WO2017065405A1 - Rna 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제 - Google Patents

Rna 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제 Download PDF

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WO2017065405A1
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seq
nucleotide sequence
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represented
rna oligonucleotide
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최병석
이장현
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한국과학기술원
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to antiviral agents comprising RNA oligonucleotides having specific sequences and structures.
  • Interferon is a glycoprotein derived from most cells in the nucleus, and has antiviral properties by inhibiting the replication of the virus. Interferons bind to specific receptors on cell surface cell membranes, resulting in a series of intracellular and immune regulatory responses. Such intracellular responses include induction of activation of specific enzymes, and immunomodulatory responses include increased phagocytosis of macrophages, increased cytotoxicity of lymphocytes to target cells, and inhibition of virus proliferation of virus-infected cells.
  • Interferons are classified into types 1 and 2 according to their physicochemical and functional characteristics.
  • Type 1 interferons include interferon- ⁇ , - ⁇ , - ⁇ and - ⁇
  • type 2 interferons have interferon- ⁇ .
  • Interferon- ⁇ is a single chain protein of about 20 kDa in molecular weight, containing about 20% sugar and composed of 166 amino acids.
  • interferon- ⁇ Recombinant interferon- ⁇ is currently used together with interferon- ⁇ as a therapeutic agent for diseases caused by various viruses such as hepatitis B and C viruses, and as an adjuvant that suppresses the recurrence of infection caused by papilloma virus.
  • viruses such as hepatitis B and C viruses
  • an adjuvant that suppresses the recurrence of infection caused by papilloma virus.
  • U.S. Patent Application Publication No. 2012/0288476 discloses that oligonucleotides in which a phosphate group is bound to the 5'-end and a cap-free oligonucleotide expresses type 1 interferon, interleukin-18, interleukin-1 ⁇ , and the like. Increasing to be used as an antiviral agent.
  • RNA consisting of four nucleotides can be used for the treatment of diseases by inducing the activity of interferon- ⁇ to promote an immune response.
  • RNAs have in common that they contain a triphosphate group at the 5'-end. As described above, it is known that RNA does not have a cap at its 5'-end and contains a triphosphate group to bind to a retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) protein in a cell to activate expression of interferon.
  • RAG-I retinoic acid-inducible gene I
  • the inventors of the present invention have been studying a substance capable of increasing the expression of interferon-activated factor 56 (ISG56) expressed by interferon- ⁇ or interferon- ⁇ , and, as previously known, at the 5'-end
  • the present invention has been completed by confirming that RNA oligonucleotides having a specific sequence and structure increase the expression of interferon- ⁇ or ISG56 and exhibit antiviral activity even without a triphosphate group, confirming that the RNA oligonucleotides can be used as antiviral agents.
  • an antiviral agent comprising an RNA oligonucleotide having a specific sequence and structure.
  • Another object of the present invention is to provide a method of treating a viral disease using RNA oligonucleotides having specific sequences and structures.
  • Another object of the present invention is to provide a use for the treatment of viral diseases of RNA oligonucleotides having specific sequences and structures.
  • the present invention is an antiviral agent containing an RNA oligonucleotide as an active ingredient, the base sequence of the RNA oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') is complementary to each other to form a double strand, the double strand has a helical bend structure,
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 has a hydroxyl group (OH) at its 5'-end, provides an antiviral agent.
  • the present invention also provides an antiviral agent containing an RNA oligonucleotide as an active ingredient, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') ) And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') are complementary to each other to form a double strand, the double strand has a spiral bent structure, the sequence number The 3'-end of the nucleotide sequence represented by 1 and the 5'-end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are connected in a loop to have a hairpin structure, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 It provides an antiviral agent having a hydroxyl group (OH) at its 5'-end.
  • SEQ ID NO: 1 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 '
  • SEQ ID NO: 2 5
  • the present invention also provides an antiviral agent containing an RNA oligonucleotide as an active ingredient, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') ) And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') is linked to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') the two are complementarily bonded to each other to form a double strand, the double strand has a helical bent structure, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 has a hydroxyl group (OH) at its 5'-end An antiviral agent is provided.
  • SEQ ID NO: 1 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 '
  • SEQ ID NO: 17 5'-N 4
  • the present invention also provides an antiviral agent containing an RNA oligonucleotide as an active ingredient, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') ) And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') is linked to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') two are complementarily bonded to each other to form a double strand, the double strand has a helical bent structure, the 3'- end of one nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 and the SEQ ID NO: 17 The 5'-terminal end of the other base sequence to be displayed is connected to the loop having a hairpin structure, and one base sequence represented by SEQ ID NO: 17 has
  • the present invention provides a method for treating a viral disease comprising administering any one of the RNA oligonucleotides to a subject in need of treatment.
  • the present invention provides a use of any one of the above RNA oligonucleotides for the manufacture of a medicament for the treatment of viral diseases.
  • RNA oligonucleotides having a specific sequence and helical bent structure increases the expression of interferon- ⁇ or ISG56 and exhibits antiviral activity, so that the composition comprising the RNA oligonucleotides is useful as an antiviral agent. Can be used.
  • RNA oligonucleotides prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram confirming the structure of 5'-OH-iav or 5'-PPP-iav RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a graph confirming the increase in the expression of interferon- ⁇ by RNA oligonucleotides prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a graph confirming the increased expression of interferon- ⁇ by 5'-OH-Bend-GC-8bp RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a graph confirming the increased expression of ISG56 by 5'-OH-8bp-Bend-GC Minimun RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is an RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-16mer-Double Bend It is a graph confirming the increased expression of ISG56 by.
  • Figure 7 is a graph confirming the increased expression of ISG56 by 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 is a graph confirming the increased expression of ISG56 by 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA oligonucleotide prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows the antiviral activity of influenza A virus of 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-Long_Bend RNA RNA nucleotides prepared according to an embodiment of the present invention (A And plaque assay (B).
  • FIG. 10 is a diagram confirming the antiviral activity against influenza A virus of the 5'-OH-Long_Bend Short RNA RNA nucleotide prepared according to an embodiment of the present invention by Western blot.
  • FIG. 11 is a diagram confirming the antiviral activity of influenza A virus of 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA RNA nucleotide prepared according to an embodiment of the present invention by Western blot.
  • the present invention is an antiviral agent containing an RNA oligonucleotide as an active ingredient, wherein the RNA oligonucleotide is represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 1 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 '
  • SEQ ID NO: 2 A base sequence (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') is complementary to each other to form a double strand, the double strand has a helical bend structure, the SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO:
  • the base sequence represented by 2 provides an antiviral agent having a hydroxyl group (OH) at its 5'-end.
  • RNA oligonucleotides according to the present invention are 8 to 100, 8 to 50, 8 to 30, 8 to 20, 10 to 100, 10 to 50, 10 to 30, 20 to 500, 20 to It may have 300, 10 to 200, 10 to 100 or 20 to 50 bases. In one embodiment according to the invention RNA oligonucleotides may be 8 to 16 single-stranded, 16 to 32 double-stranded.
  • N 1 to N 6 may be any one selected from the group consisting of A, G, C and U, specifically, G or C Can be.
  • N 1 may be G
  • N 2 is C
  • N 3 may be G (corresponding to SEQ ID NO: 3)
  • SEQ ID NO: 2 in the nucleotide sequence of N 4 may be a C
  • 5 N is G
  • N 6 is a C (corresponding to SEQ ID NO: 4).
  • each of the sixth base sequence of the third base (U) and the fifth base (G) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is represented by SEQ ID NO: 2, respectively.
  • Wobble base pairs i.e., non-Watson-Crick base pairs, are formed with the first base (G) and the fourth base (U).
  • RNA oligonucleotide according to the present invention has a helical bend structure between the fourth base (A) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 Characterized in that form.
  • the helical bending structure, the third base (U) and the fifth base (G) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the sixth base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 G) and the fourth base (U) and wobble base pairs, respectively, are formed at the fourth base (A) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the fifth base (U) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the helical bending structure has a shape bent 10 to 90 degrees, specifically, 30 to 70 degrees, more specifically 40 to 50 degrees based on the plane of the double-stranded RNA.
  • RNA oligonucleotide according to the present invention is at least one or more of the phosphodiester bond (phosphodiester bond) forming the RNA oligonucleotide in order to inhibit degradation by the endonuclease (improving in vivo stability)
  • One or more bonds selected from the group consisting of phosphorothioate bonds, boranophosphate bonds and methyl phosphonate bonds.
  • said modification is at least one phosphorothioate linkage.
  • the present invention is an antiviral agent containing an RNA oligonucleotide as an active ingredient, wherein the RNA oligonucleotide is represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and SEQ ID NO: 2
  • the displayed base sequences (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') are complementary to each other to form a double strand, the double strand has a helical bend structure
  • the 3'-end of the displayed nucleotide sequence and the 5'-end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are connected in a loop to have a hairpin structure
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is
  • An antiviral agent is provided having a hydroxyl group (OH) at the 5'-terminus.
  • RNA oligonucleotides having a hairpin structure of the present invention may have the characteristics as described above.
  • the RNA oligonucleotide, the phosphodiester bond to form it may be substituted with a phosphorothioate bond.
  • the phosphorothioate bond may be formed between all nucleotides constituting the RNA oligonucleotide or nucleotides constituting the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • Loops in the hairpin RNA structure are 4 to 80, 4 to 75, 4 to 70, 4 to 65, 4 to 60, 4 to 55, 4 to 50, 4 to 45, 4 to 40 Dog, 4 to 35, 4 to 30, 4 to 25, 4 to 20, 4 to 15 or 4 to 10 bases, in one embodiment according to the invention the loop is 4 , 15, 16, 55, 64 or 73 bases.
  • the four base sequences constituting the loop may be UUCG.
  • a part of the base sequence constituting it in the loop when a part of the base sequence constituting it in the loop is complementary to each other to form a Watson-Crick base pair may have a stem (stem) structure.
  • the stem structure may comprise an AU motif with a Watson-Crick base pair formed between A and U.
  • the AU motif may be composed of 10 to 50, 15 to 40, 20 to 35, 25 to 30 AU base pairs. In one embodiment according to the invention, the AU motif may consist of 26 consecutive AU base pairs.
  • the oligonucleotide having the hairpin RNA structure may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, or SEQ ID NO: 20.
  • the present invention is an antiviral agent containing an RNA oligonucleotide as an active ingredient, wherein the RNA oligonucleotide is represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 1 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 '
  • SEQ ID NO: 2 Two nucleotide sequences (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') represented by SEQ ID NO: 17 to which the displayed nucleotide sequences (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') are linked
  • the double strand has a helical bend structure
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 has a hydroxyl group (OH) at its 5'-end Provides antiviral agents.
  • the RNA oligonucleotide is characterized in that the two nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 17 has a regressive structure.
  • the term "palindromic structure" refers to a structure in which two nucleotide sequences forming a double strand are composed of nucleotide sequences of the same order in the direction of 5'-end to 3'-end.
  • the regressive structure forms a single strand by combining the 3′-terminal with the 5′-terminal sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and forming the single strand, and the two single strands formed with each other It may be a double strand formed by complementary binding.
  • the single strand may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • the spiral bending structure may be two.
  • RNA oligonucleotide having the regressive structure may have the characteristics as described above.
  • the phosphodiester bonds that form it in the RNA oligonucleotide may be substituted with other bonds as described above.
  • the present invention is an antiviral agent containing an RNA oligonucleotide as an active ingredient, wherein the RNA oligonucleotide is represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 1 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 '
  • SEQ ID NO: 2 Two nucleotide sequences (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') represented by SEQ ID NO: 17 to which the displayed nucleotide sequences (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') are linked
  • the double strand has a helical bend structure
  • the 3'- end of one nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 and the SEQ ID NO: 17 5'-terminus of the other nucleotide sequence is connected in a loop (hair) has
  • the RNA oligonucleotide of the hairpin structure may have a recursive structure as described above, and may have two helical bent structures.
  • the RNA oligonucleotide may have the characteristics as described above.
  • the phosphodiester bonds that form it in the RNA oligonucleotide may be substituted with other bonds as described above.
  • RNA oligonucleotides having double stranded RNA or hairpin RNA structures (FIG. 1), wherein 5'-OH-iav or 5'-PPP-iav has a helical bending structure (FIG. 2).
  • RNA oligonucleotides with a helical bent structure were found to increase the expression of interferon- ⁇ and ISG56 (FIGS. 3-8).
  • RNA oligonucleotide having the helical bent structure exhibited antiviral activity against influenza A virus (FIGS. 9 to 11).
  • RNA oligonucleotide having a helical bent structure increases the expression of interferon- ⁇ and ISG56 and exhibits antiviral activity
  • a composition including the same as an active ingredient may be usefully used as an antiviral agent.
  • the antiviral agent according to the present invention can be used to inhibit the activity of a virus having RNA as a gene.
  • RNA viruses include hepatitis C virus, dengue virus, acute respiratory syndrome virus, mers corona virus, influenza virus, West Nile virus, Ebola virus, vesicular stomatitis virus, Newcastle disease virus, and the like.
  • the antiviral agent may be used to inhibit the activity of a virus having DNA as a gene.
  • DNA viruses include hepatitis B virus.
  • the antiviral agent may include 10 to 95% by weight of the RNA oligonucleotide according to the present invention as an active ingredient with respect to the total weight of the antiviral agent.
  • the antiviral agent of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the above-mentioned active ingredients.
  • the antiviral agent of the present invention may further include one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • the dosage of the antiviral agent according to the present invention may vary depending on the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active and other ingredients contained in the antiviral agent, the type of formulation and the age, weight, general state of health, sex and diet of the patient. It may be adjusted according to various factors including the time of administration, the route of administration, the duration of treatment, and the drug used concurrently. However, for the desired effect, the effective amount of the RNA oligonucleotide included in the antiviral agent according to the present invention is such that the intracellular concentration is 1 to 1,000 nM, specifically 100 to 500 nM. In this case, the administration may be administered once a day, may be divided into several times.
  • the antiviral agents of the present invention can be administered to a subject in need of treatment by various methods known in the art.
  • the route of administration may be appropriately selected by those skilled in the art in consideration of the method of administration, the volume of body fluid, viscosity, and the like.
  • the present invention includes administering an RNA oligonucleotide to a subject in need of treatment, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') and SEQ ID NO: 2.
  • the displayed nucleotide sequence (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') is complementary to each other to form a double strand, the double strand has a spiral bent structure, the SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2
  • Provided is a method of treating a viral disease, wherein the displayed nucleotide sequence has a hydroxyl group (OH) at its 5'-end.
  • the present invention also includes administering an RNA oligonucleotide to a subject in need of treatment, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 (5′-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ′) and SEQ ID NO:
  • the nucleotide sequence represented by 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') is complementary to each other to form a double strand, the double strand has a spiral bent structure, represented by SEQ ID NO:
  • the 3'-terminal of the nucleotide sequence and the 5'-terminal of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are connected in a loop to have a hairpin structure, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a hydroxyl group at the 5'-end thereof.
  • a method of treating a viral disease, having (OH), is provided.
  • the present invention also includes administering an RNA oligonucleotide to a subject in need of treatment, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 (5′-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ′) and SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 1 5′-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ′
  • SEQ ID NO: 17 The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 to which the nucleotide sequence represented by 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') is linked (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') Two are complementarily bonded to each other to form a double strand, the double strand has a spiral bending structure, the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 has a hydroxyl group (OH) at its 5'-end, a virus Provides a method for treating sexual disorders.
  • SEQ ID NO: 1
  • the present invention also includes administering an RNA oligonucleotide to a subject in need of treatment, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 (5′-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ′) and SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 1 5′-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ′
  • SEQ ID NO: 17 The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 to which the nucleotide sequence represented by 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') is linked (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') Two are complementary to each other to form a double strand, the double strand has a helical bending structure, the 3'-terminal end of one nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 and the other represented by SEQ ID NO: 17
  • Treatment of a viral disease wherein the 5'-terminus of
  • the RNA oligonucleotide is as described above.
  • the subject may be a mammal, specifically a human.
  • the viral disease may be a disease caused by a DNA or RNA virus, examples of specific viruses are as described above.
  • the present invention is the use of the RNA oligonucleotide for use in the manufacture of a medicament for the treatment of viral diseases, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') are complementary to each other to form a double strand, the double strand has a spiral bent structure, the sequence
  • the base sequences represented by No. 1 and SEQ ID NO: 2 provide for the use of RNA oligonucleotides having a hydroxyl group (OH) at its 5′-end.
  • the present invention is the use of the RNA oligonucleotide for use in the manufacture of a medicament for the treatment of viral diseases, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') are complementary to each other to form a double strand, the double strand has a spiral bent structure, the sequence The 3'-terminus of the nucleotide sequence represented by number 1 and the 5'-terminus of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are connected in a loop to have a hairpin structure, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 5'- Provided is the use of an RNA oligonucleotide having a hydroxyl group (OH) at the end.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO
  • the present invention is the use of the RNA oligonucleotide for use in the manufacture of a medicament for the treatment of viral diseases, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') is linked to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6 -3 ') two are complementarily bonded to each other to form a double strand, the double strand has a helical bent structure, the base sequence represented by SEQ ID NO: 17 has a hydroxyl group (OH) at its 5'-end ),
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 '
  • SEQ ID NO: 17 5'-
  • the present invention is the use of the RNA oligonucleotide for use in the manufacture of a medicament for the treatment of viral diseases, wherein the RNA oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 -3 ') And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 (5'-N 4 N 5 UUUGCN 6 -3') is linked to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 (5'-N 1 GUAGAN 2 N 3 N 4 N 5 UUUGCN 6-3 '), the two are combined complementarily has a spiral structure in which the bending to form a double strand, and the double-stranded with each other, the 3'-end of a nucleotide sequence shown in the SEQ ID NO: 17 and the SEQ ID NO: 17 5'-terminal end of the other nucleotide sequence represented by the has a hairpin structure connected in a loop, one nucleo
  • the RNA oligonucleotide is as described above.
  • the viral disease may be a disease caused by a DNA or RNA virus, examples of specific viruses are as described above.
  • RNA oligonucleotides were constructed that could increase the expression of interferon- ⁇ or ISG56.
  • RNA oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and having triphosphate at the 5′-end were prepared using techniques known in the art.
  • an RNA oligonucleotide consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 5 to 10 and SEQ ID NOs: 18 to 20 and having a hydroxyl group at the 5'-end, or a phosphodiester bond substituted with a phosphorothioate bond, Customized to Integrated DNA Technologies or Dharmacon.
  • 5'-OH-Int-NS1 and 5'-OH-Bend-GC RNA oligonucleotides consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8 and having a hydroxyl group at the 5'-end were prepared, respectively.
  • a 5'-OH-Cont-GC-8bp RNA oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 and having a hydroxyl group at the 5'-end, and a phosphodiester bond forming the RNA oligonucleotide
  • a 5'-OH-Cont-GC-8bp-PS RNA oligonucleotide was substituted with phosphorothioate bonds.
  • RNA oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 and having a hydroxyl group at the 5'-end, and a phosphodiester bond forming the RNA oligonucleotide 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA oligonucleotides were substituted with phosphorothioate bonds.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 these bases are complementary to each other to form a double strand, 5'-OH-8bp-Bend having a hydroxyl group at the 5'-end -GC-Minimum RNA oligonucleotides were prepared.
  • two nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 18 are complementarily bonded to each other to form a double strand, and a 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA oligonucleotide having a hydroxyl group at its 5'-end was prepared. .
  • RNA oligonucleotide having a hydroxy group at its 5'-end, and a phosphodiester bond forming the RNA oligonucleotide 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA oligonucleotides were substituted with phosphorothioate bonds.
  • a 5'-OH-Long_Bend Short RNA oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 and having a hydroxyl group at its 5'-end was prepared.
  • RNA oligonucleotide prepared in Example 1 was prepared in the art Various spectroscopic experiments were carried out by known methods. At this time, two-dimensional NOE spectroscopy (NOESY) was carried out at a mixing time of 100 and 200 Hz with nuclear magnetic resonance (NMR) spectrometers (Bruker, USA) of 400, 600 and 800 MHz.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • 1 H- 13 C CT-HSQC, HCCH-COSY, 2D HCCH-relayed COSY, 2D HCCH-TOCSY and 3D HCCH-TOCSY spectroscopy were performed.
  • the ⁇ dihedral angle was obtained from 3 J H1 ', H2' values obtained from DQF-COSY, and all ⁇ back angles were fixed at -158 ⁇ 15 degrees.
  • Other dihedral angles eg, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇
  • the bulge portion did not limit the other back angles, except for some ⁇ and ⁇ back angles.
  • Residual dipolar coupling values were measured by HSQC experiments with increased sensitivity with an accuracy of ⁇ 1 dB.
  • the alignment tensor was analyzed by singular value decomposition to obtain anisotropy value of -8.0 ⁇ and rhombicity value of 0.32.
  • 5'-OH-Int-NS1, 5'-OH-Bend-GC which is an RNA oligonucleotide of the present invention comprising the sequences represented by 5'-GUAGA-3 'and 5'-UUUGC-3', 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, 5'-OH-16mer-Double-Bend, 5 ' It was found that -OH-Long_Bend, 5'-OH-Long_Bend-BPS and 5'-OH-Long_Bend Short RNA oligonucleotides also form a helical bent structure.
  • RNA oligonucleotides having a helical bent structure prepared in Example 1 was confirmed to increase the expression of interferon- ⁇ .
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • RNA oligonucleotide prepared in Example 1 was treated with the cell line prepared in Experimental Example 1.1.
  • the cultured cells were treated with trypsin-EDTA (Gibco, USA) to remove the cells, and counted and divided into 1 ⁇ 10 3 cells in 6-well plates. Thereafter, it was incubated for 42 hours at 37 ° C., 5% CO 2 , and after removing the medium, 400 ⁇ l of OPTI-MEM and RNA oligonucleotides without FBS were treated.
  • trypsin-EDTA Gibco, USA
  • RNA oligonucleotides Treatment of RNA oligonucleotides was carried out at 1 ⁇ M of 5'-PPP-control, 5'-PPP-iav, 5'-OH-control, 5'-OH-iav, 5'-OH-Int-NS1 and 5'-.
  • Each of OH-Bend-GC was mixed with 4 ⁇ l of lipofectamine LTX, and 1.6 ⁇ l of plus-reagent, which was treated with 200 ⁇ l of cells. Thereafter, the cells were incubated for 4 hours at 37 ° C. and 5% CO 2.
  • poly (I: C) [poly (I: C)] known as RIG-I ligand was used as a positive control group.
  • RIG-I ligand As a negative control, only the embryos were treated. After 4 hours, the medium was removed, and 2 ml of DMEM medium containing 10% FBS was added thereto, followed by further incubation for 2 hours at 37 ° C.
  • RNA was isolated by the following method.
  • RNA was removed and the cells were recovered with 500 ⁇ l of TRI-reagent (Ambion, USA), and then the chloroform was added to the collected cells to separate the RNA layer. Isopropanol was added thereto to make pellets. The pellets were washed and dried with 75% ethanol and then dissolved in sterile distilled water. DNase (Promega, USA) was added to the separated RNA and treated at room temperature for 30 minutes to remove contaminated DNA, and then inactivated with a stop solution. Subsequently, cDNA was synthesized from RNA by using SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen, USA) for 1 hour at 50 ° C.
  • Real-time PCR was performed using the thus synthesized cDNA as a template. Specifically, real-time PCR was performed on h-tag DNA polymerase (solgent, Korea), dNTP, tetraethylammonium chloride, evagreen dye (Biogreen dye, Biotium, USA), and the target gene interferon- ⁇ and the control. The primers for the gene GAPDH were mixed. Real-time PCR was fixed at 95 ° C. for 15 minutes and then repeated 40 times at 95 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 40 seconds, and 72 ° C. for 20 seconds. In this case, primers targeting interferon- ⁇ and GAPDH are shown in Table 1 below.
  • the negative control was treated only with a medium or 5'-OH-control
  • the positive control was treated with poly (I: C) [poly (I: C)].
  • the experimental group was treated with 5'-OH-Bend-GC-8bp and 5'-OH-Bend-GC RNA oligonucleotide, and 5'-OH-Bend-GC-8bp was performed three times.
  • RNA oligonucleotide As shown in FIG. 5, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, the smallest double-stranded RNA oligonucleotide to which the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are complementarily bound, expresses ISG56 expression. It was confirmed that the increase to a significant level.
  • RNA oligonucleotides having a helical bent structure produced in the present invention the phosphodiester bonds forming the RNA oligonucleotides are replaced by phosphorothioate bonds (5'-OH-Bend-GC-8bp-PS),
  • the minimum length of the RNA oligonucleotide having the helical bent structure is connected to the regression structure to determine whether the two oligo bent RNA oligonucleotides (5'-OH-16mer-Double-Bend) have an interferon- ⁇ expression-increasing activity.
  • the expression change of ISG56 induced by the expression of interferon- ⁇ was confirmed.
  • the bond forming the RNA oligonucleotide is replaced with a phosphorothioate bond and is resistant to endonuclease among the RNA oligonucleotides injected into the cell, and has a 5 'helical bending structure. It was found that -OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA oligonucleotides increased the expression of ISG56 to significant levels.
  • RNA oligonucleotides having a helical bent structure produced in the present invention in order to confirm whether long-length hairpin RNA oligonucleotides (5'-OH-Long_Bend) have an interferon- ⁇ expression-increasing activity, expression of interferon- ⁇ The expression change of ISG56 induced by was confirmed.
  • 5′-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide which is a long hairpin RNA having a helical bending structure, increased the expression of ISG56.
  • RNA oligonucleotide having a helical bent structure and a long hairpin prepared in the present invention a 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA oligonucleotide in which some phosphodiester bonds forming the same are substituted with phosphorothioate bonds.
  • the expression change of ISG56 was confirmed.
  • 5′-OH-Long_Bend-BPS RNA having a helical bent structure and a long hairpin in which the bond forming the RNA polynucleotide of the portion forming the bent structure is substituted with phosphorothioate. Oligonucleotides were found to significantly increase the expression of ISG56. Specifically, 5'-OH-Long_Bend-BPS increased the expression of ISG56 by about 7 times compared to 5'-OH-Bend-GC-8bp.
  • Influenza A virus / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) (PR8) (ATCC, USA) was infected with embryonic eggs for 10 days and amplified for 3 days at 37 ° C. The titer of the amplified virus was confirmed by plaque assay and the virus was stored at -70 ° C.
  • MDCK Mesarby canine kidney; ATCC, USA
  • MEM minimum essential medium; Hyclone, USA
  • FBS FBS
  • A549 (ATCC, USA) cell lines cultured in RPMI1640 (Hyclone, USA) medium containing 10% FBS were dispensed into 6-well plates to 1 ⁇ 10 6 cells per well.
  • the cells were transfected with 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS or 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotides at concentrations of 10, 30 and 100 nM, respectively.
  • 5'-OH-Cont-GC-8bp having no spiral bending structure was treated with a concentration of 100 nM, and 0.1 ⁇ g / mL poly I: C (polyinosine-polycytidylic acid) as a negative control.
  • oseltamivir oseltamivir, OSV-C; Sigma, USA.
  • Transfection was performed using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) according to the manufacturer's protocol. After 24 hours, the cell culture was removed and the influenza A virus prepared in Experimental Example 7.1 was infected with 0.1 MOI. After standing at 37 ° C. for 1 hour, the medium was removed, and cells were cultured by adding RPMI1640 medium containing 0.1 ⁇ g / ml of TPCK-trypsin. After 1 day of culture, cells were lysed by adding 0.3 ml of M-PER solution (Thermo Scientific, USA) to the wells, and Western blots were performed by conventional methods using cell lysates.
  • M-PER solution Thermo Scientific, USA
  • the protein contained in the cell lysate was quantitated and electrophoresed by loading it on a 10% SDS-PAGE gel to 30 ⁇ g per well. Electrophoresed proteins were transferred to PVDF membrane (Immobilion-P membrane; Millipore, USA), and pretreated for 1 hour at room temperature by the addition of 1xPBS containing 5% BSA. After washing with 1xPBS, the primary antibody was added and reacted at 4 ° C. overnight, and the secondary antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. At this time, anti-NP antibody (11675-MM03, Sino Biological, China) and HRP-bound goat anti-mouse IgG (Sigma-Aldrich, USA) were used for detection of viral NP proteins.
  • anti-NS1 antibody sc-17596, Santa Cruz Biotechnology, USA
  • HRP-linked donkey anti-goat IgG Sigma-Aldrich, USA
  • ⁇ -actin As a control, the expression level of ⁇ -actin was confirmed, wherein an anti- ⁇ -actin antibody (Sigma-Aldrich, USA) and HRP-linked goat anti-mouse IgG (Sigma-Aldrich, USA) were used.
  • Protein bands were identified using SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, USA), and the results obtained with the LAS-4000 (Fujifilm, Japan) image analyzer are shown in FIG. 9A.
  • 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS and 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotides exhibit antiviral activity against influenza A in a concentration-dependent manner.
  • the 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotide showed an excellent effect at the same level as poly I: C, a positive control even at a low concentration of 10 nM.
  • RNA oligonucleotides were transfected.
  • 5'-OH-Cont-GC-8bp having no spiral bending structure was treated with a concentration of 100 nM, and 0.1 ⁇ g / mL poly I: C (polyinosine-polycytidylic acid) as a negative control.
  • poly I polyinosine-polycytidylic acid
  • 10 ⁇ M of oseltamivir oseltamivir, OSV-C; Sigma, USA.
  • the influenza A virus prepared in Experimental Example 7.1 was diluted 100-fold and infected, and it was allowed to stand at 37 ° C for 1 hour. The medium was removed again, and the cells were cultured by adding RPMI1640 medium containing 0.1 ⁇ g / ml TPCK-trypsin. After 24 hours of culture, the cell culture was infected with the MDCK cell line in the same manner as in Experimental Example 7.1 to determine the titer of the virus.
  • FIG. 9B a photograph of the cells stained with crystal violet and the titer of the virus are shown in FIG. 9B.
  • 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS and the 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotides exhibit antiviral activity against influenza A virus in a concentration-dependent manner.
  • 5'-OH-Long_Bend RNA oligonucleotides showed a similar effect as the positive control poly I: C, even at a low concentration of 10 nM as in the Western blot results.
  • RNA oligonucleotides according to the present invention were determined in the same manner as in Experimental Example 7.2, except that 5'-OH-Long_Bend or 5'-OH-Long_Bend Short RNA oligonucleotides by concentration were treated in the experimental group. Confirmed. At this time, 5'-OH-Cont-GC-8bp having no spiral bending structure was treated as a negative control at a concentration of 100 nM, and a positive control 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS as 100 nM. RNA oligonucleotides were added.
  • RNA oligonucleotide of the present invention in the same manner as in Experiment 7.2. Virus activity was confirmed.
  • 5'-OH-Cont-GC-8bp and 5'-OH-Cont-GC-8bp-PS which did not have only a virus infection or a spiral bending structure, were added as a negative control at a concentration of 100 nM, respectively. .
  • RNA oligonucleotide of the present invention having a spiral bending structure can be used as an active ingredient of an antiviral agent.

Abstract

본 발명은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명에 따른 특정 서열과 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 세포주에 처리하면 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시키고 항바이러스 활성을 나타내므로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 항바이러스제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제
본 발명은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제에 관한 것이다.
인터페론은 핵이 존재하는 대부분의 세포로부터 유래하는 당단백질로, 바이러스의 복제를 억제하여 항바이러스 성질을 갖는다. 인터페론은 세포 표면 세포막의 특정 수용체와 결합하여 일련의 세포 내 반응과 면역 조절 반응을 나타낸다. 이러한 세포 내 반응에는 특정 효소들의 활성화 유도 등이 있고, 면역 조절 반응으로서는 대식세포의 식세포작용 활성 증가, 표적 세포에 대한 임파구의 세포독성 증가 및 바이러스에 감염된 세포들의 바이러스 증식 억제 등이 있다.
인터페론은 물리화학적 및 기능적 특징에 따라 1형과 2형으로 분류된다. 1형 인터페론에는 인터페론-α, -β, -τ 및 -ω가 있고, 2형 인터페론에는 인터페론-γ가 있다. 이 중 인터페론-β는 분자량이 약 20 kDa이고, 약 20%의 당을 함유하며 166개의 아미노산으로 구성된 단일 사슬의 단백질이다.
현재 재조합 인터페론-β는 인터페론-α와 함께 B형 및 C형 간염 바이러스와 같은 다양한 바이러스에 의해 발생하는 질환의 치료제로 사용되고 있고, 유두종 바이러스에 의한 감염의 재발을 억제하는 면역 증강제(adjuvant)로 사용될 수 있음이 보고되어 있다(Gross G. et al., Dermatology, 1998;196(3):330-4).
한편, 최근 RNA 올리고뉴클레오티드를 사용하여 면역반응을 증가시킴으로써 다양한 질환의 치료에 사용하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 미국 특허공개 제2012/0288476호는 5'-말단에 포스페이트기(phosphate group)가 결합되고, 캡(cap)이 없는 상태의 올리고뉴클레오티드가 1형 인터페론, 인터루킨-18, 인터루킨-1β 등의 발현을 증가시켜 항바이러스제로 사용될 수 있음을 개시하고 있다.
또한, 미국 특허공개 제2012/0121551호는 4개의 뉴클레오티드로 구성된 RNA가 인터페론-α의 활성을 유도하여 면역반응을 촉진함으로써, 질환의 치료 목적으로 사용될 수 있음을 개시하고 있다.
상기 공개된 RNA들은 모두 5'-말단에 트리포스페이트기를 포함한다는 공통점이 있다. 이와 같이 RNA가 이의 5'-말단에 캡이 존재하지 않고, 트리포스페이트기를 포함하면 세포 내의 RIG-I(retinoic acid-inducible gene I) 단백질과 결합하여 인터페론의 발현을 활성화시키는 것이 알려져 있다.
본 발명자들은 인터페론-β 또는 인터페론-β에 의해 발현되는 인터페론 활성인자 56(interferon stimulated gene 56; ISG56)의 발현을 증가시킬 수 있는 물질을 연구하던 중, 기존에 알려진 바와 달리, 5'-말단에 트리포스페이트기가 없어도 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시키고 항바이러스 활성을 나타내어, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 항바이러스제로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 사용하여 바이러스성 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 특정 서열 및 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드의 바이러스성 질환의 치료를 위한 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 RNA 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나를 치료가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하는 바이러스성 질환의 치료방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이러스성 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 상기 RNA 올리고뉴클레오티드 중 어느 하나의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 특정 서열과 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 세포주에 처리하면 인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시키고 항바이러스 활성을 나타내므로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 항바이러스제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드들의 서열 및 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-iav 또는 5'-PPP-iav의 구조를 확인한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드들에 의한 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp에 의한 인터페론-β의 발현증가를 확인한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC Minimun에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double Bend에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend-BPS에 의한 ISG56의 발현 증가를 확인한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-Long_Bend의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 웨스턴 블랏(A) 및 플라크 어세이(B)로 확인한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend Short의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 웨스턴 블랏으로 확인한 도면이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Long_Bend-BPS의 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 웨스턴 블랏으로 확인한 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 8 내지 100개, 8 내지 50개, 8 내지 30개, 8 내지 20개, 10 내지 100개, 10 내지 50개, 10 내지 30개, 20 내지 500개, 20 내지 300개, 10 내지 200개, 10 내지 100개 또는 20 내지 50개의 염기를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서 RNA 올리고뉴클레오티드는 단일가닥으로는 8개 내지 16개, 이중가닥으로는 16개 내지 32개일 수 있다.
상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 A, G, C 및 U로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 구체적으로는 G 또는 C일 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, 그리고 N3는 G일 수 있고(서열번호 3에 해당), 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, 그리고 N6은 C일 수 있다(서열번호 4에 해당).
상기 염기서열을 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 이중가닥을 형성할 때, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 각각 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 워블 염기쌍(wobble base pair), 즉, 비 왓슨-크릭 염기쌍을 형성한다.
또한, 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U) 사이에서 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 일실시예에서, 나선형 굽힘 구조는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 세 번째 염기(U) 및 다섯 번째 염기(G)가 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 여섯 번째 염기(G) 및 네 번째 염기(U)와 각각 워블 염기쌍일 때 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 네 번째 염기(A)와 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 다섯 번째 염기(U)에서 형성된다.
상기 나선형 굽힘 구조는 이중가닥 RNA가 이루는 평면을 기준으로 10 내지 90도, 구체적으로는, 30 내지 70도, 더욱 구체적으로는 40 내지 50도로 구부러진 형태를 갖는다.
본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드는 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의한 분해를 억제하고 생체 내 안정성 향상을 위해, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합(phosphodiester bond) 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형될 수 있다. 본 발명에 따른 구체적인 일실시예에서 상기 변형은 적어도 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합이다.
또한, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.
본 발명의 헤어핀 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는, 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 포스포로티오에이트 결합은 RNA 올리고뉴클레오티드를 구성하는 모든 뉴클레오티드 또는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열을 구성하는 뉴클레오티드 사이에 형성될 수 있다.
상기 헤어핀 RNA 구조에서 루프는 4 내지 80개, 4 내지 75개, 4 내지 70개, 4 내지 65개, 4 내지 60개, 4 내지 55개, 4 내지 50개, 4 내지 45개, 4 내지 40개, 4 내지 35개, 4 내지 30개, 4 내지 25개, 4 내지 20개, 4 내지 15개 또는 4 내지 10개의 염기로 이루어질 수 있고, 본 발명에 따른 일실시예에서 상기 루프는 4개, 15개, 16개, 55개, 64개 또는 73개의 염기로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 루프를 구성하는 4개의 염기 서열은 UUCG일 수 있다.
또한, 상기 루프에서 이를 구성하는 일부의 염기서열이 서로 상보적인 경우 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 스템(stem) 구조를 가질 수 있다. 상기 스템 구조는 A 및 U 사이에 왓슨-크릭 염기쌍이 형성된 AU 모티프(motif)를 포함할 수 있다.
상기 AU 모티프는 10 내지 50개, 15 내지 40개, 20 내지 35개, 25 내지 30개의 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 AU 모티프는 26개의 연속된 AU 염기쌍으로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 일실시예에서, 상기 헤어핀 RNA 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 표시되는 염기서열일 수 있다.
또한, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.
구체적으로, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17로 표시되는 염기서열 2개가 회귀성 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 용어 "회귀성(palindromic) 구조"는 이중가닥을 형성하는 2개의 염기서열이 5'-말단에서 3'-말단의 방향으로 동일한 순서의 염기서열로 구성되는 구조를 나타낸다. 본 발명에서 상기 회귀성 구조는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 3'-말단이 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 5'-말단과 결합하여 단일가닥을 형성하고, 상기 형성된 단일가닥 2개가 서로 상보적으로 결합하여 형성된 이중가닥일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 단일가닥은 서열번호 18로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 회귀성 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드의 이중가닥에서 나선형 굽힘 구조는 2개일 수 있다.
또한, 상기 회귀성 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 RNA 올리고뉴클레오티드에서 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합은 상술한 바와 같은 다른 결합으로 치환될 수 있다.
또한, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제를 제공한다.
상기 헤어핀 구조의 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 회귀성 구조를 갖고, 2개의 나선형 굽힘 구조를 가질 수 있다. 상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드에서 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합은 상술한 바와 같은 다른 결합으로 치환될 수 있다.
본 발명자들은 이중가닥 RNA 또는 헤어핀 RNA 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하여(도 1), 그 중 5'-OH-iav 또는 5'-PPP-iav가 나선형 굽힘 구조를 갖고(도 2), 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 및 ISG56의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 3 내지 도 8).
또한, 상기 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 항바이러스 활성을 나타냄을 확인하였다(도 9 내지 도 11).
따라서, 본 발명에 따른 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 인터페론-β 및 ISG56의 발현을 증가시키고 항바이러스 활성을 나타내므로, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 항바이러스제로 유용하게 사용될 수 있다.
일례로, 본 발명에 따른 항바이러스제는, RNA를 유전자로 갖고 있는 바이러스의 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 RNA 바이러스의 구체적인 예로는, C형 간염 바이러스, 뎅기 바이러스, 급성 호흡기 증후군 바이러스, 메르스 코로나 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 소낭성 구내염 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 등이 있다.
또한, 상기 항바이러스제는 DNA를 유전자로 갖고 있는 바이러스의 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 DNA 바이러스의 구체적인 예로는 B형 간염 바이러스가 있다.
상기 항바이러스제는 항바이러스제 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항바이러스제는 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 항바이러스제는 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항바이러스제의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 항바이러스제에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간 및 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 항바이러스제에 포함되는 RNA 올리고뉴클레오티드의 유효량은 세포 내 농도가 1 내지 1,000 nM, 구체적으로는 100 내지 500 nM이 되도록 한다. 이때 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명의 항바이러스제는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 치료가 필요한 대상에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 치료가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 바이러스성 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 치료가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 바이러스성 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 치료가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 바이러스성 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 RNA 올리고뉴클레오티드를 치료가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 바이러스성 질환의 치료방법을 제공한다.
상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 상기 서술한 바와 같다. 상기 대상은 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 바이러스성 질환은 DNA 또는 RNA 바이러스에 의한 질환일 수 있고, 구체적인 바이러스의 예는 상기 서술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 바이러스성 질환의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 RNA 올리고뉴클레오티드의 용도로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 바이러스성 질환의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 RNA 올리고뉴클레오티드의 용도로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 바이러스성 질환의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 RNA 올리고뉴클레오티드의 용도로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 바이러스성 질환의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 RNA 올리고뉴클레오티드의 용도로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공한다.
상기 RNA 올리고뉴클레오티드는 상기 서술한 바와 같다. 상기 바이러스성 질환은 DNA 또는 RNA 바이러스에 의한 질환일 수 있고, 구체적인 바이러스의 예는 상기 서술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. RNA 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 제조
인터페론-β 또는 ISG56의 발현을 증가시킬 수 있는 RNA 올리고뉴클레오티드를 제작하였다.
먼저, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 제작하였다. 반면, 서열번호 5 내지 10 및 서열번호 18 내지 20으로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖거나, 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 RNA 올리고뉴클레오티드는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지(Integrated DNA Technologies) 또는 다르마콘(Dharmacon)에 주문제작하였다.
이에 따라, 도 1에 나타난 바와 같이, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-control 및 5'-PPP-control RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기 또는 트리포스페이트를 갖는 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 7 또는 8로 표시되는 염기서열로 구성되고, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Int-NS1 및 5'-OH-Bend-GC RNA 올리고뉴클레오티드를 각각 제작하였다. 또한, 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Cont-GC-8bp RNA 올리고뉴클레오티드, 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Cont-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드 제작하였다. 또한, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 구성되고 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Bend-GC-8bp RNA 올리고뉴클레오티드, 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 구성되고, 이들 염기가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하며, 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 아울러, 서열번호 18로 표시되는 염기서열 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 또한, 서열번호 19로 표시되는 염기서열로 구성되고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드, 및 상기 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합의 일부가 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 나아가, 서열번호 20으로 표시되는 염기서열로 구성되고, 이의 5'-말단에 하이드록시기를 갖는 5'-OH-Long_Bend Short RNA 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.
실시예 2. RNA 올리고뉴클레오티드의 구조 확인
상기 실시예 1에서 제조된 5'-OH-iav 및 5'-PPP-iav RNA 올리고뉴클레오티드의 구조를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 상기 실시예 1에서 제작된 RNA 올리고뉴클레오티드를 10 mM 인산나트륨(pH 6.5), 0.01 mM EDTA, 10 (v/v)% D2O를 포함하는 완충액에 용해시킨 샘플을 제조하여 당업계에 공지된 방법으로 다양한 분광실험을 하였다. 이때, 2차원 NOE 분광실험(NOESY)은 400, 600 및 800 ㎒의 핵자기공명(NMR) 분광기(Bruker, USA)로 100 및 200 ㎳의 믹싱시간에서 하였다. 또한, 278 K의 온도에서 1H-15H HSQC(heteronuclear single quantum coherence) 분광실험, 125 ㎳ 믹싱시간에서 DQF-COSY(double quantum filtered correlated) 및 TOCSY(homonuclear total correlation) 분광실험, 30 ㎳ 믹싱시간에서 1H-31P HETCOR(heteronuclear correlation) 및 1H-31P Hetero-TOCSY 분광실험, 및 80, 150 및 250 ㎳ 믹싱시간에서 NOESY 분광실험을 하였다. 그 외에도, 1H-13C CT-HSQC, HCCH-COSY, 2D HCCH-relayed COSY, 2D HCCH-TOCSY 및 3D HCCH-TOCSY 분광실험들을 하였다.
NMR 분광실험 결과, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드의 염기 수소들과, H1', H2', H3', H4', H5'/H5''들의 NMR 피크들을 정하였다. NOESY 분광실험으로부터 약 563개의 NOE 거리 규정값(distance constraints)들을 구하였고, 거리 규정값들은 거리에 따라 3 내지 4개의 그룹들(예컨대, 1.8 내지 3.4 Å, 1.8 내지 5.0 Å 및 3.8 내지 7.0 Å, 또는 1.8 내지 3.4 Å, 2.5 내지 4.5 Å, 3.5 내지 6.0 Å 및 4.0 내지 7.0Å)로 분류하였다. 비 왓슨-크릭 결합들에 대해서는 수소결합 제한을 두지 않았다. DQF-COSY에서 얻은 3JH1 ',H2' 값으로 δ 이면각(dihedral angle)을 구하였고, 모든 χ 이면각은 -158±15도로 고정하였다. 다른 이면각(예컨대, α, β, γ, ε, ζ)은 RNA의 A형 나선 구조로 제한하였다. 벌지(bulge) 부분은 몇몇 β 및 ε 이면각을 제외하고, 다른 이면각들은 제한하지 않았다. 잔류 쌍극 결합(residual dipolar coupling) 값들을 ±1 ㎐의 정확도로 민감성이 증가된 HSQC 실험으로 측정하였다. 또한, 특이값 분해(singular value decomposition)를 통해 얼라인먼트 텐서(alignment tensor)를 분석한 결과, -8.0 ㎐의 비등방성(anisotropy) 값과 0.32의 롬빅시티(rhombicity) 값을 얻었다. 모든 구조의 계산은 X-PLOR 3.1 및 CNS로 하였다. 100개의 구조를 거리 규정값에 따라 생성하여 3,000 K에서 10 ㎰ 동안 시뮬레이션 후, 50 ㎰ 동안 300 K에서 식히는 담금질 기법(simulated annealing)을 수행하였다. 거리 힘 상수(distance force constant)는 50 ㎉/mol/Å로 유지하였고, 이면각 상수는 20 ㎉/mol/Å에서 400 ㎉/mol/Å로 변화시켰다. 제일 낮은 에너지 상태의 구조들은 300 K에서 20 ㎰로 정제하였고, 마지막 5 ㎰는 제한된 에너지 최적화(restrained energy minimization)를 하였다. 이로부터 얻어진 총 220개의 구조들은 22개의 잔류 쌍극 결합 규정 값들을 추가하여 정제하였고, 이때 잔류 쌍극 결합의 힘 상수 값은 3.0 ㎉/mol을 유지하였다. 최종적으로 32개의 구조를 얻었으며, 이를 Insight II(Biosym Technologies, USA) 및 CURVES 5.2 소프트웨어로 분석하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav RNA 올리고뉴클레오티드는 나선형 굽힘 구조를 형성하고 있었다. 이와 같은 나선형 굽힘 구조는 5'-PPP-iav 및 5'-OH-iav를 구성하는 서열 중, 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'로 표시되는 서열로 구성된 두 개의 단일 가닥이 비 왓슨-크릭 결합을 통해 이중가닥을 형성하며 생성되는 구조로 확인되었다. 따라서, 상기 5'-GUAGA-3' 및 5'-UUUGC-3'로 표시되는 서열을 포함하는 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-Int-NS1, 5'-OH-Bend-GC, 5'-OH-Bend-GC-8bp, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS, 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum, 5'-OH-16mer-Double-Bend, 5'-OH-Long_Bend, 5'-OH-Long_Bend-BPS 및 5'-OH-Long_Bend Short RNA 올리고뉴클레오티드도 나선형 굽힘 구조를 형성하는 것을 알 수 있었다.
실험예 1. RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 인터페론-β의 발현 확인
상기 실시예 1에서 제조된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드들이 인터페론-β의 발현을 증가시키는지 확인하였다.
1.1. 세포주의 준비
먼저, 100 ㎜ 조직배양 플레이트에 3×106개의 HEK293T 세포(ATCC, USA)를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco, 미국)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 7 ㎖에 분주하고, 이를 37℃, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하여 세포주를 준비하였다.
1.2. RNA 올리고뉴클레오티드의 처리
상기 실험예 1.1.에서 준비한 세포주에 상기 실시예 1에서 제조된 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
먼저, 상기 배양된 세포에 트립신-EDTA(Gibco, 미국)를 처리하여 세포들을 떼어내고, 이를 계수하여 6-웰(well) 플레이트에 1×103개가 되도록 분주하였다. 그 후, 이를 37℃, 5% CO2의 조건에서 42시간 동안 배양하고, 배지를 제거한 뒤, FBS가 포함되지 않은 400 ㎕ OPTI-MEM 및 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
RNA 올리고뉴클레오티드의 처리는, 1 μM의 5'-PPP-control, 5'-PPP-iav, 5'-OH-control, 5'-OH-iav, 5'-OH-Int-NS1 및 5'-OH-Bend-GC 각각에 4 ㎕의 리포펙타민 LTX, 및 1.6 ㎕의 플러스-시약을 혼합하여, 이를 200 ㎕씩 세포에 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 다시 37℃, 5% CO2의 조건에서 4시간 동안 배양하였고, 이때, 양성대조군으로는 RIG-I 리간드로 알려진 폴리(I:C)[poly(I:C)]를, 음성대조군으로는 배지만 처리하였다. 4시간 후, 배지를 제거하고, 10% FBS를 포함하는 2 ㎖의 DMEM 배지를 넣어 37℃, 5% CO2의 조건에서 2시간을 더 배양하였다.
1.3. 인터페론-β의 발현 확인
상기 서술한 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리한 세포에서 인터페론-β의 발현을 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 RNA를 분리하였다.
먼저, 배지를 제거하고 500 ㎕의 TRI-시약(Ambion, 미국)으로 세포를 회수한 뒤, 모아진 세포에 클로로포름을 넣어 RNA 층을 분리하였다. 여기에 이소프로판올을 첨가하여 펠렛(pellet)을 만들고, 상기 펠렛을 75% 에탄올로 세척 및 건조시킨 뒤, 멸균된 증류수에 녹였다. 이렇게 분리된 RNA에 DNase(Promega, 미국)를 첨가하여 30분 동안 상온에서 처리하여 오염된 DNA를 제거하였고, 정지용액(stop solution)으로 이를 불활성화하였다. 그 후, 슈퍼스크립트 III 역전사효소(Invitrogen, 미국)를 이용하여 50℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.
이렇게 합성된 cDNA를 주형으로 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다. 구체적으로, 실시간 PCR은 h-tag DNA 중합효소(solgent, 대한민국), dNTP, 염화테트라에틸암모늄(tetraethylammonium chloride), 에바그린 염료(evagreen dye, Biotium, USA), 및 표적 유전자인 인터페론-β 및 대조 유전자인 GAPDH를 위한 프라이머를 혼합하여 수행하였다. 실시간 PCR은 95℃에서 15분 동안 고정한 후, 95℃ 20초, 60℃ 40초, 및 72℃ 20초를 1회로 총 40회를 반복하였다. 이때, 인터페론-β 및 GAPDH를 표적으로 하는 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 이름 서열
서열번호 11 인터페론-β forward 5'-ggaggacgccgcattgac-3'
서열번호 12 인터페론-β reverse 5'-caatagtctcattccagccagtgc-3'
서열번호 13 GAPDH forward 5'-gcattgccctcaacgaccac-3'
서열번호 14 GAPDH reverse 5'-gaggccatgtgggccatgag-3'
서열번호 15 ISG56 forward 5'-gcctccttgggttcgtctacaa-3'
서열번호 16 ISG56 reverse 5'-tcaaagtcagcagccagtctca-3'
그 결과, 인터페론-β의 발현 변화를 도 3에 그래프로 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 5'-말단에 트리포스페이트를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라, 5'-말단에 하이드록시기를 갖더라도 나선형 굽힘 구조가 있는 5'-OH-Int-NS1 및 5'-OH-Bend-GC RNA 올리고뉴클레오티드도 인터페론-β의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.
실험예 2. 짧은 길이의 헤어핀 RNA에 의한 인터페론-β의 발현 확인
상기 실험예 1에서 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β의 발현을 증가시키는지 확인하였다. 이때 인터페론-β의 발현에 영향을 미치는 RNA 올리고뉴클레오티드 부분의 확인을 위하여 굽힘 구조를 포함하는 더 짧은 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Bend-GC-8bp를 이용하여 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다.
단, 이때 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 5'-OH-control을 처리하였고, 양성 대조군은 폴리(I:C)[poly(I:C)]를 처리하였다. 실험군으로 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC의 RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였고, 5'-OH-Bend-GC-8bp는 3번 실험을 수행하였다.
그 결과, 인터페론-β의 발현 변화를 도 4에 그래프로 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC를 처리한 경우 유의미한 수준으로 인터페론-β의 발현을 증가시켰음을 확인하였다.
실험예 3. 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56의 발현 확인
상기 실험예 2에서 확인된 5'-OH-Bend-GC-8bp 헤어핀 RNA에서 루프 부분을 제외한 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드로 이루어진 이중나선 RNA인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum을 이용하여 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-Control을 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 5에 그래프로 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열이 상보적으로 결합된 최소 길이의 이중가닥 RNA 올리고뉴클레오티드인 5'-OH-8bp-Bend-GC-Minimum이 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.
실험예 4. 포스포로티오에이트 결합 또는 회귀성 구조로 연결된 RNA 올리고뉴클레오티드에 의한 ISG56의 발현 확인
본 발명에서 제작된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환되거나(5'-OH-Bend-GC-8bp-PS), 나선형 굽힘 구조를 갖는 최소 길이의 RNA 올리고뉴클레오티드가 회귀성 구조로 연결되어 2개의 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드(5'-OH-16mer-Double-Bend)가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 굽힘 구조를 갖지 않은 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 6에 그래프로 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 RNA 올리고뉴클레오티드를 형성하는 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 치환하여 세포 내로 주입된 RNA 올리고뉴클레오티드 중 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 대해 저항성을 갖고, 나선형 굽힘 구조를 갖는 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-16mer-Double-Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 유의미한 수준으로 증가시켰음을 확인하였다.
실험예 5. 긴 길이의 헤어핀 RNA에 의한 ISG56의 발현 확인
본 발명에서 제작된 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 중, 긴 길이의 헤어핀 RNA 올리고뉴클레오티드(5'-OH-Long_Bend)가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 인터페론-β의 발현에 의해 유도되는 ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-PPP-iav를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 7에 그래프로 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 나선형 굽힘 구조를 갖는 긴 길이의 헤어핀 RNA인 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 증가시켰음을 확인하였다.
실험예 6. 부분적으로 포스포로티오에이트 결합을 갖는 긴 길이의 헤어핀 RNA에 의한 ISG56의 발현 확인
본 발명에서 제작된 나선형 굽힘 구조가 있고 긴 길이의 헤어핀을 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드에서, 이를 형성하는 일부 포스포다이에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 치환된 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드가 인터페론-β 발현 증가 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, ISG56의 발현 변화를 확인하였다.
모든 실험은 상기 실험예 1과 동일하게 수행되었으며, PCR에 사용된 프라이머는 상기 표 1에 기재된 바와 같다. 단, 음성 대조군은 배지만 처리하거나, 5'-OH-Cont-GC-8bp를 처리하였고, 양성 대조군으로는 5'-OH-Bend-GC-8bp 및 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS를 처리하였다. 실험군으로는 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드를 처리하였다.
그 결과, ISG56의 발현 변화를 도 8에 그래프로 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 나선형 굽힘 구조를 가지며, 굽힘 구조를 형성하는 부분의 RNA 폴리뉴클레오티드를 형성하는 결합이 포스포로티오에이트로 치환된 긴 길이의 헤어핀을 갖는 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드가 ISG56의 발현을 유의적으로 증가시켰음을 확인하였다. 구체적으로, 5'-OH-Long_Bend-BPS는 5'-OH-Bend-GC-8bp와 비교하여 약 7배 정도 ISG56의 발현을 증가시켰다.
실험예 7. 포스포로티오에이트 결합을 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드 및 긴 길이의 헤어핀 RNA의 항바이러스 활성 확인
본 발명의 나선형 굽힘 구조를 갖는 RNA 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다.
7.1. 인플루엔자 A 바이러스의 준비
인플루엔자 A 바이러스/푸에토리코/8/34(H1N1)(PR8)(ATCC, 미국)를 10일간 배아화된(embryonated) 달걀에 감염시켜, 37℃에서 3일 동안 증폭시켰다. 증폭된 바이러스의 타이터(titer)는 플라크 어세이로 확인하였고, 바이러스를 -70℃에서 보관하였다.
구체적으로, 10% FBS(Gibco, 미국)가 포함된 MEM(minimum essential medium; Hyclone, 미국) 배지를 사용하여 배양한 MDCK(Madin-Darby canine kidney; ATCC, 미국) 세포주를 48-웰 플레이트에 웰 당 5x105 개의 세포가 되도록 분주하였다. 세포가 웰에 가득 찰 때까지 이를 배양한 뒤, 여기에 무혈청 MEM 배지에 10배로 계열희석(serial dilution)한 인플루엔자 A 바이러스를 100 ㎕ 첨가하여 세포를 감염시켰다. 감염된 세포를 37℃에서 1시간 동안 방치한 뒤, 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 여기에 0.5%의 카복시메틸셀룰로오즈(carboxymethylcellulose; Sigma, 미국) 및 2 ㎍/㎖의 TPCK-트립신(Sigma, 미국)이 첨가된 MEM 배지를 0.2 ㎖ 첨가하였다. 세포를 33℃에서 3일 동안 배양한 뒤, 생성된 플라크를 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 바이러스의 타이터를 결정하였다.
7.2. 항바이러스 활성 확인-(1)
10% FBS가 포함된 RPMI1640(Hyclone, 미국) 배지에서 배양한 A549(ATCC, 미국) 세포주를 웰 당 1x106 개가 되도록 6-웰 플레이트에 분주하였다. 다음날, 상기 세포에 시험군으로 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 또는 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드를 각각 10, 30 및 100 nM의 농도로 형질감염시켰다. 이때, 음성 대조군으로는 나선형 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 100 nM의 농도로 처리하였고, 양성 대조군으로는 0.1 ㎍/㎖의 폴리 I:C(polyinosine-polycytidylic acid) 또는 2 μM의 오셀타미비르(oseltamivir, OSV-C; Sigma, 미국)를 처리하였다. 형질감염은 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen, 미국)을 사용하여 수행하였다. 24시간 후, 세포 배양액을 제거하고, 상기 실험예 7.1.에서 준비한 인플루엔자 A 바이러스를 0.1 MOI로 감염시켰다. 이를 37℃에서 1시간 동안 방치한 뒤, 배지를 제거하고, 0.1 ㎍/㎖의 TPCK-트립신이 포함된 RPMI1640 배지를 첨가하여 세포를 배양하였다. 배양 1일 후, 웰에 0.3 ㎖의 M-PER 용액(Thermo Scientific, 미국)을 첨가하여 세포를 용해시키고, 세포 용해물을 사용하여 통상의 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, 세포 용해물에 포함된 단백질을 정량하여, 이를 웰 당 30 ㎍이 되도록 10% SDS-PAGE 젤에 로딩하여 전기영동 하였다. 전기영동 한 단백질을 PVDF 멤브레인(Immobilion-P membrane; Millipore, 미국)으로 옮기고, 5% BSA가 포함된 1xPBS를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 전처리하였다. 이를 1xPBS로 세척한 뒤, 1차 항체를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고, 2차 항체를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이때, 바이러스 NP 단백질의 검출을 위해 항-NP 항체(11675-MM03, Sino Biological, 중국) 및 HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG(Sigma-Aldrich, 미국)를 사용하였다. 한편, 바이러스 NS1 단백질의 검출을 위해 항-NS1 항체(sc-17596, Santa Cruz Biotechnology, 미국) 및 HRP-결합된 당나귀 항-염소 IgG(Sigma-Aldrich, 미국)를 사용하였다. 대조군으로서 β-액틴의 발현 수준을 확인하였는데, 이때, 항-β-액틴 항체(Sigma-Aldrich, 미국) 및 HRP-결합된 염소 항-마우스 IgG(Sigma-Aldrich, 미국)를 사용하였다. 단백질 밴드는 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce, 미국)를 사용하여 확인하였고, LAS-4000(Fujifilm, 일본) 이미지 분석기로 수득한 결과 이미지를 도 9A에 나타내었다.
그 결과, 도 9A에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 농도의존적으로 인플루엔자 A에 대한 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드는 10 nM의 낮은 농도에서도 양성대조군인 폴리 I:C와 동등한 수준으로 우수한 효과를 나타내었다.
7.3. 항바이러스 활성 확인-(2)
상기 실험예 7.2.와 동일한 방법으로 세포를 준비한 뒤, RNA 올리고뉴클레오티드를 형질감염시켰다. 이때, 음성 대조군으로는 나선형 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 100 nM의 농도로 처리하였고, 양성 대조군으로는 0.1 ㎍/㎖의 폴리 I:C(polyinosine-polycytidylic acid) 또는 10 μM의 오셀타미비르(oseltamivir, OSV-C; Sigma, 미국)를 처리하였다.
형질감염 24시간 후, 세포의 배양액을 제거하였다. 여기에 상기 실험예 7.1.에서 준비한 인플루엔자 A 바이러스를 100배 희석하여 감염시키고, 이를 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 다시 배지를 제거하고, 0.1 ㎍/㎖의 TPCK-트립신이 포함된 RPMI1640 배지를 첨가하여 세포를 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포 배양액을 상기 실험예 7.1.과 동일한 방법으로 MDCK 세포주에 감염시켜 바이러스의 타이터를 결정하였다.
그 결과, 크리스탈 바이올렛으로 염색된 세포의 사진 및 바이러스의 타이터를 도 9B에 나타내었다.
도 9B에서 나타난 바와 같이, 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS 및 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드가 농도 의존적으로 인플루엔자 A 바이러스에 대해 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 상기 웨스턴 블랏 결과와 마찬가지로 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드는 10 nM의 낮은 농도에서도 양성 대조군인 폴리 I:C와 동등한 수준으로 우수한 효과를 나타내었다.
7.4. 항바이러스 활성 확인-(3)
실험군으로 농도별 5'-OH-Long_Bend 또는 5'-OH-Long_Bend Short RNA 올리고뉴클레오티드를 처리한 것을 제외하고는, 상기 실험예 7.2.와 동일한 방법으로 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성을 확인하였다. 이때, 음성 대조군으로는 나선형 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp를 100 nM의 농도로 처리하였고, 양성 대조군으로는 100 nM의 5'-OH-Bend-GC-8bp-PS RNA 올리고뉴클레오티드를 첨가하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Long_Bend RNA 올리고뉴클레오티드는 10 nM 이상의 농도에서, 5'-OH-Long_Bend Short RNA 올리고뉴클레오티드는 100 nM의 농도에서 바이러스 단백질의 발현을 대조군보다 현저하게 억제함을 확인하였다.
7.5. 항바이러스 활성 확인-(4)
실험군으로 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드를 0.1, 1, 10 또는 100 mM의 농도로 처리한 것을 제외하고는, 상기 실험예 7.2.와 동일한 방법으로 본 발명에 따른 RNA 올리고뉴클레오티드의 항바이러스 활성을 확인하였다. 이때, 음성 대조군으로는 바이러스만 감염시키거나, 나선형 굽힘 구조를 갖지 않는 5'-OH-Cont-GC-8bp 및 5'-OH-Cont-GC-8bp-PS를 각각 100 nM의 농도로 첨가하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 5'-OH-Long_Bend-BPS RNA 올리고뉴클레오티드는 1 nM 이상의 농도에서 바이러스 단백질의 발현을 현저하게 억제함을 확인하였다. 이로부터 나선형 굽힘 구조를 갖는 본 발명의 RNA 올리고뉴클레오티드가 항바이러스제의 유효성분으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (30)

  1. RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘(helical bend) 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6는 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G이고(서열번호 3에 해당), 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, N6는 C(서열번호 4에 해당)인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  4. RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프(loop)로 연결되어 헤어핀(hairpin) 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6는 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G이고(서열번호 3에 해당), 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 N4는 C, N5는 G, N6는 C(서열번호 4에 해당)인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  7. 제4항에 있어서, 상기 루프가 적어도 4개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 루프가 UUCG 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  9. 제4항에 있어서, 상기 루프가 4개 내지 80개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 루프가 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하여 스템(stem) 구조를 갖고, 상기 스템 구조가 AU 염기쌍으로 이루어진 AU 모티프(motif)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  11. 제4항에 있어서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  12. RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G, N4는 C, N5는 G, 및 N6는 C(서열번호 18에 해당)인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  15. RNA 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항바이러스제로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 항바이러스제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1 내지 N6은 G 또는 C인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열에서 N1은 G, N2는 C, N3는 G, N4는 C, N5는 G, 및 N6는 C(서열번호 18에 해당)인 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  18. 제15항에 있어서, 상기 루프가 적어도 4개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 루프가 UUCG 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 이를 형성하는 포스포다이에스테르 결합 중 적어도 하나 이상이 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합 및 메틸포스포네이트 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합으로 변형된 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항바이러스제는 C형 간염 바이러스, 뎅기 바이러스, 급성 호흡기 증후군 바이러스, 메르스 코로나 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 소낭성 구내염 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, B형 간염 바이러스 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항바이러스제.
  22. RNA 올리고뉴클레오티드를 치료가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 바이러스성 질환의 치료방법.
  23. RNA 올리고뉴클레오티드를 치료가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 바이러스성 질환의 치료방법.
  24. RNA 올리고뉴클레오티드를 치료가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 바이러스성 질환의 치료방법.
  25. RNA 올리고뉴클레오티드를 치료가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, 바이러스성 질환의 치료방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상이 포유동물인 것을 특징으로 하는, 바이러스성 질환의 치료방법.
  27. 바이러스성 질환의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 RNA 올리고뉴클레오티드의 용도로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드의 용도.
  28. 바이러스성 질환의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 RNA 올리고뉴클레오티드의 용도로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 3'-말단과 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드의 용도.
  29. 바이러스성 질환의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 RNA 올리고뉴클레오티드의 용도로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드의 용도.
  30. 바이러스성 질환의 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 RNA 올리고뉴클레오티드의 용도로서, 상기 RNA 올리고뉴클레오티드가 서열번호 1로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3-3')과 서열번호 2로 표시되는 염기서열(5'-N4N5UUUGCN6-3')이 연결된 서열번호 17로 표시되는 염기서열(5'-N1GUAGAN2N3N4N5UUUGCN6-3') 2개가 서로 상보적으로 결합하여 이중가닥을 형성하고, 상기 이중가닥이 나선형 굽힘 구조를 가지며, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열의 3'-말단과 상기 서열번호 17로 표시되는 다른 하나의 염기서열의 5'-말단이 루프로 연결되어 헤어핀 구조를 갖고, 상기 서열번호 17로 표시되는 하나의 염기서열이 이의 5'-말단에 하이드록시기(OH)를 갖는, RNA 올리고뉴클레오티드의 용도.
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