WO2024019196A1 - 핵산 분자, 핵산 구조체, 및 이를 포함하는 면역 증진용 조성물 및 후천성 면역결핍 증후군 치료용 약학 조성물 - Google Patents

핵산 분자, 핵산 구조체, 및 이를 포함하는 면역 증진용 조성물 및 후천성 면역결핍 증후군 치료용 약학 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2024019196A1
WO2024019196A1 PCT/KR2022/010794 KR2022010794W WO2024019196A1 WO 2024019196 A1 WO2024019196 A1 WO 2024019196A1 KR 2022010794 W KR2022010794 W KR 2022010794W WO 2024019196 A1 WO2024019196 A1 WO 2024019196A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
u4cpg
cells
hiv
cpg
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/010794
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
곽민석
진준오
Original Assignee
부경대학교 산학협력단
영남대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 부경대학교 산학협력단, 영남대학교 산학협력단 filed Critical 부경대학교 산학협력단
Publication of WO2024019196A1 publication Critical patent/WO2024019196A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명의 핵산 분자는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 말단에 지질-변형된 우라실(Uracil)을 결합시켜 세포막을 더 잘 통과할 수 있으며, 자가 조립되는 성질로 미셀 모양으로 응집이 가능하여 약물 전달체가 필요하지 않다. 또한 핵산 분자의 자가 조립에 의한 핵산 구조체는 면역세포 활성화 효과가 우수하며, HIV(human immunodeficiency virus) 잠복기 역전시키는 효과를 가져 에이즈 치료에 효과적이다.

Description

핵산 분자, 핵산 구조체, 및 이를 포함하는 면역 증진용 조성물 및 후천성 면역결핍 증후군 치료용 약학 조성물
본 발명은 핵산 분자, 핵산 구조체, 및 이를 포함하는 면역증진용 조성물 및 후천성 면역결핍 증후군 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
HIV 감염은 전세계 인간 건강에 대한 주요 위협 중 하나이다. 1981년 이래로 전세계적으로 칠천팔백만 명이 넘는 사람들이 인간 면역결핍 바이러스에 감염된 것으로 추정된다. 이러한 감염된 개체의 거의 절반이 같은 기간 동안 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)으로 사망하였다(참조: UNAIDS, http://www.unaids.org/, 2015년 10월).
HIV 감염 치료법 중 항바이러스 치료법은 가장 중요한 치료법으로, 국내에서도 다양한 약제들의 조합으로 항바이러스 병용 치료가 활발하게 사용되고 있다. 항레트로바이러스 요법(ART)은 지난 수십년 동안 HIV/AIDS 환자에 대한 치료의 표준이었다. ART 약물은 HIV-1 게놈의 역전사, HIV-1 게놈의 통합, 및 감염성 바이러스 입자의 생성에 필요한 단백질 전구체의 단백질분해 절단을 억제하여 역전사효소(RT), 인테그라제(IN), 및 바이러스 프로테아제(PI)와 같은 내부 단백질을 표적으로 한다. ART 또는 ART의 다른 클래스의 조합을 이용한 치료는 결과적으로 HIV-1 복제를 억제하고 후속적으로 바이러스혈증을 대개 검출할 수 없는 수준(무바이러스혈증 상태)까지 감소시킨다. ART는 질병 진행의 통제 및 전세계적인 HIV 전염병의 억제에 있어 HIV환자에게 크게 도움이 되지만, 보통 엄격한 처방에 따라 환자가 매일 약을 복용해야 한다. 약물 독성, 요법에 충실히 따르지 않거나, 새로운 약물 내성으로 인해 매년 약 10%의 환자가 치료에 실패한다. 더 많은 HIV 환자가 정상적인 수명(80세 이상)을 살 수 있게 됨에 따라, 노화 및 약물-약물 상호 작용, 및 심혈관/신장/뼈 독성과 같은 만성 합병증이 특히 우려된다. HIV/AIDS 치료에 대한 경제적 부담은 아직 까지 줄어들지 않았다.
HIV는 숙주 게놈에 통합된 프로바이러스 DNA의 형태로 장기 휴식기 기억 CD4+ T세포 등을 잠복적으로 감염시킨다. 잠복 감염된 세포는 수십년 동안 생존하며, HIV-1 저장소로 간주되는 항상성 증식을 통해 줄기 세포처럼 자가 재생된다. HIV-1 저장소는 바이러스 단백질을 발현하지 않기 때문에 ART의 영향도 숙주 면역계의 영향도 받지 않는다. 그러나, 저장소 중 적은 비율의 세포는 알려지지 않은 메커니즘에 의해 무작위로 재활성화되고, 이 는 ART가 중단되면 바이러스혈증의 재발의 원인이 된다.
이와 같이, 현재의 치료법으로는 HIV 감염의 완치는 불가능하여, 그저 바이러스를 억제하고 면역기능을 회복시켜 유지시키는 등의 치료로 사망률을 감소시키는데 목적을 두고 있다. 따라서 손상된 면역체계를 회복시키고, 잠복되어 있는 바이러스를 근절하는 등의 치료제 개발이 필요하다.
본 발명은 핵산 분자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 핵산 구조체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 면역 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 서열의 말단에 Um(U는 하기 화학식 1로 표시됨. m은 1 내지 10의 정수)을 포함하는 핵산 분자:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022010794-appb-img-000001
(R은 탄소수 5 내지 20 개의 선형 혹은 가지형 알킬기임).
2. 위 1에 있어서, 상기 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 TLR9(toll-like receptor 9) 작용제(agonist)인, 핵산 분자.
3. 위 1에 있어서, 상기 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 서열길이가 15 nt 내지 30 nt 인, 핵산 분자.
4. 위 1에 있어서, 상기 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나의 서열을 포함하는 뉴클레오티드인, 핵산 분자.
5. 위 1의 핵산 분자 복수개가 자가 조립되어 이루어진, 핵산 구조체.
6. 위 5의 핵산 구조체를 포함하는 면역 증진용 조성물.
7. 위 5의 핵산 구조체를 포함하는 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 치료용 약학 조성물.
본 발명의 핵산 분자는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 말단에 지질 치환된 우라실(Uracil)을 결합시켜 세포막을 더 잘 통과할 수 있으며, 자가 조립되는 성질로 미셀 모양으로 응집이 가능하여 약물 전달체가 필요하지 않다. 또한 핵산 분자의 자가 조립에 의한 핵산 구조체는 면역세포 활성화 효과가 우수하며, HIV(human immunodeficiency virus) 잠복기 역전시키는 효과를 가져 후천성 면역결핍 증후군 치료에 효과적이다.
도 1은 CpG-ODN 통합된 DNA 기반 나노 입자인 U4CpG의 항-HIV 면역 촉진 과정에 대한 개략도이다.
도 2는 U4CpG의 특성을 확인한 것이다.
도 3은 물과 이온의 무작위 혼합물에서 U4CpG와 DOPC 이중층 사이의 상호 작용을 나타내는 모든 원자 MD 시뮬레이션이다.
도 4는 인간 pDC의 U4CpG의 흡수를 확인한 것이다.
도 5는 생체 외 U4CpG에 의한 인간 pDC의 활성화를 확인한 것이다.
도 6은 생체 외 U4CpG에 의한 NK 세포 활성화 유도를 확인한 것이다.
도 7은 U4CpG에 의한 pDC의 활성화가 NK 세포의 자극에 기여하는 것을 확인한 것이다.
도 8 및 9는 U4CpG에 의한 항 HIV 면역 유도를 확인한 것이다.
도 10 및 11은 U4CpG 및 U4GpC의 PAGE 정제 및 분석결과이다.
도 12는 PAGE 정제된 U4CpG 및 U4GpC의 MALDI-ToF mass spectra 결과이다(A: U4CpG, B: U4GpC).
도 13은 아가로스 겔 전기영동 분석결과이다.
도 14는 GpC 및 U4GpC의 정규화된 흡광도 및 CD 스펙트럼을 확인한 것이다.
도 15는 아가로스 겔 이미지로부터 DNA 밴드 강도를 계산하는 과정을 나타낸 것이다. 혈청 처리된 DNA의 아가로스 겔 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 분석하였다.
도 16은 U4CpG 미셀의 MD 시뮬레이션을 나타낸 것이다.
도 17은 DOPC 막에 도킹된 지질-DNA의 MD 시뮬레이션을 나타낸 것이다.
도 18은 Picogreen 존재하에 U4CpG 및 U4GpC의 ssDNA 및 ds DNA의 형광 스펙트럼을 확인한 것이다.
도 19는 U4CpG의 세포 흡수를 확인한 것이다.
도 20은 U4CpG에 의한 NK cell 활성화를 확인한 것이다.
도 21은 U4CpG에 의해 촉진된 전염증성 사이토카인의 상향 조절을 확인한 것이다.
도 22 및 23은 U4CpG의 마우스에서의 염증 및 간 독성 유발 여부를 확인한 것이다.
도 24는 U4CpG에 의한 HIV-1의 잠복기 역전을 확인한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 서열의 말단에 Um(U는 하기 화학식 1로 표시됨. m은 1 내지 10의 정수)을 포함한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022010794-appb-img-000002
(R은 탄소수 5 내지 20 개의 선형 혹은 가지형 알킬기임).
본 발명의 핵산 분자는 친수성 부분과 소수성 부분을 한 분자에 동시에 가져, 수계에서 여러 분자가 모여서 특정의 형태로 조립될 수 있는 것으로서, 친수성의 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(이하, CpG ODN으로 표기한다.) 서열의 말단에 지질 치환된 우라실(이하, U로 표기한다)을 반복적으로 포함하고(Um), 그 외에 추가적으로 염기를 더 포함하여 수계에서 자가 조립될 수 있으며, 이는 상당히 희석된 조건하에서도 구조적으로 안정한 형태이다.
상기 CpG ODN은 면역을 활성화시키는 면역 증가 물질로서, 예를 들어, TLR9(toll-like receptor 9) 작용제일 수 있다. 구체적으로, 상기 CpG ODN은 TLR9의 활성화를 통해 인간 pDC(수지상 세포) 및 NK cell(자연살해세포)을 자극하여 면역을 활성화시킬 수 있다.
상기 CpG ODN은 누클레오티드(NT) 서열길이가 예를 들어, 15 NT 내지 30 NT 또는 20 NT 내지 25 NT 일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 핵산 분자의 전체적 길이 및 양친매성을 고려하여 적절히 조절될 수 있다.
상기 CpG ODN은 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나의 서열을 포함하는 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CpG ODN은 종별로 그 서열이 상이하게 사용될 수 있으며, 인간의 경우, 예를 들어, 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 서열을 포함하는 뉴클레오티드를 사용할 수 있으며, 면역 활성화 효과, 핵산 분자의 전체적인 길이 및 양친매성을 고려하여 바람직하게는 서열번호 1의 서열을 포함하는 뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 또한, 소 또는 돼지의 경우, 예를 들어, 서열번호 12의 서열을 포함하는 뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 또한, 마우스의 경우, 예를 들어, 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 서열을 포함하는 뉴클레오티드를 사용할 수 있다.
상기 U는 상기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있으나, 우라실의 C5 부분을 치환하여 핵산 분자 전체에 소수성을 부여할 수 있는 것이라면, 그 화학적 구조는 통상의 기술자에 의해 적절한 변형이 가해질 수 있다. 예를 들어, U는 도데시닐-1-우라실일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 U가 알카이닐-1-우라실인 경우, 알카이닐에 결합된 알킬기의 탄소수는 예를 들어, 5 내지 20, 7 내지 18 또는 10 내지 15일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 상기 범위보다 적은 경우, 핵산 분자에 소수성을 충분히 부여하기 어렵고, 상기 범위보다 많은 경우, 사슬의 길이가 길어서 CpG ODN과의 결합 또는 자가 조립에 구조적 방해가 될 수 있다.
상기 Um에 있어서, m은 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11 또는 1 내지 10의 정수일 수 있으나, 핵산 분자의 전체적 길이 및 양친매성을 고려할 때, 바람직하게는 1 내지 10의 정수일 수 있다.
본 발명은 핵산 구조체에 관한 것이다.
본 발명의 핵산 구조체는 상기 핵산 분자 복수개가 자가 조립되어 이루어진 것이다.
핵산 분자에 관하여는 전술한 바와 같다.
핵산 구조체는 나노 크기의 입자일 수 있다. 예를 들어, 핵산 구조체는 직경이 10 내지 20 나노미터 또는 12 내지 15 나노미터인 입자일 수 있다.
본 발명의 핵산 구조체는 친수성의 CpG ODN의 서열 말단에 소수성의 Um을 포함하는 핵산 분자로 이루어진 것으로, 자가 조립되므로, 약물 전달체가 별도로 필요하지 않고, 미셀 모양으로 응집된 균일한 구조체일 수 있다. 또한, 지질 이중막 구조를 잘 통과할 수 있고, 세포에 보다 효율적으로 흡수되어, 면역 세포 활성화에 효과적이다.
본 발명은 상기 핵산 구조체를 포함하는 면역 증진용 조성물에 관한 것이다.
핵산 구조체에 관하여는 전술한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 면역 증진이 필요한 증상이 나타나는 질병에 사용되는 것이라면 특별히 제한되지 않으며 예를 들어, 면역 질환일 수 있다.
상기 면역 질환은 예를 들어, 루프스(Lupus), 류마티스 관절염(Reumatoid Arthritis), 건선(Psoriasis), 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Diseases), 알러지성 비염(Allergic Rhinitis), 천식(Asthma), 신장 섬유증(Renal Fibrosis), 심장 염증(Carditis), B 세포 림프종(B cell Lymphoma), 고혈압(Hypertension), 종양(Tumor), 암(Cancer), 호흡기 감염, 조류 독감, 베체트병, 다발성 근육염, 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피 피부염, 천식, 일차성 간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 류마티스열, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 미토콘드리아 관련 증후군 또는 궤양성 대장염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 추가적으로 용매, 별도의 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프로인트 (Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔, 및 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트(alum)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자에게 잘 알려진 면역 증진용 조성물 제조에 사용되는 공지의 물질을 더 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 점막 투여, 비강내 투여, NALT 내 투여, 경구적 투여, 직장내 투여, 폐내 투여, 기관지내 투여, 경막내 투여, 결막내 투여, 질내 투여, 요도내 투여, 유방의 유관으로의 투여 또는 흡입 투여용으로 사용될 수 있고, 또한 상기 조성물은 비경구적 투여, 피하 내 투여, 경피적 투여, 정맥내 투여, 피부내 투여 또는 근육내 투여에 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 상기 핵산 구조체를 포함하는 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
핵산 구조체에 관하여는 전술한 바와 같다.
본 발명의 약학 조성물은 면역 세포 활성화를 통한 HIV의 제거 및 HIV 잠복기 역전을 통해 AIDS를 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 핵산 구조체를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical;볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 구조체의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 인비보 동물모델 및 인비트로에서 효과적인 것으로 측정된 EC50을 기초로 계산될 수 있으며, 예를 들면 체중 1kg당 0.01 ㎍내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 AIDS의 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 선택적으로, 화학치료제, 항염증제, 항바이러스제 및/또는 면역조절제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
재료 및 방법
1. Ethics statement
이 연구는 헬싱키 선언에 명시된 원칙에 따라 수행되었다. PBMC는 Shanghai Public Health Clinical Center의 건강한 HIV 감염 기증자로부터 입수하였다. HIV PBMC는 바이러스 부하가 <50 copies/mL이고 CD4 수가 >350일 때 조합 항레트로바이러스 요법으로 치료받은 HIV 감염 환자(n = 6)로부터 수확되었다. Shanghai Public Health Clinical Center의 기관 검토 위원회는 이 연구를 승인하였다(IRB 번호: 2017-Y037). 30mL의 말초 혈액에 대해 모든 지원자로부터 서면 동의를 얻었다.
2. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 분리
PBMC는 건강한 기증자와 HIV-1 감염 환자의 혈액에서 얻었다. 간단히 말해서, 수확된 혈액(10mL)을 Histopaque-1077(5mL; Sigma-Aldrich, Missouri, U.S.A.) 위에 겹쳤다. 혈액을 1000 x g에서 40분 동안 원심분리한 다음, 버피 코트(<1.077g/cm3)를 수확하고 PBS로 세척하였다. 혈액의 양에 따라 앞서 언급한 분리를 반복하여 필요한 세포를 수집하였다.
3. U4CpG 및 U4GpC의 합성 및 제조
U4CpG(면역 자극 연성 NP) 및 U4GpC(대조군)는 폴리스티렌 고체 지지체(GE Healthcare)에서 50μmol 규모로 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기(Oligopilot 100 plus, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 사용하여 표준 디메톡시 트리틸(DMT) 커플링 주기를 통해 합성되었다. DMT-off 올리고는 55℃에서 밤새 배양된 암모니아에서 고체 지지체로부터 절단되었다. crude U4CpG 및 U4GpC는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 통해 정제되었다. 정제된 U4CpG 및 U4GpC는 PAGE를 변성시켜 분석하였다. 장기 보관 기간 동안 뉴클레아제가 없는 상태를 보장하기 위해 두 재료의 스톡 솔루션을 준비하였다. U4CpG 및 U4GpC 용액을 제조하기 위해 정제된 물질을 1 x 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4, 25℃)에 용해시켜 U4CpG 또는 U4GpC의 최종 농도(0.5, 1 및 5 ㎍/mL)를 조정한 다음 열순환기(Eppendorf, USA)를 사용하여 95℃에서 5분 동안 변성시킨 후 80℃에서 20℃로 120분 동안 어닐링하였다. 10 μL의 용액 분취량을 PBMC로 각각의 분석에 사용하였다.
4. 아가로스 겔 전기영동
DNA 물질은 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분석되었다. 아가로스 겔(1.5 또는 3.0%)을 0.5 x Mg-TBE(1mM MgCl2)에서 실행하고 SYBR™ Safe 염색 조건에서 겔 이미지를 얻었다.
5. Circular dichroism (CD) 분광법
DNA의 CD 스펙트럼은 J-1500 원형 이색성 분광광도계(JASCO, Japan)를 사용하여 25℃에서 측정되었다. DNA 샘플(1xPBS 중 5μM, pH 7.4 및 12.5mM MgCl2)은 95℃에서 5분 동안 변성시킨 후 80℃에서 20℃로 60분 동안 어닐링하여 준비하였다.
6. Transmission electron microscopy (TEM)
음성 염색 그리드는 1% 우라닐 아세테이트로 준비하였다. U4CpG(1×PBS 중 20μM, pH 7.4)의 이미지는 120kV에서 작동하는 JEOL-1400 Plus TEM(JEOL, Japan)으로 얻었다. U4CpG 미셀의 크기는 ImageJ 소프트웨어(NIH, USA)로 결정하였다.
7. ynamic light scattering (DLS)
U4CpG의 유체역학적 직경(1×PBS 중 20μM, pH 7.4)은 Zetasizer Nano-ZS90(Malvern Instruments Ltd., UK)을 사용하여 25℃에서 측정되었다.
8. Molecular dynamic (MD) 시뮬레이션
모든 시뮬레이션은 Gromacs 2018.1 시뮬레이션 패키지를 사용하여 수행되었다. coarse-grained (CG) 시뮬레이션의 경우 DNA와 물에 대해 MARTINI force field를 사용하였다. dodec-1-ynyl 단위에 대한 force field 매개변수는 이전 작업에서 얻었다. 시뮬레이션 동안 압력은 등방성 기압계를 사용하여 1 bar에서 Berendsen 알고리즘과 결합되었으며 압축률은 3 x 10-4 bar-1 이며 시간 상수는 4 ps였다. 시스템의 온도는 1ps의 시간 상수로 v-rescale 온도 조절기를 사용하여 300K에서 결합되었다. 모든 U4CpG는 하나의 온도 조절기 그룹에 연결되어 있고 물과 이온은 다른 그룹에 연결되어 있다. U4CpG 집합체의 초기 구조는 in-house python 코드로 구성되었다. U4CpGs는 30 x 30 x 30 nm3 큐빅 셀의 중앙에 배치되었고 물과 이온에 노출되었다. 모든 원자 시뮬레이션을 위해 지질과 DNA에 대해 CHARMM force field를 사용하였다. DNA의 초기 구조와 지질-DNA는 CHARMM을 사용하여 생성되었다. 각 DNA 및 지질-DNA 구조는 310K의 TIP3P 물에서 시뮬레이션되었으며 평형된 최종 구성은 이중층 시뮬레이션을 위한 시작 상태로 사용되었다. 이중층 구조는 CHARMM-GUI 멤브레인 빌더를 사용하여 생성되었으며 10ns동안 310K에서 평형화되었다. 마지막으로 486 DOPC, 3 lipid-DNA, 45 K+, 45 Cl-, 69 Na+ 및 59,104 TIP3P 물 분자로 구성된 복합 구조가 크기 13.1 x 13.0 x 14.1 nm3의 주기 상자에 만들어졌다. 지질-DNA는 초기에 지질-DNA의 중심과 이중층 사이의 z 방향으로 3.0 nm의 거리에 위치하였다. DNA 도킹에 대한 지질 변형의 영향을 조사하기 위해 변형되지 않은 DNA가 있는 이중층 시스템도 생성되었다. 반 데르 발스 상호작용은 힘 기반 스위칭 기능에 의해 10-12 Å 이상에서 부드럽게 꺼지고 장거리 정전기 상호작용은 ~1 Å 의 메쉬 크기로 입자-메시 Ewald 방법에 의해 계산되었다. NPxyPzT 앙상블에 Berendsen 온도 조절 장치를 적용하여 1bar의 압력과 310K의 온도를 유지하였다. 시뮬레이션은 2fs의 시간 간격으로 600ns 동안 수행되었다.
9. 혈청 존재 시 CpG 및 U4CpG의 안정성
10% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)에서 DNA 용액(2μL, 1x PBS 중 40μM, pH 7.4 및 2mM MgCl2)을 준비하였다. 용액을 37℃에서 배양하고 분취량(10μL)을 각각 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 11 및 50시간에 취하였다. 그런 다음 용액을 즉시 5 μL의 포름아미드와 혼합하였다. 포름아미드와 혼합된 모든 분취량은 아가로스 겔 전기영동으로 분석하기 전에 4℃에서 보관하였다.
10. PicoGreen 분석에 의한 혼성화 분석
CpG 또는 U4CpG 및 cDNA(1xPBS 중 15μM, pH 7.4 및 2mM MgCl2)의 혼합물을 준비하고 80℃내지 20℃에서 60분 동안 열처리하여 혼성화시켰다. 혼성화된 DNA 용액(0.5μM)을 25℃에서 5분 동안 PicoGreen 용액으로 염색하였다. 이어서, 형광 강도를 측정하였다.
11. FAM으로 표지된 U4CpG의 제조
U4CpG는 2mM MgCl2와 1xPBS(pH 7.4)의 존재하에 80℃~20℃에서 120분간 열처리하여 FAM-cDNA(complementary DNA, Bioneer Co., Korea) 1/2몰과 혼성화하였다.
12. 유세포 분석
PBMC를 Fc-차단 항체(Abs) 및 표지되지 않은 이소형 대조군 Ab와 함께 30분 동안 배양하였다(BioLegend, San Diego, CA, USA). 세포를 형광 표지된 모노클로날 Ab로 30분 동안 염색하였다. 다음으로, 세포를 PBS로 세척하고 BD LSRFortessa(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 분석하였다. 4', 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 전방 및 측방 산란 특성으로 염색하여 죽은 세포 및 세포 파편을 배제하였다.
13. pDC 활성화 분석
분리된 PBMC를 추가 30분 동안 항-CD83, 항-CD123 및 항-CD303 Ab로 염색하였다. 그런 다음 세포를 PBS로 세척하고 BD LSRFortessa(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 분석하였다. CD123+CD303+ 세포(생 백혈구 중)를 pDC로 정의하였다.
14. NK 세포 분석
분리된 PBMC를 추가 30분 동안 항-CD3, 항-CD56 및 항-CD69 Ab로 염색하였다. NK 세포 집단은 BD LSRFortessa(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 측정한 CD3-CD56+ 세포(생 백혈구 중)로 정의하였다.
15. 세포내 사이토카인 염색
PBMC는 U4CpG로 처리되었다. 처리 20시간 후, PBMC를 모넨신(monensin) 용액(BioLegend, San Diego, CA, USA)으로 4시간 동안 배양하였다. 세포를 표면 항체에 대해 염색하고 고정 완충액(BioLegend, San Diego, CA, USA)으로 고정하였다. 고정된 세포를 투과성 세척 완충액으로 재현탁시키고 5분 동안 300 x g에서 원심분리한 다음 실온에서 15분 동안 세포내 사이토카인에 대해 Ab로 염색하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 BD LSRFortessa(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 분석하였다. 이소형 대조군 IgG는 대조군 염색을 확립하기 위해 모든 실험에서 사용되었다.
16. ELISA 분석
인간 IFN-α, IFN-β1 및 CXCL10 ELISA 키트는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. IFN-γ ELISA 키트는 BioLegend(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 배양 배지는 획득한 키트를 사용하여 3중으로 모든 사이토카인의 농도를 측정하는 데 사용되었다. PBMC는 ART-처리된 HIV-1 환자 혈액에서 수확되었다. PBMC를 3일 동안 표시된 NP와 함께 배양한 다음, 배양 배지에서 HIV-1 p24의 수준과 PBMC의 용해물을 중국 허베이 의과대학의 생물의학 공학 센터의 HIV-1 p24 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.
17. 세포 분리 및 제거(Cell isolation and depletion)
pDC, mDC, T, B 및 NK 세포는 면역 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 PBMC에서 분리되었다. 면역 세포는 비오틴으로 표지되지 않은 세포의 음성 선택을 통해 분리되었다. 세포 분리의 순도는 유세포 분석에 의해 결정되었으며 세포에 대해 96% 이상이었다. PBMC에서 pDC, cDC, T 및 NK 세포의 제거는 표지된 세포가 자기 컬럼을 통해 제거된 비오틴 접합 인간 항-CD303(클론: 201A), 항-CD11c(클론: 3.9), 항-CD3(클론: OKT3) 및 항-CD49b(클론 : DX5) Abs, (BioLegend, San Diego, CA, USA)에 의해 달성되었다. CD19+CD123- 세포는 B 세포로 정의되었고 세포 분류기(FACSAria II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에 의해 제거되었다. 제거 효율은 유세포 분석에 의해 측정되었으며 두 세포 유형 모두에 대해 PBMC에서 95% 이상이었다.
18. U1 세포에서 HIV-1 잠복기의 역전
잠복 감염 U1 세포를 96웰 플레이트에서 RPMI-1640로 배양하였다. 건강한 기증자의 PBMC를 U4CpG로 3일 동안 배양하고, 배양 배지를 수확하였다. U1 세포(0.2 x 105 세포/웰)를 3일 동안 PBMC 배양 배지와 함께 3중으로 배양하였다. 방출된 바이러스는 1% Empigen(Albright & Wilson UK Ltd.)으로 비활성화되었고, 배양 배지의 바이러스 수준은 HIV-1 p24 ELISA 키트(Biomedical Engineering Centre, Hebei Medical University, China)를 사용하여 측정되었다.
19. 간 독성 분석
C57BL/6 마우스에 PBS, U4T, 2.5 mg/kg murine CpG, murine U4CpG, 인간 CpG 또는 인간 U4CpG를 각각 복강내(i.p.) 주사하였다. 각 처리 후 24시간 후에 혈청을 수확하였다. 혈청에서 alanine aminotransferase 활성 (ALT)의 수준은 ALT 활성 분석 키트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 3중으로 분석되었다. 다른 장기의 경우 간, 비장, 폐, 신장 및 결장의 파라핀 절편에서 염증 조직이 각각 주의 깊게 관찰되었다.
20. 통계 분석
모든 결과에 대해 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)를 계산하였다. 데이터는 ANOVA에 이어 GraphPad Prism 4에서 Tukey 다중 비교 테스트로 분석되었다. P 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
결과
1. 연성 NP를 포함하는 CpG의 합성 및 특성화
1-undecyne 사슬을 운반하는 소수성 우라실 단위로 직접 기능화된 CpG 모티프의 작용을 조사하였다. 따라서 U4CpG(5'-UUU U GG GGG ACG ATC GTC GGG GGG-3', 기울임꼴은 ODN2216, CpG를 나타냄) 및 U4GpC(5'-UUU U GG GGG AGC ATG CTC GGG GGG-3', 기울임꼴은 ODN2243 서열 (GpC), ODN2216에 대한 대조군)을 나타낸다. 밑줄 친 U 문자는 소수성 작용기를 갖는 연속적인 우라실 단위를 나타낸다(도 1, 왼쪽 위). 변형된 DNA의 PAGE 정제 후(도 10 및 11), 분자량은 matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-ToF)에 의해 결정되었다(도 12). 아가로스 겔 이미지는 원시 대조군 DNA에 비해 전기 영동 이동성이 낮은 개별 밴드를 기반으로 하는 U4CpG 및 U4GpC의 성공적인 합성을 보여준다(도 13). 예상대로 225 nm 및 280 nm에서 지질 DNA(U4CpG 및 U4GpC)의 흡수는 원시 CpG 및 GpC에 비해 더 높았으며(도 2A 및 14), 이는 지질-변형된 DNA의 핵염기의 방향족 시스템 확장으로 인한 것이다. CpG의 5' 말단과 3' 말단 모두에 G가 풍부한 서열로 인해 DNA는 Hoogsteen 염기쌍에 의해 G-quadruplex 2차 구조를 유도한다. CpG ODN에서 poly-G의 존재는 세포 흡수 효율을 향상시키는 것으로 보고되었다. DNA의 2차 구조는 원형 이색성(CD) 스펙트럼을 측정하여 특성화되었다. 도 2A와 14에서 U4CpG와 원시 CpG의 CD 스펙트럼은 240 및 260nm 부근에서 음 및 양의 피크를 나타내었으며, U4CpG의 경우 추가 4개 뉴클레오티드로 인해 약간의 저변색성 이동이 있었다. 이 CD 스펙트럼은 CpG와 U4CpG가 G-quadruplex 구조를 형성함을 나타낸다. 형태학적 특성화를 위해 U4CpG를 투과 전자 현미경(TEM) 및 동적 광산란(DLS)으로 분석하였다. U4CpG의 둥근 모양은 TEM 현미경 사진에서 관찰되었으며(도 2B) 미셀 구조는 직경 13.8 ± 1.6 nm의 좁은 크기 분포를 나타났다(도 2C). DLS 측정에 의해 결정된 유체역학적 직경은 d = 14.5 ± 3.2 nm였다(도 2D). TEM과 DLS로 얻은 크기 분석은 잘 일치하였다. 투여 후 물질의 안정성을 시험하고 분석할 때, 뉴클레아제 분해와 관련하여 U4CpG의 소수성 단위로 변형(22.78시간)은 원래의 CpG(9.40시간)에 비해 반감기가 약 2.5배 증가하는 결과를 가져왔다(도 2E, 15 및 표 1). 결과는 고밀도 응집으로 인한 뉴클레아제의 입체 장애에 기인하고 장애는 생물학적 배지에서 U4CpG에 대한 뉴클레아제 내성을 허용한다. 몇 개월 동안 4 ℃ 미만의 뉴클레아제가 없는 보관 조건에서 전기 영동과 UV 흡광도 모두에서 차이가 없음을 확인하였다. 따라서 이러한 결과는 U4CpG가 성공적으로 응집되어 수성 매질에서 구형 NP를 형성하고(도 2B-D) U4CpG로만 구성된 구형 NP가 면역학적 분석에 매우 적합한 재료임을 시사한다(도 2E).
CpG U4CpG
Time (h) Intensity (a.u.) Intensity ratio (%) Intensity (a.u.) Intensity ratio (%)
0 26497.697 100 14777.874 100
1 15620.856 58.95 11838.874 80.11
2 24302.777 91.72 13778.217 93.24
3 22330.706 84.27 13366.095 90.45
4 21247.342 80.19 12707.752 85.99
6 22079.756 83.33 14374.803 97.27
8 13175.007 49.72 9140.095 61.85
11 7991.329 30.16 10305.409 69.74
50 4164.907 15.72 4279.539 28.96
2. 미셀(micelle) 형태의 분자 역학(MD) 시뮬레이션 및 멤브레인 도킹
U4CpG의 자기조립 구조(도 2F 및 16)와 지질-DNA와 세포막 사이의 상호작용을 조사하기 위해 MD 시뮬레이션을 수행하였다. U4CpG는 4개의 지질화된 우라실이 있는 총 24개의 염기로 구성되며 보고된 DNA 양친매성체(RHLB = 4.5)와 비교하여 유사한 친수성-/친유성-염기 균형 비율(RHLB = 5)을 갖는다. 따라서 CG MD 시뮬레이션 연구에서 보고된 응집 수(Nagg = 24)를 U4CpG 미셀 모델에 적용하였다. 완전히 확장된 24개의 U4CpG 분자는 코어 쪽으로 지질화된 염기가 위치했고 124,402개의 물 비드(497,608개의 실제 물 분자)와 522개의 나트륨 이온으로 용매화되었다. 평형 상태를 확인하기 위해 도 16A와 같이 용매 접근 가능한 표면적(SASA)의 시간 변화를 분석하였다. 150ns 후 SASA는 약 1130nm2의 일정한 값에 도달했고 나머지 50ns 궤적을 사용하여 U4CpG의 자가 조립을 분석하였다. 첫째, 미셀의 전체 크기(d = 14.4 nm)는 실험 TEM 및 DLS 데이터와 잘 일치하였다. 다음으로, U4CpG 미셀의 형태를 조사하기 위해 지질, DNA backbone 및 물의 방사형 밀도 프로파일을 계산하였다. 지질 그룹과 DNA backbone의 프로파일은 명확한 피크를 보여 소수성 지질 코어가 친수성 DNA로 둘러싸여 있음을 나타낸다. 흥미롭게도 밀도 프로파일에서 U4CpG 미셀의 코어 크기를 지질 변형 우라실이 있는 미셀 나노입자의 경우 처음인 직경 6nm 추정할 수 있었다. 농도가 더 낮아지거나 다른 초분자 상호작용이 어딘가에서 발생할 때 이러한 지질-DNA 응집체가 결국 여러 단위체로 해리될 것이라고 추측하였다.
ODN 서열과 지질 DNA의 도킹이 면역 자극과 같은 생물학적 활동에서 중요한 역할을 할 수 있다고 가정하였다. 막과 지질-DNA, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) 이중층 및 우라실에 접합된 지질 꼬리(-C12H21)를 가진 지질-DNA 가닥 사이의 상호 작용을 각각 계산적으로 관찰하기 위해 모델 시스템(도 17A 및 17B) 및 시스템은 600ns 동안 310.15K에서 시뮬레이션되었다. 모델 시스템의 대부분의 복제본에서 시뮬레이션 시간 동안 원시 DNA가 DOPC 이중층에서 도킹되지 않은 채로 유지되는 동안 지질 도킹이 자주 발생한다는 것을 발견하였다(도 17C). DOPC 이중층 내의 지질 좌표가 포지티브 도킹(도 17D의 원)으로 표시된 대표적인 MD 시뮬레이션 궤적을 분석했으며, 각 지질 꼬리의 CoM(도 17E)은 지질 위치에 대해 사용되고, DOPC의 질소(도 17D의 표면)는 이중층-물 인터페이스에 대해 사용되었다(도 17F). 도 3B는 100ns 시간 규모에 대한 대표적인 도킹을 나타내며, 여기서 각 분자는 5' 말단에 4개의 연속 지질 꼬리를 갖는 3개의 U4CpG 가닥이 시뮬레이션 큐브에 존재한다. 시뮬레이션 직후(~3ns, 보라색 궤적 참조), 하나의 U4CpG에서 두 지질의 자발적인 체류가 DOPC 이중층에 발생하고 기록된 전체 시간 동안 도킹이 안정적이었다. 지질의 다른 도킹은 50ns(녹색 선 참조)에서 발생하였다. 이어 동일한 분자에 세 개의 지질이 다시 도킹된다. 흥미롭게도 녹색으로 표시된 분자는 보라색 분자에 비해 안정화 시간이 더 오래 걸렸다. 한 번에 세 개의 지질을 도킹하면 계면 에너지를 최소화하기 위해 더 긴 체류 기간(최대 15ns)이 필요하다고 추측하였다. 완전히 도킹된 꼬리는 몇 가지 변동을 제외하고 전체 시뮬레이션 시간 동안 도킹 해제된 적이 없었다(500ns, 도 17E). 더 긴 시뮬레이션 시간을 분석하는 동안 보라색으로 표시된 U4CpG는 580ns 부근에서 지질의 추가 도킹을 나타내었고 도킹(3개 지질)은 기록된 나머지 시간 동안 안정적으로 유지되었다. 이러한 시뮬레이션 결과, DOPC 이중층에 U4CpG의 지질 꼬리의 자발적이고 안정적인 도킹은 인간 혈액 샘플로 생체 외 연구를 수행하도록 영감을 주었고, CpG 함유 엔도솜 형성과 혈액 세포에서 TLR9를 통한 결과적인 면역 자극 향상이 예상되었다.
3. 생체 외 인간 pDC에 대한 세포 흡수
인간 pDC에 의한 U4CpG 흡수의 평가를 위해, U4CpG를 5' 말단에서 FAM에 연결된 ss cDNA(FAMcDNA)와 혼성화시켰다. CpG 또는 U4CpG와 cDNA 간의 혼성화는 이중 가닥 DNA를 식별할 수 있는 PicoGreen 이중 가닥(ds) DNA 분석을 사용하여 평가되었다. 도 18에서 ds CpG 및 ds U4CpG의 형광 강도는 ss CpG 또는 ss U4CpG에 비해 각각 83.05% 및 91.12% 증가하였다. 이러한 결과는 ss CpG 및 ss U4CpG 둘 다 성공적으로 cDNA와 혼성화되었음을 나타낸다. 즉, U4CpG는 FAM-cDNA와의 혼성화에 의해 적절하게 표지될 수 있고 pDC에서 세포내이입을 검출하는 데 사용할 수 있다. PBMC의 인간 혈액 pDC, mDC 및 단핵구/대식세포는 도 4A와 같이 정의되었으며 결과는 pDC가 PBS-, CpG- 및 GpC- 처리된 대조군과 비교하여 U4CpG 및 U4GpC를 실질적으로 흡수하는 것으로 나타났다(도 4B 및 도 19A). pDC와 대조적으로, mDC, 단핵구/대식세포, B 세포, T 세포 및 NK 세포는 U4CpG를 효율적으로 흡수하지 못했다(도 4B, 4C, 19B 및 19C). 이러한 데이터는 U4CpG가 인간 혈액 pDC에 효율적으로 전달됨을 나타낸다.
4. U4CpG에 의한 인간 혈액 pDC의 활성화
인간 혈액 pDC가 U4CpG를 흡수했기 때문에 다음으로 U4CpG가 pDC의 활성화를 유도할 수 있는지 여부를 조사하였다. PBMC에서 1㎍/mL의 U4CpG로 처리하면 pDC에서 IFN-α의 세포 내 생산이 현저하게 증가했으며, 이는 5㎍/mL의 CpG로 처리한 경우보다 높았다(도 5A). pDC 배양 배지에서 IFN-α 및 IFN-β1의 농도도 U4CpG에 의해 유의하게 증가하였다(도 5B). 또한, 배양 배지에서 IFN-γ 및 CXCL10 수준은 U4CpG에 의해 상향 조절되었다(도 5C 및 D). 인간 혈액 DC에 대한 활성화 마커인 CD83의 발현 수준도 U4CpG 처리에 의해 실질적으로 상승하였다. U4GpC는 pDC에 의해 흡수될 수 있지만, I형 IFN 및 CD83 발현은 PBS 처리에 비해 증가하지 않았다(도 5E). 더욱이, 1㎍/mL U4CpG에 의한 pDC 활성화 유도 및 사이토카인 생성은 5㎍/mL CpG를 사용한 처리보다 훨씬 더 강력하였다. 따라서 이러한 데이터는 U4CpG가 pDC의 활성화를 유도하고 pDC에 대한 자극 효과가 CpG 단독 처리보다 강함을 시사한다.
5. U4CpG에 의한 자연살해(NK) 세포 활성화 유도
CpG-ODN은 NK 세포를 활성화할 수 있기 때문에 U4CpG가 인간 혈액 NK 세포의 활성화에 미치는 영향을 평가하였다. 1 ㎍/mL U4CpG 처리는 처리 24시간 후 PBMC에서 NK 세포의 빈도와 수에서 상당한 증가를 유도하였다(도 6A). 더욱이, NK 세포는 PBS 처리 대조군과 비교할 때 NK 세포의 활성화 마커인 CD69를 더 높은 수준으로 발현하였다(도 6B 및 20A). 세포내 IFN-γ 생산은 또한 U4CpG 처리에 의해 극적으로 상향조절되었다(도 6C 및 20B). pDC 활성화와 일치하여 NK 세포 활성화를 유도하는 CpG의 효율성은 U4CpG보다 훨씬 낮았다. 또한, U4CpG의 처리는 PBMC에서 전염증성 사이토카인 생성을 촉진시켰는데, 이는 CpG에 의해 유도된 것보다 훨씬 더 높았다(도 21). 다음으로, U4CpG의 처리가 말초 조직에서 독성 및 원치 않는 염증을 유발하는지 여부를 조사하였다. 도 22에 나타낸 바와 같이, murine과 인간 U4CpG를 주사한 마우스는 말초 조직에서 어떠한 염증도 유발하지 않았다. 또한, U4CpG에 의해 간 독성이 상승하지 않았다(도 23). 따라서 이러한 데이터는 U4CpG가 간 독성 및 조직 염증 없이 인간 혈액 NK 세포의 활성화를 촉진할 수 있음을 시사한다.
6. U4CpG에 의한 pDC 및 NK 세포의 직접 활성화
활성화된 면역 세포는 이러한 세포의 활성화를 유도하기 위해 다른 면역 세포와 통신하고 상호 작용하기 때문에 U4CpG가 이러한 세포를 직접 활성화할 수 있는지 여부를 분리된 pDC, mDC, B 세포, T 세포 또는 NK 세포에서 U4CpG 효과를 조사하였다. 표시된 면역 세포를 세포 분리 키트를 사용하여 PBMC에서 분리하고 PBS 또는 U4CpG로 24시간 동안 처리하였다. I형 IFN 수준은 U4CpG로 처리된 pDC 배양 배지에서 현저하게 증가된 반면, 분리된 다른 면역 세포는 I형 IFN을 생성하지 않았다(도 7A). I형 IFN의 생산 수준과 대조적으로, IFN-γ의 생산 수준은 U4CpG로 처리된 NK 세포 배양 배지에서 유의하게 상향조절된 반면, 다른 분리된 면역 세포는 U4CpG에 반응하여 IFN-γ를 생산하지 않았다(도 7B). 따라서 이러한 데이터는 U4CpG가 pDC와 NK 세포를 직접 자극함을 나타낸다.
I형 IFN이 NK 세포에 의한 IFN-γ 생산에 기여하기 때문에, NK 세포에서 IFN-γ 생산이 U4CpG에 의해 유도된 I형 IFN에 의존하는지 여부를 조사하였다. pDC가 결핍된 PBMC는 U4CpG로 처리될 때 I형 IFN을 생성하지 않은 반면, mDC, B, T 또는 NK 세포가 결핍된 PBMC는 상당한 수준의 I형 IFN을 생성하여 pDC가 I형 IFN의 주요 생산자임을 나타낸다(도 7C). 더욱이, U4CpG 처리 후 PBMC의 IFN-γ 생산은 NK 세포가 고갈되었을 때 유의하게 감소하였다(도 7D). 흥미롭게도, U4CpG 처리 후 생성된 IFN-γ의 수준은 총 PBMC와 비교하여 pDC가 고갈되었을 때 부분적으로 감소했으며(도 7D), 이는 pDC도 IFN-γ 생성에 기여했음을 나타낸다. 또한, U4CpG 처리 후 NK 세포에서 IFN-γ의 상향 조절은 pDC와 NK 세포의 공동 배양에 의해 극적으로 증가하였다(도 7E). 따라서 이러한 데이터는 pDC에 의한 Type I IFN의 U4CpG 유도 생성이 NK 세포에서 IFN-γ 생성에 기여함을 시사한다.
7. U4CpG에 의한 항 HIV-1 효과 및 HIV-1 잠복기의 역전
pDC와 NK 세포는 항 HIV-1 면역 및 HIV-1 잠복기의 역전에 기여하는 것으로 잘 알려져 있다. U4CpG가 pDC와 NK 세포의 활성화를 유도했음을 보여주는 데이터는 U4CpG가 HIV에 감염된 환자 PBMC에서 면역 세포 활성화를 유도하는 효과를 평가하도록 촉구하였다. U4CpG 처리는 pDC에서 세포 내 IFN-α 생산 및 CD83 발현의 상당한 상향 조절을 촉진하였다(도 8A). 더욱이, HIV-감염 환자 PBMC의 NK 세포는 대조군과 비교하여 U4CpG 처리 후 더 높은 수준의 CD69를 발현하고 더 많은 세포내 IFN-γ를 생성하였다(도 8B). 또한, 배양 배지에서 I형 IFN, IFN-γ 및 CXCL10의 농도는 U4CpG 처리 후 유의하게 상승한 반면, GpC 및 U4GpC는 이러한 분자의 생산을 유도하지 않았다(도 9A). 건강한 기증자 PBMC에서 pDC 및 NK 세포 활성화와 일치하게, HIV에 감염된 환자 PBMC에서 U4CpG에 의해 유도된 pDC 및 NK 세포의 활성화는 CpG 단독으로 유도된 것보다 훨씬 더 강력하였다. 이러한 데이터는 U4CpG가 HIV에 감염된 환자에서 pDC 및 NK 세포 활성화를 유도할 수 있음을 시사한다.
U4CpG는 HIV 감염 환자의 면역 세포 활성화를 촉진할 수 있기 때문에 U4CpG가 항 HIV-1 효과와 잠복기 역전을 촉진할 수 있는지 여부를 다음으로 조사하였다. HIV 감염 환자의 PBMC를 PBS, GpC, U4GpC, CpG 또는 U4CpG와 함께 3일 동안 배양하고 배양 배지 및 세포 용해물의 HIV p24 수준을 측정하였다. 배양 배지와 세포 용해물 모두에서 HIV p24의 수준은 U4CpG 처리에 의해 유의하게 감소한 반면, 다른 처리는 HIV p24 수준에 영향을 미치지 않았다(도 9B). 더욱이, U4CpG로 처리된 건강한 기증자로부터의 PBMC의 배양 배지는 HIV-1 잠복 세포주 U1에서 세포외 HIV-1 p24 수준의 극적인 증가를 유도했는데, 이는 U4CpG 처리 배양 배지가 HIV-1의 잠복 역전을 유도함을 나타낸다(도 9C). U1 세포에서 U4CpG로 직접 처리해도 배지에서 HIV-1 p24의 수준은 변경되지 않았다(도 24). 따라서 이러한 데이터는 U4CpG로 유도된 면역 활성화가 HIV-1을 근절할 수 있음을 보여준다.

Claims (7)

  1. CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 서열의 말단에 Um(U는 하기 화학식 1로 표시됨. m은 1 내지 10의 정수)을 포함하는 핵산 분자:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022010794-appb-img-000003
    (R은 탄소수 5 내지 20 개의 선형 혹은 가지형 알킬기임).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 TLR9(toll-like receptor 9) 작용제(agonist)인, 핵산 분자.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 서열길이가 15 nt 내지 30 nt 인, 핵산 분자.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나의 서열을 포함하는 뉴클레오티드인, 핵산 분자.
  5. 청구항 1의 핵산 분자 복수개가 자가 조립되어 이루어진, 핵산 구조체.
  6. 청구항 5의 핵산 구조체를 포함하는 면역 증진용 조성물.
  7. 청구항 5의 핵산 구조체를 포함하는 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 치료용 약학 조성물.
PCT/KR2022/010794 2022-07-21 2022-07-22 핵산 분자, 핵산 구조체, 및 이를 포함하는 면역 증진용 조성물 및 후천성 면역결핍 증후군 치료용 약학 조성물 WO2024019196A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2022-0090422 2022-07-21
KR1020220090422A KR20240013940A (ko) 2022-07-21 2022-07-21 핵산 분자, 핵산 구조체, 및 이를 포함하는 면역 증진용 조성물 및 후천성 면역결핍 증후군 치료용 약학 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024019196A1 true WO2024019196A1 (ko) 2024-01-25

Family

ID=89617969

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/010794 WO2024019196A1 (ko) 2022-07-21 2022-07-22 핵산 분자, 핵산 구조체, 및 이를 포함하는 면역 증진용 조성물 및 후천성 면역결핍 증후군 치료용 약학 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20240013940A (ko)
WO (1) WO2024019196A1 (ko)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100532542B1 (ko) 2003-12-15 2005-12-01 주식회사 코미팜 아르세닉산, 메타아르세나이트 또는 이들의 약제학적허용가능한 염을 함유한 에이즈 예방 및 치료용 약제 조성물

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIN JUN-O; KIM HAEJOO; HUH YANG HOON; HERRMANN ANDREAS; KWAK MINSEOK: "Soft matter DNA nanoparticles hybridized with CpG motifs and peptide nucleic acids enable immunological treatment of cancer", JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 315, 19 October 2019 (2019-10-19), AMSTERDAM, NL , pages 76 - 84, XP085936014, ISSN: 0168-3659, DOI: 10.1016/j.jconrel.2019.09.013 *
KIM HAEJOO; ZHANG WEI; HWANG JUYOUNG; AN EUN-KOUNG; CHOI YEOL KYO; MOON EUNYOUNG; LOZNIK MARK; HUH YANG HOON; HERRMANN ANDREAS; KW: "Carrier-free micellar CpG interacting with cell membrane for enhanced immunological treatment of HIV-1", BIOMATERIALS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 277, 27 August 2021 (2021-08-27), AMSTERDAM, NL , XP086797459, ISSN: 0142-9612, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2021.121081 *
LI XIAOWEI, FENG KEJUN, LI LONG, YANG LU, PAN XIAOSHU, YAZD HODA SAFARI, CUI CHENG, LI JUAN, MOROZ LEONID, SUN YUJIA, WANG BANG, L: "Lipid–oligonucleotide conjugates for bioapplications", NATIONAL SCIENCE REVIEW, vol. 7, no. 12, 18 December 2020 (2020-12-18), pages 1933 - 1953, XP093131138, ISSN: 2095-5138, DOI: 10.1093/nsr/nwaa161 *
PRIYA AGGARWAL, R.M. PANDEY, PRADEEP SETH: "Augmentation of HIV-1 Subtype C Vaccine Constructs Induced Immune Response in Mice by CpG Motif 1826-ODN", VIRAL IMMUNOLOGY., MARY ANN LIEBERT, INC., NEW YORK., US, vol. 18, no. 1, 1 March 2005 (2005-03-01), US , pages 213 - 223, XP055326305, ISSN: 0882-8245, DOI: 10.1089/vim.2005.18.213 *
TOMESCU COSTIN, CHEHIMI JIHED, MAINO VERNON C., MONTANER LUIS J.: "NK Cell Lysis of HIV-1-Infected Autologous CD4 Primary T Cells: Requirement for IFN-Mediated NK Activation by Plasmacytoid Dendritic Cells", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, WILLIAMS & WILKINS CO., US, vol. 179, no. 4, 15 August 2007 (2007-08-15), US , pages 2097 - 2104, XP093131167, ISSN: 0022-1767, DOI: 10.4049/jimmunol.179.4.2097 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20240013940A (ko) 2024-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Harris Autophagy and cytokines
WO2018097540A2 (ko) 무혈청면역세포배양용 배지첨가키트, 상기 키트를 이용한 면역세포배양방법, 상기 키트 또는 배양방법에 의해 얻어진 무혈청면역세포배양액 및 상기 배양액을 포함하는 화장료조성물
RU2007101039A (ru) Иммуностимулирующие олигонуклеотидные мультимеры
US10391166B2 (en) Short oligonucleotides as vaccine adjuvants and therapeutic agents
US20110038888A1 (en) Adjuvant compositions comprising poly-ic and a cationic polymer
EP3384938A1 (en) Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2019103541A1 (ko) 그래핀 나노구조체를 포함하는 항염증용 조성물
KR20100126390A (ko) 톨-유사 수용체 3의 선택적인 작용제
AU2014205544B2 (en) Immune regulatory oligonucleotide (IRO) compounds to modulate toll-like receptor based immune response
WO2024019196A1 (ko) 핵산 분자, 핵산 구조체, 및 이를 포함하는 면역 증진용 조성물 및 후천성 면역결핍 증후군 치료용 약학 조성물
Kim et al. Carrier-free micellar CpG interacting with cell membrane for enhanced immunological treatment of HIV-1
WO2007030602A2 (en) Treatment of b cells with il-21 and b cell activators induces granzyme b production
US10975126B1 (en) MERS-CoV inhibitor peptides
AU2007314649B2 (en) Broad spectrum immune and antiviral gene modulation by oral interferon
CA2644670A1 (en) Broad spectrum immune and antiviral gene modulation by oral interferon
WO2006108358A1 (fr) UTILISATION ANTIVIRALE D’OLIGODESOXYNUCLEOTIDES ARTIFICIELS A UN SEUL BRIN CONTENANT UN CpG EN COMBINAISON AVEC LA RIBAVIRINE
EP2236141A1 (en) siDNA oligonucleotide as antiviral agent against Herpes virus Infections
AU681350B2 (en) Inhibitiion of retrovirus infection
MXPA97004024A (en) Composition and method for the prevention and treatment of infection with vi
WO2016204515A1 (ko) STAT3 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도
CN115697394A (zh) 病毒核蛋白和包含其的制剂
WO2015194710A1 (ko) Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20040047749A (ko) 올리고뉴클레오타이드 조성물 및 세포 분화 유도시 이의용도
WO2012133997A1 (ko) 폴리소르비톨계 삼투압적 활성 전달체 및 이를 이용한 유전자 치료
KR100364938B1 (ko) 만성 씨형 간염의 치료를 위한 인테페론-알파와 아만타딘을 함유한 약제

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22952045

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1