JP2014513933A - 真核生物における遺伝子発現を調節するためまたはｄｎａ遺伝子座を検出および制御するためのコンストラクトおよび方法 - Google Patents

真核生物における遺伝子発現を調節するためまたはｄｎａ遺伝子座を検出および制御するためのコンストラクトおよび方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、真核生物発現ベクター等の細菌のプラスミドおよび染色体DNAの分配系に由来する配列に基づくコンストラクト、融合タンパク質およびこれをコードするポリヌクレオチドに関し、また、このようなコンストラクトで形質転換されたまたはこれを発現する真核細胞に関する。本発明はまた、真核細胞における遺伝子発現の調節におけるおよび/または対象のゲノムDNAの遺伝子座の動態、局在化もしくは代謝の検出および制御におけるこれらの使用に関する。

Description

本発明は、一般に、バイオテクノロジーの分野に関し、特に、バイオテクノロジーにおいて有用なツール(instrument)の分野に関する。
より具体的には、本発明は、真核細胞、特に生きた真核細胞における遺伝子発現の調節のため、および/または前記細胞における対象のゲノムDNA遺伝子座の検出および制御のための、細菌プラスミドおよび染色体DNAの分配系(partitioning system)に由来する配列の使用を提案する。
従って、本発明は、真核生物発現ベクター等、このような調節、検出および制御方法において用いられるコンストラクト、融合タンパク質およびこれをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなコンストラクトで形質転換されたまたはこれを発現する真核細胞に関する。
本発明はまた、真核細胞における遺伝子発現を調節するための方法ならびに真核細胞における対象のゲノムDNA遺伝子座を検出および制御するための方法に関する。
in vivoにおけるゲノムDNA遺伝子座の可視化は通常、タンパク質(リプレッサーと呼ばれる)により認識され特異的に結合されるDNA標的配列(オペレーターと呼ばれる)に関与する2成分系を用いて得られる(Belmont、2001;Belmont & Straight、1998;Straightら、1996)。FROS(蛍光リプレッサーオペレーター系(Fluorescent Repressor Operator System))として知られるこの系は、細菌から哺乳類細胞に至る生細胞におけるDNA領域の位置検出にルーチン的に用いられている。
現時点において、オペレーター/リプレッサー型は、２種の系のみ、即ち、LacO/LacIおよびTetO/TetR系のみが、真核生物におけるin vivoイメージング(Bystrickyら、2005;Michaelisら、1997;Therizolsら、2010)に利用できる。
これらの系の不利益の一つに、サイズおよびオペレーター配列の反復的な性質がある。この種のオペレーターは、200反復を超える細菌オペレーター配列で事実上構成されている。この理由により、LacOオペレーターは、その現行版において、10kbを超えるDNAを包含する。
たとえこの技法が、in vivoにおけるDNA領域の可視化を達成したとしても、このように膨大な配列の挿入は、クロマチン繊維の挙動を改変し得る。その上、このサイズの染色体領域の伸展および凝縮は、蛍光粒子の経時的追跡等の動的研究の実施を歪め得る。
この理由により、生細胞における染色体の構築および動態の研究は、オペレーター配列そのもののサイズにより大幅に制限される。短い非反復DNA配列の検出に関与する技法は、真核生物に対して未だ開発されていない。
従って、真核細胞、特に生きた真核細胞における、染色体の構築および動態の研究を可能にする系およびコンストラクトの必要が真にある。本発明者らは、このような系およびこのようなコンストラクトを特定するという目的を定めた。
細菌の有糸分裂における染色体の分配または分離は、3種の要素: ParSと呼ばれる短い配列、ParSと結合するParBタンパク質およびParB-ParS複合体を動員するATPase活性を有する第二のタンパク質ParAを含む系により起こる(Lin & Grossman、1998)。染色体において、ParSは通常、複製起点の領域内に分布した数コピーで存在する(Livnyら、2007)。ParBは、ParS配列に存在する結合配列へと特異的に結合する。結合すると、ParBは、そのN末端ドメインを用いて自身の他のコピーを動員することができる。その上、ParBは、双方向的様式で結合部位近傍のDNA上に広がる(Murrayら、2006;Lynch & Wang、1995)。大部分の細菌種は、1個の染色体および同一またはほぼ同一配列を有するparS部位を含有する。
対照的に、細菌のバークホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)(Bcc)は、Par-c1(1番染色体の分配系)、Par-c2(2番染色体の分配系)、Par-c3(3番染色体の分配系)およびPar-p1(プラスミドの分配系)と呼ばれる特異的分配系により独立的に分配される、3個の染色体および少数コピーのプラスミドを含有する。これら4種のレプリコンはそれぞれ、約1kbにわたり分布した特異的配列の数コピーのparSを保有する(Dubarryら、2006)。本論文において、Bccの染色体またはプラスミドのいずれかに由来するparS配列が挿入されたpDAG203に由来するプラスミド等の様々なプラスミドコンストラクトを調製した。前記プラスミドを用いて、細菌の大腸菌(Escherichia coli)(E. coli)を形質転換した。しかし、これらのプラスミドは、下に定義するもの等の真核生物ベクターを形成しない。
細菌におけるプラスミドおよび染色体DNAの分配系、特に、セントロメアParSおよびそれと結合するタンパク質ParBに基づく系は、細菌においてのみ用いられてきた。より具体的には、これまでに知られている研究では、大腸菌(E. coli)のP1プラスミドのParBタンパク質に着目してきた。だがしかし、このタンパク質には、IHF(組み込み宿主因子)と呼ばれる宿主因子の存在下でのみ、ParS配列に存在する結合部位に結合するという不利益がある(Li & Austin、2002)。IHFにおけるこのような依存性は、この系に対する関心を大幅に制限してきた。Li & Austin(2002)に記載されている研究は、緑色蛍光タンパク質(GFP)のC末端側の端と融合した大腸菌P1プラスミドのParBタンパク質の全体または一部に相当する融合タンパク質を用いる。このような融合タンパク質は、このような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むよう改変されたpDSW209プラスミドを用いて、W3110およびN100等の細菌株に挿入することにより産生された。
同様に、Surtees & Funnell(1999)による論文において、大腸菌P1プラスミドのParBタンパク質を用いて、ダブルハイブリッド(double-hybrid)技法により、ParBの構成成分間の相互作用および特にそれらの二量体形成を検出し、研究した。作製されたコンストラクトにおいて、大腸菌P1プラスミドのParBタンパク質の全体または一部は、真核生物転写因子Gal4と融合される。ParBをレポーター遺伝子に引き寄せてその発現の可視化を達成するのはこの因子であり、Gal4と融合したParBタンパク質と、特性評価が求められるパートナーとの相互作用が用いられる。要約すると、Surtees & Funnell(1999)に記載されているような融合タンパク質とDNAとの会合は、Gal4によるものであって、大腸菌P1プラスミドのParBによるものではなく、その理由として、後者は単独ではこのような会合を為し得ないからである。
Sambrookら(Molecular cloning、1989、Noland C.編、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) http://rsbweb.nih.gov/ij/
本発明により、先に定義された課題等の技術上の課題を解決し、本発明者らにより定められた目的に達することが可能になる。
本発明者らが行った研究によって、Bcc分配系を真核細胞におけるその使用に適用することによりクロマチン遺伝子座の動態をin vivoで可視化および研究する一般的方法の開発が可能となった。
本方法の利点の一つは、用いた他の系(>10kb)と比較してサイズが大幅に低下したゲノム挿入(1kb)および少ない反復数の結合配列(本明細書において認識配列とも呼ばれる)にある。この理由により、現在の技術水準におけるオペレーター配列のサイズを保つのに用いられるあらゆる方法は、本発明の系および方法において陳腐化してしまう。
注目すべき仕方で、これらのコンストラクトは、対象のゲノム遺伝子座を検出および制御し、二本鎖切断における分解等のDNA代謝における未知のステップを可視化するためだけではなく、真核生物における遺伝子の発現を調節および制御するために用いることができる。
最後に、Bcc細菌のDNA分配系の要素を用いた本発明者らによる研究の教示するところは、いかなる細菌のいかなるDNA分配系の要素に一般化してもよいが、これはただし、この細菌において、DNA分配系に属するDNA結合タンパク質が、認識部位において有機因子、特にタンパク質因子等の別の因子を必要とせずにDNAと結合することができ、有利には、自身の他のコピーの動員もできることを条件とする。
本発明は、第一に、特定の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む真核生物発現ベクターに関する。
「真核生物発現ベクター」は、該ベクターに含有されているヌクレオチド配列にコードされた少なくとも1種のポリペプチドの、真核細胞における、発現に適合したベクターを意味する。前記ベクターは、特に、宿主真核生物体の形質転換、およびその体内における下に定義する融合タンパク質等の融合タンパク質の発現に有用である。
本発明の真核生物発現ベクターは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に加えて、該ヌクレオチド配列の発現、即ち、転写および翻訳を可能にする1または複数の要素を含む。
本発明の真核生物発現ベクターは、有利には、プラスミド、コスミド、バクテリオファージおよびバキュロウイルス等のウイルスの中から選ばれる。特に、本発明のベクターは、宿主生物におけるその維持および複製を可能にする、複製起点等の要素を含む自己複製ベクターである。その上、ベクターは、宿主生物においてそれを選択できるようにする要素を含むことができる。このような要素は、「選択マーカー(selectable marker)」としても知られている。前記発現ベクターは、当業者によく知られており、文献に広く記載されている。
真核生物ベクターにおいては、真核生物型複製起点、真核生物型選択マーカー、真核生物型プロモーター、エンハンサーとしても知られる増幅器、3'UTRシグナル(非翻訳領域)、IRESシグナル(配列内リボソーム進入部位)ならびに開裂部位および/またはポリAシグナル(ポリアデニル化シグナル)を含む真核生物転写終結シグナルの中から選ばれる少なくとも1種の要素が存在することから、真核生物発現ベクターは、原核生物発現ベクターとは異なる。本発明の真核生物発現ベクターは、上に列挙する2、3、4、5、6または7種の要素、通常はこれら全要素を含むことができる。
「真核生物型選択マーカー」は、栄養要求性宿主生物により用いられる代謝の遺伝子、即ち、宿主生物のゲノムにおいて欠失された個々の遺伝子を補完する選択遺伝子の中から選ばれるマーカーを意味する。前記遺伝子は、trp-酵母等、ホスホリボシルアントラニル酸(phosphoribosylanthranilate)イソメラーゼ酵素が枯渇した真核生物により用いられるtrp-1遺伝子;ura-酵母等、オロチジン5'-リン酸デカルボキシラーゼ酵素が枯渇した真核生物により用いられるURA3遺伝子;チミジンキナーゼ酵素が枯渇した真核生物により用いられるtk遺伝子;アデノシンデアミナーゼ酵素が枯渇した真核生物により用いられるada遺伝子;アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素が枯渇した真核生物により用いられるApt遺伝子;ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素が枯渇した真核生物により用いられるHprt遺伝子であり得る。本発明の真核生物発現ベクターが、アンピシリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ジェネテシン、カルボキシン、ノーセオスリシン(nourseothricin)またはG418等の抗生物質に対し抵抗性を有する細菌遺伝子等の原核生物または真核生物において用いることのできる選択マーカーを含有してもよいことに注意されたい。
本発明における「真核生物型プロモーター」は、任意の真核細胞に適合した構成的または誘導性のプロモーターと、特定の組織に特異的な構成的または誘導性のプロモーターの両方を意味する。本発明において用いることのできる任意の真核細胞に適合したプロモーターは、特に、CMVプロモーター(サイトメガロウイルス)、特に該プロモーターのイントロンA;CYC1-TetO-7プロモーター(より詳細には実験セクションを参照);初期SV40プロモーター(サルウイルス40)、HSVプロモーター(単純ヘルペスウイルス)およびTEVプロモーター(タバコエッチ病(Etch)ウイルス)の中から選ばれる。本発明において用いることのできる特定の組織に特異的な一プロモーターは通常、肝細胞に特異的なPEPCKプロモーター(ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ)、上皮細胞、特に肺細胞に特異的なSPAプロモーター(サーファクタントタンパク質A)、筋芽細胞に特異的なMLC1:3プロモーター(ミオシン軽鎖)、腫瘍細胞に特異的なCEAプロモーター(癌胎児抗原)および骨格筋細胞に特異的なMCKプロモーター(筋肉クレアチンキナーゼ)の中から選ばれる。その上、本発明において用いることのできる酵母誘導性プロモーターは、ガラクトース誘導性のGAL1プロモーター、メタノール誘導性のAOX1プロモーター、グルコース枯渇誘導性のADH-2プロモーター、メチオニン枯渇誘導性のMET15プロモーターまたは銅イオン誘導性のCUP1プロモーターでよい。本発明の真核生物発現ベクター対象において、プロモーターは、1または複数の転写調節配列、即ち、エンハンサーを伴い得る。
有利には、本発明の真核生物発現ベクターは、動作可能に一体に連結(operationally linked together)した、真核生物型プロモーター、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列ならびに開裂部位および/またはポリAシグナルを含む真核生物転写終結シグナルを含む。本発明において、「動作可能に一体に連結」は、要素のうち一種の機能が、他の要素の機能により影響されるように一体に連結した要素を意味する。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を与えることができる場合、コード配列に動作可能に連結されている。ベクターに含有させることのできる、ペプチドの転写、翻訳および成熟化を調節する要素は当業者に知られており、当業者であれば、これら要素の中から、発現またはクローニングが行われる真核生物宿主生物に関連して選ぶことができる。
「融合タンパク質」は、融合タンパク質の各ポリペプチドが自身の機能または活性を維持できるよう互いに機能的に連結された、同一ソース由来または異なるソース由来の少なくとも2個のポリペプチドを含むタンパク質を意味する。
融合タンパク質の2個のポリペプチドは、ペプチド結合を介して互いに直接的に連結されていても、該2個のポリペプチドを離間するスペーサー腕(または連結腕もしくは接合剤)を介して間接的に連結されていてもよい。第二のポリペプチドは、第一のポリペプチドのC末端またはN末端側の端に直接的または間接的に結合されていてよい。結合が直接結合である場合、各ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列同士は、コードされるポリペプチドの翻訳フレームを損なわないように、5'-3'方向で互いに連結される。
本発明の真核生物発現ベクターにおいて、ヌクレオチド配列は、細菌DNAの分配系に属し、DNA結合タンパク質、その誘導体または断片に相当する第一のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。従って、本発明は、細菌DNAの分配系に属し、DNA結合タンパク質、その誘導体または断片に相当する第一のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む真核生物発現ベクターに関する。より詳細には、本発明は、細菌DNAの分配系に属し、その他の因子を必要とせずにその結合を行うDNA結合タンパク質、その誘導体または断片に相当する第一のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む真核生物発現ベクターに関する。「その他の因子を必要とせずにその結合を行う」とは、DNAへの結合が、用いる細菌DNA分配系に属するDNA結合タンパク質と、DNAにおける認識部位のみに依存し、他のいかなる因子、特に有機因子、より詳細にはタンパク質因子もこの結合に関与しないことを意味する。
「細菌DNAの分配系」は、細菌の有糸分裂における染色体および必要に応じてプラスミドの分配(または分離)に関与する系を意味する。この系は、文献において「par系」として知られるものである。
先に説明した通り、細菌におけるDNA分配系は、(i)ParSの用語で文献において知られるDNA配列またはセントロメア配列、(ii)該DNA配列に特異的に結合する、ParBの用語で文献において知られるタンパク質および(iii)ParAの用語で文献において知られる、ATPase活性を有するタンパク質を含む3要素系である。従って、「DNA結合タンパク質であり、細菌DNAの分配系に属する」は、ParBタンパク質を意味する。しかし、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質は、「セントロメア型配列(即ち、セントロメアの役割を果たす配列)に結合するタンパク質」またはその他の名称でも呼ばれ得ることに留意されたく、例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)においてはこのタンパク質はSpo0Jと呼ばれる。
細菌DNAの分配系に属するいかなるDNA結合タンパク質も、この結合がIHFタンパク質またはGal4等の転写因子等の別の因子に依存しない限りにおいて、本発明において潜在的に用いることができる。このようにして、本発明において用いられる融合タンパク質において、DNAへの結合は、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質、その誘導体または断片に相当する第一のポリペプチドのみに依存する。有利には、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質は、DNAに結合すると、自身の他のコピーを動員し、DNAにわたり広がることができる。当業者であれば、ルーチンのアプローチを用いて、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質を本発明において用いることができるか否か検証することができる。この目的のため、このような当業者は、例えば、蛍光焦点(fluorescent foci)の形成またはゲルシフト(EMSA)等の数種の検査を用いることができる。EMSAは、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識されるDNA配列のゲル電気泳動が、組換えタンパク質の存在下または非存在下で行われる検査である。タンパク質の存在下におけるDNAが、タンパク質の非存在下よりも短い距離を移動する場合、このタンパク質は単独でDNAに結合することができ、従って、本発明の範囲内に包含される。DNA結合タンパク質の他のコピーの動員は、タグ付き、特に蛍光の認識部位を有するDNA配列を、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質のいくつかと接触させて置くことにより、可視化することができる。動員は、DNAにおける蛍光焦点により実証される。
細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質、そのアミノ酸配列および/またはこれをコードするヌクレオチド配列は、そのゲノムが完全にまたは部分的に配列決定されている細菌のGenbankまたはNCBIゲノムプロジェクト等のアミノ酸またはヌクレオチド配列データベースにおいてアクセスできる。必要であれば、当業者は、既に記載されているParBタンパク質配列を用いて、そのゲノムが未だ完全に配列決定されていない細菌、あるいはその細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質が未だ公知でない細菌におけるParB(latter)のアナログを特定してもよい。
有利には、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質は、バークホルデリア・セノセパシアに由来するParBタンパク質である。より詳細には、このタンパク質は、次の中から選ばれる。
- NCBIゲノムプロジェクトにおいてN° YP-002229191によりアクセスできるBcc株J2315のタンパク質等の「ParB-c1」と命名されたBccの1番染色体にコードされるParBタンパク質、
- 添付の配列表におけるタンパク質配列番号2に相当する、NCBIゲノムプロジェクトにおいてN° YP-002232636によりアクセスできるBcc株J2315のタンパク質等の「ParB-c2」と命名されたBccの2番染色体にコードされるParBタンパク質、
- 添付の配列表におけるタンパク質配列番号4に相当する、NCBIゲノムプロジェクトにおいてN° YP-002153395によりアクセスできるBcc株J2315のタンパク質等の「ParB-c3」と命名されたBccの3番染色体にコードされるParBタンパク質および
- NCBIゲノムプロジェクトにおいてN° YP-002235439によりアクセスできるBcc株J2315のプラスミドpBCJ2315のタンパク質等の「ParB-p1」と命名されたBccのプラスミドにコードされるParBタンパク質、
その誘導体または断片。
「細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の誘導体」は、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の配列、特に上に記す配列と、それぞれ少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%および/または少なくとも99%同一性を有するペプチドを意味する。従って、この誘導体の定義は、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質、特に、BccのParBタンパク質のホモログ、特に、株J2315のParB-c1、ParB-c2、ParB-c3およびParB-p1のホモログを網羅する。「BccのParBタンパク質のホモログ」は、バークホルデリア・セノセパシアとは異なる株または種から単離された、株J2315のBccのParBタンパク質の異なるまたは同等の形態の両方を意味する。
本発明における2アミノ酸配列間(または下に想定する通り2ヌクレオチド配列間)の「パーセンテージ同一性」は、比較する2配列間の同一アミノ酸(またはヌクレオチド)残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは、2配列間で最良のアライメント(最適アライメント)を実行した後に得られる。当業者であれば、BLAST等の相同性アルゴリズムまたはコンピュータプログラムを必要とする、このようなパーセンテージ同一性を得るための様々な技法を知っている。
パーセンテージ同一性は統計学的であり、2配列間の差はこれら配列に沿って分布される。2配列間の差は、異なる種類の配列改変、即ち、アミノ酸(またはヌクレオチド)残基の欠失、置換または付加からなっていてよい。
その上、配列のパーセンテージ同一性がタンパク質を参照して用いられる場合、同一でない残基は多くの場合、保存されたアミノ酸の置換により異なっており、その場合、アミノ酸は、電荷、親水性または疎水性性質等の類似の化学特性を有する他のアミノ酸に置換されており、従って、分子の機能的特性を変化させないことが知られている。配列が保存的置換により異なっている場合、配列のパーセンテージ同一性は、置換の保存的性質を考慮に入れるため、上向きに調整され得る。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するといわれている。このような調整を得るための手段は、当業者によく知られている。通常、これは、保存的置換を総ミスマッチではなく部分的ミスマッチとして計数するステップからなり、これにより、配列のパーセンテージ同一性を増加させる。
機能の観点から類似のアミノ酸を収載する保存的置換の表は、本技術水準でよく知られている。例えば、次の8群はそれぞれ、互いに保存的置換となるアミノ酸を含有する。(1)アラニン(A)、グリシン(G);(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);(4)アルギニン(R)、リシン(K);(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);(7)セリン(S)、スレオニン(T);および(8)システイン(C)、メチオニン(M)。
本発明において、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の誘導体は、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%の類似性をアミノ酸配列に有するポリペプチドである。
従って、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質とその誘導体との間、特に、BccのParBタンパク質とその誘導体との間の改変は、アミノ酸の置換、付加または欠失からなることができる。適用される改変の種類にかかわりなく、これらは、結合のためにその他の因子を要求せずにDNAに特異的に結合する細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の誘導体の能力、特に、BccのParBタンパク質の誘導体の能力を破壊しない。想定される置換は、均等のアミノ酸、即ち、構造上の相同性を有するアミノ酸、または細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の特性を実質的に改変しないアミノ酸の間の置換であり得る。変更形態として、想定される置換は、非均等のアミノ酸、即ち、構造上の相同性がないアミノ酸による置換であり得る。しかし、このような改変は、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の誘導体の能力、特に、DNAに特異的に結合するBccのParBタンパク質の誘導体の能力を破壊しない。
細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の誘導体、特に、BccのParBタンパク質の誘導体は、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の配列と比較、特に、その配列を上に記すBccのParBタンパク質と比較して、少なくとも1個の追加的なC末端および/またはN末端アミノ酸、翻訳後修飾および/または化学修飾、特に、グリコシル化、アミド化、アシル化、アセチル化、エチル化およびその分解を防ぐ保護基を有することができる。有利には、誘導体は、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の配列と比較、特に、BccのParBタンパク質と比較、より詳細には、その配列を上に記すBccのParBタンパク質と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個の追加的なC末端アミノ酸および/または1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個の追加的なN末端アミノ酸を有することができる。
細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の誘導体、特に、BccのParBタンパク質の誘導体は、その1(または複数個の)アミノ酸が、エナンチオマー、ジアステレオ異性体、D-立体配座天然アミノ酸、ベータアミノ酸、置換されたアルファアミノ酸、希少アミノ酸、特に、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、アロ-ヒドロキシリシン、6-N-メチルリシン、N-エチルグリシン、N-メチルグリシン、N-エチルアスパラギン、アロ-イソロイシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸ならびに合成アミノ酸、特に、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、シクロヘキシル-アラニンおよびオメガアミノ酸からなる群から選ばれる誘導体であってもよい。細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の誘導体、特に、本発明に係るBccのParBタンパク質の誘導体は、レトロ-ペプチドおよびレトロ-インベルソ(inverso)ペプチドも網羅し、その1または複数個のアミノ酸の側鎖が、DNAに特異的に結合する誘導体の能力を改変しない化学基に置換されたペプチドも網羅する。
従って、想定される誘導体の種類にかかわりなく、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の誘導体、特に、BccのParBタンパク質の誘導体は、DNAに特異的に結合する能力を維持し、前記結合は、いかなる因子、特にいかなる有機因子、より詳細には、いかなるタンパク質因子にも依存しない。
本発明における「細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の断片」は、DNAに特異的に結合するその能力を維持している細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質、特に、BccのParBタンパク質のあらゆるパートまたはあらゆる部分を意味しており、前記結合は、他のいかなる因子、特にいかなる有機因子、より詳細にはいかなるタンパク質因子にも依存しない。細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の断片、特に、BccのParBタンパク質の断片は、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質と比較、特に、BccのParBタンパク質と比較、より詳細には、その配列が上に記載されているBccのParBタンパク質と比較して、C末端側の端および/またはN末端側の端におけるアミノ酸が少なくとも1個少ない。
有利には、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質、特に、BccのParBタンパク質の断片は、少なくともDNA結合に関与するモチーフを含有する。前記モチーフは、Dubarryら、2006に記載されている構造等のへリックス-ターン-へリックス構造(HTH)を有するモチーフに相当する。HTHモチーフは特に、添付の配列表における配列番号2の配列のアミノ酸202および225の間に存在する配列に相当する。しかし、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質が全て、必ずしもHTH構造のDNA結合モチーフを有するわけではないことに留意されたい。例えば、細菌TP228におけるParBタンパク質のホモログは、C末端側の端にリボン-へリックス-へリックス構造のモチーフを有する(Golovanovら、2003)。
明らかに、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質、特に、BccのParBタンパク質またはその誘導体もしくは断片の1種に相当する第一のポリペプチドを含む融合タンパク質は、細菌分配系のタンパク質またはそのホモログの1種それ自体は網羅しない。
本発明の真核生物発現ベクターにおいて、ヌクレオチド配列は、容易に検出可能なポリペプチドまたは遺伝子発現の調節に関与するポリペプチドのいずれかである第二のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。
本発明における「容易に検出可能なポリペプチド」は、顕微鏡、シンチグラフィおよび蛍光等の有利には非侵襲性である適切な検出技法を適用することにより検出され得るポリペプチドを意味する。このような容易に検出可能なポリペプチドを含む融合タンパク質は特に、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質、特に、BccのParBタンパク質が結合することのできるDNA部位の特定および位置決めを可能にし、このタンパク質は、融合タンパク質の他のポリペプチドに相当する。
第一の実施形態において、容易に検出可能なポリペプチドは、適合した基質の存在下に置かれたとき等の特定の条件下で検出可能な、必要に応じて定量化可能なシグナルを発生させることのできる酵素でよい。例証を目的とするものであって、非限定的な例ではないが、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ(AChE)、グルコースアミラーゼおよびリゾチームについて言及することができる。
第二の実施形態において、容易に検出可能なポリペプチドは、エクオリン;オベリン(obeline);ルシフェラーゼならびに緑色蛍光タンパク質(GFP)、e-GFPタンパク質(強化GFP)、強化シアン蛍光タンパク質(eCFP)、強化黄色蛍光タンパク質(eYFP)、強化青色蛍光タンパク質(eBFP)、赤色蛍光タンパク質DsRedおよびKeima等の蛍光タンパク質や、405nmの光で活性化できるGFPタンパク質(PA-GFP)、pH感受性GFPタンパク質(PHluorin)、Ceruleanタンパク質、azuriteタンパク質、Venusタンパク質、mCherryタンパク質およびCitrinタンパク質等のこれらの変種等の生物発光または蛍光ポリペプチドでよい。
本発明における「遺伝子発現の調節に関与するポリペプチド」は、これが存在すると、該ポリペプチドの非存在下である以外は同一操作条件下における同一遺伝子の発現と比較して、少なくとも1個の遺伝子の発現を増加または低下させるポリペプチドを意味する。
当業者であれば、1(または複数)の遺伝子の発現に影響を及ぼし得る様々な種類のポリペプチドを知っている。有利には、このようなポリペプチドは、正もしくは負の転写因子、一般転写因子、プロモーターの発現のレギュレーター、クロマチンリモデリング因子および隣接する遺伝子の位置を改変する因子、これらの誘導体または断片の中から選ぶことができる。
例えば、遺伝子発現の調節に関与するポリペプチドは、転写複合体の動員またはクロマチンの状態のいずれかにおいて、あるいはその発現を調節しようとする遺伝子の位置において、正または負に、直接的または間接的に作用し得る。クロマチンの状態に作用するポリペプチドは、DNA脱凝縮(decompaction)、DNA展開、シトシンのメチル化またはヒストンのアセチル化に作用し得る。その発現が調節される遺伝子の位置に作用する一ポリペプチドは、隣接する遺伝子を特定のオルガネラまたは特定の細胞区域(zone)にアドレス指定(addressing)するまたは動員するのを可能にする因子であり得る。非限定的な例として、特定のオルガネラまたは特定の区域は、細胞膜または核周縁部であり得る。このアドレス指定は、特定のオルガネラもしくは特定の細胞区域に特異的なタンパク質または前記タンパク質に対して作製されたモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、それらの誘導体または断片が関与するものであり得る。
上に定義するもの等の因子またはレギュレーターの「誘導体」は、公知の、遺伝子発現に負または正に影響を与えることができる、上に定義するもの等の因子またはレギュレーターと少なくとも40%類似性および/または少なくとも30%同一性を有するポリペプチドを意味する。上に定義するもの等の因子またはレギュレーターの「断片」は、遺伝子発現に影響を与えるその能力を維持している、上に定義するもの等の因子またはレギュレーターのいずれかのパートまたはいずれかの部分を意味する。その上、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の誘導体および断片に関して記載されている好ましい実施形態は、上に定義するもの等の因子またはレギュレーターの誘導体および断片に変更すべきところは変更して適用できる。
より詳細には、遺伝子発現の調節に関与するポリペプチドは、下に記す非包括的な例のリストから選ばれる。
- 転写因子TFIIA、TFIIB、TFIID、TRIIE、TFIIF、TFIIH、NF-カッパーB、SP1、熱ショック因子、
- ラミン、膜タンパク質、膜タンパク質に対して作製された抗体または抗体断片、
- エストロゲン受容体、レチノイン酸受容体、グルココルチコイド受容体、アンドロゲン受容体、3-ケトステロイドの受容体または甲状腺ホルモンの受容体等の核受容体、
- アセチラーゼ、デアセチラーゼ、メチル-トランスフェラーゼ、ポリADP-リボシルトランスフェラーゼ、ユビキチンリガーゼ、ホスファターゼ、キナーゼまたはsumo化酵素。
本発明の真核生物発現ベクターにおいて、ヌクレオチド配列は、先に定義されたもの等の第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードし、前記ヌクレオチド配列は、細胞内局在化シグナルをさらにコードすることができる。
しかし、本発明において用いられる融合タンパク質は、特にそこに含有される第一のポリペプチドのサイズが小さいおかげで、サイズが小さいものであり得、細胞内局在化シグナルの存在は必須ではなく、融合タンパク質は、細胞および核容積内を自由に拡散することができる。
融合タンパク質が、先に定義されたもの等の第一および第二のポリペプチドに動作可能に連結した細胞内局在化シグナルを含む場合、該シグナルは、核局在化シグナルでよい。2個のポリペプチドの一方または他方の機能に影響を与えることなく、融合タンパク質の2個のポリペプチドの一方の端に付いた前記シグナルは、細胞核内への融合タンパク質の輸送を促進する。当業者であれば、本発明において用いることのできる様々な細胞内局在化シグナル、特に、様々な核局在化シグナルの知識を有する。
本発明はまた、先に定義されたもの等の真核生物発現ベクターのヌクレオチド配列にコードされる特定の融合タンパク質に関する。
従って、第一の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、
- 特に先に定義されたもの等の結合のためにその他の因子を必要としない、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質、その誘導体または断片に相当する第一のポリペプチドと、
- 特に先に定義されたもの等の遺伝子発現の調節に関与する第二のポリペプチドと、
を含む。
第二の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、
- 特に先に定義されたもの等のバークホルデリア・セノセパシアに由来するParBタンパク質、その誘導体または断片に相当する第一のポリペプチドと、
- 特に先に定義されたもの等の容易に検出可能な第二のポリペプチドと、
を含む。
実施形態にかかわりなく、本発明の融合タンパク質は、特に先に定義されたもの等の細胞内局在化シグナルを必要に応じて含むことができる。
本発明はまた、先に定義されたもの等の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
従って、本発明はまた、下に挙げる様々なポリヌクレオチドの中から選ばれる単離されたポリヌクレオチドに関する。
i)先に定義されたもの等の本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
ii)項目(i)において定義されたもの等のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド、
iii)項目(i)および(ii)において定義されたもの等のポリヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる、少なくとも14ヌクレオチド、特に、少なくとも18ヌクレオチドのポリヌクレオチド。
本発明における「ポリヌクレオチド」は、核酸、核(nucleic)配列、核酸配列、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列、一本鎖DNA、二本鎖DNAまたはRNAを意味する。本発明のポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチドと、必要に応じて非天然ヌクレオチドを含む。
本発明のポリヌクレオチドは、その天然状態、即ち、その天然染色体環境におけるヌクレオチド配列に相当しない。ポリヌクレオチドは、本発明の第一および第二のポリペプチド等のポリペプチドをコードする天然ポリヌクレオチドのいずれにも相当しない。反対に、本発明のポリヌクレオチドは、単離され、必要に応じて精製され、その環境は結果的に改変されている。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝的組換えまたは化学合成により得ることもできる。
高ストリンジェンシー条件は、2本の相補的ヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの維持を可能にする温度およびイオン強度の条件に相当する。当業者であれば、特にヌクレオチド配列のサイズとの関連において、Sambrookら(Molecular cloning、1989、Noland C.編、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)による教示を参照しつつ、最もよく適合した高ストリンジェンシーの条件を決定する仕方を知っているであろう。非限定的な例証目的の例として、上述の項目(iii)のポリヌクレオチドを定義する目的における、ハイブリダイゼーションステップにおける高ストリンジェンシーの条件は、有利には次の通りである。ハイブリダイゼーション、特に、DNA-DNAまたはDNA-RNA型のハイブリダイゼーションは、2ステップで行う。(1)0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム、50%ホルムアミド、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、10×デンハート液、5%デキストラン硫酸および1%サケ精子DNAを含有する溶液を含むリン酸緩衝液(20mM、pH7.5)における42℃、3時間のプレハイブリダイゼーション、(2)適切に所謂20時間、プローブサイズに依存する温度(例えば、サイズ>100ntのプローブに対し42℃)のハイブリダイゼーションと、続く、0.3M NaCl、0.03Mクエン酸ナトリウムおよび2%SDSを含有する溶液における20分間20℃の洗浄2回、0.015M NaCl、1.5mMクエン酸ナトリウムおよび0.1%SDSを含有する溶液における20分間20℃の洗浄1回。最後の洗浄は、0.015M NaCl、1.5mMクエン酸ナトリウムおよび0.1%SDSを含有する溶液において、サイズ>100ntのプローブに対し30分間60℃で行われる。
項目(iii)のポリヌクレオチド、即ち、項目(i)および(ii)において定義されたもの等のポリヌクレオチドと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドは、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250または少なくとも300ヌクレオチドを含む。
本発明のポリヌクレオチドは、先に定義されたもの等の細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の1種と少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%および/または少なくとも99%同一性を有する少なくとも1種のヌクレオチド配列を含み、特に、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質は、バークホルデリア・セノセパシアに由来するParBタンパク質であり、より詳細には、「ParB-c1」と命名されたBccの1番染色体に保有されるParBタンパク質、「ParB-c2」と命名されたBccの2番染色体に保有されるParBタンパク質、「ParB-c3」と命名されたBccの3番染色体に保有されるParBタンパク質および「ParB-p1」と命名されたBccのプラスミドに保有されるParBタンパク質である。
例えば、本発明のポリヌクレオチドは、添付の配列表における配列番号1の配列(即ち、「ParB-c2」と命名されたBccの2番染色体に保有されるタンパク質ParBをコードする配列)または添付の配列表における配列番号3の配列(即ち、「ParB-c2」と命名されたBccの3番染色体に保有されるタンパク質ParBをコードする配列)と少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%および/または少なくとも99%同一性を有する少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、明らかに、先に想定された細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の断片をコードする配列、これら断片をコードする配列と少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%および/または少なくとも99%同一性を有する配列ならびに前記配列と相補的な配列も網羅する。想定される断片の配列および細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列から、特定の断片をコードするヌクレオチド配列を特定することは、当業者にとって容易である。
本発明のポリヌクレオチドは、明らかに、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の先に想定された誘導体をコードする配列、これら誘導体をコードする配列と少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%および/または少なくとも99%同一性を有する配列ならびに前記配列と相補的な配列も網羅する。想定される誘導体の配列および細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列から、特定の誘導体をコードするヌクレオチド配列を特定することは、当業者にとって容易である。
その上、本発明のポリヌクレオチドは、先に想定されたもの等の容易に検出可能なポリペプチドまたは遺伝子発現の調節に関与するポリペプチドのいずれかをコードする少なくとも1種の他のヌクレオチド配列、これらポリペプチドをコードする配列と少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%および/または少なくとも99%同一性を有する配列ならびに前記配列と相補的な配列を含む。
(リボ)核酸を比較する場合、それらの類似性を決定してもよい。この場合、類似性は、コドンレベルで評価される。2種のコドンが、同一アミノ酸をコードする2種の異なるコドンまたは2種の類似のアミノ酸をコードする2種の異なるコドンである場合、両者は類似している。
本発明のポリヌクレオチドは、先に定義されたもの等の細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の1種と少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%および/または少なくとも99%類似性を有する少なくとも1種のヌクレオチド配列を含み、特に、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質は、バークホルデリア・セノセパシアに由来するParBタンパク質であり、より詳細には、「ParB-c1」と命名されたBccの1番染色体に保有されるParBタンパク質、「ParB-c2」と命名されたBccの2番染色体に保有されるParBタンパク質、「ParB-c3」と命名されたBccの3番染色体に保有されるParBタンパク質および「ParB-p1」と命名されたBccのプラスミドに保有されるParBタンパク質である。
従って、本発明のポリヌクレオチドは、添付の配列表における配列番号1の配列(即ち、「ParB-c2」と命名されたBccの2番染色体に保有されるParBタンパク質をコードする配列)または添付の配列表における配列番号3の配列(即ち、「ParB-c2」と命名されたBccの3番染色体に保有されるParBタンパク質をコードする配列)と少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%および/または少なくとも99%類似性を有する少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、明らかに、先に想定された細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の断片をコードする配列、これら断片をコードする配列と少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%および/または少なくとも99%類似性を有する配列ならびに前記配列と相補的な配列も網羅する。想定された断片の配列および細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列から、特定の断片をコードするヌクレオチド配列を特定することは、当業者にとって容易である。
本発明のポリヌクレオチドは、明らかに、先に想定された細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質の誘導体をコードする配列、これら誘導体をコードする配列と少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%および/または少なくとも99%類似性を有する配列ならびに前記配列と相補的な配列も網羅する。想定された誘導体の配列および細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列から、特定の誘導体をコードするヌクレオチド配列を特定することは、当業者にとって容易である。
その上、本発明のポリヌクレオチドは、先に想定されたもの等の容易に検出可能なポリペプチドまたは遺伝子発現の調節に関与するポリペプチドのいずれかをコードする少なくとも1種の他のヌクレオチド配列、これらポリペプチドをコードする配列と少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%および/または少なくとも99%同一性を有する配列ならびに前記配列と相補的な配列を含む。
最後に、本発明のポリヌクレオチドは、特に、先に定義されたもの等の細胞内局在化配列をコードする少なくとも1種の他のヌクレオチド配列を含むことができる。
本発明はまた、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有するヌクレオチド配列を含む真核生物ベクターに関する。真核生物ベクターは、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有する、先に定義されたもの等の真核生物型選択マーカーをさらに含む。本発明の真核生物ベクターは通常、プラスミドの形態である。
有利には、真核生物ベクターは、組み込み型真核生物ベクターである。「組み込み型真核生物ベクター」は、そのヌクレオチド配列の全体または一部が、前記ベクターが挿入された生物のゲノムに組み込まれ得るベクターを意味する。その上、宿主生物のゲノムへの組み込みは、特定の所定のゲノム部位に、あるいはランダムに起こり得る。標的化された組み込みは、相同組換えを利用する。この場合、組み込み型真核生物ベクターまたはPCRにより作製された前記配列を保有する断片は、ヌクレオチド配列のいずれかの側に細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有してこの相同組換えを可能にする、適切な配列を有する。
本発明において、原核生物のプラスミドまたは染色体DNAの分配系に属するタンパク質が結合するいかなる認識部位を用いてもよい。Dubarryら、2006による論文は、細菌DNAの分配系に属する異なるDNA結合タンパク質により認識される異なる認識部位について記載する。これらの認識部位は全て、本発明の範囲内に収まる。本発明において用いられる認識部位は、好ましくは二本鎖である。
有利には、本発明において用いられる、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される認識部位は、ヌクレオチド配列(I)またはヌクレオチド配列(I)と相補的な配列のものである。
N1N2TN3N4N5N6CGN7N8N9N10AN11N12(I)(添付の配列表における配列番号5)(式中、ヌクレオチドN1およびN12は、同一もしくは異なっているまたはA、G、CもしくはTの中から選ばれ、ヌクレオチド対(N6、N7)、(N5、N8)、(N4、N9)、(N3、N10)および(N2、N11)は互いに独立的に、(A、T)、(T、A)、(C、G)および(G、C)により形成される群から選ばれ、ヌクレオチドN1およびN12は場合により、必要に応じて存在しない)。
有利には、上述の配列(I)において、N1は存在しないまたはG、CもしくはTを表し;対(N6、N7)は、(A、T)、(T、A)または(G、C)を表し;対(N5、N8)は、(C、G)または(T、A)を表し;対(N4、N9)は、(A、T)、(T、A)、(C、G)または(G、C)を表し;対(N3、N10)は、(G、C)または(T、A)を表し;対(N2、N11)は、(T、A)または(G、C)を表し、N12は存在しないまたはAもしくはCを表す。
認識部位において、対称的性質(N2〜N6とN7〜N11との)は、認識に最も重要である。従って、同じ対称的機構の配列であれば、必ずしもヌクレオチド同一性を有する必要はなく、同じ特徴を有することが可能である。
特に、本発明において用いられる、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される認識部位は、ヌクレオチド配列(II)またはヌクレオチド配列(II)と相補的な配列のものである。
N13TTN14N15N16N17CGN18N19N20N21AAC(II)(添付の配列表における配列番号6)
(式中、
- N13は、G、CまたはTを表し、
- 対(N14、N21)は、(T、A)または(G、C)を表し、
- 対(N15、N20)は、(A、T)または(T、A)を表し、
- 対(N16、N19)は、(T、A)または(C、G)を表し、
- 対(N17、N18)は、(G、C)または(A、T)を表す)。
有利には、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される認識部位は、次のヌクレオチド配列の中から選ばれるヌクレオチド配列を有する。
- GTTTATGCGCATAAAC(Sc2;添付の配列表における配列番号7)、
- CTTTATGCGCATAAAC(Sc2;添付の配列表における配列番号8)、
- GTTGTCACGTGACAAC(Sc3;添付の配列表における配列番号9)、
- TTTGTCACGTGACAAC(Sc3;添付の配列表における配列番号10)、
- CTTGTCACGTGACAAC(Sc3;添付の配列表における配列番号11)、
およびこれら配列のいずれか一配列と相補的な配列。
本発明の必要に応じて組み込み型の真核生物ベクターのヌクレオチド配列は、先に定義されたもの等の細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも2、少なくとも3または少なくとも4個の認識部位を含む。本発明のポリヌクレオチドが、少なくとも2個の認識部位を含む場合、2個の連続した認識部位は、互いに同一であっても、異なっていてもよい。本発明のポリヌクレオチドが、少なくとも2個の認識部位を含む場合、2個の連続した認識部位は、少なくとも1ヌクレオチド、特に少なくとも10ヌクレオチド、より詳細には少なくとも50ヌクレオチド、さらに詳細には少なくとも100ヌクレオチド離間していてよい。
本発明に係る必要に応じて組み込み型の真核生物ベクターのヌクレオチド配列は、天然のものであっても、合成のものであっても、天然配列の変異により得られたものであってもよい。
本発明に係る必要に応じて組み込み型の真核生物ベクターのヌクレオチド配列は、有利には、細菌分配系に関与するセントロメア配列を含む。特に、このセントロメア配列は、枯草菌、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)その他等のいずれかの細菌に由来する配列であり得る。
特定の一実施形態において、本発明に係る必要に応じて組み込み型の真核生物ベクターのヌクレオチド配列は、有利には、細菌バークホルデリア・セノセパシア(Bcc)の分配系に関与するセントロメア配列、ParSの名称で知られている配列を含む。さらに詳細には、このヌクレオチド配列は、次の中から選ばれる配列に相当する。
- GenbankにおいてN° AM747720によりアクセスできるBcc株J2315の1番染色体のヌクレオチド配列から得ることができる、「ParS-c1」と命名されたBccの1番染色体に保有されるParS配列、この配列に含有される2個の認識部位はそれぞれ、ヌクレオチド26477〜26492および28403〜28418に存在する、
- GenbankにおいてN° AM747721によりアクセスできるBcc株J2315の2番染色体のヌクレオチド配列から得ることができ、添付の配列表における配列番号12のタンパク質に相当する、「ParS-c2」と命名されたBccの2番染色体に保有されるParS配列、
- GenbankにおいてN° AM747722によりアクセスできるBcc株J2315の3番染色体のヌクレオチド配列から得ることができ、添付の配列表における配列番号13のタンパク質に相当する、「ParS-c3」と命名されたBccの3番染色体に保有されるParS配列、
- GenbankにおいてN° AM747723によりアクセスできるBcc株J2315のプラスミドpBCJ2315のヌクレオチド配列から得ることができる、「ParS-p1」と命名されたBccのプラスミドに保有されるParS配列、この配列に含有される3個の認識部位はそれぞれ、ヌクレオチド92285〜92300、92385〜92400および92438〜92453に存在する、
またはこれら配列のいずれか1配列と相補的な配列。
本発明はまた、先に定義されたもの等の真核生物発現ベクターまたは先に定義されたもの等の必要に応じて組み込み型の真核生物ベクターにより形質転換された、またはこれを含む、真核生物宿主生物に関する。
「真核生物宿主生物」は、先に定義されたもの等の真核生物発現ベクターまたは先に定義されたもの等の組み込み型真核生物ベクターが挿入されている、単細胞または多細胞、下等または高等のいずれかの真核生物を意味する。
従って、本発明に係る真核生物宿主生物は、酵母または真菌等の微生物でよい。
変更形態として、本発明に係る真核生物宿主生物は、昆虫細胞または哺乳類細胞、特に、ヒト細胞、ハムスター細胞、サル細胞、ウサギ細胞、マウス細胞、ラット細胞その他等の動物細胞;植物細胞;植物またはヒトを除く動物でよい。実際には、宿主生物は、トランスジェニック植物またはヒトを除くトランスジェニック動物でよい。
細胞の形式の本発明の宿主生物は、懸濁培養物、培養皿内の培養物、組織培養物または器官培養物の形態で供給することができる。
当業者であれば、先に定義されたもの等の真核生物発現ベクターまたは先に定義されたもの等の組み込み型真核生物ベクターの、宿主生物への効率的な挿入のための様々な形質転換またはトランスフェクション方法を知っている。本発明に係る発現ベクターの挿入は、先に定義されたもの等の融合タンパク質の産生をもたらす。
具体例として、非包括的な様式において、この方法は、エレクトロポレーション;リポフェクション;マイクロインジェクション;微粒子銃(もしくは遺伝子銃);アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefasciens)を用いた植物の生物学的形質転換;温度上昇、熱ショック、界面活性剤処理もしくはポリエチレングリコール処理による化学的透過処理を介した形質転換;DEAE-デキストラン方法を用いた形質転換またはウイルス、ビリオンもしくはウイルス粒子を介した挿入でよい。
有利には、本発明の宿主生物は、先に定義されたもの等の真核生物発現ベクターおよび先に定義されたもの等の必要に応じて組み込み型の真核生物ベクターにより形質転換されたまたはこれを含む宿主生物である。
特に、本発明の宿主生物は、先に定義されたもの等の細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有するヌクレオチド配列(即ち、本発明の組み込み型真核生物ベクターに存在するヌクレオチド配列)をそのゲノムに組み込んでいる、あるいはそれがプラスミドまたはトランスポゾンとして含有する外来DNAに組み込んでおり、先に定義されたもの等の融合タンパク質(即ち、本発明の真核生物発現ベクターに存在するヌクレオチド配列にコードされる融合タンパク質)を発現する宿主生物である。
より詳細には、本発明の宿主生物は、先に定義されたもの等の融合タンパク質を一過的に発現する。変更形態として、本発明の宿主生物は、先に定義されたもの等の融合タンパク質を構成的に発現する。
先に説明した通り、先に定義されたもの等の細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有するヌクレオチド配列は、相同組換えを用いて宿主生物の特定の所定の部位に挿入することができる。有利には、この場合、宿主生物は酵母である。この場合、また、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有するヌクレオチド配列の挿入部位に隣接する遺伝子が分かっている。
変更形態として、宿主生物のゲノムにおける挿入は、ランダムに行うことができる。この場合、当業者は、従来の分子生物学的技法を用いて、挿入の位置を決定することができる。この位置の知識により、当業者は、対象の部位で挿入が起こった宿主生物を選択することができる。よって、選択された宿主生物は、安定的な哺乳類細胞株等の安定的な細胞株を産生することができる。
従って、挿入が定方向で行われたにしろ、ランダム様式で行われたにしろ、癌遺伝子近傍、腫瘍サプレッサー近傍、遺伝的疾患に関与する遺伝子近傍その他の部位等の対象の1または複数の部位で挿入が起こった宿主生物を得ることが可能である。
この場合、宿主生物により発現される融合タンパク質が、特に、先に定義されたもの等の遺伝子発現の調節に関与するポリペプチドを含むのであれば、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有するヌクレオチド配列の挿入部位に隣接する遺伝子の発現を正または負に制御することが可能である。
同様に、この発現を制御することができる分子を検出することが可能である。「この発現を制御することができる分子」は、遺伝子の発現に影響を及ぼし得る天然分子または合成分子、特に、生物分子または生物活性分子を意味する。有利には、この分子は、エピトープ;抗原;ペプチド;オリゴペプチド;酵素等のタンパク質;抗体および抗体断片;細胞または膜受容体;多糖;ならびに一本鎖もしくは二本鎖DNA、RNA、iRNA、miRNAおよびアプタマー、PNA(ペプチド核酸)またはLNA(ロックト核酸)等の核分子の中から選ばれる。前記分子は、治療学の分野における用途を有し得る。
本発明は、対象の遺伝子の発現を正または負に制御することができる分子を検出するための方法を提案する。本方法は、
- 本発明に係る遺伝子発現の調節に関与するポリペプチドを含む融合タンパク質を発現し、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有するヌクレオチド配列が対象の遺伝子近傍に挿入されている本発明の宿主生物と、前記分子とを接触させるステップと、
- 該対象の遺伝子の発現を検出し、前記分子の非存在下で得られる発現と比較するステップと、
を含む。
被験分子が存在するか否かにかかわらず発現が同一である場合、この分子は、このような発現に効果がない。反対に、2つの発現間に差が生じる場合、被験分子は、この発現に直接または間接の、正または負の影響を有する。
変更形態として、宿主生物により発現される融合タンパク質が、容易に検出可能なポリペプチドを含む場合、ゲノムDNAまたはプラスミドもしくはトランスポゾン等の宿主生物に含有される外来DNAの対象の部位の位置と、正常条件下またはこの位置に影響を与えることができる分子の存在下においてその動態をin vivoで検出することが可能である。
「この位置に影響を与えることができる分子」は、遺伝子の位置を改変し得る天然分子または合成分子、特に、生物分子または生物活性分子を意味する。有利には、この分子は、エピトープ;抗原;ペプチド;オリゴペプチド;酵素等のタンパク質;抗体および抗体断片;細胞または膜受容体;多糖;ならびに一本鎖もしくは二本鎖DNA、RNA、iRNA、アプタマー、PNAまたはLNA等の核分子の中から選ばれる。
本発明は、対象の遺伝子または部位の位置に影響を与えることのできる分子を検出するための方法を提案する。本方法は、
- 本発明の容易に検出可能なポリペプチドを含む融合タンパク質を発現し、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有するヌクレオチド配列が対象の遺伝子または部位近傍に挿入されている本発明の宿主生物と、前記分子とを接触させるステップと、
- 容易に検出可能なポリペプチド、従って、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される認識部位の位置、従って同様に、対象の遺伝子または部位の位置を検出し、前記分子の非存在下で得られる対象の遺伝子または部位の位置と比較するステップと、
を含む。
被験分子が存在するか否かにかかわらず位置が同一である場合、この分子は、この発現に効果がない。反対に、2つの位置間に差が生じる場合、被験分子は、位置に直接的または間接的に影響する。
特定の一実施形態において、対象の部位は、DNA二本鎖切断に相当する。この場合、この対象の部位の位置の追跡は、この二本鎖切断の修復におけるDNA切除(容易に検出可能なポリペプチドにより放射される検出可能なシグナルの消失)の研究を可能にし、この分解に関与し、この過程に影響のある分子の検出を可能にする。さらなる変更形態として、本発明の方法は、二本鎖切断の2端のうち少なくとも一方のモニタリングおよびこれによる切断部位に隣接するDNA端の維持に関与する分子の検出を可能にする。この特定の実施形態において特定される分子は、特に、癌研究および抗癌、遺伝毒性処理に対する応答等の分野における治療関連のものであり得る。
変更形態として、本発明は、ゲノムまたは宿主生物に含有される外来DNAにおける対象の部位または遺伝子の動態を研究するための方法に関する。本方法は、
- 本発明の容易に検出可能なポリペプチドを含む融合タンパク質を発現し、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有するヌクレオチド配列が対象の遺伝子または部位近傍に挿入されている、本発明に係る宿主生物を用意するステップと、
- T1およびT2(T2>T1)と命名される少なくとも2つの異なる時点において、容易に検出可能なポリペプチド、従って、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される認識部位の位置、従って同様に、対象の遺伝子または部位の位置を検出し、時点T1において得られる対象の遺伝子または部位の位置を、時点T2において得られる位置と比較するステップと、
を含む。
この特定の形態の実施形態において、検出は、持続的に、あるいはTn(nは、1〜10000の間の整数を表し、各時点Tx(xは1〜9999間の整数を表す)はTx+1から分離される)と命名される異なる時点で、1m秒〜10時間の時間行うことができ、この分離時間は、場合により定数または変数となる。
従って、本発明は、真核生物におけるin vivoでの遺伝子の発現の制御において用いるための、あるいは真核生物におけるin vivoでのDNA遺伝子座の位置、動態もしくは分解(または代謝)またはDNA配列の組換えもしくは交換を検出するための、先に定義されたもの等の真核生物発現ベクター、先に定義されたもの等の融合タンパク質、先に定義されたもの等のポリヌクレオチド、先に定義されたもの等のヌクレオチド配列、先に定義されたもの等の必要に応じて組み込み型の真核生物ベクターおよび先に定義されたもの等の宿主生物の中から選ばれる本発明の要素に関する。
本発明はまた、真核生物においてin vivoで遺伝子の発現を制御することのできる分子を検出するための、あるいは真核生物においてin vivoでDNA遺伝子座の位置、動態もしくは分解(または代謝)または組換えもしくはDNA配列交換に影響を与えるための、先に定義されたもの等の真核生物発現ベクター、先に定義されたもの等の融合タンパク質、先に定義されたもの等のポリヌクレオチド、先に定義されたもの等のヌクレオチド配列、先に定義されたもの等の必要に応じて組み込み型の真核生物ベクターおよび先に定義されたもの等の宿主生物の中から選ばれる本発明の少なくとも一要素の使用に関する。
本発明の系対象のこれらの使用において、DNA遺伝子座および配列は、内在性であっても、外来性、特にプラスミドまたはトランスポゾン上のものであってもよい。
当業者であれば、添付の図面を参照しつつ、非限定的な説明として記載されている下の実施例を読むことにより、本発明の他の特徴および利点がさらに明らかになるであろう。
pMLBADcat-ParB-c2::mCherryプラスミドの円形図である。 pMLBADcat-ParB-c2::eGFPプラスミドの円形図である。 pDAG512プラスミドの円形図である。 pDAG514プラスミドの円形図である。 酵母における発現のためのParB融合体を含有するベクターの略図である。 セントロメア配列ParS-c2およびParS-c3の略図である。 哺乳類細胞におけるParB融合タンパク質の発現ベクターの略図である。 哺乳類細胞への組み込みのためのParS-c2およびParS-c3セントロメア(centrometric)配列の略図である。 ParS-c2コンストラクトがゲノムに挿入されている(ParS-c2)または挿入されていない(WT)、コンストラクトpCM189 ParB-c2-mCherryを発現する酵母細胞の写真である。 水(偽)または配列ParS-c2もしくはParS-c3(ParS)を含有するプラスミドを同時トランスフェクトした、コンストラクトpeGFP-c2 ParB-c3-GFPまたはpeGFP-c2 ParB-c2-mCherryのいずれかを一過的に発現するヒトHeLa細胞の写真である。バー;15μm。 単一のParS-c2コンストラクトを安定的に組み込んだ、プラスミドpFG9からParB-mcherryを一過的に発現するヒトHeLa細胞の写真である。 ParS-c2/ParB-c2-mCherry局在化系を用いた、HML遺伝子座の経時的な動きの例を示す。 時間に応じた、HMLにおける蛍光標識の位置のモニタリングを例示する図である。取得におけるHMLのパスウェイを示す(図10A)。時間に応じた、HMLにおける蛍光標識の位置のモニタリングを例示する図である。平均二乗変位(MSD)解析を用いたHMLの動きの特性評価を示す(図10B)。 HOエンドヌクレアーゼによる一回の二本鎖切断を誘導した際の、MAT遺伝子座に挿入されたParS-c2配列の分解を示す図である。ParS-c2配列は、ParB-c2-mCherry(ParB-c2-mCherry)によりモニターされ、MAT遺伝子座もモニターされる(Mat-YFP)。バー;2μm。 図11に示す細胞の蛍光シグナルの定量化を例示する図である。
I.用いた技法
I.1.ParB発現ベクターの構築
次のプライマーEおよびFによるPCRを用いて、それぞれプラスミドpMLBADcat-ParB-c2::mCherry(図1A)およびpMLBADcat-ParB-c2::eGFP(図1B)からParB-c2-mCherryおよびParB-c3-GFPを増幅させた。
E:5'-ATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTA-3'(添付の配列表における配列番号14)および
F:5'-GGAATTGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3'(添付の配列表における配列番号15)。
PCR産物をBamH1/Not1消化し、次に、ParB-c2-mCherryに対してはpCM189酵母、ParB-c3-GFPに対してはpCM184のBamH1/Not1消化した発現ベクターに挿入して、pFG7およびpFG8を作製した。
哺乳類細胞のため、Clontech(C)(GenBank受託番号:U57606)のpeGFP-c2プラスミドをNhe1/HindIIIで消化して、GFPコード配列を除去した。次に、プラスミドpMLBADcat-ParB-c2::mCherryまたはpMLBADcat-ParB-c2::eGFPのParB-c2-mCherryまたはParB-c3-GFPのいずれかを含有するNhe1/HindIII断片を、消化したpeGFP-c2プラスミドに挿入して、pFG9およびpFG10を作製した。
I.2.ParS配列を含有するプラスミドの構築
細菌配列ParS-c2およびParS-c3を含有するプラスミドは、以前にクローニングされている(Dubarryら、2006)。酵母シャトルプラスミドpDAG512(ParS-c2;図1C)およびpDAG514(ParS-c3;図1D)をBglII/Spe1で消化して、URA3マーカーを切除した。
次に、この直鎖状ベクターを、それぞれプラスミドpAG25およびpAG32のNATマーカーまたはHygroマーカーのいずれかを含有するBglII/Spe1断片と会合させて、プラスミドpFG2およびpFG4を作製した。
哺乳類細胞のベクターのため、ParS-c2またはParS-c3を含有するBamH1/BglII断片を、BamH1消化したpMSCV-Hygroベクター(Clontech(C)、Cat.No.634401)にライゲーションして、pFG5およびpFG6を作製した。
I.3.組み込みのためのParS配列の増幅
HMLまたはMAT遺伝子座への組み込みのため、鋳型としてpFG2を用いたPCRに、オリゴヌクレオチドGおよびHを用いた。
G:5'-CTTCAAAGAAATATTTAAACTCATTTATGGCTTTTAGAGCATATTACTCAGTGACACTATAGAACGCGGCCGCCA-3'(添付の配列表における配列番号16)および
H:5'-TCAGCGAGCAGAGAAGACAAGACATTTTGTTTTACACCGGAGCCAAACTGTATAGGGAGACCGGCAGATCCGCGG-3'(添付の配列表における配列番号17)。
ParS-NAT配列の増幅には、100μlのバッファー1×Go Taq、2%DMSO、200μM dNTP、1μMの各プライマーにおけるTaqおよびPhusion(2/1U)DNAポリメラーゼの混合物を用いた。
次の通りにPCR反応を行った。98℃2分間、35サイクルの98℃30秒間、54℃30秒間、72℃2.5分間、続いて10分間の期間の72℃。次に、PCR Quiagen精製キットを用いて増幅産物を精製した。その5μgを用いて、W303遺伝的背景の野生型酵母の株を形質転換した。
I.4.ParS-NAT配列の組み込み
Gietzら(Gietz & Schiestl、1991)により記載されたプロトコールに従って、酵母細胞を形質転換した。形質転換後に、細胞をYPDプレート上に広げて18時間置き、NATマーカーを発現させた。終濃度200μg/mlのノーセオスリシンを含有するYPDプレート上で細胞を複製させた。
2回のNAT選択ステップの後、ゲノムDNA抽出のために抵抗性クローンを選択し、ParS配列の組み込みをPCRにより検証した。次に、適切な組み込みを有するクローンをpFG7により形質転換し、最少培地における培養下に置いて、生細胞の顕微鏡観察を行った。
MATへの組み込みのため、MATの197kb上流の位置にオペレーター/YFP-リプレッサーを含有するYIL11株を用いて、HOエンドヌクレアーゼの開裂部位から100ntにParS-c2配列を組み込んだ。次に、誘導性バージョンのHOエンドヌクレアーゼを保有するプラスミドおよびpCM189 ParB-c2-mCherryで細胞を形質転換した。
I.5.HeLa細胞のトランスフェクション
5回目の継代のHeLa細胞(ATCC)を、2mlのDMEM培地、10%ウシ胎仔血清(FCS)、1×ピルビン酸ナトリウム中に400000細胞/ウェルの濃度となるよう6ウェルディッシュに播種した。
24時間37℃、5%CO2下で細胞を増殖させた。70%コンフルエンスのときにトランスフェクションを行った。要するに、1.5μgの各プラスミドを含有する100μlのOpti-MEMおよび10μlのFuGene HD(Roche)トランスフェクション試薬を共に混合し、20分間、外界温度でリポソーム作製を行った。次に、このトランスフェクション混合物を細胞に滴下し加えた。
用いた実験条件下では、良好な蛍光シグナルを得るには、20時間のトランスフェクション後インキュベーション期間で十分である。
I.6.HeLa細胞のトランスフェクション
8回目の継代のHela細胞を、10mlのDMEM培地、10%FCS、1×ピルビン酸ナトリウム中に2.5 106細胞の濃度となるよう100mmディッシュに播種した。組み込もうとする15μgの各PCR産物を含有する500μlのOpti-MEMおよび33.3μlのFuGene HD(Roche)トランスフェクション試薬を共に混合し、20分間、外界温度でリポソーム作製を行った。次に、このトランスフェクション混合物を細胞に滴下し加えた。
トランスフェクション5時間後に、0.1μM濃度の硫酸ブレオマイシンを添加して20時間置いた。ブレオマイシン添加20時間後に、細胞をPBSで2回洗浄し、次に、200μg/mlハイグロマイシンを含有する10mlの培地を添加した。非トランスフェクト対照細胞が全て対抗選択されるまで、培地を3日毎に交換しつつ細胞を数日間インキュベートした。
次に、35mm、60mm、100mmおよび140mmのディッシュに連続的に送ることにより、抵抗性クローンを濃縮し、次に凍結した。安定的なクローンを、2mlのDMEM培地、10%FCS、1×ピルビン酸ナトリウム中に400000細胞/ウェルの濃度となるよう6ウェルディッシュに播種した。24時間37℃、5%CO2下で細胞を培養した。70%コンフルエンスのときにトランスフェクションを行った。要するに、1.5μgの各プラスミドを含有する100μlのOpti-MEMおよび10μlのFuGene HD(Roche)トランスフェクション剤を共に混合し、20分間、外界温度でリポソーム作製を行った。次に、このトランスフェクション混合物を細胞に滴下し加えた。トランスフェクション24時間後にParB焦点のイメージングを行った。
I.7.画像取得
酵母のため、選択的YNBD培地において指数関数的増殖相の中期に達するまで、細胞を培養下に置いた。
CoolSnapHQカメラ(Princeton Instrument)および100×PL APO NA 1.4レンズを備えるOlympus IX-81倒立蛍光顕微鏡を用いて画像を取得した。ParB-c2-mCherryの露光時間は1000m秒であった。細胞に関する取得は、リアルタイム連続的取得(毎秒1画像を50秒間)により行った。
ヒト細胞の画像は、40×PL APO NA 0.95レンズおよびHamamatsuカメラと適合したNikon T5100倒立蛍光顕微鏡において取得した。取得時間は、400m秒〜1000m秒の間であった。
I.8.粒子動態の測定
画像のスタックをImage Jソフトウェア(http://rsbweb.nih.gov/ij/)にインポートし、次のパラメータ設定による粒子検出器およびトレーサープラグインを用いて、時間に応じた粒子の位置を自動的に決定した。半径=4、カットオフ=0、パーセンタイル=0.1、リンク=2、変位=8。
発生した軌跡を目視検査して、粒子追跡の精密度を検証した。平均二乗変位(MSD)および速度は、次式を用いて数学的に計算した。
II.結果
II.1.作製したコンストラクト
A.事前の所見
用いたDNA配列は、それぞれBccの2番染色体および3番染色体に存在する内在性ParS-c2およびParS-c3部位に相当した。各ParS配列は、ParBタンパク質の4個の結合部位(即ち、認識部位)を含有する。
これら配列の組み込みに利用できる選択マーカーは、酵母細胞ではノーセオスリシンおよびハイグロマイシンに対し抵抗性の遺伝子であり、哺乳類細胞ではハイグロマイシンに対し抵抗性の遺伝子である。
ParS組み込み配列は、PCRにより容易に作製できる。この増幅は、酵母細胞への標的化された組み込みと、哺乳類細胞へのランダムな組み込みを可能にする。
融合タンパク質をコードする核酸も提供される。このコンストラクトは、蛍光レポーターまたはGFPもしくはその変種mCherryと融合したParB-c2またはParB-c3のいずれかをコードする配列を含有する。
これらの核酸を、酵母または哺乳類に特異的な発現ベクターにクローニングした。
酵母用には、ベクターは、ドキシサイクリンの添加により下流に挿入された配列の発現を調節できる、Tet OFFプロモーターを含有するプラスミドpCM184およびpCM189の誘導体であった(Belliら、1998;Gariら、1997)。ドキシサイクリンの非存在下では、コンストラクトの発現は最大となる。
哺乳類細胞用には、ベクターは、Clontech(C)のpeGFP-c2プラスミド(GenBank受託番号:U57606)に由来した。このプラスミドは、時間依存的様式で融合タンパク質の強い発現をもたらすCMVプロモーターを含有する。ParB融合体は、いかなる細胞内局在化シグナルも含有しないが、その小さいサイズ(<70kDa)のため、細胞および核容積内を自由に拡散する。
B.酵母における使用のため
酵母に用いた2種のコンストラクトParB-c2-mCherryおよびParB-c3-GFPは、CYC1-TetO-7プロモーターの制御下にある(図2)。このプロモーターは、同一プラスミドにおいてコードされる転写トランスアクチベーター(tTA)により特異的に結合される7個のTeT-オペレーターを含有する。ドキシサイクリンの添加は、用量依存的様式でコンストラクトの発現の抑圧を誘導する。
次のプライマー対AおよびBを用いたPCR増幅により、ゲノムDNAにParS配列(図3)を挿入した。
A:5'-GTGACACTATAGAACGCGGCCGCCA-3'(添付の配列表における配列番号18)および
B:5'-TATAGGGAGACCGGCAGATCCGCGG-3'(添付の配列表における配列番号19)。
これらのプライマーは、標的遺伝子座近傍の配列と相同性を有する配列を含有し得る。この相同性は、酵母において、相同組換えを用いたParS配列の部位特異的組み込みを可能にする。
選択マーカーを含有する領域に隣接してLox部位を含有するベクターを用いて、選択マーカーの栄養要求性を回復させ、これにより挿入サイズを最小まで低下させることができる。
ParB-c2-mCherry、ParB-c3-GFP、ParS-c2およびParS-c3は、それぞれマーカーURA3、TRP1、NATおよびHYGROに関連する。これら4種のコンストラクトは、同時に用いてよい。
C.哺乳類細胞における使用のため
哺乳類細胞のため、2種のコンストラクトParB-c2-mCherryおよびParB-c3-GFPは、peGFP-c2プラスミドの骨格に存在するCMVプロモーターの制御下にある(図4)。この理由により、ParBの発現は時間依存的である。二重タギングの場合には、peGFP-c2 ParB-c2-mCherryおよびParB-c3-GFPは、一過的にトランスフェクトされる必要がある。
次のプライマー対CおよびDを用いたPCRにより、組み込みのためのParS配列を増幅させた。
C:5'-TCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCGGAA-3'(添付の配列表における配列番号20)および
D:5'-GTTCTCCAACTTCAAGAAACTGTTACCCAT-3'(添付の配列表における配列番号21)。
次に、PCR産物を細胞にトランスフェクトし、ハイグロマイシンに対し抵抗性のクローンを選択した(図5)。次に、公表された技法(Ozawaら、2004)を用いて、挿入部位を決定することができる。
II.2.酵母およびヒト細胞におけるin vivoでのParS配列の検出
A.酵母細胞における(図6)
非標識野生型細胞(WT)において、液胞を除く細胞全体にわたり拡散蛍光シグナルが可視化される。
ParS-c2コンストラクトがゲノム(この場合HML遺伝子座)に挿入される場合、ParBのParSへの結合により誘導された明るい蛍光ドットが観察できる(矢印先端)。バー:2μm。
B.プラスミドParSを有する哺乳類細胞における(図7)
peGFP-c2 ParB-c3-GFPコンストラクトまたはpeGFP-c2 ParB-c2-mCherryのいずれかを一過的に発現するヒトHeLa細胞を、ParS-c2またはParS-c3(ParS)配列を含有するプラスミドで同時トランスフェクトした。この場合、トランスフェクションにおいて多数のプラスミドDNA分子が細胞に進入するという事実に伴い、多重蛍光焦点が可視化できる(Batardら、2001)。
水(偽)で同時トランスフェクトした、peGFP-c2 ParB-c3-GFPコンストラクトまたはpeGFP-c2 ParB-c2-mCherryコンストラクトのいずれかを一過的に発現するヒトHeLa細胞において、蛍光焦点は目に見えなかった。バー;15μm。
C.安定的に組み込まれたParSを有する哺乳類細胞における(図8)
安定的に組み込まれた単一のParS-c2コンストラクトを有し、peGFP-c2 ParB-c2-GFPコンストラクトを一過的に発現するHeLa細胞株において、蛍光焦点が観察できた(矢頭)。
II.3.HML遺伝子座の動態の解析
この解析は、ParS-c2/ParB-c2-mCherry局在化系を用いて行った。ParS-c2配列は、HML遺伝子座に組み込まれ、細胞は、pCM189 ParB-c2-mCherryコンストラクトを発現する。
従って、mCherry焦点の位置は、in vivoにおけるHML遺伝子座の位置に相当する。画像を1秒間隔で50秒間撮影した(図9)。
取得から得られた画像スタックをImage Jソフトウェア(http://rsbweb.nih.gov/ij/)にインポートし、経時的なHML焦点の位置を自動的にモニターした。
取得におけるHMLパスウェイ(明るい色)を図10Aに示す。図10Bは、平均二乗変位(MSD)解析によるHMLの動きの特性評価を示す。HMLは、ゆっくりした拡散性の動きを呈する。平均速度および計算された拡散係数は、以前に公開された(Bystrickyら、2005;Bystrickyら、2009)値と同じ桁の値であった。
II.4.一回の二本鎖切断を誘導した際のParS配列の分解
HOエンドヌクレアーゼによる一回の二本鎖切断に相当する開裂部位から約100ヌクレオチド離れたMAT遺伝子座にParS-c2コンストラクトを組み込んだ細胞は、pCM189 ParB-c2-mCherryコンストラクトを発現する。
ラフィノースを含有する選択培地における培養下に細胞を置き、ガラクトースを添加することによりHOエンドヌクレアーゼの誘導を得た(pGal-Ho)。YOKOGAWA CSU22ヘッドおよびAndor iXonEM+DU888カメラを備えるANDOR高速回転(Revolution rapid)共焦点顕微鏡において、マルチカラーで細胞を撮像した。Olympus PlanSApo 100×1.40レンズにより画像を撮影した。4kbの距離においてlacO標識を保有するMAT遺伝子座の位置(3番染色体の左(left)テロメアから197kb離れる)を同時にモニターした(図11)。
ParS焦点の消失は、HO開裂部位近傍におけるMAT遺伝子座の配列の分解に相当する。
画像をImage Jソフトウェアにインポートし、任意の単位に変換した蛍光を3次元で例示する(図12)。YFPおよびmCherry焦点の位置を黒い矢頭で示す。
mCherry焦点の消失は、30分後に目に見える。mCherryの総蛍光レベルは、画像取得全体で、特に初期において(in the bud)実質的に同一であるため、焦点の喪失は特異的である。
（参考文献）

Claims (21)

  1. 細菌DNAの分配系に属し、その他の因子を必要とせずにその結合を行うDNA結合タンパク質、その誘導体または断片に相当する第一のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む真核生物発現ベクター。
  2. 前記細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質が、バークホルデリア・セノセパシアに由来するParBタンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載のベクター。
  3. 前記細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質が、
    - NCBIゲノムプロジェクトにおいてN° YP-002229191によりアクセスできるBcc株J2315のタンパク質等の「ParB-c1」と命名されたBccの1番染色体にコードされるParBタンパク質、
    - 添付の配列表における配列番号2のタンパク質に相当する、NCBIゲノムプロジェクトにおいてN° YP-002232636によりアクセスできるBcc株J2315のタンパク質等の「ParB-c2」と命名されたBccの2番染色体にコードされるParBタンパク質、
    - 添付の配列表における配列番号4のタンパク質に相当する、NCBIゲノムプロジェクトにおいてN° YP-002153395によりアクセスできるBcc株J2315のタンパク質等の「ParB-c3」と命名されたBccの3番染色体にコードされるParBタンパク質および
    - NCBIゲノムプロジェクトにおいてN° YP-002235439によりアクセスできるBcc株J2315のpBCJ2315プラスミドのタンパク質等の「ParB-p1」と命名されたBccのプラスミドにコードされるParBタンパク質、
    その誘導体または断片
    の中から選ばれることを特徴とする、請求項1または2に記載のベクター。
  4. 前記融合タンパク質が、容易に検出可能なポリペプチドまたは遺伝子発現の調節に関与するポリペプチドのいずれかである第二のポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載のベクター。
  5. 前記容易に検出可能なポリペプチドが、
    - 適合した基質の存在下に置かれたとき等の特定の条件下で検出可能な、必要に応じて定量化可能なシグナルを発生させることができる酵素または
    - 生物発光もしくは蛍光ポリペプチド
    であることを特徴とする、請求項4に記載のベクター。
  6. 遺伝子発現の調節に関与する前記ポリペプチドが、正または負の転写因子、一般転写因子、プロモーターの発現のレギュレーター、クロマチンリモデリング因子および隣接する遺伝子の位置を改変する因子、その誘導体または断片の中から選ばれることを特徴とする、請求項4に記載のベクター。
  7. 動作可能に連結された、真核生物型プロモーター、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列ならびに開裂部位および/またはポリAシグナルを含む真核生物転写終結シグナルを含むことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載のベクター。
  8. - 細菌DNA分配系に属し、その他の因子を必要とせずにその結合を行うDNA結合タンパク質、その誘導体または断片に相当する第一のポリペプチドと、
    - 遺伝子発現の調節に関与する第二のポリペプチドと、
    を含む融合タンパク質。
  9. - バークホルデリア・セノセパシアに由来するParBタンパク質、その誘導体または断片に相当する第一のポリペプチドと、
    - 容易に検出可能な第二のポリペプチドと、
    を含む融合タンパク質。
  10. i)請求項8または9に定義されているもの等の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    ii)項目(i)において定義されているもの等のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド、
    iii)高ストリンジェンシー条件下で、項目(i)および(ii)において定義されているもの等のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる、少なくとも14ヌクレオチド、特に、少なくとも18ヌクレオチドのポリヌクレオチド、
    の様々なポリヌクレオチドの中から選ばれる単離されたポリヌクレオチド。
  11. 細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有するヌクレオチド配列と、真核生物型選択マーカーとを含む真核生物ベクター。
  12. 組み込み型である、請求項11に記載のベクター。
  13. 細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される前記認識部位が、ヌクレオチド配列(I)
    N1N2TN3N4N5N6CGN7N8N9N10AN11N12(I)(添付の配列表における配列番号5)(配列中、ヌクレオチドN1およびN12は、同一もしくは異なっているまたはA、G、CもしくはTの中から選ばれ、ヌクレオチド対(N6、N7)、(N5、N8)、(N4、N9)、(N3、N10)および(N2、N11)は、互いに独立的に、(A、T)、(T、A)、(C、G)および(G、C)により形成される群から選ばれ、ヌクレオチドN1およびN12は、場合により、必要に応じて存在しない)
    またはヌクレオチド配列(I)と相補的な配列のものであることを特徴とする、請求項11または12に記載のベクター。
  14. 細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される前記認識部位が、次のヌクレオチド配列、
    - GTTTATGCGCATAAAC(添付の配列表における配列番号7)、
    - CTTTATGCGCATAAAC(添付の配列表における配列番号8)、
    - GTTGTCACGTGACAAC(添付の配列表における配列番号9)、
    - TTTGTCACGTGACAAC(添付の配列表における配列番号10)、
    - CTTGTCACGTGACAAC(添付の配列表における配列番号11)、
    およびこれら配列のうちいずれか一配列と相補的な配列
    の中から選ばれるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項11〜13のいずれか一項に記載のベクター。
  15. 前記ヌクレオチド配列が、細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも2、少なくとも3または少なくとも4個の認識部位を含むことを特徴とする、請求項11〜14のいずれか一項に記載のベクター。
  16. 前記ヌクレオチド配列が、
    - GenbankにおいてN° AM747720によりアクセスできるBcc株J2315の1番染色体のヌクレオチド配列から得ることができる、「ParS-c1」と命名されたBccの1番染色体に保有されるParS配列であって、この配列に含有される2個の認識部位は、それぞれヌクレオチド26477〜26492および28403〜28418に存在するParS配列、
    - GenbankにおいてN° AM747721によりアクセスできるBcc株J2315の2番染色体のヌクレオチド配列から得ることができ、添付の配列表における配列番号12のタンパク質に相当する、「ParS-c2」と命名されたBccの2番染色体に保有されるParS配列、
    - GenbankにおいてN° AM747722によりアクセスできるBcc株J2315の3番染色体のヌクレオチド配列から得ることができ、添付の配列表における配列番号13のタンパク質に相当する、「ParS-c3」と命名されたBccの3番染色体に保有されるParS配列、
    - GenbankにおいてN° AM747723によりアクセスできるBcc株J2315のプラスミドpBCJ2315のヌクレオチド配列から得ることができる、「ParS-p1」と命名されたBccのプラスミドに保有されるParS配列であって、この配列に含有される3個の認識部位は、それぞれヌクレオチド92285〜92300、92385〜92400および92438〜92453に存在するParS配列
    またはこれら配列のうちいずれか一配列と相補的な配列、
    の中から選ばれる配列に相当することを特徴とする、請求項11〜15のいずれか一項に記載のベクター。
  17. ヒトを除く、請求項1〜7のいずれか一項に定義されているもの等の真核生物発現ベクターまたは請求項11〜16のいずれか一項に定義されているもの等の真核生物ベクターにより形質転換された、またはそれを含む真核生物宿主生物。
  18. 酵母もしくは真菌等の微生物; 昆虫細胞もしくは哺乳類細胞、特に、ヒト細胞、ハムスター細胞、サル細胞、ウサギ細胞、マウス細胞、ラット細胞等の動物細胞;植物細胞;植物;またはヒトを除く動物であることを特徴とする、請求項17に記載の真核生物宿主生物。
  19. 細菌DNAの分配系に属するDNA結合タンパク質により認識される少なくとも1個の認識部位を有するヌクレオチド配列をそのゲノムに組み込んでおり、請求項1〜7のいずれか一項に定義されているもの等の融合タンパク質を発現することを特徴とする、請求項17または18に記載の真核生物宿主生物。
  20. 真核生物におけるin vivoでの遺伝子の発現の制御における使用のための、または真核生物におけるin vivoでのDNA遺伝子座の位置、動態および分解、もしくはDNA配列の組換えもしくは交換を検出するための、
    - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の真核生物発現ベクター、
    - 請求項1〜7のいずれか一項において先に定義されているものまたは請求項8もしくは9に記載されているもの等の融合タンパク質、
    - 請求項10に記載のポリヌクレオチド、請求項1〜7のいずれか一項に定義されているもの等のヌクレオチド配列、
    - 請求項1〜7、11または13〜16のいずれか一項に定義されているもの等のヌクレオチド配列、
    - 請求項11〜16のいずれか一項に定義されているもの等の真核生物ベクター、
    - 請求項17〜19のいずれか一項に定義されているもの等の宿主生物、
    の中から選ばれる要素。
  21. 真核生物においてin vivoで遺伝子の発現を制御することができる、または真核生物においてin vivoでDNA遺伝子座の位置、動態および分解もしくはDNA配列の組換えもしくは交換に影響を与えることのできる分子を検出するための、
    - 請求項1〜7のいずれか一項に記載の真核生物発現ベクター、
    - 請求項1〜7のいずれか一項において先に定義されているものまたは請求項8もしくは9に記載されているもの等の融合タンパク質、
    - 請求項10に記載のポリヌクレオチド、請求項1〜7のいずれか一項に定義されているもの等のヌクレオチド配列、
    - 請求項1〜7、11または13〜16のいずれか一項に定義されているもの等のヌクレオチド配列、
    - 請求項11〜16のいずれか一項に定義されているもの等の真核生物ベクター、および
    - 請求項17〜19のいずれか一項に定義されているもの等の宿主生物
    の中から選ばれる少なくとも一要素の使用。
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