JP2024517633A - 改善された特性を有する新規ルシフェラーゼ - Google Patents
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Abstract
本発明は、レポーター遺伝子として細胞内で発現された場合に改善された特徴を示す新規ルシフェラーゼ遺伝子、および試験試料中の薬理学的に活性な分子の活性を検出し、場合により定量するためにそれを使用する方法に関する。本発明はさらに、本発明のレポーター細胞株を使用して、試験試料中に存在する薬理学的に活性な分子に対する中和抗体を検出し、場合により定量するための方法に関する。本発明はさらに、前記ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として使用して、最適な感度、シグナル強度および生物学的忠実度で生物学的過程を検出および最適にモニタリングするための、創薬におけるハイスループットスクリーニングのための方法に関する。
Description
本発明は、天然に存在する海洋カイアシ類メトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子に由来するルシフェラーゼ遺伝子、および前記ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として組み込んだレポーター遺伝子細胞株、ならびに試験試料中の遺伝子発現を検出および最適に定量するためにそれらを使用する方法に関する。本発明はさらに、本発明のレポーター細胞株を使用して、試験試料中に存在する薬理活性分子の活性、ならびに前記分子に対する中和抗体応答を検出および最適に定量するための方法に関する。本発明はさらに、最適な感度、シグナル強度、および生物学的忠実度で生物学的過程を検出し、最適にモニタリングするための多重サンプリングを可能にする、創薬におけるハイスループットスクリーニングのための非毒性方法に関する。細菌と哺乳動物の両方の選択マーカー、多重クローニング部位、トランスポゾン特異的逆方向末端反復、効率的な最小プロモーターを含有し、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質(GFP)もしくは赤色蛍光タンパク質(RFP)などの蛍光タンパク質、またはこれらに限定されないが、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ、ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼを含むルシフェラーゼ、または本発明に開示されるメトリディア・ロンガ(Metridia longa)由来の新規ルシフェラーゼなどの酵素を含む広範囲の天然に存在するまたは操作されたレポーター遺伝子の発現に理想的に適している新規ベクターも開示される。
生物発光および蛍光レポーター遺伝子は、遺伝子発現の研究に広く使用されており、創薬におけるハイスループットスクリーニング(HTS)(Ingleseら、2007)および薬物活性の定量(Lallemandら、2010、2011、2017)に広く応用されている。発光の主な利点の1つは、蛍光とは対照的に外部光源による励起を必要とせず、結果としてシグナル対バックグラウンド比が高くなることである。生物発光アッセイは、ルミノメーターを使用して定量することができる発光を伴う、ルシフェリン基質のオキシルシフェリンへの酸化を触媒するルシフェラーゼ酵素を使用する。天然に存在するルシフェラーゼは、基質としてのD-ルシフェリン/ATPまたはセレンテラジンの使用に基づいて2つの主要な群に分けることができる(Thorneら、2010)。天然に存在するルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ(FL)の場合のように細胞内で発現され得るか、またはメトリディア(Metridia)ルシフェラーゼのように分泌され得る(Markovaら、2004)。FLまたはウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼは、GFPなどの蛍光タンパク質と比較して半減期が比較的短く(CorishおよびTyler-Smith 1999)、レポーター遺伝子転写レベルの動的変化を定量するために使用することができ、本発明者らなどが示したように、定量されるべき細胞内遺伝子発現または多様な細胞外シグナルの活性の定量を可能にする(Lallemandら、2008、2010、2011、2017)。ルシフェラーゼは、二重レポーター遺伝子アッセイで組み合わせることができ、それにより細胞外シグナルの活性、例えば薬物と細胞表面受容体との相互作用後の活性を、例えば薬物応答性プロモーターの制御下のFLを使用して定量することができ、結果は、一過性トランスフェクション実験中または両レポーター遺伝子構築物による細胞の安定なトランスフェクション後のいずれかで、構成的プロモーターの制御下のウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ(RL)などの第2のルシフェラーゼの発現に対して正規化することができる(Lallemandら、2010、2011、2017)。これにより、例えばFLを使用して薬物活性を定量することができ、結果を、市販の基質(Lallemandら、2010、2011、2017)を使用したマイクロタイタープレートの同じウェルにおけるFL発現のクエンチおよびRLレベルの定量後の細胞傷害性または細胞数の差などの効果について正規化することができる。
天然に存在するルシフェラーゼは、遺伝子発現の研究のための、および創薬におけるハイスループットスクリーニングでのレポーター遺伝子として広く応用されているが、理想的にはシングルコピー遺伝子の産物が容易に検出可能であるように非常に明るくあるべきであり、大きなダイナミックレンジを示し、分泌されて低いバックグラウンドレベルを与え、連続サンプリングを可能にし、インジェクタを備えたルミノメーターの使用を必要としない「glo」基質を使用し、サイズが小さく、トランスフェクト細胞における発現を促進し、高レベルで発現された場合に細胞に対して非毒性である改善されたルシフェラーゼが必要とされている。
上記から、薬理活性分子の活性の定量のためのレポーター遺伝子として使用するための、および創薬におけるハイスループットスクリーニングのための最適な特徴を示す操作されたルシフェラーゼが必要とされていることが分かる。
従来の多重クローニング部位とトランスポゾン特異的組み込み部位の両方を伴う汎用的な二重細菌-哺乳動物発現、および改善された最小プロモーターも必要とされている。
本発明は、上記先行技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、薬理活性分子の活性を定量するためのレポーター遺伝子としての使用、および創薬におけるハイスループットスクリーニングへの使用に最適化された新規ルシフェラーゼ遺伝子を提供することである。
特に、本発明の目的は、これらに限定されないが、以下の1つまたは複数を含む、天然の遺伝子によってコードされるものと比較して優れた特性を示すルシフェラーゼタンパク質をコードする最適化されたルシフェラーゼ遺伝子を提供することである;
(i):増加した光出力(輝度)、
(ii):高い相対発光量(RLU)によって反映される増強されたシグナル安定性および/またはシグナル持続時間、
(iii):薬理活性物質の非存在下で対照試料と比較して大きなダイナミックレンジを示す、
(iv):分泌されて低いバックグラウンドレベルを与え、連続サンプリングを可能にする、
(v):インジェクタを備えたルミノメーターの使用を不要にするのに十分に長い半減期を有する、
(vi):異種トランスフェクト細胞での発現を促進するために分子サイズが小さく、コドン最適化されている、
(vii):以下の特徴;細胞における発現の改善、および高レベルで発現された場合の毒性の低減の少なくとも1つを含む増強された生体適合性を示す。
(viii):2つのサブユニット、SL1-N-TerおよびSL-1-C-Terとしての再構成を可能にし、プロテアーゼ切断部位によって分離され、スプライシング中に環状化され、細胞に入るプロテアーゼによって切断され、SL1の再構成および発光をもたらし、したがって細胞死滅を検出するために使用される。
(ix)2つのサブユニット、SL1-N-TerおよびSL-1-C-Terへの分割を可能にし、2つのサブユニットは、カルモジュリン依存性セリン-トレオニンホスファターゼカルシニューリンなどのセカンドメッセンジャーの存在下で再アニーリングすることができ、したがってCa2+フラックスの変化を検出するために使用される。
(i):増加した光出力(輝度)、
(ii):高い相対発光量(RLU)によって反映される増強されたシグナル安定性および/またはシグナル持続時間、
(iii):薬理活性物質の非存在下で対照試料と比較して大きなダイナミックレンジを示す、
(iv):分泌されて低いバックグラウンドレベルを与え、連続サンプリングを可能にする、
(v):インジェクタを備えたルミノメーターの使用を不要にするのに十分に長い半減期を有する、
(vi):異種トランスフェクト細胞での発現を促進するために分子サイズが小さく、コドン最適化されている、
(vii):以下の特徴;細胞における発現の改善、および高レベルで発現された場合の毒性の低減の少なくとも1つを含む増強された生体適合性を示す。
(viii):2つのサブユニット、SL1-N-TerおよびSL-1-C-Terとしての再構成を可能にし、プロテアーゼ切断部位によって分離され、スプライシング中に環状化され、細胞に入るプロテアーゼによって切断され、SL1の再構成および発光をもたらし、したがって細胞死滅を検出するために使用される。
(ix)2つのサブユニット、SL1-N-TerおよびSL-1-C-Terへの分割を可能にし、2つのサブユニットは、カルモジュリン依存性セリン-トレオニンホスファターゼカルシニューリンなどのセカンドメッセンジャーの存在下で再アニーリングすることができ、したがってCa2+フラックスの変化を検出するために使用される。
本発明の要素は、上述の効果の1つまたは複数を提供する。
様々な実施形態では、本発明は、可溶性活性モノマーとして、またはルシフェラーゼを含む他のタンパク質、もしくは緑色蛍光タンパク質(GFP)、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)などの蛍光タンパク質、および異なる励起/発光スペクトルを示すそれらのバリアント、または様々なリンカータンパク質との融合タンパク質として溶液中に存在するか、または粒子、アッセイプレートもしくはチューブなどの固体表面に結合している新規ルシフェラーゼを含む。
課題を解決するために、本発明は、本発明の一実施形態において、(i)~(iii)の少なくとも1つを含む新規ルシフェラーゼ遺伝子を提供する:
(i)前記細胞における発現のためにコドン最適化されているルシフェラーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム。
(i)前記細胞における発現のためにコドン最適化されているルシフェラーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム。
特定の実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号1に示され、かつ配列番号AA1に示されるアミノ酸配列をコードし得るヌクレオチド配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
さらなる実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列番号2に示され、かつ配列番号AA2に示されるアミノ酸配列をコードし得るヌクレオチド配列を含み得るか、またはそれからなり得る。
(ii)同種由来または異種由来を問わず、細胞からの効率的な分泌を確実にするためのシグナルペプチド。
(ii)同種由来または異種由来を問わず、細胞からの効率的な分泌を確実にするためのシグナルペプチド。
一態様では、オープンリーディングフレームは、細胞からの効率的な分泌を可能にし得る、配列番号3に示される配列を含むかまたはそれからなる。
(iii)ヒトインターフェロンベータ遺伝子の5’UTR由来の最小プロモーター、ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼ遺伝子のコドン最適化シグナルペプチド、ならびに配列番号1および配列番号2に示される配列を含み得る、導入遺伝子またはレポーター遺伝子の挿入のためのトランスポザーゼによって認識される5’および3’転位反復、ならびにノーセオトリシン抗生物質耐性遺伝子、または例えば、EM7最小プロモーターもしくは細菌細胞および哺乳動物細胞の両方において機能性である複合CMV T7プロモーターの制御下のアンピシリンまたはカナマイシンなどの他の抗生物質耐性遺伝子、ならびに配列番号4に示される配列を含むかまたはそれらからなるコドン最適化ハイグロマイシン耐性遺伝子、またはネオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシンもしくはブラストサイジンなどの他の哺乳動物抗生物質耐性遺伝子を含有する新規細菌発現ベクター。
(iii)ヒトインターフェロンベータ遺伝子の5’UTR由来の最小プロモーター、ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼ遺伝子のコドン最適化シグナルペプチド、ならびに配列番号1および配列番号2に示される配列を含み得る、導入遺伝子またはレポーター遺伝子の挿入のためのトランスポザーゼによって認識される5’および3’転位反復、ならびにノーセオトリシン抗生物質耐性遺伝子、または例えば、EM7最小プロモーターもしくは細菌細胞および哺乳動物細胞の両方において機能性である複合CMV T7プロモーターの制御下のアンピシリンまたはカナマイシンなどの他の抗生物質耐性遺伝子、ならびに配列番号4に示される配列を含むかまたはそれらからなるコドン最適化ハイグロマイシン耐性遺伝子、またはネオマイシン、ピューロマイシン、ゼオシンもしくはブラストサイジンなどの他の哺乳動物抗生物質耐性遺伝子を含有する新規細菌発現ベクター。
一態様では、細菌発現ベクターは、その全体が配列番号5に示される配列を含み得るかまたはそれからなり得るプラスミドであり得る。
したがって、一態様では、配列番号5は、配列番号1、配列番号3および配列番号4を含むかまたはそれらからなる。
本発明の別の態様は、試験試料中の薬理活性分子の活性を検出し、場合により定量するための方法であって、以下のステップを含む、方法を提供する
(i)試験試料を準備するステップ、
(ii)前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号AA1および配列番号AA2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ。
(iii)好ましい実施形態では、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、薬理活性分子に応答するレポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第2のルシフェラーゼ、例えばウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
(iv)セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または任意の適切な市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(v)セレンテラジンの非存在下で、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害するDual-Gloシステム(Promega)からのStop&Glo試薬を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後に、前記細胞株中の第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
(vi)第2のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第1のルシフェラーゼの活性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0189658号に記載されている。
(vii)さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する二重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼ、または配列番号6に示される自己切断2AペプチドF2Aのコード配列によって分離された、基質としてルシフェリンを使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第2のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された二重またはポリシストロン性構築物をさらに有する。
(viii)セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または任意の適切な市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(ix)レポーター遺伝子ルシフェラーゼが、BrightGlo試薬(Promega)または別の市販のルシフェリン系基質を使用して同じ試料中で測定された後、前記細胞株における第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(x)さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する三重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、それぞれが、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼまたはルシフェリンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第2のオープンリーディングフレーム、それとともにウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはセレンテラジンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第3のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された異なるリガンド応答性プロモーターに作動可能に連結された3つの構築物をさらに有する。あるいは、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼは、2つのリガンド応答性ルシフェラーゼの活性を、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0189658号に記載されている構成的プロモーターの制御下のルシフェラーゼの活性に対して正規化することを可能にするために、構成的プロモーターに作動可能に連結され得る。
(xi)前記オープンリーディングフレームが、前記細胞株の培養培地または上清への第1のレポータータンパク質の効率的な分泌を確実にするシグナルペプチドの制御下の配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第1のレポータータンパク質の活性を、セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して決定するステップ、
(xii)DualGlo試薬(Promega)を使用して、細胞溶解後の前記細胞株におけるホタルルシフェラーゼなどのルシフェリン系基質を必要とする第2のレポータータンパク質の活性を決定し、その後、DualGlo試薬(Promega)を使用するか、またはその第1の成分が、ホタルルシフェラーゼ活性の定量を可能にする基質を可能にするルシフェリン系基質であり、第2の成分がホタルルシフェラーゼ活性をクエンチし、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ活性の定量を可能にするセレンテラジン系基質を含有する市販の二成分基質を使用して、同じ試料中でセレランテライズ系基質を必要とするウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼなどの第3のレポーター遺伝子の活性を測定するステップ。
(xiii)さらに好ましい実施形態では、細胞に入るプロテアーゼによって媒介される細胞死滅を検出するための改善された方法を提供するために、Svarルシフェラーゼは、2つのサブユニット、SL1-N-TerおよびSL-1-C-Terとして再構成され、プロテアーゼ切断部位によって分離され、配列番号AA5をコードする配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、スプライシング中に環状化され、細胞に入るプロテアーゼによって切断され、SL1の再構成および発光、したがって細胞死滅の定量をもたらす。
(xiv)さらに好ましい実施形態では、細胞内のセカンドメッセンジャーの活性化および結果として生じるイオンフラックスの変化、例えば、カルモジュリン依存性セリン-トレオニンホスファターゼカルシニューリンおよびCa2+フラックスの変化を検出するための改善された方法を提供するために、Svarルシフェラーゼは、2つのサブユニット、SL1-N-TerおよびSL-1-C-Terとして再構成され、配列番号AA:5をコードする配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、スプライシング中に環状化され、細胞に入るプロテアーゼによって切断され、SL1の再構成および発光、したがって細胞死滅の定量をもたらす。
(xv)2つのサブユニット、SL1-N-TerおよびSL-1-C-Terに分割することができ、配列番号AA:5をコードする配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、2つのサブユニットは、カルモジュリン依存性セリン-トレオニンホスファターゼカルシニューリンなどのセカンドメッセンジャーの存在下で再アニーリングすることができ、したがってCa2+フラックスの変化を検出するために使用することができる。
(i)試験試料を準備するステップ、
(ii)前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号AA1および配列番号AA2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ。
(iii)好ましい実施形態では、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、薬理活性分子に応答するレポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第2のルシフェラーゼ、例えばウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
(iv)セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または任意の適切な市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(v)セレンテラジンの非存在下で、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害するDual-Gloシステム(Promega)からのStop&Glo試薬を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後に、前記細胞株中の第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
(vi)第2のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第1のルシフェラーゼの活性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0189658号に記載されている。
(vii)さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する二重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼ、または配列番号6に示される自己切断2AペプチドF2Aのコード配列によって分離された、基質としてルシフェリンを使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第2のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された二重またはポリシストロン性構築物をさらに有する。
(viii)セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または任意の適切な市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(ix)レポーター遺伝子ルシフェラーゼが、BrightGlo試薬(Promega)または別の市販のルシフェリン系基質を使用して同じ試料中で測定された後、前記細胞株における第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(x)さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する三重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、それぞれが、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼまたはルシフェリンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第2のオープンリーディングフレーム、それとともにウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはセレンテラジンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第3のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された異なるリガンド応答性プロモーターに作動可能に連結された3つの構築物をさらに有する。あるいは、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼは、2つのリガンド応答性ルシフェラーゼの活性を、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0189658号に記載されている構成的プロモーターの制御下のルシフェラーゼの活性に対して正規化することを可能にするために、構成的プロモーターに作動可能に連結され得る。
(xi)前記オープンリーディングフレームが、前記細胞株の培養培地または上清への第1のレポータータンパク質の効率的な分泌を確実にするシグナルペプチドの制御下の配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第1のレポータータンパク質の活性を、セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して決定するステップ、
(xii)DualGlo試薬(Promega)を使用して、細胞溶解後の前記細胞株におけるホタルルシフェラーゼなどのルシフェリン系基質を必要とする第2のレポータータンパク質の活性を決定し、その後、DualGlo試薬(Promega)を使用するか、またはその第1の成分が、ホタルルシフェラーゼ活性の定量を可能にする基質を可能にするルシフェリン系基質であり、第2の成分がホタルルシフェラーゼ活性をクエンチし、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ活性の定量を可能にするセレンテラジン系基質を含有する市販の二成分基質を使用して、同じ試料中でセレランテライズ系基質を必要とするウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼなどの第3のレポーター遺伝子の活性を測定するステップ。
(xiii)さらに好ましい実施形態では、細胞に入るプロテアーゼによって媒介される細胞死滅を検出するための改善された方法を提供するために、Svarルシフェラーゼは、2つのサブユニット、SL1-N-TerおよびSL-1-C-Terとして再構成され、プロテアーゼ切断部位によって分離され、配列番号AA5をコードする配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、スプライシング中に環状化され、細胞に入るプロテアーゼによって切断され、SL1の再構成および発光、したがって細胞死滅の定量をもたらす。
(xiv)さらに好ましい実施形態では、細胞内のセカンドメッセンジャーの活性化および結果として生じるイオンフラックスの変化、例えば、カルモジュリン依存性セリン-トレオニンホスファターゼカルシニューリンおよびCa2+フラックスの変化を検出するための改善された方法を提供するために、Svarルシフェラーゼは、2つのサブユニット、SL1-N-TerおよびSL-1-C-Terとして再構成され、配列番号AA:5をコードする配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、スプライシング中に環状化され、細胞に入るプロテアーゼによって切断され、SL1の再構成および発光、したがって細胞死滅の定量をもたらす。
(xv)2つのサブユニット、SL1-N-TerおよびSL-1-C-Terに分割することができ、配列番号AA:5をコードする配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、2つのサブユニットは、カルモジュリン依存性セリン-トレオニンホスファターゼカルシニューリンなどのセカンドメッセンジャーの存在下で再アニーリングすることができ、したがってCa2+フラックスの変化を検出するために使用することができる。
本発明のさらなる態様は、創薬におけるハイスループットスクリーニングのための方法であって、以下のステップを含む方法に関する:
(i)スクリーニングされる化合物のライブラリからなる試験試料を準備するステップ、
(ii)(i)の前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、ステップ好ましい実施形態では、本発明による細胞株は、ウェルプレートまたはアッセイプレートに播種される。
(iii)ライブラリをスクリーニングするために使用される薬剤での本発明による細胞株の処理。
(iv)好ましい実施形態では、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、レポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第2のルシフェラーゼ、例えばウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
(v)セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(vi)Bright Glo(Promega)、またはセレンテラジンの非存在下で、配列番号AA1および配列番号AA2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する市販のルシフェリン系基質を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後に、前記細胞株中の第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
(vii)第2のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第1のルシフェラーゼの活性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0189658号に記載されている。
(i)スクリーニングされる化合物のライブラリからなる試験試料を準備するステップ、
(ii)(i)の前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、ステップ好ましい実施形態では、本発明による細胞株は、ウェルプレートまたはアッセイプレートに播種される。
(iii)ライブラリをスクリーニングするために使用される薬剤での本発明による細胞株の処理。
(iv)好ましい実施形態では、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、レポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第2のルシフェラーゼ、例えばウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
(v)セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(vi)Bright Glo(Promega)、またはセレンテラジンの非存在下で、配列番号AA1および配列番号AA2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する市販のルシフェリン系基質を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後に、前記細胞株中の第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
(vii)第2のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第1のルシフェラーゼの活性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0189658号に記載されている。
本発明のさらなる態様は、試験試料中に存在する薬理活性分子に対する中和抗体を検出し、場合により定量する方法であって、
(i)薬理活性分子を含む試験試料を準備するステップ、
(ii)第1および第2の細胞試料を準備するステップであり、前記細胞試料が本発明による細胞株を含むステップ、
(iii)第1の細胞試料を試験試料と接触させ、続いて薬理活性分子と接触させるステップ、
(iv)第2の細胞試料を薬理活性分子と接触させるステップ、
(iv)第1の細胞試料の細胞中の第1のレポータータンパク質の活性を決定し、第2の細胞試料の細胞中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(v)第1および第2の細胞試料におけるレポーター活性の間の比を提供するステップであり、1より低い比(第1/第2)が前記試料における薬理活性分子に対する抗体の存在を示すステップ
を含む方法に関する。
(i)薬理活性分子を含む試験試料を準備するステップ、
(ii)第1および第2の細胞試料を準備するステップであり、前記細胞試料が本発明による細胞株を含むステップ、
(iii)第1の細胞試料を試験試料と接触させ、続いて薬理活性分子と接触させるステップ、
(iv)第2の細胞試料を薬理活性分子と接触させるステップ、
(iv)第1の細胞試料の細胞中の第1のレポータータンパク質の活性を決定し、第2の細胞試料の細胞中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(v)第1および第2の細胞試料におけるレポーター活性の間の比を提供するステップであり、1より低い比(第1/第2)が前記試料における薬理活性分子に対する抗体の存在を示すステップ
を含む方法に関する。
結果として、本発明は、ルシフェラーゼ遺伝子および前記遺伝子でトランスフェクトされた細胞株、本発明に従ってトランスフェクトされた細胞のEC50が、対応する1つまたは複数の天然の遺伝子でトランスフェクトされた細胞と比較して少なくとも減少するように、より高い感度で薬理活性分子の活性の検出を可能にする本発明の様々な状況におけるその使用を提供する。遺伝子は、例えば、天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子であり得るが、そうでなければ他のおよび/またはさらなる遺伝子を含み得る。減少は、約2倍、例えば約3倍など、例えば約4倍など、例えば約5倍など、例えば6倍など、例えば7倍など、例えば約8倍など、例えば9倍など、例えば10倍など、例えば50倍など、例えば約100倍など、または例えば約1000倍などであり得る。
ヌクレオチド配列の簡単な説明
配列番号1.コドン最適化されたSVARルシフェラーゼLuc-1
配列番号2.コドン最適化されたSVARルシフェラーゼLuc-2
配列番号3.コドン最適化され、ガウシア(Gaussia)シグナルペプチドをコードするガウシア(Gaussia)シグナルペプチド。
配列番号4.コドン最適化されたノーセオトリシン耐性遺伝子
配列番号5.SVARプラスミドの全ヌクレオチド配列
配列番号6.F2A自己切断ペプチドのヌクレオチド配列およびホタルルシフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の上流のコドン最適化されたSVARルシフェラーゼLuc-1。
ヌクレオチド1~54 ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼシグナルペプチド
ヌクレオチド55~501 コドン最適化されたSvarルシフェラーゼLuc-1
F2A自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド517~582
コドン最適化されたホタルルシフェラーゼをコードするヌクレオチド582~2235
配列番号7は、配列番号AA5、したがって環状化ルシフェラーゼLuc-1のN末端およびC末端断片をコードする。
配列番号1.コドン最適化されたSVARルシフェラーゼLuc-1
配列番号2.コドン最適化されたSVARルシフェラーゼLuc-2
配列番号3.コドン最適化され、ガウシア(Gaussia)シグナルペプチドをコードするガウシア(Gaussia)シグナルペプチド。
配列番号4.コドン最適化されたノーセオトリシン耐性遺伝子
配列番号5.SVARプラスミドの全ヌクレオチド配列
配列番号6.F2A自己切断ペプチドのヌクレオチド配列およびホタルルシフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の上流のコドン最適化されたSVARルシフェラーゼLuc-1。
ヌクレオチド1~54 ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼシグナルペプチド
ヌクレオチド55~501 コドン最適化されたSvarルシフェラーゼLuc-1
F2A自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド517~582
コドン最適化されたホタルルシフェラーゼをコードするヌクレオチド582~2235
配列番号7は、配列番号AA5、したがって環状化ルシフェラーゼLuc-1のN末端およびC末端断片をコードする。
アミノ酸配列の簡単な説明
配列番号AA1;配列番号1によってコードされるSVARルシフェラーゼLuc-1。
配列番号AA2;配列番号2によってコードされるSVARルシフェラーゼLuc-2。
配列番号AA3;ガウシア(Gaussia)シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号AA4;ガウシア(Gaussia)シグナルペプチド(アミノ酸1~18)、SVARルシフェラーゼLuc-1(アミノ酸19~167)、F2A自己切断ペプチド(アミノ酸168~194)、ホタルルシフェラーゼ(アミノ酸195~745)のアミノ酸配列。
配列番号AA5;アミノ酸配列は、図14に示されるように、再構成された場合に機能性である環状化ルシフェラーゼLuc-1のN末端およびC末端断片に対応する
配列番号AA1;配列番号1によってコードされるSVARルシフェラーゼLuc-1。
配列番号AA2;配列番号2によってコードされるSVARルシフェラーゼLuc-2。
配列番号AA3;ガウシア(Gaussia)シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号AA4;ガウシア(Gaussia)シグナルペプチド(アミノ酸1~18)、SVARルシフェラーゼLuc-1(アミノ酸19~167)、F2A自己切断ペプチド(アミノ酸168~194)、ホタルルシフェラーゼ(アミノ酸195~745)のアミノ酸配列。
配列番号AA5;アミノ酸配列は、図14に示されるように、再構成された場合に機能性である環状化ルシフェラーゼLuc-1のN末端およびC末端断片に対応する
本発明の実施形態を説明する際に、明確にするために特定の用語が使用される。しかし、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されることを意図するものではなく、各特定の用語は、同様のまたは同等の目的を達成するために同様の方法で動作するすべての技術的等価物を含むことが理解される。
本発明者らは、とりわけ、天然のタンパク質と比較して改善された特性を有し、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されており、薬理活性分子の活性の定量のためのレポーター遺伝子として使用するために最適な特徴を示すルシフェラーゼタンパク質をコードする、メトリディア・ロンガ(Metridia longa)のルシフェラーゼ遺伝子に由来するオープンリーディングフレーム、ならびに薬理活性分子に対する抗体を検出/定量するために、および創薬におけるハイスループットスクリーニングのためにそれを使用する方法を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、配列番号AA1に示されるアミノ酸配列、または配列番号AA1と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号AA1に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームに関する。一態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号AA1に示される配列と同一のアミノ酸配列をコードすることができる。
一態様では、配列番号AA1は
MGVKVLFALICIAVAEAKRGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFIAQVDRCASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
であってもよい。
MGVKVLFALICIAVAEAKRGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFIAQVDRCASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
であってもよい。
一態様では、本発明は、配列番号AA1に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号1に示されるヌクレオチド配列、または配列番号1と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号1に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有するヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームに関する。
特定の実施形態では、本発明は、配列番号AA2に示されるアミノ酸配列、または配列番号AA2と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号AA2に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレームに関する。一態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号AA2に示される配列と同一のアミノ酸配列をコードすることができる。
一態様では、配列番号AA2は
MGVKVLFALICIAVAEAKRGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFVAQVDRCASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
であってもよい。
MGVKVLFALICIAVAEAKRGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFVAQVDRCASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
であってもよい。
一態様では、本発明は、配列番号AA2に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号2に示されるヌクレオチド配列、または配列番号2と少なくとも75%の配列同一性、例えば、配列番号2に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有するヌクレオチド配列に関する。
別の態様において、本発明は、配列番号AA1に示されるアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得、配列番号AA2に示されるアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列をさらに含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームに関する。
特定の態様において、本発明は、配列番号1に示され、かつ配列番号AA1に示されるアミノ酸配列をコードし得るヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームに関し、オープンリーディングフレームは、配列番号2に示され、かつ配列番号AA2に示されるアミノ酸配列をコードし得るヌクレオチド配列をさらに含み得るかまたはそれからなり得る。
本発明のさらなる態様では、配列番号AA3は、
MGVKVLFALICIAVAEAK、または配列番号AA3と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号AA3に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有する配列であり得る。
MGVKVLFALICIAVAEAK、または配列番号AA3と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号AA3に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有する配列であり得る。
本発明のなおさらなる態様では、配列番号AA4は、
MEAEAERGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFIAQVDRCASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDRKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV*
、または配列番号AA4と少なくとも75%の配列同一性、例えば、配列番号AA4に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有する配列であり得る。
MEAEAERGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKVYIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFIAQVDRCASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDRKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPMEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV*
、または配列番号AA4と少なくとも75%の配列同一性、例えば、配列番号AA4に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有する配列であり得る。
一態様では、本発明は、アミノ酸配列
MEAEAERGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKV YIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFIAQVDR CASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
、または配列番号AA5と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号AA5に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有する配列を含み得るかまたはそれからなり得る配列番号AA5に関する。
MEAEAERGKSPGKKLPLAVIMEIEANAFKAGCTRGCLICLSKIKCTAKMKV YIPGRCHDYGGDKKTGQAGIVGAIVDIPEISGFKEMEPMEQFIAQVDR CASCTTGCLKGLANVKCSELLKKWLPDRCASFADKIQKEVHNIKGMAGDR
、または配列番号AA5と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号AA5に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有する配列を含み得るかまたはそれからなり得る配列番号AA5に関する。
別の態様では、本発明は、細胞または細胞株に関する。前記細胞が、本発明による少なくとも1つのアミノ酸をコードする下流のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含み得る、本発明による細胞または細胞株。
細胞または細胞株は、配列番号AA1に示されるアミノ酸配列、または配列番号AA1と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号AA1に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームを含み得る。一態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号AA1に示される配列と同一のアミノ酸配列をコードすることができる。
別の態様では、本発明による細胞または細胞株は、配列番号AA2に示されるアミノ酸配列、または配列番号AA2と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号AA2に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレームを含み得る。一態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号AA2に示される配列と同一のアミノ酸配列をコードすることができる。
別の態様では、細胞または細胞株は、配列番号AA1に示されるアミノ酸配列、または配列番号AA1と少なくとも75%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得るオープンリーディングフレーム、および配列番号AA2に示されるアミノ酸配列、または配列番号AA2と少なくとも75%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレームを含み得る。1つの非限定的な例では、細胞または細胞株は、配列番号AA1をコードする配列番号1、および配列番号AA2をコードする配列番号2を含み得る。
本発明はまた、配列番号3~7、または配列番号3~7と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号3~7に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有する任意のそのような配列の1つまたは複数に関する。
別の態様では、本発明は、配列番号6に示されるヌクレオチド配列、または配列番号6と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号6に示される配列と少なくとも80%の配列同一性など、例えば少なくとも85%の配列同一性など、例えば少なくとも90%の配列同一性など、例えば少なくとも95%の配列同一性など、例えば少なくとも96%の配列同一性など、例えば少なくとも97%の配列同一性など、例えば少なくとも98%の配列同一性など、例えば少なくとも99%の配列同一性など、または例えば100%の配列同一性などを有する任意のそのような配列を含み得る、またはそれからなり得るオープンリーディングフレームをさらに含み得る、またはそれからなり得る細胞または細胞株に関する。したがって、本発明による細胞または細胞株は、配列番号1または2の1つを含み得るか、または配列番号1または2の両方を含み得、配列番号6をさらに含み得る。
さらなる態様では、本発明は、配列番号1~4に示されるヌクレオチド配列の少なくとも1つまたは複数を含み得るまたはそれからなり得るオープンリーディングフレームを含み得るまたはそれからなり得る細胞または細胞株に関する。
一態様では、本発明は、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得、配列番号3~4の1つまたは複数をさらに含み得るオープンリーディングフレームを含み得るかまたはそれからなり得、収集された配列全体が配列番号5で示され得る細胞または細胞株に関する。
別の態様では、本発明は、配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含み得るかまたはそれからなり得、配列番号3~4の1つまたは複数をさらに含み得るオープンリーディングフレームを含み得るかまたはそれからなり得る細胞または細胞株に関する。
一態様では、本発明は、任意の診断方法におけるアミノ酸配列、または本発明のアミノ酸配列のいずれか1つをコードすることができるポリヌクレオチド、または細胞もしくは細胞株の使用に関する。
一態様では、本発明は、生物学的試料中の中和抗体の存在を決定するためのアミノ酸配列、または本発明のアミノ酸配列のいずれか1つをコードすることができるポリヌクレオチド、または細胞もしくは細胞株の使用に関する。
別の態様では、本発明は、創薬におけるアミノ酸配列、または本発明のアミノ酸配列のいずれか1つをコードすることができるポリヌクレオチド、または細胞もしくは細胞株の使用、例えば、薬物または薬物候補のスクリーニングにおける使用などに関する。特定の態様では、スクリーニングは、ハイスループットスクリーニングに関してもよい。
したがって、本発明はまた、試験試料中の薬理活性分子の活性を検出し、場合により定量するための方法に関する。一態様では、前記方法は、以下のステップを含んでもよい;
(i)試験試料を準備するステップ、
(ii)前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであって、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、第1のレポータータンパク質をコードする配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含むオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ、
(iii)場合により、(ii)において薬理活性分子に応答するレポーター遺伝子構築物に使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する本発明による細胞株を使用して、アッセイの正規化を提供するステップ。一態様では、構成的産生は、(ii)のレポータータンパク質とは異なる第2のルシフェラーゼのものであり得、原則として任意の適切なレポータータンパク質であり得、例えばウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼであり得る。
(iv)その組成が表1に示されているものなどのセレンテラジン系基質、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して前記細胞株中の第1のレポータータンパク質((ii)における)の活性を決定するステップ。
(v)Dual-Gloシステム(Promega)からのStop&Glo試薬、またはホタルルシフェラーゼ活性をクエンチし、その後のウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ活性の定量を可能にするセレンテラジン系基質を含有し、セレンテラジンの非存在下で、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つによってコードされる第1のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する二重ルシフェラーゼ緩衝液の第2の成分を含む検出システムを使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼが測定された後に、前記細胞株中の第2のレポータータンパク質((iii)における)の活性を決定するステップ。
(vi)第2のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第1のルシフェラーゼの活性は、米国特許出願公開第2011/0189658号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(i)試験試料を準備するステップ、
(ii)前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであって、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、第1のレポータータンパク質をコードする配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含むオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ、
(iii)場合により、(ii)において薬理活性分子に応答するレポーター遺伝子構築物に使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する本発明による細胞株を使用して、アッセイの正規化を提供するステップ。一態様では、構成的産生は、(ii)のレポータータンパク質とは異なる第2のルシフェラーゼのものであり得、原則として任意の適切なレポータータンパク質であり得、例えばウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼであり得る。
(iv)その組成が表1に示されているものなどのセレンテラジン系基質、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して前記細胞株中の第1のレポータータンパク質((ii)における)の活性を決定するステップ。
(v)Dual-Gloシステム(Promega)からのStop&Glo試薬、またはホタルルシフェラーゼ活性をクエンチし、その後のウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ活性の定量を可能にするセレンテラジン系基質を含有し、セレンテラジンの非存在下で、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つによってコードされる第1のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する二重ルシフェラーゼ緩衝液の第2の成分を含む検出システムを使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼが測定された後に、前記細胞株中の第2のレポータータンパク質((iii)における)の活性を決定するステップ。
(vi)第2のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第1のルシフェラーゼの活性は、米国特許出願公開第2011/0189658号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する二重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれらからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼ、または配列番号6に示される自己切断2AペプチドF2Aのコード配列によって分離された、基質としてルシフェリンを使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第2のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された二重またはポリシストロン性構築物をさらに有し得る。
本発明による方法はまた、代替的に、以下のステップを含んでもよい:
(vii)その組成が表1に示されているものなどのセレンテラジン系基質、またはQuanti-Luc Gold(InvivoGen)などの市販の基質、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して前記細胞株中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
(viii)BrightGlo試薬(Promega)または別の市販のルシフェリン系基質を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼが測定された後に、前記細胞株における第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
(vii)その組成が表1に示されているものなどのセレンテラジン系基質、またはQuanti-Luc Gold(InvivoGen)などの市販の基質、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して前記細胞株中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
(viii)BrightGlo試薬(Promega)または別の市販のルシフェリン系基質を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼが測定された後に、前記細胞株における第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する三重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれらからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼ、またはルシフェリンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第2のオープンリーディングフレーム、それとともにウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ、またはセレンテラジンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第3のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された異なるリガンド応答性プロモーターにそれぞれ作動可能に連結された3つの構築物をさらに有する。あるいは、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼは、2つのリガンド応答性ルシフェラーゼの活性を、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0189658号に記載される構成的プロモーターの制御下のルシフェラーゼの活性に対して正規化することを可能にするために、構成的プロモーターに作動可能に連結され得る。
本発明による方法は、代替的に以下のステップを含んでもよい;
(ix)前記オープンリーディングフレームが、前記細胞株の培養培地または上清への第1のレポータータンパク質の効率的な分泌を確実にするシグナルペプチドの制御下の、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第1のレポータータンパク質の活性を、セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して決定するステップ。
(x)DualGlo試薬(Promega)を使用して、細胞溶解後の前記細胞株におけるホタルルシフェラーゼなどのルシフェリン系基質を必要とする第2のレポータータンパク質の活性を決定し、その第1の成分が、ホタルルシフェラーゼ活性の定量を可能にする基質を可能にするルシフェリン系基質であり、第2の成分がホタルルシフェラーゼ活性をクエンチし、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ活性の定量を可能にするセレンテラジン系基質を含有する市販の二成分基質を使用して、その後、DualGlo試薬(Promega)または別の市販の同等物を使用して、同じ試料中でセレンテラジン系基質を必要とするウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼなどの第3のレポーター遺伝子の活性を測定するステップ。
(ix)前記オープンリーディングフレームが、前記細胞株の培養培地または上清への第1のレポータータンパク質の効率的な分泌を確実にするシグナルペプチドの制御下の、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第1のレポータータンパク質の活性を、セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して決定するステップ。
(x)DualGlo試薬(Promega)を使用して、細胞溶解後の前記細胞株におけるホタルルシフェラーゼなどのルシフェリン系基質を必要とする第2のレポータータンパク質の活性を決定し、その第1の成分が、ホタルルシフェラーゼ活性の定量を可能にする基質を可能にするルシフェリン系基質であり、第2の成分がホタルルシフェラーゼ活性をクエンチし、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ活性の定量を可能にするセレンテラジン系基質を含有する市販の二成分基質を使用して、その後、DualGlo試薬(Promega)または別の市販の同等物を使用して、同じ試料中でセレンテラジン系基質を必要とするウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼなどの第3のレポーター遺伝子の活性を測定するステップ。
上述のように、本発明はまた、創薬におけるハイスループットスクリーニングのための方法であって、以下のステップを含む方法に関する
(i)スクリーニングされる化合物のライブラリからなる試験試料を準備するステップ、
(ii)前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ。一態様では、本発明による細胞株は、96、384または1536ウェルプレートアッセイプレートに播種され得る。
(iii)ライブラリをスクリーニングするために使用される薬剤または薬物候補による本発明による細胞株の処理。
(iv)場合により、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、レポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なり、したがって配列番号1または配列番号2によってコードされるレポータータンパク質とは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第2のルシフェラーゼ、例えばウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
(v)セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
(vi)Bright Glo(Promega)、またはセレンテラジンの非存在下で配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する市販のルシフェリン系基質を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後に、前記細胞株中の第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
(vii)第2のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第1のルシフェラーゼの活性を決定するステップは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0189658号に記載されている。
(i)スクリーニングされる化合物のライブラリからなる試験試料を準備するステップ、
(ii)前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ。一態様では、本発明による細胞株は、96、384または1536ウェルプレートアッセイプレートに播種され得る。
(iii)ライブラリをスクリーニングするために使用される薬剤または薬物候補による本発明による細胞株の処理。
(iv)場合により、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、レポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なり、したがって配列番号1または配列番号2によってコードされるレポータータンパク質とは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第2のルシフェラーゼ、例えばウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
(v)セレンテラジン系基質、例えばその組成が表1に示されるもの、または市販の基質、例えばQuanti-Luc Gold(InvivoGen)、または別の市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
(vi)Bright Glo(Promega)、またはセレンテラジンの非存在下で配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する市販のルシフェリン系基質を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後に、前記細胞株中の第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ。
(vii)第2のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第1のルシフェラーゼの活性を決定するステップは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2011/0189658号に記載されている。
本発明のさらなる態様は、試験試料中に存在する薬理活性分子に対する中和抗体を検出し、場合により定量する方法に関する。
本発明による方法は、以下のステップを含んでもよい;
(i)薬理活性分子を含む試験試料を準備するステップ、
(ii)第1および第2の細胞試料を準備するステップであり、前記細胞試料が本発明による細胞株を含むステップ、
(iii)(ii)における第1の細胞試料を試験試料((i)における)と接触させ、続いて薬理活性分子と接触させるステップ、
(iv)第2の細胞試料を薬理活性分子と接触させるステップ、
(iv)第1の細胞試料の細胞中の第1のレポータータンパク質の活性を決定し、第2の細胞試料の細胞中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(v)第1および第2の細胞試料におけるレポーター活性の間の比を提供するステップであり、1より低い比(第1/第2)が前記試料における薬理活性分子に対する抗体の存在を示すステップ。
(i)薬理活性分子を含む試験試料を準備するステップ、
(ii)第1および第2の細胞試料を準備するステップであり、前記細胞試料が本発明による細胞株を含むステップ、
(iii)(ii)における第1の細胞試料を試験試料((i)における)と接触させ、続いて薬理活性分子と接触させるステップ、
(iv)第2の細胞試料を薬理活性分子と接触させるステップ、
(iv)第1の細胞試料の細胞中の第1のレポータータンパク質の活性を決定し、第2の細胞試料の細胞中の第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(v)第1および第2の細胞試料におけるレポーター活性の間の比を提供するステップであり、1より低い比(第1/第2)が前記試料における薬理活性分子に対する抗体の存在を示すステップ。
定義
ベクター
「ベクター」または「ベクター構築物」という用語は、組換え遺伝物質を宿主細胞に移入するためのビヒクルとして使用されるDNA分子を指す。ベクターの4つの主要なタイプは、プラスミド、バクテリオファージおよび他のウイルス、コスミド、および人工染色体である。ベクター自体は、一般に、インサート(異種核酸配列、導入遺伝子)、およびベクターの「骨格」として機能するより大きな配列からなるDNA配列である。遺伝情報を宿主に伝達するベクターの目的は、典型的に、インサートを標的細胞において単離、増殖または発現することである。発現ベクター(発現構築物)と呼ばれるベクターは、標的細胞における異種配列の発現に特異的に適合され、一般に、異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。本発明の実施形態に用いられるベクターの選択は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするベクターの特定の用途に依存する。
ベクター
「ベクター」または「ベクター構築物」という用語は、組換え遺伝物質を宿主細胞に移入するためのビヒクルとして使用されるDNA分子を指す。ベクターの4つの主要なタイプは、プラスミド、バクテリオファージおよび他のウイルス、コスミド、および人工染色体である。ベクター自体は、一般に、インサート(異種核酸配列、導入遺伝子)、およびベクターの「骨格」として機能するより大きな配列からなるDNA配列である。遺伝情報を宿主に伝達するベクターの目的は、典型的に、インサートを標的細胞において単離、増殖または発現することである。発現ベクター(発現構築物)と呼ばれるベクターは、標的細胞における異種配列の発現に特異的に適合され、一般に、異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。本発明の実施形態に用いられるベクターの選択は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするベクターの特定の用途に依存する。
作動可能に連結される
「作動可能に連結される」という用語は、遺伝子またはオープンリーディングフレームなどの機能単位の一部である要素の接続を指す。したがって、ポリペプチドをコードする核酸配列(オープンリーディングフレーム、ORF)にプロモーターを作動可能に連結することにより、2つの要素は機能単位、すなわち遺伝子の一部になる。核酸配列への発現制御配列(プロモーター)の連結は、プロモーターによって指示される核酸配列の転写を可能にする。ポリペプチドをコードする2つの異種核酸配列を作動可能に連結することによって、配列は機能単位、すなわち異種核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの一部になる。2つのアミノ酸配列を作動可能に連結することにより、配列は同じ機能単位、すなわちポリペプチドの一部になる。2つの異種アミノ酸配列を作動可能に連結することにより、ハイブリッド(融合)ポリペプチドが生成される。
「作動可能に連結される」という用語は、遺伝子またはオープンリーディングフレームなどの機能単位の一部である要素の接続を指す。したがって、ポリペプチドをコードする核酸配列(オープンリーディングフレーム、ORF)にプロモーターを作動可能に連結することにより、2つの要素は機能単位、すなわち遺伝子の一部になる。核酸配列への発現制御配列(プロモーター)の連結は、プロモーターによって指示される核酸配列の転写を可能にする。ポリペプチドをコードする2つの異種核酸配列を作動可能に連結することによって、配列は機能単位、すなわち異種核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの一部になる。2つのアミノ酸配列を作動可能に連結することにより、配列は同じ機能単位、すなわちポリペプチドの一部になる。2つの異種アミノ酸配列を作動可能に連結することにより、ハイブリッド(融合)ポリペプチドが生成される。
最小構成的プロモーター
レポーター遺伝子の発現を指示するプロモーターは、典型的に、本発明のレポーター細胞株を樹立するために使用される哺乳動物宿主細胞において最小構成的に活性であり、単独では、薬理学的活性分子による細胞の処理に応答しない。有用な構成的に活性なプロモーターには、サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサー/プロモーター、SV40プロモーター、UBCプロモーター、PGKプロモーター、ヒトβ-アクチン(hACTB)、ヒト伸長因子-1α(hEF-1α)、チミジンキナーゼ(TK)プロモーターおよびサイトメガロウイルス初期エンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
レポーター遺伝子の発現を指示するプロモーターは、典型的に、本発明のレポーター細胞株を樹立するために使用される哺乳動物宿主細胞において最小構成的に活性であり、単独では、薬理学的活性分子による細胞の処理に応答しない。有用な構成的に活性なプロモーターには、サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサー/プロモーター、SV40プロモーター、UBCプロモーター、PGKプロモーター、ヒトβ-アクチン(hACTB)、ヒト伸長因子-1α(hEF-1α)、チミジンキナーゼ(TK)プロモーターおよびサイトメガロウイルス初期エンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の実施形態を説明するとき、すべての可能な実施形態の組合せおよび順列は明示的に説明されていない。それにもかかわらず、特定の手段が相互に異なる従属請求項に記載されているか、または異なる実施形態に記載されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを有利に使用することができないことを示すものではない。本発明は、記載された実施形態のすべての可能な組合せおよび順列を想定している。
本明細書における「含む(comprising)」、「含む(comprise)」および「含む(comprises)」という用語は、あらゆる場合において、それぞれ「からなる(consisting of)」、「からなる(consist of)」および「からなる(consist of)」という用語で場合により置換可能であることを意図している。本発明は、本発明の詳細な説明を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかし、これは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての文献の引用は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「配列番号X」という用語は、DNAまたはポリヌクレオチド配列番号Xを意味することを意図する。本発明によれば、定義は、例えば配列番号1~7のいずれか1つを指し得る。
「配列番号AAX」という用語は、ペプチドまたはアミノ酸配列番号Xを意味することを意図する。本発明によれば、定義は、例えば配列番号AA1~5のいずれか1つを指し得る。
例
以下では、本発明を非限定的な例によってさらに説明する。
以下では、本発明を非限定的な例によってさらに説明する。
薬理活性分子の活性を定量するためのレポーター遺伝子として、また、創薬におけるハイスループットスクリーニングに使用するために最適な特徴を示すルシフェラーゼタンパク質を開発するために、特にルシフェラーゼが他のタンパク質または他の分子との融合タンパク質として発現される場合、哺乳動物細胞における発現を促進するために遺伝子が可能な限り小さいことが望ましい。天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子の5’コード領域の一連の欠失変異体をインシリコで設計し、インビトロで合成し、一過性トランスフェクション実験で試験した。天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)遺伝子ルシフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図1に、アミノ酸配列を図2に示す。天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子の5’翻訳領域において開始コドン(AUG)のアミノ酸1からアミノ酸76までを含む欠失変異体(図1)は、天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)タンパク質の23.8kDaの分子量と比較して、SVAR Luc-1タンパク質の分子量が17.3kDaであることを考慮すると、6.5kDaの分子量の減少に相当する76アミノ酸だけルシフェラーゼタンパク質のサイズを減少させながら、天然のタンパク質のものに匹敵する活性を示すことが見出された(図3)。分泌の効率を高め、したがって生物発光のバックグラウンドレベルを低下させ、連続サンプリングを可能にするために、これまで記載された最も効率的なシグナルペプチドであることが示されているカラヌス目カイアシ類ガウシア(Gaussia)由来のルシフェラーゼ遺伝子のシグナルペプチド(Stern,Bら、2007)を、シグナルペプチドの17アミノ酸をコードするメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子(図1)の天然のシグナルペプチド(図1~図51)に置き換えた(図2)。薬理活性分子による細胞の処理に応答する、レポーター遺伝子構築物でトランスフェクトされた細胞における分泌効率を高め、バックグラウンドレベルを低下させ、したがって薬理活性分子で処理されていない対照細胞と比較してシグナルを増加させるために、メトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子の天然のシグナルペプチドを欠失させ、ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼをコードする遺伝子からのコドン最適化シグナルペプチドで置き換えた。
単一または複数の変異を有するオリゴヌクレオチドを使用して、天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列に一連のランダム変異を導入した(図4)。オリゴヌクレオチドをインビトロで合成し、組織培養で成長させたヒト胎児腎臓細胞に元来由来するヒトHEK293細胞株(ATCCカタログCRL-1573)における一過性トランスフェクション実験で試験した。天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列に導入された特定の変異は、以下の特徴;増大した光出力(輝度)を含む増強された発光、高い相対発光量(RLU)によって反映される増強されたシグナル安定性および/またはシグナル持続時間、ならびに薬理活性物質の非存在下での対照試料と比較して増大したダイナミックレンジの少なくとも1つにおいて、天然の遺伝子によってコードされるものよりも優れたルシフェラーゼタンパク質をコードすることが個々におよび一緒に見出された。図5に示すように、第1の推定触媒ドメイン(Markova,SV.ら、2004)において、位置66および105のメチオニンをコードするヌクレオチドをそれぞれセリン(S)およびイソロイシン(I)に変異させると、発光が安定化し、「glo」基質の使用が可能になり、インジェクタを備えたルミノメーターの必要がなくなることが見出された。
天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の第2の推定触媒ドメイン(Markova,SV.ら、2004)中の位置100におけるアラニン(A)のグルタミン酸(E)への変異は、天然の遺伝子、またはアミノ酸配列においてのみ位置22および35における変異をコードする遺伝子によって示されるよりも増大した光出力(輝度)を含む増大した発光、高い相対発光量(RLU)によって反映される増加したシグナル安定性および/またはシグナル持続時間(図5)、ならびに天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子によって示されるよりも高い薬理活性物質の非存在下での対照試料と比較したダイナミックレンジ(図3B)を示すルシフェラーゼタンパク質(配列番号AA1によるSVAR Luc-1および配列番号AA2によるSVAR Luc-2)をコードすることが見出された。
アミノ酸配列中の位置106のイソロイシン(I)を第1の推定触媒ドメイン中のバリン(V)に変異させると、天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼまたは5’翻訳領域に177ヌクレオチド欠失を有するメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子によってコードされるルシフェラーゼと比較して改善された活性、およびSVAR Luc-1ルシフェラーゼ(ヌクレオチド配列番号1およびアミノ酸配列配列番号AA1)と比較して同等またはわずかに低下した活性を示すルシフェラーゼタンパク質SVAR Luc-2(ヌクレオチド配列番号2およびアミノ酸配列配列番号AA2)が得られることが見出された。
位置141および142のアミノ酸アラニン(A)およびセリン(S)をコードする天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子のコード配列における配列nt423~nt435のアミノ酸チロシン(T)およびグリシン(G)への変異は、それぞれ、減少した光出力(輝度)を含む減少した発光、天然の遺伝子によって示されるよりも低下した相対発光量(RLU)によって反映される減少したシグナル安定性および/またはシグナル持続時間、ならびに天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子、Svarルシフェラーゼ1またはSvarルシフェラーゼ2によって示されるものよりも低い薬理活性物質の非存在下での対照試料と比較したダイナミックレンジを示すルシフェラーゼタンパク質(SVAR Luc-3)をコードすることが見出された(図3)。同様に、天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列中の位置144におけるアラニン(A)および位置145におけるメチオニンをそれぞれコードするnt432およびnt433の変異は、減少した光出力(輝度)を含む減少した発光、天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子、SvarルシフェラーゼLuc-1またはSvarルシフェラーゼLuc-2によって示されるものよりも低い相対発光量(RLU)によって反映される減少したシグナル安定性および/またはシグナル持続時間を示すルシフェラーゼタンパク質(SVAR Luc-4)をコードすることが見出された(図3B)。37℃で18時間のヒトHEK293細胞における一過性トランスフェクション実験で試験し、その後市販のセレンテラジン系「glo」基質QuantiLuc Gold(Invivogen)を使用してルシフェラーゼ活性を定量した強力な構成的CMVプロモーターの制御下のSvarルシフェラーゼ1およびSvarルシフェラーゼ2の両方は、野生型メトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼによって示されるものよりも増大したシグナル安定性および/またはシグナル持続時間を示した(図6)。Svarルシフェラーゼ1とSvarルシフェラーゼ2の両方はまた、天然のメトリディア・ロンガ(Metridia longa)遺伝子、または遺伝子の5’翻訳領域のアミノ酸1~76が欠失したメトリディア・ロンガ(Metridia longa)遺伝子、またはSVARルシフェラーゼ3、またはウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ、Nanoルシフェラーゼ、またはガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼによって示されるものよりも高い相対発光量(RLU)によって反映される増大した光出力(輝度)を示した(図3A)。野生型メトリディア・ロンガ(Metridia longa)ルシフェラーゼ遺伝子、それぞれSV40最小プロモーターおよびカノニカルNFkB認識配列の6倍縦列反復からなるキメラプロモーターの制御下にあるSvarルシフェラーゼ1またはSvarルシフェラーゼ2でトランスフェクトし、100ng/mlのTNFαで37℃で6時間処理したまたは処理していないHEK293細胞における一過性トランスフェクション実験の結果は、市販のセレンテラジン系「glo」基質QuantiLuc Plus(Invivogen)を使用してより高い相対発光量(RLU)によって反映されるように、両方のSVARルシフェラーゼ遺伝子が野生型遺伝子と比較して増強されたルシフェラーゼ活性を示したことを示した(図3B)。
HEK293細胞を、SV40最小プロモーターおよびカノニカルNFkB認識配列の6倍縦列反復からなるキメラプロモーターの制御下のSvarルシフェラーゼLuc-1遺伝子でトランスフェクトし、安定なクローンを単離し、特徴づけた。そのようなクローン細胞株の1つを、増加するTNFαで37℃で6時間処理したまたは処理しなかった場合、市販のセレンテラジン系「glo」基質QuantiLuc Gold(Invivogen)を使用して、TNFαで処理しなかった対照試料と比較して相対発光量(RLU)と誘導倍率の両方のレベルが高くなった(図7)。
慢性骨髄性白血病に元来由来するK562細胞(ATCC、カタログ番号CCL-243)を、それぞれSV40最小プロモーターおよびカノニカルNFkB認識配列の6倍縦列反復からなるキメラプロモーターの制御下のSvarルシフェラーゼLuc-1遺伝子またはホタルルシフェラーゼ遺伝子のいずれかでトランスフェクトした。安定なクローンを単離し、特徴づけた。クローン細胞株を漸増濃度のTNFαで37℃で6時間処理した(図8)。SVAR Luc-1遺伝子で安定にトランスフェクトした細胞は、市販のセレンテラジン系「glo」基質QuantiLuc Gold(Invivogen)を使用したルシフェラーゼ活性の定量後に、同じNFkB応答性プロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼ遺伝子で安定にトランスフェクトした細胞よりも著しく高い相対発光量(RLU)値を示した(図8)。
SVAR Luc-1ルシフェラーゼは、小さいサイズ、輝度、およびトランスフェクトされた哺乳動物細胞に対する毒性の非存在を含む、文献に報告されている他の天然または操作されたルシフェラーゼと比較して、いくつかの改善された特性を示す(表2)。
配列番号1および配列番号2に示されるヌクレオチド配列が含まれるがこれらに限定されない、レポーター遺伝子としてのSvar Luc-1およびSvar Luc-2ルシフェラーゼの発現のためのベクターとして、薬理活性分子の活性の定量のため、および創薬におけるハイスループットスクリーニングのために使用するのに最適な特徴を示すプラスミドを開発するために、プラスミドは大腸菌(E.coli)の実験室株において染色体外で容易に複製することができ、この目的に必要とされる必要なDNA配列を含有し、宿主因子との干渉の確率が少なく、細菌における収率が増加するように、3,000~6,000塩基対程度の比較的小さいサイズであることが望ましい。したがって、以下を含有するプラスミド(pSVAR001)をインシリコで設計し、インビトロで合成した:細菌複製起点(nt.5954~217)、ヒトインターフェロンベータ遺伝子の5’UTR由来の最小プロモーター(nt.1141~1263)、コドン最適化されたガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼ遺伝子(nt.1276~1329)由来のシグナルペプチド(配列番号3)、これらに限定されないが配列番号1および配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むレポーター遺伝子のコード配列(nt.1330~1779)、ならびにトランスポゾン特異的5’(nt.652~682)および3’(nt.4567~4601)逆方向末端反復、導入遺伝子のトランスポザーゼ組み込みのための認識配列、EM7プロモーター(nt.5072~5137)の制御下のノーセオトリシン抗生物質耐性遺伝子(nt.5138~5710)、および配列番号4に示される配列を含むかまたはそれからなるSV40最小プロモーター(nt.2138~2495)の制御下のコドン最適化ハイグロマイシン耐性遺伝子(nt.2532~3557)。プラスミドは、いくつかの重要な制限部位をさらに含有する:コンセンサス応答配列の挿入のためのKpnI、NheIおよびXhol、哺乳動物選択マーカーの置換のためのBcuI-SalI、これらに限定されないが配列番号1および配列番号2に示される配列を含むレポーター遺伝子の置換のためのBglI-Xbal、および最小プロモーター配列の置換のためのXhol-BglII。pSVAR001プラスミドの性能を試験するために、カノニカルNFkB認識配列の6倍縦列反復をKpn-XhoI制限部位に挿入し、得られたプラスミドを、200ng/mlのTNFαで37℃で4時間処理したまたは処理していないヒトHEK293細胞における一過性トランスフェクション実験で試験し、その後市販のセレンテラジン系基質(QuantiLuc Gold、Invivogen)を使用してSVAR1ルシフェラーゼ活性を定量した。カノニカルNFkB認識配列の6倍縦列反復を含有するpSVAR001プラスミドの性能を、Kpn-XhoI制限部位に挿入されたカノニカルNFkB認識配列の6倍縦列反復の制御下の、BgIII-Xbal制限部位に挿入されたSVAR Luc-1ルシフェラーゼ遺伝子を含有するpGL4プラスミド(Promega)の性能と比較すると、pSVAR001プラスミドで得られた最大RLUレベルは、カノニカルNFkB認識配列の6倍縦列反復の制御下のSVAR Luc-1ルシフェラーゼ遺伝子を含有するpGL4プラスミドで得られたものと同等であるが、pSVAR001プラスミドを使用すると、誘導倍率は有意に大きかったことが示された(図9)。
参考文献
Inglese, J., et al., Nat. Chem. Biol. 3:466-479, 2007
Thorne, N., et al., Chem. Biol. 17:646-657, 2010
Markova, SV., et al., J. Biol. Chem. 279:3212-3217, 2004
Stern, B., et al. Trends Cell Mol. Biol. 2:1-17, 2007
Corish, P., and Tyler-Smith, C., Protein Eng., 12:1035-1040, 1999
Lallemand et al. J. Interferon & Cytokine Res. 28:393-404, 2008.`
Lallemand et al. J.Immunol. Methods. 356: 18-28, 2010.
Lallemand et al. J.Immunol. Methods. 373: 229-239, 2011
Lallemand et al. J.Immunol. Res. 390: 1-19, 2017
Inglese, J., et al., Nat. Chem. Biol. 3:466-479, 2007
Thorne, N., et al., Chem. Biol. 17:646-657, 2010
Markova, SV., et al., J. Biol. Chem. 279:3212-3217, 2004
Stern, B., et al. Trends Cell Mol. Biol. 2:1-17, 2007
Corish, P., and Tyler-Smith, C., Protein Eng., 12:1035-1040, 1999
Lallemand et al. J. Interferon & Cytokine Res. 28:393-404, 2008.`
Lallemand et al. J.Immunol. Methods. 356: 18-28, 2010.
Lallemand et al. J.Immunol. Methods. 373: 229-239, 2011
Lallemand et al. J.Immunol. Res. 390: 1-19, 2017
特定の実施形態では、本発明はまた、以下の項目に関する:
1.
(i)下流プロモーター配列に作動可能に連結された異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドであり、前記プロモーターが、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、前記オープンリーディングフレームが、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、第1の異種ポリヌクレオチド。
(ii)好ましい実施形態では、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、薬理活性分子に応答するレポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第2のルシフェラーゼ、例えば構成的プロモーターの制御下のウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
(xi)さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する三重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、それぞれ異なるリガンド応答性プロモーターに作動可能に連結され、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼ、またはルシフェリンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第2のオープンリーディングフレーム、それとともにウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ、または第3のリガンド応答性プロモーターの制御下にあるか、もしくは2つのリガンド応答性ルシフェラーゼの活性を、米国特許出願公開第2011/0189658号に記載される構成的プロモーターの制御下のルシフェラーゼの活性に対して正規化することを可能にする構成的プロモーターの制御下にある、セレンテラジンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第3のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された二重構築物をさらに有する。
(iii)前記オープンリーディングフレームが、前記細胞株の培養培地または上清中の第1のレポータータンパク質の効率的な分泌を確実にするシグナルペプチドの制御下にある、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第1のレポータータンパク質の活性を、その組成が表1に示されるものなどのセレンテラジン系基質、またはQuanti-Luc Gold(InvivoGen)などの市販の基質を使用して決定するステップ。
(iv)Dual-Glo基質(Promega)を使用して、細胞の溶解後の前記細胞株におけるホタルルシフェラーゼなどのルシフェリン系基質を必要とする第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップであり、第2のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害するDualGlo試薬(Promega)を使用して、細胞溶解後に同じ試料においてセレランテライズ系基質を必要とするウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼなどの第3のレポーター遺伝子の活性を測定し、その後第3のレポーター遺伝子の活性を定量するステップ
を含む後生動物細胞。
1.
(i)下流プロモーター配列に作動可能に連結された異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドであり、前記プロモーターが、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、前記オープンリーディングフレームが、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、第1の異種ポリヌクレオチド。
(ii)好ましい実施形態では、アッセイの正規化を提供するために、本発明による細胞株は、薬理活性分子に応答するレポーター遺伝子構築物で使用されるものとは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有する。例えば、構成的産生は、第2のルシフェラーゼ、例えば構成的プロモーターの制御下のウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼまたはホタルルシフェラーゼの産生であり得る。
(xi)さらに好ましい実施形態では、異なる基質を使用する三重ルシフェラーゼアッセイを提供するために、本発明による細胞は、それぞれ異なるリガンド応答性プロモーターに作動可能に連結され、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオープンリーディングフレーム、およびホタルルシフェラーゼ、またはルシフェリンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第2のオープンリーディングフレーム、それとともにウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ、または第3のリガンド応答性プロモーターの制御下にあるか、もしくは2つのリガンド応答性ルシフェラーゼの活性を、米国特許出願公開第2011/0189658号に記載される構成的プロモーターの制御下のルシフェラーゼの活性に対して正規化することを可能にする構成的プロモーターの制御下にある、セレンテラジンを基質として使用する任意の他のルシフェラーゼをコードする第3のオープンリーディングフレームに作動可能に連結された二重構築物をさらに有する。
(iii)前記オープンリーディングフレームが、前記細胞株の培養培地または上清中の第1のレポータータンパク質の効率的な分泌を確実にするシグナルペプチドの制御下にある、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第1のレポータータンパク質の活性を、その組成が表1に示されるものなどのセレンテラジン系基質、またはQuanti-Luc Gold(InvivoGen)などの市販の基質を使用して決定するステップ。
(iv)Dual-Glo基質(Promega)を使用して、細胞の溶解後の前記細胞株におけるホタルルシフェラーゼなどのルシフェリン系基質を必要とする第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップであり、第2のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害するDualGlo試薬(Promega)を使用して、細胞溶解後に同じ試料においてセレランテライズ系基質を必要とするウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼなどの第3のレポーター遺伝子の活性を測定し、その後第3のレポーター遺伝子の活性を定量するステップ
を含む後生動物細胞。
2.前記オープンリーディングフレームが、配列番号1もしくは配列番号2に示される配列、または配列番号1もしくは配列番号2と少なくとも75%の配列同一性、例えば配列番号1もしくは配列番号2と79%の配列同一性、例えば配列番号1もしくは配列番号2と85%の配列同一性、例えば配列番号1もしくは配列番号2と90%の配列同一性、例えば配列番号1もしくは配列番号2と95%の配列同一性、例えば配列番号1もしくは配列番号2と97%の配列同一性、例えば配列番号1もしくは配列番号2と98%の配列同一性、例えば配列番号1または配列番号2.10と99%の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる、先行する項目に記載の哺乳動物細胞。前記オープンリーディングフレームが、配列番号1に示される配列を含むかまたはそれからなる、先行する請求項のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
3.前記細胞が、これらに限定されないが、すべてのバリアントを含むHEK293、HEK293T、K562、U937、Jurkat、Molt-4、HeLa細胞、HT1080細胞、ARPE-19、ARPE-19/HPV-16、昆虫細胞、例えばSf9細胞、鳥類細胞、例えばDT-40、MSB1またはLMH、マウス細胞、例えばL929細胞またはLSバリアント、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、例えばCHO-K1、CHO-DXB11、CHO-DG44、CHOK1SV細胞からなる群から選択される、先行する項目のいずれかに記載の細胞。
4.前記細胞株がHEK293である、先行する項目のいずれかに記載の細胞株。
5.試験試料中の薬理学的に活性な分子の活性を検出し、場合により定量するための方法であって、
(i)試験試料を準備するステップ、
(ii)前記試験試料を先行する項目のいずれか一項に記載の細胞株と接触させるステップ、
(iii)前記細胞株における第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ
を含む、方法。
(i)試験試料を準備するステップ、
(ii)前記試験試料を先行する項目のいずれか一項に記載の細胞株と接触させるステップ、
(iii)前記細胞株における第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ
を含む、方法。
6.前記細胞株が第2のレポータータンパク質を発現し、前記方法が、
(iv)前記細胞株における第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(v)第1のレポータータンパク質の活性と第2のレポータータンパク質の活性の間の比を提供するステップ
をさらに含む、項目のいずれかに記載の方法。
(iv)前記細胞株における第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(v)第1のレポータータンパク質の活性と第2のレポータータンパク質の活性の間の比を提供するステップ
をさらに含む、項目のいずれかに記載の方法。
7.創薬におけるハイスループットスクリーニングのための方法であって:
(i)スクリーニングされる化合物のライブラリからなる試験試料を準備するステップ、
(ii)前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ
を含む、方法。好ましい実施形態では、本発明による細胞株は、384または1536ウェルプレートアッセイプレートに播種される。
(i)スクリーニングされる化合物のライブラリからなる試験試料を準備するステップ、
(ii)前記試験試料を本発明による細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、試験試料中に存在する薬理活性分子による細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含有し、前記プロモーターが、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されているステップ
を含む、方法。好ましい実施形態では、本発明による細胞株は、384または1536ウェルプレートアッセイプレートに播種される。
8.薬理活性分子の活性を定量するためのレポーター遺伝子の発現のためのベクターとして使用するのに最適な特徴を示すプラスミド。
9.レポーター遺伝子の発現のためのベクターとして使用するのに最適な特徴を示すプラスミドであって、前記レポーター遺伝子が、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる、プラスミド。
10.配列番号4に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるコドン最適化ハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する哺乳動物細胞におけるレポーター遺伝子の発現のためのベクターとして使用するのに最適な特徴を示すプラスミド。
11.配列番号5に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる哺乳動物細胞におけるレポーター遺伝子の発現のためのベクターとして使用するのに最適な特徴を示すプラスミド。
配列表1 <223>人工配列
配列表1 <223>配列番号1
配列表2 <223>人工配列
配列表2 <223>配列番号2
配列表3 <223>人工配列
配列表3 <223>配列番号3
配列表4 <223>人工配列
配列表4 <223>配列番号4
配列表5 <223>人工配列
配列表5 <223>配列番号5
配列表6 <223>人工配列
配列表6 <223>配列番号6
配列表7 <223>人工配列
配列表7 <223>配列番号AA1
配列表8 <223>人工配列
配列表8 <223>配列番号AA2
配列表9 <223>人工配列
配列表9 <223>配列番号AA3
配列表10 <223>人工配列
配列表10 <223>配列番号AA4
配列表11 <223>人工
配列表11 <223>配列番号7
配列表12 <223>人工
配列表12 <223>配列番号AA5
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配列表1 <223>配列番号1
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Claims (16)
- 配列番号AA1、配列番号AA2、配列番号AA3、配列番号AA4および配列番号AA5に示されるペプチド配列の1つまたは複数をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列。
- 前記1つまたは複数のヌクレオチド配列が、配列番号AA1、および/または配列番号AA2、および/または配列番号AA5に示されるペプチド配列の1つまたは複数をコードする、請求項1に記載の1つまたは複数のヌクレオチド配列。
- 前記ヌクレオチド配列が、配列番号1~配列番号7に示される配列の1つまたは複数である、請求項1~2のいずれか一項に記載の1つまたは複数のヌクレオチド配列。
- 前記ヌクレオチド配列が、配列番号1および/または配列番号2に示される配列の1つまたは複数である、請求項1~3のいずれか一項に記載の1つまたは複数のヌクレオチド配列。
- 配列番号1~配列番号7に示される配列の1つまたは複数を含むベクター。
- 配列番号1および/または配列番号2、場合により配列番号6の1つまたは複数を含む、請求項5に記載のベクター。
- 請求項5~6のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞または細胞株。
- 前記細胞または細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含み、前記プロモーターが、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、前記オープンリーディングフレームが、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、場合により配列番号AA1および配列番号AA2とは異なる第2のレポータータンパク質の構成的産生のためのさらなる構築物を含む、請求項1~7のいずれかに記載の細胞または細胞株。
- 配列番号3および配列番号4をさらに含む、請求項1~8のいずれかに記載の細胞または細胞株。
- 前記細胞または細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含み、前記プロモーターが、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、前記オープンリーディングフレームが、配列番号1または配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、場合により、下流プロモーター配列に作動可能に連結された異種シス作用性調節配列を含むさらなる構築物を含み、前記プロモーターが、ルシフェリン系基質を必要とするホタルルシフェラーゼなどのルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、場合により、下流プロモーター配列に作動可能に連結された第3の異種シス作用性調節配列を含むさらなる構築物を含み、前記プロモーターが、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼなどの配列番号AA1および配列番号AA2とは異なるセレンテラジン系基質を必要とするルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、請求項1~9のいずれかに記載の細胞または細胞株。
- すべてのバリアントを含む、HEK293、HEK293T、K562、U937、Jurkat、Molt-4、HeLa細胞、HT1080細胞、ARPE-19、ARPE-19/HPV-16、昆虫細胞、例えばSf9細胞、鳥類細胞、例えばDT-40、MSB1またはLMH、マウス細胞、例えばL929細胞またはLSバリアント、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、例えばCHO-K1、CHO-DXB11、CHO-DG44、CHOK1SV細胞を含む群から選択される後生動物細胞または細胞株である、請求項1~10のいずれかに記載の細胞または細胞株。
- 診断方法または薬物スクリーニング方法における、請求項7~11のいずれか一項に記載の細胞もしくは細胞株、または請求項1~4のいずれか一項に記載の配列の使用。
- 診断用途が、試験試料中の薬理学的に活性な分子の活性を検出し、場合により定量するための方法を含み、前記薬物スクリーニング方法がハイスループットスクリーニング方法である、請求項12に記載の使用。
- 試験試料中の薬理学的に活性な分子の活性を検出し、場合により定量するための方法であって、
i)試験試料を準備するステップ、
ii)下流プロモーター配列に作動可能に連結された、前記試験試料中に存在する薬理活性分子による前記細胞株の処理に応答する請求項7~11に記載の細胞株と前記試験試料を接触させるステップであり、前記プロモーターが、配列番号AA1および配列番号AA2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質をコードし、配列番号AA1および配列番号AA2とは異なる第2のレポータータンパク質の構成的産生のためのさらなる構築物を含むオープンリーディングフレームに作動可能に連結される、接触させるステップ、
iii)セレンテラジン系基質を使用して、配列番号AA1または配列番号AA2に示される前記第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
iv)セレンテラジンの非存在下で、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む前記第1のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する市販のルシフェリン系基質を使用することにより、配列番号AA1または配列番号AA2の前記レポータータンパク質を同じ試料中で測定した後に、前記細胞株中の前記第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
v)前記第1のレポータータンパク質の活性を前記第2のレポータータンパク質の活性に対して正規化するステップ
を含む、方法。 - 創薬におけるハイスループットスクリーニングのための方法であって、
(i)スクリーニングされる薬理活性分子のライブラリを含む試験試料を準備するステップ、
(ii)前記試験試料を請求項7~11に記載の細胞株と接触させるステップであり、前記細胞株が、下流プロモーター配列に作動可能に連結された、前記試験試料中に存在する前記薬理活性分子による前記細胞株の処理に応答する異種シス作用性調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチドを含み、前記プロモーターが、配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む第1のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、ステップ、
(iii)請求項7~11に記載の細胞株を、前記ライブラリをスクリーニングするために使用される薬剤または薬物候補で処理するステップ、
(iv)場合により、アッセイの正規化を提供するために、請求項7~11に記載の細胞株が、レポーター遺伝子構築物に使用されるものとは異なり、したがって配列番号1または配列番号2によってコードされる前記レポータータンパク質とは異なるルシフェラーゼの構成的産生のための構築物をさらに有するステップ、
(v)セレンテラジン系基質または任意の他の市販のセレンテラジン系基質を使用して、前記細胞株における前記第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(vi)セレンテラジンの非存在下で配列番号1および配列番号2に示される配列の1つを含む前記第1のレポータータンパク質の活性を効率的に阻害する市販のルシフェリン系基質を使用して、同じ試料中でレポーター遺伝子ルシフェラーゼを測定した後に、前記細胞株中の前記第2のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、および
(vii)前記第2のルシフェラーゼの活性に対して正規化された前記第1のルシフェラーゼの活性を決定するステップ
を含む、方法。 - 前記試験試料中に存在する薬理活性分子に対する中和抗体を検出し、場合により定量するための方法であって、
(i)薬理活性分子を含む試験試料を準備するステップ、
(ii)第1および第2の細胞試料を準備するステップであり、前記細胞試料が請求項7~11に記載の細胞株を含むステップ、
(iii)(ii)における前記第1の細胞試料を前記薬理活性分子と接触させ、その後試験試料((i)における)と接触させるステップ、
(iv)前記第2の細胞試料を前記薬理活性分子と接触させるステップ、
(iv)前記第1の細胞試料の前記細胞中の前記第1のレポータータンパク質の活性を決定し、前記第2の細胞試料の前記細胞中の前記第1のレポータータンパク質の活性を決定するステップ、
(v)前記第1および第2の細胞試料におけるレポーター活性の間の比を評価するステップであり、1より低い比(第1/第2)が前記試料における前記薬理活性分子に対する抗体の存在を示すステップ
を含む方法。
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