바이러스 감염과 매우 유사하다고 인식되고 있다.
[0012] 독감(INF)은 독감 바이러스에 의해 유발되는 접촉 전염성 질병이다. 인간(코, 목, 폐) 호흡기관을 공격한다. 미국에서 일년에 평균 약 36,000명이 독감으로 죽으며, 매년 114,000명이 독감으로 인하여 입원을 요한다.
[0013] 모든 전염성 질병들에서, 소정의 치료법의 유효성은 종종 숙주의 면역 반응에 의존한다. 이것은 특히 헤르페스 바이러스의 경우에 맞으며, 잠복 감염을 거치는 모든 헤르페스 바이러스의 능력은 면역손상 환자들에서 대단히 높은 감염 재활성을 초래한다. 신장 이식을 받은 사람들에게서 40% 내지 70%가 잠복기의 HSV 감염 재활성화하며, 80% 내지 100%가 CMV 감염을 재활성화한다. 이러한 바이러스 재활성화는 AIDS 환자들에서도 역시 관찰된다.
[10014] B형 간염 바이러스(HBV)는 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae)에 속하는 DNA 바이러스이다. HBV는 인간에서 B형 간염을 일으킨다. 세계적으로 2십억 명(3명중 1명)이 감염되어 있는 것으로 추정된다. 약 3억 5천명이 만성적으로 감염된 상태이며, 백만명의 사람들이 매년 B형 간염 및 그의 합병증으로 죽는 것으로 추정된다. HBV는 평생 감염, 간경변(cirrhosis), 간암, 간부전 및 죽음을 유발할 수 있다. 상기 바이러스는 혈액 및 체액을 통하여 전염된다. 이는 직접적인 혈액 대 혈액 접촉, 무방비 성관계(unprotected sex), 멸균하지 않은 바늘의 사용 및 분만동안 감염된 산모에서 신생아로의 수직 감염을 통하여 야기될 수 있다. 감염된 대부분의 건강한 성인들(90%)은 회복하고, 향후의 B형 간염 바이러스 감염에 대항하는 보호 항체를 발현할 것이다. 바이러스에 감염되었을 때 유아의 90% 및 50% 이하의 어린이가 만성적인 감염으로 진전하는 반면 적은 수(5-10%)의 성인이 바이러스를 제거할 수 없을 것이고, 만성적인 감염으로 진전할 것이다. 알파-인터페론은 가장 흔하게 사용되는 타입의 치료이다. 독감 같은 증상, 우울증, 발진, 기타 반응 및 비정상 혈구수등을 포함하는 중대한 부작용이 상기 치료와 관련되어 있다. 또 다른 치료 선택은 또한 그 사용과 연관된 많은 부작용을 가지는 3TC를 포함한다. 지난 몇 년 안에 3TC로 치료를 받은 환자들이 HBV의 내성 균주를 발현시키고 있음을 보이는 다수의 보고가 증가하고 있다. 이는 HBV 및 HIV에 함께 감염된 환자들의 집단에서 특히 문제가 된다. 상기 바이러스에 대항한 새로운 항바이러스성 치료법의 긴급한 개발 요구가 명백하다.
[0015] C형 간염 바이러스(HCV) 감염은 감염된 환자의 수가 4백만을 초과하리라 예상되는 미국에서 가장 흔한 만성 혈액매개 감염이다. 상기 흔한 바이러스 감염은 간경변 및 간암의 주된 요인이며 또한 미국에서 현재 간 이식의 주된 이유이다. 감염 회복은 드물며, 감염 환자의 약 85%는 바이러스 만성 보균자가 되면 10 내지 20%는 간경화로 진행한다. 현재 만성 보균자가 전세계적으로 1억 7천만명인 것으로 추정된다. 질병통제 예방센터(Centers for Disease Control and Prevention)에 따르면, 만성 C 형 간염은 미국에서만 매년 8,000 내지 10,000명을 죽게 하며, 약 1,000명을 간 이식으로 이끈다. C 형 간염에 유용한 백신이 없다. 알파 인터페론 또는 리바비린(Ribavirin)과 인터페론을 조합한 지속적인 치료는 환자의 약 40%에서만이 효과적이며, 중대한 부작용을 일으킨다.
[0016]오늘날, 일반적으로 바이러스 감염에 대한 치료 전망은 밝지 않다. 일반적으로, 바이러스에 대한 치료법은 보통의 유효성을 가지며 유효 용량의 투여 또는 장기 치료를 방해하는 강한 부작용과 연관되어있다. 상기 문제들을 예시하는 세가지 임상적 상태가 헤르페스바이러스과, HIV 및 RSV 감염이다.
[0017] 헤르페스바이러스과의 경우, 현재 임상 사용이 승인된 다섯가지 주된 치료법이 있다: 이독수리딘(idoxuridine), 비다라빈(vidarabine), 아시클로비르(acyclovir), 포스카르넷(foscarnet) 및 간시클로비르(ganciclovir). 제한된 유효성을 가지는 반면, 상기 치료법은 또한 부작용을 가지고 있다. 알러지 반응이 이독수리딘으로 치료한 환자의 35%에서 보고되었고, 비다라빈은 15%의 환자에서 위장장애를 일으킬 수 있으며, 뉴클레오시드 유사체인 아시클로비르, 포스카멧 및 간시클로비르는 숙주 세포에서 DNA 복제에 영향을 미친다. 간시클로비르의 경우, 이 약물로 치료한 AIDS환자의 40%에서 호중성 백혈구 감소증(neutropenia) 및 저혈소판증(thrombocytopenia)이 보고되었다.
[0018]현재 HIV 감염 치료에 이용 가능한 많은 상이한 약물들이 있으나, 이들 모두가 환자들에게 정당한 삶의 질을 주기 위하여 광범위한 추가 약물치료가 요구될 만큼의 효력이 있는 부작용과 연관되어 있다. HIV 약물 내성 균주의 부가적인 문제(문제는 또한 헤르페스 바이러스 감염에서 발견하였다)는 치료 칵테일의 주기적인 변화를 요구하며, 몇몇 경우에서 감염 치료를 대단히 어렵게 한다.
[0019] 어린 유아들에서 RSV 감염 치료는 새로운 약물 개발이 긴급히 요구되는 또 하나의 예이다. 상기 경우에, 보통의 치료방침은 분리 텐트(isolation tent)에서 작은 입자 에어로졸을 사용한 흡입으로, 리바비린 (Ribavirin)을 전달하는 것이다. 리바비린은 단지 가벼운 효과를 낼 뿐만 아니라 이의 사용법은 심각한 부작용과 연관되어있다. 더불어, 상기 약물의 잠재적 방출은 리바비린이 태아기형성(teratogenicity)으로 알려져 있기 때문에 병원 직원들에 큰 우려를 유발한다.
[0020] 개발되고 있는 새로운 신생 항바이러스 약물의 경우 다음 3가지 특징들을 포함하는 것이 더욱 바람직하다는 것은 명백하다: 1- 약효 향상; 2- 부작용의 위험 감소 및 3- 바이러스가 돌연변이에 의해 극복하기 어려운 작용기전.
[0021]다양한 안티센스 접근법에 의하여 특정 바이러스 억제를 위한 몇몇 시도들이 행해지고 있다.
[0022]Zamecnik등은 역전사효소 프라이머 사이트 및 스플라이스 공여자/수용자 사이트(Zamecnik, et al (1986) Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 83:4143-) (Goodchild & Zamecnik (1989) US Pat 4,806,463)에 특이적으로 표적화된 ON을 사용하였다.
[0023]Crooke 및 동료들(Crooke et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:527-532)는 HSV-1에 대한 안티센스를 기술하였다.
[0024]Draper(1993, US Pat 5,248,679)은 Cat 서열을 포함하는 항-HSV 활성을 가지며, HSV-1 유전자 UL13, UL39 및 UL40와 혼성화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 보고하였다.
[0025]Kean(Biochemistry (1995) 34:14617-14620)등은 항-HSV 작용제로서 안티센스 메틸포스포네이트 올리고머(antisense methylphosphonate oligomers)를 시험하였다.
[0026]Peyman(Biol Chem Hoppe Seyler (1995) Mar; 376:195-198)등은 이들의 항바이러스적 특성에 대하여 HSV-1의 IE110 및 UL30 mRNA에 대한 특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험을 보고하였다.
[0027]IE1, IE2 또는 DNA 중합효소를 코딩하는 CMV mRNAs를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체(analogs)가 Anderson(1997, US Pat 5,591,720)등에 의하여 보고되었다.
[0028]Hanecak(1999, US Pat 5,952,490)등은 HSV-1와 같은 바이러스의 활성을 현저하게 억제하기에 충분한 수의 플랭킹 뉴클레오티드 및 보존된 G 쿼텟(quartet) 서열을 가지는 변형된 올리고뉴클레오티드들을 기술하였다.
[0029]Jairath(Antiviral Res. (1997) 33:201-213)등은 RSV에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 보고하였다.
[0030]Torrence(1999, US Pat 5,998,602)등은 RSV 항게놈 가닥(antigenomic strand, mRNA 가닥)의 단일 가닥 일부에 상보적인 안티센스 구성성분, 올리고뉴클레오티드 활성인자(activator) 및 RNase L의 링커(linker)를 포함하는 화합물을 보고하였다.
[0031]Qi(Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi (2000) 14:253-256)등은 B3수족구병 바이러스(Coxsackie virus B3)에서 안티센스 PS-ODNs 시험을 보고하였다.
[0032]국제 공보 W09203051(Roizman 및 Maxwell)는 HSV 바이러스 게놈 또는 항바이러스적 활성을 나타내는 이의 mRNA 전사체의 생명 유지에 필요한 부분에 상보적인 메틸포스포네이트 안티센스 올리고머를 기술하였다.
[0033]구아노신/티미딘(Guanosine/thymidine) 또는 구아노신-리치 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드(GT-PS-ODNs)는 항바이러스적 활성을 가지는 것으로 보고되었다. 상기 논문은 "길이가 모두 26 또는 27 nts 인 몇몇 상이한 PS-함유 GT-리치 ODNs(13106-140, 1100-12 및 G106-57)는 36 (8106-96,13106-97) 또는 45 nts (표 4)로 구성되는 GT-리치 ODNs만큼 HIV-2 역가(titers)를 감소시키는데 효과적이었다."(Fennewald et al., Antiviral Res. (1995) 26:37-54)고 언급한다.
[0034]미국특허 6,184,369는, 구아노신 염기를 높은 퍼센트로 함유하는 항-HIV, 항-HSV 및 항-CMV 올리고뉴클레오티드를 기술한다. 바람직한 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 3차원 구조를 가지는데, 이러한 구조는 구아노신 테트라드(tetrads)에 의해 안정화된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 조성은 두개의 근접한 데옥시구아노신이 둘 이상의 연속(runs)을 가진다. 상기 특허는 두 위치 이상에서 둘 이상의 G 잔기(residues)을 포함하는 G-리치 ODN을 청구한다.
[0035]Cohen(US Pats. 5,264,423 and 5,276,019)등은 HIV의 복제 억제 및 정상적인 살아있는 세포 존재시에 외래 핵산의 복제를 방지하기 위하여 사용될 수 있는 PS-ODN 유사체에 대하여 더욱 상세히 설명하였다. Cohen등은 바이러스 서열에 특이적인 안티센스 PS-ODNs의 항바이러스적 활성을 기술한다. 이들은 또한 14, 18, 21 및 28-mers의 polyA, polyT 및 polyC PS-ODN의 서열 시험을 설명하고, 상기 PS-ODN의 항바이러스 효과를 제시한다.
[0036]Matsukura(Matsukura et al (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:7706-7710)등은 이후에 상기 Cohen등의 미국 특허에서 설명한 결과를 발표하였다.
[0037]Gao(Gao et al (1989) J Biol Chem 264:11521-11526)등은 7, 15, 21 및 28 뉴클레오티드들의 크기의 polyA, polyT 및 polyC PS-ODN 서열을 시험하여 PS-ODNs에 의한 HSV-2의 복제 억제를 기술한다.
[0038] Archambault, Stein 및 Cohen(Archambault et al (1994) Arch Virol 139:97109)은 28 뉴클레오티드의 PS-ODN polyC가 HSV-1에 효과적이지 못하다고 보고한다.
[0039] Stein(Stein et al. (1989) AIDS Res Hum Retrovir 5:639-646)등은 일반적으로 21--28 뉴클레오티드 길이의 항-HIV ODNs 상에서 부가적인 데이터에 관한 결과를 발표하였다.
[0040] Marshal(Marshall et al. (1992) Proc. Natl. Acact. Sci. USA 89:6265-6269)등은 길이가 4-28 뉴클레오티드인 포스포로티오에이트 및 포스포로티오에이트 poly-C 올리고의 항-HIV-1 효과를 기술한다.
[0041] Stein 및 Cheng(Stein et al. (1993) Science 261 :1004-1012)은 리뷰문헌에서, "PS 올리고의 항-HIV 특성이 비-서열 특이적 효과들에 의하여 현저하게 영향을 받는다는 것은 즉, 억제 효과가 염기 서열에 독립적이라는 것이다."라고 하여 28 뉴클레오티드들 중 비특이적 ODN의 항바이러스적 활성을 언급한다.
[0042]리뷰문헌에서 Lebedeva 및 Stein(Lebedeva et al (2001) Annul Rev Pharmacol 41:403-419)은 바이러스 단백질을 포함하는 PS-ODNs 의 다양한 비특이적 단백질 결합 활성을 보고한다. 이들은 "상기 분자들이 생물학적으로 매우 활성이 높으며, 또한 그것은 종종 비교적 인공물을 안티센스로 착각하기 쉽다"고 말한다.
[0043]Rein(US Pat. 6,316,190)등은 항바이러스성 화합물로 사용될 수 있는 HIV 뉴클레오캡시드에 결합하고 융합 파트너에 연결된 GT-리치 ON 교란물(decoy)을 보고하였다. 유사하게, Campbell(Campbell et al (1999) J. Virol. 73:2270-2279)등은 항바이러스적 활성과 관계없이 HIV 뉴클레오캡시드에 특이적으로 결합하는 TGTGT 모티프를 갖는 PO-ODN를 보고하였다.
[0044]Feng(Feng et al. (2002) J. Virol. 76:11757-11762)등은 항-HIV 활성에 대한 데이터나 언급없이 재조합 HIV 뉴클레오캡시드에 결합하는 A(n) 및 TG(n) PO-ODNs을 설명하였다.
[0045]항암 작용제(agents), 항바이러스성 작용제 또는 다른 질병들을 치료하는 것으로 개발된 안티센스 ODNs는 전형적으로 대략 길이가 20 nts이다. 리뷰문헌(Stein, CA, (2001) J. Clin. Invest. 108:641-644)에서, "안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이가 최적화되어야만 한다: 안티센스 올리고뉴클레오티드가 너무 길거나 너무 짧으면, 특이성의 요소를 잃는다. 현재, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 최적 길이는 대략 16-20 nts인 것으로 보인다 "라고 단언한다. 유사하게, 다른 리뷰(Crooke, ST (2000) Methods Enzymol. 313:3-45)에서 "RNA 및 RNA 2중 형성(duplex formation)에 비하여, 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드는 대략 단위당 2.2℃ 낮은 Tm을 가진다. 이는 생체외(in vitro)에서 효과적이기 위하여, 일반적으로 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드는 길이가 17- 내지 20-mer 이어야 한다는 것을 의미한다"고 말한다.
[0046] Caruthers 및 동료들(Marshall et al. (1992).Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:6265-6269)은 12mer 폴리시티딘-PS2-ODN 및 14mer PS2-ODN에 대한 포스포로디티오에이트 ODNs(PS2-ODNs)의 항-HIV 활성을 보고하였다. 항-HIV 활성을 위하여 이밖에 다른 사이즈는 시험하지 않았다. 이들 또한 12, 14, 20 및 28mer 폴리시티딘-PS2-ODNs에 대한 HIV 역전사효소(RT)의 억제를 보고하였다. 후에, Marshal(Marshal et al (1993) Science 259:1564-1570)등이 HIV RT의 서열 특이적 억제를 보이는 결과들을 보고하였다. 같은 그룹이 몇몇 특허에서 PS2-ODNs에 대한 데이터들을 발표하였다. 미국 특허 제5218103호 및 제5684148호에서 PS2-ODN 구조 및 합성이 기술되었다. 미국 특허 제5,452,496호, 제5,278,302호 및 제5,695,979호에서 HIV RT 억제가 PS2-ODNs이 15 염기를 넘지않는다고 기술한다. 미국 특허 제5,750,666호 및 제5,602,2 44호에서 PS2-ODNs의 안티센스 활성을 기술하였다.
[0106]도 1. HSV-1 (KOS 균주)를 사용하여 VERO 세포에서 구축된 플라크 환원 시험(Plaque reduction assay). 감염된 세포들은 (a)REP 1001, (b) REP 2001또는 (c)REP 3007의 점차 증가하는 농도들로 처리된다. 선형 회귀곡선으로부터 계산된 IC50 값들이 각 그래프에서 보고된다.
[0107]도 2. HSV-1에 대한 PS-ODN 크기 및 IC50사이의 관계. 도1의 IC50 값이 도 1에서 시험된 각 PS-ODN의 특이적인 크기에 대하여 스팟팅(spotted)되었다.
[0108]도 3. HSV-1 (KOS 균주)를 사용하여 VERO 세포에서 구축된 플라크 환원 시험. 감염된 세포들은 (a)REP 2001, (b)REP 2002 또는 (c)REP 3003, (d)REP 2004, (e)REP 2005, (f)REP 2006 및 (g)아시클로비르(Acyclovir)의 점차 증가하는 농도들로 처리된다. 선형 회귀곡선으로부터 계산된 IC50 값들이 각 그래프에서 보고된다.
[0109]도 4. HSV-1에 대한 PS-ODN 크기 및 IC50사이의 관계. 도 3의 IC50 값이 항-HSV-1 활성을 보이는 도 3에서 시험된 각 PS-ODN의 특이적인 크기에 대하여 스팟팅(spotted)되었다. 아시클로비르(Acyclovir)에 대한 IC50은 임상적 상관 관계에 대한 참조로서 나타내었다.
[0110]도 5. HSV-1 (KOS 균주)를 사용하여 VERO 세포에서 구축된 플라크 환원 시험. 넓은 범위의 PS-ODN 랜더머 크기들이 점차 증가하는 농도로 시험되었다; (a)REP 2003, (b)REP 2009, (c)REP 2010, (d)REP 2011, (e)REP 2012, (f) REP 2004, (g) REP 2006, (h) REP 2007 및 (i) REP 2008. 선형 회귀곡선으로부터 계산된 IC50 값들이 각 그래프에서 보고된다.
[0111]도 6. 아크릴아미드 젤 전기영동에 의하여 분리된 도 5 에서 시험한 PS-ODN 랜더머의 UV 이미지(backshadowing).
[0112]도 7. HSV-1에 대한 PS-ODN 랜더머 크기 및 IC50 사이의 관계. 도 5의IC50 값은 항-HSV-1 활성을 보인 도 5에서 시험한 각 PS-ODN의 특이적 크기에 대하여 스팟팅되었다.
[0113]도 8. HSV-1(KOS 균주)를 사용하여 VERO 세포에서 구축된 플라크 환원 시험. 변형되지 않은 ODNs; HSV-1 IE110의 개시 코돈(start codon)을 가지는 PS-ODNs 및 무작위 서열은 점차 증가하는 농도로 시험하였다. (a) REP 2013, (b) REP 2014, (c) REP 2015, (d) REP 2016, (e) REP 2017, (f) REP 2018, (g) REP 2019, (h) REP 2020 및 (i) REP 2021. 선형 회귀곡선으로부터 계산된 IC50 값들이 각 그래프에서 보고된다.
[0114] 도 9. 아크릴아미드 젤 전기영동에 의하여 분리된 도 8에서 시험한 PS-ODN 랜더머들의 UV이미지(backshadowing).
[0115]도 10. HSV-1 에 대한 PS-ODN 랜더머, PS-ODN 무작위 서열, PS-ODN HSV-1 IE110 서열 및 IC50 사이의 관계. 도 8의 IC50 값들은 항-HSV-1 활성을 보인 도 8에서 시험한 각 PS-ODN의 특이적 크기에 대하여 스팟팅된다. 도 5로부터의 부가적인 IC50 값은 PS-ODN 랜더머들에 대한 비교를 위하여 포함된다.
[0116]도 11. HSV-1(KOS 균주)를 사용하여 VERO 세포에서 구축된 플라크 환원 시험. 상기 올리고(REP 2024, [a])의 각 끝부분에 4 리보스 당(ribose sugars)으로 2-O 메틸 변형을 가지는 PS-ODN; 상기 올리고(REP 2026 [b])의 각 끝부분에 4 에스테르 연결로 메틸 포스포네이트 변형을 가지는 ODN; 및 20 염기(REP2059 [c]) 및 30 염기 (REP2060 [d]) 길이 RNA PS-ODNs를 점차 증가하는 농도로 시험하였다. 선형 회귀곡선으로부터 계산된 IC50 값들이 각 그래프에서 보고된다.
[0117]도 12. HSV-2 (MS2 균주)를 사용하여 인간 섬유아세포(fibroblast cell)에서 구축된 플라크 환원 시험. 감염된 세포는 (a) REP 1001, (b)REP 2001 또는(c)REP 3007를 점차 증가하는 농도로 처리된다. 선형 회귀곡선으로부터 계산된 IC50 값들이 각 그래프에서 보고된다.
[0118]도 13. HSV-2에 대한 PS-ODN 크기 및 IC50사이의 관계. 도 12의 IC50 값은 도 12에서 시험한 각 PS-ODN의 특이적 크기에 대하여 스팟팅된다.
[0119]도 14. HSV-2(MS2 균주)를 사용한 VERO 세포에서 구축된 플라크 환원 시험. 감염된 세포는 (a) REP 2001, (b)REP 2002 또는(c) REP 2003, (d) REP 2004, (e) REP 2005, (f) REP 2006 및 (g) 아시클로비르의 점차 증가하는 농도로 처리된다. 선형 회귀곡선으로부터 계산된 IC50 값들이 각 그래프에서 보고된다.
[0120]도 15. HSV-2에 대한 PS-ODN 크기 및 IC50사이의 관계. 도 14의 IC50값은 항-HSV-2 활성을 보인 도 14에서 시험한 각 PS-ODN의 특이적 크기에 대하여 스팟팅되었다. 아시클로비르(Acyclovir)에 대한 IC50은 임상적 상관 관계에 대한 참조로서 증명된다.
[0121]도 16. CMV(AD169 균주)를 사용하여 VERO 세포에서 구축된 플라크 환원 시험. 감염된 세포는 (a)REP 2004 또는(b)REP 2006의 점차 증가하는 농도로 처리된다. 선형 회귀곡선으로부터 계산된 IC50 값들이 각 그래프에서 보고된다. CMV에 대한 PS-ODN 크기 및 IC50 사이의 관계는 (c)에 스팟팅된다. (a) 및 (b)의 IC50 값은 시험한 각 PS-ODN의 특이적 크기에 대하여 스팟팅된다.
[0122]도 17. CMV(AD169 균주)를 사용하여 VERO 세포에서 구축된 플라크 환원 시험. 3가지 임상적 CMV 치료법이 시험되었다: (a) 간시클로비르(Gancyclovir), (b) 포스카르넷(Foscarnet) 및 (c) 시도포비르(Cidofovir). 넓은 범위의 PS-ODN 랜더머 크기들이 또한 점차 증가하는 농도로 시험되었다; (d) REP 2003, (e) REP 2004, (f) REP 2006 및 (g) REP 2007. 최종적으로, REP 2036(Vitravene)은 (h) 조직내에서(in house) 합성됨으로써 또한 (l) 시판되는 것으로써 시험된다. 선형 회귀곡선으로부터 계산된 IC50 값들이 각 그래프에서 보고된다.
[00123]도 18. CMV에 대한 PS-ODN 크기 및 IC50 사이의 관계. 도 17의 IC50 값은 항-CMV-1 활성을 보인 도 17에서 시험한 각 PS-ODN의 특이적 크기에 대하여 스팟팅된다.
[0124]도 19. HIV-1(NL4-3 균주)를 사용하여 MT4 세포에서 구축된 CPE 시험(assay). 감염된 세포는 (a) REP 2004 또는(b) REP 2006의 점차 증가하는 농도로 처리된다. 선형 회귀곡선으로부터 계산된 IC50 값들이 각 그래프에서 보고된다. 감염되지 않은 MT4 세포에서 세포독성 프로파일들은 (c) REP 2004 및 (d) REP 2006에 나타난다.
[0125]도 20. HIV-1에 대한 PS-ODN 크기 및 IC50 사이의 관계. 도 1의 IC50 값은 도 1에서 시험한 각 PS-ODN의 특이적 크기에 대하여 스팟팅된다.
[0126]도 21. 재조합 자연형 HIV-1 NL4-3 (CNDO 균주)를 사용하여 293A 세포에 구축된 복제 시험. 감염된 세포들은 (a) 암프레나비르(Amprenavir), (b) 인디나비르(Indinavir), (c) 로피나비르(Lopinavir), (d) 사퀴나비르(Saquinavir), (e) REP 2003, (f) REP 2004, (g) REP 2006 및 (h)REP 2007의 점차 증가하는 농도로 처리된다. 두 곡선(흑색 실선 및 점선)은 CNDO 균주에 대한 투여량 반응 곡선(Dose response curves) 을 나타낸다.
[0127]도 22. (a)도 21의 IC50 값 및 (b) 재조합 HIV-1에 대한 PS-ODN 크기 및 IC50사이의 관계. (a)의 IC50 값은 도 21에서 시험한 각 PS-ODN의 특이적 크기에 대하여 스팟팅된다.
[0128]도 23. 재조합 다중 약물 내성 HIV-1 (MDRC4 균주)를 사용하여 293A 세포에 구축된 복제 시험. 감염된 세포들은 (a) 암프레나비르(Amprenavir), (b) 인디나비르(Indinavir), (c) 로피나비르(Lopinavir), (d) 사퀴나비르(Saquinavir), (e) REP 2003, (f) REP 2004, (g) REP 2006 및 (h)REP 2007의 점차 증가하는 농도로 처리된다. CNDO (자연형)에 대한 투여량 반응 곡선은 점선으로 나타내고, MDRC4 (약물 내성)에대한 것은 실선으로 나타낸다.
[0129]도 24. (a) 재조합 HIVA의 자연형(CNDO) 및 약물 내성(MDRC4) 균주 사이에 IC50 값에서 배 증가를 보이는 도 21 및 도 23의 IC50 값 및 (b) (a)에서 계산된 배(fold) 증가의 플랏(plot).
[0130]도 25. RSV (A2 균주)를 사용하여 Hep2 세포에 구축된 CPE 시험(assay). 감염된 세포는 (a) REP 2004, (b) REP 2006, (c) REP 2007 또는 (d) 리바비린(Ribavirin)의 점차 증가하는 농도로 처리된다. 선형 회귀곡선으로부터 계산된 IC50 값들이 각 그래프에서 보고된다. 감염되지 않은 Hep2 세포에서 세포독성 프로파일들은 (e) REP 2004, (f) REP 2006, (g) REP 2007 또는 (h) 리바비린에 나타낸다.
[0131]도 26. RSV에 대한 PS-ODN 크기 및 IC50 사이의 관계. 도 25의 IC50 값은 항-RSV 활성을 보이는 도 25에서 시험한 각 PS-ODN의 특이적 크기에 대하여 스팟팅된다.
[0132]도 27. 콕사키바이러스 B2 (Ohio-1 균주)를 사용하여 LLC-MK2 세포에서 구축된 CPE 시험. 감염된 세포는 (a) REP 2006의 점차 증가하는 농도로 처리된다. REP 2006 세포독성 프로파일은 (b)에 나타낸다.
[0133]도 28. A) FBS로부터 20 염기 PS-ODN 랜더머 미끼의 상호작용에 경쟁하기 위한 PS-ODN 랜더머들(REP 2003, 2004, 2006 및 2007)의 능력을 나타내는 FP 상호작용 시험. 더 큰 랜더머들은 더 효율적으로 경쟁한다. B) 및 C) DOTAP 및 Cytofectin을 가진 293 A 세포에서 혈청 보호 및 향상된 REP2006전달. D) 및 E)FP에 의해 측정된 DOTAP 또는 cytofectin으로 캡슐화된 REP 2006의 혈청 보호.
[0134]도 29. 형광 편광(fluorescence polarization)에 의한 다른 크기들의 미끼와 결합하는 바이러스 용해물(viral lysate)의 결정. REP 2032-FL, REP 2003-FL 및 REP 2004-FL은 (a) HSV-1, (b) HIV-1 또는 (c) RSV의 용해물들에서 결합한 용해물에 대하여 시험하였다.
[0135]도 30. 형광 편광(fluorescence polarization)에 의한 바이러스 용해물들에 대한 PS-ODN 랜더머들의 친화성 결정. 미끼로 REP 2004-FL을 사용하여, (a) HSV-1 용해물, (b) HIV-1 용해물 또는 (c) RSV 용해물과의 복합체 형성은 REP 2003, REP 2004, REP 2006 또는 REP 2007의 점차 증가하는 농도로 검사된다.
[0136]도 31. REP 2004-FL은 HIVA p24gag 및 HIV-1 gp41와 결합할 수 있다. 상기 정제된 두 단백질들의 점차 증가하는 양과 상호작용하는 REP 2004-FL의 능력은 형광 편광에 의해 테스트된다.
[0137]도 32. p24 및 gp41 결합상에서 미끼 크기의 효과. 점차 증가하는 크기의 미끼들은 형광 편광에 의하여 p24gag 및 gp41와 결합하는 능력에 대하여 테스트된다.
[0138]도 33. 바이러스 용해물들과 결합하기 위한 이중 가닥 PS-ODNs의 능력은 형광 편광에 의해 테스트된다. 단일 가닥(ss) 또는 이중 가닥(ds) 포스포로티오에이트화된 REP 2017(형광으로 표지된)은 그것의 비-티오에이트화된 유사체(analog)(2017U)와 마찬가지로 조제된다. 상기 미끼들은 HSV-1 및 HIV-1 바이러스 용해물들과 결합에 대하여 테스트된다.
[0139]도 34. 세포내 형광이 붙은(tagged) PS-ODNs의 전달은 250 nM REP 2004-FL 존재 하에서 4시간동안 293A 세포를 배양함으로써 측정하였다. 상기 배양 뒤에 세포는 용해되었고 용해로 세포에서 방출된 상대적 형광은 형광측정기(fluorometry)에 의하여 측정하였다.
[0140]도 35. 바이러스 용해물들과 결합하기 위한 다른 서열 조성물들 중 20-mer PS-ODNs의 능력은 형광 편광에 의해 측정하였다. 3'-말단에 FITC로 표지된 PS-ODNs은 1 ug 의 (a) HSV-1, (b) HIV-1 또는 (c) RSV 용해물들 존재하에서 배양되었다. 상기 PS-ODNs를 위한 결합 프로파일들은 모든 3가지 바이러스 용해물들 (도 35 참조)에서와 유사하다.
[0141]도 36. 우두가 감염된 VERO 세포로부터 감염된 상층액에서 미접촉 세포(naive cell)에서 상기 상층액에 의해 유도된 CPE 측정에 의한 바이러스 부하의 간접적인 결정. 시도포비르(Cidofovir)를 50uM으로 테스트할 때 REP 2004, 2006 및 2007은 10uM으로 테스트된다.
[0142]도 37. (A) HSV-1(KOS 균주)를 사용하여 VERO 세포에 구축된 플라크 환원 시험으로부터 발생된 IC50 값. 감염된 세포는 REP 2006 (N40), REP 2028 (G40), REP 2029 (A40), REP 2030 (T40) 및 IC50 값을 발생시키는 REP 2031 (C40)의 점차 증가하는 농도로 검사된다. (B) 다음의 IC50 값을 발생시키는 HSV-1 PRA: N40 (REP 2006), AC20 (REP 2055, TC20 (REP 2056), 또는 AG20 (REP 2057).
선택된 약어들
ON: 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide)
ODN: 올리고데옥시뉴클레오티드(Oligodeoxynucleotide)
PS: 포스포로티오에이트(phosphorothioate)
PRA: 플라크 환원 시험 (Plaque reduction assay)
PFU: 플라크 형성 단위(Plaque forming unit)
INF A: 독감 A 바이러스
HIV: 인간 면역결핍 바이러스(특정되지는 않으면, HIV-1 및 HIV-2 둘 다 포함)
HSV: 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus) (특정되지는 않으면, HSV-2 및 HSV-3 둘 다 포함)
RSV: 호흡기 합보체 바이러스 (Respiratory syncytial virus)
COX: 콕사키바이러스(Coxsackievirus)
DHBV: 오리 간염 B 바이러스(Duck hepatitis B virus)
바람직한 구현예의 상세한 설명
[00143]상기 본 발명은 비서열 상보적 기작에 의하여 작용하는 항바이러스 올리고뉴클레오티드의 용도 및 동정(identification)에 관한 것이며, 또한 많은 바이러스들에 대하여 상기 상기 항바이러스 활성이 올리고뉴클레오티드가 클수록 더 크며, 일반적으로 길이가 40 nts 또는 그 이상인 올리고뉴클레오티드에서 바람직하다는 발견을 포함한다.
[0144]배경 기술에서 설명된 바와 같이, 수많은 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ONS) have been tested for 항바이러스 활성. 그러나, 이러한 안티센스 ONs는 서열-특이적이며, 또한 전형적으로 약 16-20 nts 길이이다.
[0145] 실시예 1 및 2의 결과들에 의하여 입증된 바와 같이, 상기 무작위 PS-ODNs의 항바이러스 효과는 서열 특이적이지 않다. 상기 시험들에 사용된 PS-ODNs 의 부피와 농도등을 고려하여 특정한 무작위 서열이 상기 혼합물에서 1복제수 이상으로 존재한다는 것은 이론적으로 거의 불가능하다. 이는 상기 PS--ODNs 랜더머들에서 안티센스 효과가 없을 수 있다는 것을 의미한다. 후자의 구현예에서, 항바이러스 효과가 PS-ODNs의 서열-특이성에 의하여 유발되었을 것이다. 따라서 이러한 효과는 가능할 것 같지 않은 결과인 단지 하나의 분자에 의해서 유발되어야만 한다는 것이다. 예를 들어, 길이가 40염기인 ON 랜더머에 대하여, 그 집단에서 어느 특정한 서열은 이론적으로 전체 분획의 1/440 또는 8.27ⅹ10-25으로 나타낼 것이다. 주어진 1 mole = 6.022ⅹ1023 분자라는 것 및 본 발명자의 가장 큰 합성이 현재 15 micromole 크기이라는 사실들로서는 모든 가능한 서열들이 존재하지 않을 것인데, 그래서 각 서열은 1복제수로서 대부분 존재한다. 물론, 본 발명의 가르침을 적용하는 당해 기술분야에 숙련된 이는 서열 특이적 ONs를 또한 사용할 수 있으나, 본 발명에서 발견된 비서열 상보적 활성을 이용한다. 따라서, 본 발명은 비서열상보적 ONs로 제한되는 것은 아니나, 바이러스 감염들을 치료하기 위한 서열- 특이적 안티센스 ONs 에 관한 사전 기술에 나타나 있는 것을 포기한다.
[0146]적용가능한 바이러스들(예를 들어, 데이터가 본 명세서에 기술된 것들을 포함하는)로서, 랜더머의 크기가 증가하는 것과 같이, 그것의 항바이러스 잠재력 (potency) 또한 증가한다. 현재 포스포라미디트(phosphoramidite)-기본 DNA 합성에서의 한계 때문에, 더 큰 PS-ODNs(예, 80- 및 120--mers)이 바람직한 크기 보다 작은 단편들로 상당히 오염된다는 것이 지적되어야 한다. 더 큰 올리고들(80 및 120 bp)이 나타내는 더 약한 효과들(염기 당 기준(basis)으로)은 상기 집단에서 더 낮은 농도의 전체 길이 랜더머들을 반영하며 또한 세포로의 감소된 흡수를 반영할 수 있다. 합당한 순도 (75% 전체 길이)의 더 큰 랜더머들(>40 염기)이 합성되고 정제된다면 및/또는 상기 ODNs의 세포 흡수가 전달 체계에 의하여 용이해진다면, 항바이러스 활성에서 훨씬 더 많은 증가를 얻는 것이 가능할 것이다.
[0147] 본 발명에서, 랜더머들(또는 다른 올리고뉴클레오티드)은 다음을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 몇몇 기작들에 의하여 바이러스 복제를 차단할 수 있다: 1. 바이러스 입자들(virions)의 흡착 또는 리셉터 상호작용 방지, 따라서 감염 방지, 2. 결함이 있는 바이러스 입자생성을 초래하는, 바이러스 조립 또는 캡시드들(바이러스DNA또는RNA 패키징과 경쟁하는)로 바이러스 게놈의 패키징(packaging) 도핑(doping), 3. 바이러스 방출 억제로 귀착함으로써, 또는 결함이 있는 바이러스 입자들의 방출을 유발함으로써, 패키징동안 캡시드의 형성 방지 또는 파괴 또는 다른 구조 단백질들과 캡시드 단백질들의 상호작용, 4. 주된 바이러스 성분 결합 및 그들의 활성 감소 또는 방지, 5. 바이러스 증식에 요구되는 주된 숙주 성분들 결합.
[0148] 현재 바이러스 억제가 성취되는 상기 기작에 한정되지 않고, 상기에 나타낸 바와 같이 바이러스 복제에 대한 ONs의 억제 특성들을 예측 및/또는 설명할 수 있는 몇몇 가능한 기작들이 있다. 이들 중 첫째는 ONs의 일반적인 압타머(aptameric) 효과가 세포 표면상의 단백질들 또는 바이러스 단백질들에 그것들의 부착을 위하여 바이러스 흡착 및 융합을 방지를 참작한다는 것이다. 효과를 위한 크기 역치(threshold)는 상호작용에 요구되는 누적된 차지(charge)의 결과일 수 있다.
[0149]두번째 가능한 기작은 ONs가 상기 바이러스의 패키징 및/또는 조립을 방지함으로써 세포내에서 기능할 수 있다는 것이다. 크기역 이상의 ONs는 새로운 바이러스들 내에 기능적 바이러스 게놈의 패키징을 방지하여 정상적인 캡시드/핵산 상호작용을 방해 또는 경쟁할 수 있다. 선택적으로, ONs은 정상 바이러스 출아(budding)를 방지하고, 바이러스 안정성을 변경하며, 또는 세포내 혼입시 바이러스 입자의 적절한 해체를 방지하여 정상 캡시드(capsid) 형성을 방지할 수 있다.
[0150]작용 기작이 아직 완전히 밝혀지지 않았지만, 시험 결과들은 현재 ONs가 임상적 상관관계, 아시클로비르, 간시클로비르, 리바비린, 및 단백질분해효소 억제자들(protease inhibitors)를 바교한 바이러스 억제에서 더 큰 유효성을 나타낸다. 이와 같이 본 발명대로 ONs 바이러스 감염 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 상기 치료된 바이러스 감염들은 인간 , 동물 및 식물 바이러스들에 의해 유발되는 것들일 수 있다.
폭넓은 범위(broad spectrum)의 항바이러스 활성
[00151]상기에 논의된 결론 및 본 명세서에 보고된 데이터들에 의하면, 무작위 ONs 및 ON 랜더머들이 바이러스 게놈의 조립 및/또는 패키징 및/또는 캡시드화(encapsidation)이 복제에서 요구되는 단계인 바이러스들에 대한 폭넓은 범위의 항바이러스 활성을 가질 수 있음을 나타냈다. 그 결과, 상기 가정을 테스트하기 위하여, 몇몇 다른 크기의 PS-ODN 랜더머들이 다양한 바이러스 감염의 세포모델에서 테스트되기 위하여 선택되었다. 수많은 이러한 시험들이 본 명세서내 구현예들에서 설명된다(실시예 1 및 2에 설명된 HSV-1 및 HSV-2상에서의 시험들 뿐만 아니라 CMV, HIV-1, RSV, 콕사키 바이러스 B2, DHBV, 한타바이러스, 파라독감 바이러스 및 우두 바이러스 시험들을 포함하여). 몇몇 테스트된 올리고뉴클레오티드에 나타난 고 활성 수준에도 불구하고, DOTAP, 리포펙타민 또는 올리고펙타민과 같은 올리고 전달 체계는 특히 더 큰 랜더머들(≥40 염기)에서 훨씬 더 큰 유효성들로 귀착될 수 있다.
폭넓은 범위(broad spectrum)의 항바이러스 활성상의 결론
[0152] 다른 바이러스들에서의 유효성 연구들은 무작위 ONs 및 랜더머들 다양한 다른 바이러스들에 대한 억제 특성들을 드러낸다는 것을 입증한다. 더욱이, 상기 연구들은 더 큰 랜더머들이 더 작은 랜더머들보다 바이러스 감염에 대하여 더 큰 유효성을 드러낸다는 결론을 뒷받침한다. 이는 모든 캡시드화하는 바이러스들에서 무작위 ONs또는ON 랜더머들 활성을 위한 공통(common) 크기 및/또는 차지(charge) 의존 기작을 제시한다.
[0153] HSV 및 CMV가 모두 헤르페스바이러스과의 이중 가닥 DNA 바이러스들인 반면, HIV는 레트로바이러스과 RNA 바이러스이고, 또한 RSV는 파라믹소바이러스과 RNA 바이러스이다. ON 랜더머들이 다양한 다른 바이러스들에서 바이러스 기능을 억제할 수 있다는 주어진 사실로서, 작성된 기작들에 한정되지 않고 상기에 논의된 바와 같이 다음의 기작들은 합당하다: A)세포막과의 바이러스 융합을 방지함으로써 ONs/ON 랜더머들은 압타머 효과를 거쳐 바이러스 감염을 억제하고 있다; 및/또는 B) ONs/ON 랜더머들은 결함이 있는 바이러스 입자들로 귀착되는 캡시드들 내부에 바이러스 입자들의 조립 또는 바이러스DNA의 패키징 방지 또는 도핑(doping)하고 있다; 및/또는 C) ONs/ON랜더머들은 상기 바이러스의 유전자 발현 및/또는 조립 및/또는 패키징에 요구되는 숙주 단백질들 또는 성분들을 방해하고 있다.
항바이러스 활성에 대한 요구조건(Requirement for antiviral activity)
[0154] 무작위 추출된 DNA 서열이 바이러스 억제에 충분해보이기 때문에, 항바이러스 활성이 포스포로티오에이트 변형의 부재시에 유지되는지 또한 유효성이 바이러스 게놈에서 찾은 무작위 서열 또는 특이적 서열 중 선별함으로써 증대되는지 아는 것이 흥미로울 것이다.
[0155]따라서, DNA 및 RNA 변형들은 랜더머들의 항바이러스 유효성에서 그 효과들에 관하여 연구되었다. 랜더머들은 비서열상보적 기전을 거쳐 작용하기 때문에, 상기 시험들은 핵산 구조(conformation) 및 항바이러스 유효성상의 차지(charge)분포에서 약간의 변화들을 테스트하기 위하여 디자인된다.
[0156] 다른 뉴클레오티드/뉴클레오시드 변형들에서 ODNs이 HSV-1, REP 2024, 2026, 2059 및2060을 억제하는지 테스트는 구현예에서 설명한 바와 같이 HSV-1 PRA에서 시험하였다. REP 2024(ODN 양 말단에서 4 염기상의 리보스(ribose)에 2-O-메틸 변형을 가지는 PS-ODN), REP 2026 (ODN 양 말단에서 4 염기사이에 연결을 위한 메틸포스포네이트 변형을 가지는 PO-ODN), REP 2059 (길이가 20염기인 RNA PS-ODN 랜더머) 및 REP 2060(길이가 30염기인 RNA PS-ODN 랜더머)는 항-HSV-1 활성을 보였다(도 11 참조).
[0157]하기의 구현예에서, 상기 항바이러스 효과는 단지 DNA 포스포로티오에이트 골격을 구성하는 ONs에 의하여 야기되며, 이러한 효과는 따라서 단 하나의 분자에 의하여 유발될 수도 있다. 그러나, 다른 골격 및 변형들은 양성 항바이러스 활성을 가져왔다. 물론, 본 발명의 본 발명의 가르침을 적용하는 당해 기술분야에 숙련된 이는 또한 다른 화학물질 ONs를 사용할 수 있다. 이에 한정되지는 않으나 포스포로티오에이트 변형과 같은 상기 ON의 변형변형변형러스 활성을 유익하게 하는 것으로 보인다. 이는 대개 요구된 ONs의 차지(charge) 및/또는 배지에서 및 세포내적에서 모두 DNA의 안정화 요구조건 때문인 것 같으며, 또한 상기 PS-ODNs의 키랄성(chirality)때문인 것 같다.
[0158]화합물 REP 2026은 변형되지 않은 PO-뉴클레오티드들 및 분해를 막는 두 말단에서의 4 메틸포스포네이트 연결들을 포함하는 중심 부분을 가지고 있을 때, 항 바이러스 활성을 보였다. 상기 결과는 분해로부터 보호받을 때 항바이러스제로 사용될 수 있음을 제시한다. 이 보호는 하기에 기술한 대로 말단에서 뉴클레오티드를 변형시키고 적절한 전달 체계를 사용함으로써 이룰 수 있다.
[0159]일반적으로, 사용된 DNA 서열 조성물, 랜더머, 무작위 염기서열 또는 특이적인 HSV-1 염기서열은 전체적인 효능에서는 효과가 조금밖에 없다. 그러나, 중간 길이에서, HSV-1 염기서열은 무작위 염기서열보다 거의 3배보다 더 강력했다 (도 10 참조). 상기 결과는 특이적 안티센스 기능성(functionality)은 HSV 서열에 대한 것이지만, 본 발명에서 제시한 비-안티센스 기작(비서열상보적 기작)은 상기 활성의 지배적인 부분임을 제시하는 것이다. 사실 ON의 길이가 40머로 되면 필수적인 모든 항바이러스 활성은 비-안티센스 효과의 의한 것이다.
랜더머의 낮은 독성
[0160]ON 랜더머를 사용하는 목적은 독성을 낮추는 것이다. 다른 염기 서열은 동물에서 일반적인 독성, 혈청 단백질과의 상호작용 및 면역체계와의 상호작용과 같은 여러 가지 반응을 야기시킬 수 있다고 알려져 있다(Monteith et al (1998) Toxicol Sci 46:365-375). ON 혼합물은 특정 서열의 수준이 매우 낮아서 서열이나 뉴클레오티드 조성물에 의한 상호작용이 없기 때문에 독성 효과를 낮출 수 있다.
약학적 조성물들
[0161]본 발명의 ON은 인간 또는 비-인간 동물에서 특정 바이러스 또는 바이러스의 그룹에 사용하기 위해 규제기관에 의하여 승인될 수 있는 바이러스 질병의 치료(또는 예방)에 유용한 치료 조성물 또는 제형의 형태이다. 이들 ON은 생리학적으로 및/또는 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 경우 약학적 조성물의 부분으로 사용될 수 있다. 담체의 특징은 투여 경로에 의존적일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 다른 활성 작용제 및/또는 활성을 향상시키는 작용제를 포함할 수 있다.
[0162]약학적 조성물 또는 제형 또는 동물의 치료 방법을 수행하기 위하여 본 발명의 ON 투여는 안내투여, 경구투여, 장내 투여, 흡입 또는 피부, 피하, 근내, 복강내, 경막내, 기관내 또는 정맥내(intravenous) 주사와 같은 다양한 통상의 방식으로 수행될 수 있다.
[0163]본 발명의 약학적 조성물 또는 올리고뉴클레오티드 제형은 추가로 이로 제한하는 것은 아니나 리팜핀(Rifampin), 리바비린(Ribavirin), 플레코나릴(Pleconaryl), 시도포비르(Cidofovir), 아시클로비르, 펜시클로비르(Pencyclovir), 간시클로비르(Gancyclovir), 발아시클로비르(valacyclovir), 팜시클로비르(Famciclovir), 포스카넷(Foscarnet), 비다라빈(Vidarabine), 아만타딘(Amantadine), 자나미비르(Zanamivir), 오셀타미비르(Oseltamivir), 레스퀴모드(Resquimod), 항프로테아제(antiproteases), HIV 통합 억제제(fusion inhibitors), 뉴클레오티드 HIV RT 억제제(예, AZT, 라미부딘(Lamivudine), 아바카비르(Abacavir), 비-뉴클레오티드 HIV RT 억제제, 도코노졸(Doconosol), 인터페론, 부틸레이트 하이드로옥시톨루엔(Butylated Hydroxytoluene, BHT) 및 하이페리신(Hypericin)와 같이 제한 없이 바이러스 질환을 치료하기 위하여 다른 화학치료 약물들을 더 포함할 수 있다. 이러한 부가적인 작용제들 및/또는 작용제들은 본 발명의 ON과 함께 상승적인 효과를 내기 위하여 약학적 조성물에 포함될 수 있다.
[0164]본 발명의 상기 약학적 조성물 또는 올리고뉴클레오티드 제형은 이로 제한하는 것은 아니며 다중 음이온(polyanionic) 작용제, 황산화된 다당류(sulfated polysaccharides), 헤파린(heparin), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 펜토산 폴리설페이트(pentosan. polysulfate), 폴리비닐 알코올 설페이트(polyvinylalcool sulfate), 아세만난(acemannan), 폴리하이드록시카르복실레이트(polyhydroxycarboxylates), 셀루로즈 설페이트(cellulose sulfate), 설포네이트 벤젠 (sulfonated benzene) 또는 나프탈렌 고리(naphthalene rings)를 포함하는 폴리머 및 나프탈렌 설포네이트(naphthalene sulfonate) 폴리머, 아세틸 프탈로일 셀루로즈(acetyl phthaloyl cellulose), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 소디움 카프레이트(sodium caprate), 양이온 양성 분자(cationic amphiphiles), 콜산(cholic acid)과 같은 폴리머를 제한 없이 더 포함할 수 있다. 폴리머는 몇몇 경우에서, 바이러스 입자에 결합 또는 흡착을 함으로써 세포에 바이러스 입자가 침투하는 것에 영향을 준다고 알려져 있다. 이러한 항바이러스 폴리머의 특징은 바이러스 입자에 결합 또는 흡착하는데 있어서ON과 경합하는데 유용하여 ON의 세포외 활성에 비하여 세포내 활성을 증가시킬 것이다.
대표적인 전달 시스템
[0165]형광물질로 표지된 랜더머들을 배양된 세포에 노출시킴으로써 PS-ODN의 흡수를 모니터링하였고(monitered), 그런 다음 2회 세척 후 용해된 세포에서 형광 강도를 측정하였다. 전달체 없는 조건 및 하기 지질을 기본으로 하는 전달 체계 중의 하나로 캡슐화시킨 조건으로 250 nM REP 2004-FL을 세포에 노출하여 세포내 흡수를 조사하였다; LipofectamineTM(Invitrogen), PolyfectTM(Qiagen) 및 OligofectamineTM (Invitrogen). 4 시간 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고, MPER용해 시약(PROMEGA)으로 용해시켰다. 도 34는 전달체 있을 때 및 없을 때 노출된 동일 수의 세포에서 상대적인 형광 효율을 보여준다. 전달체가 없을 때와 비교해서 사용된 모든 세가지 전달체가 있을 때 세포내 PS-ODN 농도가 상당히 증가한 것을 관찰하였다.
[0166]상기 시험 결과와 일치하는 것으로, 전달 시스템의 사용은 ON 랜더머의 항바이러스 활성을 상당히 증가시킬 수 있다. 부가적으로, 전달체들은 혈청 상호작용으로부터 화합물을 보호하여 부작용을 줄이고 조직 및 세포내 분포를 극대화 시킬 것이다.
[0167]PS-ODN은 천연 포스포디에스테르보다 내인성 뉴클레아제에 대해 훨씬 더 내성적이기는 하지만, PS-ODN도 완벽하게 안정하지는 않고 혈액 및 조직에서 천천히 분해된다. PS 올리고뉴클레오티드 약물의 임상적인 적용에 있어서 한계점은 정맥 주사 투여시 보체를 활성화시킬 수 있는 성질이 있다는 것이다. 일반적으로, 리포좀(liposomes) 및 다른 전달 시스템 약제 독성을 낮추고, 원형질에서 체류 시간을 증가시키고, 투과성이 높은 혈관계를 통하여 전달체의 분출로 질환 조직으로 활성화 약제를 전달함으로써 ON을 포함한 약제의 치료 인덱스를 증가시킨다. 더욱이PS-ODN의 경우, 지질 캡슐화는 순환하는 동안 잠재적인 단백질-결합 사이트의 상호 작용을 막는다. (Klimuk et al. (2000) J Pharmacol Exp Ther 292:480-488).
[0168]본 발명에서 기술된 결과들에 따르면, 본 발명에서 기술된 ON의 전달을 위하여 지질 친화적인(lipophilic) 분자들, 극성 지질들(polar lipids), 리포좀, 단일층(monolayers), 이중층(bilayers), 소포(vesicles), 계획화된 융합 소포(programmable fusogenic vesicles), 미셀(micelles), 싸이크로덱스트린(cyclodextrins), PEG, 이온영동(iontophoresis), 분말 주사 및 나노 입자들 (PIBCA, PIHCA, PHCA, 젤라틴, PEG-PLA과 같은)와 같은 전달 시스템을 사용할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 전달체계들을 사용하는 목적은 인간 및 동물에서 활성적인 화합물의 독성을 낮추고, 세포내 전달을 증가시키고, IC50을 낮추고, 혈청 단백질과 비-특이적인 결합으로부터 올리고뉴클레오티드들 보호하는 것이다.
[0169] PS-ODN 랜더머들의 길이가 증가할수록 항바이러스 활성 또한 증가함을 보였다. 더욱이, 이러한 활성은 바이러스 단백질(바이러스 용해물에서)에 대한 친화성이 증가한 것과 관련이 있다. 본 발명에서 포스포로티오에이트 변형이 단백질-DNA 상호작용의 친화성을 증가시키는 것으로 잘 알려져 있기 때문에 바이러스 용해물과의 상호작용을 측정하기 위하여 사용된 FP-기본 분석을 이용하여 점차적으로 길어진 PS-ODN 랜더머들이 FBS에 결합하는 능력을 측정하였다(도 28a). 이 에세이에서, 결합이 포화된 조건에서(mP 수치), 250 μg의 열로 불활성화 되지 않은 FBS는 형광물질로 표지된 20머의 PS--ODN 랜더머와 복합체를 형성한다. 표지하지 않은 길이가 증가하는PS-ODN 랜더머(REP 2003, REP 2004, REP 2006 및 REP 2007)를 표지된 베이트와 함께 FBS의 상호작용을 경합하기 위하여 사용하였다. 상기 시험시험과는 PS-ODN 랜더머의 길이가 증가할수록 FBS에 대한 친화도가 증가함을 명확히 제시하였다. 이러한 결과는 가장 높은 항바이러스 활성을 가진 PS-ODN은 단백질에 대해 가장 높은 친화도를 가지고 결합하는 것이라는 것을 제시한다.
[0170] Kandimalla 및 동료들(Kandimalla et al. (1998) Bioorg. Med. Chem. Left. 8:2103-2108)에 의하여 기술된 바와 같이 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드의 치료학적 문제 중의 하나는 단백질과의 상호작용의 증가에 의한 부작용이라는 것은 당업계 공지이다. 본 발명의 결과는 혈청 단백질과의 상호작용을 막으면서 세포 안으로 항바이러스 ON을 전달할 수 있는 적절한 전달 시스템의 실질적인 이점(benefits)을 제시한다.
[00171] 전달 시스템의 잇점을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 리포좀 기반의두 가지 전달 기술인 사이토펙틴(Cytofectin)과 DOTAP을 시험하였다. 본 발명자들은 고농도의 혈청(serum, 50%) 존재하에 PS-ODN 랜더머(randomer) REP 2006(사이토펙틴이나 DOTAP로 씌워진)이 293A 세포로 전달되는지, 표지된 REP 2006의 세포내 농도를 형광분석법(fluometry)으로 측정하여 확인하였다(도 28b 및 c). 전달 결과, REP 2006의 세포내 농도증가가 야기되고 DOTAP는 24 시간 후에 세포내 REP 2006 의 레벨이 현저히 증가하였다. 결국 본 발명자들은 시험관내 FP-기반의 상호작용분석에서 DOTAP(28d)과 사이토펙틴(28e)에 의해 혈청 단백질 상호작용으로 REP2006이 보호(protection)됨을 확인하였다. 캡슐화되지 않은 REP 2006은 혈청으로부터, 결합된 형광 올리고(oligo)와 경쟁할 수 있었으나 DOTAP 또는 사이토펙틴 REP 2006으로 캡슐화되면 더 이상 혈청 결합을 위해 경쟁할 수 없었다. 이러한 자료는 캡슐화가 올리고(oligo)를 혈청 상호작용으로부터 보호하며 그 결과 부작용은 더 적으면서보다 효과적인 치료효과를 얻을수 있다는 것을 나타낸다.
[00172] 전달 시스템을 사용하는데 있어서 또 다른 잠재적인 잇점은 비리온(virion)의 세포내 침투 증가와 같은 다른 기작을 통해 바이러스 감염 증폭을 막기위해 감염 비리온들을 이용해 흡착(adsorption)과 같은 상호작용으로부터 올리고뉴클레오티드를 보호할 수 있다는 것이다.
[00173] 다른 접근법은 특정 세포와의 친화도(affinity)를 증가시키는 분자들을 제한 항체(restriction antibodies), 수용체 리간드(ligand), 비타민, 호르몬 및 펩타이드가 없는 채로 전달시스템과 결합시킴으로써 세포 특이적인 전달이 가능하게 하는 것이다. 그러한 분자들은 제한 항체(restrictionantibodies), 수용체 리간드(ligand), 비타민, 호르몬 및 펩타이드 없이 분자.
[00174] 전달 시스템에 대한 추가적인 선택사양은 하기에 제공된다.
연결된 올리고데옥시뉴클레오티드(Linked ODN)
[00175] 실시예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 바이러스 복제를 저해할 능력을 방해하지 않는 다수의 방법으로 변형된다(modified). 예를 들어 올리고뉴클레오티드는 그들의 뉴클레오티드 잔기의 하나 또는 그 이상에서 다른 부분(moiety)에 연결되거나 결합되어 있다. 그러므로 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 변형은 활성, 세포 분배(distribution) 또는 세포의 섭취를 증가시키거나 세포막을 통과하는 수송을 특이적으로 증가 또는 감소시키는 하나 또는 그 이상의 부분(moiety) 또는 접합체(conjugate)에 화학적으로 결합 또는 분해나 배설로부터의 보호 또는 다른 이로운 특성을 제공하는 것과 관련될 수 있다. 그러한 이로운 특성은 예를 들면 낮은 혈청 상호작용, 높은 바이러스-단백질 상호작용, 전달을 위해 제형화되는 능력, 감지할 수 있는 신호, 향상된 약동학적(pharmacokinetical) 특성 및 낮은 독성을 포함한다. 그러한 접합체(conjugate) 군(group)은 1차 또는 2차 수산기와 같은 작용기(functional group)에 공유결합으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 접합체(conjugate) 부분(moiety)은 스테로이드 분자; 비-방향성 소수성(lipophilic) 분자, 펩타이드, 콜레스테롤, 비스-콜레스테롤(bis-cholesterol), 항체, PEG, 단백질, 수용성 비타민, 지용성 비타민, 다른 올리고뉴클레오티드또는 올리고뉴클레오티드의 활성 및/또는 생물학적 동등성을 향상시키는 또다른 분자를 포함할 수 있다.
[100176] 보다 상세하게는, 본 발명의 대표적인 접합체 군은 인터컬레이터(intercalator), 리포터 분자, 폴리아민(polyamines), 폴리아마이드(polyamides), 폴리에틸렌 글리콘(polyethylene glycols), 폴리에테르(polyethers), SATE, t-부틸(butyl)-SATE, 올리고머(oligomer)의 약력학적(pharmacodynamic) 특성을 증가시키는 군 및 올리고머의 약동학적 특성을 증가시키는 군을 포함할 수 있다. 대표적인 접합체 군은 콜레스테롤, 지질, 인지질, 바이오틴(biotin), 페나진(phenazine), 엽산(folate), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라퀴논(anthraquinone), 아크리딘(acridine), 형광(fluorescein), 로다민(rhodamine), 쿠마린(coumarin), 형광 핵염기(fluorescent nucleobase) 및 염료를 포함한다.
[00177] 본 발명의 내용에서 약력학적 특성을 증가시키는 군은 올리고머의 세포내 섭취를 향상시키고/또는 분해에 대한 올리고머 저항성을 향상시키고/또는 혈청 상호작용으로부터 보호하는 군을 포함한다. 본 발명의 내용에서 약동학적 특성을 증가시키는 군은 올리고머 흡수, 분배, 대사 또는 배출을 향상시키는 군을 포함한다. 대표적인 접합체 군은 국제특허(International Patent Application) PCTIUS92/09196(1992년 11월 23일 출원)에 기술되어 있는데, 상기 특허의 전문이 본 발명의 참고문헌으로 포함된다.
[100178] 접합체 부분은 콜레스테롤 부분 (Letsinger et al., Proc. Natf. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556),(Letsinger et al., Proc. Natf. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), 콜산(cholic acid, Manoharan et al., Bio org: Med. Chem. Let, 1994, 4, 1053-1060), 티오에테르(thioether, 예; 헥실-S-트리틸티올(hexyl-S-tritylthiol, Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660,306-309; Manoharan et al., Bio org. Med. Chem. Let,, 1993, 3, 2765-2770), 티오콜 에스테롤(thiochol esterol, Oberhauser et al., MCI. Acids Res., 1992, 20, 533-538), 비방향족 사슬(aliphatic chain, 예; 도데칸디올(dodecandiol) 또는 운데실(undecyl) 잔기(Saison-Behmoaras et at., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Left., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et at., Biochimie, 1993, 75, 49-54), 인지질, 예; 다이-헥사데실-락-글리세롤(di-hexadecyl-rac-glycerol) 또는 트리에틸-암모늄 1,2-다이-O-헥사데실-락-글리세로-3-H-포스포네이트(triethyl-ammonium 1,2-di-O--hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphornate, Manoharan et at., Tetrahedron Left., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(polyamine or a polyethylene glycol chain, Manoharan et at., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만테인 아세트산(adamantane acetic acid, Manoharan et at., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 부분(Mishra et at., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), 또는 옥타데실(octadecyl) 아민(amine) 또는 헥실아미노카르보닐 옥시콜레스테롤 부분 (hexylaminocarbonyl-oxycholesteroI moiety, Crooke et al., J. Pharmacol Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)와 같은 지질 부분을 포함할 수는 있지만 이에 한정되지는 않는다.
[00179] 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 활성 약물, 예를 들어 아스피린(aspirin), 와파린(warfarin), 페닐부타존(phenylbutazone); 이부프로펜(ibuprofen), 수프로펜(suprofen), 펜부펜(fenbufen), 케토프로펜(ketoprofen),(S)-(+)-프라노프로펜(pranoprofen), 카프로펜(carprofen), 단실사르코신(dansylsarcosine), 2,3,5-트리이오도벤조산(2,3,5-triiodobenzoic acid), 플루페남산(flufenamic acid), 폴린산(folinic acid), 벤조시아디아자이드(benzothiadiazide), 클로로시아자이드(chl또는othiazide), 디아제핀(diazepine), 인도메티신(indomethicin), 바비투레이트(barbiturate), 세파이오스포린(cephaiosporin), 설파제(sulfa drug), 항당뇨제, 항균 또는 항생제(상기에 국한되지는 않는다)에 접합될 수 있다.
[00180] 대표적인 올리고뉴클레오티드 접합체에 관해 기술하는 미국특허는 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525;465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580*731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4;605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258;506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552, 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및5,688,941를 포함한다. 각각은 전문이 본 발명의 참고문헌으로 인용된다.
[00181] 항바이러스 올리고뉴클레오티드를 준비하는 다른 방법은 s-아세틸티오-에틸 또는 s-피바스로일티오-에틸(s-acetylthio-ethyl 또는s-pivasloylthio-ethyl, Vives et al., 1999, Nucl Acids Res 27:4071-4076)과 같은 효소로 분리할 수 있는 전하 중화 내전제로 변형시켜 친지성 프로올리고뉴클레오티드(lipophilic prooligonucleotide)-로 준비하는 것이다. 그러한 변형은 세포로 올리고뉴클레오티드의 흡수를 증가시키는 것으로 나타났다.
비특이적인 올리고뉴클레오티드 디자인(Design)
[00182] 다른 방법으로는, 인간(또는 다른 피실험 개체) 게놈과 낮은, 바람직하게는 가능한한 최대로 낮은 상동성(homology)을 갖는 항바이러스 올리고뉴클레오티드를 준비하는 것이다. 목표는 인간 또는 동물 게놈 서열 및 mRNA와의 상호작용으로 인한 독성을 가장 적게 나타내는 올리코뉴클레오티드를 수득하는 것이다. 첫번째 단계는 예를 들어 무작위적인 방법으로(random fashion), 수동으로(manually) 또는 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 보다 일반적으로 뉴클레오티드 A, C, G, T를 배열함으로써 원하는 길이, 서열의 만들어내는 것이다. 두번째 단계는 올리고뉴클레오티드 서열을 유전자 은행(GenBank) 및/또는 EHGD(Ensemble Human Genome Database)와 같은 인간 서열 라이브러리와 비교하는 것이다. 원한다면 서열 또는 피실험 개체의 게놈과 낮은 상동성을, 바람직하게는 전체 게놈과 가장 낮은 상동성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 확인하기 위해 서열 생성과 비교는 반복적으로 실시될 수 있다.
안티센스(antisense) 활성을 갖는 비특이적인 올리고뉴클레오티드
[00183] 또 다른 방법에서, 최종 올리고뉴클레오티드의 활성을 증가시키기 위해 항바이러스 비특이적인 서열 부분은 안티센스 서열부분과 결합(couple)되어 있다. 올리고뉴클레오티드의 비특이적인 부분은 본 발명에 기술되에 있다. 안티센스 부분은 바이러스 mRNA에 상보적이다.
G-rich motif 활성을 갖는 비특이적인 올리고뉴클레오티드
[00184] 또 다른 방법은 항바이러스 비특이적인 서열부분은 최종 올리고뉴클레오티드의 활성을 향상시키기 위해 모티프(motif) 부분과 결합되어 있다. 올리고뉴클레오티드의 비특이적인 부분은 본 발명에 기술되어 있다. 모티프 부분은 면역체계의 자극제로 문헌에 기록되어 있는 CpG, Gquartet 및/또는 CG에 한정되지는 않으나 이를 포함할 수 있다(Agrawal et al. Curr. Cancer drug Targets 3:197-209, 2001).
비-왓슨-크릭 (non -Watson-Crick) 올리고뉴클레오티드
[00185] 또 다른 방법은 한 가지 유형 또는 그 이상의 비-왓슨-크릭 뉴클레오티드/뉴클레오사이드로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 PS-ODN과 다음의 특징 중 일부가 유사할 수 있다.a) 전체 전하 b) 단위(unit) 사이의 공간 c) 사슬의 길이 d) 한쪽에 음전하가 축적된 알짜 쌍극자(net dipole) e) 단백질에 결합하는 능력 f) 바이러스 단백질에 결합하는 능력 g) 세포에 침투하는 능력 h) 허용가능한 치료 목록 I) 항바이러스 활성. 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오산(phosphorothioate) 골격을 갖는 것이 바람직하지만 그에 국한되지는 않는다. 비-왓슨크릭 뉴클레오티드/뉴클레오사이드의 예는 Kool, 2002, Acc. Chem. Res. 35:936-943; and Takeshita et al.,(1987) J. Biol. Chem. 262:10171-10179 에 기술되어 있는데 여기에는 합성 abasic 부위를 포함하는 ODN이 기술되어 있다.
항바이러스 중합체(polymer) .
[00186] 또 다른 방법은 포스포로티오산 ODN의 활성과 유사한 폴리머를 사용하는 것이다. 문헌에 기술된대로 몇가지 음이온성 중합체들은 항바이러스 억제 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 이러한 중합체들은 몇가지 군으로 나뉜다(1) 폴리사카라이드의 황산 에스테르 (덱스트린과 덱스트란 황산; 셀룰로스 황산);(2) 술폰산 벤젠(sulfonated benzene) 또는 나프탈렌 고리를 포함하는 중합체 및 나프탈렌 술폰산 중합체;(3) 폴리카르복실산(polycarboxylate, 아크릴산 중합체(acrylic acid polymer)); 및 아세틸 프탈로일 셀룰로스(Neurath et al.(2002) BMC Infect Dis 2:27); 및 (4) abasic 올리고뉴클레오티드(Takeshita et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:10171-10179). 비-뉴클레오티드 항바이러스 중합체의 다른 예들은 문헌에 기술되어 있다. 본 발명에 기술된 중합체는 본 발명에 기술된 PS-ODN과 유사하고 PS--ODN과 유사한 다음의 특징을 가지고 있다: a) 사슬의 길이; b) 한 쪽에 음전하가 축적된 알짜 쌍극자; c) 단백질에 결합하는 능력; d) 바이러스 단백질에 결합하는 능력, e) 가능한 치료 목록, f) 항바이러스 활성. PS-ODN의 효과와 유사하도록 하기 위하여, 항바이러스 중합체는 바람직하게는 PS-ODN과 비교할 때, 단위(unit) 간 유사한 다중음이온(polyanion) 분배를 가질 수 있다. 또한 단독으로 또는 전달 시스템과 결합하여 세포로 침투할 수 있는 능력을 가지고 있을 것이다.
이중가닥 PS-ODN의 항바이러스 활성
[100187] 무작위 서열(REP 2017)과 그의 보완물(complement, PS 변형된 또는 변형되지 않은)은 본 발명에 기재된 것처럼 형광으로 표지되어 있고 순수분리된 HSV-1 과 HIVA 단백질에 결합하는 능력은 형광 분극(polarization)으로 테스트된다. 혼성화(Hybridization)은 아크릴아마이트 젤 전기영동에 의해 확인된다. 단일 또는 이중가닥의 변형되지 않은 REP 2017(2017U)는 HSV-1 또는 HIV-1 세포 상등액(lysates) 어느 것에서도 결합 활성을 가지고 있지 않았다. 그러나, 단일 가닥이거나 이중 가닥인 PS 변형된REP 2017는 HSV-1과 HIV-1 삽입이 가능했다(도 33 참조).
[00188] 본 발명에 기술된 결과에 따르면, 효과적인 항바이러스 물질로 사용하는 한가지 방법은 이중가닥 올리고뉴클레오티드로 사용하는 것이다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오산(phosphorothioate) 골격을 가지고 있는 것이 바람직하나 여기에서 기술된대로 단일가닥 올리고뉴클레오티드에 대하여 전달 및/또는 항바이러스 활성 및/또는 안정성을 증가시키는 다른 추가적인 변형을 가지고 있을
수 있다.
약물 발견을 위한 시험관 분석
[00189] 시험관 분석은 PS-ODN이 바이러스 성분, 예를 들어 바이러스 단백질에 결합하는 능력을 측정하기 위해 형광 분극에 기초를 두고 개발되었다. 단백질(또는 또 다른 상호작용자(interacinor))이 형광 표지된 베이트(bait)에 결합할 때, 용액내에 있는 베이트의 삼차원 텀블링(tumbling)은 느려진다. 이러한 텀블링의 지연은 표지된 베이트로부터 여기된(excited) 빛의 분극의 증가에 의해 측정된다. 그러므로 분극의 증가는([mP]로 나타나는 무차원 측정(dimension less measure))은 결합 증가와 관련되어 있다.
[00190] 하나의 방법은 3'말단에 구부러지지 않는 결합자(inflexible linker, 3'-(0-Fluorescein) CPG)를 사용하여 FITC로 표지한 PS-ODN 랜더머(randomer)를 베이트로 사용하는 것이다. 이 PS-ODN 랜더머는 분석 완충용액에 2Nm로 희석하였다(10mM Tris, pH7.2, 80mM NaCl, 10mM EDTA, 100mM b-mercaptoethanol and 1 % tween 20). 그리고나서 이 올리고는 적당한 상호작용자와 혼합시켰다. 이 경우에 본 발명자들은 수크로스(sucrose) 농도구배로 순수분리된 HSV-1(strain Maclntyre), HIV-1(strain Mn) 또는 RSV(strain A2)를 0.5M KCI 및 0.5% Triton X-100(HSV-1 및 HIVA) 또는 10mM Tris, pH7.5, 150mM NaCl, 1 mM EDTA 및 0.1% Triton X-100(RSV)에 현탁했다. 베이트 상호작용에 이어 표지되지 않은 다양한 PS-ODN을 이용하여 복합체들이 복합체로부터 베이트를 유리시키는 능력을 측정하였다. [00191] 도 29에서, 본 발명자들은 다른 길이의 세가지 베이트(6(REP 2032-FL), 10(REP 2003-FL) 및 20 개의 염기(REP 2004-FL))로 예비 테스트를 실시하였다. 이러한 베이트들은 HSV-1(도 29a) , HIV-1(도 29b) 및 RSV(도 29c) 세포 파쇄액과 상호작용하는 능력을 테스트하였다. 바이러스 세포 파쇄액의 존재하에 결합 정도는 사용된 베이트 크기에 의존적이었고 2004-F의 mP(결합)이 가장 크게 이동(shift)했다. 본 발명자들은 이것이 PS-ODN 랜더머의 크기 의존적인 항바이러스 효과와 유사하다는 것을 알아내었다. 그리고나서 상기 베이트는 다른 크기의 PS-ODN이 베이트와 세포파쇄액 간의 상호작용과 경쟁하는 능력을 측정하는데 사용되었다. [00192] 도 30에서, REP 2004-FL 와HSV-1(도30a), HIV-1(도30b) 및 RSV(도30c) 세포파쇄액의 상호작용은 PS-ODN의 크기를 증가시키면서 실험하였다. 테스트된 각각의 바이러스 세포 파쇄액에 대하여, 본 발명자들은 REP 2003이 세포파쇄액 없이는 베이트와 경쟁할 수 없다는 것을 알아내었다. 베이트 상호작용은 REP 2004(표지되지 않은 베이트) 경쟁자(competitor)에 의해 일어난 상대적으로 약한 경쟁에서 나타난대로 매우 강력했다. 그러나 경쟁자 PS-ODN의 크기가 20 염기 이상 증가함에 따라 베이트를 대체할 능력은 보다 강해졌다. 이는 PS-ODN 랜더머의 크기가 증가함에 따라 바이러스 세포파쇄액에서 단백질 성분에 대한 친화도가 증가함을 나타낸다. 이러한 현상은 HSV-1, HSV-2, CMV, HIV-1 및RSV에 대해 PS-ODN 랜더머 항바이러스 활성이 더 크게 증가함을 나타낸다.
[00193] 베이트 경쟁의 효과와 PS-ODN 랜더머의 항바이러스 활성 사이의 유사성은 이러한 분석 패러다임이 항바이러스 활성의 좋은 예보(predictor)가 됨을 나타낸다. 상기 분석은 강력하고 수행하기 간편하며 매우 안정하여, 특이적인 목표 확인(target identification)이 아닌 하나 또는 그 이상의 성분, 예를 들어 바이러스 단백질과 상호작용하는 능력에 기초를 둔 새로운 항바이러스 분자를 식별할 수 있는 고생산성 스크리닝의 매우 훌률한 후보이다.
[00194] 본 발명에 기재된 방법은 어떠한 원천, 예를 들어 조합화학(combinatorial chemistry)에 의해 합성되거나 천연물질의 순수분리에 의해 분리된 라이브러리로부터 새로운 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은,새로운 올리고뉴클레오티드의 적합한 크기, 변형 및 골격을 결정;새로운 중합체를 포함하는 새로운 분자를 테스트; 특정 바이러스의 새로운 올리고뉴클레오티드 또는 새로운 화합물에 대한 감수성(susceptibility)을 예측; 또는 특정 바이러스를 최대로 억제하는 화합물의 적합한 수트(suite)를 결정하는데 이용될 수 있다.
[00195] PS-ODN 랜더머의 크기가 증가할수록 세포파쇄액과의 친화도가 증가하는 것은 PS-ODN 랜더머의 항바이러스기작이 하나 또는 그 이상의 비리온(virion)의 감염 또는 정확한 복제를 억제하는 바이러스 단백질 성분과의 상호작용에 기반을 두고 있음을 나타낸다. 또한 이러한 상호작용이 전하(크기)와 관계가 있고 서열과는 관계가 없다는 것을 나타낸다. 이러한 PS-ODN 랜더머가 몇가지 다른 과(family)에 결쳐있는 다수의 바이러스에 대해 크기 의존적인 활성을 가지고 있기 때문에 본 발명자들은 PS-ODN 랜더머가 일반적으로 전하 의존적인 단백질-단백질 상호작용, 단백질--DNA/RNA 상호작용, 및/또는 다른 분자-분자 상호작용을 방해한다는 것을 나타낸다. 이러한 상호작용은 다음을 포함한다(그러나 다음에 한정되지는 않는다):
a. 캡시드(capsid) 를 형성하는 동안 각각의 캡시드 서브유닛 간의 상호작용.
b. 캡시드/뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질과 바이러스 게놈 간의 상호작용.
c. 출아(budding) 중 캡시드와 당단백질(glycoprotein) 간의 상호작용
d. 감염 중 당 단백질과 그 수용체 간의 상호작용.
e. 바이러스 복제에 관련된 다른 바이러스 중요 성분 간의 상호작용.
[00196] 이러한 단백질-단백질 상호작용의 복합적, 동시적 억제는 항 바이러스 억제의 새로운 기작을 나타낸다.
세포 파쇄액에서 PS-ODN 서열 조성(compositon)의 영향
[00197] 본 발명자들은 몇몇 바이러스 세포 파쇄액과 상호작용하는 다른 서열의 PS-ODN의 능력을 모니터했다. 각각의 경우에, 본 발명에 기술된대로 20-머 PS-ODN은 3' 말단을 FITC로 표지하였다. 테스트한 PS-ODN은 A20, T20, G20, C20, AC10, AG10, TC10, TG10, REP 2004 및REP 2017을 포함한다. 이 서열의 각각은 분석 완충용액에 4nM로 희석되었고 HSV-1, HIV-1 또는RSV 세포 파쇄액 lug 존재하에 정온배치되었다. 상호작용은 형광 분극에 의해 측정된다.
[00198] 테스트된 모든 서열과의 상호작용 프로파일(profile)은 모든 바이러스 세포 파쇄액에서 유사하다. 이는 결합 상호작용의 성격이 매우 유사함을 나타낸다. 각각의 세포 파쇄액내에서 동일한 조성(A20, G20, T20, C20)의 PS ODN은 A20과 가장 약한 상호작용을 나타내었는데 이는 다른 것들과 상당한 차이로 가장 약한 상호작용자였다. 테스트한 나머지 PS-ODN들에서, 그들 모두는 TG10만 제외하고 유사하게 강한 상호작용을 나타냈는데 TG10은 각각의 세포 파쇄액에서 지속적으로 가장 강한 상효작용을 나타내었다(도 35 참조).
HIV에서 PS-ODN 랜더머(randomer) 에 대한 목표물 확인.
[00199] PS-ODN 랜더머가 순수분리된 HIV-1 단백질에 결합하는 능력은 실시예 9에 기재된대로 형광분극에 의하여 테스트된다. 순수분리된 HIV-1 p24 또는 HIV-1 gp41의 증가분은 REP 2004-FL과 반응했다(도 31 참조). 본 발명자들은 이러한 단백질간에 대해 단백질 농도 의존적인 형광분극의 이동(shift)을 확인하였고 이는 이러한 단백질 간의 상호작용을 나타낸다.
[00200] PS-ODN 랜더머의 크기 범위에 단백질에 결합하는 능력은 REP 2032, REP 2003, REP 2004, REP 2006 및REP 2007의 형광 버전을 사용하여 테스트하였다(도 32 참조). 본 발명자들은 p24와 크기 의존적인 상호작용은 없으나(도 32a 참조) 20보다 더 많은 염기를 가진 PS-ODN 랜더머에서 gp41 결합 증가를 관찰하였다. 이는 PS-ODN 랜더머 길이가 20 개의 염기 이상으로 증가하면 gp41의 카피 다수가 각각의 랜더머에 결합하여 분극을 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
[00201] 이는 올리고뉴클레오티드의 크기가 커짐에 따라 바이러스 합성 중에 구조 단백질을 고립시키고(sequester) 새로운 비리온 생성 능력을 제한할 잠재력이 있음을 나타내는 것이다.
고친화도(High affinity) 올리고뉴클레오티드
[00202] 다른 방법은 올리고뉴클레오티드의 시작 풀(starting pool)에서 올리고뉴클레오티드의 평균 친화도보다 바이러스 단백질과 같은 바이러스 성분에 더 높은 친화도를 갖는 항바이러스 올리고뉴클레오티드를 농촉(enrich)하거나 순수분리하는 방법이다. 상기 방법은 예를 들어 상승된 결합친화도를 갖게 하는 3차원적 형태를 나타내는 하나 또는 그 이상의 바이러스 성분에 친화도 증가를 나타낼 서열 상보적이지 않은 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드를 제공할 것이다. 이에 적합한 이론적 근거는 올리고뉴클레오티드가 이 바이러스 성분과 결합하는데 있어 선 분자(linear molecule) 로 작용할 것이라는 것이다.
그들은 또한 그러한 바이러스 성분과의 상호작용을 촉진할 수 있는 3차원 구조로 접힐 수 있다(folding). 특정 기술에 의존하지 않고 고친화도 올리고뉴클레오티드는 다음의 방법으로 순수분리되거나 농축(enrich)될 수 있다.
[00203] 고친화도 올리고뉴클레오티드 또는 고친화도 올리고뉴클레오티드의 다수(plurality)를 순수분리하는 한가지 방법은, 올리고뉴클레오티드에 결합시키기 위한 친화도 매트릭스로 결합된 바이러스 단백질을 가진 고정상(stationary phase) 배지를 이용하는 것과 관련되어 있다. 이는 매우 엄격한(stringent) 조건(예를 들어 염 또는 다른 무질서 유발(chaotropic) 물질의 농도를 증가시키고/거나 온도를 증가시키는 것 및/또는 pH에 변화를 주는 것)하에서 용리될 수 있다. 예를 들어, 그러한 방법은 다음에 의하여 수행될 수 있다:
(a) 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)을 고정상에 결합된 바이러스 단백질이나 몇몇 바이러스 단백질 또는 바이러스 세포 파쇄액을 가지고 있는 교환컬럼(exchange column)에 로딩(loading)하는 단계;
(b) 예를 들어 증가된 염 용액과 같은 여과기(displacer)용액을 사용하여 결합된 올리고뉴클레오티드를 컬럼으로부터 분리(용리)하는 단계;
(c) 다른 염 농도에서 용리된 올리고뉴클레오티드의 분획을 모으는 단계;
(d) 다른 분획에서, 보다 바람직하게는 고농도염의 분획으로부터 용리된 올리고뉴클레오티드를 클로닝하고 시퀀싱(sequencing)하는 단계, 고농도의 염에서 용리된 올리고뉴클레오티드는 바이러스 단백질에 더 큰 결합 친화도를 갖고 있다; 및
(e) 시퀀싱된 올리고뉴클레오티드의 활성을 결합 및/또는 바이러스 억제 분석(viral irihibiton assay) 으로 테스트하는 단계, 예를 들어 본문에 기술된 형광 분극-결합 분석 및/또는 세포내 바이러스 억제 분석 및/또는 동물내 바이러스 억제 분석.
[00204] 두번째 예에서, SELEX 방법(Morris et al(1998) Biochemistry 95:2902-2907) 에서 유래하고 변형된 방법은 고 친화도 올리고뉴클레오티드를 순수분리하는데 이용될 수 있다. 그러한 방법 중 하나는 다음과 같이 수행될 수 있다:(a) 시작 올리고뉴클레오티드 풀(starting ON pool )물질을 제공하는 단계, 예를 들어 다수의 서열, 예를 들어 1014내지 1016의 서로 다른 서열과 접촉하는 합성, 임의 올리고뉴클레오티드의 집합을 제공하는 단계. 각각의 올리고뉴클레오티드 분자는 각 말단에 중합효소연쇄반응(PCR)을 용이하게 실시하도록 프라이머 결합 서열에 이어진 무작위 서열의 조각을 포함한다. 분자들 모두의 뉴클레오티드 서열은 고유하기 때문에 구조의 대다수가 모집단에 표집되어있다. 이러한 구조는 각 분자의 생화학적 특성, 예를 들어 주어진 바이러스 목표 분자에 결합하는 능력 같은 특성을 결정한다;
(b) 올리고뉴클레오티드를 하나의 바이러스 단백질 또는 몇 가지 바이러스 단백질 또는 바이러스 세포 파쇄액과 접촉시키는 단계;
(c) 젤 이동(native gell shift) 및 니트로셀룰로스 여과(nitrocellulose filtration)와 같이 결합된 올리고뉴클레오티드와 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드를 분리할 수 있는 기술을 사용하여 바이러스 단백질에 결합하는 올리고뉴클레오티드를 선별하는 단계. 이러한 방법은 물리적으로 결합되지 않은 것과 결합된 것을 분리시켜 가장 잘 결합하는 서열의 우선 회수(preferential recovery)를 가능하게 한다. 또한, 작은 단백질에 결합하는 올리고뉴클레오티드를 선별하기 위해, 목표물을 고형 지지대에 부착시키고 그 지지대를 친화도 순수분리 매트리스로 사용하는 것이 바람직하다. 결합되지 않는 분자들은 씻겨나가고 결합된 분자들은 자유로운 목표물로 용리되어 다시 물리적으로 결합된 것과 결합되지 않은 것을 분리한다;
(d) 용리된 결합 올리고뉴클레오티드를 증폭하는 단계, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 양쪽으로 이어진(flanking) 서열에 혼성화하는 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하는 것;
(e) 바이러스 단백질에 가장 높은 결합 친화도를 나타내는 올리고뉴클레오티드를 우선 회수하기 위하여,(b)(c) 및(d) 단계는 여러 번 실시될 수 있다(즉 농축 및 증
폭을 여러 주기 또는 여러 횟수(round)로). 몇 주기의 농축(enrichment)및 증폭 후에, 모집단(population)은 원하는 생화학적 특성을 나타내는 서열의 수가 훨씬 많아진다;
(f) 농축주기(예를 들어 마지막 주기)에서 선택된 하나 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드를 클로닝 및 시퀀싱하는 단계; 및
(g) 분석(assay)에서 시퀀싱된 올리고뉴클레오티드의 결합 및/또는 활성을 테스트하는 단계, 예를 들어 본문에 기재된대로 형광분극분석 및/또는 세포내 바이러스 억제 분석 및/또는 동물내 바이러스 억제분석.
[00205] 다른 방법은 Yang et al(2002) Nuch Acids Res. 30(el32):1-8에 기재된 것처럼 one-비드(bead) one-PS-ODN 과 one-PS2-ODN 라이브러리를 생성하기 위하여 분할 합성(split synthesis) 방법을 변형시켜 적용하는 것이다. 바이러스 단백질에 특이적인 비드(bead)를 결합시키고 선택하는 것이다. 핵산 염기와 티오에이트/다이티오에이트(thioate/dithioate) 결합의 위치 시퀀싱은 선택한 비드의 PCR-기반 확인 표지(PCR based identification tag)를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 방법은 바이러스 단백질에 결합하여 잠재적인 항 바이러스 특성을 나타내는 PS-ODN 또는 PS2-ODN을 빠르고 간편하게 찾을 수 있도록 한다.
[00206] 일단 고친화도로 바이러스 단백질에 결합하는 특정 서열이 결정되면(예를 들어, 각각의 서열을 증폭하고 시퀀싱함으로써), 하나 또는 그 이상의 고친화도 서열은 고친화도 올리고뉴클레오티드를 준비하기 위해 제공되기 위해 선택되고 합성될 수 있다(예를 들어, 화학적 또는 효소적 합성에 의해) 이는 약동학적 특성을 포함하여 그들의 특성을 향상시키기 위하여 변형될 수 있다. 그러한 고친화도 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 이용될 수 있다.
프리온(Prion) 질병
[00207] 프리온 질병의 치료, 조절, 또는 예방을 위해서 또다른 방법이 본 발명의 변형된 실시예(alternative embodiment)에서 사용된다. 이러한 치명적인 신경퇴화질병(neurodegenerative disease)은 감염되고 인간과 동물에 모두 영향을 끼칠 수 있다. 세포내 프리온 단백질, PrPC의 스크래피 동위형(scrapie isoform)인, PrPSC으로의 구조 변화는 프리온 질병의 발병과 진행에 있어 꼭 거쳐야 하는 단계(obligatory step)로 여겨진다. 아밀로이드 중합체(Amyloid polymer)는 프리온 질병의 신경병리학(neuropathology) 과 연관되어 있다.
[00208] 프리온 단백질 단편과 이중가닥 핵산을 정온배치하면 아밀로이드 섬유(fibre)가 형성된다(Nandi et al(2002), J Mol Blot 322: 153-161). 포스포로티오산(포스포로티오산)과 같은 단백질에 친화도를 갖는 올리고뉴클레오티드는 이중가닥 핵산과 PrPC 이 상호작용하는 것과 경쟁하거나 상호작용을 억제하여 아밀로이드 중합체 형성을 멈추게 하기 위하여 사용된다. 다른 크기와 조성의 올리고뉴클레오티드는 프리온 질병을 앓는 환자를 치료하기 위하여 또는 고위험상황 예방(prophylaxis)을 위해 적합한 전달 형태로 사용될 수 있다. 그러한 방해(interfering) 올리고뉴클레오티드는 Nandi et al.(상기와 동일) 에 기재된 것과 같이 테스트 올리고뉴클레오티드의 존재하에서 아밀로이드 중합체의 접힘(folding) 변화를 측정함으로써 알아낼 수 있다.
추측되는 바이러스 병인들(Putative viral etiologies)
[00209] 본 발명의 실시예에서는 다음에 기술되어 있는(이에 국한되지 않고) 바이러스 병인을 가졌다고 추정되는 질병 또는 상태를 치료 또는 방지하기 위해 또다른 방법을 사용한다. 바이러스는 주로 바이러스 감염과 관련되지 않았다고 생각되는 질병과 상태에서도 질병을 일으키는 흔한 물질이다. 예를 들어, 관절염(arthritis)은 HCV(Olivieri et al.(2003) Rheum Dis Clin N또는th Am 29:111-122), 파르보바이러스(Parvovirus) B19, HIV, HSV, CMV, EBV, 및 VZV(Stahl et al.(2000) Clin Rheurnafol 19:281-286)와 관련되어 있다. 다른 바이러스들은 또한 각기 다른 질병의 원인이 된다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어 파킨슨 질환에서 인플루엔자 A(influenza A, Takahashi et al.(1999), Jpn J Infect Dis 52:89-98), 코로나바이러스(Coronavirus), EBV 및 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)에서 다른 바이러스들(Talbot et al(2001) Curr Top Microblol Immunol 253:247-71); 만성 피로 증후군에서 EBV, CMV 및HSV-6(Lerner et al.(2002) drugs Today 38:549-561); 및 천식(ashma, Walter et al(2[702] J Clin Invest 110:165-175)와 파젯 병(Paget's disease)에서 파라미소바이러스(paramyxoviruses); 및 길리언-바레 증후군(Guiliain-Barre Syndrome)에서HBV, HSV, 및 인플루엔자(influrenza).
[00210] 이러한 병인들 때문에, 본 발명을 이용하여 관련 바이러스을 억제하여 해당 질병이나 상태의 진행 또는 적어도 상기 질병의 몇가지 증상을 미루거나 지연시키거나 방지할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 변형과 합성
[10021] 상기 요약에 기재된 것처럼, 변형된 올리고뉴클레오티드는 본 발명에서 유용하다. 그러한 변형된 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 변형된 골격 또는 자연에 존재하지 않는 뉴클레오사이드내 결합(internucleoside linkage)을 포함한다. 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드는 골격에 인 원자(phosphorus atom)를 갖고있는 올리고뉴클레오티드와 인 원자를 갖고 있지 않은 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[00212] 그러한 변형된 올리고뉴클레오티드 골격은 예를 들어 포스포로티오산(phosphorothioates), 키랄(chiral) 포스포로티오산, 포스포로디티오산(phosphorodithioates), 포스포트리에스테르(phosphotriesters), 아미노알킬포스포트리에스테르(aminoalkylphosphotriesters), 3'-알킬렌포스포네이트(alkylene phosphonates), 5'-알킬렌포스포네이트(alkylene phosphonates) 및 키랄 포스포네이트를 포함하여 메틸(methyl) 및 다른 알킬 포스포네이트(alkyl phosphonates), 포스포네이트(phosphonates), 3'-아미노포스포나미데이트(aminophosphonamidates) 및 아미노알킬포스포아미데이트(aminoalkylphosphoramidates)를 포함하여 포스포아미데이트(phosphonamidates), 티오노포스포아미데이트(thionophosphoramidates), 티오노알킬포스포네이트(thionoalkylphosphonates), 티오노알킬포스포트리에스테르(thionoalkylphosphotriesters), 셀레노인산 (selenophosphates), 카르보아닐인산(carboranylphosphate) 및 정상적인 3'-5' 연결, 이들의2'-5' 연결된 아날로그(analog) 및 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드내 결합(internucleotide linkage)이 3' 에서 3'로, 5'에서 5'로 또는 2' 에서2'로의 결합인 역전된 극성(polarity)을 갖고있는 보라노인산(borano-phosphate)을 포함한다. 역전된 극성을 갖고있는 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 3'-가장 내부뉴클레오티드 결합(most internucleotide linkage)에 단일한 3' 에서 3'로의 결합을 갖고 있다. 즉 어베이직 뉴클레오베이스(abasic nucleobase)는 수산기(hydroxyl group)기 없거나 하나의 수산기를 가지고 있다)인 단일한 역전된 뉴클레오사이드를 포함한다. 다양한 염, 혼합된 염 및 자유 산 형태(free acid form) 또한 포함되어 있다.
[00213] 인(phosphorus) 포함 결합을 가진 올리고뉴클레오티드 준비는 상기에 기재된 대로이다. 예를 들어 미국특허 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676, 5,4Q5,939-,5,453,496, 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306, 5,550,111; 5,563,253; 5,5T1,799; 5,587,361; 5,194,599; 5,565,555; 5,527,899; 5,721,218; 5,672,697 및5,625,050 각각은 참고문헌으로 전문이 본 발명에 인용된다.
[00214] 인을 포함하지 는 몇가지 대표적인 변형된 올리고뉴클레오티드 골격은 짧은 체인의 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드내 결합(internucleoside linkage), 혼합된 이원자(heteroatom) 및 알킬 또는 사이클로알킬(cycloalkyl) 뉴클레오사이드내 결합(intemuceoside linkage) 또는 하나 또는 그 이상의 짧은 체인 이분자(heteroatomic) 또는 이환(heterocyclic) 뉴클레오사이드내 결합으로 형성된 골격을 가지고 있다. 이들은 모폴리노 결합(morpholino linkages, 뉴클레오사이드의 당(sugar) 부위로부터 일부분 형성된)를 가지고 있는 것들을 포함한다; 실로제인(siloxane) 골격; 황화물(sulfide), 술폭사이드(sulfoxide) 및 술폰(sulfone) 골격; 포름아세틸(formacetyl) 및 티오포름아세틸(thioformacetyl)골격; 메틸렌 포름아세틸(methylene formacetyl) 및 티오포름아세틸(thioformacetyl) 골격; 리보아세틸(riboacetyl) 골격; 알케니(alkeny) 포함 골격; 술포메이트 골격(sulfamate); 메틸렌이미노(methyleneimino) 및 메틸렌하이드라지노(methylenehydrazino) 골격; 술폰산(sulfonate) 및 술폰아마이드(sulfonamide) 골격; 아미드(amide) 골격; 및 혼합된 N, O, S 및CH2 성분을 갖는 다른 골격. 특히 하나 또는 그 이상의 전하를 가진 부분을 포함하는 골격을 갖는 것이 유리하다. 상기 올리고뉴클레오티드를 준비하는 것이 기재된 미국 특허의 예는 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489, 677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5;602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 및 5,677,439이다. 각각의 참고문헌은 전문이 본 발명에 포함된다.
[00215] 변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 또는 그 이상의 치환된 당 부분(sugar moietiy)을 포함할 수 있다. 예를 들어 그러한 올리고뉴클레오티드는 다음의 2'-변형 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬(alkyl); 0.-, S-, 또는 N-알케닐(alkenyl); 0-, S- 또는 N-알키닐(alkynyl); 또는 0-알킬(alkyl, 여기에서 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl) 및 알키닐(alkynyl) C1 내지 C10 알킬 또는 C2내지 C10 알케닐 및 알키닐 또는2'-O-(O-카르보란-1-일)메틸(2'-O-(O-carboran-1-yl)methyl)로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 특히 예는 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)-OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, 여기서 n 과 m은 1내지 10이다. 다른 대표적인 올리고뉴클레오티드는 다음의 2'-변형 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10낮은 알킬(lower alkyl), 치환된 낮은(lower) 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아랄킬(aralkyl), 0-알카릴(alkaryl) 또는 O--아랄킬(aralkyl), SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3. OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬(heterocycloalkyl), 헤테로사이클로알카릴(heterocycloalkaryl), 아미노알킬아미노(aminoalkylamino), 폴리알킬아미노(polyalkylamino), 치환된 시릴(silyl), 리포터 군(reporter group), 인터컬레이터(intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 향상시키기 위한 군 또는 약력학적(pharmacodynamic) 특성을 향상시키기 위한 군. 예들은 2' 메톡시에톡시(methoxyethoxy, 2'-O-CH2CH2OCH3(또는 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-(2-(methoxyethyl))) 또는 2'-MOE로 알려져 있다))(Martin et al., Heiv. Chim. Acta, 1995, 78,486-504) 즉 알코올시알콕시 군(alkoxyalkoxy group); 2'-다이메틸-아미노옥시에톡시(2'-dimethyl-aminooxyethoxy), 즉 O(CH2)20N(CH3)2 군(또한 2'-DMAOE로 알려져 있다); 및 2'-다이메틸아미노에톡시에톡시(또한 2'-dimethylaminoethoxyethoxy)(또한 2'-O-다이메틸아미노에톡시에틸(2'-O-dimethylaminoethoxyethyl) 또는 2'-DMAEOE로 알려져 있다), 즉, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.[00216] 다른 변형은 2'-수산기가 당 고리(sugar ring)의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결되어 이고리 당(bicyclic sugar) 부분을 형성하는 잠긴 핵산(Locked Nucleic Acids, LNA)을 포함한다. 상기 연결은 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 연결하고 n은 1 또는 2인 메텔린(methelyne, -CH2-)ㆍ그룹일 수 있다. LNA과 그로부터 나온 제제(preparation)는 WO 98139352과WO 99114226에 기술되어 있고 상기 문헌은 전문이 본 발명의 참고문헌으로 포함된다.
[00217] 다른 변형은 orum et al.(2001) Curr. Opln. Mol. Ther 3:239-243에 기재되어 있는 잠긴 핵산과 같은 황-질소(sulfur-nitrogen) 다리 변형을 포함한다[100218] 다른 변형은 2'-메톡시(0methoxy, 2'-O-CH3), 2'-메톡시에틸(2'methoxyethyl, 2'-O-CH2-CH3), 2'-아미노프록시(aminopropoxy, 2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴(allyl)(2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-알릴(allyl)(2'-0-CH2-CH=CH2) 및 2'-fluoro(2'-F)를 포함한다. 2' 변형은 아라비노(arabino, up) 위치나 리보(ribo, down) 위치에서 일어날 수 있다. 유사한 변형은 또한 올리고뉴클레오티드의 다른 위치에서 일어날 수 있다. 특히 3'말단 뉴클레오티드나 2'-5'연결 올리고뉴클레오티드에 있는 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 일어날 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실(pentofuranosyl) 당의 위치에 사이클로부틸(cyclobutyl) 부분과 같은 당 모방물(sugar mimetic)을 가지고 있을 수 있다. 그러한 변형된 당 구조 제제(preperation)에 대하여 기재하고 있는 대표적인 미국 특허는 예를 들어, 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,444; 5,393, 878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567, 811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627, 053; 5,639,873; 5,646,265 5,658,873; 5,670,633; 5,792, 747; 및 5,700,920를 포함하고 각각은 전문이 본 발명의 참고문헌으로 포함된다.
[00219] 다른 변형은 링커(linker)에 의해 연결된 다수의 올리고뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 콘카타머(concatemer)를 포함한다. 링커는 예를 들어 변형된 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 단위로 이루어질 수 있다. 실시예에서 링커는 올리고뉴클레오티드 콘카타머에 유연성(flexibility)을 제공한다. 그러한 올리고뉴클레오티드 콘카타머는 원하는 길이를 얻기 위해 더 작은 올리고뉴클레오티드를 결합시켜 최종 분자를 합성하는 간편한 방법을 제공한다. 예를 들어, 12 탄소 링커(C12 포스포래미다이트(phosphoramidite))는 두 개 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드 콘카타머를 연결시켜 길이, 안정성 및 유연성을 제공하는데 이용될 수 있다.
[00220] 본문에서 사용되는 것처럼 "변형되지 않은" 또는 "자연적인" 염기(뉴클레오베이스)는 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G) 및 피리미딘 염기인 티민(T) 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 또한 염기 변형이나 치환을 포함할 수 있다. 변형된 염기들은 합성의 그리고 자연적으로 존재하는 5-메틸 시토신(5-methyl cytosine(5-me-C)), 5-하이드록시메틸 시토신(5-hydroxymethyl cytosine), 잔틴(xanthine), 하이포잔틴(hypoxanthine), 2-아미노아데닌(2-aminoadenine), 6-메틸(6-methyl) 및 아데닌(adenine) 과 구아닌(guanine) 의 다른 알킬(alkyl)유도체 , 2-프로필(2-propyl) 및 아데닌(adenine)과 구아닌(guanine) 의 다른 알킬(alkyl) 유도체, 2-티오우라실(2-thiouracil), 2-티오티민(2-thiothymine) 및 2-티오시토신(2-thiocytosine), 5-할로우라실(5-halouracil) 및 시토신(cytosine), 5-프로피닐 우라실(5-propynyl(C-C-CH3) uracil)및 시토신(cytosine) 및 피리미딘(pyrimidine) 염기의 다른 알키닐(alkynyl)유도체, 6-아조 우라실(6-azo uracil), 시토신(cytosine) 및 티민(thymine), 5-우라실(5-uracil)(수도우라실(pseudouracil)), A-티오우라실(A-thiouracil), 8-할로(8-halo), 8-아미노(8-amino), 8-티올(8-thiol), 8-티오알킬(8-thioalkyl), 8-하이드록실(8-hydroxyl) 및 다른8-치환된 아데닌(8-substituted adenine) 및 구아닌(guanine), 5-할로(5-halo) 특히5-브로모(5-bromo), 5-트리플로로메틸(5--trifluoromethyl) 및 다른 5-치환된 우라실(5-substituted uracil) 및 시토신(cytosine), 7-메틸구아닌(7-methylguanine) 및 7-메틸아데닌(7-methyladenine), 2-F-아데닌(2-F-adenine), 2-아미노-아데닌(2-amino-adenine), 8-아자구아닌(8-azaguanine) 및 8-아자아데닌(8--azaadenine), 7-디아자구아닌(7-deazaguanine) 및 7-디아자아데닌(7-deazaadenine) 및 3-디아자구아닌(3-deazaguanine) 및 3-디아자아데닌(3-deazaadenine). 추가적으로 변형된 염기는 페녹사진 시티딘(phenoxazine cytidine, 1-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조사진-2(3H)-온)([1H-pyrimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-one])), 페노티아진 시티딘(phenothiazine cytidine, 1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온 (1H-pyrimido[5,4-b][1,4]benzothiazin-2(3H)-one))와 같은 트리사이클릭 피리미딘(tricyclic pyrimidines), 치환된 페녹사진 시티딘(phenoxazine cytidine)(예를 들어 9-(2-아미노에톡시)-H--피리미도[5,4-b][1,4]벤조사진-2(3H)-온)(9-(2-amincethoxy)-H-pyrimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-one))와 같은 G-ciamps, 카르바졸(carbazole) 시디틴(cytidine, 2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온(2H-pyrimido[4,5-b]indol-2-one)), 피리미돌 시티딘(pyridoindole cytidine, (H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2--온(H-pyrido[3',2':4,5]pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2--one))을 포함한다. 변형된 염기는 또한 퓨린(purine) 또는 피리미딘(pyrimidine) 염기가 다른 이형고리(heterocycle), 예를 들어 7-디아자-아데닌(7-deaza-adenine), 7-디아자구아노신(7--deazaguanosine), 2-아미노피딘(2-aminopyddine) 및 2-피리돈(2-pyridon)과 같은 염기에 의해 치환된 염기를 포함한다. 더 나아가 핵염기(nucleobase)는 미국 특허 3,687,808에 기재된 것들을 포함하는데 이들은 The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & ON, 1990, Englisch et al., Angewand te Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and those disclosed by Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Application, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993에 기재되어 있다.
[00221] 다른 변형은 포스포로디티오산 결합(phosphorodithioate linkage)을 포함한다. 포스포로디티오산 ODN(PS2-ODN)과 PS-ODN이 단백질에 대한 유사한 결합 친화도를 갖는다는 것을 알고(Tonkinson et al.(1994) Antisense Res. Dev 4 :269-278)(Cheng et al.(1997) J. Mol. Recogn. 10:101-107) ODN의 활동의 가능한 기작이 바이러스 단백질과 결합하는 것이라는 것을 알기 때문에 본 발명에 기재된 항바이러스 ODN의 포스포로디티오에이트결합을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. [00222] ODN을 변형시키는 다른 방법은 Yu at al(2000) Bio org. Med. Chem. 8:275-284 및 in lnagawa et al.(2002) FEBS Lets. 25:48-52에 기재된대로 공간정의된(stereodefned)또는 공간채워진(stereoenriched) ODN을 생산하는 것이다. 기존의 방법으로 준비된 ODN 은 뉴클레오티드내 결합과 관련된 인 원자(phosphorous atom) 주위의 비대칭성에 의해 이성질체의 혼합물로 구성된다. 이는 ODN과 바이러스 단백질과 같은 바이러스 성분과의 결합 안정성에 영향을 미칠 것이다. 이전의 데이터는 단백질 결합이 상당히 공간(stereo)에 의존적이라는 것을 보여준다(Yu et al.). 그러므로 공간정의된(stereodefined) 또는 공간채워진(stereoenriched) ODN을 사용하여 단백질 결합 특성을 향상시키고 항 바이러스 효과를 향상시킬 수 있다.
[00223] 상기에 기재된 것과 같은 변형을 삽입하는 것은 매우 여러가지 삽입 패턴과 레벨로 이용될 수 있다. 즉 올리고뉴클레오티드 내의 각각의 뉴클레오티드나 결합(linkage)에 특정변형이 포함될 필요는 없고 여러가지 변형이 하나의 올리고뉴클레오티드에 또는 하나의 올리고뉴클레오티드에 쓰일 수 있다.
올리고뉴클레오티드 합성
[00224] 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 알려진 방법으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 치환되지 않은 그리고 치환된 인산이중에스테르(phosphodiester)(P=O) 올리고뉴클레오티드는 표준 산화병 (standard oxidation bottle)이 아인산염(phosphite) 결합의 단계적인 티오화(thioation)를 위해 아세토니트릴(acetonitrille) 의 311-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드(311-1,2-benzodithiole-3-one 1,1-dioxide) 0.2 M 용액으로 치환될 수 있다는 것만 제외하면 요오드(iodine)에 의한 산화로 표준 포스포래미다이트 화학(phosphoramidite chemistry)을 이용하여 자동 DNA 합성기(예를 들어, Applied Biosystems model 38013)로 합성할 수 있다. 티오화 대기 단계(tioation wait step)는 캡핑 단계(capping step)에 이어 68 초까지 늘릴 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 CPG 컬럼으로부터의 분리하고 고농도 암모늄 하이드록사이드(ammonium hydroxide)에서 탈블로킹(deblocking, 18시간, 섭씨 55 도) 후에, 0.5 M NaCl 용액에서 2.5 배 부피의 에탄올로 두번 침전시켜 순수분리할 수 있다.
[00225] 포스피네이트(Phosphinate) 올리고뉴클레오티드는 5,508,270에 기재된대로 준비할 수 있다; 3'-Deoxy-3'-methylene phosphonate 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 5,610,289 와 5,625,050에 기재된대로 준비할 수 있다; 포스포래미다이트(phosphoramidite) 올리고뉴클레오티드는 미국특허5,256,775 와 5,366,878에 기재된대로 준비될 수 있다; alkylphosphor othloate 올리고뉴클레오티드는 PCT 출원 PCT/US94100902 및PCT/U593106976에 기재된대로 준비될 수 있다(WO 94117093 및WO 94102499); 3'-데옥시-3'-아미노 포스포래미데이트)3'-Deoxy-3'-amino phosphoramidate) 올리고뉴클레오티드는 미국특허 5,476,925에 기재된대로 준비될 수 있다; 포스포트리에스테르(Phosphotriester) 올리고뉴클레오티드는 미국특허 5,023,243에 기재된대로 준비될 수 있다; 보로인산(boranophosphate) 올리고뉴클레오티드는 미국특허5,130,302 과5,177,198에 기재된대로 준비될 수 있다; 메틸렌메틸이미노-결합된(methylenemethyl imino-linked) 올리고뉴클레오티드(또는MMI linked oligonucleotide), 메틸렌디메틸-하이드라조 결합된(methylenedimethyl-hydrazo linked) 올리고뉴클레오티드(또는 MDII linked oligonucleotide) 및 메틸렌카르보닐아미노 결합된(methylenecarbonylamino linked) 올리고뉴클레오티드(또는 s-3 linked oligonucleotide) 및 메틸렌아미노카르보닐 결합된 올리고뉴클레오티드(methyleneaminocarbonyl linked oligonucleotides, 또는 아미드-4 결합된 올리고뉴클레오티드(amide-4 linked oligonucleoside)) 뿐만 아니라 혼합된 골격 화합물, 예를 들어 변형된(alternating) MMI 및 P=O 또는 P=S 결합을 가지고 있는 혼합된 골격 화합물은 미국 특허5,378, 825, 5,386,023, 5,489,677, 5,602,240 및 5,610,289에 기술된대로 준비될 수 있다. 포름아세탈(formacetal) 및 티오포름아세탈(thioformacetal)이 결합된 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 5,264,562 및 5,264,564에 기술된대로 준비될 수 있다; 에틸렌 옥사이드(ethylene oxide) 결합된 올리고뉴클레오티드는 미국 특허5,223,618에 기술된대로 준비될 수 있다. 인용된 특허 및 특허 출원(patent application)은 전문이 본 발명의 참고문헌으로 포함된다.
올리고뉴클레오티드 제형(formulation)과 약학적 조성물(Pharmaceutical composition)
[00226] 본 발명의 올리고뉴크레오타이드는 올리고뉴클레오티드 제형 또는 약학적 조성물로 준비될 수 있다. 즉, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다른 분자, 분자 구조물 또는 화합물의 혼합물, 예를 들어 리포솜(liposome), 수용체 타겟 분자, 섭취, 분배 및/또는 흡수를 돕기 위한 구강, 직장, 외용 제형과 혼합되거나(admixed), 캡슐화되거나(encapsulated) 접합되거나(conjugated) 결합될(associated) 수 있다. 그러한 섭취, 분배 및/또는 흡수를 돕는 제형 준비에 대해 기재한 대표적인 미국 특허는 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932, 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948;5,580,575; 및 5,595,756를 포함하고, 각각은 전문이 본 발명의 참고문헌으로 포함된다.
[00227] 올리고뉴클레오티드, 제형 및 본 발명의 조성물은 어떠한 약학적으로 허용되는 염, 에스테르(ester), 또는 에스테르의 염 또는 사람을 포함한 동물에 투여하자마자(직접 또는 간접적으로) 생물학적으로 활성이 있는 대사산물(metabolite)이나 그로부터 나온 잔기를 제공할 수 있는 다른 어떤 화합물을 포함한다. 본 발명은 또한 약물전구체(prodrug) 및 본 발명의 화합물의 약물전구체의 약학적으로 허용가능한 염 및 다른 생물학적등가물(bioequivalent)을 포함한다. [00228] "약물전구체(prodrug)" 라는 용어는 체내 또는 그 세포내에서 세포내(endogenous) 효소나 다른 화학물질 및/또는 조건에서 활성화 형태(즉 약물)로 전환되는 불활성화 형태로 준비된 치료제를 말한다. 실시예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 약물전구체는 Gosselin et al., WO 93/24510 및 Imbach et al., WO 94/26764 및 미국특허 5,770,713에 기재된SATE((S-acety[-2-thioethyl] phosphate) 유도체로 준비되는데 상기 문헌은 전문이 본 발명의 참고문헌으로 포함된다.
[00229] "약학적으로 허용가능한 염"이란 본 발명의 화합물의 생리학적으로 그리고 약학적으로 허용가능한 염을 말한다: 즉 모 화합물(parent compound)의 바람직한 생물학적 활성을 보유하고 바람직하지 않은 독성학적 효과는 갖지 않는 염을 말한다. 그러한 약학적으로 허용되는 염은 많이 알려져있고 본 발명에서 사용될 수 있다.
[100231] 올리고뉴클레오티드에 있어 약학적으로 허용가능한 염의 예는 나트륨(sodium), 포타슘(potassium), 암모늄(ammonium), 마그네슘(magnesium), 칼슘(calcium), 폴리아민(polyamine, 스퍼민(spermine) 및 스퍼미딘(spermidine)) 같이 양이온(cation)으로 형성된 염을 포함하나 이에 국한되지는 않는다; 예를 들어 하이드로클론산(hydrochlonic acid), 하이드로브롬산(hydrobromic acid), sulfuric acid, 인산(phosphoric acid), 질산(nitric acid) 등과 같은 무기산으로 형성된 산 첨가 염(acid additional salt) 염 ; 예를 들어 아세트산(acetic acid),옥살산(oxalic acid), 타르타르산(tartaric acid), 숙신산(succinic acid), 말레산(maleic acid), 푸마르산(fumaric acid), 글루콘산(gluconic acid), 시트르산(citric acid), 말산(malic acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 벤조산(benzoic acid), 탄산(tannic acid), 팔미트산(palmitic acid), 알진산(alginic acid), 폴리글루탐산(polyglutamic acid), 나프탈렌술폰산(naphthalenesulfonic acid), 메탄술폰산(methanesulfonic acid), p-톨루엔술폰산(p-toluenesulfonic acid), 나프탈렌디술폰산(naphthalenedisulfonic acid), 폴리갈락투론산(polygalacturonic acid) 등과 같은 유기산으로 형성된 염; 및 클로린(chlorine), 브로민(bromine), 및 요오딘(iodine) 과 같은 원소 음이온(elemental anion)으로 형성된 염을 포함한다[00231] 본 발명은 또한 본 발명의 항바이러스 올리고뉴클레오티드를 포함하는약학적 조성물과 제형을 포함한다. 그러한 약학적 조성물은 국소적 또는 전신적 치료가 바람직한지에 따라 그리고 처리되는 부위에 따라 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 국소적(눈의 세포막과 질(vaginal) 및 직장(rectal) 전달을 포함하는 점막(mucous membranes)을 포함하는); 폐의(pulmonary), 예를 들어 흡입기(nebulizer)를 포함하여 가루나 에어로졸(aerosol) 의 흡입(inhalation)이나 주입(insufflation)에 의해; 기관내(intratracheal); 비내(intranasal); 상피(epidermal) 및 경피(transdermal); 경구(oral); 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내(intravenous), 동맥내(intraarterial), 피하(subcutaneous), 복강(Intraperitoneal) 또는 근육(intramuscular) 주사(injection) 또는 주입(infuion)을 포함한다; 또는 두개골내(intracranial), 예를 들어 수막강내(intrathecal ) 또는 뇌실내(intraventricular) 투여를 포함한다.
[00232] 국소 투여를 위한 약학적 조성물 및 제형은 경피 패치(transdermal patch), 연고(ointment), 로션(lotion), 크림(cream), 젤(gel), 점적약(drops), 좌약(suppositories), 스프레이(spray), 액체(liquid) 및 가루(powder)일 수 있다. 기존의 약학적 담체(carrier), 수용액(aqueous), 가루 또는 오일 베이스(oily base), 증점제(thickener) 등도 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔(Coated condom), 글로브(glove) 등 또한 유용할 것이다. 바람직한 국소 제형은 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 액체, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드(steroid), 킬레이팅 물질(chelating agent) 및 계면활성제와 같은 국소 전달 물질과 혼합물을 이루는 것을 포함한다. 바람직한 리피드(lipid)와 리포좀(liposome)은 중성(예를 들어 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(dioleoylphosphatidyl ethanolamine, DOPE), 디미리스토일포스파티딜 콜린(dimyristoylphosphatidyl choline, DMPC), 디스테아르오일포스파티딜 콜린(distearolyphosphatidyl choline)) 음성(negative) (예를 들어 디미리스토일포스파티딜 글리세롤(dimyristoylphosphatidyl glycerol, DMPG)) 및 양이온(예를 들어 디올레일테트라메틸아미노프로필(dioleoyltetramethylaminopropyl, DOTAP) 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(dioleoylphosphatidyl ethanolamine, DOTMA))을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 리포좀, 특히 양이온성 리포좀에 둘러싸여 있거나 복합체를 형성할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 지질, 특히 양이온성 지질과 복합체를 이룰수 있다. 바람직한 지방산과 에스테르는 아라키돈산(arachidonic acid), 올레산(oleic acid), 에이코사노산(eicosanoic acid), 라울 산(lauric acid), 카프릴산(caprylic acid), 카프리산(capric acid), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 디카프산(dicaprate), 트리카프레이(tricaprate), 미노올레인(minoolein), 디라우린(dilaurin), 글리세롤 1-모노카레이트(glycerol 1-monocaprate), 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온(1-dodecylazacycloheptan-2-one), 아실카르니틴(acylcarnitine), 아실콜린(acylcholine), 또는 C1-10 알킬 에스테르(예를 들어 이소프로필미리스isopropylmyristate IPM), 모노글리세라이드(monoglyceride), 다이글리세라이드(diglyceride) 또는 그로부터 나온 약학적으로 허용가능한 염을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
[00233] 구강 투여를 위한 조성물과 제형은 가루 또는 입자(granule), 미세입자(microparticulate), 나노입자(nanoparticulate), 현탁물 또는 수용액 또는 비-수성 배지(non-aqueous media), 캡슐, 젤 캡슐, 세세(sachet), 정제 또는 미니정제를 포함한다. 증점제(thickener), 방향제(flavoring agent), 희석제(diluent), 유화제(emulsifier), 분산보조제(dispersing aid) 또는 바인더(binder)가 바람직할 것이다: 바람직한 구강 제형은 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 하나 또는 그 이상의 침투 촉진제(penetration enhancer) 계면활성제 및 킬레이터(chelator)와 함께(conjunction with) 투여된다. 대표적인 계면활성제는 지방산 및/또는 에스터 또는 그로부터나온 염, 담즙 산 및/또는 그로부터 나온 염을 포함한다. 대표적인 담즙 산/염은 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid, CDCA) 과 우르소데옥시케네데옥시콜산(ursodeoxychenedeoxycholic acid, UDCA), 콜산(cholic acid), 디하이드로콜산(dehydrocholic acid), 디옥시콜산(deoxycholic acid), 글루콜산(glucholic acid), 글리콜산(glycholic acid), 글리데옥시콜산(glycodeoxycholic acid), 타우로콜산(taurocholic acid), 타우로데옥시콜산(taurodeoxycholic acid), 소듐 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트(sodium tauro-24,25-dihydro-fusidate), 소듐 글리코디하이드로푸시데이트(sodium glycodihydrofusidat)를 포함한다. 대표적인 지방산은 아라키돈산(arachidonic acid), 운데칸산(undecanoic acid), 올레산(oleic acid), 라울산(lauric acid), 카프릴산(caprylic acid), 카프리산(capric acid), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 리놀산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 디카프레이트(dicaprate), 트리카프레이트(tricaprate), 모노올레인(monoolein), 디라우린(dilaurin), 글리세롤 1-모노카프레이트(glycerol 1-monocaprate), 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온(1-dodecylazacycloheptan-2-one), 아실카르니틴(acylcarnitine), 아실콜린(acylcholine), 또는 모노글리세라이드(monoglyceride), 디글리세라이드(diglyceride) 또는 그로부터 나온 약학적으로 허용가능한 염(예를 들어 소듐(sodium))을 포함한다. 또한 침투 촉진제와의 조합이 바람직한데, 예를 들어 지방산/염 담즙 산/염과 지방산/염의 조합이다. 특별히 선호되는 조합은 라울산(lauric acid)의 소듐(sodium) 염, 카프리산(capric acid) 과 UDCA이다. 더 나아가 대표적인 침투 촉진제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(polyoxyethylene-9-lauryl ether), 폴리옥시에틸렌-20-아세틸 에테르(polyoxyethylene-20-acetyl ether)를 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 건조된 입자로 분무되거나 마이크로 또는 나노입자(nanoparticle)를 형성하는 것을 포함하여 입자형태(granular form)로 경구로 전달될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 복합물질(complexing agent)은 폴리-아미노산(poly-amino acid)을 포함한다; 폴리아민(poly1mines); 폴리아크릴레이트(polyacrylates); 폴리아크릴레이트(polyalkylacrylates), 폴리옥시에탄(polyoxyethanes), 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylates); 양이온화된 젤라틴(cationized gelatins) 알부민(albumins), 녹말(starches), 아크릴레이트(acrylates), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG) 및 starches; 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylates; DEAF-유도된 폴리아민(DEAF-derivatized polyimines), 폴루란(pollulans), 셀룰로오스(celluloses), 및 녹말(starches). 특히 이로운 복합물질은 키토산(chitosan), N-트리메틸키토산(N-trimethytchitosan), 폴리-L-리신(poly-L-lysine), 폴리히스티딘(polyhistidine), 폴리오리틴(polyorithine), 폴리스퍼민(polyspermines), 프로타민(protamine), 폴리비닐피리딘(polyvinylpyridine), 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(polythiodiethylamino-methylethylene P, TDAE), 폴리아미노스티렌(polyaminostyrene)(예를 들어 p-아미노(p-amino)), 폴리(메틸시아노아크릴레이트(poly(methylcyanoacrylate)), 폴리(에틸시아노아크릴레이트(poly(ethylcyanoacrylate)), 폴리(부틸시아노아크릴레이트(poly(butylcyanoacrylate)), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트(poly(isobutylcyanoacrylate)), 폴리(이소헥실시아나(아크릴레이트)(poly(isohexylcyna(acrylate)), DEAE-메타크릴레이트(DEAE-methacrylate), DEAE-헥실아크릴레이트(DEAE-hexylacrylate), DEAE-아크릴아마이드(DEAE-acrylamide), DEAE-알부민(DEAE-albumin) 및 DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 폴리메틸아크릴레이트(polymethylacrylate), 폴리헥실아크릴레이트(polyhexylacrylate), 폴리(D,L-락트산)(poly(D,L-lactic acid)), 폴리(D,L-락트-코글리콜산)(poly(DL-lactic-co-glycolic acid, PLGA)), 알긴산(alginate), 및 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG)을 포함한다.
[00234] 비경구, 수막강내(intrathecal) 또는 뇌실내(intraventricular) 투여를 위한 조성물과 제형은 완충용액, 희석제(diluent) 및 침투 촉진제, 담체(carrier) 화합물 및 다른 약학적으로 허용가능한 담체(carrier) 또는 부형제(exipient)와 같은(상기에 국한되지는 않는다) 다른 적합한 첨가제(additives)를 포함하는 멸균된 수용액을 포함할 수 있다.
[00235] 본 발명의 약학적 조성물은 용액, 에멀션(emulsion) 및 리포좀-함유 제형을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 이러한 조성물은 이미 만들어진(preformed) 액체, 자동-유화 고체(self-emulsifying solid) 및 자동-유화 반고체(self-emulsifying semisolid)를 포함하나 이에 국한되지는 않는 다양한 성분으로 만들어질 수 있다.
[00236] 단위제형(unit dosage form)으로 간단하게 제시될 본 발명의 약학적 제형 은 제약산업분야에 잘 알려진 기존의 기술에 따라 준비될 것이다. 그러한 기술은 활성 성분을 약학적 담체(carrier) 또는 부형제(exipient)와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 제형은 활성성분을 담체나 세밀하게 나뉜 고형 담체또는 둘 다와 동일하게 그리고 밀접하게 결합하고 만약 필요하다면 그 산물을 흔들어서(shaking) 준비한다.
[00237] 본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 젤 캡슐, 액상 시럽, 연성 젤(soft gel), 좌제(suppository) 및 관장약(enema)과 같은(이에 국한되지는 않는다) 여러가지 가능한 제형(dosage form)으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수성의(aqueous), 비-수성의(non-aqueus) 또는 혼합된 배지에 현탁물질(suspension)로 제형화될 수 있다. 더 나아가 수성의 현탁물은 예를 들어 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨(sodium carboxymethyl cellulose), 솔비톨(sorbitol) 및/또는 덱스트란(덱스트란)과 같이 현탁물의 점성을 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 현탁물은 또한 안정제(stabilizer)를 포함할 수 있다.
[00238] 본 발명의 실시예에서 약학적 조성물은 포말(foam)로 제형화되어 사용될 수 있다. 약학적 포말은 에멀션, 마이크로에멀션, 크림, 젤리 및 리포솜과 같은(이에 국한되지는 않는다) 제형을 포함한다. 기본적으로 성질이 유사한 이러한 제형들은 성분과 최종 산물의 지속성(consistency)이 다양하다. 그러한 조성물과 제형의 조제(preperation)는 약학 및 제형 기술분야의 숙련자에게는 잘 알려져 있으므로 본 발명의 조성물의 제형에 적용될 수 있을 것이다.
에멀션(emulsion)
[00239] 본 발명의 제형 및 조성물은 에멀션으로 조제되고 제형화될 수 있다. 에멀션은 전형적으로 보통 직경이 0.1 pm을 초과하는 물방울 형태로 다른 액체에 퍼져있는 한 액체의 비균질계(heterogenous system)이다(ldson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieber-man, Rleger and Banker(lids.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et at., in Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). 에멀션은 종종 긴밀하게 혼합되어 서로 분산된 섞이지 않는 액체상(immiscible liquid phase)으로 이루어진다. 일반적으로 에멀션은 워터-인-오일(water-in-oil) 또는 오일-인-원터(oil-in water)이다. 수성의 상(aqueous phase)이 세분화되어 미세한 물방울로 큰 오일의 상으로 분산되어 생성된 조성물은 워터-인-오일(oil-in-water)(w/o) 에멀션으로 불린다. 또한, 오일의 상(oily phase)이 세밀하게 나뉘어 미세한 방울로 큰 수성의 상으로 분산되면 그 조성물은 오일-인-워터(oil-in-water)(o/w) 에멀션으로 불린다. 에멀션은 분산된 상과 수성의 상, 오일의 상 또는 그 자체가 분리된 상(separate phase)으로 존재할 수 있는 활성 약물에 더불어 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 유화제(emulsifier), 안정제(stabilizer), 염료(dye), 및 해독제(anti-oxidant) 와 같은 약학적 부형제는 또한 필요하면 에멀션에 존재할 수 있다. 약학적 에멀션은 또한 예를 들어, 오일-인-워터-인-오일(oil-in-water-in-oil)(o/w/o) 및 워터-인-오일-인-워터(water--in-oil-in-water)(w/o/w) 에멀션과 같은 두 개 이상의 상으로 이루어진 다수의 에멀션일 수 있다. 그러한 복합 제형은 종종 단일한 2가의(binary) 에멀션에는 없는 장점을 제공한다. 에멀션의 각각의 오일 방울이 작은 물방울을 둘러싼 복합 에멀션은 w/o/w 에멀션이다. 오일에서 안정화된 물방울로 둘러싸인 오일 방울계(droplet system)는 o/w/o 이멀션이다.
[00240] 에멀션은 거의 또는 전혀 열역학적 안정성(thermodynamic stability)에 의해 특징지워지지 않는다. 종종 에멀션의 분산된 또는 불연속적인 상은 외부(external) 또는 연속된 상(continuous phase)으로 잘 분산될 수 있고 유화제 또는 제형의 점성을 통해 이러한 형태로 유지된다. 에멀션의 상 중 하나는 에멀션-형태의 연고 베이스 및 크림처럼 반고형(semisolid) 또는 고형(solid)일 수 있다. 에멀션을 안정화시키는 다른 방법은 에멀션의 한 상(phase)으로 삽입될 수 있는 유화제(emulsifier)를 사용하는 것일 수 있다. 유화제는 크게 4개의 군): 합성계면활성제, 자연적으로 존재하는 유화제, 흡수bases, 및 미세하게 분산된 고체)으로 분류될 수 있다(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
[OQ241] 계면활성제(surface active agent)로 알려져있는 합성 계면활성제는 에멀의 제형에서 광범위한 응용가능성을 가지고 있음이 발견되었고 문헌에 리뷰(review)되었다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 288; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). 계면활성제는 전형적으로 양친매성(amphiphilic)이고 및 친수성 및 소수성 부분으로 이루어져 있다. 계면활성제의 친수성 대 소수성 비율은 hydrophilellipophile balance(HLB)로 정의되었고 이는 제형 준비에서 계면활성제를 분류하고 선택하는데 있어 매우 유용한 도구이다. 계면활성제는 친수성 기의 특성에 따라 다른 군으로 분류될 수 있다: 비-이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성(Rieger, in Pharmaceutical Dosage For ms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
[00242] 에멀션 제형에 사용되는 자연적으로 존재하는 유화제는 라놀린(lanolin), 밀랍(beeswax), 포스포티드(phosphatides), 레시틴(lecithin) 및 아카시아(acacia)를 포함한다. 흡수 베이스(base) 는 물을 흡수하여 w/o 에멀션을 형성하는 친수성을 가지나 anhydrous lanolin 및 hydrophilic petrolatum 과 같은 반고형을 유지한다. 미세하게 나뉘어진 고체는 특히 계면활성제 및 점성 제제(preparation)와 함께 좋은 유화제로 사용될 수 있다. 이들은 중금속 하이드록사이드(hydroxide)와 같은 극성 무기 고체, 벤토나이트(bentonite), 아타펄지트(attapulgite), 헥토라이트(hectorite), 카올린(kaolin), 몬트모리로나이트(montmorillonite), 콜로이드 암모늄 실리케이트(colloidal aluminum silicate) 및 콜로이드 마그네슘 실리케이트(colloidal magnesium aluminum silicate) 와 같은 부풀지않는 점토, 안료(pigment) 및 탄소나 글리세릴 트리테아레이트(glyceryl tristearate)같은 비극성 고체를 포함한다.
[00243] 매우 다양한 비-유화(non-emulsifying) 물질 또한 에멀션의 특성 때문에 에멀션 제형에 포함되고. 이들은 지방(fat), 오일(oil), 왁스(wax); 지방산(fatty acid), 지방 알코올(fatty alcohol), 지방 에스테르(fatty ester), humectant, 친수성 콜로이드, 방부제 및 해독제(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New york, N.Y., volume 1, p. 199)를 포함한다.
[00244] 친수성 콜로이드(colloid) 또는 하이트로콜로이드(hydrocolioid)는 자연적으로 존재하는 고무(gum) 및 다당류(polysaccharid)(예를 들어, 아카시아(acacia), 아가(agar), 알긴산(alginic acid), 카라게난(carrageenan), 구아르 검(guar gum), 카라야 검(karaya gum), 및 트라가캔트(tragacanth), 셀룰로오스 유도체(예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose) 및 카르복시프로필셀룰로오스(carboxypropylcellulose)) 및 합성 중합체(예를 들어, carbomers, 셀룰로오스 에테르(cellulose ethers) 및 카르복시비닐 중합체(carboxyvinyl polymers)) 를 포함한다. 이들은 물속으로 분산되거나 부풀어(swell) 분산된-상 물방울 주위에 강력한 경계면 필름(interfacial film)을 형성하고 외부 상(external phase) 의 점성을 증가시킴으로써 에멀션을 안정화시키는 콜로이드 용액을 형성한다.
[00245] 에멀션은 종종 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 미생물의 성장을 도울 수 있는 인지질과 같은 다수의 성분을 포함하기 때문에 이들 제형은 종종 방부제(preservative)를 삽입한다. 에멀션 제형에 포함되는 일반적으로 사용되는 방부제에는 메틸 파라벤(methyl paraben), 프로필 파라벤(propyl paraben), 제4암모늄 염, 벤자일코늄 클로라이드(benzaikonium chloride), p-하이드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)의 에스테르 및 보르산(boric acid)이 있다. 항산화제(Antioxidant)는 또한 일반적으로 제형의 변질(deterioration)을 막기위해 에멀션 제형에 추가된다.
[00246] 사용되는 항산화제(Antioxidant)는 토코페롤(tocopherol)과 같은 자유 라디칼 스캐빈저(free radical scavenger), 아스코르브산(ascorbic acid) 및sodium metabisulfite와 같은 환원제(reducing agent) 및 시트르산(citric acid), 타르타르산(tartaric acid), 및 레시틴(lecithin)과 같은 항산화 상승제(antioxidant synergist)일 수 있다. 상피(dermatological), 구강 및 비경구(parenteral) 경로를 통한 에멀션 제형의 제조를 위한 적용 및 방법은 문헌에 리뷰(review)되어 있다(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New Yo(k, N.Y., volume 1, p. 199). 구강 전달(delivery)을 위한 에멀션 제형은 제형의 용이성, 흡수 효과 및 생물학적동등성(bioavailability)의 견지에서 인해 매우 광범위하게 사용되어 왔다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). 미네랄-오일 베이스(base) 완화제(laxative), 지용성 비타민 및 고지방 영양 제제들(preparation)은 일반적으로 구강으로 투여되는 o/w 에멀션이다.
[00247] 본 발명의 실시예에서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 마이크로에멀션(micremulsion)으로 제형화된다. 마이크로에멀션은 물, 오일 및 단일한 광학적 등방성(isotropic) 및 열역학적으로 안정한 액체 용액인 양친화성체(amphiphile)의 계(system)로 정의될 수 있다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger 및 Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 대표적인 마이크로-에멀션은 먼저 수성의 계면활성제 용액에 오일을 분산시키고나서 일반적으로 투명계(transparent system)를 형성하는 중간 사슬-길이 알코올(intermediate chain-length alcohol)인 충분한 양의 제 4의 성분(fourth component)을 첨가하여 준비되는 시스템이다. 그러므로 마이크로에멀션은또한 계면-활성 분자(surface-active molecule)의 경계막 필름(interfacial film)에 의해 안정화되는 두 개의 혼합할 수 없는(immiscible) 액체의 열역학적으로 안정하고 등방성인 맑은 분산(isotropically clear dispersion)으로 기술된다(Leung and Shah, in: Controlled Release of drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215), 마이크로에멀션은 보통 오일, 물, 계면활성제, 보조계면활성제(cosurfactant) 및 전해질(electrolyte)을 포함하는 3 내지 5개의 성분의 조합으로 준비된다. 마이크로에멀션이 워터-인-오일(water-in-oil, w/o) 또는 오일-인-워터(oil-in-water, olw) 타입인지는 사용되는 오일과 계면활성제 및 구조와 극성 머리부분(polar head) 의 기하학적 패킹(geometric packing) 에 달려있다(Schott, in Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
[00248] 상태도(phase diagram)를 이용한 현상학적 접(phenomenological approach)은 광범위하게 연구되었고 및 당업계의 숙련자가 마이크로에멀션을 어떻게 제형화하는지에 대해 이해할만한 지식을 제공했다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245;. Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). 기존의 에멀션과 비교할 때, 마이크로에멀션은 물에 녹지 않는 약물을 자발적으로(spontaneously) 만들어지는 열역학적으로 안정한 물방울로 녹이는 장점이 있다.
[00249] 마이크로에멀션을 준비할 때 사용되는 계면활성제는 단독으로 또는 보조계면활성제와 함께 이온성(ionic) 계면활성제, 비-이온성(non-ionic) 계면활성제; Brij 96, 폴리에틸렌 올레일 에테르(polyoxyethylene oleyl ethers), 폴리글리세롤 지방산 에스테르(polyglycerol fatty acid esters), 테트라글리세롤 모노라우레이트(tetraglycerol monolaurate(ML310)), 테트라글리세롤 모노올레이트(tetraglycerol monooleate(M0310)), 헥사글리세롤 모노올레이트(hexaglycerol monooleate(PO310)), 헥사글리세롤 펜타올레이트(hexaglycerol pentaoleate(P0500)), 데카글리세롤 모노카프레이트(decaglycerol monocaprate(MCA750)), 데카글리세롤 모노올레이트(decaglycerol monooleate(M0750)), 데카글리세롤 세퀴올레이트(decaglycerol, sequioleate(SO750)), 데카글리세롤 데카올레이트(decaglycerol decaoleate(DA0750))를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 보조 계면활성제는 일반적으로 에탄올, 1-프로파놀(propanol) 및 1-부탄올(butanol)과 같은 짧은-체인 알코올은 계면활성제 분자 간에 생성된 빈 공간(void space) 때문에 계면활성제 필름으로 침투하고 그 결과 분산된 필름을 만들어 경계막 유동성(interfacial fluidity)을 증가시키는 역할을 한다. 마이크로에멀션은 그러나 보조계면활성제를 사용하지 않고 제조될 수 있고 무알콜 자체-유화 마이크로에멀션 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다. 수성의 상(aqueous phase)은 전형적으로 물, 약물의 수용액, 글리세롤 PEG300, PEG400, 폴리글리세롤(polyglycerol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 및 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)의 유도체 일 수 있지만 이에 국한되지는 않는다. 오일 상(oil phase)은 캡텍스 300(Captex 300), 캡텍스 355(Captex 355), 캡물 MCM(Capmul MCM), 지방산 에스테르, 중간 사슬(C8-C12) 모노, 다이, 및 트리글리세라이드(tri-glycerides), 폴리옥시에틸레이티드 글리세롤 지방산 에스테르(polyoxyethylated glycerol fatty acid estes), 지방 알코올(fatty alcohols), 폴리글리콜라이즈드 글리세라이드(polyglycolized glycerides), 포화된 폴리글리콜라이즈드 C8-C10 글리세라이드(saturated polyglycolized C8-C10 glycerides), 식물성 오일(vegetable oil) 및 실리콘 오일(silicone oi)과 같은 물질을 포함할 수 있으나 이에 국한되지는 않는다.
[00250] 마이크로이멀젼은 특히 약물 안정화 및 약물의 향상된 흡수에 잇점이 있다. 지질 베이스(lipid base) 마이크로에멀션(o/w 와 w/o 둘 다)은 펩타이드를 포함한 약물의 구강 생물학적동등성(oral bioavailability)을 증가시키기 위해 제안되었다(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschet, Met/i. Find. Exp. Clin. Pharmacol, 1993, 13, 205). 마이크로 에멀션은 약물 용해(solubilization), 효소 가수분해로부터 약물 보호, 계면활성제-유도 로 인한 막 유동성(membrane fluidity) 및 투과성(permeability) 변화로 약물 흡수 증진, 고형 복용 형태(solid dosage form)에 대한 경구 투여의 편이를 제공하고, 임상적 능력을 향상시키고 독성을 감소시켰다(Contantinides et at., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Set, 1996, 85,138-143). 종종 마이크로에멀션은 그들의 성분이 주위 온도(ambient temperature)에 이르면자발적으로 형성될 수 있다. 이는 특히 열 불안정성의(thermolabile) 담즙 약물 , 펩타이드 또는 올리고뉴클레오티드를 제형화할 때 유리하다. 마이크로에멀션은 또한 화장품 및 약학적 용도 모두에서 활성성분의 경피성(transdernmal) 전달 에 효과적이다. 본 발명의 마이크로에멀션 조성물 및 제형은 소화관(gastrointestinal tract), 질(vagina), 구강낭(buccal cavity) 및 다른 부분으로의 투여 시 올리고뉴클레오티드와 핵산의 국소적 세포 흡수를 증가시킬 뿐 아니라 소화관으로부터 올리고뉴클레오티드와 핵산(nucleic acid)을 전신적(systemic) 흡수를 증가시킬 것으로 기대된다.
[00251] 본 발명의 마이크로에멀션은 또한 제형의 특성을 향상시키고 본 발명의 올리고뉴클레오티드 핵산의 흡수를 증진시키기 위해 추가적인 성분과 소르비탄 모노스테아레이트(sorbitan monostearate(Grill 3)), 라브라솔(Labrasol) 및 침투 촉진제(penetrate enhancer)와 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 마이크로에멀션에서 사용되는 침투 촉진제 는 5개의 광범위한 카테고리(계면활성제, 지방산, 담즙 염, 킬레이팅제(chelating agent), 및 비-킬레이팅제(non-chelating agent)) 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(Lee et.al., Critical Reviews in Therapeutic drug carrier Systems, 1991, p. 92).
리포좀
[00252] 약물 제형을 위해 연구되고 사용된 마이크로에멀션 외에 많은 조직화된(organized) 계면활성제 구조가 있다. 이들은 단일막(monolayer), 마이셀(micelle), 이중막(bilayer) 및 소포(vesicle)를 포함한다. 소포는 약물 전달의 특이성(specificity)을 제공할 뿐 아니라 활성이 지속(duration)되는 것을 연장시킨다. 본문에서 사용되는 것처럼 리포좀이라는 용어는 구형 이중막(spherical bilayer) 또는 이중막으로 배열된 양친매성 지질로 이루어진 소포를 말한다. 즉. 리포좀은 친지성 물질 및 수성의 내부(interior)로부터 만들어진 세포막을 갖고 있는 단일박막(unilamellar) 또는 복합박막(multilamellar) 소포이다. 수성의 부분은 전달될 조성물을 포함한다. 포유류의 피부를 통과하기 위해서, 지질 소포는 적당한 경피 경사(transdermal gradient)하에서 50 nm이하의 직경을 가진 미세한 구멍들을 통과해야만 한다, 그러므로 변형가능하고(deformable) 미세한 구멍을 지날 수 있는 리포좀을 사용하는 것이 바람직하다. 리포좀의 추가적인 요인은 지질 표면 전하와 리포솜의 수용액 부피(aqueous volume)를 포함한다
[00253] 더 나아가 리포좀의 잇점은 다음을 포함한다; 자연의 인지질에서 얻어진 리포좀은 생물호환성이 있고(biocompatible) 생분해된다; 리포좀은 물과 지질 용해성 약물의 다양한 범위를 삽입할 수 있다; 리포솜은 내부에 캡슐로 싸인 약물을 대사 및 분해로부터 보호할 수 있다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245).
[00254] 국소 투여에 있어, 리포좀은 몇가지 다른 제형에 비해 잇점을 갖는다는 증거가 있다. 그러한 잇점은 투여된 약물의 전신 흡수 증가와 관련하여 부작용을 줄이는 것, 원하는 타겟에 투여약물축적을 증가시키는 것 및 피부로 친수성 및 소수성의 다양한 종류의 약물 투여 능력이 증가하는 것을 포함한다. 진통제(analgesic), 항체, 호르몬 및 고분자량 DNA를 포함하는 화합물은 피부로, 일반적으로 상부 표피(upper epidermis)를 타겟으로 투여되어 왔다.
[00255] 리포좀은 두개의 넓은 군으로 나뉜다. 양이온성 리포좀은 양전하를 띤 리포좀으로, 이는 음전하를 띤 DNA 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성한다. 양전하를 띤 DNA 리포좀 복합체는 음전하를 띤 세포 표면에 결합하고 엔도솜(endosome)으로 만들어진다(internalized)된다. 엔도좀 내의 산성 pH 때문에 리포좀은 파열되고 그 내용물을 세포의 사이토플라즘에 분비하게 된다(Wang et at., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987,147,980-985).
[00266] 리포좀 pH-에 민감하거나 음전하를 띤 리포좀은 DNA와 복합체를 형성하기 보다 DNA를 잡아둔다(entrap). DNA와 지질 둘다 유사하게 전하를 띠고 있기
때문에 복합체가 형성되기 보다는 척력이 작용한다. 그러므로 DNA는 리포좀의 수
성(aquoues) 내부에 갇히게 된다. pH에 민감한 리포좀은 예를 들어, 사이미딘
(thymidine) 키나제 유전자를 암호화하는 DNA를 배양중인 세포단층(monolayer)으로
전달하는 데 사용되어 왔다(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992,
19, 269-274).
[00257] 리포좀 조성물의 하나의 주요한 형태는 자연적으로 유도되는 포스파티
딜콜린(phosphatidylcholine)외에 인지질을 포함한다. 예를 들어 중성 리포좀 조
성물은 다이미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine, DMPC)
또는 다이팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine, DPPC)로부터
만들어질 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로 다이미리스토일 포스파
티딜글리세롤(dimyristoyl phosphatidylglycerol)로부터 만들어진다. 반면에 음이
온성 융해(fusogenic) 리포좀은 주로 다이올레일포스파티딜에탄올아민
(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE)로부터 만들어진다. 대두(soybean) PC,
및 달걀(egg) PC 와 같은 또다른 타입의 리포좀 조성물은 포스파티딜콜린
(phosphatidylcholine, PC)로부터 만들어진다. 다른 타입은 인지질 및/또는 포스
파티딜콜린(phosphatidylcholine) 및/또는 콜레스테롤(cholesterol)의 혼합물로부
터 만들어진다.
[00258] 몇가지 연구는 피부로의 리포좀 약물 제형 국소 전달을 측정했다. 기
니아피그의 피부로 인터페론을 포함한 리포좀을 적용(application)했더니 피부 헤
르페스바이러스(herpes virus)를 감소시킨 반면 다른 방법으로 인터페론을 전달시
키면(예를 들어 용액 또는 에멀션) 효과가 없었다(Weiner et at., Journal of
drug, Targeting, 1992, 2, 405-410). 더 나아가, 수성(aqueous) 시스템을 사용한
인터페론 투여에 비해 리포좀 제형의 일부분으로서 투여된 인터페론의 효과를 테스
트한 추가적인 연구는 리포좀 제형은 수성(aqueous) 투여에 비해 효과가 좋다는 결
론을 내렸다 (du Plessis et al., antivirus Research, 1992, 18, 259-265).
[00259] 비-이온성 리포좀 시스템은 또한, 특히 비이온성 계면활성제 및 콜레
스테롤을 구성하는 시스템에서 피부로 약물을 전달하는데 있어 그들의 유용성을 검
사하였다. 노바소니 I (NovasoniTM I)(글리세릴 다이마우레이테콜 에스테롤폴리옥
시에틸렌-10-스테아릴 에테르(glyceryl dilauratelchol esterollpolyoxyethylene-
10-stearyl ether) 및 노바소니NovasomeP II(glyceryl distearate/chol
esterol/polyoxyethylene-10-stearyl ether) 으로 구성된 비이온성 리포좀 제형은
마우스 피부의 진피(dermis)로 사이클로스포린-A(cyclosporin-A)를 전달하는데 사
용되었다. 결과는 그러한 비-이온성 리포좀 시스템이 사이클로스포린-A 를 피부
의 다른 층으로 축적을 용이하게 하는데 효과적이라는 것을 나타낸다(Hu et at. S.
T .P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
[00260] 리포좀은 또한 "sterically stabilized" 리포좀을 포함한다. 본 발
명에서 사용되는 상기 용어는 리포좀에 삽입되었을 때 그러한 특이적 지질이 없는
리포솜에 비해 순환 반감기(lifetime)가 향상되는 하나 또는 그 이상의 특이적 지
질로 구성되는 리포좀을 말한다. sterically stabilized 리포좀의 예는 리포좀의
소포 형성 지질 부분이 모노시아이오갱글리오사이드(monosiaioganglioside) GM1와
같은 하나 또는 그 이상의 당지질(glycolipid)을 포함하는 또는 폴리에틸렌글리콜
(polyethylene glycol, PEG) 부분처럼 하나 또는 그 이상의 친수성 중합체로 유도
된 리포좀이다. 특정 이론에 구애되지 않고, 갱글리오사이드(gangliosides), 스핑
고메엘린(sphingomyelin), 또는 PEG-유도된(derivatized) 지질을 포함하는
sterically stabilized 리포좀에서 이러한 sterically stabilized리포좀의 순환 반
감기 증가는 망상내피계(reticuloendothellal system, RES)의 세포로 흡수가 감소
하기 때문이다 (Alien et at., FEES Left., 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer
Research, 1993, 53, 3765).
[00261] 반복된 하나 또는 그 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포좀은
Papahadjopoulos et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64(모노시아토갱글리
오사이드(monosiatoganglioside) GM1, 갈락토세레브로사이드 황산
(galactocerebroside sulfate) 및 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)),
Gabizon et at., Proc. Naf. Acad. Sci. USA., 1988, 85, 6949,;Allen et al., US.
Pat. . No. 4,837,028 and International Application Publication WO
88104924(스핑고미엘린(sphingomyelin) 및 갱글리오사이드GM(ganglioside GM), 또
는 갈락토세레브로사이드 황산 에스테르(galactocerebroside sulfate ester)),
Webb et al., U.S. Pat. No. 5,543,152(sphingomyelin), Lim et al., WO
97113499(1,2-sn-다이미리스토일포스파티딜콜린(1,2-sn-
dimyristoylphosphatidylcholine)에 기재되어 있다.
[100262] 하나 또는 그 이상의 친수성 중합체를 포함하는 리포좀 및 준비 방법
은 예를 들어, in Sunamoto et al_, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980,,53, 2778(PEG
부분을 포함하는 비이온성 계면활성제); Illum et al., FEBS Lett., 1984, 167,
79(중합 글리콜로 폴리스티렌 입자의 친수성 코팅); Sears, U.S. Pat. Nos.
4,426,330 및 4,534, 899(폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycol)의 카르복실 그
룹을 붙여 변형시킨 합성 인지질(예를 들어, PEG)); Klibanov et al., FEBS Left.,
1990, 268, 235(PEG 또는 PEG stearate 로 유도된 포스파티딜에탄올아민
(phosphatidylethanolamine, PE)); Blume et al., Biochimica et Biophysica Acta,
1990, 1029, 91(PEG-유도된 인지질(phospholipids), 예를 들어, 다이스테아르오일
포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE) 및 PEG 의 조합
으로 형성된 DSPE-PEG(DSPE)); Fisher, European Patent No. EP 0 445 131 131 및
WO 90104384,(리포좀 외부 표면에 공유결합된 PEG); Woodle et al., U.S. Pat.
Nos. 5,013,556 및 5,356,633, 및 Martin et al., U.S. Pat. No. 6,213,804 및 유
럽 특허 EP 0 496 813 B1(PEG 로부터 유도된 PE 1-20몰 퍼센트를 포함하는 리포좀
조성물); Martin et al., WO 91105545 및 U.S. Pat. No. 5,225,212 및 in Zalipsky
et al., WO 94/20073(다수의 다른 지질 중합체 접합체 를 포함하는 리포좀); Choi
et al., WO 96110391(PEG-변형된 세라마이트(ceramide) 지질을 포함하는 리포좀);
Miyazaki et al., U.S. Pat. No. 5,540,935, 및 Tagawa et al., U.S. Patent No.
5,556,948(표면에 작용 moieties 로부터 유도될 수 있는 PEG-포함 리포좀)에 기재
되어 있다.
[00263] 핵산을 포함하는 리포좀은 예를 들어, in Thierry et al., WO
96140062(리포좀에 고분자량 핵산을 캡슐화(encapsulating)하는 방법); Tagawa et
al., U.S. Pat. No. 5,264,221(RNA를 포함하는 단백질-결합된 리포좀); Rahman et
al., U.S. Pat. No. 5,665,710(리포좀에 올리고데옥시뉴클레오티드
(oligodeoxynucleotide)를 캡슐화하는 방법); Love et al., WO 97104787(올리고뉴
클레오티드의 안티센스를 포함하는 리포좀)에 기술되어 있다.
[00264] 리포좀의 다른 타입인 트랜스퍼좀(transfersome)은 약물 전달체로 매
력적인 매우 변형이 잘되는(deformable) 지질이다(Cevc et al., 1998, Biochim
Blophys Acta. 1368(2):201-15.). 트랜스퍼좀은 매우 변형이 잘되어서 방울
(droplet)보다 작은 구멍을 투과할 수 있을 정도인 지질 방울로 기술될 수 있다.
트랜스퍼좀은 사용되는 환경에 적응가능하다. 예를 들어, 그들은 모양적응가능하
고(shape adaptive), 자체수리가능하고(self-repairing), 종종 분절화
(fragmenting) 없이 목표에 도달하고 종종 스스로를 로딩하기도한다(self-
loading). 트랜스퍼좀은는 예를 들어, 표면 가장자리활성제(surface edge-
activator), 대개 계면활성제를 첨가하여 표준 리포좀(standard liposomal)조성물
로 만들 수 있다.
[00265] 계면활성제는 에멀션(마이크로에멀션을 포함하여) 및 리포좀과 같은
제형으로 주로 이용된다. 많은 여러가지 타입의 계면활성제(천연 및 합성)의 특성
을 분류하고 순위를 매기는 가장 일반적인 방법은 hydrophilellipophile
balance(HLB)를 사용하는 것이다. 친수성 기("머리부분(head)"로 알려진)의 성질
은 제형에 사용되는 여러가지 계면활성제를 분류하는 가장 유용한 방법을 제공한다
(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, inc., New York, N.Y.,
1988, p. 285).
[00266] 계면활성제 분자가 이온화되지 않으면 비이온성 계면활성제로 분류된
다. 제약 및 화장품에서 광범위하게 사용되는 비이온성 계면활성제는 광범위한pH값
의 범위 및 구조에 따라 2내지 18의 값을 갖는 전형적인 HLB 값에서 사용가능하다.
비이온성 계면활성제는 에틸린 글리콜 에스테르(ethylene glycol esters), 프로필
렌 글리콜 에스테르(propylene glycol esters), 글리세릴 에스테르(glyceryl
esters), 폴리글리세릴 에스테르(polyglyceryl esters), 솔비탄 에스테르(sorbitan
esters), 수크로스 에스테르(sucrose esters), 및 에톡실레이티드 에스테르
(ethoxylated esters) 와 같은 비이온성 에스테르 및 비이온성 알카놀아마이드
(alkanolamide) 및 지방 알코올 에톡실레이트(fatty alcohol ethoxylates), 프로폭
실레이티드 알코올(propoxylated alcohol), 및 에톡실레이티드프로폭실레이티드 블
락 중합체(ethoxylatedlpropoxylated block polymer)와 같은 에테르(ether) 또한
이 군(class)에 포함된다. 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene) 계면활성제는 가장 일
반적으로 사용되는 비이온성 계면활성제 군의 구성요소이다.
[00267] 물에 용해되거나 분산될 때 음전하를 운반하는 계면활성제 분자는 음
이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제는 비누와 같은 카르복실레이트, 아실
락틸레이트(acyl lactylate), 아미노산의 아릴 아마이드(aryl amide), 알킬 황산
(alkyl sulfate)과 에톡실레이티드 알킬 황산(ethoxylated alkyl sulfates)과 같은
술폰산의 에스테르, 알킬 벤젠 술폰산(alkyl benzene sulfonates)과 같은 술폰산
(sulfonate), 아릴 이소시오네이트(aryl isothionate), 아실 로레이트(acyl
laurate) 및 술포숙시네이트(sulfosuccinate) 및 인산(phosphates)이 포함된다..
알킬 황산(alkyl sulfate) 및 비누(soap)는 가장 일반적으로 사용되는 음이온성 계
면활성제이다.
[00268] 물에 용해되거나 분산되었을 때 양전하를 띠는 계면활성제 분자는 양
이온성 계면활성제로 분류된다. 양이온성 계면활성제는 종종 사용되는 제 4 암모
늄 염(quaternary ammonium) 염과 함께 제4암모늄 염 및 에톡실레이티드 아민
(ethoxylated amine)을 포함한다.
[00269] 양 또는 음전하를 띠는 계면활성제 분자는 양쪽성(amphoteric)으로 분
류된다. 양쪽성 계면활성제는 아크릴산 유도체(acrylic acid 유도체), 치환된 알킬
아마이드(alkylamides), N-알킬베타인(alkylbetaine) 및 포스파티드(phosphatide)
를 포함한다.
[00270] 약물내에 계면활성제의 사용과 에멀션에서의 제형은(Rieger, in
Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p.
285)에 리뷰(review)되어 있다.
침투 촉진제 .
[00271] 실시예에서, 침투 촉진제는 조성물 내에 또는 조성물과 함께 핵산 특
히 올리고뉴클레오티드를 동물의 피부로 전달하는 것을 증가시키기 위해 사용된다.
대부분의 약물은 이온화, 비이온화된 형태 모두로 용액내에 존재한다. 그러나 보
통 지용성 또는 친지성 약물은 쉽게 세포막을 통과한다. 비-친지성 약물이라도 세
포막을 침투 촉진제로 처리하면 세포막을 통과할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 세포
막을 통과하는 비-친지성(non-lipophilic) 약물의 분산을 돕는 것과 더불어 침투
촉진제는 또한 친지성 약물의 투과성을 증진시킨다.
[00272] 침투 촉진제는 다섯개의 군 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다.
즉 계면활성제, 지방산, 담즙염(bile salt), 킬레이팅 물질(chelating agent) 및
비-킬레이팅 비계면활성제(nonsurfactent)(Lee et al., Critical Reviews in
Therapeutic drug carrier Systems, 1991, p.92). 침투 촉진제군의 각각은 이후에
보다 상세하게 기술된다.
[00273] 계면활성제
본 발명과 관련하여 계면활성제(또는 "표면 활성제(surface-active agent)")는 수
용액에 용해되면 용액의 표면장력 또는 수용액과 다른 액체 간의 interfacial
tensi올리고뉴클레오티드 을 줄여 점막을 통한 올리고뉴클레오티드의 흡수를 축진
시키는 화학물질이다. 이러한 침투 촉진제는 예를 들어, 소듐 라우릴 황산(sodium
lauryl sulfate), 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(polyoxyethylene-9-lauryl
ether) 및 폴리옥시에틸렌-20-아세틸 에테르(polyoxyethylene-20-cetyl ether)(Lee
et at., CriticalReviews in Therapeutic drug carrier Systems, 1991, p.92); 및
FC-43과 같은 퍼플루오계(perfluorochemical) 에멀션을 포함한다(Takahashi et
al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252), 각각은 전문이 본문의 참고문헌으로
삽입되었다.
[00274] 지방산: 침투 촉진제로 작용하는 여러가지 지방산 및 그들의 유도체는
예를 들어, 올레산(oleic acid), 라울산(lauric acid), 카프리산(capric acid, 엔
데카노산(n-decanoic acid)), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic
acid), 스테아르산(stearic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic
acid), 다이카프레이트(dicaprate), 트리카프레이트(tricaprate), 모노올레인
(monoolein, 1-모노엘레빌-락-글리세롤(1-monoolebyl-rac-glycerol)), 다이알루린
(dilaurin), 카프릴산(caprylic acid), 아라키돈산(arachidonic acid), 글리세롤
1-모노카프레이트(glycerol 1-monocaprate), 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온(1-
dodecylazacycloheptan-2-one), 아실카르니틴(acylcarnitines), 아실콜린
(acylcholines), 그로부터 나온 C1-10 알킬 에스테르(alkyl esters)(예를 들어, 메틸
(methyl), 이소프로필(isopropyl) 및 t-부틸(t-butyl)), 및 그로부터나온 모노 및
다이글리세라이드(diglycerides)(즉, oleate, laurate, caprate, myristate,
palmitate, stearate, linoleate, 등)를 포함한다(Lee et al., Critical Reviews
in Therapeutic drug carrier Systems, 1991, p.92;Mu ran ishi, Critical Reviews
in Therapeutic drug carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Harid et al., J.
Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654), 각각은 본문에 전문이 참고문헌으로 삽입
되어 있다.
[00275] 담즙 염: 담즙의 생리학적 역할은 분산 촉진, 지질과 지용성 비타민의
흡수를 포함한다(Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The
Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-
Hill, New York, 1996, pp. 934-935). 여러가지 자연에 존재하는 담즙 염, 및 그들
의 합성 유도체는 침투 촉진제로 작용한다. 그러므로 "담즙 염"이라는 용어는 자
연적으로 존재하는 담즙의 성분 뿐 아니라 합성 유도체도 포함한다. 본 발명의 담
즙 염은 예를 들어, 콜산(cholic acid)(또는 그의 약학적으로 혀용되는 나트륨 염,
나트륨 콜레이트(sodium cholate)), 디하이드로콜산(dehydrocholic acid, 나트륨 디하이드로콜레이트(sodium dehydrocholate)), 데옥시콜산(deoxycholic
acid, 나트륨 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate)), 글루콘 산(glucholic acid, 나트륨 글루콜레이트(sodium glucholate)), 글리콜 산(glycholic
acid, 나트륨 글리콜레이트(sodium glycocholate)), 글리코데옥시콜산(glycodeoxycholic acid, 나트륨 글리코데옥시콜산(sodium glycodeoxycholate)),
타우로콜산(taurocholic acid, 나트륨 타우로콜레이트(sodium taurocholate)), 타우로데옥시콜산(taurodeoxycholic acid, 나트륨 타우로데옥시콜산(sodium
taurodeoxycholate)), 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid, 나트륨 케노데옥시콜산(sodium chenodeoxycholate)), 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid, UDCA), 나트륨 타우로-24, 25-디하이드로-푸시데이트(sodium tauro-24,25-dihydro-fusidate, STDHF), 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트(sodium glycodihydrofusidate) 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴-에테르(polyoxyethylene-9-lauryl ether, POE)를 포함한다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic drug carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic drug carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm:. Sci., 1990, 79, 579-583).
[00276] 킬레이팅 물질(Chelating Agents): 본 발명에서, 킬레이팅 물질은 복
합체를 형성하여 용액에서 금속이온을 제거함으로써 점막을 통한 올리고뉴클레오티
드의 흡수를 촉진하는 화합물로 생각될 수 있다. 본 발명에서 침투 촉진제로의 용
도와 관련하여 킬레이팅 물질은 또한 대부분의 DNA 분해효소가 촉매로 2가의 금속
이온 억제자를 필요로 하기 때문에 DNA 분해효소 억제자로 작용하도록 첨가되고
킬레이팅 물질에 의해 억제된다(Jarrett, J. Chromatogn, 1993, 618, 315-339). 제
한없이, 킬레이팅 물질은 다이나트륨 에틸렌디아민테트라아세테이트(disodium ethylenediaminetetraacetate, EDTA), 시트르산(citric acid), 살리실레이트(salicylates, 예를 들어, 니트륨 살리실레이트(sodium salicylate, 5-메톡시살리실레이트(5-methoxysalicylate) 및 호모바닐레이트(homovanilate), 콜라겐의 N-아릴 유도체, 베타-다이케톤(beta-diketones, 엔아민(enamines))의 라우레트-9(laureth-9) 및 N-아미노 아실 유도체 를 포함한다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic drug carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic drug carrier) Systerns, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[00277] 비-킬레이팅 비-계면활성제: 본문에서 사용된 것처럼 비-킬레이팅 비
계면활성제 침투 촉진(penetration enhancing) 화합물은 킬레이팅 물질 또는 계면
활성제 활성을 나타내지 않는 화합물이다. 그러나 여전히 소화점막(alimentary
mucosa)을 통해 흡수를 촉진한다(Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic
drug carrier Systems, 1990, 7, 1-33). 그러한 침투 촉진제의 예는 불포화된 사이
클릭 우레아(cyclic urea), 1 -알킬- 및 1-알케닐아자사이클로-알카논(1-alkenylazacyclo-alkanone) 유도체(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic drug carrier Systems, 1991, page 92); 및 다이클로페낙 나트륨(diclofenac sodium), 인도메타신(indomethacin) 및 페닐부타존(phenylbutazone)와 같은 비스테로이드성 항염 물질(non-steroidal anti-inflammatory agen)을 포함한다(Yamashita et al.J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[00278] 세포 수준에서 올리고뉴클레오티드의 흡수를 촉진하는 물질은 또한 약
학적 조성물 그리고 다른 조성물 및 본 발명의 제형에 포함될 수 있다. 예를 들
어, 리포펙타민(lipofectin) 같은 양이온성 지질(Junichi et al, U.S. Pat. No.
5,705,188), 양이온성 글리세롤 유도체 및 폴리리신(polylysine)과 같은 다중양이
온성(polycation ic) 분자(Lollo et al., PCT Application WO 97130731) 또한 올리
고뉴클레오티드의 세포 섭취를 촉진하는 것으로 알려져 있다.
[00279] 다른 물질은 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜 같은 글리콜(glycol,
2-피롤, 아존(azones) 및 리모넨(limpnene)과 멘톤(menthone) 같은 테르펜
(terpene)과 같은 피롤(pyrrol) 을 포함하여 투여한 핵산의 침투를 촉진시키는데
사용될 수 있다.
담체(carrier)
[00280] 본 발명의 조성물은 제형에 담체 화합물을 삽입할 수 있다. 본문에
사용된 것처럼 "담체(carrier) 화합물" 또는 "담체(carrier)" 는 핵산 또는 불활성
인(inert, 즉, 생물학적 활성이 없는)하지만 예를 들어, 생물학적으로 활성을 가진
핵산을 분해하거나 순환으로부터 제거하는 것을 촉진하여 생물학적 활성을 가진 핵
산의 생물학적동등성(bioavailability)을 줄이는 생체내 과정에 의해 핵산으로 인
식되는 그로부터 나온 유사물을 의미할 수 있다. 핵산과 담체 화합물의 동시투여
는 종종 담체가 과하면 간, 신장 또는 다른 외부순환 저장소(extracirculatory
reservoir)에서 회수되는(recovered) 핵산의 양의 실질적 감소를 가져올 수 있다.
예를 들어, 간세포내에서 포스포로티오산 올리고뉴클레오티드를 부분적으로 회수하
는 것은 폴리이노신산(polyinosinic acid), 덱스트란 황산, 폴리시티드산(polycytidic acid) 또는 4-아세트아미도-4'이소티오시아노-스틸벤-2,2-다이술폰산((4-acetamido-4'isothiocyano-stilbene-2,2-disulfonic acid)과 함께 동시투여했을 때 감소될 수 있다(Miyao et aL,AntisenseRes. Dev., 1996,5,115-121; Takakura et al., Antisense & NucL Acid drug Dev., 1996, 6, 177-183), 각각은 본문에 전문이 참고문헌으로 삽입되어 있다.
부형제
[00281] 담체 화합물과 대비하여, "약학적 담체" 또는 "부형제" 는 약학적
으로 허용되는 용매, 분산제(suspending agent)또는 하나 또는 그 이상의 핵산을
동물로 전달하기 위한 다른 어떤 약리학적으로(pharmacologically) 불활성인 매개
체(vehicle)이고 전형적으로 액체 또는 고체이다. 약학적 담체(carrier)는 원하
는 투여방법으로 핵산 및 약학적 조성물의 다른 성분과 혼합될 때, 일반적으로 원
하는 크기(bulk), 농도(conistency) 등을 갖도록 선택된다. 전형적인 약학적 담체
(carrier)는 결합물질(예를 들어, 호화한 옥수수 전분(pregelatinized maize starch), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose 등)); 충진제(filler)(예를 들어, lactose 및 다른 당, 마이크로크리스탈 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 펙틴(pectin), 젤라틴(gelatin), 칼슘 황산(calcium sulfate), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylates) 또는 칼슘 하이드로젠 포스페이트(calcium hydrogen phosphate 등)); 윤활제(lubricant)(예를 들어, 마그네슘 스티아레이트(magnesium stearate), 탈크(talc), 실리카(silica), 콜로이드 실리콘 다이옥사이드(colloidal silicon dioxide), 스테아르산(stearic acid), 메탈 스테아레이트(metallic stearates), 수소화된 식물성 오일(hydrogenated vegetable oils), 옥수수 전분(corn starch), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols), 나트륨 벤조에이트(sodium benzoate, sodium acetate 등)); 붕괴제(disintegrant)(예를 들어, 전분(starch), 나트륨 전분 글리코테이트(sodium starch glycotate) 등)); 및 습윤제(wetting agent)(예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulphate) 등))를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
[00282] 핵산과 해롭게 반응하지 않는 경구(non-parenteral)투여에 적합한 약
학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 부형제 또는유기 부형제는 또한 본 발명의 조
성물을 제형화하는데 사용될 수 잇다. 알맞은 약학적으로 담체(carrier)는 물, 염
용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols), 젤라틴(gelatin), 락토오즈(lactose), 아밀로오즈(amylose), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 탈크(talc), 실릭산(silicic acid), 점성 파라핀(viscous paraffin), 하이드록시메틸셀룰로즈오스(hydroxymethylcellulose), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 등을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
[00283] 핵산의 국소 투여를 위한 제형은 살균 및 비-살균 수용액, 일반적으로
알코올과 같은 비-수용액(non-aqueous solution) 또는 액체 내 또는 고형 핵산 용
액 또는 고형 오일 베이스(solid oil bases)을 포함한다. 용액은 또한 완충용액,
희석액(diluent) 및 다른 알맞은 첨가제를 포함할 수 있다. 핵산과 유해하게 작용
하지 않는 경구(non-parental)투여에 알맞은 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다.
다른 약학적 조성물 성분
[00284] 본 발명의 조성물은 당업계의 사용수준에서 기존의 약학적 조성물에서 발견되는 다른 성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 추가적인, 양립가능한(compatible), 예를 들어, 항소양제(antipruritics), 수렴제
(astringents), 국소마취제(local anesthetics) 또는 항염제(anti-inflammatory
agent)와 같은 약학적 활성이 있는 물질을 포함할 수 있고 또는 염료(dye), 방향제(flavoring agents), 방부제, 해독제, 유백제(opacifiers), 점증제(thickening
agents) 및 안정제(stabilizers) 와 같이 물리적으로 다양한 투여 형태(dosage
form)을 만드는데 사용될 수 있다. 그러나 그러한 물질은 첨가되면 본 발명의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 저해하지 말아야 할 것이다. 제형은 살균되고 원한다면 제형의 핵산과 해롭게 상호작용하지 않는 윤활제(lubricants), 방부제, 안정제(stabilizers), 습윤제(wetting agents), 유화제(emulsifiers), 삼투압에 영향을 미치는염, 완충용액, 색소(colorings), 방향제(flavorings) 및/또는 방향족 물질(aromatic substances) 등과 같은 보조제(auxiliary agent) 와 혼합될 수 있다.
[00285] 수성의 현탁물, 예를 들어, 나트륨 카르복실메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose), 소르비톨(sorbitol) 및/또는 덱스트란 및/또는 안정제(stabilizer)를 포함하는 현탁물의 점성을 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. [00286] 본 발명의 실시예는 하나 또는 그 이상의 항바이러스 올리고뉴클레오
티드 및 여러가지 기작으로 작용하는 하나 또는 그 이상의 화학요법 물질
(chemotherapeutic agent)을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 그러한 화학요
법 물질의 예는 다우노루비신(daunorubicin), 다우노마이신(daunomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 에소루비신(esorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 마포스파미드(mafosfamide), 이포스파미드(ifosfamide), 시토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside), 비스-콜로에틸니트로스우레아(bis-chloroethylnitrosurea), 부술판(busulfan), 미토신 C(mitomycin C), 액티노마이신 D(actinomycin D), 미트라미신(mithramycin), 프레드니손(prednisone), 하이드록시프로게스테론(hydroxyprogesterone), 테스토스테론(testosterone), 타모시펜(tamoxifen), 다카르바진(dacarbazine), 프로카르바진(procarbazine), 헥사메틸메이아민(hexamethylmeiamine), 펜타메틸메타민(pentamethytmetamine), 미토산트론(mitoxantrone), 암사크린(amsacrine), 클로람부실((chlorambucil), 메틸사이클로헥실니트로스우레아(ethylcyclohexylnitrosurea), 질산 머스타드(nitrogen mustards), 멜팔란(melphalan), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 6-머캅토푸린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 5-아자시티딘(5-azacytidine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데옥시포르마이신(deoxycoformycin), 4-하이드록시페록시사이클로포스포아미드(4-hydroxyperoxycyclophosphoramide), 5-플로오로우라실(-fluorouracil, 5-FU), 5-플로오로데옥시우리딘(5-fluorodeoxyuridine, 5-FUdR), 메토트렉세이트(methotrexate, MTX), 콜히신(colchicine), 탁솔(taxol), 빈크리스틴(vincristine, vinblastine), 에토포시드(etoposide(VP-16)), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 겜시타빈(gemcitabine), 테니포시드(teniposide), 시스플라틴(cisplatin), 및 다이에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol, DES)을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다(The Merck Manual of Diagnosis 및 Therapy, 15th Ed. 1987, pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, NJ, ) 본 발명의 화합물과 함께 사용되면 그러한 화학요법 물질은 개별적으로(예를 들어, 5-FU 및 올리고뉴클레오티드), 연속적으로(sequentially)(예를 들어, MTX에 이어지는 시간 주기의 5-FU 및 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드), 또는 하나 또는 그 이상의 화학요법 물질 (예를 들어, 5-EU, MTX 및 올리고뉴클레오티드, 또는 5-FU, 방사선 요법(radiotherapy) 및 올리고뉴클레오티드)와 함께 사용될 수 있다. 비-스테로이드성 항염약물(non-steroidal anti-inflammatory drug) 및 코르티코스테로이드(corticosteroids), 및 항바이러스 약물은 본 발명의 조성물과 결합(combine)될 수 있다(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed.,Berkow et al., eds., 1987, Rahway, NJ., pages 2499-2506 및 46-49, 각각). 다른 비올리고뉴클레오티드 화학요법 물질은 또한 존 발명의 범위 내에 있다. 둘 또는 그 이상의 결합된 화합물이 함께 또는 연속적으로 사용될 수 있다.
발명의 요약(SUMMARY OF THE INVENTION)
[0047]본 발명은 올리고뉴클레오티드(ONs) 예를 들어, 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODNs)가 널리 적용할 수 있는 비서열 상보적 항바이러스적 활성을 가질 수 있다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 항바이러스적 활성을 가지기 위하여 상기 올리고뉴클레오티드는 임의의 바이러스 서열에 상보적이거나 특정 뉴클레오티드 분포를 가질 필요가 없다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 조제약에서 많아야 몇 복제수(예를 들어 15 mM 랜더머 조제에서 32 또는 그이상의 뉴클레오티드)의 특정 서열을 가질 것이기 때문에 심지어 랜더머(randomer)로 제조될 수 있다.
[0048]더불어, 본 발명자들은 상이한 길이 올리고뉴클레오티드가 다양한 항바이러스 효과를 가지며, 또한 나아가 최대 항바이러스 효과를 나타내는 항바이러스 올리고뉴클레오티드의 길이가 40-120 nts의 범위라는 것을 발견하였다. 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 특성에 관한 현재 발견들의 관점에서, 본 발명은 수많은 다른 바이러스들에 대한 활성을 가질 수 있고, 심지어 넓은-스펙트럼의 항바이러스성 작용제로서 선택될 수 있는 올리고뉴클레오티드 항바이러스성 작용제를 제공한다. 이러한 항바이러스 작용제는 현재 이용가능한 항바이러스성 치료법 선택이 제한된 관점에서 특히 유리하다.
[0049] 그러므로, 본 발명의 ONs(예, ODNs)는 바이러스 감염을 치료하거나 방지하기 위하여 또는 암바이러스(예로 레트로바이러스, 유두종바이러스 및 헤르페스바이러스)와 같은 바이러스들에 의하여 유도된 종양 또는 암을 치료하거나 방지하기 위하여, 그리고 병인이 바이러스에 기본을 둔 질병들을 치료하거나 방지하는 데에 치료법으로 유용하다. 이러한 치료는 많은 타입의 환자들 및 치료법(예를 들면, 면역억제된 인간 및 동물 환자에서 바이러스 감염의 예방 또는 치료를 포함)에 적용할 수 있다.
[0050] 첫번째 양태에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드의 항바이러스적 활성이 원칙적으로 비-서열 상보적 작용 방식에 의하여 일어나는, 항바이러스성 작용제로서 사용하기에 적합한, 하나 이상의 항바이러스성 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 길이 6 nts 이상)를 포함하는 항바이러스성 올리고뉴클레오티드 제형(formulation)을 제공한다. 이러한 제형은 예로 적어도2, 3, 5, 10, 60, 100 또는 그 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드의 혼합을 포함할 수 있다.
[0051] 본 명세서내에 올리고뉴클레오티드 또는 다른 물질들과 관련하여 사용된, "항바이러스성"이라는 용어는 올리고뉴클레오티드 또는 다른 물질의 존재가 바이러스 입자의 생산 억제에 미치는 영향 즉, 감염성 바이러스 입자의 형성에 적합한 시스템에서 형성되는 감염성 바이러스 입자의 수를 감소시키는 것을 언급하는 것이다.
[0052] "항바이러스성 올리고뉴클레오티드 제형"이라는 용어는 항바이러스성 작용제로서 사용하기에 적합한 하나 이상의 항바이러스성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제조를 나타낸다. 상기 제형은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들을 포함하고 생체내(in vivo)에서 항바이러스성 작용제로서 사용을 방해하지 않는 다른 물질들을 포함할 수 있다. 이러한 다른 물질들은 제한되지 않으며 희석제, 부형제, 담체 및/또는 다른 항바이러스성 물질들을 포함할 수 있다.
[0053] 본 명세서에 사용된 "약학적 조성물"이라는 용어는 생리적으로 또는 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 항바이러스성 올리고뉴클레오티드 제형을 나타낸다. 이러한 조성물들은 또한 상기 성분들이 인간과 같은 바람직한 피험자에 투여를 적합하게 하는 다른 성분들을 포함할 수 있다.
[0054]본 발명의 맥락에서, 구체적으로 한정하지 않는 한 "올리고뉴클레오티드 (ON)"라는 용어는 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN) 또는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 또는 올리고리보뉴클레오티드를 의미한다. 따라서, " 올리고뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 그것의 모방체(mimetics)의 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 상기 용어는 유사하게 기능하는 비 천연적 부분들을 가지는 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 천연적 뉴클레오베이스들(nucleobases) 올리고뉴클레오티드, 당(sugars) 및 뉴클레오시드 골격(internucleoside, backbone)간의 공유 결합으로 구성되는 올리고뉴클레오티드들을 포함한다. 이러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드들은 종종 예를 들면 향상된 세포 흡수(cellular uptake), 핵산 표적에 대한 향상된 친화성 및 핵산 가수분해효소의 존재시에 증가된 안정성등과 같은 바람직한 특성 때문에 천연 형태보다 더 선호된다. 사용될 수 있는 변형의 예들을 본 명세서에 설명한다. 골격 및/또는 다른 변형들을 포함하는 올리고뉴클레오티드들 또한 올리고뉴클레오티드로 나타낼 수 있다.
[0055] 항바이러스성 제형, 약학적 조성물 또는 다른 물질에 관련하여 사용된 "항바이러스 작용제로서 사용하기에 적합한"이라는 말은 상기 물질은 항바이러스 효과를 나타내며, 생체내 시스템에서, 예로 인간과 같은 피험자 투여용 바이러스 생산 억제에 사용하기에 부적합한 임의의 물질 또는 성분을 포함하지 않는다는 것을 나타낸다.
[0056] 물질의 항바이러스 작용에 관련하여 본 명세서에 사용된 "비서열 상보적 작용 방식"이라는 말은 상기 물질이 항바이러스적 효과를 나타내는 기작이 상보적 핵산 서열의 혼성화, 예로 안티센스 효과에 의한 것이 아니라는 것을 나타낸다. 역으로, "서열 상보적 작용 방식"은 물질의 항바이러스 효과가 상보적 핵산 서열의 혼성화와 관련있음을 의미한다. 따라서, 물질의 항바이러스 활성이 주로 서열 상보적 작용 방식에 의한 것이 아님"을 나타내는 것은 올리고뉴클레오티드의 활성이 항바이러스 활성이 "주로 서열 상보적 작용 방식에 의한 것이 아닌지" 결정하기 위한 본 명세서(실시예 10 참조)에 제공된 4 시험들 중 하나 이상을 만족시킨다는 것을 의미한다. 각각의 구현예들에서, 올리고뉴클레오티드는 시험 1, 시험 2, 시험 3 또는 시험 4를 만족시킨다. 올리고뉴클레오티드는 두가지 시험의 조합 즉, 시험 1 및 2; 시험1 및 3; 시험 1 및 4; 시험 2 및 3; 시험 2 및 4 또는 시험 3 및 4를 만족시킨다; 올리고뉴클레오티드는 3가지 시험의 조합 즉, 시험 1, 2 및 3, 시험 1, 2 및4, 시험 1, 3 및 4 또는 시험 2, 3 및 4를 만족시킨다; 올리고뉴클레오티드는 모든 시험 1, 2, 3 및 4를 만족시킨다.
[0057] 본 명세서에서 항바이러스 물질 투여에 관련하여 사용된 "피험자(subject)"라는 용어는 예로, 포유동물(예를 들면 인간, 비인간 영장목, 소, 돼지, 말, 개 및 고양이) 같은 동물; 새; 및 과일나무 같은 식물을 포함하는 살아있는 고등 생물을 나타낸다.
[0058] 관련된 양태은 랜더머의 항바이러스 활성이 비서열 상보적 작용 방식에 의하여 주로 일어나는 항바이러스 올리고뉴클레오티드 랜더머 제형에 관한 것이다. 이러한 랜더머 제형은 예로서, 적어도 2, 3, 5, 10 또는 그 이상의 상이한 길이에서 다양한 길이의 랜더머 혼합물을 포함할 수 있다.
[0059]본 명세서내에 올리고뉴클레오티드 서열에 관련하여 사용된 "무작위(random)"라는 용어는 바이러스mRNA에 상보적이지 않으며, 헤어핀을 형성하지 않고, 그에 회문(palindromic) 서열을 가지지 않도록 선택된 서열 또는 ON의 특징을 나타낸다. 무작위(random)"라는 용어가 특정 바이러스에 대한 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성에 관하여 사용될 때, 그것은 상기 특정 바이러스의 바이러스 mRNA에 상보성이 없음을 뜻한다. 상보성의 부재는 예로 대다수의 바이러스들, 특정 바이러스 패밀리유래의 바이러스들 또는 감염성 인간 바이러스들에서 훨씬 폭넓을 수 있다.
[0060] 본 명세서에서, "랜더머(randomer)"라는 용어는 NNNNNNNNNN 과 같이 모든 각 부분에 워블(wobble) (N)을 가지는 단일 가닥 DNA를 의미하기 위한 것이다. 각각의 염기(base)는 상기 ON이 실제로 같은 크기의 상이한 무작위적으로 생산된 서열의 집단으로 존재하기 때문에 워블로서 합성된다.
[0061]다른 양태에서, 본 발명은 표적 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 가지는 올리고뉴클레오티드를 제공하는데, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이가 29 nts 이상(또는 각각의 구현예들에서, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 46, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120 nts 이상의 길이)이며, 또한 올리고뉴클레오티드의 서열은 표적 바이러스의 게놈 서열 어느 부분에도 상보적이지 않다.
[0062] 또 다른 측면에서, 본 발명은 표적 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 가지는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형을 제공하는데, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이가 6 nts이상(또는 각각의 구현예들에서, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 46, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 120 nts 이상의 길이)이며 올리고뉴클레오티드의 서열은 표적 바이러스의 게놈 서열 임의의 부분에 대해 상보성이 70% 미만이며 반드시 polyA, polyC, polyG, polyT, G 쿼텟 또는 TG-리치 서열을 구성하지는 않는다. 각각의 구현예들에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 표적 바이러스의 게놈 핵산 서열 임의의 부분에 대하여 65%, 60%, 55%, 50%, 80% 90%, 95% 또는 100% 미만의 상보성을 가진다
[0063]상기 올리고들에 관련하여 사용된 "TG-리치(rich)"라는 용어는 항바이러스 올리고뉴클레오티드의 서열이 70 % 이상 T 및 G 뉴클레오티드 또는 좀더 특정하자면, 80, 90 또는95% 이상 T 및 G 또는 심지어 100% T 및 G 뉴클레오티드로 구성되는 것을 나타낸다.
[0064]관련된 양태은 본 명세서에 설명하였듯이(예로 항바이러스 올리고뉴클레오티드 제형들에서 설명하였듯이) 및 분리, 정제 또는 풍부화된 항바이러스 올리고뉴클레오티드및 다른 올리고뉴클레오티드 조제(예, 생체외 사용에 적합한 조제)이다.
[0065] 본 발명에서 유용한 항바이러스 올리고뉴클레오티드들은 다양한 길이(예, 적어도 6, 10, 14, 15, 20, 25, 28, 29, 30, 35, 38, 40, 46, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 140,160 또는 그 이상의 뉴클레오티드들)일 수 있다. 마찬가지로 상기 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 앞서 열거한 값 중 임의 두개를 포괄적인 엔드 포인트(end points) 범위(예를 들면 10-20, 20-40, 30-50, 40-60, 40-80, 60-920 및 80-120 nts)로 취하여 정의된 범위일 수 있다. 각각의 구현예들에서 최소 길이 또는 길이 범위는 본 항바이러스 올리고뉴클레오티드에 대하여 명세서에 열거된 임의의 다른 올리고뉴클레오티드 목록과 조합된다.
[0066]상기 항바이러스 뉴클레오티드는 다양한 변형(예, 안정화시키는 변형) 들을 포함할 수 있으며, 따라서 포스포디에스테르 결합 및/또는 당 및/또는 염기에서 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 혹은 그 이상의 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합 및/또는 메틸포스포네이트 결합; 2'-O-메틸 변형, 2'-아미노 변형 같은 당의 2'-위치 변형, 2'-플루오로(fluoro) 같은 2'-할로 변형; 비환 뉴클레오티드 유사체들을 포함할 수 있으며, 또한 하나 이상의 포스포디에스테르 결합을 포함할 수 있다. 다른 변형들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 또한 사용될 수 있다. 2'-O-메틸 변형을 포함하는 올리고들에서, 상기 올리고는 현재의 결과가 이러한 올리고들이 적합한 활성을 가지지 않는다는 것을 암시하므로, 전체에 있어 2'-O-메틸 변형을 갖지 않는다. 상기 올리고뉴클레오티드는 예로, 포스포로티오에이트의 변형된 결합을 갖는다; 3'- 및/또는 5'-캡을 가진다; 말단 3'-5' 결합을 포함한다; 상기 올리고뉴클레오티드는 링커(들)에 의하여 연결된 둘 이상의 올리고뉴클레오티드 서열로 구성된 컨케이터머(concatemer)이거나 이를 포함한다.
[0067]상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 바이러스 단백질과 결합한다. 올리고뉴클레오티드의 서열(또는 그것의 일부, 예, 적어도 1/2)은 바이러스 게놈으로부터 유도된다; 바이러스 게놈으로부터 유도된 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드의 활성은 랜더머 올리고뉴클레오티드 또는 같은 길이의 무작위 올리고뉴클레오티드에 우세하지 않다. 상기 올리고뉴클레오티드는 바이러스 서열에 상보적인 부분 및 바이러스 서열에 상보적이지 않은 부분을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 서열은 바이러스 패키징 서열 또는 압타머 상호작용(aptameric interaction)에 관련된 다른 바이러스 서열로부터 유도된다. 달리 언급되지 않으면, 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 A(x), C(x), G(x), T(x), AC(x), AG(x), AT(x), CG(x), CT(x) 또는GT(x)를 포함하는데, 상기의 x는 2, 3, 4, 5, 6,... 60 ... 120 (상기 올리고뉴클레오티드 길이가 적어도 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 46, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는 120 nts이며, 또는 특정 반복 서열의 길이는 바로 앞서 명시된 길이이다) 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드 단일 가닥(RNA 또는 DNA)이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥(RNA 또는 DNA)이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나 이상의 G 쿼텟 또는 CpG 부분을 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 바이러스 mRNA에 상보적인 부분을 포함하며 또한 적어도 29, 37 또는 38 nts 길이이다(또는 상기에 명시된 다른 길이). 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 비-왓슨-크릭 올리고뉴클레오티드 및/또는 또 다른 뉴클레오티드와 결합하는 비-왓슨-크릭에 관여하는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드 무작위 올리고뉴클레오티드이며, 상기 올리고뉴클레오티드는 랜더머이거나 또는 랜더머 부분을 포함한다(예, 올리고뉴클레오티드 길이에 대하여 상기에 명시된 길이를 가지는 랜더머 부분); 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드의 특징을 변형하는(예, 더 높은 안정성을 제공하는 것(혈청에서의 안정성 또는 특정 용액에서의 안정성과 같은), 더 낮은 혈청 상호작용, 더 높은 세포 흡수, 더 높은 바이러스 단백질 상호작용, 전달을 위하여 제형화되기 위한 향상된 능력, 검출가능한 신호, 향상된 약물동력학적 특성, 특이적 조직 분포 및/또는 더 낮은 독성) 분자에서 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기에 연결 또는 결합된다.
[0068]올리고뉴클레오티드들은 또한 조합물(예를 들면, 혼합물로서)로 사용될 수 있다. 이러한 배합물들 또는 혼합물들은 예로 적어도 2, 4, 10, 100, 1000, 10000, 100,000, 1,000,000 또는 그 이상의 다른 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 조합물들 또는 혼합물들은 예로 상이한 서열 및/또는 상이한 길이들 및/또는 상이한 변형 및/또는 상이하게 연결된 또는 결합된 분자들일 수 있다. 이러한 조합물 또는 혼합물은 각각의 구현예들에서, 다수의 올리고뉴클레오티드는 최소 길이를 가지거나 또는 올리고뉴클레오티드에 대하여 상기 명시된 것과 같은 길이 범위내에 있다. 이러한 조합물 또는 혼합물의 하나 이상, 다수 또는 각각의 상기 올리고뉴클레오티드는 개별 항바이러스 올리고뉴클레오티드들(또한 임의의 일관성있는 조합일 수 있음)에 대하여 명세서내에 명시된 임의의 다른 특성들을 가질 수 있다.
[0069] "바이러스 게놈으로부터 유도된"이라는 말은 특정 서열이 바이러스 게놈 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 상보적 서열(예, 이러한 바이러스 게놈 서열과 같거나 또는 상보적이다)에 70% 이상의 동일성을 가지는 뉴클레오티드 염기 서열을 가진다는 것을 나타내거나 또는 대응하는 RNA 서열이다. 본 발명의 상기 용어는 상기 서열이 올리고뉴클레오티드가 합성된 특정 바이러스의 바이러스 게놈 서열 또는 그것의 상보적 서열에 대하여 70% 이상 동일함을 나타낸다. 동일성은 적어도 80, 90, 95, 98, 99 또는 100% 이다.
[0070] 본 발명은 또한 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성이 주로 비서열 상보적 작용 방식에 의하여 일어나는 6 nts 길이(또는 본 명세서에 열거된 다른 길이) 이상인, 약학적으로 유효한 양의 약리학적으로 허용가능한 항바이러스 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하는 항바이러스 약학적 조성물을 제공한다. 각각의 구현예들에서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 조합물 또는 혼합물은 각각의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 조합물 또는 혼합물에 대해 상기에 명시된 바와 같다. 각각의 구현예들에서, 상기 약학적 조성물은 인간 또는 비인간 영장류와 같은 인간이 아닌 동물 투여에 대하여 승인된다.
[0071] 각각의 구현예들에서, 상기 약학적 조성물은 바이러스 병인(etiology)을 가지는 병의 치료, 조절 또는 예방에 적합하다. 프리온(prion) 질병의 치료, 조절 또는 예방에 적합하다. 안내 투여(intraocular administration), 경구 섭취, 장 투여, 흡입, 피부(cutaneous), 피하(subcutaneous), 근내(intramuscular), 복강내(intraperitoneal), 경막내(intrathecal), 기관내(intratracheal) 또는 정맥내(intravenous) 주사 또는 국소(topical) 투여에 의한 전달에 적합하다. 각각의 구현예들에서, 상기 조성물은 전달 체계(예, 특이적 세포 또는 조직에 표적화된 전달 체계; 리포좀 제형, 또 다른 항바이러스 약물, 예, 비-뉴클레오티드 항바이러스 폴리머, 안티센스 분자, siRNA 또는 작은 분자 약물)를 포함한다.
[0072]각각의 구현예들에서, 상기 항바이러스 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 조제, 올리고뉴클레오티드 제형 또는 항바이러스 약학적 조성물은 0.50, 0.20, 0.10, 0.09. 0.08, 0.07, 0.75, 0.06, 0.05, 0.045, 0.04, 0.035, 0.03, 0.025, 0.02, 0.015 또는 0.01μM 또는 미만의 표적 바이러스(예, 임의의 특정한 바이러스들 또는 본 명세서에 나타낸 바이러스들군의 바이러스들)에 대한 IC50을 가진다.
[0073] 제형, 약학적 조성물 및 예방 또는 치료를 위한 방법의 각각의 구현예들에서 상기 조성물 또는 제형은 바이러스 병인을 가지는 병의 치료, 조절 또는 예방에 적합하다. 프리온 질병의 치료, 조절 또는 방지에 적합하다. 안내, 경구 섭취, 장, 흡입 또는 피부, 피하, 근내 또는 정맥내 주사 전달로 구성되는 군으로부터 선택되는 방식에 의한 전달에 적합하다. 더욱이 특이적 세포와의 친화성을 증가시키는 분자를 포함 또는 이와 연관될 수 있는 전달 시스템을 포함한다. 나아가 하나 이상의 다른 항바이러스 약물을 조합으로 포함한다; 및/또는 더욱이 항바이러스 폴리머를 조합으로 포함한다.
[0074] 특정 바이러스 또는 바이러스군과 관련하여 항바이러스 올리고뉴클레오티드 및 제형등과 관련되어 본 명세서에 사용된 "표적화"이란 용어는 상기 올리고뉴클레오티드가 바이러스 또는 바이러스들의 그룹을 억제하기 위하여 선택됨을 나타낸다. 특정 조직 또는 세포 타입에 관련하여 사용된 대로, 상기 용어는 올리고뉴클레오티드, 제형 또는 전달 시스템이 특정 조직 또는 세포 타입에 인접하기에서 또는 이에 인접부위에서 상기 올리고뉴클레오티드가 우선적으로 존재, 및/또는 우선적으로 항바이러스 효과를 나타내도록 선택된다.
[0075] 본 명세서에 사용된 "전달 시스템"이란 용어는 본 명세서에 기술된 올리고뉴클레오티드와 결합하였을 때, 생체내(in vivo)에서의 의도된 위치에서 접촉하는 양을 증가시키거나 또한/또는 전달체계 부재시의 양 및/또는 지속과 비교하여 적어도20, 50 또는100%만큼 표적에서의 지속을 늘리거나 또한/또는 부작용을 유발하는 상호작용을 예방하거나 또는 감소시키는 구성성분 또는 구성성분들을 나타낸다.
[0076]항바이러스 작용제들 및 다른 약물들 또는 시험 화합물들에 관련하여 본 명세서에 사용된 "작은 분자"라는 용어는 상기 분자의 분자량이 1500 달톤(daltons) 또는 그 이하임을 나타낸다. 몇몇 경우에, 상기 분자량은 1000, 800, 600, 500 또는 400달톤(daltons) 또는 그 이하이다.
[0077] 또다른 측면에서, 본 발명은 표지가 붙은 패키지중 하나 이상의 항바이러스 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 제형을 포함하는 키트(kit)를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성은 주로 비서열 상보적 작용 방식에 의하여 일어나며 또한 패키지상의 표지는 상기 항바이러스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 바이러스에 대하여 사용될 수 있음을 나타낸다.
[0078]각각의 구현예들에서 상기 키트는 본 명세서에 기술한 바와 같은 하나 이상의 항바이러스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 상기 항바이러스 올리고뉴클레오티드는 동물에서 생체내 사용에 적합하며 또한/또는 상기 표지는 상기 올리고뉴클레오티드 또는 조성물이 동물에서 사용에 대하여 허용가능하거나 또한/또는 승인됨을 나타낸다; 상기 동물은 인간 또는 소, 돼지, 반추동물, 양 또는 말처럼 비인간 포유동물과 같은 포유동물이다; 상기 동물은 비 인간 동물이다; 상기 키트는 미국 FDA 또는 동물(예, 인간)에서의 사용에 대한 동등한 정부기관등과 같은 규제 기관에 의하여 승인된다.
[0079] 또 다른 측면에서, 본 발명은 항바이러스 작용제로 사용하기 위한 항바이러스 올리고뉴클레오티드(예, 비서열 상보적 항바이러스 올리고뉴클레오티드)를 선택하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다수의 상이한 무작위 올리고뉴클레오티드의 합성, 상기 올리고뉴클레오티드를 바이러스가 감염성 바이러스 입자를 생산하는 능력 억제에 있어서의 활성에 대한 시험, 항바이러스 작용제로서의 사용을 휘해 약학적으로 허용가능한 수준의 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 선별을 포함한다.
[0080]각각의 구현예들에서, 상이한 무작위 올리고뉴클레오티드는 다른 길이의 랜더머들을 포함한다; 다수의 가장 짧은 올리고들의 서열과 같이 상기 무작위 올리고뉴클레오티드는 상이한 서열을 가질 수 있으며 또는 공통적인 서열을 가질 수 있다; 및/또는 상기 상이한 무작위 올리고뉴클레오티드는 적어도 5 nts 길이 랜더머 단편(segment)을 포함하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 또는 상이한 무작위 올리고뉴클레오티드는 다수의 상이한 길이의 랜더머들을 포함한다. 나머지 올리고뉴클레오티드는 예로, 항바이러스 올리고뉴클레오티드에 대하여 본 명세서에 기술된 바와 같이, 특정 시스템으로 시험될 수 있다.
[0081] 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기술한 바와 같이(예, 6 nts 이상 길이의 비서열 상보적 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스 약학적 조성물 또한 제형), 치료에 유효한 양의 하나 이상의 약리학적으로 허용가능한 올리고뉴클레오티드를 이러한 치료가 필요한 대상체에 투여함으로써 대상체에서 바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 방법을 제공한다. 각각의 구현예들에서, 상기 바이러스는 본 발명을 사용한 억제에 적합한 명세서에 기재된 임의의 것들일 수 있다; 상기 감염은 바이러스 감염과 관련됨으로써 명세서에 기술된 질병 또는 증상과 관련된다; 상기 대상체는 명세서에 기재된 한 유형의 대상체이다.(예, 인간, 비인간 동물, 비인간 포유동물, 식물 및 이와 동일한 종류의 것); 상기 치료는 바이러스 질병 또는 바이러스 병인을 가지는 질병(예, 본 배경기술에 나타낸 바와 같은 질병)에 대한 것이다.
[0082] 각각의 구현예들에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 항바이러스 올리고뉴클레오티드(또는 올리고뉴클레오티드 제형 또는 약학적 조성물)가 투여된다; 투여는 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법이다; 본 명세서에 기술된 바와 같이 전달 체계 또는 방법이 사용된다; 상기 바이러스 감염은 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스 중에 있다; 상기 바이러스는 파보바이러스과(parvoviridae), 파포바바이러스과(papovaviridae), 아데노바이러스과(adenoviridae), 헤르페스바이러스과(herpesviridae), 폭스바이러스과(poxviridae), 헤파드나바이러스과(hepadnaviridae) 또는 파필로마바이러스과(papillomaviridae) 이다; 상기 바이러스는 아레나바이러스과(arenaviridae), 부니아바이러스과(bunyaviridae), 칼시바이러스과(calciviridae), 코로나바이러스과(coronaviridae), 필로바이러스과(filoviridae), 플라바이러스과(flaviridae), 오쏘믹소바이러스과(orthomyxoviridae), 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae), 피코나바이러스과(picornaviridae), 레오바이러스과(reoviridae), 랍도바이러스과(rhabdoviridae), 레트로바이러스과(retroviridae) 또는 토가바이러스과(togaviridae)이다; 상기 헤르페스바이러스과 바이러스는 EBV, HSV-1, HSV-2, CMV, VZV, HHV-6, HHV-7, 또는 HHV-8이다; 상기 바이러스는 HIV-1 또는 HIV-2이다; 상기 바이러스는 RSV이다; 상기 바이러스는 독감(influenza) 바이러스(예,influenza A)이다; 상기 바이러스는 HBV이다; 상기 바이러스 천연두(smallpox) 바이러스 또는 우두(vaccinia) 바이러스이다; 상기 바이러스는 코로나바이러스(coronavirus)이다; 상기 바이러스는 SARS 바이러스이다; 상기 바이러스는 웨스트 나일(West Nile) 바이러스이다; 상기 바이러스는 한타바이러스(hantavirus)이다; 상기 바이러스는 파라독감(parainfluenza) 바이러스이다; 상기 바이러스는 콕사키바이러스(coxsackievirus)이다; 상기 바이러스는 리노바이러스(rhinovirus)이다; 상기 바이러스는 황열 바이러스이다; 상기 바이러스는 뎅기열(dengue) 바이러스; 상기 바이러스는 C형 간염 바이러스이다; 상기 바이러스는 에볼라(Ebola) 바이러스이다; 상기 바이러스는 마버그(Marburg) 바이러스이다.
[0083] 유사하게, 관련된 양태에서, 본 발명은 약리학적으로 허용가능한, 치료에 유효한 양의 적어도 6 nts 이상의 길이(또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 또다른 길이)인 하나 이상의 무작위 올리고뉴클레오티드 또는 이러한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제형 또는 약학적 조성물을 이러한 치료가 필요한 인간 또는 동물에게 투여함으로써 인간 또는 동물에서 암바이러스에 의해 유발되는 암의 예방 치료에 대한 방법을 제공한다.
[0084]각각의 구현예들에서, 상기 올리고뉴클레오티드(들)은 본 발명에 대한 본 명세서에 기술된 바와 같다(예, 본 명세서에 기술된 바와 같은 길이를 가지는); 본 명세서에 기술된 바와 같이 투여방법이 이용된다; 본 명세서에 기술된 바와 같이 전달 시스템이 이용된다.
[0085] "치료에 효과적인 양"이라는 용어는 의도된 유형의 전형적인 대상체에게 투여하였을 때 감염성 바이러스 입자들의 생산에서 치료 또는 예방적으로 현저한 감소 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 대상체에게 항바이러스 올리고뉴클레오티드의 투여에 관한 양태들에서, 전형적으로 올리고뉴클레오티드, 제형, 또는 조성물은 치료에 유효한 양으로 투여되어야만 한다.
[0086] 또다른 양태에서, 비 서열 상보적 상호작용들이 효과적인 항바이러스 활성을 생성한다는 발견은 하나 또는 그이상의 바이러스 단백질들(예, 감염된 숙주 생명체들의 바이러스 배양으로부터 추출 또는 정제된 또는 재조합 방법들에 의해 생산된)과 같이 바이러스 성분에 올리고뉴클레오티드의 결합을 변경하는 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 방법은 시험 화합물이 하나 또는 그이상의 바이러스 성분들에 올리고뉴클레오티드의 결합을 감소시키는지 결정하는데 관여할 수 있다.
[0087] 명세서에 사용된 바와 같이, "스크리닝(screening)"이라는 용어는 그것들이 바람직한 특성을 가지는지 결정하기 위하여 다수의 화합물들을 분석하는 것을 나타낸다. 대다수의 화합물들은 예로 적어도 10, 100, 1000, 10,000 또는 그 이상의 시험 화합물(test compounds)일 수 있다.
[0088]각각의 구현예들에서, 다양한 시험 포맷(assay formats) 및 검출 방법이 결합(예, 스크리닝(예, 분리 반응들에서) 될 화합물(들)의 존재 및 부재시에 바이러스 성분(들)과 올리고뉴클레오티드 접촉 및 상기 화합물 부재시와 비교하여 상기화합물의 존재시에 바이러스 성분과 올리고의 결합에서 차이가 일어나는지 결정함으로써)에서 이러한 변경(alteration)을 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 차이의 존재는 상기 화합물이 상기 바이러스 성분과 무작위 올리고뉴클레오티드의 결합을 변경함을 나타낸다. 선택적으로, 경쟁적 치환(displacement)은 올리고뉴클레오티드가 바이러스 성분과 결합되고 또한 첨가된 시험 화합물에 의한 치환을 결정하고, 또는 반대로 시험 화합물이 결합되고 또한 첨가된 올리고뉴클레오티드에 의한 치환이 대체되게 사용될 수 있다.
[0089] 각각의 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 항바이러스 올리고뉴클레오티드에 대하여 명세서에 기술된 바와 같다; 상기 올리고뉴클레오티드 적어도 6, 8, 10, 15, 20, 25, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 46, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 또는120 nts 길이 또는 최소한 항바이러스 올리고뉴클레오티드에 대하여 명세서에 특정한 또 다른 길이이며, 또는 포괄적인 엔드포인트 범위로서 앞서 기재된 어느 두 가지의 값들을 획득함으로써 정의된 범위내에 있다; 상기 시험 화합물(들)은 작은 분자이다; 상기 화합물은 400, 500, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500 또는3000 달톤 미만의 분자량을 가지며, 또는 포괄적인 엔드포인트 범위로서 앞서 기재된 어느 두 가지의 값들을 획득함으로써 정의된 범위내에 있다; 상기 바이러스 추출물 또는 성분은 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스로부터 온다; 최소 100, 1000, 10,000, 20,000, 50,000 또는 100,000 화합물들이 스크리닝된다; 상기 올리고뉴클레오티드는 0.500, 0.200, 0.100, 0.075, 0.05, 0.045, 0.04, 0.035, 0.03, 0.025, 0.02, 0.015 또는 0.01 μM 같거나 또는 미만의 IC50을 가진다.
[0090]본 명세서에 사용된 바와 같이, "바이러스 성분(viral component)"이라는 용어는 상기 바이러스 감염의 결과로서 바이러스에 의해 암호화된 또는 감염된 숙주세포에 의해 생산된 생산물을 나타낸다. 이러한 성분들은 다른 생분자들(biomolecules) 뿐만 아니라 단백질들을 포함할 수 있다. 예를 들어 이러한 바이러스 성분들은 바이러스 배양체들(viral cultures), 감염된 숙주 생명체들(예, 동물들 및 식물들)로부터 획득되며, 또는 재조합 시스템(원핵 생물 및 진핵 생물)들 에서 바이러스 서열들로부터 생산될 수 있으며, 또한 바이러스 암호화 단백질들에 해당하는 아미노산 서열들을 가지는 합성 단백질들로부터 획득된다. "바이러스 배양 추출물(viral culture extract)"이라는 용어는 바이러스-특이적 생산물들을 포함할 바이러스에 감염된 세포로부터의 추출물을 나타낸다. 유사하게, "바이러스 단백질"은 보통 바이러스에 의해 암호화된 바이러스- 특이적 단백질을 나타낸다. 그러나 바이러스 감염의 결과로 숙주 서열들에 의해 최소한 부분적으로 또한 암호화될 수 있다.
[0091] 관련된 양태에서, 본 발명은 선행 방법에 의해 동정된 항바이러스 화합물(예, 새로운 항바이러스 화합물 )을 제공한다.
[0092] 또다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 바이러스 성분과 상기 풀을 접촉함으로써(예, 정지기(stationary phase) 배지에 결합) 올리고뉴클레오티드 풀(pool)로부터 하나 이상의 바이러스 성분들에 결합하는 올리고뉴클레오티드를 정제하고 바이러스 성분(들)과 결합하는 올리고뉴클레오티드 수집하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 수집은 바이러스 성분(들)로부터 올리고뉴클레오티드 치환을 수반한다. 상기 방법은 또한 수집된 올리고뉴클레오티드(즉, 바이러스 단백질과 결합한 올리고뉴클레오티드)의 항바이러스 활성 시험 및/또는 시퀀싱(sequencing)을 수반할 수 있다.
[0093] 각각의 구현예들에서, 상기 풀(pool)의 결합된 올리고뉴클레오티드는 적합한 방법(예, 이온 치환기(ionic displacer)를 사용함으로써)에 의하여 정지기 배지로부터 치환되며 또한 치환된 올리고뉴클레오티드는 수집된다. 전형적으로 다양한 방법의 치환을 위하여, 올리고뉴클레오티드들은 일반적으로 증가된 결합 친화성의 순으로 치환되기 때문에 상기 치환은 점점 빨라지는 방식(예, 단계적인 또는 연속적인 기울기가 있어 염 농도와 같이 치환 작용제의 점점 증가하는 농도로서)으로 수행될 수 있다. 많은 경우에서, 낮은 엄격성 세척(stringency wash)은 약하게 결합된 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위하여 수행될 것이며, 또한 하나 혹은 그 이상의 분획(fractions)은 치환된 것들을 포함하여 단단하게 결합하는 올리고뉴클레오티드가 수집될 것이다. 몇몇 경우에, 상기는 또 다른 사용을 위하여 매우 단단하게 결합하는 올리고뉴클레오티드(예, 훨씬 더 엄격한 치환 조건들에 의한 치환으로 인해 생기는 분획들내의 올리고뉴클레오티드들)을 포함하는 분획들을 선택하기에 바람직할 것이다.
[0094] 유사하게, 본 발명은 하나 혹은 그 이상의 바이러스 단백질들과 풀을 접촉함으로써 또한 풍부해진 올리고뉴클레오티드 풀(pool)을 제공하기 위한 바이러스 단백질들과 결합된 올리고뉴클레오티드를 증폭함으로써 하나 이상의 바이러스 성분에 결합하는 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)로부터 올리고뉴클레오티드를 풍부하게 하기 위한 방법을 제공한다. 상기 접촉 및 증폭은 다중 단계(multiple rounds)로 수행될 수 있다(예, 다음 단계를 위한 올리고뉴클레오티드의 풀로서 선행 단계로부터 풍부해진 올리고뉴클레오티드 풀을 사용하여 최소 1, 2, 3, 4, 5, 10 또는 그 이상의 부가적인 횟수). 상기 방법은 또한 1회이상의 접촉 및 증폭 단계들(rounds)에 이어 풍부해진 올리고뉴클레오티드 풀에서 시퀀싱 및 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성 시험을 수반할 수 있다.
[0095] 상기 방법은 상기에 기술된 것들과 같이(예, 치환 작용제를 사용하여) 다양한 기술들을 가지고 상기 바이러스 성분(예, 고체상 배지에 결합된 바이러스 단백질)으로부터 올리고뉴클레오티드 치환을 수반할 수 있다. 상기에 나타낸 바와 같이, 상기 방법은 더 나은 사용을 위하여(예, 결합 및 증폭의 더 나아간 단계들(rounds)에서) 더 단단히 결합하는 올리고뉴클레오티드를 선택하는데 유리할 수 있다. 상기 방법은 더 나은 사용을 위하여 하나 혹은 그이상의 풍부해진 올리고뉴클레오티드,(예, 고 친화성 올리고뉴클레오티드) 선택을 수반할 수 있다. 각각의 구현예들에서, 상기 선택은 흥미로운 특정 바이러스에 대하여 숙주 게놈 서열들(예, 인간 )에 상보적인 서열들을 가지는 올리고뉴클레오티드 제거를 포함할 수 있다. 이러한 제거는 서열 데이터베이스(들)(예, 서열 정렬 프로그램(예, BLAST 검색)을 사용하여)에서 상기 특정 숙주로부터 서열들과 상기 올리고뉴클레오티드 서열(들) 비교 및 숙주 서열에 대하여 동일한 서열들 또는 특정한 수준의 상동성을 가지는 올리고뉴클레오티드 제거를 수반할 수 있다. 이러한 숙주 상보적 서열들 제거 및/또는 숙주 서열들에 상보적이지 않은 하나 혹은 그 이상의 올리고뉴클레오티드 선택은 본 발명의 다른 양태들에서 또한 수행될 수 있다.
[0096] 올리고뉴클레오티드를 동정, 정제 또는 풍부화하기 위한 선행 방법들에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 유형들 중에 속할 수 있다. 상기 방법들은 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 랜더머 조제로부터 고-친화성 올리고뉴클레오티드를 동정, 정제 또는 풍부화하기에 유리하다.
[0097] 관련된 양태에서, 본 발명은 초기 올리고뉴클레오티드 풀로부터 항바이러스 올리고뉴클레오티드 동정, 획득 또는 정제하기 위한 선행 기술들의 어느 한 방법들을 사용하여 확인된 하나 혹은 그 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스 올리고뉴클레오티드 조제에 관여하며, 올리고뉴클레오티드 조제에서 상기 올리고뉴클레오티드는 초기 올리고뉴클레오티드 풀에서 올리고뉴클레오티드들의 평균 결합 친화성보다 하나 혹은 그 이상의 바이러스 단백질들과 더 높은 평균 결합 친화성을 나타낸다
[0098] 각각의 구현예들에서, 올리고뉴클레오티드의 평균 결합 친화도(affinity)는 초기 올리고뉴클레오티드 풀에서 올리고뉴클레오티드의 평균 결합 친화도보다 더 큰 최소 2배, 3배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100 배이거나 또는 그 이상이다; 상기 결합 친화성의 중앙값(median)은 초기 올리고 풀의 결합 친화성 중앙값에 비례하여 최소 2배, 3배, 5배, 10배, 20배, 50 배 또는 100배 더 크며, 상기 중앙값은 중간의 값을 나타낸다.
[0099] 좀더 다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 항바이러스 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 비-뉴클레오티드 항바이러스 폴리머를 포함하는 항바이러스 폴리머 믹스(mix)를 제공한다. 각각의 구현예들에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 항바이러스 올리고뉴클레오티드에 대하여 본 명세서에 기술된 바와 같으며 또한/또는 상기 항바이러스 폴리머는 본 명세서에 기술된 바와 같거나 또는 만약 그렇지 않다면 당해 기술분야에 잘 알려져 있거나 또는 이후에 확인되었다.
[0100]좀더 다른 양태에서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 랜더머를 제공하며 상기 랜더머는 길이가 6 nts 이상이다. 각각의 구현예들에서 상기 랜더머는 항바이러스 올리고뉴클레오티드에 대하여 상기에 특정한 바와 같은 길이를 가진다; 상기 랜더머는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결(linkage)을 포함하며, 상기 랜더머는 하나 이상의 포스포로디티오에이트 연결 또는 본 명세서에 작성된 다른 변형을 포함한다; 상기 랜더머 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드에 대하여 상기에 특정한 바와 같은 길이를 가지는 하나 이상의 비-랜더머 단편(선택된 바이러스 핵산서열에 상보적인 단편들과 같이)를 포함한다; 상기 랜더머는 최소5, 10, 15, 20, 50, 100, 200, 500 또는700 micromol을 포함하는 조제 또는 조제들의 풀 또는 1, 5, 7, 10, 20, 50, 100, 200, 500 또는700 mmol 또는 1 mole의 랜더머 또는 포괄적인 엔드 포인트로서 선행한 것으로부터 두 다른 값들을 획득함으로써 정의된 범위내에 있으며, 또는 상기 기재된 크기(scales) 및 크기 범위(scale ranges)중의 하나로서 합성된다.
[0101]또한, 본 발명은 하나 이상의 랜더머(예, 상기에 기술된 바와 같은 랜더머)를 합성함으로써 항바이러스 랜더머들을 조제하는 방법을 제공한다.
[0102]상기에 나타낸 바와 같이, 각각의 구현예들에서 바이러스 감염 또는 바이러스 감염의 위험 또는 특정 바이러스에 대한 표적화에 관여하는 다른 양태에서 상기 바이러스는 상기에 기재된 것과 같다.
[0103]"인간 및 동물 바이러스들"라는 표현은 한정하는 것은 아니며, 일반적으로 DNA 및 RNA 바이러스들을 포함함을 나타낸다. DNA바이러스들은 예로 파보바이러스과(parvoviridae), 파포바바이러스과(papovaviridae), 아데노바이러스과(adenoviridae), 헤르페스바이러스과(herpesviridae), 폭스바이러스과(poxviridae), 헤파드나바이러스과(hepadnaviridae) 또는 파필로마바이러스과(papillomaviridae)을 포함한다. RNA 바이러스들은 예를 들어 아레나바이러스과(arenaviridae), 부니아바이러스과(bunyaviridae), 칼시바이러스과(calciviridae), 코로나바이러스과(coronaviridae), 필로바이러스과(filoviridae), 플라바이러스과(flaviridae), 오쏘믹소바이러스과(orthomyxoviridae), 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae), 피코나바이러스과(picornaviridae), 레오바이러스과(reoviridae), 랍도바이러스과(rhabdoviridae), 레트로바이러스과(retroviridae) 또는 토가바이러스과(togaviridae)을 포함한다.
[0104] 또 다른 분자 또는 일부(moiety)와 연결 또는 결합함으로써 올리고뉴클레오티드의 특징들을 변형하는 것과 관련하여 상기 특징들에서의 변형은 상기 연결 또는 결합된(conjugated) 분자 또는 일부 없는 같은 올리고뉴클레오티드와 비교하여 평가된다.
[0105]부가적인 구현예들에서 상세한 설명 및 청구항들로부터 분명해질 것이다.
실시예1: 허피스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus)
[00287] 허피스 심프렉스 바이러스는 인구 수의 상당 부분에 영향을 준다. 본 발명에서는 무작위 ODN 또는 ODN 랜더머(randomers)가 HSV와 같은 바이러스의 감염을 억제한다는 것을 발견하였다. Vero 세포(HSV-1(KOS 균주) 및 HSV-2(MS2 균주)에 감염되기 쉬운)에서 세포내 HSV 복제 분석으로 HSV의 복제 오리진(origin)에 상보적인 단일 가닥 PS-ODN이 HSV-1 및 HSV-2의 복제를 억제한다는 것을 발견하였다. 더욱이, 인간(343 ARS) 및 플라스미드(pBR322/pUC)에 상보적인 대조군 PS-ODN 또한 바이러스 감염을 억제하였다. 무작위 서열 PS-ODN과 PS-OND 랜더머의 시험에서 ODN의 사이즈가 증가할수록 바이러스 감염 억제의 정도가 증가한다는 것을 증명하였다. 상기 결과들은 ON은 바이러스 감염을 치료하는데 유용한 강력한 항바이러스제임을 나타낸다.
[00288] 본 발명자들은 HHV와 같은 바이러스의 번식을 억제하기 위한 강력한 기작은 바이러스 DNA의 복제를 막는 것이라 착안하였다. 이를 위하여 HSV1 및 HSV2의 복제 오리진에 상보적인 포스포티오에이트 올리고뉴클레오티드(phosphorothioate oligonucleotide, ODNs)를 감염된 세포에 도입하였다. 이들 OND은 바이러스의 복제 오리진에서 DNA 삼중구조를 형성해서, 필수적인 전사조절인자의 결합 및 바이러스의 DNA 복제를 억제하였다. 실시예에서 ODN의 길이가 증가할수록 바이러스의 감염을 억제 시키는 효력이 증가하는 놀라운 결과를 제시하고 있다.
HSV-1의 억제
[00289] PS-OND의 HSV-1을 억제하는 능력을 플라크 감소 분석(plaque reduction assay, PRA)으로 측정하였다. 불멸화된 아프리카 원숭이 신장 세포(Immortalized African Green Monkey kidney cell, VERO cell)를 37℃, 5% CO2 조건에서 젠타마이신(gentamycin), 반코마이신(vancomycin) 및 암포테레신 B(amphoterecin B) 보충물 및 10% 우태아 혈청이 첨가된 MEM(minimal essential medium) 배지에서 배양하였다. 세포가 4일 동안 증식 후 포화된 단일층을 이를 수 있는 밀도로 12웰 플레이트에 접종하였다. 포화상태에 이르렀을 때 상기에서 서술한 보충물과 5% 혈청만을 포함하도록 배지를 바꾼 다음, 90분 동안 시험 합성물(test compound) 존재시 HSV-1(KOS 균주, 전체 약 40-60 PFU)에 접촉시켰다. 바이러스에 접촉 후, 배지를 5% 혈청, 1% 인간 이뮤노글로블린, 상기에서 서술한 보충물 및 시험 합성물을 포함하는 새로운 덮게(overlay) 배지로 교환하였다. 감염 3-4일 후 감염된 세포를 포르말린 고정 및 크리스탈 바이올렛 염색을 하여 플라크 개수를 계산하였다.
[00290] 모든 ON(다른 곳에서 제시한 것을 제외함)은 캘거리 대학교 코어 DNA 서비스 시험실(Core DNA service lab)에서 합성하였다. ON(테이블 1 참조)은 50 cm 세파덱스(Sepadex) G25 컬럼에서 탈보호기 및 제염을 하여 1 또는 15 mM로 준비하였다. 합성된 ON은 UV 새도우 겔 전기영동으로 분석하였고, ~95%의 전장 올리고, n-1 및 n-2 올리고 및 5%의 더 짧은 올리고 종(무작위 결실을 가지고 있을 것으로 추정된다)을 포함하도록 정하였다. 무작위 올리고 합성을 위하여, 합성동안 알라닌, 구아노신, 시토신 및 타이미딘 아미디트(amidites)를 ODN의 각각의 위치에 무작위 삽입을 극대화하기 위하여 동량으로 함께 섞었다.
[00291] PS-ODN이 HSV-1을 억제하는지 시험하기 위하여 REP 1001, 2001 및 3007을 HSV-1 PRA로 시험하였다. PS-ODN(다른 두 가지는 인간 및 플라스미드에 있는 복제 오리진에 대한 것이다)이 HSV의 복제 오리진에 대한 것이기 때문에 단지 REP 2001만이 임의의 활성을 보일 것으로 예상된다. 그러나 세가지 모든 PS-ODN이 항-HSV-1 활성을 보였다(도 1 참조). 더욱이, 항-HSV-1 효력은 올리고의 사이즈에 의존적이었다(도 2 참조).
[00292] 항-HSV-1 활성에 있어서 PS-ODN의 사이즈 의존성과 상대적인 염기서열 독립성을 확인하기 위하여, 사이즈가 다른 PS-ODN(REP 2002, 2003, 2004, 2005 및 2006)을 시험하였다. 이들 PS-ODN은 와블(Wobble, N)로 각각의 염기를 합성함으로써 염기서열 특이적인 효과의 관점에서 불활성화 되도록 하였고, 그 결과 각 PS-ODN은 실질적으로 같은 사이즈를 가진 다른 무작위 염기서열의 집단으로 나타내고 이들 PS-ODN을 랜더머(randomer)로 명명하였다. 이들 올리고머로 HSV-1 PRA에서 시험할 때, 10머의 올리고 또는 그보다 작은 것은 항-HSV-1 활성을 검출할 수 없었지만 PS-ODN의 사이즈를 10머 이상으로 증가시키면 활성 또한 증가하였다(IC50이 감소하였다. 도 3 및 4 참조). 또한, 20머 보다 긴 PS-ODN은 임상적으로 인정 받는 항-HSV 약제, 아실크로비어(acylclovir™) 보다 낮은 주목할만한 IC50 수치를 가짐을 알 수 있었다(도 4 참조).
[00293] 항-HSV-1 활성에 있어서 PS-ODN의 효과적인 사이즈 범위를 더욱 한정하기 위하여 10머에서 120머까지의 넓은 범위를 포함하는 PS-ODN을 시험하였다(도 5 및 6 참조). 올리고 12머 및 더 긴 올리고는 검출할 수 있을 정도의 항-HSV-1 활성을 가지고 있었고 항-HSV-1에 대한 효능 또한 적어도 120머까지 PS-ODN 랜더머의 길이가 증가할수록 증가한다는 것을 발견하였다. 그러나, 사이즈의 증가에 대한 효능의 증가는 40머 보다 큰 PS-ODN 랜더머에서 적어졌다(도 7 참조).
[00294] 비(non)-PS-ODN 랜더머(무작위 염기서열 PS-ODN 및 HSV-1 특이적인 염기서열 PS-ODN)의 효능을 비교하기 위하여, 사이즈가 10, 20, 40머로 변형된 3 가지 형태로 시험하였다(도 8 및 9 참조). 변형되지 않은 ODN 랜더머는 테스트된 사이즈에서는 항- HSV-1 활성을 감지할 수 없었다(도 8a-c 참조). 무작위 염기서열 및 특이적인 HSV-1 염기서열 PS-ODN 모두에서 사이즈에 의존적인 항-HSV-1 활성을 보였다(이들 변형물의 10머에서는 활성을 관찰할 수 없었다. 도 8d 및 g 참조). 무작위 염기서열(특이적인 HSV-1 염기서열 및 랜더머 PS-ODN)의 비교(도 10 참조)에서 PS-ODN 20머에 있어서는 특이적인 HSV-1 염기서열로 증가된 항-HSV-1 활성을 보였지만, 40머에 있어서는 랜더머, 무작위 염기서열 또는 특이적인 HSV-1 염기서열인 모든 변형물이 HSV-1에 대해 동일한 효능을 보였다.
[00295] 우리가 알고 있는 지식으로, PS-ODN에 대해 0.059 mM 및 0.043 mM만큼 낮은 농도의 HSV에 대한 IC50을 보고한 것은 이것이 처음이다.
실시예2: HSV-2의 억제
[00296] HSV-2를 억제하는 PS-ODN의 능력을 PRA로 측정하였다. 불멸화된 아프리카 그린 원숭이 신장(Immortalized African Green Monkey kidney, VERO) 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 젠타마이신(gentamycin), 반코마이신(vancomycin) 및 암포테레신 B(amphoterecin B) 보충물 및 10% 우태아 혈청이 첨가된 MEM(minimal essential medium) 배지에서 배양하였다. 세포가 4일 동안 증식 후 포화된 단일층을 이를 수 있는 밀도로 12웰 플레이트에 접종하였다. 포화상태에 이르렀을 때 상기에서 서술한 보충물과 5% 혈청만을 포함하도록 배지를 바꾼 다음, 90분 동안 시험 합성물(test compound) 존재 시 HSV-2(MS2 균주, 전체 약 40-60 PFU)에 접촉시켰다. 바이러스에 접촉 후, 배지를 5% 혈청, 1% 인간 이뮤노글로블린, 상기에서 기술한 보충물 및 시험 합성물을 포함하는 새로운 덮게(overlay) 배지로 교환하였다. 감염 3-4일 후 감염된 세포를 포르말린 고정과 크리스탈 바이올렛 염색을 하여 플라크의 개수를 계산하였다.
[00297] PS-ODN이 HSV-2를 억제하는지 시험하기 위하여 REP 1001, 2001 및 3007을 HSV-2 PRA에서 시험하였다. PS-ODN(다른 두가지는 인간 및 플라스미드에 있는 복제 오리진에 대한 것이다)이 HSV-1/2의 복제 오리진에 대한 것이기 때문에 단지 REP 2001만이 임의의 활성을 보일 것으로 예상된다. 그러나 세가지 모든 PS-ODN이 항-HSV-2 활성을 보였다(도 12 참조). 더욱이, 항-HSV-1 효력은 올리고의 사이즈에 의존적이고 염기서열에는 비의존적이었다(도 13 참조).
[00298] 항-HSV-2 활성에 있어서 PS-ODN의 사이즈 의존성과 상대적인 염기서열 독립성을 확인하기 위하여, 사이즈가 다른 PS-ODN(REP 2002, 2003, 2004, 2005 및 2006)으로 시험하였다. 이들 PS-ODN은 와블(Wobble, N)로 각각의 염기를 합성함으로써 염기서열 특이적인 효과의 관점에서 불활성화 되도록 하였고, 그 결과 각 PS-ODN은 실질적으로 같은 사이즈를 가진 다른 무작위 서열의 집단으로 나타나고 이들 PS-ODN을 랜더머(randomer)로 명명하였다. 이들 올리고머를 HSV-2 PRA에서 시험할 때, 올리고 10머나 그보다 작은 것은 항-HSV-1 활성을 검출할 수 없었지만 PS-ODN의 사이즈를 10머 이상으로 증가시키면 활성 또한 증가하였다(IC50이 감소하였다. 도 14 및 15 참조). 또한, 20머 보다 긴 PS-ODN은 임상적으로 인정 받는 항-HSV 약제, 아실크로비어 (acylclovir™) 보다 낮은 주목할만한 IC50 수치를 가짐을 알 수 있었다(도 15 참조).
[00299] 우리가 알고 있는 지식으로, PS-ODN에 대해 0.012 mM만큼 낮은 농도의 HSV-2에 대한 IC50을 보고한 것은 이것이 처음이다.
[00300] 비-특이적인 염기서열 조성이 항바이러스 활성에 영향을 주는지 결정하기 위하여, 염기서열 조성은 르다지만 동일 사이즈의 수개의 PS-ODN으로 HSV-1 PRA에서 항-HSV-1 활성을 시험하였다. 시험에는 REP 2006(N20), REP 2028(G40), REP 2029(A40), REP 2030(T40) 및 REP 2031(C40)을 사용하였다. HSV-1 PRA시험에서 측정된 IC50 값은 REP 2006(N40)이 가장 명확하게 시험에 사용된 모든 염기서열 중에서 가장 높은 활성도를 보인 반면, REP 2029(A40)는 가장 낮은 활성도를 보였다. 또한, 다른 모든 PS-ODN은 N40>C40>T40>A40≫G40 효능의 순으로 N40보다 훨씬 낮은 활성을 보였다.
[00301] 또한, 두 가지 다른 뉴클레오티드로 다양한 염기서열 조성을 가진 PS-ODN들의 효능을 측정하였다. PS-ODN 랜더머(REP 2006)가 HSV-1에 대하여 다른 랜더머보다 훨씬 효과적이었고 AC20(REP 2055), TC20(REP 2056) 또는 AG20(REP 2057)의 효능은 다음과 같은 순이었다: N40>AG>AC>TC. 상기 결과는 항-바이러스 효과는 비-염기서열 상보적이지만, 임의의 비-특이적인 염기서열은 조성(즉, C40 및 N40)은 가장 강력한 항-바이러스 활성을 가지고 있다는 것을 제시한다. 이러한 현상은 고유의 단백질 결합 능력을 보유한다 할지라도 C40, A40, T40 및 C40와 같은 염기서열은 아마도 그들의 염기서열 내에서 형성된 임의의 제한된 삼차 구조 때문에 높은 친화력으로 바이러스 단백질에 덜 결합하는 현상으로 설명되어 질 수 있다는 것을 제시한다. 한편, N40의 무작위 성질 때문에, 강력한 항-바이러스 활성에 기여할 수 있는 넓은 범위의 항-바이러스 단백질에 높은 친화력으로 결합할 수 있는 능력을 보유한다.
실시예 3: CMV의 억제
[00302] CMV를 억제하는 능력을 플라크 감소 분석(plaque reduction assay, PRA)으로 측정하였다. 이 분석은 바이러스 접종으로 CMV(AD169 균주)를 이용하고 세포 숙주로는 인간 섬유아세포를 이용한 것을 제외하고는 항-HSV-1 및 항-HSV-2를 시험할 때 사용한 분석과 동일하다.
[00303] 항-CMV 활성에서 PS-ODN의 사이즈 의존성과 염기서열 독립성을 시험하기 위하여, 사이즈가 다른 PS-ODN 랜더머로 시험을 하였다(도 16a 및 b 참조). 이들 PS-ODN으로 CMV PRA에서 시험을 하면 PS-ODN의 사이즈가 증가할수록, CMV를 억제하는 능력 또한 증가함을 알 수 있었다(IC50이 감소한다. 도 16c 참조).
[00304] PS-ODN의 항-CMV 활성에 있어서 효과적인 사이즈 범위를 더욱 명확하게 밝히기 위하여, 10머에서 80머까지 넓은 범위를 포함하는 PS-ODN 랜더머로 시험을 하였다. 또한, CMV로 인한 망막 질환을 치료하기 위한 상품화된 안티센스의 2가지 종류(VitraveneTM; 상품화되어 있고 캘거리 대학교에서 합성하였다) 및 임상적으로 인정 받는 소분자 CMV 치료제(Gancyclovir, Foscarnet 및 Cidofovir)를 포함하여 시험하였다(도 17 참조). PS-ODN 랜더머의 사이즈가 증가할수록 억제하는 능력이 증가하지만 이러한 효능은 40머에서 포화상태가 된다(도 18참조). 더욱이, 20머, 40머 및 80머 PS-ODN 랜더머는 모든 시험에 사용된 소분자 치료제보다 더욱 상당한 효능을 보였다(도 17 참조). 또한 40 및 80머 PS-ODN 랜더머는 VitraveneTM보다 더 효능이 있었다.
[00305] 우리가 알고 있는 지식으로, PS-ODN에 대해 0.067 mM만큼 낮은 농도의 CMV에 대한 IC50을 보고한 것은 이것이 처음이다.
실시예 4: HIV-1의 억제
[00306] PS-ODN 랜더머가 HIV-1을 억제하는 능력을 다른 두 가지 방법에 의해 측정하였다.
세포변성 효과(Cytopathic Effect, CPE)
[00307] 세포변성효과는 세포내 신진대사의 정도를 측정하기 위하여 MTT 염료를 이용하여 측정하였다. 불멸화된 인간 임파구(Immortalized human lymphocyte, MT4) 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 10% 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 MEM 배지에서 배양하였다. 세포를 적절한 시험 합성물이 포함된 배지로 96웰 플레이트에 접종하고 두시간 배양하였다. 시험 합성물을 먼저 배양하고, HIV-1(NL 4-3 균주)을 각 웰에 첨가하였다(0.0002 TCID50/세포). 6일 동안 배양한 후 MTT 전환에 의해 CPE를 측정하였다. 세포변성은 바이러스를 접종하지 않고 6일동안 약제를 배양함으로써 측정하였다. MTT 흡광도 수치를 생존율로 전환하기 위하여 감염되지 않고 처리하지 않은 세포의 흡광도를 100%로 정하고, 감염되고 처리하지 않은 세포를 0%로 정하였다.
복제 분석(Replication Assay, RA)
[00308] HIV의 복제능을 불멸화된 인간 태아 신장(immortalized human embryonic kidney, 293A) 세포에서 측정하였다. 이들 세포에 두 가지 플라스미드를 공동형질감염 시켰다. 하나의 플라스미드는 env 유전자가 루시퍼라제 발현 카세트(CNDO 균주와 일치)로 절단된 재조합 야생형 HIV-1 게놈(NIL 4-3)을 포함하고, 다른 플라스미드는 쥐과의 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MLV)로부터 유래한 env 유전자를 포함한다. 이들 두 플라스미드는 MLV env 유전자로부터 트랜스로 제공되는 단백질 생산물을 제외하고는 HIV-1의 모든 구성요소를 가지고 있는 성숙한 카이메라 바이러스를 생산하기 위하여 트랜스로 모든 단백질 요소를 제공한다. 이들 세포로부터 생산된 비리온는 감염력 있고 복제를 할 수 있지만 env 유전자 생산물이 결핍되어 감염력 있는 비리온의 다음 세대는 생산할 수 없다.
[00309] 형질감염 24시간 후, 상기 세포에 트립신 처리를 하고 96웰 플래이트에 접종하였다. 세포가 바닥에 정착한 후, 배지로 세척을 하고 시험 화합물이 포함된 배지로 교환하였다. 바이러스 생산을 위하여 24시간 동안 더 배양하였다. 그런 다음 상층액을 수거하여 293A 세포에 재감염 시키는데 사용하였다. 감염된 세포는 루시퍼라제 유전자 생산물에 의하여 식별된다. 루시퍼라제 양성 세포의 수는 재조합 HIV-1의 복제 및/또는 감염의 정도를 나타내는 수치이다. 이 분석은 또한 몇 가지 다른 종류의 항-HIV 약제에 내성을 유도한다고 알려진 여러 가지 점 돌연변이를 가진 HIV-1 게놈을 이용하여 임상적으로 적용 가능한 항-HIV 약제에 대한 내성을 시험하기 위하여 사용된다. 억제 백분율은 루시퍼라제 양성세포가 검출되지 않은 것을 100%로 정하고, 감염되고 처리하지 않은 대조군에서 양성 세포의 수를 0%로 정한다.
[00310] 항-HIV-1 활성에 있어서 PS-ODN의 사이즈 의존성과 염기서열 독립성을 시험하기 위하여 사이즈가 다양한 PS-ODN 랜더머로 시험을 하였다. 이들 PS-ODN을 HIV-1 CPE 분석으로 시험을 하면 PS-ODN의 사이즈가 증가할수록 억제력 또한 증가함을 알 수 있었다(IC50 감소, 도 19a, b 및 20 참조). 또한, PS-ODN 랜더머는 이 분석에서 숙주세포에 상당한 독성을 보이지 않음을 알 수 있었다(도 19c, d 참조).
[00311] 우리가 알고 있는 지식으로, PS-ODN에 대해 0.011 mM만큼 낮은 농도의 HIV-1에 대한 IC50을 보고한 것은 이것이 처음이다.
[00312] PS-ODN의 항-HIV-1 활성에 있어서 효과적인 사이즈의 범위를 더욱 명확히 하기 위하여, 야생형 HIV-1(재조합 NL 4-3, CNDO)을 이용하여 RA로 10머에서 80머까지의 넓은 범위의 사이즈를 가진 PS-ODN로 시험을 하였다. 또한, 현재 임상에서 사용되고 있는 프로제아제 억제제(aprenavir, indinavir, lopinavir and saquinavir)도 시험하였다. 10머 및 더 큰 PS-ODN가 항-HIV 활성을 가지고 있고 또한 HIV-1에 대한 효능은 PS-ODN 랜더머의 길이가 증가할수록 증가하였지만, 40머에서 포화상태가 됨을 확인하였다(도 21 e-h 및 도 22b). 더욱이, 40 및 80머 PS-ODN 랜더머는 4가지 임상 대조군과 효능에 있어서 거의 동일하였다(도 21a-d 및 22a).
[00313] 우리가 알고 있는 지식으로, PS-ODN에 대해 0.014 mM만큼 낮은 농도의 HIV-1에 대한 IC50을 보고한 것은 이것이 처음이다.
[00314] PS-ODN 랜더머가 HIV 균주의 약제 내성을 억제할 수 있는 능력이 있는지 알아보기 위하여, HIV-1의 재조합 MDRC4 균주를 이용하여 상기 시험을 반복하였다. 상기 재조합 균주는 모든 종류(뉴클레오티드 RT 억제제, 비뉴클레오티드 RT 억제제 및 프로테아제 억제제)의 적어도 16가지의 임상적으로 사용되는 약제에 상당한 내성을 보였다. 모든 PS-ODN 랜더머는 야생형 균주에 대한 시험과 같이 내성 균주에 대한 시험에서도 수행하였다(도 23e-h 참조). 그러나, 4가지 프로테아제 억제제 중 3개는 돌여변이 균주에 대해 그들의 효능이 감소함을 보였고(도 23a-d 및 24), 40 및 80머의 PS-ODN 랜더머는 이들 약제보다 내성 균주에 대해 더욱 강력한 활성을 가짐을 확인하였다.
실시예 5: RSV의 억제
[00315] PS-ODN 랜더머의 RSV를 억제하는 능력은 알라마 블루(세포 내 신진대사의 간접 측정, alamar blue)로 CPE를 측정하였다. 인간 후두 종양(Hep2) 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 10% 우태아 혈청이 첨가된 MEM 배지에서 배양하였다. 세포가 5-6일 동안 증식 후 포화된 단일층을 이를 수 있는 밀도로 96웰 플레이트에 접종하였다. 접종한 다음 날 세포에 2 시간 동안 감량된 부피에서 시험 합성물과 함께 RSV(A2 균주, 108.2TCID50/ml)를 감염하였다. 접종 후, 배지를 바꾸고 시험 화합물을 첨가하였다. 감염 후 6일째, 알라마 블루를 형광물질로 전환하여 CPE를 측정하였다. Hep2 세포에서 시험 합성물의 독성은 감염되지 않은 세포에 7일 동안 처리하고 이들 세포에서 알라마 블루 변환을 측정함으로써 관찰하였다. 감염되지 않고 처리하지 않은 세포에서 알라마 블루의 수치를 100%로 정하였고, 감염되고 처리하지 않은 세포에서의 수치를 0%로 정하였다.
[00316] 항-RSV 활성에 있어서 PS-ODN의 사이즈 의존성 및 염기서열 독립성을 확인하기 위하여, 사이즈가 다른 PS-ODN 랜더머로 시험을 하였다. 추가적으로, 임상적으로 사용되는 RSV 감염 치료제, 리바비린(Ribavirin, VirazoleTM)도 시험하였다. RSV CPE 분석으로 시험을 하여, PS-ODN 랜더머의 사이즈가 증가할수록 억제능 또한 증가하지만 사이즈가 40머일 때 포화상태가 된다(도 25a-c 및 도 26 참조). 또한, 20, 40 및 80머의 PS-PDN는 임상적으로 적용되는 항-RSV 약제인 리바비린보다 상당히 낮은 ID50 수치를 보임을 확인하였다(도 25a-d 및 26 참조). PS-ODN 랜더머는 Hep2 세포에서 독성을 보이지 않았지만, 리바비린은 상당한 독성을 보였다(치료상의 지표=2.08, 도 25e-h 참조).
[00317] 우리가 알고 있는 지식으로, PS-ODN에 대해 0.015 mM만큼 낮은 농도의 RSV-1에 대한 IC50을 보고한 것은 이것이 처음이다.
실시예 6: 콕사키(Coxackie) 바이러스 B2의 억제
[00318] PS-ODN 랜더머의 COX B2를 억제하는 능력을 알라마 블루(세포 내 신진대사의 간접 측정, alamar blue)를 이용하여 CPE로 측정하였다. 붉은털 원숭이 신장(Rhesus monkey kidney, LLC-MK2) 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 10% 우태아 혈청이 첨가된 MEM 배지에서 배양하였다. 세포가 5-6일 동안 증식 후 포화된 단일층을 이를 수 있는 밀도로 96웰 플레이트에 접종하였다. 접종한 다음 날 세포에 2 시간 동안 감량된 부피에 시험 합성물과 함께 COX2(Ohio-1 균주, 107.8TCID50/ml)를 감염하였다. 접종 후, 배지를 바꾸고 시험 화합물을 첨가하였다. 감염 후 6일째, 알라마 블루를 형광물질로 전환하여 CPE를 측정하였다. LLC-MK2 세포에서 시험 합성물의 독성은 감염되지 않은 세포에 7일 동안 처리하고 이들 세포에서 알라마 블루 변환을 측정함으로써 관찰하였다. 감염되지 않고 처리하지 않은 세포에서 알라마 블루의 수치를 100%로 정하였고, 감염되고 처리하지 않은 세포에서의 수치를 0%로 정하였다.
[00319] COX B2 CPE 분석에서 REP 2006의 항-COX-2 활성을 시험하였다. PS-ODN 랜더머는 LLC-MK2 세포에서 약간의 독성을 보였지만(도 27b), COX B2 감염으로부터 감염된 LLC-MK2세포를 부분적으로 구할 수 있었다(도 27a 참조).
실시예 7: 백시니아(vaccinia) 바이러스의 억제
[00320] 스몰폭스(smallpox) 바이러스를 포함한 폭스바이러스 (poxvirus)에 대한 본 발명의 합성물의 효능을 측정하기 위하여 백시니아 감염 모델을 이용하였다. PS-ODN 랜더머의 백시니아 바이러스를 억제하는 능력은 알라마 블루(세포 내 신진대사의 간접 측정, alamar blue)로 CPE를 측정하였다. Vero 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 5% 우태아 혈청이 첨가된 MEM 배지에서 배양하였다. 세포가 5-6일 동안 증식 후 포화된 단일층을 이를 수 있는 밀도로 96웰 플레이트에 접종하였다. 접종한 다음 날 세포에 2 시간 동안 감량된 부피에 시험 합성물과 함께 백시니아 바이러스(Ohio-1 균주, 107.9TCID50/ml)를 감염하였다. 접종 후, 배지를 교체하고 시험 화합물을 첨가하였다(시도포비르(Cidofovir)의 경우 50 mM로 처리하고 나머지는 모두 10 mM로 처리). 감염 후 5일째, 상층액을 수거하였다. 바이러스가 포함된 상층액을 1:100으로 희석하여 VERO 세포에 재감염 후 알라마 블루를 형광물질로 전환하여 측정하였다.
[00321] 사이즈가 다른 PS-ODN 랜더머(REP 2004, 2006 및 2007) 로 시험 하였다. 추가적으로 효과적인 백시니아 바이러스 감염 치료제로 잘 알려진 시도포비어(Cidofovir, VistideTM) 또한 측정하였다. 백시니아 CPE 분석에서 REP 2004, 2006 및 2007로 처리 시 모두 항바이러스 활성을 보였지만(즉, 재감염시 감소된 CPE를 보이는 상층액의 결과), 이러한 활성은 시도포비어에서 보인 결과보다 약했다(도 36 참조).
실시예 8: DHBV, 파라인프루엔자(parainfluenza)-3 바이러스 및 한타(Hanta) 바이러스의 억제
[00322] DHBV, 파라인플루엔자-3 바이러스 및 한타 바이러스는 쉽게 측정할 수 있는 플라크나 CPE를 보이지 않으므로, FFFU(fluorescence focus forming unit) 검출법을 이용하여 이들 바이러스에서 REP 2006의 효능을 검사하였다. 이 분석에서 REP 2006(최종 농도 10 mM)를 바이러스와 함께 혼합하고 그런 다음, 세포로 흡착하였다. 흡착 후, 감염된 세포를 7-14일 동안 배양하고 메탄올로 고정하였다. 바이러스 복제 부위를 적절한 바이러스의 항원에 대하여 면역형광 현미경으로 측정하였다. 시험한 세가지 바이러스 각각에 대하여, 특정 시험 조건 및 결과는 하기에 서술하였다:
바이러스 숙주세포 FFFU 검출에 사용된 항체 FFFU 개수 (약제 처리 무) FFFU 개수(10 mM REP 2006)
DHBV (HBV 대리) 일차 오리간세포 마우스 항-DHBVIgG 163+/-38.5 0
파라인플루엔자-3 LLC-MK2 마우스 항-P13 IgG 288+/-126 0
한타바이러스(Prospect Hill) 균주) VERO E6 마우스 항SinNombre핵단백질 IgG 232.3+/-38.17 0
[00323] 상기 결과는 DHBV, 파라인플루엔자-2 및 한타바이러스를 억제하는데 있어서 10 mM의 REP 2006가 효과적임을 보여준다. 주어진 예비 시험의 반응으로 IC50 수치는 더 낮을 것이라고 예상한다. 상기 결과는 치료를 시작하기 위한 다른 진단을 필요로 하지 않고 RSV 및 파라인플루엔자로 유발된 소아기의 세기관지염의 즉각적인 치료를 위한 근거를 제공할 뿐만 아니라, 한타 바이러스 및 B형 간염 바이러스(DHBV와 밀접한 관련이 있는)의 인간 감염의 치료를 위한 PS-ODN의 효능을 제시한다.
실시예 9: 현재 반응하지 않은 바이러스
[00324] 하기의 바이러스 시스템에서 전달 시스템, 약제 조합 또는 화학적 변형을 하지 않고 PS-ODN 랜더머(10 mM까지)로 지금까지 탐지할 만한 항-바이러스 효능을 관찰할 수 없었다:
바이러스 균주 숙주세포 분석 방법
인플루엔자 A H3N2 MDCK 플라크 감소
코로나 바이러스 (SARS 대리) MHV2 (마우스)MHV-A59(마우스)HCoV-OC43(인간) NCTC-1496DBTHRT-18 플라크 감소
BVDV (HCV 대리) NA BT 알라마 블루에 의한 CPE
라이노바이러스 HGP HeLa 알라마 블루에 의한 CPE
아데노바이러스 인간 Ad5 293A 플라크 감소
[00325] 본 시험 과정에서, 항바이러스 활성은 입증하지 못하였지만, 이 분석 조건에서 PS-ODN의 세포내 침투력이 낮아서 일 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 바이러스에서 효과적인 결과를 얻기 위하여 추가적인 시험은 진행 중이다. 이들 바이러스는 리포솜 방법과 같은 전달 시스템을 사용하여 PS-ODN의 세포내 농도를 증가시킨다면 PS-ODN에 반응할 수도 있을 것이다. 또한, 본 발명에서 서술한 것처럼, 다른 항바이러스 약제와 병합한다면, PS-ODN은 이들 바이러스에 대하여 항바이러스 효능을 보일 수도 있을 것이다. 세포내 농도를 증가 시기키 위한 화학적 변형 또한 이들 바이러스에 대해 PS-ODN이 활성화할 수 있도록 하는데 유용할 것이다.
[00326] PS-ODN의 전하가 몇 가지 다른 과의 바이러스를 억제하는 데 있어서 중요하다는 증거가 있기 때문에, 바이러스 활성을 억제하는 전하 의존적 기작이 모든 외막단백질이 있는 바이러스의 활성을 억제하는 능력을 가지게 할 것으로 기대한다. 상기 추론의 결과는 실시예 9에서 작성한 이들 바이러스에 대한 항-바이러스 효능의 결핍은 이들 바이러스의 구조 단백질과 PS-ODN의 상호작용은 이들 바이러스의 복제동안 바이러스 단백질의 상호작용을 막을 만큼 강력하지 못했음을 제시한다. 이들 바이러스에 대한 효능을 가지게 하는 방법 중 하나는 DNA 또는 항 바이러스 폴리머(즉, DNA에서 포스포로티오에이트 결합을 포스포로디티오에이트로 치환하여 바이러스 단백질에 대한 친화력을 증가시킨다)의 전하를 바꾸는 것이다.
실시예 10: 올리고누클레오티드가 비-염기서열 상보적인 작용방식으로 주로 작용하는지를 결정하기 위한 시험
[00327] 하기의 3가지 시험 중 임의의 특징을 만족한다면 OD 즉, ODN은 비-염기서열 상보적인 작용방식에 의하여 작용하는 것으로 생각할 수 있을 것이다.
시험 #1-항바이러스 효능의 부분적인 디제너러시(degeneracy)의 효과
[00328] 이 시험은 염기서열의 부분을 디제너레이트(degenerate)로 만들었을 때, 특정 ON 염기서열의 항바이러스 활성의 측정하는 것이다. 만약 같은 화학성을 가지고 있는 ON의 디제너레이트(degenerate version)가 하기에서 서술한대로 활성을 가지고 있다면, 주로 비-염기서열 상보적인 작용방식에 의해 작용하는 것으로 생각할 수 있다. ON은 하기와 같은 법칙에 따라 디제너레이트를 만들 수 있을 것이다:
LON = 본래 ON의 염기의 수
X = 디제너레이트를 만들기 위하여 올리고의 각 말단에 있는 염기의 수(그러 나 본래의 ON과 같은 화학성을 가지고 있음)
만약 LON이 짝수이면, X=LON/4
만약 LON이 홀수이면, X=정수(LON/4)+1
[00329] 각각의 디제너레이트 염기는 적절한 방법, 즉, PS-ODN 랜더머의 합성을 위하여 본 발명에서 기술한 방법에 따라 합성이 될 것이다.
[00330] 만약, 허피스바이러스과, 레트로바이러스과, 파라믹소바이러스과의 바이러스에 대해 항-바이러스 활성을 가지고 있다고 생각되면, 제시된 바이러스 균주로 그 바이러스과에 대하여 본 발명에서 기술한 분석을 이용하여 IC50 수치를 측정해야 할 것이다. 만약 ON이 상기에서 언급하지 않은 특정 바이러스과의 균주에 대하여 항-바이러스 활성을 가지고 있다고 여겨지면, 제약 산업분야에서 적용되는 항바이러스 활성의 시험에 의하여 IC50 수치를 측정해야 할 것이다. 농도 반응 그래프의 직선범위에 있는 3개 또는 그 이상의 농도로 최소 7가지 농도를 이용하여 IC50 수치를 측정해야 할 것이다. 이러한 시험을 이용하여, ON의 IC50 수치를 그것의 상응하는 디제너레이트와 비교해야 할 것이다. 만약, 디제너레이트 ON의 IC50 수치가 ON의 25머 및 그 이하에 대한 본래 ON의 것보다 2배 이상 적다면, 또는 ON의 26머 및 그 이상에 대한 본래 ON의 것보다 10배 이상 적다면(적어도 3번 반복 측정하고 표준 편차가 평균의 15%를 초과하지 않아야 함), ON은 주로 비-염기서열 상보적인 작용방식에 의하여 작용하는 것으로 여길 수 있을 것이다.
시험 #2- 랜더머와 효능 비교
[00331] 본 시험은 같은 바이러스나 바이러스과에 대하여 동일 사이즈 및 동일 화학성을 가진 랜더머 ON의 항바이러스 효능을 ON의 항-바이러스 효능과 비교하는 시험이다.
[00332] 만약, 허피스바이러스과, 레트로바이러스과, 파라믹소바이러스과의 바이러스에 대해 항-바이러스 활성을 가지고 있다고 생각되면, 제시된 바이러스 균주로 그 바이러스과에 대하여 본 발명에서 기술한 분석을 이용하여 IC50 수치를 측정해야 할 것이다. 만약 ON이 상기에서 언급하지 않은 특정 바이러스과의 균주에 대하여 항-바이러스 활성을 가지고 있다고 여겨지면, 제약 산업분야에서 적용되는 항바이러스 활성의 시험에 의하여 IC50 수치를 측정해야 할 것이다. 농도 반응 그래프의 직선범위에 있는 3개 또는 그 이상의 농도로 최소 7가지 농도를 이용하여 IC50 수치를 측정해야 할 것이다. 이러한 시험을 이용하여, ON의 IC50 수치를 그것의 상응하는 디제너레이트와 비교해야 할 것이다. 만약, 디제너레이트 ON의 IC50 수치가 ON의 25머 및 그 이하에 대한 본래 ON의 것보다 2배 이상 적다면, 또는 ON의 26머 및 그 이상에 대한 본래 ON의 것보다 10배 이상 적다면(적어도 3번 반복 측정하고 표준 편차가 평균의 15%를 초과하지 않아야 함), ON은 주로 비-염기서열 상보적인 작용방식에 의하여 작용하는 것으로 여길 수 있을 것이다.
시험 #3- 다른 바이러스과에서 효능 비교
[00333] 이 시험은 ON과 상동성이 없는 게놈을 가진 바이러스에 대한 ON의 효능과 ON과 상동성을 가지는 표적 바이러스에 대한 ON의 효능을 비교하기 위한 시험이다. 많은 경우에 다른 바이러스는 표적 바이러스의 바이러스과보다는 다른 바이러스과로부터 선택되어 질 것이다. 타겟 바이러스와 다른 바이러스에서 ON의 상대적인 비교는 두 바이러스에서 획득된 ON의 IC50 수치를 정규화하기 위하여 동일 길이와 화학성을 가진 랜더머의 활성을 이용하여 이루어진다.
[00334] 따라서, 만약 ON이 임의의 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 가지고 있다면 허피스바이러스과, 레트로바이러스과, 파라믹소바이러스과의 바이러스에 대하여 본 발명에서 서술한 분석 또는 논문에서 보고된 다른 분석 중 하나를 이용하여 이 바이러스에서 IC50 수치를 측정해야 할 것이다. ON의 염기서열과 상동성이 없는 게놈을 가진 바이러스에 대해 본 발명에서 서술한 분석을 이용하여 다른 바이러스 대한 ON의 IC50 수치를 측정해야 할 것이다. 또한 각각의 바이러스에 대해 동일 사이즈와 화학성을 가진 랜더머에 대해 IC50 수치를 측정해야 할 것이다. 두 가지 다른 바이러스에 대한 랜더머의 IC50 효능은 하기와 같이 특이적인 ON에 대한 IC50 수치를 정규화하기 위하여 사용되었다:
1. 상동성 바이러스에서 ON 및 랜더머의 IC50에 대수학적 전환을 적용하여 랜더머의 IC50 수치는 현재 1이다.
2. 비상동성 바이러스에서 ON 및 랜더머의 IC50에 대수학적 전환을 적용하여 랜더머의 IC50 수치는 현재 1이다.
3. 상동성 바이러스 대 비상동성 바이러스에 대한 IC50 수치의 배수 차이는 상동성 바이러스에서 ON의 전환된 IC50 수치로 비상동성 바이러스에서 ON의 IC50 수치를 나눔으로써 계산되어진다.
[00335] 길이가 25머 미만인 ON에 대하여 만약 배수 차이가 2이하이면 ON은 비-염기서열 상보적인 작용방식에 의하여 작용한다고 할 수 있을 것이다. 길이가 25머 또는 그 이상인 ON에 대하여 만약 배수 차이가 10 미만이면 ON은 비-염기서열 상보적인 작용방식에 의하여 작용한다고 할 수 있을 것이다.
시험 #3- 다른 바이러스과에서의 효능
[00336] 이 시험은 바이러스 게놈의 임의의 부분에도 상동성이 없는 ON이 그 바이러스에서 약제와 같은 활성을 가지고 있는지 결정하기 위한 것이다. 따라서, 바이러스 게놈의 임의의 부분에도 상동성이 없는 ON을 이용하여 허피스바이러스과, 레트로바이러스과, 파라믹소바이러스과의 바이러스에 대하여 본 발명에서 서술한 분석으로 시험하였다. 농도 반응 그래프의 직선범위에 있는 3개 또는 그 이상의 농도로 최소 7가지 농도를 이용하여 IC50 수치를 측정해야 할 것이다. 만약 나타난 농도 반응 그래프가 활성을 가진 약제와 같은 결과를 보이고(ON 농도의 감소로 감소된 항-바이러스 효능을 가지는 전형적으로 감소하거나 S자 모양 곡선으로 보여진다) 그래프로부터 유추된 IC50 수치가 1 mM 이하이면, ON은 약제와 같은 활성을 가진 것으로 생각할 수 있다. 만약, ON이 상보적이지 않은 바이러스에서 약제와 같은 활성을 가지고 있고 상보적인 염기서열에 의존적이지 않은 활성을 가지고 있다면, 비-염기서열 상보적인 작용방식에 의하여 작용하는 것으로 여겨진다.
상기 시험에서 사용된 역치(Thresholds)
[00337] 25머 보다 긴 안티센스 ON을 제작하기 위하여 학문적 또는 산업적 분야에서 과학적 또는 경험적 근거는 없다. 또한, 우리가 알고 있는 지식으로, 임상 시험에서 25머 보다 긴 뉴클레오티드로 주입된 ON 제형은 없었다.
[00338] 주어진 사실에서, 주로 비-염기서열 상보적인 작용방식으로 작용을 한다고 규정하기 위하여 사용하여 두 가지 다른 역치를 정하였다. 25머 및 그보다 작은 올리고머에 대하여, ON은 안티센스 기작에 의하여 주로 작용하는 것으로 여겨지기 위하여 같은 화학성을 가진 랜더머 또는 디제너레이트 ON보다 적어도 2배 이상의 항바이러스 활성을 가지고 있어야만 한다. 만약 안티센스 ON이 랜더머 또는 디제너레이트 ON보다 적어도 2배가 안된다면, 활성의 반 이상이 비-안티센스 작용방식이 기여한 것으로 결정할 수 있다.
[00339] 26머 및 그보다 큰 올리고머에 대하여, ON은 안티센스 기작에 의하여 주로 작용하는 것으로 여겨지기 위하여 같은 화학성을 가진 랜더머 또는 디제너레이트 ON보다 적어도 10배(1 로그) 이상의 항바이러스 활성을 가지고 있어야만 한다. 최근 안티센스에 대한 ON 제작의 논문에서 보면, 26머 및 그 보다 더 크고 항 바이러스 활성을 가지고 있다고 여겨지는 올리고머는 본 발명에서 언급된 지식으로 제작되는 것으로 추정되기 때문에 이렇게 큰 역치를 가진다(적정 안티센스 ON의 길이는 일반적으로 16에서 21머로 적용된다).
[00340] 상기 1에서 3까지의 시험에서 기술된 역치는 디폴트 역치이다. 만약 특정적으로 지정된다면, 다른 역치가 상기 비교 시험 1- 3에서 이용될 수 있을 것이다. 예를 들어, 25머 미만 및/또는 25머, 또는 그 이상의 ON에 대하여, ON이 비-염기서열 상보적인 작용방식에 의하여 주로 작용하는지를 결정하는 역치가 특정적으로 지정된다면, 역치는 10배, 8배, 6배, 5배, 4배, 3배, 2배, 1.5배 또는 1배 중 임의의 것이라도 될 수 있다. 상기 시험 4에 기술된 역치 또한 디폴트 역치이다. 만약, 시험 4에서 ON이 비-염기서열 상보적인 작용방식에 의하여 주로 작용하는지를 결정하는 역치가 특정적으로 지정된다면, 역치는 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.5 mM, 0.4 mM, 0.3 mM, 0.2 mM 또는 0.1 mM 미만의 IC50 수치가 될 수 있다. 유사하게, 디폴트가 상기 시험 4 중 어느 한가지를 충분히 만족시킨다 할지라도, 만약 특정적으로 지정된다면, ON은 4가지 시험 중 그 임의의 둘(즉, 시험 1 & 2, 1 & 3, 1 & 4, 2 & 3, 2 & 4 및 3 & 4) 또는 그 임의의 셋(즉, 시험 1 & 2 & 3, 1 & 3 & 4 및 2 & 3 & 4) 또는 4가지 모두 디폴트 역치에서 만족시키는 것이 필요하고, 또한 만약 특정적으로 지정된다면 상기에서 서술한대로 다른 역치에서 만족시키는 것이 필요하다.
허피스바이러스에 대한 항바이러스 분석
[00341] 하기와 같이 플라크 감소 분석을 수행하였다.
[00342] HSV-1 또는 HSV-2에 대해서는, VERO 세포(ATCC#CCL-81)를 37℃, 5% CO2 조건에서 젠타마이신(gentamycin), 반코마이신(vancomycin) 및 암포테레신 B(amphoterecin B) 보충물 및 10% 열로 불활성화된 우태아 혈청이 첨가된 MEM(minimal essential medium) 배지가 있는 12웰 조직 배양 플레이트에 포화상태로 키운다. 포화상태에 이르렀을 때, HSV-1(KOS2 균주, 전체 40-60 PFU) 또는 HSV-2(MS2 균주, 전체 40-60 PFU)와 함께 상기에서 서술한 항생제와 5% 혈청이 포함된 배지로 바꾸었다. 90분 동안 바이러스 흡착시키고, 세포를 세척하고 5% 우태아 혈청, 1% 인간 이뮤노글로블린을 포함하는 새로운 덮게(overlay) 배지로 교체하였다. 흡착 후, 3에서 4일째, 세포를 포르말린으로 고정시키고, 크리스탈 바이올렛 염색을 하여 플라크를 개수를 계산하였다.
[00342] CMV에 대해서는, HSV-1/2 분석에서 VERO 세포에 대해 기술된 것처럼, 인간 섬유아세포를 배양하였다. 배지 조성 및 흡착 / 덮게 과정은 하기의 예외를 제외하고는 동일하다.
1. 흡착동안 세포를 감염시키기 위하여 사용된 것은 CMV (AD169 균주, 전체 40-60 PFU)이다.
2. 덮게 배지에서 1% 인간 이뮤노글로블린을 4% 씨(sea)-플라크 아가로즈로 교체하였다.
[00344] 다른 허피스바이러스과에 대해서는, 흡착동안 적당한 숙주 세포 및 40-60 PFU로 상기에서 서술된 플라크 분석으로 시험하였다.
[00345] 상기 시험은 시험의 마지막 시점에 화합물이 없을 때에 확실한 플라크가 존재할 때만 유효하다.
[00346] IC50 수치는 처리하지 않은 대조군과 비교해서 플라크가 50%가 존재하는 농도이다.
[00347] 처리하는 화합물은 흡착과정 및 덮게에 존재한다.
레트로바이러스과에 대한 항바이러스 분석
[00348] HIV-1로 감염된 세포의 상층액에서 전체 p24 단백질을 하기와 같이 수행하였다:
[00349] 인간 PBMC에 화합물과 함께 일차 분리 HIV-1를 감염시켰다. 그런 다음, 화합물이 첨가된 신선한 배지에서 7일 동안 세포를 배양한 후, 상업적으로 판매되는 p24 ELISA 키트(BIOMERIEUX 또는 그에 상당하는 것)를 이용하여 상층액에서의 p24 레벨을 측정하였다.
[00350] 상기 시험은 감염되고 처리하지 않은 세포의 조직 배양 상층액에서 p24 단백질의 축적이 있을 때만 유효하다.
[00351] IC50 수치는 처리하지 않은 대조군에 존재하는 p24 단백질의 50%가 검출되는 농도이다.
[00352] 처리하는 화합물은 흡착과정 및 흡착 후 배지에 존재한다.
파라믹소바이러스과에 대한 항바이러스 분석
[00353] RSV에 대해서는, 하기와 같이 CPE 측정을 수행하였다.
[00354] Hep2 세포를 96 웰 플래이트에 접종하고 하룻 밤 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 5% 우태아 혈청이 첨가된 MEM 배지에서 배양하였다. 다음날, 세포에 RSV(A2 균주, 108.2 TCID50/ml, 100 ml/웰)를 2시간동안 흡착시킴으로써 감염시켰다. 흡착 후, 배지를 교체하고 7일 동안 배양 후 살아있는 세포에 의해 알라마 블루 염료를 형광물질로 전환시켜 CPE를 측정하였다.
[00355] 이 시험은 화합물이 첨가되지 않고 감염된 세포에서의 CPE 측정값이 감염되지 않은 세포에서 측정 전환값의 10%일 때만 유효하다.
[00356] IC50 수치를 비교하기 위하여, 100% CPE는 감염된 세포에서 보이는 전환 수준으로 정하고, 0% CPE는 감염되지 않은 세포에서 보이는 전환 수준으로 정하였다. 따라서 IC50 수치는 50% CPE를 보이는 화합물의 농도이다.
[00358] 명세서에 언급된 모든 특허와 다른 참고문헌은 본 발명에 속하는 분야의 숙련자의 기술 수준으로 나타내고, 각각의 참고문헌이 각각의 전체의 참고문헌에 의해 통합되는 정도와 같이 테이블 및 도면의 포함한 전체에서 참고문헌에 의해 통합된다.
[00359] 이 분야의 숙련자는 본 발명에 있는 것뿐만 아니라 언급된 목적과 장점을 얻기 위하여 잘 적용되었음을 쉽게 식별할 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 제시한대로 방법, 변이, 조성이 바람직하고 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다. 당 분야의 숙련자는 본 발명의 변화 및 다른 이용을 할 수 있고, 이것도 본 발명의 정신에 포함되고 청구항의 범주에 한정된다.
[00360] 본 발명의 범주 및 정신에서 벗어남이 없이 당 분야의 숙련자는 다양한 치환과 변형을 만들 수 있음은 명백하다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 합성 조건 및 조성에 변화를 줄 수 있다. 따라서, 이러한 추가적인 구현예는 본 발명 및 하기의 청구항의 범주에 있다.
[00361] 설명에 도움이 되게 서술된 본 발명은 본 발명에서 명확하게 언급하지 않은 임의의 구성요소, 구성요소들, 제한점, 제한점들이 없어도 실행되어 질 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 각각의 예에서 "포함하는", "필수적으로 구성하는" 및 "구성하는"의 용어는 다른 두 용어 중의 하나와 대체되어질 수 있다. 사용된 용어와 표현은 서술의 용어로 사용된 것이지 한정의 용어로 사용된 것이 아니고, 본 발명에서 보여지고 서술되어진 특징에 상응하는 임의의 것을 배제하려는 용어 및 표현에 사용하려는 의도는 없지만, 다양한 변형은 청구된 발명의 범위 안에서 가능하다는 것을 인정한다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시예 및 선택적 특성을 나타냈지만, 본 발명의 개념의 변형 및 변이는 당 분야의 숙련자에게 도움을 줄 것이며, 이러한 변형 및 변이는 첨부된 청구항에 의해 한정되는 것처럼, 본 발명의 범주로 여겨진다.
[00362] 추가적으로, 본 발명의 특징 또는 관점은 마르쿠시(Markush) 그룹 또는 다른 그룹의 용어에서 서술되어서, 당 분야의 숙련자는 본 발명은 마르쿠시 그룹 또는 다른 그룹의 개개인이나 구성원의 서브그룹의 용어에서 서술되고 있음을 인지할 수 있을 것이다.
[00363] 또한, 실시예에서 제공되는 다양한 수치에 반대되지 않는다면, 추가적인 실시예는 종료점의 범위로써 2가지 다른 수치를 취함으로써 서술되어진다. 이러한 범위 또한 본 발명의 범주 안에 있다.
[00364] 따라서, 추가적인 실시예는 본 발명 및 하기 청구항의 범위 안에 있다

Claims (137)

  1. 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성은 주로 비-서열 상보적인 작용방식에 의해 발생하는 하나 이상의 항바이러스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스 올리고뉴클레오티드 제형.
  2. 제 1항에 있어서, 항바이러스 올리고뉴클레오티드 제형은 두 개 이상의 상이한 항바이러스 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 항바이러스 올리고뉴클레오티드 제형.
  3. 하나 이상의 항바이러스 랜더머 올리고뉴클레오티드를 포함하며 상기 랜더머(randomer)의 항바이러스 활성은 주로 비-서열 상보적인 작용방식에 의해 일어나는 항바이러스 랜더머 올리고뉴클레오티드 제형.
  4. 제 3항에 있어서, 항바이러스성 올리고뉴클레오티드 랜더머 제형은 상이한 길이의 두 가지 이상의 항바이러스 랜더머의 혼합물을 포함하는 항바이러스 올리고뉴클레오티드 랜더머 제형.
  5. 올리고뉴클레오티드는 길이가 29 뉴클레오티드 이상이고 상기 올리고뉴클레오티드 서열은 표적 바이러스의 게놈 서열의 어느 부분과도 상보적이지 않은 하나 이상의 항바이러스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 제형.
  6. 올리고뉴클레오티드는 길이가 6 뉴클레오티드 이상이고 상기 올리고뉴클레오티드의 서열은 표적 바이러스의 게놈 서열의 어느 부분과도 상보적이지 않고 기본적으로 polyA, polyC, polyG, polyT, G 쿼텟(quartet), 또는 G-풍부 서열을 포함하지 않는 하나 이상의 항바이러스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 제형.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 제형은 표적 바이러스에 대해 0.10 μM 이하의 IC50 을 갖는 올리고뉴클레오티드 제형.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 제형은 표적 바이러스에 대해 0.05 μM이하의 IC50 을 갖는 올리고뉴클레오티드 제형.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 제형은 표적 바이러스에 대해 0.025 μM 이하의 IC50 을 갖는 올리고뉴클레오티드 제형.
  10. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 제형은 표적 바이러스에 대해 0.015 μM 이하의 IC50 을 갖는 올리고뉴클레오티드 제형.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 DNA 바이러스인 올리고뉴클레오티드 제형.
  12. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 RNA 바이러스인 올리고뉴클레오티드 제형.
  13. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 헤르페스 바이러스과(herpesviridae)의 일원인 리고뉴클레오티드 제형.
  14. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 HSV-1인 올리고뉴클레오티드 제형.
  15. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 HSV-2인 올리고뉴클레오티드 제형.
  16. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 CMV인 올리고뉴클레오티드 제형.
  17. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 헤파드나바이러스과(hepadnaviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  18. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 HBV인 올리고뉴클레오티드 제형.
  19. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 파르보바이러스과(parvoviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  20. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 폭스바이러스과(poxviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  21. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 파필로마바이러스과(papillomaviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  22. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 아데노바이러스과(adenoviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  23. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 레트로바이러스과(retrovindae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  24. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 HIV-1 인 올리고뉴클레오티드 제형.
  25. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 HIV-2인 올리고뉴클레오티드 제형.
  26. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  27. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 RSV인 올리고뉴클레오티드 제형.
  28. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 파라인플루엔자 바이러스(Parainfluenza virus)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  29. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 부리야바이러스과(buriyaviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  30. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 한타바이러스(hantavirus)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  31. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 피코나바이러스과(piconaviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  32. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 콕사키바이러스(coxsackievirus)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  33. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 리노바이러스(rhinovirus)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  34. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 플라비바이러스과(flaviviridae) 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  35. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 황열바이러스(yellow fever virus)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  36. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 뎅기 바이러스(dengue virus)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  37. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  38. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 C 형 간염 바이러스(hepatitis C virus)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  39. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 필로바이러스과(filoviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  40. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 에볼라 바이러스(Ebola virus)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  41. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 마버그 바이러스(Marburg virus)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  42. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 오소믹소바이러스과(orthomyxoviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  43. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 인플루엔자 바이러스(influenza virus)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  44. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 토가 바이러스과(togaviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  45. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 코로나바이러스과(coronaviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  46. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 레오바이러스과(reoviridae) 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  47. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 랍도바이러스과(rhabdoviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  48. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 아레나바이러스과(arenaviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  49. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 표적이 칼시바이러스과(calciviridae)의 일원인 올리고뉴클레오티드 제형.
  50. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 6항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 6 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  51. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 6항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  52. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 6항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 20 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  53. 제 1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 29 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형
  54. 제 1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 32 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  55. 제 1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 34 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  56. 제 1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 36 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  57. 제 1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 38 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  58. 제 1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 40 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  59. 제 1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 46 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  60. 제 1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 50 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  61. 제 1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 80 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  62. 제 1항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 120 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  63. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 하나의 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포디에스테르 결합(phosphodiester linkage)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  64. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 화학구조에 하나 이상의 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  65. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioated linkage)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  66. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합 및 전달 시스템(delivery system)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  67. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합 및 리포좀 전달 시스템을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  68. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 리보오스 모이어티(moiety)에 하나 이상의 2'-O 메틸 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  69. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 리보오스 모이어티에 하나 이상의 2'- 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드
    제형.
  70. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 메틸 포스포네이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  71. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로디티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  72. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로디티오에이트 결합 및 전달 시스템을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  73. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로디티오에이트 결합 및 리포좀 전달 시스템을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  74. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 링커에 의해 이어진 둘 이상의 올리고뉴클레오티드 서열로 구성된 콘케이터머(concatemer)인 올리고뉴클레오티드 제형.
  75. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 더 높은 안정성, 더 낮은 혈청 상호작용, 더 높은 세포 흡수(cellular uptake), 더 높은 바이러스 단백질 상호작용, 전달을 위해 제형화될 수 있는 향상된 능력, 검출가능한 신호, 더 높은 항바이러스 활성, 더 나은 약동학적 특성, 특이적 조직 분포, 더 낮은 독성으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 수득하기 위하여, 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기에서, 올리고뉴클레오티드의 특성을 변형시키는 분자에 연결된 또는 결합된(conjugated) 올리고뉴클레오티드 제형.
  76. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 이중가닥인 올리고뉴클레오티드 제형.
  77. 제 1항 내지 제 62항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 비-왓슨-크릭 상호작용을 통해 혼성화할 수 있는 하나 이상의 염기를 포함하고 이중 또는 단일가닥인 올리고뉴클레오티드 제형.
  78. 제 1 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 G 쿼텟 모티프 부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  79. 제 1 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 CpG 모티프 부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  80. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 바이러스 mRNA에 상보적인 부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  81. 제 1 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 바이러스 성분에 결합하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  82. 제 1 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 호스트 성분과 상호작용하며, 상기 상호작용은 바이러스 활성 또는 생산 억제를 초래하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  83. 제 1 항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분이 바이러스 게놈 유래인 올리고뉴클레오티드 제형.
  84. 제 1 항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분이 바이러스 게놈 유래이고, 주로 비서열 상보적 작용방식의 항바이러스 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 제형.
  85. 제 1 항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분이 바이러스 패키지 서열 또는 앱타머성 상호작용에 관여하는 다른 바이러스 서열 유래인 올리고뉴클레오티드 제형.
  86. 제 1항 내지 제 77항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분이 바이러스 성분 또는 호스트 성분 또는 이들 모두와 앱타머성 상호작용에 관여하는 올리고뉴클레오티드 제형
  87. 제 1항 내지 제 77항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분은 polyA, polyC, polyG, polyT, polyAC, polyAG, polyAT, polyCG, polyCT, 또는 polyGT를 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  88. 제 1항 내지 제 77항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분은 둘 이상의 반복된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  89. 제 1항 또는 제 5항 내지 제 88항 중 어느 한 항에 있어서, 두 가지 이상의 상이한 항바이러스 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  90. 제 89항에 있어서, 10가지 이상의 상이한 항바이러스 올리고뉴클레오티드의 혼합물을을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  91. 제 89항에 있어서, 100가지 이상의 상이한 항바이러스 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  92. 제 89항에 있어서, 1000가지 이상의 상이한 항바이러스 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  93. 제 89항에 있어서, 106 가지 이상의 상이한 항바이러스 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드 제형.
  94. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 6 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  95. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  96. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 20 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  97. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 29 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  98. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 32 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  99. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 34 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  100. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 36 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  101. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 38 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  102. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 40 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  103. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 50 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  104. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 80 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  105. 제 89항에 있어서, 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드는 길이가 120 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드 제형.
  106. 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성은 주로 비-서열 상보적인 작용방식으로 일어나는, 치료적으로 유용한 양의 하나 이상의 제 1항 내지 제 105항 중 어느 한 항에 따른 약리적으로 허용가능한 항바이러스 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항바이러스 약학적 조성물.
  107. 제 105항에 있어서, 바이러스 병인을 갖는 질병의 치료, 조절 또는 예방에 적합한 항바이러스 약학적 조성물.
  108. 제 105항에 있어서, 프리온(prion) 질병의 치료, 조절 또는 예방에 적합한 항바이러스 약학적 조성물.
  109. 제 105항에 있어서, 안내(intraocular), 경구 섭취(oral ingestion), 장내(enterally), 흡입(inhalation), 피부 주사(cutaneous injection), 피하주사(subcutaneous injection), 근육주사(intramuscular injection), 복강내주사(intraperitoneal injection), 경막내주사(intrathecal injection), 기관내 주사(intrachael injection) 및 정맥내주사(intravenous injection)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방식에 의한 전달에 적합한 항바이러스 약학적 조성물 .
  110. 제 105항에 있어서, 조성물은 전달 시스템을 추가로 포함하는 항바이러스 약학적 조성물 .
  111. 제 105항에 있어서, 조성물은 리포좀 제형을 추가로 포함하는 항바이러스 약학적 조성물.
  112. 제 110항 또는 제 111항에 있어서, 전달 시스템 또는 리포좀 제형은 특이적인 세포 또는 특이적 조직을 표적으로 하는 항바이러스 약학적 조성물.
  113. 제 105항에 있어서, 조성물은 하나 이상의 다른 항바이러스 약물을 조합으로 추가로 포함하는 항바이러스 약학적 조성물.
  114. 제 105항에 있어서, 조성물은 비-뉴클레오티드 항바이러스 폴리머를 조합으로 추가로 포함하는 항바이러스 약학적 조성물.
  115. 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성은 주로 비-서열 상보적인 작동방식으로 일어나고 패키지(pakage)의 표지는 항바이러스 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 바이러스에 대해 사용될 수 있음을 나타내는, 표지된 패키지 중의 하나 이상의 제 1항 내지 제 105항 중 어느 한 항에 따른 항바이러스 올리고뉴클레오티드 또는 항바이러스 올리고뉴클레오티드 제형을 포함하는 키트.
  116. 제 115항에 있어서, 키트는 두 가지 이상의 상이한 항바이러스 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 키트.
  117. 제 115항에 있어서, 키트는 인간에게 사용하기 위해 규제 기관에 의해 승인받은 키트.
  118. 제 115항에 있어서, 키트는 하나 이상의 인간이 아닌(non-human) 동물에게 사용하기 위해 규제 기관에 의해 승인받은 키트.
  119. 하기를 포함하는, 항바이러스 작용제용 항바이러스 올리고뉴클레오티드를 선별하는 방법:
    1) 다수의 상이한 무작위 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계;
    2) 상기 올리고뉴클레오티드가 감염성 비리온(virion)을 생산하는 바이러스의 능력을 억제하는 활성을 갖는지 테스트하는 단계:
    3) 항바이러스 물질로 사용하기 위해 약학적으로 허용가능한 활성 수준을 갖는 올리고뉴클레오티드를 선별하는 단계.
  120. 제 119항에 있어서, 상이한 무작위 올리고뉴클레오티드는 상이한 길이의 랜더머를 포함하는 방법.
  121. 제 119항에 있어서, 상이한 무작위 올리고뉴클레오티드는 상이한 길이의 올리고뉴클레오티드
    세트를 포함하고, 상기 세트에서 각각의 올리고뉴클레오티드는 상기 세트에서 가장 짧은 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함하는 방법.
  122. 제 119항에 있어서, 상이한 무작위 올리고뉴클레오티드는 길이가 6 뉴클레오티드 이상인 랜더머 단편을 포함하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 방법.
  123. 하기를 포함하는, 대상체의 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 방법:
    제 1항 내지 제 105항 중 어느 한 항에 따른 치료적으로 유효한 양의 하나 이상의 약리학적으로 허용가능한 올리고뉴클레오티드를 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계.
  124. 제 123항에 있어서, 대상체는 인간인 방법.
  125. 제 123항에 있어서, 대상체는 인간이 아닌 동물인 방법.
  126. 제 123항에 있어서, 대상체는 식물인 방법.
  127. 하기를 포함하는, 인간 또는 인간이 아닌 동물에서 암형성 바이러스(oncovirus)에 의해 야기되는 암의 예방적 치료방법:
    제 1 내지 105항 중 어느 한 항에 따른 치료적으로 유효한 양의 하나 이상의 약리학적으로 허용가능한 올리고뉴클레오티드를 그러한 치료를 필요로 하는 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 투여하는 단계.
  128. 제 127항에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 인간에게 투여하는 방법.
  129. 하기를 포함하는, 하나 이상의 바이러스 성분에의 올리고뉴클레오티드의 결합을 변경시키는(alter) 화합물을 스크리닝하는 방법:
    1) 별도의 반응에서, 스크리닝될 화합물의 존재 및 부재시에 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 바이러스 성분과 접촉시키는 단계; 및
    2) 상기 화합물의 부재시와 비교하여, 상기 화합물의 존재시에 상기 올리고뉴클레오티드의 상기 바이러스 성분에의 결합에 변화가 일어났는지 여부를 측정하는 단계로, 상기 차이는 상기 화합물이 상기 올리고뉴클레오티드의 상기 바이러스 성분에의 결합을 변경시킴을 나타냄.
  130. 제 129항에 따른 방법에 의하여 규명된 신규한 항바이러스 화합물.
  131. 하기를 포함하는, 올리고뉴클레오티드의 풀로부터 하나 이상의 바이러스 성분에 결합하는 올리고뉴클레오티드를 정제하는 방법:
    1) 상기 풀을 하나 이상의 바이러스 성분과 접촉시키는 단계;
    2) 상기 바이러스 성분으로부터 상기 풀의 결합된 올리고뉴클레오티드를 분리하는(displace) 단계;
    및
    3) 분리된 올리고뉴클레오티드를 회수하는 단계.
  132. 제 131항에 있어서, 정지상 배지에서 회수한 결합된 올리고뉴클레오티드의 서열결정 및 항바이러스 활성을 시험하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  133. 하기를 포함하는 하나 이상의 바이러스 성분에 결합하는 올리고뉴클레오티드의 풀로부터 올리고뉴클레오티드를 풍부화하는 방법:
    1) 상기 풀과 하나 이상의 바이러스 성분을 접촉시키는 단계; 및
    2) 풍부화된 올리고뉴클레오티드 풀을 제공하기 위하여 상기 바이러스 성분에 결합된 올리고뉴클레오티드를 증폭시키는 단계.
  134. 제 133항에 있어서, 상기 접촉 및 증폭은 상기 풍부화된 올리고뉴클레오티드 풀을 올리고뉴클레오티드 풀로서 사용하여 부가적으로 한번 이상 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  135. 제 133항 또는 제 134항에 있어서, 풍부화된 올리고뉴클레오티드 풀에서 올리고뉴클레오티드의 서열결정 및 항바이러스 활성을 시험하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  136. 올리고뉴클레오티드 제제 중의 올리고뉴클레오티드는 초기의 올리고뉴클레오티드 풀의 올리고뉴클레오티드의 평균 결합 친화도보다 하나 이상의 바이러스 성분과 더 높은 평균 결합 친화도를 나타내는, 제 131 내지 135 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 규명된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스 올리고뉴클레오티드 제제(preparation).
  137. 제 136항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 평균 결합 친화도는 초기 올리고뉴클레오티드 풀 중의 올리고뉴클레오티드의 평균 결합 친화도보다 두 배 이상 큰 항바이러스 올리고뉴클레오티드 제제.
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