JP2016054715A - 合成遺伝子の設計方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】目的タンパク質遺伝子の塩基配列を、ヒト細胞で使用頻度の高いコドンのみを選択し、かつGC含量が60%以上になるよう改変する工程を含む、選択型遺伝子の設計方法、及び、発光タンパク質または発光酵素が、イクオリン、クライチィンII、ガウシアルシフェラーゼ、エビルシフェラーゼの発光触媒タンパク質の変異体、北米産ホタルルシフェラーゼ、ゲンジボタルルシフェラーゼ、またはレニラルシフェラーゼから選択される選択型遺伝子、及び、選択型遺伝子を用いたタンパク質の製造方法
【選択図】なし
Description
(1)目的タンパク質遺伝子の塩基配列を、ヒト細胞で使用頻度の高いコドンのみを選択し、かつGC含量が60%以上になるよう改変する工程を含む、選択型遺伝子の設計方法。
(2)目的タンパク質遺伝子が、機能性タンパク質、または構造性タンパク質をコードする遺伝子である、上記(1)記載の方法。
(3)目的タンパク質遺伝子が、発光タンパク質または発光酵素をコードする遺伝子である、上記(2)に記載の方法。
(4)発光タンパク質または発光酵素が、イクオリン、クライチィンII、ガウシアルシフェラーゼ、エビルシフェラーゼの発光触媒タンパク質の変異体、北米産ホタルルシフェラーゼ、ゲンジボタルルシフェラーゼ、またはレニラルシフェラーゼから選択される、上記(3)に記載の方法。
(5)上記(1)または(2)に記載の方法によって合成された、選択型遺伝子。
(6)上記(3)に記載の方法によって合成された、発光タンパク質または発光酵素をコードする選択型遺伝子。
(7)上記(4)に記載の方法によって合成された、イクオリンをコードする選択型遺伝子。
(8)上記(4)に記載の方法によって合成された、クライチィンIIをコードする選択型遺伝子。
(9)上記(4)に記載の方法によって合成された、ガウシアルシフェラーゼをコードする選択型遺伝子。
(10)上記(4)に記載の方法によって合成された、エビルシフェラーゼの発光触媒タンパク質の変異体をコードする選択型遺伝子。
(11)上記(4)に記載の方法によって合成された、北米産ホタルルシフェラーゼをコードする選択型遺伝子。
(12)上記(4)に記載の方法によって合成された、ゲンジボタルルシフェラーゼをコードする選択型遺伝子。
(13)上記(4)に記載の方法によって合成された、レニラルシフェラーゼをコードする選択型遺伝子。
(14)上記(5)〜(13)に記載のいずれか1つに記載の選択型遺伝子と、他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが融合した選択型遺伝子。
(15)上記(1)または(2)に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
目的タンパク質の製造方法。
(16)上記(3)に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の製造方法。
(17)上記(4)に記載の方法で合成した選択型遺伝子のいずれか1つを用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の製造方法。
(18)上記(14)に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
融合目的タンパク質の製造方法。
(19)哺乳類細胞がヒト細胞である、上記(15)〜(18)に記載のいずれか1つに記載の製造方法。
(20)上記(15)または(19)に記載の方法で製造した目的タンパク質。
(21)上記(16)または(19)に記載の方法で製造した発光タンパク質または発光酵素。
(22)上記(17)または(19)に記載の方法で製造した発光タンパク質または発光酵素。
(23)上記(18)または(19)に記載の方法で製造した融合目的タンパク質。
(24)上記(5)〜(14)のいずれか1つに記載の選択型遺伝子の位置が、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下である、組換え発現ベクター。
(25)上記(5)〜(14)のいずれか1つに記載の選択型遺伝子を有する組換え哺乳類細胞。
(26)哺乳類細胞がヒト細胞である、上記(25)の組換え哺乳類細胞。
(27)上記(1)または(2)に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
目的タンパク質の発現量を増加させる方法。
(28)上記(3)に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の発現量を増加させる方法。
(29)上記(4)に記載の方法で合成した選択型遺伝子のいずれか1つを用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の発現量を増加させる方法。
(30)上記(14)に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
融合目的タンパク質の発現量を増加させる方法。
(31)哺乳類細胞がヒト細胞である、上記(27)〜(30)のいずれか1つに記載の発現量を増加させる方法。
(32)上記(3)に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の検出感度を増加させる方法。
(33)上記(4)に記載の方法で合成した選択型遺伝子のいずれか1つを用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の検出感度を増加させる方法。
(34)哺乳類細胞がヒト細胞である、上記(32)または(33)に記載の検出感度を増加させる方法。
(35)上記(21)または(22)に記載の発光タンパク質、発光酵素、もしくは上記(23)に記載の融合目的タンパク質を、ルシフェリン、またはルシフェリン類縁体と接触させ、発生した光量を測定する、発光活性の測定方法。
(36)ルシフェリン、またはルシフェリン類縁体の発光強度を増強させるための、上記(5)〜(14)のいずれか1つに記載の選択型遺伝子、上記(21)または(22)に記載の発光タンパク質、発光酵素、もしくは上記(23)に記載の融合目的タンパク質の使用。
(37)上記(5)〜(14)のいずれか1つに記載の選択型遺伝子をレポーター遺伝子として、プロモーター制御に関する配列の活性を測定する方法。
(38)上記(5)〜(14)のいずれか1つに記載の選択型遺伝子を哺乳類細胞内で発現させ、発光タンパク質、発光酵素、もしくは融合目的タンパク質を形成させる工程、
前記哺乳類細胞をルシフェリン、またはルシフェリン類縁体と接触させる工程、
発生した光量を測定する工程を含む、細胞内カルシウム濃度の変化を測定する方法。
(39)哺乳類細胞がヒト細胞である、上記(38)に記載の細胞内カルシウム濃度の変化を測定する方法。
(40)上記(5)〜(14)のいずれか1つに記載の選択型遺伝子、上記(24)に記載の組換え発現ベクター、もしくは上記(25)または(26)に記載の組換え哺乳類細胞の少なくとも1つを含み、さらにルシフェリンおよび/またはルシフェリン類縁体を含む、キット。
本発明は、ヒト細胞で使用頻度の高いコドンのみを優先的に選択し、かつGC含量が60%以上になるように発光タンパク質または発光酵素遺伝子を改変することで、天然型遺伝子と比較して高発現し、検出感度が向上する発光タンパク質または発光酵素の合成遺伝子、ならびに当該合成遺伝子の設計方法を提供する。
[配列番号:1]天然型イクオリン遺伝子の塩基配列を示す。GenBank Accession No.は、L29571である。
[配列番号:2]ヒト型イクオリン遺伝子の塩基配列を示す。
[配列番号:3]選択型イクオリン遺伝子の塩基配列を示す。
[配列番号:4]天然型クライチィンII遺伝子の塩基配列を示す。GenBank Accession No.は、AB360785である。
[配列番号:5]選択型クライチィンII遺伝子の塩基配列を示す。GenBank Accession No.は、HJ241347である。
[配列番号:6]天然型ガウシアルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。GenBank Accession No.は、AY015993である。
[配列番号:7]ヒト型ガウシアルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
[配列番号:8]選択型ガウシアルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
[配列番号:9]ヒト型エビルシフェラーゼの発光触媒タンパク質変異体遺伝子の塩基配列を示す。GenBank Accession No.は、JQ437370である。
[配列番号:10]選択型エビルシフェラーゼの発光触媒タンパク質変異体遺伝子の塩基配列を示す。GenBank Accession No.は、AB823628である。
[配列番号:11]天然型北米産ホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。GenBank Accession No.は、M15077である。
[配列番号:12]ヒト型北米産ホタルルシフェラーゼの塩基配列を示す。GenBank Accession No.は、AY738225である。
[配列番号:13]選択型北米産ホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
[配列番号:14]天然型ゲンジホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。GenBank Accession No.は、M26194である。
[配列番号:15]ヒト型ゲンジホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
[配列番号:16]選択型ゲンジホタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
[配列番号:17]天然型レニラルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。GenBank Accession No.は、M63501である。
[配列番号:18]ヒト型レニラルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
GenBank Accession No.は、AY738226である。
[配列番号:19]選択型レニラルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
[配列番号:20]実施例2で用いられたDNA断片(HindIII配列-コザック配列-ATG配列)の塩基配列を示す。
[配列番号:21]実施例2で用いられたDNA断片(BamHI配列-コザック配列)の塩基配列を示す。
[配列番号:22]実施例2で用いられたDNA断片(HindIII配列-コザック配列)の塩基配列を示す。
[配列番号:23]実施例2で用いられたDNA断片(HindIII配列-コザック配列)の塩基配列を示す。
実施例1:評価モデル酵素の選択型遺伝子の化学合成と遺伝子組成評価
モデルタンパク質として、表2に示した発光タンパク質遺伝子(イクオリン:AQ、クライティンII: CLII)およびルシフェラーゼ遺伝子(ガウシアルシフェラーゼ:GLuc、2種のホタルルシフェラーゼ:エビルシフェラーゼの発光触媒19kDaタンパク質: KAZ、PyLucとLcLuc、レニラルシフェラーゼ:RLuc)について、天然型のアミノ酸配列を変えずに、ヒト細胞で使用頻度の高いコドンのみを優先的に選択し、かつGC含量が60%以上になるように選択型新規遺伝子(opAQ、opCLII、nanoKAZ、opGLuc、opPyLuc、opLcLuc、opRLuc)を合成委託により、化学合成した(オペロンバイオテクノロジー社)。天然型遺伝子(wAQ、wCLII、wGLuc、wPyLuc、wLcLuc)、ヒト型遺伝子(hAQ、 nanoLuc、hGLuc、hPyLuc、hLcLuc、hRL)も必要に応じて、発現比較、活性比較のためのコントロール遺伝子は、化学合成法またはPCR法により調製した。
(1)イクオリン
動物培養細胞発現ベクターpcDNA3(インビトロジェン社製)の制限酵素HindIII−XbaI部位に、5’末端に制限酵素HindIII配列−コザック配列−ATG配列(AAGCTTGGTACCACCATG:配列番号20)および3’末端に制限酵素部位XbaI配列(TCTAGA)を付加した天然型(配列番号1)、ヒト型(配列番号2)、または選択型(配列番号3)イクオリン遺伝子のHindIII−XbaIフレグメントを調製し、挿入することにより、pcDNA3-wAQ、pcDNA3-hAQおよびpcDNA3-opAQを構築した。
動物培養細胞発現ベクターpcDNA3(インビトロジェン社製)の制限酵素HindIII−XbaI部位に、5’末端に制限酵素HindIII配列−コザック配列−ATG配列(AAGCTTGGTACCACCATG:配列番号20)および3’末端に制限酵素XbaI配列(TCTAGA)を付加した天然型(配列番号4)、または選択型(配列番号5)クライチィンII遺伝子のHindIII−XbaIフレグメントを調製し、挿入することにより、pcDNA3-wCLIIおよびpcDNA3-opCLIIを構築した。
動物培養細胞発現ベクターpcDNA3(インビトロジェン社製)の制限酵素BamHI−XbaI部位に、5’末端に制限酵素BamHI配列−コザック配列(GGATCCAACCGCC:配列番号21)および3’末端に制限酵素XbaI配列(TCTAGA)をもつ天然型(配列番号6)、ヒト型(配列番号7)、または選択型(配列番号8)ガウシアルシフェラーゼ遺伝子のBamHI−XbaIフレグメントを調製し、挿入することにより、pcDNA3-wGlucおよびpcDNA3-opGLucを構築した。
ガウシアルシフェラーセの分泌シグナル配列を有する動物培養細胞分泌発現ベクターpcDNA3-GLsp(Biochem.Biopphys.Res.Commun. (2013) 437: 23-28)の制限酵素EcoRI-XbaI部位に、ヒト型(配列番号9)、または選択型(配列番号10)エビルシフェラーゼの発光触媒タンパク質の変異体遺伝子の5’および3’末端に制限酵素EcoRIとXbaIを有するフラグメントを調製し、挿入することにより、pcDNA3-GLsp-nanoLucおよびpcDNA3-GLsp-dnKAZを構築した。
ヒト型(配列番号12)北米産ホタルルシフェラーゼ発現ベクターpGL4.13[luc2/sv40](プロメガ社製)の制限酵素HindIII−XbaI部位に挿入されている北米産ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、5’末端に制限酵素HindIII配列−コザック配列(AAGCTTGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACC:配列番号22)および3’末端に制限酵素XbaI配列(TCTAGA)をもつ天然型(配列番号11)および選択型(配列番号13)北米産ホタルルシフェラーゼ遺伝子のHindIII−XbaIフレグメントを調製し、置換することにより、pJN-wPyLuc-svおよびpJN-opPyLuc-svを構築した。
ヒト型(配列番号12)北米産ホタルルシフェラーゼ発現ベクターpGL4.13[luc2/sv40](プロメガ社製)の制限酵素HindIII−XbaI部位に挿入されている北米産ホタルルシフェラーゼ遺伝子を、5’末端に制限酵素HindIII配列−コザック配列(AAGCTTGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACC:配列番号22)および3’末端に制限酵素XbaI配列(TCTAGA)をもつ天然型(配列番号14)、ヒト型(配列番号15)および選択型(配列番号16)ゲンジホタルルシフェラーゼ遺伝子のHindIII−XbaIフレグメントを調製し、置換することにより、pJN-wLcLuc-sv、pJN-hLcLuc-svおよびpJN-opLcLuc-svをした。
動物培養細胞発現ベクターpcDNA3(インビトロジェン社製)の制限酵素HindIII−XbaI部位に、5’末端に制限酵素部位HindIII−コザック配列(AAGCTTGGTACCACC:配列番号22)および3’末端に制限酵素部位XbaI配列(TCTAGA)をもつ天然型(配列番号17)、ヒト型(配列番号18)、または選択型(配列番号19)レニラルシフェラーゼ遺伝子のHindIII−XbaIフレグメントを調製し、挿入することにより、pcDNA3-RL、pcDNA3-hRL、およびpcDNA3-opRLを構築した。
(1)発現プラスミドの精製
実施例2にて得られた組換えプラスミドを用いて以下の実験を行った。組換えプラスミドは大腸菌JM83またはDH5aより、プラスミド精製キット(QIAGEN社製)を用いて精製、滅菌水に溶解し、トランスフェクションに使用した。
動物培養細胞株CHO−K1株を、10%(v/v)牛胎児血清(HyClone社製またはBiowest社製)を含むHam’s F−12培地(和光純薬社製)(以降Ham’s−F12培地と記載することもある)にて培養した。
(1)発光タンパク質イクオリンおよびクライティンIIの発光測定法
実施例3で得られた発光タンパク質のアポ発光蛋白質発現細胞を、3 mLのPBS(和光純薬社製)で洗浄後、1mL PBSを加え、スクレーパーで細胞を回収した。250μLの回収細胞溶液に、250μLの30mM Tris-HCl(pH7.6)−10mM EDTAを加え、氷上で5秒間超音波破砕機にて破砕した。その破砕溶液に、1μgのセレンテラジン(JNC社製)および1μLの2−メルカプトエタノール(和光純薬社製)を加え、4oCで3時間以上放置し、アポ発光蛋白質から発光蛋白質へ再生した。10μLの再生溶液に、50mM Tris-HCl(pH7.6)に溶解した50 mM CaCl2を100μL注入することにより、発光反応を開始させた。発光測定装置(ベルトールド社:LB960)で、0.1秒間隔で5秒間測定し、最大発光値(Imax)の平均値(n=3)として表した。
実施例3で得られたガウシアルシフェラーゼの分泌発現細胞の培養液および細胞内の発光活性を測定した。細胞抽出液は、発現細胞を0.5 mLのPBS 溶液で3回洗浄後、100μLのPassive lysis buffer(プロメガ社製)を加え室温で15分震振し調製した。培養液または細胞抽出液の発光測定のために、Passive lysis bufferで100倍希釈した後、1μLを、セレンテラジン(0.25μg)を含む50μL のPBSに加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、0.1秒間隔で5秒間測定し、最大発光値(Imax)の平均値(n=4)として表した。
実施例3で得られたエビルシフェラーゼの発光触媒タンパク質の変異体の分泌発現細胞の培養液1μLを、セレンテラジン(0.25μg)を含む50μL のPBSに加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、1/100の減衰フィルター存在下、0.1秒間隔で5秒間測定し、最大発光値(Imax)の平均値(n=4)として表した。
実施例3で得られたホタルルシフェラーゼ発現細胞からの細胞抽出液の調製は、発現細胞を1mLのPBS 溶液で3回洗浄後、100μLのPassive lysis buffer(プロメガ社製)加え、室温で15分震振した。得られた細胞抽出液10μLを、50μLのホタルルシフェラーゼアッセイ溶液(Firefly luciferase assay solution:プロメガ社製)に加え、発光反応を開始させた。 発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、1/100の減衰フィルター存在下、0.1秒間隔で10秒間測定し、10秒間の発光の積分値(Int.)の平均(n=4)として表した。
実施例3で得られたレニラルシフェラーゼ発現細胞からの細胞抽出液の調製は、発現細胞を1mLのPBS 溶液で3回洗浄後、100μLのPassive lysis buffer(プロメガ社製)加え、室温で15分震振した。得られた細胞抽出液10μLを、セレンテラジン(0.25μg)を含む50μL のPBSに加え、発光反応を開始させた。発光活性は、発光測定装置(アトー社製:AB2200)で、1/10の減衰フィルター存在下、0.1秒間隔で10秒間測定し、10秒間の発光の積分値の平均(n = 4)として表した。
(1)イクオリンの発現
実施例4記載の活性測定法により、細胞内での発現イクオリンの活性を測定した(表4)。その結果、天然型遺伝子に比べ、ヒト型遺伝子は2.7倍、選択型遺伝子は7.9倍高い活性を示した。
実施例4記載の活性測定法により、細胞内での発現イクオリンの活性を測定した(表5)。その結果、天然型遺伝子に比べ、選択型遺伝子は11.8倍高い活性を示した。
実施例4記載の活性測定法により、培養液と細胞内での発現ガウシアルシフェラーゼの活性を測定した(表6)。天然型遺伝子の培養液の活性および細胞質の活性に比べ、選択型遺伝子は,培養液では12.6倍、細胞内では10.8倍高い活性を示した。
実施例4記載の活性測定法により、培養液に分泌したエビルシフェラーゼの発光触媒タンパク質の変異体の活性を測定した(表7)。その結果、ヒト型遺伝子は、選択型遺伝子に比べ89%の活性を示し、ほぼ同様な活性であった。
実施例4記載の活性測定法により、細胞内での北米産ホタルルシフェフェラーゼの活性を測定した(表8)。その結果、天然型遺伝子に比べ、ヒト型遺伝子は5.2倍、選択型遺伝子は3.4倍高い活性を示した。
実施例4記載の活性測定法により、細胞内でのゲンジホタルルシフェフェラーゼの活性を測定した(表9)。その結果、天然型遺伝子に比べ、ヒト型遺伝子は320倍、選択型遺伝子は402倍高い活性を示した。
実施例4記載の活性測定法により、細胞内でのレニラルシフェフェラーゼの活性を測定した(表10)。その結果、天然型遺伝子に比べ、ヒト型遺伝子は25.4倍、選択型遺伝子は47.4倍高い活性を示した。
Claims (40)
- 目的タンパク質遺伝子の塩基配列を、ヒト細胞で使用頻度の高いコドンのみを選択し、かつGC含量が60%以上になるよう改変する工程を含む、選択型遺伝子の設計方法。
- 目的タンパク質遺伝子が、機能性タンパク質、または構造性タンパク質をコードする遺伝子である、請求項1記載の方法。
- 目的タンパク質遺伝子が、発光タンパク質または発光酵素をコードする遺伝子である、請求項2に記載の方法。
- 発光タンパク質または発光酵素が、イクオリン、クライチィンII、ガウシアルシフェラーゼ、エビルシフェラーゼの発光触媒タンパク質の変異体、北米産ホタルルシフェラーゼ、ゲンジボタルルシフェラーゼ、またはレニラルシフェラーゼから選択される、請求項3に記載の方法。
- 請求項1または2に記載の方法によって合成された、選択型遺伝子。
- 請求項3に記載の方法によって合成された、発光タンパク質または発光酵素をコードする選択型遺伝子。
- 請求項4に記載の方法によって合成された、イクオリンをコードする選択型遺伝子。
- 請求項4に記載の方法によって合成された、クライチィンIIをコードする選択型遺伝子。
- 請求項4に記載の方法によって合成された、ガウシアルシフェラーゼをコードする選択型遺伝子。
- 請求項4に記載の方法によって合成された、エビルシフェラーゼの発光触媒タンパク質の変異体をコードする選択型遺伝子。
- 請求項4に記載の方法によって合成された、北米産ホタルルシフェラーゼをコードする選択型遺伝子。
- 請求項4に記載の方法によって合成された、ゲンジボタルルシフェラーゼをコードする選択型遺伝子。
- 請求項4に記載の方法によって合成された、レニラルシフェラーゼをコードする選択型遺伝子。
- 請求項5〜13に記載のいずれか1項に記載の選択型遺伝子と、他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが融合した選択型遺伝子。
- 請求項1または2に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
目的タンパク質の製造方法。 - 請求項3に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の製造方法。 - 請求項4に記載の方法で合成した選択型遺伝子のいずれか1つを用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の製造方法。 - 請求項14に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
融合目的タンパク質の製造方法。 - 哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項15〜18に記載のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項15または19に記載の方法で製造した目的タンパク質。
- 請求項16または19に記載の方法で製造した発光タンパク質または発光酵素。
- 請求項17または19に記載の方法で製造した発光タンパク質または発光酵素。
- 請求項18または19に記載の方法で製造した融合目的タンパク質。
- 請求項5〜14のいずれか1項に記載の選択型遺伝子の位置が、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下である、組換え発現ベクター。
- 請求項5〜14のいずれか1項に記載の選択型遺伝子を有する組換え哺乳類細胞。
- 哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項25の組換え哺乳類細胞。
- 請求項1または2に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
目的タンパク質の発現量を増加させる方法。 - 請求項3に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の発現量を増加させる方法。 - 請求項4に記載の方法で合成した選択型遺伝子のいずれか1つを用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の発現量を増加させる方法。 - 請求項14に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
融合目的タンパク質の発現量を増加させる方法。 - 哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項27〜30のいずれか1項に記載の発現量を増加させる方法。
- 請求項3に記載の方法で合成した選択型遺伝子を用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の検出感度を増加させる方法。 - 請求項4に記載の方法で合成した選択型遺伝子のいずれか1つを用いて、哺乳類細胞において作動するプロモーターの制御調節下に置いた組換え発現ベクターを調製する工程、
前記組換え発現ベクターを哺乳類細胞に導入し、組換え哺乳類細胞を作製する工程、
前記組換え哺乳類細胞を培養し、前記選択型遺伝子を発現させる工程を含む、
発光タンパク質または発光酵素の検出感度を増加させる方法。 - 哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項32または33に記載の検出感度を増加させる方法。
- 請求項21または22に記載の発光タンパク質、発光酵素、もしくは請求項23に記載の融合目的タンパク質を、ルシフェリン、またはルシフェリン類縁体と接触させ、発生した光量を測定する、発光活性の測定方法。
- ルシフェリン、またはルシフェリン類縁体の発光強度を増強させるための、請求項5〜14のいずれか1項に記載の選択型遺伝子、請求項21または22に記載の発光タンパク質、発光酵素、もしくは請求項23に記載の融合目的タンパク質の使用。
- 請求項5〜14のいずれか1項に記載の選択型遺伝子をレポーター遺伝子として、プロモーター制御に関する配列の活性を測定する方法。
- 請求項5〜14のいずれか1項に記載の選択型遺伝子を哺乳類細胞内で発現させ、発光タンパク質、発光酵素、もしくは融合目的タンパク質を形成させる工程、
前記哺乳類細胞をルシフェリン、またはルシフェリン類縁体と接触させる工程、
発生した光量を測定する工程を含む、細胞内カルシウム濃度の変化を測定する方法。 - 哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項38に記載の細胞内カルシウム濃度の変化を測定する方法。
- 請求項5〜14のいずれか1項に記載の選択型遺伝子、請求項24に記載の組換え発現ベクター、もしくは請求項25または26に記載の組換え哺乳類細胞の少なくとも1つを含み、さらにルシフェリンおよび/またはルシフェリン類縁体を含む、キット。
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