FR2947839A1

FR2947839A1 - Nouveaux agents antibacteriens

Info

Publication number: FR2947839A1
Application number: FR0954782A
Authority: FR
Inventors: Herbert Edwin David Lane; Franck Pasta; Fanny Marie Passot
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2009-07-09
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2011-01-14

Abstract

La présente invention concerne un acide nucléique isolé comprenant la séquence nucléotidique d'un centromère de réplicon bactérien ou un fragment de celle-ci pour son utilisation comme médicament.

Description

Nouveaux agents antibactériens

Domaine de l'invention La présente invention concerne le traitement d'infections bactériennes. 5 Arrière-plan technique La mucoviscidose, aussi appelée fibrose kystique, est une maladie génétique, affectant les épithéliums glandulaires de nombreux organes. C'est la maladie génétique létale à transmission autosomique récessive la plus fréquente 10 dans les populations caucasiennes. Elle est liée à des mutations du gène CFTR sur le chromosome 7, entraînant une altération de la protéine CFTR, dont la fonction est de réguler le transport du chlore à travers les membranes cellulaires. Son dysfonctionnement provoque une augmentation de la viscosité du mucus et son accumulation dans les voies respiratoires et digestives. La maladie touche de 15 nombreux organes mais les atteintes respiratoires sont prédominantes et représentent l'essentiel de la morbidité. La forme clinique la plus fréquente associe troubles respiratoires, troubles digestifs et troubles de la croissance staturopondérale. D'évolution chronique et progressive, la maladie s'exprime souvent tôt dès la petite enfance. Aucun traitement curatif n'existe à ce jour. 20 Au niveau des poumons, l'altération fonctionnelle des canaux CFTR entraîne des modifications des propriétés du mucus de la surface bronchique, en particulier une diminution de ses qualités antibactériennes. Cette altération favorise la colonisation des voies respiratoires des patients par des microorganismes pathogènes, entraînant l'apparition, dans la vaste majorité des 25 cas d'infections chroniques associées à une réaction inflammatoire marquée. La plupart des patients subissent des épisodes respiratoires aigus et finissent par décéder d'insuffisance respiratoire résultant de l'infection (Lyczak et al. (2002) Clin. Microb. Rev. 15:194-222). Parmi les pathogènes fréquemment rencontrés dans ces infections, les 30 espèces bactériennes principales sont Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia cenocepacia. B. cenocepacia est une bactérie du sol, particulièrement redoutable de par sa virulence foudroyante et sa résistance à la quasi-totalité des antibiotiques connus. Cette multirésistance rend le développement de nouveaux moyens de traitement particulièrement important. Burkholderia cenocepacia possède un génome atypique constitué de quatre réplicons : trois chromosomes et un plasmide. Chaque réplicon de B. cenocepacia possède un système de partition propre constitué de trois éléments : une ATPase, une protéine liant l'ADN (PLA) et un centromère (parS) cible de la PLA.

Résumé de l'invention La présente invention découle de l'identification, par les inventeurs, des séquences des centromères exclusives de chacun des réplicons de B. cenocepacia. De plus, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que, pour chacun des systèmes de partition, l'introduction en excès de la séquence d'une seule de ces séquences centromériques dans la bactérie entraîne une toxicité chez B. cenocepacia. La présente invention concerne ainsi un acide nucléique isolé comprenant la séquence nucléotidique d'un centromère de réplicon bactérien pour son utilisation comme médicament. La présente invention concerne également un acide nucléique isolé comprenant la séquence nucléotidique d'un centromère de réplicon bactérien pour son utilisation comme agent anti-bactérien. La présente invention porte également sur un acide nucléique isolé comprenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4, ou une séquence nucléotidique ayant au moins 80% d'identité avec les séquences SEQ I D NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ I D NO: 3 ou SEQ I D NO: 4, sous réserve que les nucléotides flanquant ladite séquence nucléotidique ne soient pas identiques aux nucléotides flanquant la même séquence nucléotidique dans les chromosomes et/ou le plasmide de Burkholderia cenocepacia, et sous réserve que l'introduction de l'acide nucléique comprenant cette séquence dans une bactérie du genre Burkholderia inhibe le développement et/ou la multiplication de cette bactérie. La présente invention concerne aussi un vecteur comprenant un ou plusieurs acides nucléiques tels que définis ci-dessus.

La présente invention concerne également une composition antibactérienne comprenant à titre d'agent actif au moins un acide nucléique tel que défini ci-dessus et/ou au moins un vecteur tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et un agent biologique permettant le transfert dudit au moins un acide nucléique et/ou dudit au moins un vecteur dans une bactérie.

Description détaillée de l'invention Réplicon Par "réplicon", on entend ici tout segment d'ADN qui se réplique à partir d'une origine de réplication. De manière préférée, un réplicon bactérien selon la présente invention est un chromosome bactérien ou un plasmide bactérien. Par "chromosome bactérien" ou "nucléoside", on entend ici un réplicon de bactérie de forme circulaire ou linéaire, constitué par une molécule d'ADN bicaténaire et qui contient au moins un gène essentiel. Un chromosome bactérien selon l'invention est en particulier choisi parmi les chromosomes 1, 2 et 3 de B. cenocepacia. Par "plasmide bactérien", on entend ici une petite molécule d'ADN extrachromosomique, de forme circulaire. De manière préférée, un plasmide bactérien selon l'invention est le plasmide de B. cenocepacia.

Centromère Par "séquence nucléotidique d'un centromère" ou "séquence nucléotidique d'un site de partition", on entend ici une séquence nucléotidique présente sur un réplicon d'une bactérie qui promeut la partition active de ce réplicon aux cellules filles bactériennes. Dans le contexte de l'invention, la "partition" ou "ségrégation" se réfère au mécanisme par lequel deux réplicons fils issus de la réplication d'un réplicon père sont séparés dans les deux cellules filles. La partition est généralement obtenue par un système constitué de trois éléments, spécifiques du réplicon concerné : une protéine ayant une activité ATPase et une protéine liant l'ADN (PLA), qui sont codés par les gènes de partition, et un centromère, site de liaison de la PLA. Ces trois éléments de la partition sont impliqués parfois dans d'autres fonctions cellulaires. De préférence, un centromère selon l'invention consiste en des unités de séquence répétées qui flanquent les gènes de partition. Comme il est bien connu de l'homme du métier, le nombre de répétitions, leurs longueurs et séquences et l'espacement entre les répétitions peuvent varier selon les centromères et les espèces bactériennes. Certaines des unités de séquence répétées constituant le centromère peuvent également être inversées par rapport aux unités de séquence généralement disposées de manière symétrique. De manière préférée, ladite unité de séquence répétée est une séquence parS. Les séquences parS sont bien connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans Lin & Grossman (1998) Gel/ 92:675-685 et dans Dubarry et al. (2006) J. Bacteriol. 188:1489-1496. On entend ici par "séquence parS", une unité de séquence d'un site de centromère agissant en cis, sur laquelle vient se fixer la PLA, codée par le gène parB, pour former le complexe de partition. Une séquence parS selon l'invention correspond donc à la séquence nucléotidique à laquelle se lie la protéine de partition parB.

Dans un mode réalisation préféré, la séquence nucléotidique d'un centromère de réplicon bactérien selon l'invention comprend au moins une séquence parS. Dans un autre mode de réalisation préféré, la séquence nucléotidique d'un centromère de réplicon bactérien selon l'invention consiste en une séquence parS. De manière particulièrement préférée, ladite séquence parS est une séquence parS de Burkholderia cenocepacia. Plus spécifiquement, lorsque ledit réplicon bactérien est le chromosome 2, le chromosome 3 ou le plasmide de B. cenocepacia, la séquence nucléotidique du centromère de réplicon bactérien selon l'invention est préférablement une séquence comprenant plusieurs séquences parS de B. cenocepacia, et lorsque ledit réplicon bactérien est le chromosome 1 de B. cenocepacia, la séquence nucléotidique du centromère de réplicon bactérien selon l'invention est préférablement une séquence comprenant une seule séquence parS de B. cenocepacia.

Burkholderia Dans le contexte de l'invention, le terme "Burkholderia" se réfère à un genre de bactéries à coloration Gram négatives, mobiles, aérobies obligatoires et formant des bâtonnets. Les espèces du genre Burkholderia ont généralement pour habitat principal le sol et les plantes, mais quelques espèces peuvent être pathogènes pour l'homme ou l'animal ou peuvent se comporter comme des pathogènes opportunistes. Les espèces du genre Burkholderia selon l'invention comprennent en particulier Burkholderia arbores, Burkholderia ambifaria, Burkholderia andropogonis, Burkholderia anthina, Burkholderia brasilensis, Burkholderia caledonica, Burkholderia caribensis, Burkholderia caryophylli, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia contaminans, Burkholderia diffusa, Burkholderia dolosa, Burkholderia fungorum, Burkholderia gladioli, Burkholderia glathei, Burkholderia glumae, Burkholderia graminis, Burkholderia hospita, Burkholderia kururiensis, Burkholderia lata, Burkholderia latens, Burkholderia mallei, Burkholderia metallica, Burkholderia multivorans, Burkholderia phenazinium, Burkholderia phenoliruptrix, Burkholderia phymatum, Burkholderia phytofirmans, Burkholderia plantarii, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia pyrrocinia, Burkholderia sacchari, Burkholderia semianalis, Burkholderia singaporensis, Burkholderia sordidicola, Burkholderia stabilis, Burkholderia terricola, Burkholderia thailandensis, Burkholderia tropica, Burkholderia tuberum, Burkholderia ubonensis, Burkholderia unamae, Burkholderia vietnamiensis, et Burkholderia xenovorans. De préférence, les espèces du genre Burkholderia selon l'invention sont choisies parmi Burkholderia ambifaria, Burkholderia anthina, Burkholderia arboris, Burkholderia cenocepacia, Burkholderia cepacia, Burkholderia contaminans, Burkholderia dolosa, Burkholderia diffusa, Burkholderia lata, Burkholderia latens, Burkholderia metallica, Burkholderia multivorans, Burkholderia pyrrocinia, Burkholderia seminalis, Burkholderia stabilis, Burkholderia ubonensis, et Burkholderia vietnamiensis. De préférence, les espèces du genre Burkholderia selon l'invention sont choisies parmi Burkholderia cenocepacia, Burkholderia mallei et Burkholderia pseudomallei. De manière préférée entre toutes, l'espèce du genre Burkholderia selon l'invention est Burkholderia cenocepacia. Burkholderia cenocepacia est une bactérie du sol, pathogène pour les patients atteints de mucoviscidose. Elle possède un génome atypique constitué de quatre réplicons : trois chromosomes et un plasmide. C'est le cas notamment de la souche J2315 de B. cenocepacia, souche de référence pour l'épidémiologie de la mucoviscidose. Chaque réplicon de B. cenocepacia a un système de partition propre constitué d'une ATPase, une protéine liant l'ADN et un centromère parS.

Les présents inventeurs ont plus particulièrement identifié les séquences des centromères des chromosomes 1, 2 et 3 et du plasmide de B. cenocepacia. Dans le cas du chromosome 2, la séquence du centromère comprend 739 nucléotides. Dans le cas du chromosome 3, elle comprend 1059 nucléotides, et dans le cas du plasmide, elle contient 169 nucléotides. De plus, les présents inventeurs ont également identifié les séquences parS présentes au niveau de la séquence nucléotidique des centromères des chromosomes 1, 2 et 3 et du plasmide de B. cenocepacia comme consistant chacun en un motif palindromique de 16 paires de base. La séquence parS du chromosome 1 a ainsi été identifiée comme correspondant à la séquence TGTTTCACGTGAAACA (SEQ ID NO: 1). La séquence parS du chromosome 2 correspond à la séquence GTTTATGCGCATAAAC (SEQ ID NO: 2). La séquence parS du chromosome 3 correspond à la séquence GTTGTCACGTGACAAC (SEQ ID NO: 3); et la séquence parS du plasmide correspond à la séquence CTTGGCTCGAGCCAAG (SEQ ID NO: 4). Chaque motif est exclusif d'un seul réplicon. Sur le chromosome 1, deux répétitions de la séquence parS sont présentes, espacées de 2000 bp. Sur les trois autres réplicons, quatre ou cinq répétitions groupées sur moins de 1000 bp sont présentes, et situées dans une région intergénique en amont du gène de l'ATPase.

Burkholderia mallei est un parasite strict responsable de la morve des équidés qui peut occasionnellement se transmettre aux carnivores et à l'homme chez qui elle est responsable d'une maladie grave. Burkholderia pseudomallei est également une bactérie du sol, responsable de la mélioïdose chez les hommes et les animaux.

Acide nucléique isolé Dans le contexte de l'invention, le terme "acide nucléique isolé" se réfère à la fois à un ARN et un ADN, y compris l'ADNc, l'ADN génomique et l'ADN synthétique. Les acides nucléiques peuvent avoir n'importe quelle structure tridimensionnelle. Un acide nucléique peut être double brin ou simple brin. Des exemples non limitatifs d'acides nucléiques comprennent les gènes, les fragments géniques, les exons, les introns, les ARN messagers (ARNm), les ARN de transfert (ARNt), les ARN ribosomiques, les siARN, les micro-ARN, les ribozymes, les ADNc, les acides nucléiques recombinants, et les acides nucléiques ramifiés. Un acide nucléique peut contenir des nucléotides non conventionnels ou modifiés. Les acides nucléiques isolés selon l'invention peuvent être purifiés ou recombinants.

De manière préférée, l'acide nucléique selon l'invention comprend une séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué par les séquences SEQ I D NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ I D NO: 3 et SEQ I D NO: 4, ou une séquence nucléotidique ayant au moins 80% d'identité avec les séquences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, sous réserve que les nucléotides flanquant ladite séquence nucléotidique ne soient pas identiques aux nucléotides flanquant la même séquence nucléotidique dans les chromosomes et/ou le plasmide de Burkholderia cenocepacia, et sous réserve que l'introduction de l'acide nucléique comprenant cette séquence dans une bactérie du genre Burkholderia inhibe le développement et/ou la multiplication de cette bactérie.

Tel qu'utilisé ici, une première séquence nucléotidique ayant au moins x% d'identité avec une seconde séquence nucléotidique signifie que x% représente le nombre de nucléotides de la première séquence qui sont identiques à leurs nucléotides appariés de la deuxième séquence quand les deux séquences sont alignées de manière optimale, par rapport à la longueur totale de la deuxième séquence nucléotidique. Les deux séquences sont dites alignées de manière optimale quand x est maximal. L'alignement peut être réalisé manuellement ou automatiquement. Des algorithmes d'alignement automatisé de séquences nucléotidiques sont bien connus de l'homme du métier et sont par exemple décrits dans Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 et mis en oeuvre par des logiciels tels que le logiciel Blast. Ladite séquence nucléotidique qui a au moins 80% d'identité avec les séquences définies ci-dessus peut être obtenue à partir des séquences nucléotidiques natives par mutation, par exemple par insertion, délétion ou substitution d'au moins un nucléotide et/ou par traitement chimique.

Plus préférablement, la séquence nucléotidique ayant au moins 80% d'identité avec les séquences définies ci-dessus a au moins 85%, 90%, 95%, 98%, 99% d'identité avec SEQ I D NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ I D NO: 3 ou SEQ I D NO: 4 sous réserve que les nucléotides flanquant ladite séquence nucléotidique ne soient pas identiques aux nucléotides flanquant la même séquence nucléotidique dans les chromosomes et/ou le plasmide de Burkholderia cenocepacia, et sous réserve que l'introduction de l'acide nucléique comprenant cette séquence dans une bactérie du genre Burkholderia inhibe le développement et/ou la multiplication de cette bactérie. Par "nucléotides flanquant la même séquence nucléotidique dans les chromosomes et/ou le plasmide de Burkholderia cenocepacia", on entend ici les nucléotides localisés directement en amont de ladite séquence nucléotidique en 5' et directement en aval de ladite séquence nucléotidique en 3', lorsque cette séquence se trouve naturellement dans les chromosomes et/ou le plasmide de Burkholderia cenocepacia. De préférence, lesdits nucléotides flanquant la même séquence nucléotidique correspondent aux 20 nucléotides, plus préférablement 15, 10, 5, 4, 3 ou 2 nucléotides, ou au nucléotide localisés directement en amont de ladite séquence nucléotidique en 5' et directement en aval de ladite séquence nucléotidique en 3'. Comme il est bien connu de l'homme du métier, l'expression "introduction d'un acide nucléique dans une bactérie", correspond au transfert d'un acide nucléique dans une bactérie. Les techniques d'introduction d'un acide nucléique dans une bactérie sont bien connues de l'homme du métier et comprennent par exemple la transformation, la conjugaison, la transduction et l'utilisation de vésicules membranaires ou liposomes comprenant ledit acide nucléique. L'introduction de l'acide nucléique peut être transitoire ou stable. Dans le contexte de l'invention, l'expression "inhibition du développement" d'une bactérie se réfère au ralentissement de la croissance bactérienne. Par "croissance bactérienne", on entend ici la croissance de la cellule bactérienne c'est-à-dire de sa taille, sa masse et son volume. Les techniques de détermination de la croissance bactérienne sont bien connues de l'homme du métier et incluent par exemple les techniques de détermination de la masse sèche, les techniques de turbidimétrie, les techniques de mesure du volume des cellules empaquetées (packed cells volume, PCL), les techniques de mesure de l'activité cellulaire, les techniques de dosage de l'azote, les techniques de dosage de l'ATP, les techniques de dosage des produits du métabolisme, et les techniques de mesures des variations physicochimiques du milieu.

Dans le contexte de l'invention, l'expression "inhibition de la multiplication" d'une bactérie correspond au ralentissement et/ou à l'arrêt de la division bactérienne. Les techniques de détermination du ralentissement et/ou de l'arrêt de la division bactérienne sont bien connues de l'homme du métier et incluent par exemple les techniques de dénombrement par détection et dénombrement direct microscopique (cellule de numération, méthode de Breed), les techniques de comptage électronique (compteur de particules, cytométrie en flux, DEFT (direct epifluorescent filter technique), et les techniques de dénombrement nécessitant une culture (technique de comptage des unités formant colonie, technique de "plate count", technique de Postgate, dénombrement en surface après culture sur membrane filtrante). De manière préférée, les acides nucléiques selon l'invention sont constitués de 10 à 1500 nucléotides, de préférence de 10 à 1400 nucléotides, de 10 à 1300 nucléotides, de 10 à 1200 nucléotides, de 10 à 1100 nucléotides, de 10 à 1000 nucléotides, de 10 à 900 nucléotides, de 10 à 800 nucléotides, de 10 à 700 nucléotides, de 10 à 600 nucléotides, de 10 à 500 nucléotides, de 10 à 400 nucléotides, de 10 à 300 nucléotides, de 10 à 250 nucléotides, de 10 à 200 nucléotides, de 10 à 150 nucléotides, de 10 à 100 nucléotides, de 10 à 90 nucléotides, de 10 à 80 nucléotides, de 10 à 70 nucléotides, de 10 à 60 nucléotides, de 10 à 50 nucléotides, de 10 à 45 nucléotides, de 10 à 40 nucléotides, de 10 à 35 nucléotides, de 10 à 30 nucléotides, de 10 à 25 nucléotides ou de 10 à 20 nucléotides. De manière davantage préférée, les acides nucléiques selon l'invention sont constitués de 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou 11 nucléotides.

Vecteur Par "vecteur", on entend ici le véhicule par lequel une séquence d'acide nucléique peut être introduite dans une cellule hôte de manière à transformer la cellule hôte. Des exemples de vecteurs incluent les plasmides, les phages, les virus. De manière préférée, un vecteur selon l'invention est un vecteur plasmidique. Un vecteur plasmidique contient généralement une séquence d'ADN codante, une séquence d'ADN promotrice et présente un ou plusieurs sites de restriction permettant d'introduire l'acide nucléique désiré. Il contient en outre de préférence une origine de réplication et un gène permettant la sélection des cellules ayant reçu le vecteur, tel qu'un gène de résistance à un antibiotique. Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur selon l'invention comprend l'acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO: 2 et l'acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO: 4. Le vecteur selon l'invention peut également comprendre successivement les acides nucléiques comprenant respectivement les séquences SEQ I D NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ I D NO: 3 et SEQ ID NO: 4.

Médicament Par "médicament", on entend ici toute substance ou composition possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard de maladies humaines ou animales. Un mode de réalisation préféré de la présente invention concerne l'acide nucléique tel que défini ci-dessus pour son utilisation comme agent anti-bactérien. Par "agent anti-bactérien", on entend ici un agent biologique qui inhibe le développement et/ou la multiplication de bactéries. Préférablement, l'agent antibactérien est un agent anti-bactérien efficace contre les bactéries du genre Burkholderia. De manière davantage préférée, l'agent anti-bactérien est agent anti-bactérien efficace contre les bactéries B. cenocepacia, B. malle/ et/ou B. pseudomallei. De manière préférée entre toutes, l'agent anti-bactérien est un agent anti-bactérien efficace contre les bactéries B. cenocepacia. Dans un autre mode de réalisation préféré, la présente invention a donc trait à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus pour son utilisation dans le traitement d'une infection par une bactérie du genre Bulkhoderia chez un sujet. Une méthode de traitement comprenant l'administration chez un sujet d'une quantité efficace sur le plan thérapeutique de l'acide nucléique tel que défini ci-dessus est également décrite dans la présente invention. Toute méthode appropriée d'administration, connue de l'homme du métier, peut être utilisée. En particulier, l'acide nucléique peut être délivré par exemple par voie orale, par inhalation, ou par voie parentérale (en particulier par injection intraveineuse). Quand la voie parentérale est choisie, l'acide nucléique peut être sous forme de solutions et suspensions injectables, conditionné en ampoules ou fioles. Les formes d'administration parentérale sont conventionnellement obtenues en mélangeant l'acide nucléique selon l'invention avec des tampons, des stabilisants, des conservateurs, des agents solubilisants, des agents isotoniques et des agents de charge. Selon des techniques connues, ces mélanges peuvent ensuite être stérilisés et conditionnés sous forme d'injections intraveineuses. L'homme du métier pourra utiliser des tampons à base de sels de phosphate organique comme tampon. Des exemples d'agents de charge incluent la méthylcellulose, l'acacia et la carboxymétylcellulose de sodium. Des exemples de stabilisants incluent le sulfite de sodium et le métasulfite de sodium, et des exemples de conservateurs incluent le p-hydroxybenzoate de sodium, l'acide sorbique, le crésol et le chlorocrésol. La quantité d'acide nucléique délivrée dépend naturellement de la voie d'administration, et de la taille et/ou du poids du sujet. Le terme "quantité efficace sur le plan thérapeutique" se réfère à une quantité de composé qui confère un effet thérapeutique au sujet traité. L'effet thérapeutique peut être objectif (c'est-à-dire mesurable par un test ou un marqueur) ou subjectif (c'est-à-dire que le sujet donne une indication ou un sentiment sur l'effet). Dans le contexte de l'invention, un "sujet" désigne un humain ou un mammifère non-humain, tel qu'un rongeur (rat, souris, lapin), un équidé (cheval), un porcin (porc), un caprin (chèvre), un ovin (mouton), un primate (chimpanzé), un félin (chat), un canin (chien). De préférence, le sujet est choisi parmi un humain ou un équidé. De manière davantage préférée, le sujet est humain. Par "infection", on entend ici la pénétration et le développement dans un organisme d'une bactérie, d'un virus ou d'un champignon pathogène. Préférablement, dans le contexte de l'invention, une infection est due à une bactérie, de manière davantage préférée à une bactérie du genre Burkholderia, de manière davantage préférée à une bactérie choisie parmi Burkholderia cenocepacia, Burkholderia malle/ et Burkholderia pseudomallei, de manière préférée entre toutes à une bactérie B. cenocepacia. De manière préférée, la présente invention concerne donc un acide nucléique tel que défini ci-dessus pour son utilisation dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué de la mucosviscidose, la morve et la mélioïdose. Comme il est bien connu de l'homme du métier, la mucoviscidose ou fibrose kystique est une maladie génétique, affectant les épithéliums glandulaires de nombreux organes, qui se caractérise par des troubles respiratoires, digestifs et de la croissance staturopondérale. Plus particulièrement, elle est associée à une inflammation et une infection chronique des poumons (en particulier par Burkholderia cenocepacia) qui entraînent une dégradation pulmonaire par des lésions du tissu pulmonaire conduisant à un tableau de broncho-pneumopathie chronique obstructive. La morve correspond à une maladie infectieuse grave due à Burkholderia malle/ qui touche principalement les équidés. D'autres animaux comme les chats, les chiens et les chèvres peuvent cependant la contracter ainsi que l'homme par accident. Elle se transmet habituellement par ingestion d'aliments ou d'eau contaminés. Les manifestations cliniques comportent une altération de l'état général avec toux et fièvre, une dermite érysipélateuse, des collections purulentes cutanées et sous-cutanées, et une inflammation sévère des fosses nasales avec jetage. En l'absence de traitement, la mort survient en quelques jours par septicémie. Il existe cependant une forme chronique de la maladie dans laquelle les animaux infectés ne meurent pas mais servent de vecteur à l'agent infectieux et sont donc capables de propager la maladie. Lorsque les muqueuses ne sont pas atteintes, la maladie prend le nom de farcin. La mélioïdose, aussi appelée maladie de Stanton, pneumo-entérite, ou pseudocholéra, est une maladie infectieuse due à Burkholderia pseudomallei qui touche les ovins, les équidés, les porcins, les caprins, les rongeurs et les primates. L'homme peut également la contracter par accident. Les symptômes de la mélioïdose sont similaires à ceux de la morve. La maladie évolue de façon très diverse, sous forme latente, subaiguë ou aiguë, ou chronique. Sous sa forme aiguë, elle se manifeste par une septicémie accompagnée d'une forte fièvre, de douleurs multiples, de vomissements, de diarrhées, d'abcès et d'une pneumonie sévère. Sous sa forme chronique, elle est caractérisée par des suppurations au niveau de l'intestin, du foie, des poumons, des reins et des ganglions lymphatiques, et par une éruption cutanée inflammatoire.

De manière davantage préférée, l'acide nucléique tel que défini ci-dessus est utilisé dans le traitement de la mucoviscidose.

Composition anti-bactérienne Par "composition anti-bactérienne", on entend ici une composition ayant les effets d'un agent anti-bactérien tel que défini ci-dessus. Par "agent actif", on entend ici un composé ou un mélange de composés responsable de l'effet anti-bactérien de la composition anti-bactérienne telle que définie ci-dessus. Des exemples d'agent actif selon l'invention incluent des molécules chimiques ou biologiques telles que des acides nucléiques, des peptides ou des protéines. De manière préférée, l'agent actif selon l'invention est un acide nucléique. Par "véhicule pharmaceutiquement acceptable", on entend ici un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires et permettant par exemple la facilitation de l'administration de l'agent actif, l'augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l'organisme, l'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ces véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme du métier en fonction de la nature et du mode d'administration du ou des composés actifs choisis. De préférence, la composition anti-bactérienne selon l'invention comprend en outre un agent biologique permettant le transfert dudit au moins un acide nucléique et/ou dudit au moins un vecteur dans une bactérie. Par "agent biologique permettant le transfert dans une bactérie", on entend ici un agent d'origine biologique qui permet d'introduire un acide nucléique, un vecteur, un peptide ou une protéine dans une bactérie. Des exemples d'agents biologiques appropriés permettant le transfert dans une bactérie sont bien connus de l'homme du métier et incluent les virus tels que les bactériophages, les liposomes, les bactéries inactivées capables de conjugaison. De plus, comme il est bien connu de l'homme du métier, un tel agent biologique n'est pas toujours nécessaire pour obtenir le transfert d'un acide nucléique dans une bactérie dans la mesure où ledit acide nucléique peut être directement internalisé par certaines espèces bactériennes douées de transformation naturelle.

Différents aspects de la présente invention ressortiront encore plus nettement au vu des exemples illustratifs ci-après Description de la figure

La figure présente des photographies de boites de Pétri ensemencées avec des bactéries Burkholderia cenocepacia transformées par un vecteur plasmidique vide (control) ou par un vecteur plasmidique portant la séquence du centromère parS du chromosome 1 de Burkholderia cenocepacia.

Exemple

Cet exemple démontre l'effet anti-bactérien de l'introduction de séquences supplémentaires de centromères de réplicons bactériens dans des bactéries B. cenocepacia.

Matériel et méthodes Clonages des sites parS dans le plasmide pMMB206 Les sites parS uniques (canoniques ou mutés) ont été reconstitués par hybridation d'oligonucléotides présentant les extrémités cohésives EcoRl et Mlul. Les clusters de parS ont été amplifiés sur l'ADN de la souche J2315 avec des amorces spécifiques portant des sites de restriction Apal ou Hpal en 5', et ensuite purifiés sur gel d'agarose. Le vecteur pMMB206 (Morales et al. (1991) Gene 97:39-47) a été digéré par ces mêmes paires d'enzymes et purifié sur gel avant ligaturation avec les sites parS, unique ou en cluster, par la T4 DNA ligase. Les produits de ligaturation ont été introduits dans E. coli DH1OB par électroporation. Les plasmides ont été ensuite extraits et vérifiés par PCR et/ou digestion aux endonucléases de restriction.

Transfert des plasmides dans B. cenocepacia Les plasmides ont été au préalable électroporés dans SCS110, souche dam- dcm d'E. coli, pour obtenir des plasmides non méthylés dont les taux de transformation dans B. cenocepacia sont bien meilleurs que ceux des plasmides issus de DH10B. Ces plasmides ont été ensuite introduits dans B. cenocepacia par électroporation. Les transformants sélectionnés pour la résistance au chloramphénicol ont été caractérisés pour leur phénotype de croissance.

Résultats Les inventeurs ont obtenu, par hybridation d'oligonucléotides de synthèse, les centromères de 16 bp de chaque réplicon de B. cenocepacia, plus particulièrement le centromère de séquence SEQ ID NO: 1 du chromosome 1, le centromère de séquence SEQ ID NO: 2 du chromosome 2, le centromère de séquence SEQ ID NO: 3 du chromosome 3 et le centromère de séquence SEQ ID NO: 4 du plasmide. Ils ont également obtenu, par amplification PCR sur B. cenocepacia, un fragment d'ADN contenant le regroupement des parS des chromosomes 2 et 3 et du plasmide. Ils ont cloné ces différents centromères, en site unique de 16 bp et en regroupement, sur des plasmides dérivés du plasmide RSF1010, à moyen nombre de copies (12) et réplicatifs chez Escherichia col/ et B. cenocepacia. Les plasmides sont d'abord produits massivement par E. col/, bactérie chez laquelle les parS ne présentent aucune toxicité. Les plasmides sont ensuite introduits par électrotransformation chez B. cenocepacia.

Les inventeurs ont ainsi observé une baisse de la croissance, et ceci pour chacun des quatre centromères introduits séparément (Figure). Pour les centromères des chromosomes 1 et 3, de séquence respective SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3, un effet délétère très net (notamment très fort retard de croissance des colonies de transformants) apparaît pour une copie unique de 16 bp clonée sur le plasmide. Pour les centromères du chromosome 2 et du plasmide, de séquence respective SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 4, l'effet néfaste est très fort, mais seulement si le plasmide porte le regroupement des 4 ou 5 sites parS.30

Claims

REVENDICATIONS1. Acide nucléique isolé comprenant la séquence nucléotidique d'un centromère de réplicon bactérien pour son utilisation comme médicament.
2. Acide nucléique isolé selon la revendication 1 pour son utilisation comme agent anti-bactérien.
3. Acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, pour son utilisation dans le 10 traitement d'une infection par une bactérie du genre Burkholderia chez un sujet.
4. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour son utilisation dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué de la morve, de la mélioïdose, et des infections bactériennes chez un patient atteint de 15 mucoviscidose.
5. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la séquence nucléotidique d'un centromère de réplicon bactérien est une séquence comprenant au moins une séquence parS.
6. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la séquence nucléotidique d'un centromère de réplicon bactérien consiste en une séquence parS. 25
7. Acide nucléique selon la revendication 5 ou 6, dans lequel la séquence parS est une séquence parS de Burkholderia cenocepacia.
8. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ 30 ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4, ou une séquence nucléotidique ayant au moins 80% d'identité avec les séquences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, sous réserve que les nucléotides 20flanquant ladite séquence nucléotidique ne soient pas identiques aux nucléotides flanquant la même séquence nucléotidique dans les chromosomes et/ou le plasmide de Burkholderia cenocepacia, et sous réserve que l'introduction de l'acide nucléique comprenant cette séquence dans une bactérie du genre Burkholderia inhibe le développement et/ou la multiplication de cette bactérie.
9. Acide nucléique isolé comprenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4, ou une séquence nucléotidique ayant au moins 80% d'identité avec les séquences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, sous réserve que les nucléotides flanquant ladite séquence nucléotidique ne soient pas identiques aux nucléotides flanquant la même séquence nucléotidique dans les chromosomes et/ou le plasmide de Burkholderia cenocepacia, et sous réserve que l'introduction de l'acide nucléique comprenant cette séquence dans une bactérie du genre Burkholderia inhibe le développement et/ou la multiplication de cette bactérie.
10. Vecteur comprenant un ou plusieurs acides nucléiques selon la revendication 9.
11. Vecteur selon la revendication 10, comprenant l'acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO: 2 et l'acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO: 4. 25
12. Composition anti-bactérienne comprenant à titre d'agent actif au moins un acide nucléique selon la revendication 9 et/ou au moins un vecteur selon la revendication 10 ou 11, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 30
13. Composition anti-bactérienne selon la revendication 12 comprenant en outre un agent biologique permettant le transfert dudit au moins un acide nucléique et/ou dudit au moins un vecteur dans une bactérie.20
14. Composition anti-bactérienne selon la revendication 13, dans laquelle l'agent biologique permettant le transfert dudit au moins un acide nucléique et/ou dudit au moins un vecteur dans une bactérie est choisi dans le groupe constitué par un bactériophage, un liposome et une bactérie inactivée capable de conjugaison.