CN112673109A - 细胞选择方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及筛选转基因细胞群体中产生目的蛋白的细胞的方法。所述方法包括在细胞培养基中包括至少一种非天然氨基酸(nnAA)的培养条件下培养转基因细胞。所述转基因细胞包含至少一种编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域编码目的蛋白，所述第二结构域编码的结构域有助于当所述转基因细胞表达所述第二结构域时检测表达所述目的蛋白的所述转基因细胞。

Description

细胞选择方法
背景技术
技术领域
本发明涉及筛选转基因细胞群体中产生目的蛋白的细胞的方法。所述方法包括在细胞培养基中包括至少一种非天然氨基酸(nnAA)的培养条件下培养转基因细胞。所述转基因细胞包含至少一种编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域编码目的蛋白，所述第二结构域编码的结构域有助于当所述转基因细胞表达所述第二结构域时检测表达所述目的蛋白的所述转基因细胞。融合蛋白还包含至少一种nnAA。
背景技术
在整个药物开发过程中使用产生目的蛋白的转基因细胞。例如，在药物开发的早期，这类细胞用于抗体生成活动和基于细胞的测定以评估活性，而在药物开发的后期，这类细胞用于生产生物药物。因此，转基因细胞的选择对于药物开发至关重要。
已经进行了许多努力来提供用于选择产生目的蛋白的转基因细胞的替代方法。例如，流式细胞术使得鉴定具有特定特征的细胞更加可行。流式细胞术的重要优点包括筛选大量细胞的能力。然而，流式细胞术是费时费力的。
本发明通过例如减少工作量和增加效率来提供优于现有方法的优点。例如，PCT公开号WO 2003/014361公开了一种系统，所述系统使用终止密码子抑制技术来实现融合蛋白的通读和表达，其中融合蛋白的结构域之一是抗生素抗性基因。然后在抗生素存在下培养细胞，以确定哪些细胞表达融合蛋白。但是，所述方法不允许选择高水平的融合蛋白生产者，因此没有选择高产克隆的机制。类似地，PCT公开号WO 2005/073375公开了抗生素依赖性系统的使用，使得在实现终止密码子抑制之前，转基因细胞必须在培养中暴露于抗生素至少两天。这些方法也不会导致在单轮克隆/选择后选择高产者的能力。PCT公开号WO2010/022961使用了密码子序列，所述密码子序列使得能够实现终止密码子的漏通读。这样的系统是不可诱导的，表现出效率低并且不能被严格控制。因此，在单轮克隆和选择后，该系统也不能选择目的蛋白的高产者。
本发明提供了一种具有许多优点(包括提高的效率和控制)的富集和选择转基因细胞的新颖方法。该方法也已经跨不同的目的蛋白得到验证，并且因此可以用作富集和选择表达任何目的蛋白的转基因细胞的平台。
发明内容
本发明涉及筛选转基因细胞群体中产生目的蛋白的细胞的方法。所述方法包括在细胞培养基中包括至少一种非天然氨基酸(nnAA)的培养条件下培养转基因细胞。所述转基因细胞包含至少一种编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域编码目的蛋白，所述第二结构域编码的结构域有助于当所述转基因细胞表达所述第二结构域时检测表达所述目的蛋白的所述转基因细胞。融合蛋白还包含至少一种nnAA。
在一个实施例中，转基因细胞包含至少一种编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域编码目的蛋白，所述第二结构域编码锚结构域，当转基因细胞表达所述第二结构域时，所述锚结构域将所述目的蛋白锚定至细胞膜。这些融合蛋白还包含至少一种nnAA。
在另一个实施例中，转基因细胞包含至少一种编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域编码目的蛋白，所述第二结构域编码标签，当转基因细胞表达所述第二结构域时，所述标签对所述目的蛋白进行标记。这些融合蛋白还包含至少一种nnAA。
附图说明
图1描绘了在本发明的方法中使用的可诱导系统。nnAA的存在导致靶基因3’末端编码的琥珀终止密码子通读以及融合蛋白的表达，例如包含跨膜结构域或糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着序列(其使得能够将抗体锚定至细胞膜)的抗体。在这些相同的细胞中，细胞培养基中不存在nnAA导致没有膜锚的抗体的表达，并被分泌到细胞培养基中。在这些实施例中，编码nnAA的密码子在抗体的重链的C末端，其允许抗体通过重链锚定到细胞膜上。
图2描绘了可以插入本发明的转基因细胞中的多核苷酸。在该实施例中，HC代表抗体的重链，并且DAF-7代表GPI信号肽，其允许将重链锚定在细胞表面膜上。TM代表来自跨膜蛋白的跨膜结构域。在该实例中，使用了人血栓调节蛋白的TM结构域。TAG(红色星号)代表当nnAA存在于培养基中时编码nnAA的琥珀终止密码子。TGA和TAA(绿色星号)代表不是针对nnAA的整合位点的终止密码子。
图3描述了使用本发明方法的流式细胞术结果。在存在或不存在nnAA的情况下培养表达所示构建体的细胞，并用抗HC和抗LC抗体检测表面结合的IgG。在细胞培养基中，构建体“IgG-DAF-琥珀”在不存在nnAA的情况下显示出低表面荧光，而在存在nnAA的情况下显示出高表面荧光。在细胞培养基中，构建体“IgG-TM-1x琥珀”在不存在nnAA的情况下显示出低表面荧光，而在存在nnAA的情况下显示出高表面荧光。
图4描绘了在用2mM、0.mM和0.1mM nnAA激活表面展示系统后，MFI和表达池的表达滴度的相关性。通过表面展示获得的表达与MFI之间的相关性随nnAA浓度的降低而提高。B)可以通过调节nnAA的浓度和细胞暴露于nnAA的时间来调节抗体-GPI融合物的表面展示的程度。随着暴露时间的延长或nnAA浓度的增加，群体的MFI增加。
图5描绘了基于表面展示的稳定池的选择。A)稳定表达IgG-GPI-琥珀的细胞的分选门在不存在(-nnAA)或存在nnAA(+nnAA)的情况下生长，并基于HC表达通过FACS分选到池中，以将细胞分离为未富集池、低(靠后)和高(靠前)表面展示池。B)扩增分选的子池，并确定其分批补料滴度和C)单位生产率(Qp)。从高表面展示分选的细胞显示出比未富集或低表面展示池更高的总体滴度。
图6描绘了高表面展示水平与滴度增加相关。A)稳定的IgG-GPI-琥珀池在nnAA存在下生长，并通过FACS批量分选为低、中和高表面染色池。B)通过分批补料培养确定分选的子池的表达水平(n＝3)。C)在扩增后通过流式细胞术测量分选的子池的表面展示。通过分批补料方法保留了三个具有不同表面染色水平的重叠群体。D)重链表面展示MFI并且子池滴度显示强正相关性。显示测定系数(R2)。
图7描绘了表面展示用于鉴定和分离高表达克隆的实用性。A)使用表面展示从高、中和低表面展示门控分选表达IgG-GPI-琥珀的单细胞，并以单细胞密度将细胞分选到96孔板中。这些克隆的表达水平在96深孔分批补料培养物中测量。将每个克隆的表达水平与在没有表面展示的情况下分选的对照群体一起作图。来自高表面展示门控的平均表达值显示出中、低和非富集群体的统计学显著差异。显示了指示对的P值。B)为了突出利用表面展示对高产克隆的富集，将所选滴度以上的克隆的频率绘制在堆叠图中。高表面展示选择显示，与其他门控或非富集群体相比，非常高产克隆(＞8.5g/L)的富集。C)在来自表面展示门控部分中的每个的30个克隆中检查了表面展示MFI和表达水平之间的相关性。显示了拟合的回归线及其测定系数(R2)。这些数据表明表面展示和表达滴度之间的强相关性。
图8描绘了表面展示针对难以表达的分子富集和选择高表达子的实用性。A)对稳定表达双特异性抗体的细胞进行表面展示，并使用高和低门控来选择单个细胞，所述双特异性抗体在常规细胞系工程筛选中显示出低滴度。还分离了衍生自非富集群体的克隆。B)在96深孔分批补料培养物评估分离的克隆中的表达滴度。衍生自高表面展示门控的克隆显示较高的总体表达滴度水平，但也显示较高数量的高产克隆。
图9描绘了Jump-In CHOK1细胞系中琥珀抑制的流式细胞术测量。用mCherryAMBGFP报告子(9A)转染的池1的代表性数据。用mCherryAMB GFP报告子(9B)转染的克隆7。
图10描绘了用于验证这种(可诱导)方法的DNA和蛋白构建体。代表琥珀抑制依赖性(AMB)和通读(K)变体的DNA构建体。AzK，由pylRS/tRNA对(10A)掺入的赖氨酸类似物。代表琥珀抑制依赖性(AMB)和通读(K)变体的蛋白质，具有和不具有nnAA(10B)补充。不存在nnAA的情况下，含有AMB构建体的细胞仅表达‘不带标签’的蛋白变体；但是，存在nnAA的情况下，细胞表达‘不带标签’和‘带标签’的蛋白变体两者。包含通读构建体的细胞仅表达‘带标签’的蛋白变体。内部Rho 1D4序列(*)不被Rho 1D4抗体识别。
图11描绘了蛋白印迹，其证明了通过将细胞暴露于nnAA而特异性地引发了带标签的膜蛋白表达。向表达EphA2-、密封蛋白1-、CXCR2-或CXCR4的细胞补充nnAA以诱导GFP表达。暴露于nnAA后0、24和48h产生总细胞裂解物，并使用针对Rho 1D4、eGFP和微管蛋白的抗体通过蛋白印迹进行评估。箭头表示‘不带标签’的膜蛋白(单星号)和‘带标签’的膜蛋白(双星号)。每个膜蛋白的‘通读’变体(未显示)用于鉴定‘带标签’的变体。
图12描绘了亲本群体、预分选的群体和分选的群体的比较分析。通过蛋白印迹(12A)评估了亲本群体、预分选的群体和分选的群体中‘带标签’的EphA2、密封蛋白1、CXCR2和CXCR4的总表达。细胞表面FCM，使用抗EphA2 1C1(12B)。细胞表面FCM，使用抗密封蛋白1FAB4618R(12C)。细胞表面FCM，使用抗CXCR2-X2-753(12D)。细胞表面FCM，使用抗CXCR4MEDI3185(12E)。IL-8配体与亲本细胞系和分选的‘不带标签’的CXCR2表达细胞系结合(12F)。SDF-1α配体与亲本细胞系和分选的‘不带标签’的CXCR4表达细胞系结合(12G)。
图13描绘了在nnAA暴露后0和48小时的膜蛋白细胞系的荧光显微镜检查。暴露于nnAA后48小时，通过荧光显微镜检查评估了表达EphA2-、密封蛋白1-、CXCR2-或CXCR4的克隆7细胞。每种膜蛋白的‘带标签’的变体表现出与‘通读’变体相似的细胞分布。密封蛋白1融合蛋白显示出定位至细胞间接触区域。箭头指示细胞间相互作用。
发明详细说明
本发明涉及筛选转基因细胞群体中产生目的蛋白的细胞的方法。所述方法包括在细胞培养基中包括至少一种非天然氨基酸(nnAA)的培养条件下培养转基因细胞。所述转基因细胞包含至少一种编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域编码目的蛋白，所述第二结构域编码的结构域有助于当所述转基因细胞表达所述第二结构域时检测表达所述目的蛋白的所述转基因细胞。融合蛋白还包含至少一种nnAA。
在一个具体实施例中，本发明涉及筛选转基因细胞群体中与其他细胞相比产生更高水平的目的蛋白的方法，所述其他细胞在所述转基因细胞群体中产生较低水平的所述目的蛋白。所述方法包括在细胞培养基中包括至少一种非天然氨基酸(nnAA)的培养条件下培养转基因细胞。转基因细胞包含至少一种编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域编码目的蛋白，所述第二结构域编码锚结构域，当转基因细胞表达所述第二结构域时，所述锚结构域将所述目的蛋白锚定至细胞膜。这些融合蛋白还包含至少一种nnAA。
在本发明的另一个具体实施例中，图1描绘了在本发明的方法中使用的可诱导系统。nnAA的存在导致靶基因3’末端编码的琥珀终止密码子通读以及融合蛋白的表达，例如包含跨膜结构域或糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着序列(其使得能够将抗体锚定至细胞膜)的抗体。在这些相同的细胞中，细胞培养基中不存在nnAA导致没有膜锚的抗体的表达，并被分泌到细胞培养基中。在这些实施例中，编码nnAA的密码子在抗体的重链的C末端，其允许抗体通过重链锚定到细胞膜上。
在本发明的另一个具体实施例中，图2描绘了可以插入本发明的转基因细胞中的多核苷酸。在该实施例中，HC代表抗体的重链，并且DAF-7代表GPI信号肽，其允许将重链锚定在细胞表面膜上。TM代表来自跨膜蛋白的跨膜结构域。在该实例中，使用了人血栓调节蛋白的TM结构域。TAG(红色星号)代表当nnAA存在于培养基中时编码nnAA的琥珀终止密码子。TGA和TAA(绿色星号)代表不是针对nnAA的整合位点的终止密码子。
在另一个具体实施例中，本发明涉及筛选转基因细胞群中产生目的蛋白的细胞的方法，所述目的蛋白包含至少一个跨膜结构域。所述方法包括在细胞培养基中包括至少一种非天然氨基酸(nnAA)的培养条件下培养转基因细胞。转基因细胞包含至少一种编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白具有第一结构域和第二结构域，所述第一结构域编码目的蛋白，所述第二结构域编码标签，当转基因细胞表达所述第二结构域时，所述标签对所述目的蛋白进行标记。这些融合蛋白还包含至少一种nnAA。
本发明的转基因细胞已经进行了工程改造以当nnAA存在于细胞培养基中时将nnAA掺入多肽链中。如本文所用，术语非天然氨基酸(nnAA)用于表示具有不是标准遗传密码的20个“蛋白原”氨基酸之一的氨基酸结构的任何分子。本领域技术人员可以完全识别标准遗传密码的20个蛋白原氨基酸，因此，本领域技术人员将容易识别nnAA氨基酸。具体而言，术语nnAA不包括以下氨基酸：精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸。但是，术语nnAA可以包括以上列出的氨基酸的衍生物，条件是这些衍生物不是标准遗传密码的20个蛋白原氨基酸中的任何一个。重要的是，只要nnAA可以掺入到正在生长的多肽链中并且可以支持琥珀抑制，nnAA的具体身份对于本发明的方法不是关键性的。相反，只要nnAA可以掺入到正在生长的多肽链中，在转基因细胞培养环境中仅存在或不存在nnAA都是关键性的。可以在本发明的方法中使用的nnAA的实例包括但不限于以下中列出的那些nnAA：Liu，C.和Shultz，P.，Ann.Rev.Biochem.[生物化学年度综述]，79：413-444(2010)和Wan等人Biochim Biophys Acta.[生物化学与生物物理学学报]2014年1月；1844(6)：1059-1070，将其通过引用并入。
在一个具体实施例中，本发明方法中存在于细胞培养环境中的nnAA是赖氨酸类似物(包括但不限于吡咯赖氨酸、赖氨酸叠氮化物、炔丙基赖氨酸、赖氨酸-Aloc和Boc-赖氨酸)。在本发明的方法中使用的nnAA的身份将必然鉴定正交tRNA和正交tRNA合成酶。例如，当本发明的nnAA是赖氨酸叠氮化物时，正交tRNA合成酶将被鉴定为吡咯赖氨酰-tRNA合成酶或PylRS，并且其同源tRNA为tRNA-Pyl(或tRNA(Pyl))。因此，在一个实施例中，nnAA是赖氨酸叠氮化物，并且正交tRNA合成酶是吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，并且tRNA是tRNA-Pyl。
在另一个具体实施例中，某些天然存在的氨基酸可用于本发明的方法。在这种情况下，本文所述或要求保护的nnAA也将包括那些某些天然存在的氨基酸。此类天然存在的氨基酸包括但不限于吡咯赖氨酸。
现在，在本领域中众所周知，当通过正常的细胞转录和翻译过程产生肽时，如何构建具有将nnAA掺入这些肽的氨基酸序列中的能力的细胞。即，具有将nnAA掺入到生长的肽链中的细胞必须包括经过工程改造以“接受”nnAA的正交tRNA，以及与正交tRNA和nnAA“匹配”的tRNA合成酶。正交tRNA合成酶在酯化反应过程中将nnAA“附着”至正交tRNA，从而与nnAA形成氨基酰基-tRNA。如本文所用，术语“正交tRNA合成酶”在本领域中按原样使用是指通常在培养的特定细胞类型中不存在的tRNA合成酶种类。通常，正交tRNA合成酶对nnAA具有特异性，并且在酯化过程中不接受任何天然存在的氨基酸。此外，宿主细胞的tRNA合成酶不识别“正交tRNA”。但是，本发明的转基因细胞已经被工程改造以表达正交的tRNA合成酶和tRNA两者，使得正交tRNA将加载nnAA。任何已知的正交tRNA合成酶和tRNA对都可以用于本发明，只要tRNA可以加载nnAA以掺入并支持琥珀抑制。
在本发明的方法的操作过程中，当nnAA存在于培养环境中时，正交tRNA和匹配的正交tRNA合成酶将匹配的nnAA插入生长的肽链中的由琥珀终止密码子指定的位点。当培养环境中不存在nnAA时，正交tRNA将不接受任何天然存在的氨基酸，并且因此琥珀密码子将充当终止密码子并导致肽合成停止。换句话说，对本发明方法中使用的转基因细胞中存在的正交tRNA进行工程改造，使得tRNA的反密码子环将与mRNA分子上的终止密码子碱基配对。因此，在具有转基因细胞的培养条件下nnAA的存在将允许转基因细胞中生长的多肽链延长，从而将nnAA掺入到生长的多肽链中。此外，在具有转基因细胞的培养条件下不存在nnAA将导致多肽链停止生长，因为除了琥珀终止密码子之外没有氨基酸会插入多肽链中。因此，在具有转基因细胞的培养条件下nnAA的存在或不存在作为多肽延长的“守门人”。因此，nnAA的具体身份对于本发明方法的操作不是关键的，因为nnAA仅作为多肽延长的守门人。
本发明的转基因细胞可以是能够被培养并且能够被工程改造以产生正交tRNA和匹配的正交tRNA合成酶的任何细胞类型。可以用于本发明的方法的细胞的实例包括但不限于真核细胞(例如但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞和酵母细胞)以及原核细胞(例如细菌细胞)。可用于本发明的方法的转基因细胞的具体实例包括但不限于大肠杆菌(E.coli)细胞、CHO细胞、HEK293细胞、PERC6细胞、COS-1细胞、HeLa细胞、VERO细胞和小鼠杂交瘤细胞。在一个实施例中，在PCT公开号WO 2014/044872中公开的细胞可以用于本发明的方法。
本发明的转基因细胞还包含至少一种编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白具有至少一个第一结构域和至少一个第二结构域，所述第一结构域编码目的蛋白，所述第二结构域编码的结构域有助于检测在转基因细胞中或上表达所述目的蛋白的转基因细胞。编码第一和第二结构域的融合蛋白的多核苷酸还包含至少一个编码nnAA的密码子。如上所解释，当在培养条件下存在nnAA时，多肽链将在蛋白合成过程中继续延长，使得在蛋白合成过程中生成第一和第二结构域两者，其中这些第一和第二结构域被至少一个nnAA隔开。在一个具体实施例中，多核苷酸编码多于一个的nnAA。在一个更具体实施例中，这些多个nnAA是相同的nnAA。在另一个更具体实施例中，多个nnAA是不同的nnAA。如果在多核苷酸中编码了两个以上的nnAA，则所述nnAA中的两个或更多个可以彼此相同或不同。在第一和第二结构域之间编码第一nnAA的该第一密码子也将在蛋白合成过程中用作终止密码子，使得在生成第一结构域后多肽链停止生长。
在选择的实施例中，编码融合蛋白的多核苷酸还编码第一和第二结构域之间的接头肽。在这些实施例中，编码至少一个nnAA的密码子可以是接头肽的5’或3’。如本文所用，接头肽用于意指长度通常在约1至约120个氨基酸范围内的多肽，其被设计为有助于两个结构域功能性连接成连接的结合结构域。清楚地，对于本发明的目的，单个氨基酸可以被认为是接头肽。当然，在本发明的融合蛋白中使用的接头肽可以包含长度超过120个残基的氨基酸或替代性地由其组成。如果存在，则接头肽的长度对于融合蛋白的功能可以不是关键性的，条件是亚结构域接头肽允许亚结构域之间的功能连接。可用作接头的氨基酸序列包括在以下中公开的那些：Maratea等人，Gene[基因]40：39-46(1985)、Murphy等人，Proc.Nat.Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]，83：8258-8562(1986)、美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180，其全部通过引用并入。
在接头肽的上下文中，术语“功能性连接”是指有助于每个结构域的多肽折叠成三维结构的连接，所述三维结构允许所连接的融合多肽模拟其所衍生自的结构域的一些或所有功能性方面或生物学活性。术语功能连接也表示连接的结构域具有至少最小程度的稳定性、柔性和/或张力，这是结合结构域如所期望地起作用所必需的。在本发明的一个实施例中，结构域接头肽包含相同的氨基酸或由其组成。在另一个实施例中，结构域接头肽的氨基酸彼此不同。
在本发明的另外的实施例中，至少一种多核苷酸编码具有两个以上结构域的融合蛋白，其中多个结构域中的至少一个编码的结构域有助于检测表达目的蛋白的转基因细胞。在具体实施例中，编码具有多个结构域的融合蛋白的多核苷酸包含至少一个编码nnAA的密码子。在具体实施例中，编码具有多个结构域的融合蛋白的多核苷酸包含编码每个结构域之间的至少一个nnAA的至少一个密码子。在该实施例中，编码nnAA的多个密码子可以编码或可以不编码相同的nnAA。因此，如果转基因细胞包含多于一组的正交tRNA/正交tRNA合成酶，即每组对应于不同的nnAA，则有可能在培养基中包括特定的nnAA，但不包括其他。在这种情况下，可以控制具有一个或两个或更多个与第一个结构域融合的结构域的蛋白的产生。
编码融合蛋白的多核苷酸应编码至少一种目的蛋白。本发明的方法不受目标蛋白质的身份的限制。生成包括编码融合蛋白的多核苷酸的表达载体的方法在本领域中是众所周知的，以至于实际上任何编码序列都可用于生成任何目的蛋白。目的蛋白的实例包括结构蛋白、酶、抗体和其他防御蛋白、信号传导蛋白、调节性蛋白、转运蛋白、感测蛋白、运动蛋白和贮存蛋白。
编码融合蛋白的多核苷酸还应编码至少一个第二结构域，其有助于检测表达目的蛋白的转基因细胞。在一个实施例中，第二结构域是锚结构域，其将整个融合蛋白锚定至表达融合蛋白的转基因细胞的细胞膜。如本文所用，锚结构域是允许目的蛋白在转基因细胞表面上“展示”的结构域，使得目的蛋白在细胞内生成，但细胞无法将目的蛋白分泌到与细胞分开的细胞培养环境中。锚结构域本身不必是完整的蛋白，并且包括能够将融合蛋白锚定至表达融合蛋白的转基因细胞的细胞膜的蛋白的功能部分。例如，更复合的蛋白的跨膜结构域部分可以在本发明的方法中用作锚结构域。锚结构域的实例包括但不限于单次跨膜结构域、跨膜β-桶或其任何部分。可用作本发明的锚结构域的跨膜结构域的具体实例包括但不限于来自以下的跨膜结构域：肿瘤坏死因子受体超家族成员CD30，血小板衍生生长因子受体(PDGFR，例如人PDGFR的氨基酸514-562；Chestnut等人1996J ImmunologicalMethods[免疫学方法杂志]193：17-27；也参见Gronwald等人1988PNAS[美国国家科学院院刊]85：3435)；神经生长因子受体，鼠B7-1(Freeman等人1991J Exp Med[实验医学杂志]174：625-631)，去唾液酸糖蛋白受体H1亚基(ASGPR；Speiss等人1985J Biol Chem[生物化学杂志]260：1979-1982)，CD27、CD40、CD120a、CD120b、CD80(Freeman等人1989J Immunol[免疫学杂志]143：2714-22)淋巴毒素β受体，半乳糖基转移酶(E.G.GenBank登录号AF155582)，唾液酸转移酶(E.G.GenBank登录号NM-003032)，天冬氨酰转移酶1(Asp1；例如GenBank登录号AF200342)，天冬氨酰转移酶2(Asp2；例如GenBank登录号NM-012104)，突触融合蛋白6(例如GenBank登录号NM-005819)，泛素，多巴胺受体，胰岛素B链，乙酰葡糖氨基转移酶(例如GenBank登录号NM-002406)，APP(例如GenBank登录号A33292)，G蛋白偶联受体，血栓调节蛋白(Suzuki等人1987EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]6，1891)，A-凝集素结合亚基，和TRAIL受体。跨膜结构域的实例还描述于PCT公开号WO 1998/021232、WO 2003/104415和WO 2007/047578中。
在其他实施例中，锚结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号肽，其促进目的蛋白锚定到细胞膜中存在的GPI部分。GPI信号肽在本领域中是众所周知的，并且包括来自在以下中讨论的GPI锚定蛋白的信号肽：Chapter11 of Essentials of Glycobiology[糖生物学要点第11章]，第2版，Varki，A.等人编辑，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)(2009)，将其通过引用并入。GPI信号肽的具体实例包括来自以下的GPI信号肽：衰变加速因子7(DAF-7)、nogo受体、尾随诱饵受体(trail decoy receptor)、叶酸受体、膜锚定的丝氨酸蛋白酶和痒病朊病毒蛋白。
在一个实施例中，第二结构域是对目的蛋白进行标记的标签。标签可以是附接至蛋白以有助于检测或纯化表达的蛋白的任何可检测分子，例如肽序列。本发明的融合蛋白可以包含两个、三个、四个或更多个结构域，其中的每个可以是不同的标签。如果本发明的融合蛋白包含一个以上的标签，则所述标签在化学上可以相同或可以不相同。在某些实施例中，标签可以是亲和标签、表位标签或荧光标签。亲和标签、表位标签或荧光标签是本领域公知的。作为本发明的融合蛋白的一部分的亲和标签的实例包括但不限于谷胱甘肽-S转移酶(GST)、多组氨酸标签(His)、钙调素结合蛋白(CBP)和麦芽糖结合蛋白(MBP)。作为本发明的融合蛋白的一部分的表位标签的实例包括但不限于myc、人流感血凝素(HA)和FLAG。作为本发明的融合蛋白的一部分的荧光标签的实例包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP、AcGFP、ZsGreen)，红移GFP(rs-GFP)、红色荧光蛋白(RFP，包括DsRed2、HcRed1、dsRed-Express)、黄色荧光蛋白(YFP，Zsyellow)、青色荧光蛋白(CFP，AmCyan)、蓝色荧光蛋白(BFP)和藻胆蛋白，以及这些蛋白的增强版本和突变。对于一些荧光蛋白，增强表明通过增加蛋白的亮度或创建具有更快发色团成熟的蛋白来优化发射。这些增强可以通过将突变工程改造进入荧光蛋白来实现。
所述方法包括在允许蛋白合成的培养条件下培养转基因细胞。根据本发明培养的转基因细胞可以根据技术人员需要的实验条件进行培养和铺板或悬浮。本文的实例证明了可以与本文描述的方法结合使用的至少一个功能性培养条件组。如果未知，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来确定用于给定细胞类型的促进蛋白合成的铺板或悬浮和培养条件。细胞可以铺板也可以不铺板在培养容器的表面，如果铺板，可以使用附着因子将细胞铺板在培养容器的表面。如果使用附着因子，则可以用一种或多种天然的、重组的或合成的附着因子或其肽片段(例如但不限于胶原蛋白、纤连蛋白及其天然片段或合成片段)预先包被培养容器。
可以针对所需的特定培养条件来控制培养条件下的细胞接种密度。对于在塑料培养容器中进行常规培养，转基因细胞的接种密度可以是约1x104至约1x107个细胞/cm2，这很典型，例如，1x106个细胞通常在35mm2-100mm2组织培养皮氏培养皿中培养。细胞密度可以在任何传代中根据需要改变。
如果使用本发明的方法培养哺乳动物转基因细胞以进行蛋白合成，则通常将这些细胞在细胞培养箱中在正常大气压下于约37℃下培养。孵化器气氛通常是加湿的，并且通常在空气中包含约3％-10％的二氧化碳。只要细胞仍有活力，温度、压力和CO2浓度可以根据需要进行更改。培养基pH可以在约7.1至约7.6的范围内，特别是在约7.1至约7.4的范围内，并且甚至更特别地在约7.1至约7.3的范围内。
在允许蛋白合成发生的条件下培养转基因细胞。当在培养条件下存在一种或多种nnAA时，将合成包含两个或更多个结构域的全长融合蛋白，并且目的蛋白将锚定至转基因细胞或锚定在转基因细胞上，或者目的蛋白将被标记。当在培养条件下不存在一种或多种nnAA时，将不会合成全长融合蛋白。相反，仅目的蛋白被表达，因为当不存在nnAA时，编码nnAA的密码子将充当终止密码子。在具体实施例中，将nnAA与转基因细胞一起置于细胞培养条件下约48小时或更短，之后用不含nnAA的细胞培养基代替含有nnAA的细胞培养基。除去细胞培养基并用缓冲液(例如但不限于PBS)洗涤细胞以除去痕量的先前细胞培养基是常规的。在更具体实施例中，将nnAA与转基因细胞一起置于细胞培养条件下少于约48小时、少于约46小时、少于约44小时、少于约42小时、少于约40小时、少于约38小时、少于约36小时、少于约34小时、少于约32小时、少于约30小时、少于约28小时、少于约26小时、少于约24小时、少于约22小时、少于约20小时、少于约18小时、少于约16小时、少于约14小时、少于约12小时、少于约10小时、少于约8小时、少于约6小时、少于约5小时、少于约4小时、少于约3小时、少于约2小时、少于约1小时，这之后用不含nnAA的细胞培养基代替含有nnAA的细胞培养基。
在其他实施例中，细胞培养基中一种或多种nnAA的浓度可以变化。在一个具体实施例中，一种或多种nnAA在细胞培养基中的总浓度是约5mM或更小。在一个更具体实施例中，一种或多种nnAA在细胞培养基中的总浓度在约2mM至约10μM之间。在甚至更具体实施例中，一种或多种nnAA在细胞培养基中的总浓度是约10μM至约20μM、约20μM至约30μM、约30μM至约40μM、约40μM至约50μM、约50μM至约60μM、约60μM至约70μM、约70μM至约80μM、约80μM至约90μM、约90μM至约100μM、约100μM至约120μM、约120μM至约140μM、约140μM至约160μM、约160μM至约180μM、约180μM至约200μM、约200μM至约250μM、约250μM至约300μM、约300μM至约350μM、约350μM至约400μM、约400μM至约450μM或约450μM至约500μM、约500μM至约550μM、约550μM至约600μM、约600μM至约650μM或约650μM至约700μM、约700μM至约750μM、约750μM至约800μM、约800μM至约850μM或约850μM至约900μM、约900μM至约950μM、约950μM至约1.0mM、约1.0mM至约1.1mM、约1.1mM至约1.2mM、约1.2mM至约1.3mM、约1.3mM至约1.4mM、约1.4mM至约1.5mM、约1.5mM至约1.6mM、约1.6mM至约1.7mM、约1.7mM至约1.8mM、约1.8mM至约1.9mM、约1.9mM至约2.0mM、约2.0mM至约2.1mM、约2.1mM至约2.2mM、约2.2mM至约2.3mM、约2.3mM至约2.4mM、约2.4mM至约2.5mM、约2.5mM至约2.6mM、约2.6mM至约2.7mM、约2.7mM至约2.8mM、约2.8mM至约2.9mM、约2.9mM至约3.0mM、约3.0mM至约3.1mM、约3.1mM至约3.2mM、约3.2mM至约3.3mM、约3.3mM至约3.4mM、约3.4mM至约3.5mM、约3.5mM至约3.6mM、约3.6mM至约3.7mM、约3.7mM至约3.8mM、约3.8mM至约3.9mM、约3.9mM至约4.0mM；约4.0mM至约4.1mM、约4.1mM至约4.2mM、约4.2mM至约4.3mM、约4.3mM至约4.4mM、约4.4mM至约4.5mM、约4.5mM至约4.6mM、约4.6mM至约4.7mM、约4.7mM至约4.8mM、约4.8mM至约4.9mM、约4.9mM至约5.0mM。
如果融合蛋白合成，即培养条件包括一种或多种nnAA，则目的蛋白将展示在转基因细胞的表面上。然后，本发明的方法将包括用于确定在转基因细胞中产生的目的蛋白的水平或数量的方法。通过确定在转基因细胞群体中单个细胞上或细胞亚群中展示的目的蛋白水平，可以确定哪些单个细胞或细胞亚群产生与转基因细胞群体的其余细胞相比更高数量的目的蛋白。
确定和定量展示在细胞表面的蛋白的方法是本领域的常规方法。在一个实施例中，确定展示在转基因细胞表面上的目的蛋白的水平包括流式细胞术。在其他实施例中，确定展示在转基因细胞表面上的目的蛋白的水平包括基于细胞的ELISA、均相测定、蛋白印迹、配体结合、抗原结合、功能测定、抗体依赖性杀伤测定。
在一个具体实施例中，将产生更低量的展示在转基因细胞表面上的目的蛋白的转基因细胞与转基因细胞群体中的其余细胞分开。在一个具体实施例中，将产生更高量的展示在转基因细胞表面上的目的蛋白的转基因细胞与转基因细胞群体中的其余细胞分离。从细胞群体内分离细胞的方法是本领域常规的，并且包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)、基于珠的分选、ClonePix、伯克利(Berkley)灯技术以及有限稀释克隆和表达评估。
如本文所用，当确定目的蛋白质的水平、数量或量时，这些确定可以是相对的或绝对的。例如，当使用FACS从剩余的细胞群体中分选更高产者时，一种确定可能只是测量相对于细胞群体的其他成员更亮或更强烈的荧光信号。
如本文所用，术语“更高”当与目的蛋白的数量结合使用时是可以由技术人员设置的相对术语。例如，如果使用荧光作为对转基因细胞表面展示的目的蛋白数量的替代测量，则操作员可以设置必须展示以被视为“更高”产者的最小荧光量。在替代性方案中，技术人员可以简单地选择展示出最高水平的目的蛋白的细胞的一部分或百分比。在具体实施例中，术语“更高”当与目的蛋白的数量结合使用时是指来自处于允许融合蛋白合成的条件下的转基因细胞的初始群体中的展示目的蛋白的细胞的约前50％、约前45％、约前40％、约前35％、约前30％、约前25％、约前20％、约前15％、约前10％、约前5％或约前1％。
如本文所用，术语“更低”当与目的蛋白的数量结合使用时是可以由技术人员设置的相对术语。例如，如果使用荧光作为对转基因细胞表面展示的目的蛋白数量的替代测量，则操作员可以设置必须展示以不被视为“更低”产者的最小荧光量。在替代性方案中，技术人员可以简单地选择展示出最低水平的目的蛋白的细胞的一部分或百分比。在具体实施例中，术语“更低”当与目的蛋白的数量结合使用时是指来自处于允许融合蛋白合成的条件下的转基因细胞的初始群体中的展示目的蛋白的细胞的约后50％、约后45％、约后40％、约后35％、约后30％、约后25％、约后20％、约后15％、约后10％、约后5％或约后1％。
一旦细胞被分选并因此从转基因细胞的初始群体中分离为目的蛋白的更高产者或“非更低产者”，这些分离的细胞然后可以被放置在后续的细胞培养环境中。后续的细胞培养环境可以包含也可以不包含nnAA。在一个实施例中，后续的细胞培养环境不包含nnAA，使得产生目的蛋白，但不作为融合构建体的一部分。在另一个实施例中，后续的细胞培养环境最初不包含nnAA，但是在一段时间或传代细胞后，将一种或多种nnAA添加到细胞培养环境中。一旦添加了nnAA，就允许细胞生成融合蛋白，并且可以重新评估该随后的转基因细胞群体的生产水平。在细胞培养基中包括nnAA并随后确定蛋白水平，该重复可用于进一步分离目的蛋白的更高产者。
一旦将细胞放置在允许蛋白合成且没有任何nnAA的细胞培养环境中，细胞然后可以产生融合蛋白的第一结构域。因此，例如，然后可以将未锚定的蛋白分泌到细胞培养基中，并且随后使用传统的蛋白分离技术进行分离。同样，可以在转基因细胞中生成正确折叠的未标记的蛋白。
本文中的实例意在是说明性的，并不意图限制本发明的范围。
实例
实例1-复合膜蛋白表达
产生了编码马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)的吡咯赖氨酰tRNA合成酶(pylRS)和tRNApyl的质粒，以有助于在琥珀终止密码子处掺入非天然赖氨酸衍生物。该tRNA合成酶和tRNA对在多种宿主细胞中是正交的，并且无需修饰即可容纳多种赖氨酸类似物。来自pMOAV2的带有FLAG标签的pylRS和tRNApyl首先通过Gateway BP克隆酶反应转移到pDONR221，并且最后转移到pEF-DEST51-Puro，生成pEF-DEST51-Puro-MOAV2。在此载体内，巨细胞病毒(CMV)启动子控制经修饰的pylRS基因的转录，并且U6 snRNA启动子控制tRNApyl基因的18个拷贝的转录。
编码复合膜蛋白的质粒在慢病毒载体(pCDH1-CMV-MCS-Puro，系统生物科学公司(System Biosciences)，帕洛阿尔托(Palo Alto)，加利福尼亚州)中作为被琥珀终止密码子(TAG)或赖氨酸密码子(AAG)隔开的增强绿色荧光蛋白(eGFP)的融合蛋白产生，已对所述慢病毒载体进行了修饰，以用SV40-杀稻瘟素抗性盒替代EF1-嘌呤霉素抗性盒。含有赖氨酸的变体在细胞系中充当‘通读’对照蛋白。对表达载体进行进一步修饰，以有助于通过蛋白印迹检测不带标签和带标签的蛋白：(1)在琥珀终止密码子/赖氨酸密码子融合蛋白连接之前，对膜蛋白序列进行修饰以包含被三丙氨酸(AAA)接头隔开的AVITAGTM序列(GLNDIFEAQKIEWHE)和Rho1D4表位(TETSQVAPA-COOH)；以及(2)在琥珀终止/赖氨酸连接后，eGFP前面是富含甘氨酸/丝氨酸的接头(G(GSG)4G)，后面是富含甘氨酸/丝氨酸的接头(G(GSG)4G)、FLAG表位(DYDDDDK)、甘氨酸/丝氨酸接头(GSG)和Rho 1D4表位。Rho 1D4抗体对蛋白质C末端的表位具有特异性；因此，未检测到内部表位(如琥珀抑制过程中的情况)。DNA测序用于确认所有构建体。
Jump-In CHOK1(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)得以维持并在F12培养基中繁殖。培养基中补充有10％FBS和1mM 5-(((烯丙基氧基)羰基)氨基)戊酸，这是一种不可水解的吡咯赖氨酸类似物，其干扰pylRS功能并促进含有pylRS和tRNApyl的细胞系健康生长。将CHOK1用pEF-DEST51-Puro-MOAV2稳定转染，并在转染后24小时开始用5μg/mL嘌呤霉素(英杰公司)进行选择。为了评估细胞系中的琥珀抑制，将由选定的混合群体组成的嘌呤霉素选择的产物用编码在CMV启动子控制下的mCherryAMB GFP报告子的pMax-mCherryOpt-GFP amb瞬时转染并在2mM N6-((2-叠氮基乙氧基)羰基)-L-赖氨酸盐酸盐(赖氨酸叠氮化物)(IRIS生物技术公司(IRIS Biotech)，马克特雷德维茨(Marktredwitz)，德国)中生长。使用该报告子构建体，转染的细胞表现出mCherry荧光，而抑制琥珀密码子的细胞表现出mCherry和GFP荧光。使用100μm喷嘴和PBS作为鞘液，通过流式细胞术和BD FACSAria III上的荧光激活细胞分选评估细胞在PE-德克萨斯红(mCherry)和FITC(GFP)通道中的荧光。将表现出mCherry和GFP荧光的细胞分选到96孔板中，所述板包含200μL生长培养基，所述生长培养基中添加了1mM诱饵和5μg/mL嘌呤霉素。在96孔板中扩增后，将12个菌落进一步扩增进入12孔板，最后扩增进入T75烧瓶，然后冷冻并保存在液氮中。细胞系被重命名为‘Jump-In CHOK1+MOAV2’。
为了评估琥珀抑制在单个Jump-In CHOK1+MOAV2克隆1-12中的特异性，将mCherryAMB GFP报告子质粒瞬时转染，并使克隆在补充了1mM诱饵或2mM赖氨酸叠氮化物的培养基中生长。在LSR Fortessa上分析了转染的细胞在PE-德克萨斯红(mCherry)和FITC(GFP)通道中的荧光。从中选择克隆7来表征可诱导系统。
通过将DNA瞬时转染到悬浮293F细胞中生成了用于表达膜蛋白的慢病毒，如下：使用293Fectin(生命技术公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德，CA)转染编码膜蛋白的1.65μg慢病毒载体质粒和8.35μg pPACKH1(系统生物科学公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州)。转染两天后收集含有慢病毒的细胞上清液，并通过超速离心浓缩50倍。用慢病毒(MOI＝2.5)和2μg/mL聚凝胺(密理博西格玛公司(Millipore Sigma)，密尔沃基(Milwaukee)，威斯康辛州)在补充了10％FBS和1mM诱饵的2mL F12中自旋转导克隆7细胞，然后在32℃下以2,500rpm离心1.5h。转导后24小时从细胞中除去聚凝胺，并在转导后两天针对杀稻瘟素(10μg/mL)抗性选择细胞。约7-10天后完成杀稻瘟素选择；在抗生素选择后存活的细胞代表选定的混合群体，其遗传基因座、拷贝数和表达表型各不相同。
对于膜蛋白细胞系的细胞分选，将表达EphA2、密封蛋白1、CXCR2或CXCR4的克隆7细胞用PBS充分洗涤，并在补充了10％FBS和2mM赖氨酸叠氮化物的F12中生长，以诱导GFP标签翻译48h，之后进行细胞分选。在细胞分选的那天，将细胞用Tryp-LE(英杰公司)分离，洗涤并重悬浮于FACS缓冲液(PBS，pH 7.4，补充有2％FBS)中，并过滤。样品在BD INFLUXTM细胞分选仪(BD生物科学公司(BD Biosciences)，圣何塞(San Jose)，加利福尼亚州)上运行，在其中收集了前10％的GFP阳性细胞并批量扩增。
对于流式细胞术(FCM)，将细胞用Tryp-LE与培养皿分离，用FACS缓冲液洗涤，并用10μg/mL Hy29-1(CXCR2)、X2-753(CXCR2)或MEDI3185(CXCR4)在100μL FACS缓冲液中在冰上染色30分钟。将细胞充分洗涤，用10μg/mL山羊抗人IgG(H+L)-Alexa Fluor647(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))在FACS缓冲液中在冰上染色30min，并且充分洗涤。同种型对照抗体R347用作阴性对照。样品在MACSQuant VYB(梅旖旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)，奥本(Auburn)，加利福尼亚州)上运行，并门控活细胞。使用FlowJo软件(树星公司(Tree Star，Inc.)，阿什兰(Ashland)，俄勒冈州)进行数据分析。
在确认了这种可诱导方法可用于控制此可转换标签系统之后，研究了通过FACS基于标签的细胞系富集，以确定其是否可以用作蛋白特异性抗体方法的替代方法。这种方法的原理来自于带标签的融合蛋白构建体中膜蛋白：eGFP的固定比例。在48h赖氨酸叠氮化物诱导后，将表达模型膜蛋白的‘AMB’版本的选定混合群体细胞系暴露于细胞分选。分离GFP阳性细胞的前10％并批量扩增。可替代地，可以通过单细胞稀释来克隆分选的细胞；但是，这种方法的目的是评估可诱导的膜蛋白富集方法，因此选择了批量扩增以简化工作流程。为了评估细胞分选富集，通过抗Rho 1D4和微管蛋白的蛋白印迹以及膜蛋白特异性FCM对表达不带标签的模型膜蛋白的选定的混合的和分选的细胞群体进行了评估。
为了评估细胞分选是否导致高表达细胞整体富集，使用抗Rho1D4抗体通过蛋白印迹评估了模型膜蛋白的总表达。发现EphA2、密封蛋白1、CXCR2和CXCR4分别比混合群体显示出约2倍、1.3倍、7.6倍和1.5倍的表达改善(图13A)。这些结果表明，生物膜内的位点可能受到限制，因为对于表达良好的模型膜蛋白EphA2、密封蛋白1和CXCR4，未观察到相同水平的CXCR2富集。然而这些结果表明，该方法对于低表达水平的复合蛋白最有用。
由于蛋白印迹可对总表达水平进行评估，而与蛋白的定位无关，因此寻求蛋白特异性FCM来评估模型膜蛋白的表面表达。由于通过蛋白印迹观察到的富集水平以及由于功能筛选和药物发现中受体表面表达的相关性，检查了CXCR2和CXCR4。为了达到这个目的，使用了抗CXCR2抗体HY29-1和X2-753，以及抗CXCR4抗体MEDI3185。HY29-1和X2-753具有独特的CXCR2表位，其在功能测定中具有可变的配体抑制作用。将HY29-1和X2-753用于分选的群体和选定的混合群体(其表达‘不带标签’的CXCR2)，对于分选的群体，相比于选定的混合群体，分别观察到2.25倍和2.53倍的表达改善(图13B)。然后，将MEDI3185用于表达CXCR4的细胞的FCM分析，其中MEDI3185是有效的抗CXCR4拮抗抗体。将MEDI3185用于分选的群体和选定的混合群体(其表达‘不带标签’的CXCR4)，观察到表面表达的约10％改善(图13)。
分别通过蛋白印迹和FCM分析确定的CXCR2和CXCR4总表达和表面表达富集的差异突出了这些富集的细胞器位置的差异。例如，预期总表达的富集将占据分泌途径的所有生物膜，包括内质网、高尔基体和质膜。对于CXCR2，总表达的7.6倍富集导致表面表达的约2.4富集。尽管在一些应用中，例如纯化膜蛋白用于生物物理和结构表征，总表达富集可以是足够的；然而，对于其他应用，例如基于细胞的药物发现和功能测定，表面表达富集是期望的。可以通过多轮批量分选、单细胞分选或使用专门检测表面表达的融合策略来实现期望的表达表型。
通过以下来生成克隆7对照细胞和诱导后0、24或48h的含CMP细胞的全细胞裂解物：在含1％十二烷基硫酸钠(SDS)和1x完全蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche))的200μL PBS中裂解1E7细胞，然后重悬浮于1x样品缓冲液(生命技术公司)中，并在55℃加热10分钟。然后通过4％-12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，并转移到硝酸纤维素膜(赛默科技公司(Thermo Scientific)，Kirya Shmona，以色列)上。用STARTINGBLOCKTM(PBS)封闭缓冲液(赛默科技公司，罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州)封闭印迹1h，并用针对以下的一抗在4℃探测过夜：Rho 1D4(1∶1000，ab5417，艾博抗公司(Abcam)，剑桥(Cambridge)，马萨诸塞州)、
Figure BDA0002962939660000231
M2-HRP缀合的(1∶5000，A8592，西格玛公司(Sigma)，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州)、GFP(1∶5000，ab6556，艾博抗公司)或微管蛋白(1∶5000，ab6160，艾博抗公司)。充分洗涤印迹，并在室温下与适当的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗孵育1h。使用LumiGLO化学发光底物A+B(色瑞保健公司(SeraCare)，米尔福德(Milford)，马萨诸塞州)检测信号并记录在胶片上。通过使用ImageJ软件比较条带强度，获得了表达改善的定性估计。将原始数据针对微管蛋白上样对照进行标准化。将蛋白印迹图像针对亮度和对比度进行统一修改。
使用EVOSTM FL自动成像系统(生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)以10倍或20倍光学物镜对对照细胞和诱导后0、24或48小时的AMB膜蛋白表达细胞系的荧光成像进行数字捕获。将多个实验的代表性图像针对亮度和对比度进行统一调整。
为了研究可诱导方法的实用性，生成了能够均一、高效琥珀抑制的克隆细胞系。转染Jump-In CHOK1细胞以稳定表达来自马氏甲烷八叠球菌的吡咯赖氨酰tRNA合成酶(pylRS)和tRNA(CUA pyl)基因。由于以下原因，选择Jump-In CHOKl细胞系作为模型系统：1)易于生成用于药物发现的高表达细胞池，以及2)报告显示CHO衍生的细胞系支持有效的琥珀抑制。通过瞬时转染编码mCherryAMBGFP的报告子质粒来评估选定的细胞的琥珀抑制潜能，所述报告子质粒包含中断融合蛋白的琥珀密码子。因此，所述构建体使得实现mCherry-GFP融合物的组成型表达。可以通过表达融合蛋白(mCherry+/GFP+)的细胞的百分比来衡量细胞群体中琥珀抑制的效率。使用该报告子，在异质群体中很少有有效的琥珀抑制，其中只有约2％的细胞显示出应答于培养基的有效琥珀抑制(图9A)，所述培养基补充了非天然氨基酸N6-((2-叠氮基乙氧基)羰基)-L-赖氨酸(赖氨酸叠氮化物)。通过单细胞分选分离表现出期望表型的细胞(前2％mCherry并且GFP阳性)并且扩增。选择所述分离的克隆之一(克隆7)进行进一步表征，因为该克隆在补充了赖氨酸叠氮化物的培养基中表现出高琥珀抑制活性(43％)，并且在没有赖氨酸叠氮化物的情况下表现出低背景抑制(2.5％)(图9B)。
为了评估此方法是否可以应用于跨膜蛋白的表达，用编码模型膜蛋白的慢病毒转导了上述克隆7，所述模型膜蛋白在跨膜结构域复杂性、N末端和C末端方向、生理功能和表达水平方面不同(表1)，如下。
表1-测试的模型膜蛋白的多样性
Figure BDA0002962939660000241
Figure BDA0002962939660000251
肝配蛋白A型受体2(EphA2)、密封蛋白1、C-X-C趋化因子受体2(CXCR2)和C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)被表达为琥珀抑制依赖性和通读融合蛋白(带有增强的绿色荧光蛋白(eGFP))，其携带FLAG和Rho 1D4表位(图10)。天然膜蛋白序列在琥珀终止密码子之前被进一步修饰以包含Rho 1D4表位，以进行表达的比较分析。为了评估针对这种‘可转换’表达的可诱导概念，在nnAA诱导后，通过蛋白印迹(图11)和荧光显微镜检查(图13A)分析了表达模型膜蛋白的细胞。对于所有测试的蛋白均严格控制琥珀抑制。仅当细胞培养基中补充了赖氨酸叠氮化物时，才能检测到带标签的蛋白。此外，EphA2和密封蛋白1在该系统中表达良好，但是CXCR2和CXCR4表达不佳，表明表达可能不是对于所有蛋白质的关键障碍。带标签的EphA2、CXCR2和CXCR4在细胞膜中展示了分布良好的定位，但是带标签的密封蛋白1显示了特异性定位至细胞间接触，这与其在紧密连接形成中的作用一致(图13B)。在所有测试的模型蛋白中，表达带标签的膜蛋白变体的细胞显示出与相应的通读变体相似的细胞分布。
确认此方法可用于控制模型膜蛋白的‘可转换’表达后，我们随后研究了通过FACS基于标签的细胞系富集是否可以用作蛋白特异性抗体方法的替代方法。诱导48小时后，对表达模型膜蛋白的GFP阳性细胞的前10％进行了分选和扩增。通过蛋白印迹和细胞表面FCM评估表达改善水平的‘不带标签’的膜蛋白的细胞群体的富集。如图12A所示，如通过蛋白印迹所确定的，分选的EphA2、密封蛋白1、CXCR2和CXCR4细胞系表现出比分选前的群体在总表达方面约200％-800％改善。但是，总表达的这种改善并不一定反映细胞表面表达的同时增加。为了确定表面表达水平的特定改善，使用对每种模型膜蛋白特异的参考抗体标记细胞，并通过FCM定量荧光水平。有趣的是，表达受限的G蛋白偶联受体CXCR2在表面染色方面比分选前的群体显示了约2.5倍增加。相反，分选的EphA2、密封蛋白1和CXCR4细胞的表面表达仅得到了少量改善，为10％-20％(图12B-E)，这表明这些蛋白在这些细胞中已经达到或接近其最大表面表达水平。最后，富集的细胞系中受体的结构完整性通过结合其天然配体的能力来测试。由于GPCR折叠的复杂性[40]，我们将这些努力集中在CXCR2和CXCR4上。将携带生物素化白介素8(IL-8)或基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)配体的链霉亲和素复合物分别暴露于表达‘不带标签’CXCR2或CXCR4的亲本细胞系和分选的细胞系，并通过FCM评估配体结合。尽管在亲本细胞中CXCR2和CXCR4的内源表达水平较低，但高表达CXCR2和CXCR4的细胞系表现出特异性染色，这表明受体正确折叠(图12F和G)。总的来说，这些结果验证了该方法作为平台的有效性，并表明这对于富集和选择表达具有低起始表达水平的膜蛋白的细胞系可能特别有益。
实例2-抗体表达
编码针对EphA2的IgG的重链(HC)和轻链(LC)的基因放置在载体pCLD中的UCOE元件附近的CMV启动子的控制下(IgG对照)。通过表达与DAF-7的糖基磷脂酰肌醇膜锚定序列融合的HC制得膜缔合IgG(IgG-DAF-无琥珀)。在HC-DAF-7连接处的框架内编码琥珀密码子以生成(IgG-DAF-琥珀)。
pMOAV2载体基于包含CMV-pylRS表达盒和在U6 snRNA启动子控制下的tRNApyl基因的18个串联重复的pSELECT-Jump-In(赛默公司(Thermo))载体。pCLD-puro-pylRS-tRNA载体基于pCLD载体，所述pCLD载体包含嘌呤霉素抗性标记、CMV-pylRS表达盒和在U6 snRNA启动子控制下的tRNApyl基因的18个串联重复。pRFP-GFPamb载体是编码RFP-GFP融合物的报告子构建体，其在RFP和GFP荧光团之间含有琥珀密码子。
产生能够掺入nnAA的宿主细胞的方法是已知的并且已经被描述。简而言之，将CHO细胞用pMOAV2或pCLD-puro-pylRS-tRNA转染，并进行选择步骤以在含有潮霉素或嘌呤霉素(6.5μg/ml)的培养基中生长。将存活者用pRFP-GFPamb转染，并在2mM nnAA存在下生长16-24小时。选择显示最佳RFP：GFP比率的分离物(C13-43)用于进一步分析。
可替代地，为了生成I-21宿主，对GFP-RFP+细胞池进行了分选。进一步评估候选宿主将nnAA掺入靶IgG的能力并测量滴度。鉴定了最佳候选物C13-43和I-21。
为了测试琥珀抑制诱导的mAb表面展示，将表达1C1-DAF的1x107个转染的细胞在300g离心5分钟，重悬浮于10ml含赖氨酸叠氮化物的新鲜培养基中，并在37℃在120rpm振荡下孵育2或4小时。赖氨酸叠氮化物处理后，将1x106个细胞在300g离心5分钟，用FACS缓冲液(1％PBS中的2％胎牛血清)洗涤，并用FITC缀合的γ链抗体和APC缀合的κ轻链抗体(生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)在室温下染色15min。将表面染色的细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并且重悬浮在FACS缓冲液中，以在LSRII(BD生物科学公司，圣何塞，加利福尼亚州)中进行流式细胞术分析。测试了不同浓度的赖氨酸叠氮化物以确定最佳浓度。使用FlowJo软件(树星公司(Tree Star，Inc.)，阿什兰(Ashland)，俄勒冈州)进行数据分析。
将细胞以3x105个细胞/ml接种在125ml摇瓶中的30ml内部培养基中，并在37℃、6％CO2和120rpm下在定轨摇床培养箱中生长。使用ViCell自动细胞计数器(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，布雷亚(Brea)，加利福尼亚州)测量活细胞密度和活率后，每周两次传代细胞。
基于mAb表面展示的批量和单细胞分选使用BD Influx细胞分选仪(BD生物科学公司)进行。简而言之，将细胞用赖氨酸叠氮化物处理2或4小时，然后通过离心分别收获20x106个和1x106个细胞用于批量和单细胞分选。将细胞洗涤，并使用FITC缀合的γ链抗体进行染色，使用含有PBS、0.5％重组人血清白蛋白(西格玛公司，圣路易斯，密苏里州)，5mMEDTA(生命技术公司)和25mM HEPES(卡尔生物化学公司(Calbiochem)，圣地亚哥，加利福尼亚州)的分选缓冲液。对于批量分选，将染色的细胞洗涤两次，重悬浮于分选缓冲液中至浓度为1x107个细胞/ml，并且将2.5x105个表面染色的门控(基于高或低FITC荧光强度)的细胞沉积于含有培养基的5ml收集管中。将分选的细胞离心，重悬浮于2.5ml新鲜培养基中，并铺在6孔板中。对于单细胞分选，将染色的细胞洗涤，重悬浮于分选缓冲液中至浓度为1x106个细胞/ml，并且在含有条件培养基的384孔板中每孔中沉积一个细胞。
将分选的批量和单细胞扩增、繁殖、并且最后接种在分批补料培养基中以产生抗体。培养物接受12-14天的常规补料，之后使用Octet QK384(颇尔福特生物公司(PallForteBio)，弗里蒙特(Fremont)，加利福尼亚州)中的蛋白A生物传感器确定细胞培养物上清液中的抗体滴度。
为了确定是否可以在细胞表面上有效展示和可视化可转换的IgG膜锚，将琥珀抑制宿主细胞I-21用IgG表达质粒瞬时转染，并生成了稳定池。在这些细胞中表达了三种不同的构建体，它们编码对照IgG、含有HC-糖基磷脂酰肌醇膜锚(GPI-锚)的IgG或含有HC-GPI锚的IgG(其在GPI盒之前并且在GPI盒框内还含有琥珀终止密码子)。为了评估是否可以观察到离散的膜染色，将瞬时转染的I-21细胞用赖氨酸叠氮化物处理12小时，对膜结合的LC和HC进行免疫染色，并通过流式细胞术进行分析。用IgG-DAF-琥珀转染目的细胞，而用IgG-对照和IgG-DAF-无琥珀转染的细胞分别用作阴性和阳性对照。流式细胞分析显示，对于阴性对照细胞(IgG对照)，无表面展示；对于阳性对照细胞(IgG-DAF-无琥珀)，在存在和不存在赖氨酸叠氮化物情况下都有大于50％LC+HC+群体；并且对于IgG-DAF-琥珀，在存在赖氨酸叠氮化物情况下有42％双阳性细胞。重要的是，在不存在nnAA情况下，此构建体的表面染色与IgG对照样品相似，这表明IgG在细胞表面上没有明显的积累。这些结果显示了IgG-GPI在细胞表面的清晰可辨的积累(图3)。
为了确定该展示是否适用于稳定池，在已用IgG-DAF-琥珀构建体转染的I-21和C13-43平台细胞的稳定池中分析了表面结合。赖氨酸叠氮化物处理12小时并进行免疫染色后，在I-21和C13-43稳定池中均观察到明显的IgG表面展示，这从LC+HC+双阳性群体的存在是明显的。在稳定的细胞中观察到了IgG-DAF融合物的清晰展示。检查了各种浓度的nnAA和处理时间，以确定时间和nnAA浓度对于在最短时间内在细胞膜不饱和情况下琥珀抑制的最佳效率的影响。为了确定用于IgG-DAF-琥珀构建体的最佳表面展示条件，从被2mM nnAA、0.5mM nnAA活化24小时或被0.1mM nnAA活化12h的细胞群体中收集从高表面展示门控分选的细胞。我们的结果表明，在0.1mM nnAA下活化12h的细胞中，滴度与MFI的相关性得到了改善，这表明需要系统的优化活化以有效地区分通过该方法的低产者和高产者(图4)。此外，可能对于每个靶优化这些条件是必要的以匹配其相对表达水平。对该靶的进一步优化确定了2-4小时的5-25μM赖氨酸叠氮化物处理足以诱导可检测的mAb细胞表面结合。
为了评估膜结合的IgG的表达是否与分泌的IgG滴度相关，将表达IgG-DAF的I-21和C13-43稳定池用赖氨酸叠氮化物处理，并基于通过流式细胞术检测到的膜结合的IgG的高和低表达水平分选为两个群体。将分选的细胞传代培养，并在摇瓶中分批补料培养11天后测量其生产率。与选择为低水平表面展示的细胞或未选择的群体相比，选择为高水平表面展示的细胞显示出改善的表达水平。I-21池的高和低表面展示滴度分别为2.4和1.2g/L(图5)，并且C13-43池的高和低表面展示滴度分别为3.4和1.5g/L(图6)，表明琥珀抑制依赖性表面展示与培养基中分泌的IgG成比例。而且，与未富集的细胞相比，FACS富集导致生产率提高了2倍。
为了进一步研究生产率和表面展示之间的相关性，基于高、中和低表面展示对C13-43池进行了分选，并扩增分选后的细胞用于分批补料培养以及表面结合分析。当滴度值针对膜结合的IgG的荧光强度作图时，观察到显著的相关性，相关系数为0.9005(图6)，表明nnAA诱导的表面展示可以用作细胞生产率的代表。
赖氨酸叠氮化物处理C13-43-IgG-DAF稳定池并进行表面染色后，将单细胞基于膜结合的IgG-HC的低(靠后的5％)、中(中间的5％)和高(靠前的3％)荧光强度分别沉积在384孔板的每个孔中。克隆未处理的细胞，不染色。在分批补料培养中筛选了总共283个克隆(靠前的77个，中间50个，靠后的84和未处理的72个)，并分析了生产率。与靠后的表面展示克隆相比，从靠前的表面展示门控区域获得的克隆具有显著更高的生产率。此外，靠前的克隆的平均生产率高于未富集的克隆。
为了确定克隆细胞的分泌的抗体和膜结合的抗体之间的相关性，从具有不同滴度水平的高、中和低表面展示组中各自选择33个克隆进行进一步分析(图7)。用赖氨酸叠氮化物处理各个克隆细胞，对轻链和重链的表面结合染色并通过流式细胞术分析。当针对膜结合的重链抗体的中值荧光强度(MFI)作图时，所述克隆的滴度显示出正相关(R2＝0.7611)，从而增强了该方法的效率，并表明该策略为生物生产过程中高通量筛选高产细胞提供了有效工具。
实例3-难以表达的蛋白的表达
复合重组分子正在成为下一代治疗剂。这些高度工程化的蛋白包括双特异性抗体(例如BiTES、DARTS和IgG-scFv)和融合蛋白，它们代表了具有增强的疾病治疗功能的重要新药。但是，由于低表达滴度和低单位生产率，这些分子通常被标记为“难以表达”。为了解决瓶颈，我们研究了使用表面展示法来分离难以表达的靶的高产细胞。为此，用编码带有可逆GPI膜锚的专有双特异性抗体(MEDI-X)的质粒稳定转染C13-34细胞。选择MEDI-X(一种IgG-scFv融合蛋白)，部分原因是最近进行了广泛的常规筛选，导致分离了能够实现1g/L产率的细胞系。使转染的细胞经受表面展示和来自高和低表面染色门控的选择，以确定该方法是否可以改善先前观察到的产率。表面展示条件的优化确定了1mM赖氨酸叠氮化物和4小时的活化足以证明这种低表达分子的表面展示。该条件用于克隆的分选和选择。并行生成在无表面展示情况下分选的对照群体(未富集的)。扩增回收的克隆，并通过分批补料培养在96深孔板中确定其生产率(图8A)。来自未富集的群体的靠前克隆的滴度达到约800mg/L，与先前的努力一致。但是，在表面展示情况下，我们不仅看到靠前的表达子的滴度显著改善(高达1.8g/L)，而且另外十八个克隆具有超过800mg/L的滴度，包括五个克隆具有超过1g/L的产率(图8B)。这些数据说明该方法在富集和选择高表达克隆中的实用性(图8)。

Claims (26)

1.一种筛选转基因细胞群体中产生目的蛋白的细胞的方法，所述方法包括：
a)在允许蛋白合成的培养条件下培养所述转基因细胞，其中所述细胞培养条件包含在细胞培养基中的至少一种非天然氨基酸(nnAA)，并且
b)确定所述转基因细胞中的哪些细胞产生所述目的蛋白，
其中所述转基因细胞包含(i)编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含至少一种nnAA、第一结构域和第二结构域，所述第一结构域编码目的蛋白，所述第二结构域编码的结构域有助于当所述转基因细胞表达所述第二结构域时检测产生所述目的蛋白的所述转基因细胞，和(ii)至少一种正交tRNA和接受至少一种nnAA并识别所述至少一种正交tRNA的至少一种正交tRNA合成酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中编码所述至少一种nnAA的多核苷酸是琥珀终止密码子，所述琥珀终止密码子在所述nnAA存在下支持翻译终止的抑制。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种nnAA是吡咯赖氨酸，所述正交tRNA是吡咯赖氨酰-tRNA(tRNA-Pyl)，并且所述正交tRNA合成酶是吡咯基-tRNA合成酶(PyrlRS)。
4.如权利要求1-3所述的方法，其中所述融合蛋白的所述第二结构域包含跨膜蛋白结构域、细胞膜锚结构域或标签。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述转基因细胞是哺乳动物细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述转基因细胞是CHO细胞、HEK293细胞、PERC6细胞、COS-1细胞、HeLa细胞、VERO细胞或小鼠杂交瘤细胞。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述转基因细胞是原核细胞。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白在所述第一和第二结构域之间包含接头肽序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第二结构域是跨膜蛋白结构域。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第二结构域是细胞膜锚结构域，所述细胞膜锚结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号肽，所述信号肽促进所述目的蛋白锚定到细胞膜中存在的GPI部分。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述GPI信号肽是来自衰变加速因子7蛋白(DAF-7)的GPI信号肽。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白的所述第一结构域是抗体或抗体片段。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中确定所述目的蛋白是否在所述转基因细胞中或上产生包括确定在所述转基因细胞表面上展示的目的蛋白的水平，以确定所述转基因细胞中的哪些细胞与所述转基因细胞群体中的其他转基因细胞相比产生更高水平的所述目的蛋白。
14.如权利要求13所述的方法，其中将产生更高量的所述目的蛋白的转基因细胞与产生更低量的所述目的蛋白的转基因细胞分离。
15.如权利要求14中任一项所述的方法，其中分离所述转基因细胞包括使用荧光激活细胞分选(FACS)。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中分离的更高产转基因细胞随后在允许蛋白合成的细胞培养条件下培养。
17.如权利要求16所述的方法，其中在细胞培养环境中在不存在所述至少一种nnAA情况下培养所述更高产转基因细胞，其中在不存在所述至少一种nnAA情况下培养所述转基因细胞导致产生不具有所述融合蛋白的所述第二结构域的所述目的蛋白。
18.如权利要求17所述的方法，所述方法进一步包括从所述细胞培养环境分离所述目的蛋白。
19.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第二结构域是蛋白标签。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述标签是亲和标签、表位标签或荧光标签。
21.如权利要求1-8、19或20中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白的所述第一结构域是复合膜蛋白(CMP)。
22.如权利要求21所述的方法，其中确定所述目的蛋白是否在所述转基因细胞中或上产生包括检测从荧光蛋白发射的荧光信号以确定哪些转基因细胞正在产生所述目的蛋白。
23.如权利要求22所述的方法，其中将产生所述目的蛋白的转基因细胞与不产生所述目的蛋白的转基因细胞分离。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中分离不产生所述目的蛋白的转基因细胞包括荧光激活细胞分选(FACS)。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中分离的产生所述目的蛋白的转基因细胞随后在允许蛋白合成的细胞培养条件下培养。
26.如权利要求25所述的方法，其中在细胞培养环境中在不存在所述至少一种nnAA情况下培养产生所述目的蛋白的所述转基因细胞，其中在不存在所述至少一种nnAA情况下培养所述转基因细胞导致产生不具有所述融合蛋白的所述第二结构域的所述目的蛋白。
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