JP4528623B2 - 迅速分解性レポーター融合タンパク質 - Google Patents
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Description
定義
本明細書で使用する、用語「核酸分子」、「遺伝子」又は「核酸配列」は、ポリペプチド又はタンパク質前駆体の生成に必要なコード配列を含む、核酸、DNA又はRNAを指す。ポリペプチドは、所望のタンパク質活性が保持される限り、完全長コード配列によって、或いは当該コード配列の一部によってコードされるものでよい。
があるが、これらだけには限られない(Wada他、1990)。したがって、一実施形態では、本発明の合成核酸分子は、多数の好ましいヒトコドン、例えばCGC、CTG、TCT、AGC、ACC、CCA、CCT、GCC、GGC、GTG、ATC、ATT、AAG、AAC、CAG、CAC、GAG、GAC、TAC、TGC、TTC、又はこれらの任意の組合せを有することによって、野生型核酸配列と異なるコドン組成を有する。例えば、本発明の核酸分子は、野生型核酸配列と比較して、多数のCTG又はTTGロイシン−コードコドン、GTG又はGTCバリン−コードコドン、GGC又はGGTグリシン−コードコドン、ATC又はATTイソロイシン−コードコドン、CCA又はCCTプロリン−コードコドン、CGC又はCGTアルギニン−コードコドン、AGC又はTCTセリン−コードコドン、ACC又はACTスレオニン−コードコドン、GCC又はGCTアラニン−コードコドン、又はこれらの任意の組合せを有することができる。同様に、植物中でより頻繁に使用される多数のコドンを有する核酸分子は、これらだけに限られないが、
又はこれらの任意の組合せを含む、多数の植物コドンを有することによって、野生型又は親核酸配列と異なるコドン組成を有する(Murray他、1989)。好ましいコドンは、異なる型の植物では異なる可能性がある(Wada他、1990)。
細菌細胞及びプラスミド
大腸菌JM109細胞を使用して、プラスミドを増殖させた。細菌培養物を37℃においてLBブロス中で通常通り増殖させ、必要なときは100μg/mlのアンピシリン又は30μg/mlのカナマイシンを加えた。プラスミドDNAの抽出及び精製は、Plasmid Maxiキット(Qiagen)を使用して行った。
制限酵素AgeI、ApaI、BamHI、BglII、BstEII、Bst98I、EcoRI、EcoRV、NcoI、NotI、ScaI、XbaI及びXmnI、並びにT4 DNAポリメラーゼ及びS1ヌクレアーゼを、Promegaから得た。Rapid DNA Ligation Kit及びExpand(商標)High Fidelity PCR Systemは、Boehringer Mannheimにより供給された。
ポリメラーゼ連鎖反応のために使用したオリゴヌクレオチド並びにクローニング及び塩基配列決定のために使用したオリゴヌクレオチドを表1に列挙する。すべてのオリゴヌクレオチドは、Promegaで合成した。
プラスミドDNAの配列を、Luc5’又はLuc3’プライマー(表1)を使用して、ABI Prizmモデル377でDNAの塩基配列を決定することによって確認した。
TNT(登録商標)SP6結合小麦麦芽抽出物系とTNT(登録商標)T7結合網状赤血球溶解物系(Promega)の両方を使用して、ホタルルシフェラーゼ及びその融合タンパク質をin vitroで発現させた。[3H]−ロイシンを反応混合物に含ませた。終了時に、反応混合物を2部割した。第1の部分を使用して、「ルシフェラーゼアッセイの条件」という表題の項に記載されているようにルシフェラーゼ活性を測定し、第2の部分を使用して、合成されたルシフェラーゼの量を測定した。第2の部分中に含まれていたタンパク質を、4〜20%Tris−グリシンゲル(Novex)を使用するSDSゲル電気泳動によって分離した。電気泳動が終了した後、ゲル上の目的タンパク質の位置を、オートラジオグラフィーによって測定した。次いで、目的タンパク質を含むバンドをゲルから切り出し、取り込まれた放射活性の量を液体シンチレーションによって測定した。発光データと放射活性の量の比を使用して、比活性(specific activity)を特徴付けした。
ヒト腺癌細胞系HeLa、アフリカミドリザル腎臓細胞系COS−7、チャイニーズハムスター卵巣細胞系CHO−K1、及びヒト胚腎臓293細胞を、ATCCから得た。すべての細胞系が、5%ウシ胎児血清及び抗生物質混合物(ペニシリン、100μg/ml;ストレプトマイシン、100μg/ml;アンホテリシンB、0.25μg/ml)を含むRPMI−1640培地で維持された。
トランスフェクション用に、T25フラスコ中で細胞を集密状態まで増殖させた(Falkon、Becton Dickinson、Oxford)。トランスフェクションは、8μgのプラスミドDNA及び20μlのLipofectamine(商標)2000(GIBCO BRL)と混合した1mlの無血清RPMI−1640中で行った。CHO細胞はトランスフェクション培地中で30分間インキュベートし、HeLa細胞は1時間、COS−7細胞は5時間インキュベートした。インキュベーションの後、トリプシン−EDTA(GIBCO BRL)を用いて細胞をトリプシン処理し、遠心分離によって回収した。それぞれのT25フラスコから回収した細胞を、5%ウシ胎児血清及び抗生物質混合物を含む10mlのRPMI−1640培地に再懸濁させ、96ウェルプレート(100μl/ウェル)に移し、異なる物質で処理する前に12〜16時間増殖させた。シクロヘキシミド(Sigma)又はドキシサイクリンを、異なるウェルに異なる回数加えた(最終濃度は、それぞれ100μg/mlと2μg/mlであった)。熱誘導用に、細胞を1時間42℃に移し、次いで37℃で異なる時間インキュベートした。インキュベーションの後、ホタルルシフェラーゼの誘導体を発現する細胞を含むプレートを、70℃に移した。Renillaルシフェラーゼを発現する細胞の場合、培養培地を、Renillaルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)からの溶解バッファーと交換した。
ホタルルシフェラーゼの活性を測定するために、凍結/解凍によって細胞を溶解させた。それぞれのウェル(100μl)からの溶解物を、100μlのBright−Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を含む不透明な96ウェルプレート(Falkon、Becton Dickinson、Oxford)の対応するウェルに移し、MLXマイクロタイタープレート照度計(Dynex)を使用して、発光強度を測定した。Renillaルシフェラーゼの活性を、Renillaルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)からの100μlのアッセイ試薬と、40μlのサンプルを混合させることによって測定した。
CMV最少プロモーター、及びヘプタマー化した上流のtet−オペレーター(Gossen他、1992)を含むDNA断片を、プライマー:
を用いたPCRによって、プラスミドpUHD10−3から増幅させた。増幅させた断片を使用して、CMVプロモーターをRenillaルシフェラーゼコードプラスミドに置換した。RenillaルシフェラーゼコードプラスミドとプラスミドpUHD15−1を4.5:1の割合で含む混合物を用いて、HeLa細胞をトランスフェクトした。プラスミドpUHD15−1は、テトラサイクリン抑制因子と、テトラサイクリンオペレーター配列に融合させた最少プロモーターを刺激するHSV由来のVP16のC末端ドメインとを含むハイブリッドトランスアクチベーターをコードする。ドキシサイクリンの存在下では、ハイブリッドトランスアクチベーターの活性は阻害される。
D293細胞は、誘導時に多量のcAMPを生成する293細胞の単離された亜群である。pGL−3プラスミドは、転写の増大によってcAMP誘導に応答する多数のCREを含む。D293細胞をトリプシン処理し、7.5×103個の細胞を96ウェルプレートのウェルに加えた。一晩のインキュベーションの後、トランスフェクト細胞の培地を除去し、イソプロテレノール(Iso、Calbiochem#420355、最終濃度1μM)、及びRO(Ro−20−1724、Calbiochem#557502、最終濃度100μM)を含む培地と交換した。IsoはcAMP経路を誘導し、ROはcAMPの分解を防ぐ。プレートはインキュベーターに戻した。Iso/RO後の時点t=0、3、6、9及び12時間からの、サンプルを回収した。Iso/ROの添加後6時間又は24時間で、プロスタグランジンE1(PGE1、Calbiochem#538903、最終濃度1.0μM)を細胞に加えた。次いで、Iso/ROの添加(即ち、実験開始)後24、27、30、33、及び36時間の時点で、サンプルを回収した。
D293細胞をプラスミドでトランスフェクトし、次いで600μg/mlのG418を含む培地中で増殖させた。安定的にトランスフェクトした細胞の個々の系は、G418含有培地で増殖させた群由来の個々の細胞を、96ウェルプレートのウェルに接種し、G418含有培地中に接種した細胞を増殖させることによって生成させた。
ユビキチン−ホタルルシフェラーゼ融合体の構築及び脱ユビキチン化の分析
そのN末端に望ましいアミノ酸残基を有すると思われる、ルシフェラーゼ種を作製するために、Varshavsky及び共著者によって初期に記載された手法を使用した(Bachmair他、1986)。この手法は、細胞中においてユビキチンを特異的にプロセシングするプロテアーゼが、N末端にユビキチンを含む融合タンパク質を切断する能力を使用する。このような切断は、ユビキチンの最後のアミノ酸残基の直後で起こる。Bachmair他(1986)によれば、このような脱ユビキチン化は、切断部位の直後に位置する残基の同一性とは無関係に起こる。
Sung他(1995)は、ホタルルシフェラーゼN末端領域の修飾によって、酵素活性を妨害する可能性があることを報告した。したがって、脱ユビキチン化プロセスの結果として生じたルシフェラーゼ種は、野生型ルシフェラーゼのそれとは異なる酵素活性を有する可能性がある。ルシフェラーゼ融合タンパク質の比活性(specific activity)を評価し、それらを野生型ルシフェラーゼの比活性と比較するために、プラスミドpT7Ubiq(Y)Luc19.2及びpT7Ubiq(E)Luc19.1を、真核生物のプロモーターに加え、それらがバクテリオファージT7のプロモーターを有するように構築した。結果として、これらのプラスミドは、in vitro転写/翻訳系でルシフェラーゼ融合タンパク質の合成を指示する。プラスミドpT7Ubiq(Y)Luc19.2は、プラスミドpUbiq(Y)Luc19によってコードされるタンパク質と、まったく同じタンパク質をコードする。プラスミドpT7Ubiq(E)Luc19.1は、プラスミドpT7Ubiq(Y)Luc19.2によってコードされるタンパク質とただ1つの位置が異なる、ユビキチン−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質をコードする。ユビキチンの最後のアミノ酸残基の直後に位置するこの位置において、プラスミドpT7Ubiq(E)Luc19.1によってコードされるタンパク質は、チロシン残基の代わりにグルタミン酸残基を有する。さらに、バクテリオファージT7のプロモーターを有し、野生型ホタルルシフェラーゼ、又はホタルルシフェラーゼ及び突然変異形のC−ODCを含む融合タンパク質をコードする、プラスミドpETwtLuc1及びpT7Luc−PEST10をそれぞれ構築した。
プラスミドpUbiq(Y)Luc19によってコードされるタンパク質の半減期を、哺乳動物細胞において測定し、野生型ルシフェラーゼ、並びにホタルルシフェラーゼ及び突然変異形のC−ODC(Luc−PEST10)を含む融合タンパク質の半減期と比較した。それぞれプラスミドpUbiq(Y)Luc19又はpwtLuc1又はpLuc−PEST10を用いて一過的にトランスフェクトした細胞によって発せられた発光を評価することによって、この比較を行い、次いで異なる時間、これらをタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドに曝した。この実験では、シクロヘキシミドを暴露の7.5分以内にタンパク質合成の完全な阻害を引き起こした濃度(100μg/ml)で使用した。図3に示す結果は、COS−7細胞中では、Ubiq(Y)Luc融合タンパク質は、野生型ルシフェラーゼ及びLuc−PEST融合タンパク質の半減期と比較して、中程度の半減期を有することを実証する。これらの細胞中でのUbiq(Y)Lucの推定半減期は、約170〜200分であり、この半減期は、大腸菌及びS.cerevisiaeにおいてN末端にチロシン残基を含むβ−ガラクトシダーゼに関して、Varshavsky(1992)によって報告された半減期(それぞれ2分と10分)よりはるかに長い。同時に、COS−7細胞中での野生型ルシフェラーゼの半減期(約7時間)は、大腸菌及びS.cerevisiaeにおける野生型β−ガラクトシダーゼの半減期(それぞれ10時間及び20時間を超える)より短く、COS−7細胞中では、N−デグロン開始型の分解が、酵母菌及び細菌中ほど効率良く起こらないことが示唆された。これらの細胞中でのLuc−PESTの半減期(約120分)が、Ubiq(Y)Lucの半減期より短いという事実によって、プロテオソームのタンパク質分解能は、Ubiq(Y)Lucの半減期を測定するための制限的なパラメータではないことが示唆される。CHO細胞又はHeLa細胞を使用して同じ分析を行うと、これらの細胞中での3つすべてのタンパク質の分解が、COS−7細胞中より、わずかに速く起こることが見出された(図7参照)。
哺乳動物細胞におけるN末端法則が、酵母菌及び大腸菌における同じ法則と、どの程度異なる可能性があるかを理解するために、ユビキチン−ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質をコードする一組のプラスミド、即ちpUbiq(Y)Luc19、pT7Ubiq(Y)Luc19.2及びpT7Ubiq(E)Luc19.1を作製した(プラスミドのリストに関しては、表2を参照)。これらのプラスミドによってコードされるタンパク質には、それらの配列にただ1つの相違がある;ユビキチン配列の直後に位置するアミノ酸残基。したがって、脱ユビキチン化によって、これらのタンパク質は、第1のN末端アミノ酸残基のみが異なるホタルルシフェラーゼ種を生じるはずである。プラスミド自体には、融合タンパク質コード領域の上流に位置する他の領域の違いがある。これらのプラスミドのいくつかは、他のバクテリオファージT7プロモーターを有する(プラスミド名pT7Ubiq(X)Luc)。それにもかかわらず、図3に示すように(プラスミドpT7Ubiq(Y)Luc19.2及びpUbiq(Y)Luc19に関する曲線を参照)、バクテリオファージT7プロモーターの存在又は不在は、対応するタンパク質の安定性に対してまったく影響がなかった。
哺乳動物細胞内のタンパク質の運命を決定する際の、N末端残基の優勢を理解するために、N末端に同じアミノ酸残基を有するが、ホタルルシフェラーゼと結合したペプチド配列が異なる、ルシフェラーゼ融合タンパク質の安定性を比較した。図5に示すように、プラスミドpUbiq(E)ΔLuc6及びpUbiq(H)ΔLuc18によってコードされるタンパク質は、それぞれプラスミドpT7Ubiq(E)Luc19.1及びpUbiq(His2)Luc3によってコードされるタンパク質と比較すると、4個のアミノ酸の欠失がある。プラスミドpUbiqLuc15によってコードされるタンパク質では、1個のグルタミン酸残基が、pUbiq(Y)Luc19によってコードされるタンパク質中で見られる残基を置換している。
ODCの分解は事前のユビキチン化なしに26Sプロテオソームで起こる(Bercovich他、1989;Murakami他、1992)ことが報告されてきており、一方、N−デグロンによって指示される分解は、ユビキチン依存性プロセスであることが報告された。同じタンパク質中のN−デグロンとC−ODCの組合せが、2つの異なる経路によるプロテオソームでの組換えタンパク質の分解を指示し、それによってタンパク質の半減期をさらに低下させることができるかどうかを判定するために、3つのプラスミド、pUbiq(Y)Luc−PEST5、pUbiq(R)Luc−PEST12及びpT7Ubiq(E)Luc−PEST23を構築した。これらのプラスミドによってコードされるタンパク質の配列は、ユビキチン配列の最後のアミノ酸残基の直後に続く位置のみが異なる。その位置では、プラスミドpUbiq(Y)Luc−PEST5によってコードされるタンパク質はチロシンを有し、プラスミドpUbiq(R)Luc−PEST12によってコードされるタンパク質はアルギニンを有し、プラスミドpT7Ubiq(E)Luc−PEST23によってコードされるタンパク質は、グルタミン酸残基を有する。これらのプラスミドによってコードされるタンパク質の安定性は、HeLa(図7)、COS−7及びCHO細胞で試験した。この分析によって、すべての細胞系で、2つの分解シグナルを有するタンパク質は、ただ1つのシグナルを含むタンパク質よりも安定性が低かったことが明らかになった。例えば、HeLa細胞では、ユビキチン−ルシフェラーゼ融合タンパク質Ubiq(E)Luc又はLuc−PEST10は、それぞれ70分及び65分の半減期を有していた(図4及び図7)。同時に、プラスミドpUbiq(Y)Luc−PEST5、pUbiq(R)Luc−PEST12及びpT7Ubiq(E)Luc−PEST23によってコードされるタンパク質の半減期は、それぞれ55、40及び30分であった。さらに、同じタンパク質中の2つの分解シグナルの組合せによって、細胞系毎のより一貫した分解がもたらされた。例えば、3つの異なる細胞系を使用して、N−デグロンのみを含むタンパク質Ubiq(E)Lucの半減期を測定すると、その値は70〜150分で変化した(図4)。同じ細胞系を使用して、プラスミドpT7Ubiq(E)Luc−PEST23によってコードされるタンパク質の半減期を測定すると、その半減期はHeLa細胞に関しては30分であり(図7)、COS−7細胞に関しては45分であり、CHO細胞に関しては40分であった。ルシフェラーゼ及び他のタンパク質不安定化配列の組合せをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞からの、発光データを図8に示す。ルシフェラーゼ融合タンパク質中にCL−1及びPESTが存在することによって、CL−1又はPEST配列を有するルシフェラーゼ融合タンパク質と比較して、低い半減期を有するタンパク質がもたらされた。
Varshavsky及び共著者は、酵母菌及び大腸菌細胞中では、N末端残基の同一性と対応するタンパク質の半減期の間に、明確な相関関係があると決定した(N末端法則)。これらの発見によって、タンパク質のN末端に位置する残基は、細菌及び酵母菌細胞中のタンパク質の運命を決定する際に、重要な役割を果たすことが示唆された。本明細書のデータによって、異なる哺乳動物細胞では、N末端残基の同一性に応じて、ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質の半減期が420〜70分で変わる可能性があることが実証され、N末端法則が哺乳動物細胞において機能することが示唆された。それにもかかわらず、哺乳動物細胞におけるN末端法則は、酵母菌及び大腸菌に関して初期に記載されたN末端法則とは驚くほど異なっている。実際、アルギニン及びリシン残基は、酵母菌及び大腸菌において最も不安定な残基として同定された(Varshavsky、1992)。対照的に、これらの残基は、哺乳動物細胞中ではちょうど中程度に不安定であった。試験したすべての細胞系で、グルタミン酸残基は、ホタルルシフェラーゼの安定性に対して最も劇的な影響があった。一方、Varshavsky(1992)によれば、酵母菌中ではこの残基は中程度な不安定効果があり、大腸菌中ではグルタミン酸には、まったく不安定効果がなかった。
Claims (37)
- レポータータンパク質と、そのレポータータンパク質のC末端に結合する、少なくとも2つの異なる異種タンパク質不安定化配列とを含有する融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子であって、その異種タンパク質不安定化配列の1つが、CL1、CL2、CL6,CL9,CL10、CL11、CL12、CL15、CL16もしくはSL17であり、他のひとつの異種タンパク質不安定化配列がプロリン、グルタミン酸、セリン そして/又は スレオニンに富んだアミノ酸配列であるPEST配列を含み、さらにレポータータンパク質がルシフェラーゼ、蛍光タンパク、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ又はβ-ガラクトシダーゼであり、少なくとも上記2つの異種タンパク質不安定化配列が融合タンパクに存在することにより1つのタンパク質不安定化配列が融合タンパクに結合している時に比べ、タンパク分解が哺乳動物細胞において促進することを特徴とする、上記単離核酸分子。
- 単離核酸分子の核酸配列がルシフェラーゼをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を有し、そのルシフェラーゼのORFのコドンの大多数が哺乳類宿主細胞において選択的に使用されるコドンであり、単離核酸分子がORF配列領域の3’側にさらに、AU-richな配列を有している、又はステムループ構造を形成するmRNA不安定化配列を含む、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 前記mRNA不安定化配列が1以上のAUUAもしくはUUAUUUAUU配列を有すし、ステムループ構造を形成する、請求項2に記載の単離核酸分子。
- 前記核酸配列と動作可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項1、2又は3に記載の単離核酸分子。
- 前記プロモーターが制御可能なプロモーターである、請求項4に記載の単離核酸分子。
- 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項5に記載の単離核酸分子。
- 前記プロモーターが抑制プロモーターである、請求項5に記載の単離核酸分子。
- 異種mRNA不安定化配列をさらに含む、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 前記mRNA不安定化配列が1以上のAUUAもしくはUUAUUUAUU配列を有する、もしくはステムロープ構造を形成する、請求項8の単離核酸分子。
- 前記mRNA不安定化配列が前記核酸配列に対して3’側にある、請求項8又は9に記載の単離核酸分子。
- 少なくとも前記レポータータンパク質をコードする前記核酸配列が、真核細胞中での発現に対して最適化されている、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 前記レポータータンパク質がルシフェラーゼをコードする、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 前記レポータータンパク質が甲虫類のルシフェラーゼをコードする、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 前記レポータータンパク質がコメツキムシルシフェラーゼをコードする、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 前記レポータータンパク質が花虫類のルシフェラーゼタンパク質をコードする、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 核酸配列が、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号66、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80を含む、或いは配列番号47、配列番号48、配列番号66、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79又は配列番号80によってコードされる、対応する完全長融合ポリペプチドの少なくとも70%の活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸断片を含む、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 1つの異種タンパク質不安定化配列が、哺乳動物オルニチンデカルボキシラーゼのC末端に由来する、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 1つの異種タンパク質不安定化配列が、突然変異オルニチンデカルボキシラーゼの配列である、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 前記突然変異オルニチンデカルボキシラーゼがマウスオルニチンデカルボキシラーゼの423-461アミノ酸残基に相当するHGFXXXMXXQXXGTLPMSCAQESGXXRHPAACASARINVを有し、その内、Xで示す位置の1つまたは複数の残基が天然に存在しない残基である、請求項18に記載の単離核酸分子。
- 前記突然変異オルニチンデカルボキシラーゼの配列が、ネズミのオルニチンデカルボキシラーゼの位置426、427、428、430、431、433、434、439又は448に対応する位置にアミノ酸置換体を有する、請求項19に記載の単離核酸分子。
- 融合ポリペプチドのN末端にユビキチンポリペプチドをさらに含む、請求項1に記載の単離核酸分子。
- グルタミン酸又はアルギニン残基がユビキチンのC末端のさらにC末端に存在する、請求項21に記載の単離核酸分子。
- 20分を越えない発現の半減期を有するRenillaルシフェラーゼ融合ポリペプチドをコードする、請求項11に記載の単離核酸分子。
- 30分を越えない発現の半減期を有するホタルルシフェラーゼ融合ポリペプチドをコードする、請求項11に記載の単離核酸分子。
- 請求項1、2又は3に記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記核酸分子が制御可能なプロモーターと動作可能に連結している、請求項25に記載のベクター。
- 前記プロモーターが抑制プロモーターである、請求項25に記載のベクター。
- 前記核酸分子が、配列番号49、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、或いは配列番号49、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79又は配列番号80によってコードされる、対応する完全長融合ポリペプチドの少なくとも70%の活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸断片を含む、請求項25に記載のベクター。
- 請求項1、2又は3に記載の核酸分子によってコードされる融合ポリペプチド。
- レポータータンパク質がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼである、請求項29に記載の融合ポリペプチド。
- 請求項25に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 発光タンパク質を含む融合ポリペプチドをコードするベクターを用いて、安定してトランスフェクトされる、請求項31に記載の宿主細胞。
- 前記ベクターを含む宿主細胞により発せられるシグナルが、1つ又は複数の前記不安定化配列を欠くベクターを含む対応する宿主細胞により発せられるシグナルより大きい、請求項31に記載の宿主細胞。
- 請求項25に記載のベクターを含む安定細胞系であって、前記レポータータンパク質により発せられるシグナルが、1つ又は複数の前記異種不安定化配列を欠くベクターを含む対応する安定細胞系により発せられるシグナル以上である、安定細胞系。
- 細胞中のレポータータンパク質を検出するための方法であって、
a)細胞と請求項25に記載のベクターを接触させること、及び
b)前記細胞又はその溶解物中の前記レポータータンパク質の存在又は量を、検出又は測定することを含む方法。 - レポータータンパク質が緑色蛍光タンパク質(GFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼである、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 哺乳動物細胞である請求項31記載の宿主細胞。
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