KR20230126717A - 체세포로부터의 나이브형 인간 iPS 세포 제조 방법 - Google Patents

체세포로부터의 나이브형 인간 iPS 세포 제조 방법 Download PDF

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KR20230126717A
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츠구미네 슈
지츠타로 가와구치
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고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
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Abstract

하기 공정 (1) 내지 (3)을 포함하는, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법을 제공한다; (1) 인간 체세포에, 초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터를 도입하는 공정, (2) 상기 체세포를 나이브용 배지의 존재 하에서 배양하는 공정 및 (3) 공정 (2) 후, 얻어진 세포를 나이브용 배지의 존재 하, 상기 체세포당의 상기 벡터양이 공정 3 개시 시에 비해 30％ 이하로 감소하는 조건 하에서 배양하는 공정.

Description

체세포로부터의 나이브형 인간 iPS 세포 제조 방법
본원은, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
마우스의 인공 다능성 줄기(iPS) 세포 및 배성간(ES) 세포는, 착상 전 블라스트 포낭의 상태에 가깝고, 고도로 미분화되는 상태인 나이브형인 것에 비해, 통상의 방법으로 제조되는 인간 iPS 세포 및 인간 ES 세포는, 착상 후 배의 상태에 가깝고, 나이브형보다도 발생이 진행된 상태인 프라임형의 특징을 갖는 것이 알려져 있다.
인간 iPS 세포는 나이브형인 마우스 iPS 세포와 비교하여, 다분화능이 한정되어 있는 것, 유전자 조작이 곤란한 것, 세포주 사이에 있어서의 유전자 발현이나 다분화능 등의 질의 변동이 큰 것 등이 지적되어 있지만, 그것들의 주된 원인의 하나로서 인간 iPS 세포가 나이브형보다도 발생이 진행된 프라임형인 것이 지적되어 있다. 그 때문에, 재생 의료의 발전을 위해, 나이브형의 성질을 갖는 인간 다능성 줄기 세포의 제조 방법이 갈망되고 있다.
지금까지 인간 나이브형 다능성 줄기 세포의 제조 방법으로서, (1) 프라임형 다능성 줄기 세포에, 특정 유전자를 발현시키고, 특정 성분을 함유하는 배지에서 배양함으로써 나이브형 다능성 줄기 세포로 변환하는 방법(특허문헌 1, 비특허문헌 1), (2) 프라임형 다능성 줄기 세포를, 특정 성분을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 나이브형 다능성 줄기 세포로 변환하는 방법(특허문헌 2 내지 4), (3) 체세포(섬유아세포)를 초기화할 때, 도중부터 특정 성분을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 나이브형 iPS 세포를 제조하는 방법(비특허문헌 2 내지 4)이 보고되어 있다.
WO2016/148253 일본 특허 공개 제2015-136349 WO2016/179243 WO2017/170849
Takashima Y et al., Cell, 158: 1254-1269, 2014 Theunissen T et al., Cell Stem Cell, 15: 471-487, 2014 Kilens S et al., Nature Communications, 9: 360-, 2018 Liu X et al., Nature Methods, 14: 1055-, 2017
본원은, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본원은, 하기의 실시 형태를 제공한다.
[1]
하기 공정 (1) 내지 (3)을 포함하는, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법;
(1) 인간 체세포에, 초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터를 도입하는 공정,
(2) 상기 체세포를 나이브용 배지의 존재 하에서 배양하는 공정 및
(3) 공정 (2) 후, 얻어진 세포를 나이브용 배지의 존재 하, 상기 체세포당의 상기 벡터양이 공정 3 개시 시에 비해 30％ 이하로 감소하는 조건 하에서 배양하는 공정.
[2]
상기 1개 이상의 벡터가 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터인, 상기 [1]에 기재된 방법.
[3]
상기 1개 이상의 벡터가 파라믹소 바이러스 벡터인, 상기 [2]에 기재된 방법.
[4]
상기 1개 이상의 벡터가 센다이 바이러스 벡터인, 상기 [3]에 기재된 방법.
[5]
공정 (1)의 1 내지 10일 후에 공정 (2)를 개시하는, 상기 [1] 내지 [4]의 어느 것에 기재된 방법.
[6]
공정 (2)를 1 내지 20일간 행하는, 상기 [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 방법.
[7]
상기 1개 이상의 벡터가, 온도 감수성을 나타내는 벡터, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터 및 온도 감수성을 나타내고, 또한 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는, 상기 [1] 내지 [6]의 어느 것에 기재된 방법.
[8]
상기 1개 이상의 벡터가, 온도 감수성을 나타내는 벡터인, 상기 [7]에 기재된 방법.
[9]
상기 1개 이상의 벡터가, 나이브형 다능성 줄기 세포를 수립하는 세포 배양 환경 하에서 온도 감수성을 나타내는 벡터인, 상기 [8]에 기재된 방법.
[10]
상기 1개 이상의 벡터가, TS7 변이(TS 변이(M 단백질의 G69E/T116A/A183S 변이, HN 단백질의 A262T/G264R/K461G 변이, P 단백질의 L511F 변이 및 L 단백질의 N1197S/K1795E 변이)에 더하여, L 단백질의 Y942H/L1361C/L1558I 변이), TS12 변이(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이) 또는 TS15 변이(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이 및 L 단백질의 L1361C/L1558I)를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 상기 [9]에 기재된 방법.
[11]
공정 (3)이, 얻어진 세포를 38℃ 이상에서 배양하는 것을 포함하는, 상기 [7] 내지 [10]의 어느 것에 기재된 방법.
[12]
인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터가 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터이며, 상기 마이크로 RNA의 표적 서열이, NP 유전자 또는 P 유전자의, 번역 영역, 5'UTR, 또는 3'UTR에 존재하는, 상기 [7] 내지 [11]의 어느 것에 기재된 방법.
[13]
상기 마이크로 RNA가 miR-367인, 상기 [12]에 기재된 방법.
[14]
초기화 인자가, OCT 유전자, SOX 유전자, MYC 유전자 및/또는 KLF 유전자를 포함하는, 상기 [1] 내지 [13]의 어느 것에 기재된 방법.
[15]
상기 1개 이상의 벡터가, OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터, MYC 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는, 상기 [14]에 기재된 방법.
[16]
MYC 유전자를 포함하는 벡터가, TS15 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 상기 [15]에 기재된 방법.
[17]
OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터가, TS12 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 상기 [15] 또는 [16]에 기재된 방법.
[18]
공정 (3)에 있어서, 상기 체세포당의 상기 벡터양이, 공정 3 개시 시부터 12일 이내에 공정 3 개시 시에 비해 30％ 이하로 감소하는, 상기 [1] 내지 [17]의 어느 것에 기재된 방법.
[19]
상기 나이브용 배지가, LIF(백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor)), MEK 저해제, GSK3 저해제, cAMP 산생 촉진제, TGF-β 저해제 및 PKC 저해제에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함하는, 상기 [1] 내지 [18]의 어느 것에 기재된 방법.
[20]
상기 나이브용 배지가, t2iLGo, 5iLAF 및 tt2iLGo로 이루어지는 군에서 선택되는 배지인, 상기 [19]에 기재된 방법.
[21]
공정 (2) 및 (3)을 피더 세포의 비존재 하에서 행하는, 상기 [1] 내지 [20]의 어느 것에 기재된 방법.
[22]
상기 인간 체세포가 단핵구 또는 섬유아세포인, 상기 [1] 내지 [21]의 어느 것에 기재된 방법.
[23]
하기를 포함하는, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하기 위한 키트:
초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터, 여기서 상기 1개 이상의 벡터는, 온도 감수성을 나타내는 벡터, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터 및 온도 감수성을 나타내고, 또한 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택됨; 및
나이브용 배지.
[24]
상기 1개 이상의 벡터가 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터인, 상기 [23]에 기재된 키트.
[25]
상기 1개 이상의 벡터가 파라믹소 바이러스 벡터인, 상기 [24]에 기재된 키트.
[26]
상기 1개 이상의 벡터가 센다이 바이러스 벡터인, 상기 [25]에 기재된 키트.
[27]
상기 1개 이상의 벡터가 온도 감수성을 나타내는 벡터인, 상기 [23] 내지 [26]의 어느 것에 기재된 키트.
[28]
상기 1개 이상의 벡터가, 나이브형 다능성 줄기 세포를 수립하는 세포 배양 환경 하에서 온도 감수성을 나타내는 벡터인, 상기 [27]에 기재된 키트.
[29]
상기 1개 이상의 벡터가, TS7 변이(TS 변이(M 단백질의 G69E/T116A/A183S 변이, HN 단백질의 A262T/G264R/K461G 변이, P 단백질의 L511F 변이 및 L 단백질의 N1197S/K1795E 변이)에 더하여, L 단백질의 Y942H/L1361C/L1558I 변이), TS12 변이(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이) 또는 TS15 변이(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이 및 L 단백질의 L1361C/L1558I)를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 상기 [28]에 기재된 키트.
[30]
인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터가 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터이며, 상기 마이크로 RNA의 표적 서열이, NP 유전자 또는 P 유전자의, 번역 영역, 5'UTR, 또는 3'UTR에 존재하는, 상기 [23] 내지 [29]의 어느 것에 기재된 키트.
[31]
상기 마이크로 RNA가 miR-367인, 상기 [30]에 기재된 키트.
[32]
초기화 인자가, OCT 유전자, SOX 유전자, MYC 유전자 및/또는 KLF 유전자를 포함하는, 상기 [23] 내지 [31]의 어느 것에 기재된 키트.
[33]
상기 1개 이상의 벡터가, OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터, MYC 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는, 상기 [32]에 기재된 키트.
[34]
MYC 유전자를 포함하는 벡터가, TS15 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 상기 [33]에 기재된 키트.
[35]
OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터가, TS12 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 상기 [33] 또는 [34]에 기재된 키트.
[36]
상기 나이브용 배지가, LIF(백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor)), MEK 저해제, GSK3 저해제, cAMP 산생 촉진제, TGF-β 저해제 및 PKC 저해제에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함하는, 상기 [23] 내지 [35]의 어느 것에 기재된 키트.
[37]
상기 나이브용 배지가, t2iLGo, 5iLAF 및 tt2iLGo로 이루어지는 군에서 선택되는 배지인, 상기 [36]에 기재된 키트.
[38]
상기 인간 체세포가 단핵구 또는 섬유아세포인, 상기 [23] 내지 [37]의 어느 것에 기재된 키트.
[39]
상기 [1] 내지 [22]의 어느 것에 기재된 방법으로 제조된 나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 배양 상청.
[40]
상기 [1] 내지 [22]의 어느 것에 기재된 방법으로 제조된 나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 배양 상청을 원료로서 포함하는 화장품.
본원에 의해, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 또한, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하기 위한 벡터 세트 및 키트가 제공된다. 본원의 방법에 의해 얻어지는 나이브형 인공 다능성 줄기 세포는, 초기화 인자를 포함하는 벡터를 실질적으로 포함하지 않고, 형질 안정성이 높다.
도 1은 체세포로부터 나이브형 iPS 세포를 제조하기 위해 종래 사용되고 있는 센다이 바이러스 벡터(CytoTune-iPS2.0L)의 구조.
도 2는 인간 피부 섬유아세포(HDF)로부터 나이브형 iPS 세포를 제조하기 위한 프로토콜. 세로 방향의 바는 배지 교환의 타이밍의 일례를 나타내고 있다.
도 3a는 45회 계대한 HDF 유래 나이브형 iPS 세포의 위상차 현미경에 의한 화상.
도 3b는 45회 계대한 HDF 유래 나이브형 iPS 세포의 다능성 마커에 의한 면역 염색상. 가로로 나열된 3매의 화상은 각각 동시야의 화상이다.
도 4는 고온 배양이 센다이 바이러스 벡터의 게놈양에 미치는 효과.
도 5는 인간 말초혈 단핵구(PBMC)로부터 나이브형 iPS 세포를 제조하기 위한 프로토콜. 세로 방향의 바는 배지 교환의 타이밍의 일례를 나타내고 있다.
도 6은 PBMC 유래 나이브형 iPS 세포 중에 있어서의 센다이 바이러스 벡터의 게놈양의 day14부터의 계대마다의 정량 평가.
도 7은 각 세포종의 싱글 셀 데이터를 통합한 주성분 분석.
도 8은 각 세포종에 있어서의 인쇄 유전자 및 X 염색체 관련 유전자의 발현 패턴.
도 9a는 각 세포종의 글로벌 메틸화를 나타내는 밀도 빈 플롯(Density bean plot).
도 9b는 각 세포종의 글로벌 메틸화를 나타내는 주성분 분석.
도 9c는 본 실시예에서 얻어진 HDF 유래 나이브형 iPS 세포에 있어서의, 5-메틸시토신의 전 시토신에 차지하는 비율.
도 10은 장기 계대 후(P16 내지 45)의 HDF 또는 PBMC 유래 나이브형 iPS 세포의 3배엽 성분의 초기 분화능. 컨트롤로서, Reset Naive ESC(인 하우스)를 사용했다.
도 11a는 SeV 감염으로부터 94일 후의 CytoTune-iPS 2.0L(nCT2.0L_1)로 초기화된 나이브형 인간 iPSC에 있어서의 위상차 화상 및 SeV에서의 면역 형광 염색. 스케일 바는 100㎛를 나타낸다.
도 11b는 CytoTune 2.0 또는 2.0L SeV 초기화 키트를 사용하여 초기화한 나이브형 iPSC에 있어서의 SeV 게놈 발현의 qRT-PCR 해석. 값을 GAPDH 발현량으로 정규화하여, 평균값±s.d.로 나타낸다. 각 점에 대하여 n=3이다.
도 11c는 CytoTune 2.0 또는 2.0L로 초기화된 나이브형 인간 iPSC에 있어서의, GAPDH 발현으로 정규화한 각 SeV 벡터 게놈 발현의 qRT-PCR 해석. 데이터를 평균값±s.d.로 나타낸다. 각 점에 대하여 n=3이다. 본 실험에서는 각 SeV 벡터를 특이적으로 검출하도록 설계된 프라이머 및 SYBR Green을 사용했다.
도 11d는 SeV 벡터 및 개변형 초기화 칵테일의 모식도. CytoTune-2.0 또는 2.0L 초기화 키트에 있어서의 SeV18+KLF4/TSΔF(KLF4/TS) 벡터를 이하의 3개의 개변형 벡터 중 하나로 변경했다: SeV18+KLF4/TS12ΔF(KLF4/TS12), SeV18+KLF4/PmiR367T2/TSΔF(KLF4/miR/TS), 또는 SeV18+KLF4/PmiR367T2/TS12ΔF(KLF4/miR/TS12). KLF4/miR/TS12는 본 실시예에 있어서 신규로 개발되었다.
도 11e는 hsa-miRNA423-3p 발현으로 정규화한 HDF 및 PSC에 있어서의 hsa-miRNA367-3p 발현의 qRT-PCR 해석. 데이터를 평균값±s.d.로 나타낸다. n=3이다. ND는 40회의 증폭 사이클 후에 있어서도 검출되지 않은 것을 나타낸다.
도 11f는 개변형 SeV-OSKL 칵테일을 사용한 HDF 또는 PBMC로부터의 나이브형 인간 iPSC의 유도 및 나이브형 인간 iPSC가 생성된 후의 인큐베이션 온도의 변화에 대한 실험 계획.
도 11g는 CytoTune-iPS 2.0 SeV 벡터 감염으로부터 14일 후의 PBMC의 대표적인 위상차 화상. 스케일 바는 200㎛를 나타낸다.
도 12a는 day14에 있어서의 HDF로부터 제작한 나이브형 인간 iPSC 콜로니의 수. SeV-KLF4/TS 및 3개의 개변형 SeV-KLF4 벡터를, 각각 SeV-KOS 및 SeV-LMYC와 공감염시켰다. 데이터를 평균값±s.d.로 나타낸다. n=3이고, *는 P<0.05를 나타낸다.
도 12b는 qRT-PCR에 의해 해석된, SeV 벡터 감염으로부터 14일 후의 세포에 있어서의 SeV 게놈의 검출 감도. X축은, SeV 음성 세포에 있어서의 SeV 양성 세포의 비율을 나타낸다.
도 12c는 SeV-KOS, SeV-LMYC 및 각 SeV-KLF4 벡터로 초기화한 HDF 유래의 나이브형 iPSC에 있어서의 SeV 게놈 발현의 qRT-PCR 해석. 데이터를 평균값±s.d.로 나타낸다. 각 점에 대하여 n=3이다.
도 12d는 day14 및 day34에 있어서의 SeV-KOS, SeV-LMYC 및 SeV-KLF4/miR/TS12 벡터로 초기화한 HDF 유래의 나이브형 iPSC(nOSKL_1, 2) 및 PBMC 유래의 나이브형 iPSC(nOSKL_3, 4)에 있어서의 SeV 게놈 발현의 qRT-PCR 해석. 데이터를 평균값±s.d.로 나타낸다. n=3이다.
도 12e는 SeV-KOS, SeV-LMYC 및 SeV-KLF4/miR/TS12 벡터로 초기화한 iMEF 피더 세포 상의 나이브형 iPSC 및 피더 프리의 나이브형 iPSC의 대표적인 위상차 화상. 스케일 바는 200㎛를 나타낸다.
도 12f는 수립한 nOSKL_1-4의 세포 증식 속도.
도 13a는 GAPDH 발현으로 정규화하고, qRT-PCR에 의해 해석한 나이브형 다능성 마커의 상대적 발현. nH9의 값을 1.0으로 하고 있다. 데이터를 평균값±s.d.로 나타낸다. n=3이다.
도 13b는 GAPDH 발현으로 정규화하고, qRT-PCR에 의해 해석한 프라임형 다능성 마커의 상대적 발현. 데이터를 평균값±s.d.로 나타낸다. n=3이다.
도 13c는 나이브형 및 프라임형 인간 PSC에 있어서의 공통, 프라임형 및 나이브형의 다능성 관련 마커 유전자의 발현 레벨을 나타내는 RNA-seq 데이터의 히트 맵.
도 13d는 각 문헌(Takashima, Y. et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell 158, 1254-1269, doi: 10.1016/j. cell. 2014. 08. 029(2014).; Theunissen, T. W. et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell stem cell 15, 471-487, doi: 10.1016/j. stem. 2014.07.002(2014).; Yan, L. et al. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nature structural & molecular biology 20, 1131-1139, doi: 10.1038/nsmb. 2660(2013).)의 리셋 나이브형 인간 iPSC 및 착상 전 배 시료와 비교한 본 실시예에 있어서의 프라임형 및 나이브형 인간 PSC의 RNA-seq 데이터의 PCA.
도 14a는 DNA 메틸화 어레이를 사용하여 해석한 프라임형 및 나이브형 인간 PSC에 있어서의 글로벌인 DNA 메틸화 레벨의 빈 플롯. 빈 플롯 중의 가로선은 메틸화 베타값의 평균값을 나타낸다.
도 14b는 DNA 메틸화 어레이를 사용한 프라임형 및 나이브형 인간 PSC에 있어서의 글로벌인 DNA 메틸화의 PCA.
도 14c는 X연쇄 유전자 UTX(X 염색체의 불활성화를 회피함), HUWE1(X 염색체의 불활성화를 받음) 및 XIST를 검출하는 나이브형 및 프라임형 인간 iPSC의 대표적인 RNA-FISH 화상. 정상적인 X 염색체를 갖는 PSC만이 정량화에 포함되어 있는 것을 보증하기 위해, UTX를 해석했다. 스케일 바는 20㎛를 나타낸다.
도 14d는 양 알레르 UTX 발현을 갖는 세포에 있어서의 XIST 및 HUWE1의 RNA-FISH 패턴의 정량화. 각 세포주에 있어서 100개의 세포를 해석했다. 대부분의 나이브형 인간 iPSC는, 양 알레르 HUWE1 발현에 의해 나타나는 X 재활성화를 나타냈다. nOSKL_3 및 4의 몇 가지의 세포는 양 알레르 HUWE1 발현에 더하여 양 알레르 XIST 발현을 나타내고, 이것은 착상 전 외배엽의 발현 패턴에 유사하다.
도 15a는 미토콘드리아의 내막에 존재하는 전자 전달계의 단백질을 코드하는 유전자의 히트 맵. 이들 유전자는 산화적 인산화의 활성을 반영하고 있고, 미토콘드리아 복합체에 의해 분류되어, 계층적으로 클러스터화된다.
도 15b는 세포외 플럭스 애널라이저를 사용한 나이브형 iPSC 및 프라임형 iPSC의 대사능의 비교.
도 15c는 나이브형 iPSC 및 프라임형 iPSC의 예비 호흡능의 정량화.
도 15d는 나이브형 iPSC 및 프라임형 iPSC에 있어서의 세포 외 산성화 속도(ECAR) 및 산소 소비 속도(OCR).
도 16a는 원시 내배엽으로의 분화의 모식도.
도 16b는 프라임형 ESC(H9; 좌측 도면) 및 SeV(-)나이브형 iPSC(nOSKL_4; 우측 도면) 유래의 원시 내배엽의 대표적인 위상차 화상. 스케일 바는 100㎛를 나타낸다.
도 16c는 플로 사이토메트리에 의한, 프라임형 ESC(H9), 나이브형 ESC(nH9), SeV(-)나이브형 iPSC(nOSKL_4) 및 SeV(+)나이브형 iPSC(nCT2.0L_4)에 있어서의 PDGFRA 및 ANPEP 발현의 정량화.
도 16d는 플로 사이토메트리에 의한, PDGFRA/ANPEP 공양성 세포에 있어서의 시그널값의 중앙값.
도 17a는 영양 외배엽으로의 분화의 모식도.
도 17b는 프라임형 ESC(H9; 좌측 도면) 및 SeV(-)나이브형 iPSC(nOSKL_4; 우측 도면) 유래의 영양 외배엽의 대표적인 위상차 화상. 스케일 바는 200㎛를 나타낸다.
도 17c는 플로 사이토메트리에 의한, 프라임형 ESC(H9), 나이브형 ESC(nH9), SeV(-)나이브형 iPSC(nOSKL_4) 및 SeV(+)나이브형 iPSC(nCT2.0L_4)에 있어서의 TACSTD2, ENPEP, HAVCR1 및 HLA-ABC 발현의 정량화.
도 17d는 플로 사이토메트리에 의한 TACSTD2(+)/ENPEP(+) 및 HAVCR1(+) 세포의 비율. 각 플롯은 1회의 실험을 나타낸다.
본 명세서 및 특허 청구의 범위에 있어서는, 수치가 「약」의 용어를 수반하는 경우, 그 값의 ±10％의 범위를 포함하는 것을 의도한다. 예를 들어, 「약 20」은, 「18 내지 22」를 포함하는 것으로 한다. 수치의 범위는, 양 단부점 사이의 모든 수치 및 양 단부점의 수치를 포함한다. 범위에 관한 「약」은, 그 범위의 양 단부점에 적용된다. 따라서, 예를 들어 「약 20 내지 30」은, 「18 내지 33」을 포함하는 것으로 한다.
[벡터]
본원에 있어서, 벡터는 체세포에 유전자를 도입할 수 있는 벡터이면 되고, 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터일 수 있고, 예를 들어 바이러스 벡터이다. 본 개시에 있어서, 바이러스 벡터는, 당해 바이러스에서 유래하는 게놈 핵산을 갖고, 해당 핵산에 도입 유전자를 조합함으로써, 해당 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터이다. 본원의 벡터는, 예를 들어 염색체 비내장형 바이러스 벡터이다. 염색체 비내장형 바이러스 벡터란, 바이러스에서 유래하여, 유전자를 표적 세포에 도입할 수 있는 바이러스 벡터이며, 도입된 유전자가 숙주의 염색체(핵 유래 염색체)에 내장될 위험성이 없는 운반체를 말한다. 본원에 있어서, 바이러스 벡터에는, 감염성 바이러스 입자 외에, 비감염성 바이러스 입자, 바이러스 코어 또는 바이러스 게놈과 바이러스 단백질의 복합체 등을 포함하는 복합체이며, 세포에 도입함으로써 탑재하는 유전자를 발현하는 능력을 갖는 복합체가 포함된다. 예를 들어, RNA 바이러스에 있어서, 바이러스 게놈과 그것에 결합하는 바이러스 단백질을 포함하는 리보뉴클레오 단백질(바이러스의 코어 부분)은, 세포에 도입함으로써 세포 내에서 도입 유전자를 발현할 수 있다(WO00/70055). 세포로의 도입은, 적절히 형질 감염 시약 등을 사용하여 행하면 된다. 이러한 리보뉴클레오 단백질(RNP)도 본원에 있어서 바이러스 벡터에 포함된다.
본 명세서에 있어서, 숙주의 염색체에 내장될 위험성이 없다는 것은, 바이러스 벡터를 도입한 경우에, 숙주 염색체에 내장되는 빈도가 충분히 낮은 것을 의미한다. 바람직하게는, 숙주의 염색체로의 내장 빈도는, 예를 들어 인간 섬유육종 유래 세포주 HT1080(ATCC CCL121)에 10PFU/cell로 감염시킨 경우에 5×10-4 이하이고, 보다 바람직하게는 10-4 이하이고, 보다 바람직하게는 10-5 이하이고, 보다 바람직하게는 10-6 이하이고, 보다 바람직하게는 10-7 이하이다. 염색체 비내장형 바이러스 벡터는, 바람직하게는 RNA 바이러스이다. 본 개시에 있어서, RNA 바이러스란, RNA 게놈을 갖고, 라이프 사이클에 있어서 DNA의 페이즈를 갖지 않는 바이러스를 의미한다. 본 개시에 있어서 RNA 바이러스는, 역전사 효소를 갖지 않는다(즉, 레트로 바이러스는 포함되지 않음). 즉, 바이러스 증식에 있어서, 바이러스 게놈은 DNA를 통하지 않고, RNA 의존성 RNA 폴리메라아제에 의해 복제된다. RNA 바이러스는 DNA 페이즈를 갖지 않기 때문에, RNA 바이러스 벡터를 사용함으로써, 숙주 염색체로의 내장의 리스크를 최소한으로 억제하는 것이 가능해진다. RNA 바이러스에는, 단일쇄 RNA 바이러스(플러스쇄 RNA 바이러스 및 마이너스쇄 RNA 바이러스를 포함함) 및 이중쇄 RNA 바이러스를 포함한다. 또한 엔벨로프를 갖는 바이러스(엔벨로프 바이러스; enveloped virus) 및 엔벨로프를 갖지 않는 바이러스(비엔벨로프 바이러스; non-enveloped virus)를 포함하지만, 바람직하게는 엔벨로프 바이러스에서 유래하는 벡터가 사용된다. 본원에 있어서 RNA 바이러스에는, 구체적으로는 이하의 과에 속하는 바이러스가 포함된다.
라사 바이러스 등의 아레나 바이러스과(Arenaviridae)
인플루엔자 바이러스 등의 오르토믹소 바이러스과(Orthomyxo viridae)
SARS 바이러스 등의 코로나 바이러스과(Coronaviridae)
풍진 바이러스 등의 토가 바이러스과(Togaviridae)
멈프스 바이러스, 홍역 바이러스, 센다이 바이러스, RS 바이러스 등의 파라믹소 바이러스과(Paramyxoviridae)
폴리오 바이러스, 콕삭키 바이러스, 에코 바이러스 등의 피코르나 바이러스과(Picornaviridae)
마르부르그 바이러스, 에볼라 바이러스 등의 필로 바이러스과(Filoviridae)
황열병 바이러스, 뎅기열 바이러스, C형 간염 바이러스, G형 간염 바이러스 등의 플라비 바이러스과(Flaviviridae)
부니아 바이러스과(Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus 및 Phlebovirus속 등을 포함함)
광견병 바이러스 등의 랍도 바이러스과(Rhabdoviridae)
레오 바이러스과(Reoviridae)
염색체 비내장형 바이러스 벡터는, 예를 들어 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터이다. 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터란, 마이너스쇄(바이러스 단백질을 코드하는 센스쇄에 대한 안티센스쇄)의 RNA를 게놈으로서 포함하는 바이러스를 포함하는 벡터이다. 마이너스쇄 RNA는 네거티브쇄 RNA라고도 불린다. 마이너스쇄 RNA 바이러스는, 예를 들어 단일쇄 마이너스쇄 RNA 바이러스(비분절형(non-segmented) 마이너스쇄 RNA 바이러스라고도 함)이다. 「단일쇄 네거티브쇄 RNA 바이러스」란, 단일쇄 네거티브쇄[즉, 마이너스쇄] RNA를 게놈에 갖는 바이러스를 의미한다. 이러한 바이러스로서는, 파라믹소 바이러스(Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus 및 Pneumovirus속 등을 포함함), 랍도 바이러스(Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus 및 Ephemerovirus속 등을 포함함), 필로바이러스(Filoviridae) 등의 과에 속하는 바이러스가 포함되고, 분류학상 모노 네가 바이러스목(Mononegavirales)에 속하고 있다(바이러스 제57권 제1 호, pp29-36, 2007; Annu. Rev. Genet. 32, 123-162, 1998; Fieldsvirologyfourth edition, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1305-1340, 2001; Microbiol. Immunol. 43, 613-624, 1999; Field Virology, Third edition pp1205-1241 1996).
마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터는, 예를 들어 파라믹소 바이러스 벡터이다. 파라믹소 바이러스 벡터는, 파라믹소 바이러스과(Paramyxoviridae) 바이러스에서 유래하는 바이러스 벡터이다. 예를 들어, 파라믹소 바이러스과(Paramyxoviridae) 바이러스의 센다이 바이러스(Sendaivirus)를 들 수 있다. 다른 예로서는, 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 유행성이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measlesvirus), RS 바이러스(Respiratory syncytia lvirus), 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(SV5), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1,2,3형, 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)의 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 라브드 바이러스과(Rhabdoviridae)의 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 광견병 바이러스(Rabies virus) 등을 들 수 있다.
본원에 있어서 사용될 수 있는 바이러스를 더 예시하면, 예를 들어 센다이 바이러스(Sendai virus)(SeV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(human parainfluenza virus)-1(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스-3(HPIV-3), 물개 전염성 급성염증 바이러스(phocine distemper virus)(PDV), 개홍역 바이러스(canine distemper virus)(CDV), 돌고래 몰빌리바이러스(dolphin molbillivirus)(DMV), 페스트-데스-페티스-반추동물 바이러스(peste-des-petits-ruminants virus)(PDPR), 홍역 바이러스(measles virus)(MV), 우역 바이러스(rinderpest virus)(RPV), 헨드라 바이러스(Hendra virus)(Hendra), 니파 바이러스(Nipah virus)(Nipah), 인간 파라인플루엔자 바이러스-2(HPIV-2), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(simian parainfluenza virus) 5(SV5), 인간 파라인플루엔자 바이러스-4a(HPIV-4a), 인간 파라인플루엔자 바이러스-4b(HPIV-4b), 멈프스 바이러스(mumps virus)(Mumps) 및 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus)(NDV) 등이 포함된다. 보다 바람직하게는, 센다이 바이러스(SeV), 인간 파라인플루엔자 바이러스-1(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스-3(HPIV-3), 물개 전염성 급성염증 바이러스(phocinedistemper virus)(PDV), 개홍역 바이러스(canine distemper virus)(CDV), 돌고래 몰빌리바이러스(dolphin molbillivirus)(DMV), 페스트-데스-페티스-반추동물 바이러스(peste-des-petits-ruminants virus)(PDPR), 홍역 바이러스(measles virus)(MV), 우역 바이러스(rinderpest virus)(RPV), 헨드라 바이러스(Hendra virus)(Hendra) 및 니파 바이러스(Nipah virus)(Nipah)로 이루어지는 군에서 선택되는 바이러스를 들 수 있다.
본원에 있어서 사용되는 벡터는, 예를 들어 파라믹소 바이러스아과(레스피로 바이러스속, 루불라 바이러스속 및 모르빌리 바이러스속을 포함함)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체이고, 예를 들어 레스피로 바이러스속(genus Respirovirus)(파라믹소 바이러스속(Paramyxovirus)이라고도 함)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체이다. 유도체에는, 바이러스에 의한 유전자 도입능을 손상시키지 않도록, 바이러스 유전자가 개변된 바이러스 및 화학 수식된 바이러스 등이 포함된다. 본 발명을 적용 가능한 레스피로 바이러스속 바이러스로서는, 예를 들어 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형(HPIV-3), 소 파라인플루엔자 바이러스 3형(BPIV-3), 센다이 바이러스(Sendai virus; 마우스 파라인플루엔자 바이러스 1형이라고도 불림) 및 원숭이 파라인플루엔자 바이러스 10형(SPIV-10) 등이 포함된다. 파라믹소 바이러스는, 가장 바람직하게는 센다이 바이러스이다.
마이너스쇄 RNA 바이러스는, 일반적으로, 엔벨로프의 내부에 RNA와 단백질을 포함하는 복합체(리보뉴클레오 프로테인; RNP)를 포함하고 있다. RNP에 포함되는 RNA는 마이너스쇄 RNA 바이러스의 게놈인 (-)쇄(네거티브쇄)의 단일쇄 RNA이고, 이 단일쇄 RNA가, NP 단백질, P 단백질 및 L 단백질과 결합하여, RNP를 형성하고 있다. 이 RNP에 포함되는 RNA가 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 위한 주형이 된다(Lamb, R. A., and D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae: The viruses and their replication. pp.1177-1204. In Fields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al.(ed.), Raven Press, New York, N. Y.).
마이너스쇄 RNA 바이러스의 「NP, P, M, F, HN 및 L 유전자」란, 각각 뉴클레오캡시드, 포스포, 매트릭스, 퓨전, 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 및 라지 단백질을 코드하는 유전자를 가리킨다. 뉴클레오캡시드(NP) 단백질은, 게놈 RNA에 결합하고, 게놈 RNA가 주형 활성을 갖기 위해 불가결한 단백질이다. 일반적으로, NP 유전자는 「N 유전자」라고 표기되는 경우도 있다. 포스포(P) 단백질은, RNA 폴리메라아제의 소서브 유닛인 인산화 단백질이다. 매트릭스(M) 단백질은, 바이러스 입자 구조를 내측으로부터 유지하는 기능을 행한다. 퓨전(F) 단백질은, 숙주 세포에의 침입에 관계되는 막 융합 단백질이고, 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(HN) 단백질은 숙주 세포와의 결합에 관계되는 단백질이다. 라지(L) 단백질은, RNA 폴리메라아제의 대서브 유닛이다. 상기 각 유전자는 개개의 전사 제어 유닛을 갖고, 각 유전자로부터 단독의 mRNA가 전사되어, 단백질이 전사된다. P 유전자로부터는, P 단백질 이외에, 다른 ORF를 이용하여 번역되는 비구조 단백질(C)과, P 단백질 mRNA를 판독하여 도중의 RNA 편집에 의해 만들어지는 단백질 (V)가 번역된다. 예를 들어, 파라믹소 바이러스아과에 속하는 각 바이러스에 있어서의 각 유전자는, 일반적으로, 3'으로부터 차례로, 다음과 같이 표기된다.
레스피로 바이러스속 N P/C/V M F HN-L
루불라 바이러스속 N P/V M F HN(SH) L
모르빌리 바이러스속 N P/C/V M F H-L
예를 들어, 센다이 바이러스의 각 유전자의 염기 서열의 데이터베이스의 액세션 번호는, N 유전자에 대해서는 M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P 유전자에 대해서는 M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M 유전자에 대해서는 D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F 유전자에 대해서는 D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN 유전자에 대해서는 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, L 유전자에 대해서는 D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886을 참조. 또한 그밖의 바이러스가 코드하는 바이러스 유전자를 예시하면, N 유전자에 대해서는, CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MeV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; 및 Tupaia, AF079780, P 유전자에 대해서는, CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MeV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; 및 Tupaia, AF079780, C 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, D00047; MeV, ABO16162; RPV, X68311; SeV, AB005796; 및 Tupaia, AF079780, M 유전자에 대해서는 CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MeV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; 및 SV5, M32248, F 유전자에 대해서는 CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MeV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; 및 SV5, AB021962, HN(H 또는 G) 유전자에 대해서는 CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MeV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; 및 SV-5, S76876, L 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV, AJ608288; HPIV-1, AF117818; HPIV-2, X57559; HPIV-3, AB012132; Mumps, AB040874; MeV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV, Z30698; 및 SV-5, D13868을 예시할 수 있다. 단, 각 바이러스는 복수의 주가 알려져 있고, 주의 차이에 의해 상기에 예시한 것 이외의 서열을 포함하는 유전자도 존재한다. 이들 어느 유전자에서 유래하는 바이러스 유전자를 갖는 센다이 바이러스 벡터는, 본원의 벡터로서 유용하다. 또한, P 단백질에 관해서는 그 기능 부위가 C 말단측의 N 결합 부위, L 결합 부위, 올리고머 형성 부위를 포함하는 영역이고(SeV의 경우는 P 단백질의 C 말단측의 320-568)(Blanchard L. et al., Virology.(2004) 319, 201-211.), 본원에 있어서 P 단백질은 적어도 이 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본원의 벡터는, 상기한 어느 것의 바이러스 유전자의 코드 서열(SeV의 P 유전자에 관해서는, 예를 들어 C 말단측의 서열이어도 되고, 예를 들어 479번째 내지 568번째의 아미노산 서열 또는 320번째 내지 568번째의 아미노산 서열)과, 90％ 이상, 바람직하게는 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함한다. 또한, 본원의 벡터는, 예를 들어 상기한 어느 것의 바이러스 유전자의 코드 서열이 코드하는 아미노산 서열(SeV의 P 단백질에 관해서는, 예를 들어 C 말단측의 서열이어도 되고, 예를 들어 479번째 내지 568번째의 아미노산 서열 또는 320번째 내지 568번째의 아미노산 서열)과, 90％ 이상, 바람직하게는 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 또한, 본원의 벡터는, 예를 들어 상기한 어느 것의 바이러스 유전자의 코드 서열이 코드되는 아미노산 서열(SeV의 P 유전자에 관해서는 예를 들어 C 말단측의 서열이어도 되고, 예를 들어 479번째 내지 568번째의 아미노산 서열 또는 320번째 내지 568번째의 아미노산 서열)에 있어서, 10개 이내, 바람직하게는 9개 이내, 8개 이내, 7개 이내, 6개 이내, 5개 이내, 4개 이내, 3개 이내, 2개 이내, 또는 1개의 아미노산이 치환, 삽입, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 염기 서열을 포함한다.
또한 본 명세서에 기재한 염기 서열 및 아미노산 서열 등의 데이터베이스 액세션 번호가 참조된 서열은, 예를 들어 본원의 출원일 및 우선일에 있어서의 서열을 참조하는 것이며, 본원의 출원일 및 우선일의 어느 시점에 있어서의 서열로서도 특정할 수 있고, 바람직하게는 본원의 출원일에 있어서의 서열로서 특정된다. 각 시점에서의 서열은 데이터베이스의 리비전 히스토리를 참조함으로써 특정할 수 있다.
또한 본원의 마이너스쇄 RNA 바이러스는, 천연주, 야생주, 변이주, 연구소 계대주 및 인위적으로 구축된 주 등에서 유래해도 된다. 예를 들어, 센다이 바이러스 Z주를 들 수 있다(Medical Journal of Osaka University Vol.6, No.1, March 1955 p1-15). 즉, 당해 바이러스는 천연으로부터 단리된 바이러스와 마찬가지의 구조를 갖는 바이러스 벡터라여도 되고, 유전자 재조합에 의해 인위적으로 개변된 바이러스여도 된다. 예를 들어, 야생형 바이러스가 갖는 어느 유전자에 변이나 결손이 있는 것이어도 된다. 예를 들어, 바이러스의 엔벨로프 단백질 또는 외각 단백질을 코드하는 적어도 하나의 유전자에 변이 또는 결손을 갖는 바이러스를 적합하게 사용할 수 있다. 이러한 바이러스 벡터는, 예를 들어 감염 세포에 있어서는 게놈을 복제할 수는 있지만, 감염성 바이러스 입자를 형성할 수 없는 바이러스 벡터이다. 이러한 전파능 결손형의 바이러스 벡터는, 주위에 감염을 확대시킬 우려가 없으므로 안전성이 높다. 예를 들어, F 및/또는 HN 등의 엔벨로프 단백질 또는 스파이크 단백질을 코드하는 적어도 하나의 유전자, 혹은 그것들의 조합이 포함되어 있지 않은 마이너스쇄 RNA 바이러스를 사용할 수 있다(WO00/70055 및 WO00/70070; Li, H. -O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569(2000)). 게놈 복제에 필요한 단백질(예를 들어, N, P 및 L 단백질)을 게놈 RNA에 코드하고 있으면, 감염 세포에 있어서 게놈을 증폭시킬 수 있다. 결손형 바이러스를 제조하기 위해서는, 예를 들어 결손되어 있는 유전자 산물 또는 그것을 상보할 수 있는 단백질을 바이러스 산생 세포에 있어서 외래적으로 공급한다(WO00/70055 및 WO00/70070; Li, H. -O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569(2000)). 또한, 결손하는 바이러스 단백질을 완전히 상보하는 일 없이, 비감염성의 바이러스 입자(VLP)로서 바이러스 벡터를 회수하는 방법도 알려져 있다(WO00/70070). 또한, 바이러스 벡터를 RNP(예를 들어, N, L, P 단백질 및 게놈 RNA를 포함하는 RNP)로서 회수하는 경우는, 엔벨로프 단백질을 상보하는 일 없이 벡터를 제조할 수 있다.
또한 본원의 바이러스는, 천연의 바이러스에 한정되지 않고, 예를 들어 인공적으로 제작한 바이러스도 포함된다. 예를 들어 본원의 바이러스에는, 코돈을 최적화하기 위해 핵산 서열에 변이를 도입한 것이나, 키메라 바이러스(예를 들어, 동종 바이러스간의 키메라 및 타종 바이러스간의 키메라 바이러스(예를 들어, PIV와 SeV의 키메라 등)를 포함함) 등도 포함된다(J. Virol. 1995, 69, 849-855).
또한 본원에 있어서 N, L, P 단백질 등의 바이러스 단백질은, 도입 세포에 있어서 유전자를 발현하는 기능을 유지하는 한 야생형이 아니어도 된다. 예를 들어 태그 등의 펩티드를 적절히 부가한 개변 단백질이나, 코돈을 개변한 단백질이나, 기능을 상실하지 않도록 야생형 단백질의 아미노산 서열의 일부를 결실시킨 단백질 등을 적절히 사용할 수 있다. 본원에 있어서, N, L, P 단백질에는, 그러한 개변 단백질이나 결실형 단백질도 포함된다. 예를 들어, P 단백질은 C 말단의 일부가 있으면, 그밖의 영역은 바이러스 벡터의 발현에 필수는 아니다.
바이러스 벡터는, 예를 들어 당해 바이러스의 (-)쇄 단일쇄 RNA 게놈에서 유래하는 RNA 및 당해 바이러스의 (-)쇄 단일쇄 RNA와 결합하는 바이러스 단백질에서 유래하고, 당해 RNA에 결합하는 단백질의 복합체이며, 세포에 도입함으로써 탑재 유전자를 발현하는 벡터이다. (-)쇄 단일쇄 RNA와 결합하는 단백질이란, 해당 (-)쇄 단일쇄 RNA와 직접 및/또는 간접으로 결합하여, 해당 (-)쇄 단일쇄 RNA와 복합체를 형성하는 단백질을 의미한다. 복합체에는, 마이너스쇄 RNA 바이러스에서 유래하는 (-)쇄 단일쇄 RNA 및 그것에 결합하는 마이너스쇄 RNA 바이러스에서 유래하는 단백질(예를 들어, NP, P 및 L 단백질)을 포함하는 복합체가 포함된다. 본원에 있어서, 「마이너스쇄 RNA 바이러스에서 유래한다」란, 마이너스쇄 RNA 바이러스의 구성물(단백질, RNA를 포함함)이 그대로의 상태에서, 또는 일부가 개변된 상태인 것을 의미한다. 예를 들어, 마이너스쇄 RNA 바이러스의 단백질 또는 RNA를 개변하여 조제된 단백질 또는 RNA는, 「마이너스쇄 RNA 바이러스에서 유래하는」 단백질 또는 RNA이다. 본원의 벡터는, 예를 들어 엔벨로프 단백질(F, HN 및 M 단백질) 등을 갖고, 바이러스 입자의 구조를 취하는 바이러스 벡터여도 된다. 또한, 바이러스 포락선을 갖지 않는, RNP 자체인 RNP 벡터여도 된다.
마이너스쇄 RNA 바이러스에 있어서 NP, P, L 단백질은, (-)쇄 단일쇄 RNA와 결합하여, 게놈 RNA 복제 및 단백질 발현에 불가결한 기능을 행한다(이하에 있어서, 경우에 따라, NP, P, L 단백질을, 「게놈 RNA 결합 단백질」이라고 칭함). NP 단백질은, 게놈 RNA와 매우 견고하게 결합하여, 게놈 RNA에 주형 활성을 부여하는 단백질이다. 게놈 RNA는, NP 단백질과의 결합 상태에 있어서만 RNA 합성의 주형 활성을 갖고, NP 단백질과 결합하지 않은 상태에서는 주형 활성은 전혀 갖지 않는다. P 단백질은 RNA 폴리메라아제의 소서브 유닛으로서, L 단백질은 RNA 폴리메라아제의 대서브 유닛으로서, 게놈 RNA에 결합한다. 그 때문에 마이너스쇄 RNA 바이러스에서는, NP, P, L 단백질 중 하나라도 부족하면, 게놈 RNA 복제는 일어나지 않는다.
본원의 벡터의 게놈 RNA에 포함되어 있는 유전자는, 바이러스 유래의 유전자 서열 그대로여도 되지만, 어떤 변이가 도입되어 있어도 된다. 예를 들어, 당업자라면 각 단백질의 기능을 손상시키지 않는 경미한 변이를, 공지 방법에 의해 게놈 RNA 상의 각 유전자에 도입할 수 있다. 예를 들어, PCR법이나 카세트 변이법 등에 의해 부위 특이적으로 변이를 도입하거나, 화학 시약이나 랜덤 뉴클레오티드 등에 의해 랜덤 변이를 도입하거나 하는 것이 가능하다.
예를 들어, 엔벨로프 단백질이나 스파이크 단백질에 있어서 약독화 변이나 온도 감수성 변이를 포함하는 다수의 변이가 알려져 있다. 이들 변이 단백질 유전자를 갖는 바이러스를 본원에 있어서 적합하게 사용할 수 있다. 본원에 있어서는, 바람직하게는 세포 상해성을 감약한 벡터를 사용할 수 있다. 벡터의 세포 상해성은, 예를 들어 벡터 감염 세포로부터의 유산 데히드로게나제(LDH)의 방출을 정량함으로써 측정할 수 있다. LDH 방출량이 적을수록 세포 상해성은 낮다. 예를 들어 세포 상해성이 야생형에 비해 유의미하게 감약화한 벡터를 사용할 수 있다. 세포 상해성의 감약화의 정도는, 예를 들어 인간 유래 HeLa 세포(ATCC CCL-2) 또는 원숭이 유래 CV-1 세포(ATCC CCL70)에 MOI(감염가) 3으로 감염시켜, 35 내지 37℃(예를 들어, 37℃)에서 3일간 배양한 배양액 중의 LDH 방출량이 야생형에 비해 유의미하게 저하된 것, 예를 들어 20％ 이상, 25％ 이상, 30％ 이상, 35％ 이상, 40％ 이상, 또는 50％ 이상 저하된 벡터를 사용할 수 있다. 또한 세포 상해성을 저하시키는 변이에는, 온도 감수성 변이도 포함된다.
저온(예를 들어, 30 내지 36.5℃)에 비해, 통상의 온도(예를 들어, 37 내지 38℃)에 있어서 유의미하게 활성이 저하되는 온도 감수성은, 바이러스 숙주의 통상의 온도에 있어서의 바이러스의 증식 속도 또는 탑재 유전자의 발현 레벨을 측정함으로써 결정할 수 있다. 변이를 갖지 않는 것에 비해, 바이러스의 증식 속도 및/또는 탑재 유전자의 발현 레벨이 저하될수록, 온도 감수성은 높다고 판단된다.
본원에 있어서 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 바람직하게는 적어도 하나, 보다 바람직하게는 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 바이러스 유전자에 결실 또는 변이를 갖는다. 결실과 변이는, 각 유전자에 대하여 임의로 조합하여 도입해도 된다. 여기서 변이란, 기능 저하형의 변이 또는 온도 감수성 변이여도 된다. 이러한 개변 바이러스 벡터를 사용하는 것은, 특히 숙주 세포에 있어서의 세포 상해성을 저감시키거나, 벡터의 제거를 촉진하거나 할 수 있는 점에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 있어서 적합하게 사용되는 바이러스 벡터는, 적어도 2개의 바이러스 유전자가, 결실 또는 변이되어 있다. 이러한 바이러스에는, 적어도 2개의 바이러스 유전자가 결실되어 있는 것, 적어도 2개의 바이러스 유전자가 변이되어 있는 것, 적어도 하나의 바이러스 유전자가 변이되어 있고 적어도 하나의 바이러스 유전자가 결실되어 있는 것이 포함된다. 변이 또는 결실되어 있는 적어도 2개의 바이러스 유전자는, 바람직하게는 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자이다. 예를 들어, 본원의 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터는, 적어도 F 유전자 또는 M 유전자를 결손하고 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, F 유전자를 결실하고, M 및/또는 HN 유전자를 더 결실하거나, M 및/또는 HN 유전자에 변이(예를 들어, 온도 감수성 변이)를 더 갖는 벡터는, 본원에 있어서 적합하게 사용된다. 또한, 본원에 있어서 사용되는 벡터는, 보다 바람직하게는, 적어도 3개의 바이러스 유전자(바람직하게는 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 적어도 3개의 유전자; F, HN 및 M)가, 결실 또는 변이되어 있다. 이러한 바이러스 벡터에는, 적어도 3개의 유전자가 결실되어 있는 것, 적어도 3개의 유전자가 변이되어 있는 것, 적어도 하나의 유전자가 변이되어 있고 적어도 2개의 유전자가 결실되어 있는 것, 적어도 2개의 유전자가 변이되어 있고 적어도 1개의 유전자가 결실되어 있는 것이 포함된다. 보다 바람직한 양태를 들면, 예를 들어 F 유전자를 결실하고, M 및 HN 유전자를 더 결실하거나, M 및 HN 유전자에 변이(예를 들어, 온도 감수성 변이)를 더 갖는 벡터는, 본원에 있어서 적합하게 사용된다. 또한 예를 들어 F 유전자를 결실하거나, M 혹은 HN 유전자를 더 결실하고, 남은 M 혹은 HN 유전자에 변이(예를 들어, 온도 감수성 변이)를 더 갖는 벡터는, 본원에 있어서 적합하게 사용된다. 이러한 변이형의 바이러스는, 공지의 방법에 준하여 제작하는 것이 가능하다.
예를 들어, M 유전자의 온도 감수성 변이로서는, 센다이 바이러스 M 단백질에 있어서의 69위(G69), 116위(T116) 및 183위(A183)로 이루어지는 군에서 임의로 선택되는 부위, 혹은 마이너스쇄 RNA 바이러스 M 단백질의 상당 부위의 아미노산 치환을 들 수 있다(Inoue, M. et al., J. Virol. 2003, 77: 3238-3246). M 단백질에 상기한 3개의 부위의 어느 것, 바람직하게는 임의의 2부위의 조합, 더욱 바람직하게는 3개의 부위 모든 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이 M 단백질을 코드하는 게놈을 갖는 바이러스는, 본원에 있어서 적합하게 사용된다.
아미노산 변이는, 측쇄의 화학적 성질이 상이한 다른 아미노산으로의 치환이 바람직하고, 예를 들어 BLOSUM62 매트릭스(Henikoff, S. and Henikoff, J. G.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)의 값이 3 이하, 바람직하게는 2 이하, 보다 바람직하게는 1 이하, 보다 바람직하게는 0의 아미노산으로 치환한다. 구체적으로는, 센다이 바이러스 M 단백질이면, G69, T116 및 A183을, 각각 Glu(E), Ala(A) 및 Ser(S)로 치환할 수 있다. 다른 마이너스쇄 RNA 바이러스 M 단백질에 대해서도, 상당 부위의 아미노산을 각각 Glu(E), Ala(A) 및 Ser(S)로 치환할 수 있다. 또한, 홍역 바이러스 온도 감수성주 P253-505(Morikawa, Y. et al., Kitasato Arch. Exp. Med. 1991: 64;15-30)의 M 단백질의 변이와 상동의 변이를 이용하는 것도 가능하다. 변이의 도입은, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 등을 사용하여, 공지의 변이 도입 방법에 따라 실시하면 된다.
본 명세서에 있어서, 센다이 바이러스의 아미노산 서열은, GenBank ACCESSION 번호: AB855655에 기재된 Z주 유래의 F 유전자 결손형 센다이 바이러스의 아미노산 서열을 기준으로 한다. 따라서, 센다이 바이러스의 X번째의 아미노산 잔기란, GenBank ACCESSION 번호: AB855655에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 X번째의 아미노산 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 의미한다. 본 명세서에 있어서, 어느 아미노산 서열의 소정의 위치에 「상당하는 위치」란, 어느 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열의 얼라인먼트에 있어서, 어느 아미노산 서열의 소정의 위치에 상당하는 다른 아미노산 서열의 위치를 의미한다. 얼라인먼트는, 예를 들어 공지의 유전자 해석 소프트웨어를 이용하여 실시할 수 있다. 구체적인 유전자 해석 소프트웨어로서는, 히타치 솔루션즈제의 DNASIS, 제네틱스제의 GENETYX, DDBJ가 공개하고 있는 FASTA, BLAST, ClustalW 등을 들 수 있다.
또한, HN 유전자의 온도 감수성 변이로서는, 예를 들어 센다이 바이러스의 HN 단백질의 262위(A262), 264위(G264) 및 461위(K461)로 이루어지는 군에서 임의로 선택되는 부위, 혹은 마이너스쇄 RNA 바이러스 HN 단백질의 상당 부위의 아미노산 치환을 들 수 있다(Inoue, M. et al., J. Virol. 2003, 77:3238-3246). 3개의 부위의 어느 하나, 바람직하게는 임의의 2부위의 조합, 더욱 바람직하게는 3개의 부위 전체의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이 HN 단백질을 코드하는 게놈을 갖는 바이러스는, 본원에 있어서 적합하게 사용된다. 상기와 마찬가지로, 아미노산의 치환은, 측쇄의 화학적 성질이 상이한 다른 아미노산으로의 치환이 바람직하다. 바람직한 일례를 들면, 센다이 바이러스 HN 단백질의 A262, G264 및 K461을, 각각 Thr(T), Arg(R) 및 Gly(G)로 치환한다. 다른 마이너스쇄 RNA 바이러스 HN 단백질에 대해서도, 상당 부위의 아미노산을 각각 Thr(T), Arg(R) 및 Gly(G)로 치환할 수 있다. 또한, 예를 들어 멈프스 바이러스의 온도 감수성 백신주 UrabeAM9를 참고로, HN 단백질의 464 및 468번째의 아미노산에 변이를 도입할 수도 있다(Wright, K. E. et al., Virus Res. 2000: 67;49-57).
또한 본원의 벡터는, P 유전자 및/또는 L 유전자에 변이를 갖고 있어도 된다. 이러한 변이로서는, 구체적으로는, SeV P 단백질의 86번째의 Glu(E86)의 변이, SeV P 단백질의 511번째의 Leu(L511)의 다른 아미노산으로의 치환을 들 수 있다. 다른 마이너스쇄 RNA 바이러스 P 단백질에 대해서도 상당 부위의 치환을 들 수 있다. 상기와 마찬가지로, 아미노산의 치환은, 측쇄의 화학적 성질이 상이한 다른 아미노산으로의 치환이 바람직하다. 구체적으로는, 86번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 511번째의 아미노산의 Phe로의 치환 등을 예시할 수 있다. 또한 L 단백질에 있어서는, SeV L 단백질의 1197번째의 Asn(N1197) 및/또는 1795번째의 Lys(K1795)의 다른 아미노산으로의 치환 및 그밖의 마이너스쇄 RNA 바이러스 L 단백질의 상당 부위의 치환을 들 수 있고, 상기와 마찬가지로, 아미노산의 치환은, 측쇄의 화학적 성질이 상이한 다른 아미노산으로의 치환이 바람직하다. 구체적으로는, 1197번째의 아미노산의 Ser로의 치환, 1795번째의 아미노산의 Glu로의 치환 등을 예시할 수 있다. P 유전자 및 L 유전자의 변이는, 지속 감염성, 2차 입자 방출의 억제, 또는 세포 상해성의 억제의 효과를 현저하게 높일 수 있다. 또한, 엔벨로프 단백질 유전자의 변이 및/또는 결손을 조합함으로써, 이들 효과를 극적으로 상승시킬 수 있다. 또한 L 유전자는, SeV L 단백질의 1214번째의 Tyr(Y1214) 및/또는 1602번째의 Met(M1602)의 다른 아미노산으로의 치환 및 그밖의 마이너스쇄 RNA 바이러스 L 단백질의 상당 부위의 치환을 들 수 있고, 상기와 마찬가지로, 아미노산의 치환은, 측쇄의 화학적 성질이 상이한 다른 아미노산으로의 치환이 바람직하다. 구체적으로는, 1214번째의 아미노산의 Phe로의 치환, 1602번째의 아미노산의 Leu로의 치환 등을 예시할 수 있다. 이상에 예시한 변이는, 임의로 조합할 수 있다.
예를 들어, SeV M 단백질의 적어도 69위의 G, 116위의 T 및 183위의 A, SeV HN 단백질의 적어도 262위의 A, 264위의 G 및 461위의 K, SeV P 단백질의 적어도 511위의 L, SeV L 단백질의 적어도 1197위의 N 및 1795위의 K가, 각각 다른 아미노산으로 치환되어 있고, 또한 F 유전자를 결손 또는 결실하는 센다이 바이러스 벡터, 그리고 세포 상해성이 이것들과 마찬가지 또는 그 이하, 및/또는 온도 감수성이 이것들과 마찬가지 또는 그 이상의 F 유전자 결손 또는 결실 센다이 바이러스 벡터는 특히 적합하다. 다른 마이너스쇄 RNA 바이러스에 대해서도, 상당 부위를 마찬가지로 치환하여, F 유전자를 결손 또는 결실하는 벡터, 그리고 세포 상해성이 이것들과 마찬가지 또는 그 이하, 및/또는 온도 감수성이 이것들과 마찬가지 또는 그 이상인 F 유전자 결손 또는 결실 벡터가 바람직하다. 구체적인 치환예를 예시하면, 예를 들어 M 단백질에 대해서는 G69E, T116A 및 A183S의 치환을, HN 단백질에 대해서는 A262T, G264R 및 K461G의 치환을, P 단백질에 대해서는 L511F의 치환을, 그리고 L 단백질에 대해서는 N1197S 및 K1795E의 치환을 들 수 있다.
아미노산 변이는, 원하는 다른 아미노산으로의 치환이어도 되지만, 바람직하게는 상기와 마찬가지로 측쇄의 화학적 성질이 상이한 아미노산으로의 치환이다. 예를 들어 아미노산은, 염기성 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 분지 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 등의 그룹으로 분류할 수 있지만, 어느 아미노산에 대하여, 그 아미노산이 속하는 그룹의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 것 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 염기성 아미노산이라면, 산성 또는 중성 아미노산으로의 치환, 극성 아미노산이라면 비극성 아미노산으로의 치환, 20종의 천연의 아미노산의 평균 분자량보다 큰 분자량을 갖는 아미노산이라면, 그 평균 분자량보다 작은 아미노산으로의 치환, 반대로 그 평균 분자량보다 작은 아미노산이라면, 그것보다 큰 아미노산으로의 치환 등을 들 수 있지만, 그것에 한정되지 않는다.
또한, L 단백질의 변이로서는, SeV L 단백질의 942위(Y942), 1361위(L1361) 및 1558위(L1558)로부터 임의로 선택되는 부위, 혹은 마이너스쇄 RNA 바이러스 L 단백질의 상당 부위의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환도 들 수 있다. 상기와 마찬가지로, 아미노산의 치환은, 측쇄의 화학적 성질이 상이한 다른 아미노산으로의 치환이 바람직하다. 구체적으로는, 942번째의 아미노산의 His로의 치환, 1361번째의 아미노산의 Cys로의 치환, 1558번째의 아미노산의 Ile로의 치환 등을 예시할 수 있다. 특히 적어도 942위 또는 1558위가 치환된 L 단백질을 적합하게 사용할 수 있다. 예를 들어, 1558위에 더하여, 1361위도 다른 아미노산으로 치환된 변이 L 단백질도 적합하다. 또한, 942위에 더하여, 1558위 및/또는 1361위도 다른 아미노산으로 치환된 변이 L 단백질도 적합하다. 이들 변이에 의해, L 단백질의 온도 감수성을 상승시킬 수 있다.
또한 P 단백질의 변이로서는, SeV P 단백질의 433위(D433), 434위(R434) 및 437위(K437)로부터 임의로 선택되는 부위, 혹은 마이너스쇄 RNA 바이러스 P 단백질의 상당 부위의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 들 수 있다. 상기와 마찬가지로, 아미노산의 치환은, 측쇄의 화학적 성질이 상이한 다른 아미노산으로의 치환이 바람직하다. 구체적으로는, 433번째의 아미노산의 Ala(A)로의 치환, 434번째의 아미노산의 Ala(A)로의 치환, 437번째의 아미노산의 Ala(A)로의 치환 등을 예시할 수 있다. 특히 이들 3개의 부위 모두가 치환된 P 단백질을 적합하게 사용할 수 있다. 이들 변이에 의해, P 단백질의 온도 감수성을 상승시킬 수 있다.
본원의 벡터에 포함될 수 있는 온도 감수성 변이는 WO2012/029770, WO2010/008054, WO2003/025570에 상세하게 설명되어 있다. 바람직하게는, P 단백질에 대해서는 적어도 433위의 D, 434위의 R 및 437위의 K의 3군데가, 다른 아미노산으로 치환된 변이 P 단백질이다. 또한, L 단백질에 대해서는 적어도 1558위의 L이 치환된 변이 L 단백질(바람직하게는 적어도 1361위의 L도 다른 아미노산으로 치환된 변이 L 단백질)을 코드하는, F 유전자를 결손 또는 결실하는 센다이 바이러스 벡터, 그리고 세포 상해성이 이것과 마찬가지 또는 그 이하, 및/또는 온도 감수성이 이것과 마찬가지 또는 그 이상의 F 유전자를 결손 또는 결실하는 센다이 바이러스 벡터도, 본원에 있어서 적합하게 사용된다. 각 바이러스 단백질은, 상기한 변이 이외에 다른 아미노산(예를 들어, 10 이내, 5 이내, 4 이내, 3 이내, 2 이내, 또는 1아미노산)에 변이를 갖고 있어도 된다. 상기에 나타낸 변이를 갖는 벡터는 높은 온도 감수성을 나타낸다.
본원의 벡터에 포함되는 게놈 RNA는, 엔벨로프 단백질 유전자를 모두 포함하고 있어도 되고, 일부 또는 전부의 엔벨로프 단백질 유전자를 포함하고 있지 않아도 된다. 게놈 RNA에 포함되는 엔벨로프 단백질 유전자(M 유전자, F 유전자, HN 유전자)는 야생형이어도 되지만, 온도 감수성 변이가 도입되어 있어도 된다. 엔벨로프 단백질의 온도 감수성 변이는, WO2012/029770, WO2010/008054, WO2003/025570에 상세하게 설명되어 있다.
바이러스 벡터를 제조할 때, 원하는 외래성 엔벨로프 단백질을 바이러스 산생 세포로 발현시킴으로써, 이것을 포함하는 바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 이러한 단백질에 특별히 제한은 없고, 포유 동물 세포로의 감염능을 부여하는 원하는 접착 인자, 리간드, 수용체 등의 단백질이 사용된다. 구체적으로는, 예를 들어 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus; VSV)의 G 단백질(VSV-G)을 들 수 있다. VSV-G 단백질은, 임의의 VSV주에서 유래하는 것이어도 되고, 예를 들어 Indiana 혈청형주(J. Virology39: 519-528(1981)) 유래의 VSV-G 단백을 사용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 본원의 바이러스 벡터는, 다른 바이러스 유래의 엔벨로프 단백질을 임의로 조합하여 포함할 수 있다.
본원에 있어서 온도 감수성이란, 배양 온도에 따라 활성이 변화되는 것을 의미한다. 예를 들어 발현 벡터의 경우, 온도 감수성 벡터란, 배양 온도에 따라 발현량이 바뀌는 벡터이며, 30 내지 36.5℃의 범위 내의 있는 온도에서의 발현량이, 이러한 온도보다 0.5 내지 5℃, 바람직하게는 1 내지 4℃, 예를 들어 약 3℃ 높은 온도에서의 발현량보다 유의미하게 높은 것이 적합하게 사용된다. 예를 들어 WO2012/029770, WO2010/008054에 상세히 기술된 센다이 바이러스 TS7(M 단백질의 G69E/T116A/A183S 변이, HN 단백질의 A262T/G264R/K461G 변이, P 단백질의 L511F 변이 및 L 단백질의 N1197S/K1795E 변이(이상을 「TS 변이」라고 함)에 더하여, L 단백질의 Y942H/L1361C/L1558I 변이), TS12(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이), TS13(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이 및 L 단백질의 L1558I 변이), TS14(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이 및 L 단백질의 L1361C), TS15(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이 및 L 단백질의 L1361C/L1558I) 등의 변이는, 바람직한 온도 감수성 변이이다.
구체적인 벡터를 예시하면, 예를 들어 TS7 변이, TS12 변이, TS13 변이, TS14 변이, 또는 TS15 변이를 갖는 F 유전자 결실형 센다이 바이러스 벡터(예를 들어, Zstrain)일 수 있다. 구체적으로는, SeV18+/TSΔF(WO2010/008054, WO2003/025570)나 SeV(PM)/TSΔF에 있어서, TS 변이에 더하여 TS7, TS12, TS13, TS14 또는 TS15의 변이를 도입한 벡터 등을 더 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
또한 「TSΔF」는, M 단백질에 G69E, T116A 및 A183S의 변이를, HN 단백질에 A262T, G264R 및 K461G의 변이를, P 단백질에 L511F 변이를, 그리고 L 단백질에 N1197S 및 K1795E 변이를 갖고, F 유전자를 결실하는 것을 의미한다.
바람직하게는, 본원의 벡터는 센다이 바이러스 Z주에서 유래하는 센다이 바이러스 벡터이다. Z주의 게놈 서열은 알려져 있고, 예를 들어 Z주 유래의 F 유전자 결손형 센다이 바이러스 벡터의 게놈 서열로서는 ACCESSION: AB855655를 들 수 있다. 여기서 Z주에서 유래한다는 것은, 벡터의 게놈 중에 있는 센다이 바이러스 게놈의 서열 중, Z주의 서열이 가장 높은 비율을 차지하는 것을 의미한다. 즉, 벡터의 게놈 서열 중, 비센다이 바이러스성의 서열(제한 효소 인식 부위나 단순한 스페이서 서열, 다른 종의 바이러스 유래의 서열, 도입하는 유전자의 서열 등)을 제외하고, 센다이 바이러스의 서열만을 모은 경우에, 그 중에서 SeV Z주의 서열이 가장 높은 비율을 차지하는 것을 말한다. 보다 바람직하게는, Z주에서 유래한다는 것은, 벡터의 게놈 중에 있는 마이너스쇄 RNA 바이러스 유래의 서열 중, SeV Z주의 서열이 가장 높은 비율을 차지하는 것을 말한다. 즉, 벡터의 게놈 서열 중, 마이너스쇄 RNA 바이러스로부터 취한 서열이 아닌 서열(제한 효소 인식 부위나 단순한 스페이서 서열, 마이너스쇄 RNA 바이러스 이외의 바이러스 유래의 서열, 도입하는 유전자의 서열 등)을 제외하고, 마이너스쇄 RNA 바이러스의 서열만을 모은 경우에, 그 중에서 SeVZ주의 서열이 가장 높은 비율을 차지하는 것을 말한다. 그 비율은, 바람직하게는 30％ 이상, 보다 바람직하게는 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상이다. 또한 바람직하게는, Z주에서 유래하는 센다이 바이러스 벡터는, Z주가 아닌 센다이 바이러스의 게놈 서열(Z주와 동일한 서열을 제외함)을, 연속해서, 예를 들어 1000염기 이하, 500염기 이하, 300염기 이하, 200염기 이하, 100염기 이하, 50염기 이하, 30염기 이하, 또는 20염기 이하밖에 게놈 중에 포함하지 않는다. 보다 바람직하게는, Z주에서 유래하는 센다이 바이러스 벡터는, Z주가 아닌 센다이 바이러스의 게놈 서열(Z주와 동일한 서열을 제외함)을 게놈 중에 포함하지 않는다.
본원의 벡터의 제조는, 공지의 방법을 이용하여 행하면 된다. 예를 들어, 마이너스쇄 RNA 바이러스의 경우, 구체적인 수순으로 하고, 전형적으로는, (a) 마이너스쇄 RNA 바이러스 게놈 RNA(마이너스쇄) 또는 그 상보쇄(플러스쇄)를 코드하는 cDNA를, 바이러스 입자 형성에 필요한 바이러스 단백질(NP, P 및 L)을 발현하는 세포로 전사시키는 공정, (b) 생성한 바이러스를 회수하는 공정에 의해 제조할 수 있다. 바이러스로서는 감염성 입자에 한정되지 않고, 세포에 도입함으로써 유전자를 발현하는 능력을 유지하고 있는 한, 비감염성 입자나 RNP 등도 포함된다. 바이러스의 형성에 필요한 바이러스 단백질은, 전사시킨 바이러스 게놈 RNA로부터 발현되어도 되고, 게놈 RNA 이외로부터 공급되어도 된다. 예를 들어, NP, P 및 L 단백질을 코드하는 발현 플라스미드를 세포에 도입하여 공급할 수 있다. 게놈 RNA에 있어서 바이러스의 형성에 필요한 바이러스 유전자가 결손되어 있는 경우는, 그 바이러스 유전자를 바이러스 산생 세포로 별도 발현시켜, 바이러스 형성을 상보할 수도 있다. 바이러스 단백질이나 RNA 게놈을 세포 내에서 발현시키기 위해서는, 해당 단백질이나 게놈 RNA를 코드하는 DNA를 숙주 세포에서 기능하는 적당한 프로모터의 하류에 연결한 벡터를 숙주 세포에 도입한다. 전사된 게놈 RNA는, 바이러스 단백질의 존재 하에서 복제되어 비리온이 형성된다. 엔벨로프 단백질 등의 유전자를 결손하는 결손형 바이러스를 제조하는 경우는, 결손되는 단백질 또는 그 기능을 상보할 수 있는 다른 바이러스 단백질 등을 바이러스 산생 세포에 있어서 발현시킬 수도 있다. 본원에 있어서는, 적어도 F 유전자를 결실한 벡터 또는 F 유전자에 변이를 갖는 벡터를 적합하게 사용할 수 있다.
본원의 벡터에 포함되는 게놈 RNA(포지티브쇄 또는 네거티브쇄)를, NP, P 및 L 단백질의 존재 하에서 전사시킴으로써, 본원의 RNP를 제조할 수 있다. RNP의 형성은, 예를 들어 BHK-21 또는 LLC-MK2 세포 등으로 행하게 할 수 있다. NP, P 및 L 단백질의 공급은, 바이러스 벡터에 의해 공급되어도 되고, 그 이외에도 다양한 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들어, 상술한 바와 같이 각 유전자를 포함하는 발현 벡터를 세포에 도입함으로써 행해질 수 있다. 또한, 각 유전자는 숙주 세포의 염색체에 내장되어 있어도 된다. RNP를 형성시키기 위해 발현시키는 NP, P 및 L 유전자는, 벡터의 게놈에 코드되는 NP, P 및 L 유전자와 완전히 동일할 필요는 없다. 즉, 이들 유전자가 코드하는 단백질의 아미노산 서열은, RNP 게놈이 코드하는 단백질의 아미노산 서열 그대로가 아니어도 되고, 게놈 RNA와 결합하여, 세포 내에서 게놈으로의 전사 복제 활성을 갖는 한, 변이를 도입해도 되고, 혹은 다른 바이러스의 상동 유전자로 대용해도 된다. 또한, 야생형 단백질(야생형 NP, P, 및/또는 L 단백질)을 발현시켜도 된다.
예를 들어, 본원의 마이너스쇄 RNA 바이러스의 제조는, 이하의 종래의 방법을 이용하여 실시할 수 있다(WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570; WO2005/071092; WO2006/137517; WO2007/083644; WO2008/007581; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16:578-587 및 Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14:6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38, Li, H. -O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569). 또한 바이러스의 증식 방법 및 재조합 바이러스의 제조 방법에 대해서는, 바이러스학 실험학 각론, 개정 2판(국립 예방 위생 연구소 학우회편, 마루젠, 1982)도 참조.
[초기화 인자]
본원에 있어서 초기화 인자란, 단독으로 또는 복수의 인자와 공동하여, 어느 세포의 분화 상태를 더 미분화하는 상태로 유도하기 위해 사용되는 유전자 또는 그 산물을 말하고, 예를 들어 분화된 세포의 탈분화를 유도하기 위해 사용되는 유전자 또는 그 산물이 포함된다. 본원에 있어서 초기화 인자에는, 핵의 초기화에 필수적인 인자 및 핵 초기화의 효율을 상승시키는 보조적인 인자(보조 인자)가 포함된다. 본원에 있어서는, 핵 초기화에 사용하기 위한 원하는 유전자를 벡터에 탑재해도 된다. 예를 들어, 다능성 줄기 세포의 제조에 사용하기 위한 유전자를 탑재할 수 있다. 다능성 줄기 세포를 유도하기 위한 초기화 인자로서는, 구체적으로는, 예를 들어 ES 세포나 초기 배 등에서 발현되지만, 분화된 많은 체세포에서는 발현되지 않거나, 발현이 저하되는 유전자(ES 세포 특이적 유전자 등)를 사용할 수 있다. 이러한 유전자는, 바람직하게는 전사 인자나 핵단백질 등을 코드하는 유전자이다. 핵 초기화 유전자를 동정하는 방법은 이미 알려져 있고(WO2005/80598), 실제, 이 방법을 사용하여 동정된 유전자는, 다능성 줄기 세포로의 초기화(reprogramming)에 유용한 것이 나타나 있다(WO2007/69666).
그러한 유전자의 예를 들면, DPPA5(발달 다능성 관련(developmental pluripotency associated) 5, ES 세포 특이적 유전자(ES cell specific gene) 1(ESG1); accession numbers NM_001025290, NM_025274, XM_236761), F-box 단백질 15(Fbx15, NM_152676, NM_015798), Nanog(NM_024865, AB093574), ECAT1(ES 셀 관련 전사(ES cell associated transcript) 1; AB211062, AB211060), ERAS(EScell expressed Ras; NM_181532, NM_181548), DNMT3L(DNA(시토신-5-)-메틸트랜스퍼라아제 3-형; NM_013369, NM_019448), ECAT8(AB211063, AB211061), GDF3(성장 분화 인자(growth differentiation factor) 3; NM_020634, NM_008108), SOX15(SRY(성 결정 부위(sex determining region) Y)-box 15; NM_006942, NM_009235), DPPA4(발달 다능성 관련(developmental pluripotency associated) 4; NM_018189, NM_028610), DPPA2(NM_138815, NM_028615), FTHL17(페리틴, 중 폴리펩타이드형(heavy polypeptide-like) 17; NM_031894, NM_031261), SALL4(sal-like 4; NM_020436, NM_175303), Oct3/4(POU5F1이라고도 불리는; NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178), Sox2(NM_003106, NM_011443, XM_574919), Rex-1(ZFP42(아연 손가락 단백질(zinc fingerprotein) 42 homolog); NM_174900, NM_009556), Utf1(미분화 배아 세포 전사 인자(undifferentiated embryonic cell transcription factor) 1; NM _003577, NM_009482), TCL1A(T-세포 백혈병/림프종 1A; NM_021966, NM_009337), DPPA3(Stella라고도 불리는, NM_199286, NM_139218, XM_216263), KLF4(크루펠형 인자(Kruppel-like factor) 4; NM_004235, NM_010637), 카테닌(catenin)β1(카데린 관련 단백질 베타(cadherin-associated protein beta) 1; NM_001904, NM_007614; S33Y 변이체를 포함함), c-Myc(NM_002467, NM_010849; T58A 변이체를 포함함), STAT3(signal transducer and activator of transcription 3; NM_139276, NM_213659), GRB2(성장 입자 수용체-결합 단백질(growth factor receptor-bound protein) 2; NM_002086, NM_008163), 그리고 이들 유전자가 속하는 패밀리의 다른 멤버의 유전자 등을 들 수 있다. 이들 유전자는, 세포에 도입함으로써 다능성 줄기 세포를 유도할 수 있는 것이 나타나 있다(WO2007/69666). 이들 유전자는, 1개씩 별도의 벡터에 내장해도 되고, 복수의 유전자를 통합하여 1개의 벡터에 내장할 수도 있다. 또한, 각각의 유전자를 1종류의 벡터에 내장해도 되고, 혹은 다른 종류의 벡터(염색체 내장형 바이러스 벡터 및/또는 비바이러스 벡터를 포함함)를, 염색체 비내장형 바이러스 벡터와 조합하여 사용해도 된다. 또한, 본원의 초기화된 세포의 제조 방법은, 모든 유전자 도입을 바이러스 벡터를 사용하여 행하는 방법에 한정되지 않는다. 즉 본원의 방법은, 적어도 하나의 염색체 비내장형 바이러스 벡터를 사용하면 되고, 초기화 인자를 발현하는 다른 벡터(염색체 내장형 바이러스 벡터 및/또는 비바이러스 벡터) 및/또는 초기화를 유도하는 화합물 등을 병용하는 것이 포함된다.
여기서 초기화는, 예를 들어 분화된 세포로부터의 다능성 줄기 세포의 유도여도 된다. 벡터는, 초기화를 위한 인자를 코드하는 유전자를 조합하여 사용된다. 초기화 인자로서는, 예를 들어 상기, 혹은 이하에 예시한 어느 유전자를 들 수 있다.
세포의 초기화를 유도하기 위해 특히 바람직한 유전자를 예시하면, F-box protein 15(Fbx15, NM_152676, NM_015798), Nanog(NM_024865, AB093574), ERAS(ES cell expressed Ras; NM_181532, NM_181548), DPPA2(NM_138815, NM_028615), Oct3/4(POU5F1이라고도 불리는; NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178), Sox2(NM_003106, NM_011443, XM_574919), TCL1A(T-세포 백혈병/림프종 1A; NM_021966, NM_009337), KLF4(크루펠형 인자 4; NM_004235, NM_010637), 카테닌β1(카데린 관련 단백질 베타 1; NM_001904, NM_007614; S33Y 변이체를 포함함) 및 c-Myc(NM_002467, NM_010849; T58A 변이체를 포함함), 그리고 이들 유전자가 속하는 패밀리의 다른 멤버의 유전자 등을 들 수 있다. 개개의 바이러스 벡터는, 사용 시에 조합하여 사용할 수 있다.
특히 바람직한 유전자의 조합의 하나는, Sox 유전자, KLF 유전자, Myc 유전자 및 Oct 유전자의 4종류의 유전자를 적어도 포함하는 조합이다(Takahashi, K. and Yamanaka S., Cell 126, 663-676, 2006; Lowry WE et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8): 2883-8, 2008; Masaki, H. et al., Stem Cell Res. 1: 105-115, 2008; WO2007/69666). 여기서 Sox 단백질, KLF 단백질, Myc 단백질 및 Oct 단백질, 그리고 그것들의 유전자란, 각각 Sox 패밀리, KLF 패밀리, Myc 패밀리 및 Oct 패밀리에 속하는 멤버의 단백질 및 유전자를 말한다. 이들 4개의 패밀리의 멤버를 각각 1개 이상 발현하도록 조정하면 된다. 예를 들어 Sox 패밀리의 유전자에 대해서는, Sox1, Sox2, Sox3, Sox15, Sox17의 어느 유전자를 사용해도 된다. 또한 KLF 패밀리에 대해서는, KLF4 또는 KLF2를 사용하면 된다. Myc 패밀리에 대해서는, 야생형 c-Myc뿐만 아니라, T58A 변이체나, N-Myc, L-Myc를 사용할 수 있다. 이와 같이, 패밀리의 유전자를 다양하게 선택하여 사용하는 것이 가능하므로, 상기한 4종의 패밀리 유전자를 적절히 선택하여, 초기화를 유도할 수 있다.
예를 들어, 야생형 c-Myc는 센다이 바이러스 벡터 등의 RNA 바이러스 벡터로부터의 발현량이 적은 것이 판명되어 있다. 그러나 야생형 c-Myc에, a378g, t1122c, t1125c, a1191g 및 a1194g에서 선택되는 1개 이상, 바람직하게는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5개의 모든 변이를 도입함으로써, 벡터로부터 유전자를 안정적으로 고발현시키는 것이 가능해진다. 유전자의 벡터 중의 삽입 위치는 원하는 부위를 선택할 수 있다.
예를 들어, Myc 유전자는, 마이너스쇄 RNA 게놈의 후방(5'측), 즉 게놈 상에 배치되는 복수의 단백질 코드 서열에 있어서, 3'측으로부터 카운트하는 것보다도 5'측으로부터 카운트한 쪽이 더 빠른 위치에 배치해도 된다. Myc 유전자는, 예를 들어 가장 5'측(즉, 5'측으로부터 1번째), 혹은 5'측으로부터 2 또는 3번째에 배치할 수 있다. Myc 유전자는, 예를 들어 게놈의 5'측으로부터 2번째, 구체적으로는, 게놈의 가장 5'측에 L 유전자가 있고, 그 다음에 HN 유전자가 있는 경우에, 그 사이에 배치해도 된다. Myc 유전자는, 코드되는 아미노산 서열을 바꾸지 않도록 적절히 사일런트 변이를 도입하여, 연속한 A 또는 T의 염기 서열을 치환할 수 있다.
Myc 유전자를 마이너스쇄 RNA 게놈의 후방(5'측)에 배치한 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터는, 다른 초기화 인자를 포함하는 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터와 조합하여 사용할 수 있다. 이 경우, 다른 초기화 인자를 포함하는 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터에 있어서는, 그것들의 초기화 인자는, 각각의 벡터의 마이너스쇄 RNA 게놈에 있어서 전방(3'측), 즉 게놈 상에 배치되는 복수의 단백질 코드 서열에 있어서, 5'측으로부터 카운트하는 것보다도 3'측으로부터 카운트한 쪽을 더 빠른 위치에 배치할 수 있다. 예를 들어 가장 3'측(즉, 3'측으로부터 1번째), 혹은 3'측으로부터 2 또는 3번째에 배치해도 된다. 예를 들어, Myc 이외의 초기화 인자(예를 들어, Oct 유전자, Klf 유전자 및 Sox 유전자)는, 각각의 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터에 있어서, 게놈의 3'측으로부터 1번째 또는 2번째, 보다 바람직하게는 1번째에 배치된다. 구체적으로는, 게놈의 NP 유전자의 3'측의, 가장 3' 단측에 초기화 인자를 배치할 수 있다.
구체적으로는, KLF 패밀리로서는, Klf1(NM_006563, NM_010635), Klf2(NM_016270, NM_008452), Klf4(NM_004235, NM_010637), Klf5(NM_001730, NM_009769)가 포함되고, Myc 패밀리로서는, c-Myc(NM_002467, NM_010849, T58A 변이체를 포함함), NMyc(NM_005378, NM_008709), L-Myc(NM_005376, NM_005806)가 포함되고, Oct 패밀리로서는, Oct1A(NM_002697, NM_198934), Oct3/4(NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178), Oct6(NM_002699, NM_011141)이 포함되고, Sox 패밀리로서는, Sox1(NM_005986, NM_009233), Sox2(NM_003106, NM_011443, XM_574919), Sox3(NM_005634, NM_009237), Sox7(NM_031439, NM_011446), Sox15(NM_006942, NM_009235), Sox17(NM_022454, NM_011441), Sox18(NM_018419, NM_009236)이 포함된다. 이들 유전자의 어느 것을 탑재하는 염색체 비내장형 바이러스 벡터는, 본원에 있어서 세포의 탈분화의 유도에 사용하기 위해 유용하다.
Sox 유전자, KLF 유전자 및 Oct 유전자의 각 유전자의 어느 것, 혹은 Sox 유전자, Myc 유전자 및 Oct 유전자의 각 유전자의 어느 것, 혹은 Sox 유전자, Myc 유전자 및 Klf 유전자의 조합을 탑재하는 1개 이상의 바이러스 벡터는, 본원에 있어서 세포의 초기화 유도에 사용하기 위해 유용하다. Myc 유전자를 발현시키지 않는 경우는, 그 대신에 예를 들어 p53 siRNA 및 UTF1을 사용해도 된다. 각각의 유전자를 포함하는 바이러스 벡터는 따로따로 단체로서 준비되어도 된다. 그것들은, 사용 시에 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 원래의 분화된 세포에 있어서, 상기한 유전자 중 하나 또는 몇 가지가, 예를 들어 내재적으로 이미 발현되어 있는 경우는, 그 유전자의 도입을 생략할 수 있다. 초기화 인자를 포함하는 바이러스 벡터는, 적절히, 필요한 것만을 사용해도 된다. 또한, 내재성의 초기화 인자의 내재성의 발현이, 별도의 유전자의 발현 또는 화합물 처리 등에 의해 유도되는 것이라면, 당해 별도의 유전자를 발현하는 벡터의 도입이나 화합물 처리를 조합하여, 그것만으로는 유도할 수 없는 초기화 인자를 포함하는 바이러스 벡터만을 도입해도 된다. 본원에 있어서, 적어도 Oct 유전자, Klf 유전자 및 Sox 유전자의 3종, 적어도 Oct 유전자, Klf 유전자, Sox 유전자 및 Myc 유전자의 4종, 혹은 적어도 Oct 유전자, Sox 유전자, Nanog 유전자, Lin28 유전자의 4종이 내재성 또는 외래성으로 발현되도록 벡터를 조합하는 것은, 예를 들어 어느 초기화 인자가 자연의 상태에서 내재성으로 발현하고 있는 상태뿐만 아니라, 다른 유전자를 발현하는 벡터의 도입이나 화합물, 단백질 처리 등에 의해, 내재성의 초기화 인자의 발현을 유도할 수 있는 경우에, 그 처리를 조합하고, 부족한 인자만을 외래적으로 발현하도록 바이러스 벡터를 조합하는 경우를 포함한다.
또한, 상기 4종류 또는 3종류의 조합 이외에, Oct 유전자, Sox 유전자, NANOG 유전자(NM_024865, AB093574) 및 LIN28 유전자(NM_024674)의 4종류의 각 유전자를 포함하는 조합도 유용하다. 또한, 이들 Myc 유전자 및 KLF 유전자를 더 조합한 것도 적합하다. 이들 어느 유전자를 탑재하는 바이러스 벡터는, 본원에 있어서 세포의 탈분화 유도에 사용하기 위해 유용하다. 이들 유전자의 임의의 조합(또는 모두)을 포함하는, 1개 이상의 바이러스 벡터도, 세포의 초기화에 있어서 적합하게 사용할 수 있다. 또한 상기와 마찬가지로, 대상으로 하는 세포가 이미 이들 유전자 중 일부를 발현하고 있는 경우에는, 그 유전자를 발현하는 벡터는 도입해도 되고 하지 않아도 된다.
이상에 기재한 유전자의 조합에, 또 다른 유전자를 조합하여, 초기화의 유도 효율을 상승시킬 수도 있다. 이러한 유전자로서는, TERT(NM_198253, NM_009354) 및/또는 SV40 large Tantigen(NC_001669.1, Fiers, W.(05-11-1978) Nature 273: (5658)113-120)을 들 수 있다. 또한, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil(NM_005180, NM_007552)로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 유전자를 더 조합해도 된다. 또한, Fbx15(Mol Cell Biol. 23(8): 2699-708, 2003), Nanog(Cell 113: 631-642, 2003), ERas(Nature 423, 541-545, 2003), DPPA2(Development 130: 1673-1680, 2003), TCL1A(Development 130: 1673-1680, 2003), β-Catenin(Nat Med 10(1): 55-63, 2004)로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 또는 임의의 조합을 발현시켜도 된다. 또한, ECAT1(AB211062, AB211060), DPPA5(NM_001025290, NM_025274, XM_236761), DNMT3L(NM_013369, NM_019448), ECAT8(AB211063, AB211061), GDF3(NM_020634, NM_008108), SOX15(NM_006942, NM_009235), DPPA4(NM_018189, NM_028610), FTHL17(NM_031894, NM_031261), SALL4(NM_020436, NM_175303), Rex-1(NM_174900, NM_009556), Utf1(NM_003577, NM_009482), DPPA3(NM_199286, NM_139218, XM_216263), STAT3(NM_139276, NM_213659) 및 GRB2(NM_002086, NM_008163)로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 유전자를 조합해도 된다. 이들 인자도, 본원에 있어서의 염색체 비내장형 바이러스 벡터를 사용하여 발현시킬 수 있다.
또한, 도입하는 인자는, 초기화하고자 하는 세포의 유래에 맞추어 적절히 선택하면 되고, 인간 유래여도 되고, 그밖의 포유 동물 유래, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 원숭이 등의 영장류 유래여도 되지만, 바람직하게는 인간 유래이다. 또한, 유전자 및 단백질의 서열은 반드시 야생형의 서열이 아니어도 되고, 초기화를 유도할 수 있는 한, 어떤 변이를 갖고 있어도 된다. 예를 들어, 1 또는 소수(예를 들어, 수개, 3개 이내, 5개 이내, 10개 이내, 15개 이내, 20개 이내, 25개 이내)의 아미노산이 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 코드하는 유전자이며, 초기화를 유도할 수 있는 유전자는, 본원에 있어서 사용할 수 있다. 또한 생물학적 활성(초기화의 유도능)을 유지하고 있는 한, 예를 들어 N 말단 및/또는 C 말단의 1 내지 수 잔기(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15 또는 20잔기)의 아미노산이 결실 또는 부가된 폴리펩티드 및 1 내지 수 잔기(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15 또는 20잔기)의 아미노산이 치환된 폴리펩티드 등도 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 밸리언트로서는, 예를 들어 천연의 단백질의 단편, 아날로그, 파생체 및 다른 폴리펩티드와의 융합 단백질(예를 들어, 이종 시그널 펩티드 또는 항체 단편을 부가한 것 등)이 포함된다. 구체적으로는, 야생형의 아미노산 서열의 1 또는 그 이상의 아미노산을 치환, 결실, 및/또는 부가한 서열을 포함하고, 야생형 단백질과 동등한 생물학적 활성(예를 들어, 초기화를 유도하는 활성)을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 야생형 단백질의 단편을 사용하는 경우는, 통상, 야생형 폴리펩티드(분비 단백질의 경우는 성숙형의 형태)의 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 95％ 이상, 또는 98％ 이상의 연속 영역을 포함한다.
아미노산 서열의 밸리언트는, 예를 들어 천연의 폴리펩티드를 코드하는 DNA에 변이를 도입함으로써 조제할 수 있다(Walker and Gaastra, eds. Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York, 1983); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492, 1985; Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y.), 1989; U. S. Pat. No.4,873,192). 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 아미노산을 치환하기 위한 가이던스로서는, 예를 들어 Dayhoff 외(Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.), 1978)를 들 수 있다.
개변되는 아미노산수에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 천연의 성숙형 폴리펩티드의 전 아미노산의 30％ 이내, 바람직하게는 25％ 이내, 보다 바람직하게는 20％ 이내, 보다 바람직하게는 15％ 이내, 보다 바람직하게는 10％ 이내, 5％ 이내, 또는 3％ 이내이고, 예를 들어 15아미노산 이내, 바람직하게는 10아미노산 이내, 보다 바람직하게는 8아미노산 이내, 보다 바람직하게는 5아미노산 이내, 보다 바람직하게는 3아미노산 이내이다. 아미노산을 치환하는 경우는, 측쇄의 성질이 유사한 아미노산으로 치환함으로써 단백질의 활성을 유지하는 것을 기대할 수 있다. 이러한 치환은, 본원에 있어서 보존적 치환이라고 한다. 보존적 치환은, 예를 들어 염기성 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 분지 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 등의 각 그룹 내의 아미노산 사이의 치환 등을 들 수 있다. 또한, 예를 들어 BLOSUM62 치환 매트릭스(S. Henikoff and J. G. Henikoff, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992)에 있어서, 양의 값의 관계에 있는 아미노산 사이의 치환을 들 수 있다.
개변된 단백질은, 야생형 단백질의 아미노산 서열과 높은 호몰로지를 나타낸다. 높은 호몰로지란, 예를 들어 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 93％ 이상, 95％ 이상, 또는 96％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 아미노산 서열의 동일성은, 예를 들어 BLASTP 프로그램(Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어 NCBI(National Center for Biothchnology Information)의 BLAST의 웹페이지에 있어서, 디폴트의 파라미터를 사용하여 검색을 행할 수 있다(Altschul S. F. et al., Nature Genet. 3: 266-272, 1993; Madden, T. L. et al., Meth. Enzymol. 266: 131-141, 1996; Altschul S. F. et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997; Zhang J. & Madden T. L., Genome Res. 7: 649-656, 1997). 예를 들어 2개의 서열의 비교를 행하는 blast2sequences 프로그램(Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250, 1999)에 의해, 2서열의 얼라인먼트를 작성하여, 서열의 동일성을 결정할 수 있다. 갭은 미스매치와 마찬가지로 취급하여, 예를 들어 천연형 사이토카인(분비 후의 성숙형의 형태)의 아미노산 서열 전체에 대한 동일성의 값을 계산한다. 구체적으로는, 야생형 단백질(분비 단백질의 경우는 성숙형)의 전 아미노산수에 있어서의 일치하는 아미노산수의 비율을 계산한다.
또한 유전자는, 코드되는 아미노산 서열을 바꾸지 않도록 사일런트 변이를 도입할 수 있다. 특히 AT rich한 유전자에 있어서는, 5개 이상의 연속한 A 또는 T의 염기에 대하여, 코드되는 아미노산 서열을 바꾸지 않도록 G 또는 C로 치환함으로써, 안정적으로 유전자의 고발현을 얻을 수 있다.
또한 개변 단백질 혹은 초기화에 사용하는 단백질은, 야생형 단백질을 코드하는 유전자의 코드 영역의 일부 또는 전부와 엄격한 조건에서 하이브리다이즈하는 핵산이 코드되는 단백질이며, 야생형 단백질과 동등한 활성(초기화를 유도하는 활성)을 갖는 단백질을 들 수 있다. 하이브리다이제이션에 있어서는, 예를 들어 야생형 단백질 유전자의 코드 영역의 서열 또는 그 상보 서열을 포함하는 핵산 또는 하이브리다이즈의 대상으로 하는 핵산의 어느 쪽으로부터 프로브를 조제하고, 그것이 다른 쪽의 핵산에 하이브리다이즈하는지를 검출함으로써 동정할 수 있다. 엄격한 하이브리다이제이션의 조건은, 예를 들어 5xSSC, 7％(W/V) SDS, 100㎍/ml 변성 연어 정자 DNA, 5x 덴하르트액(1x 덴하르트 용액은 0.2％ 폴리비닐피롤리돈, 0.2％ 소혈청 알부민 및 0.2％ 피콜을 포함함)을 포함하는 용액 중, 60℃, 바람직하게는 65℃, 보다 바람직하게는 68℃에서 하이브리다이제이션을 행하고, 그 후 하이브리다이제이션과 동일한 온도에서 2xSSC 중, 바람직하게는 1xSSC 중, 보다 바람직하게는 0.5xSSC 중, 보다 바람직하게는 0.1xSSC 중에서, 진탕하면서 2시간 세정하는 조건이다.
[나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 제조 방법]
본원은, 하기 공정 (1) 내지 (3)을 포함하는, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법을 제공한다;
(1) 인간 체세포에, 초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터를 도입하는 공정,
(2) 상기 체세포를 나이브용 배지의 존재 하에서 배양하는 공정 및
(3) 공정 (2) 후, 얻어진 세포를 나이브용 배지의 존재 하, 상기 체세포당의 상기 벡터양이 공정 3 개시 시에 비해 30％ 이하로 감소하는 조건 하에서 배양하는 공정.
본 개시에 있어서, 체세포로서는, 특별히 한정되지 않고, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 각질화하는 상피 세포(예, 각질화 표피 세포), 점막 상피 세포(예, 혀 표층의 상피 세포), 외분비선 상피 세포(예, 유선 세포), 호르몬 분비 세포(예, 부신수질 세포), 대사·저장용의 세포(예, 간세포), 경계면을 구성하는 내강 상피 세포(예, I형 폐포 세포), 내쇄관의 내강 상피 세포(예, 혈관 내피 세포), 운반능을 갖는 섬모가 있는 세포(예, 기도 상피 세포), 세포 외 매트릭스 분비용 세포(예, 섬유아세포), 수축성 세포(예, 평활근 세포), 혈액과 면역계의 세포(예, 말초혈 단핵구, 제대혈, T림프구), 감각에 관한 세포(예, 간 세포), 자율 신경계 뉴런(예, 콜린 작동성 뉴런), 감각 기관과 말초 뉴런의 지지 세포(예, 수반 세포), 중추 신경계의 신경 세포와 글리아 세포(예, 성상 글리아 세포), 색소 세포(예, 망막 색소 상피 세포) 및 그것들의 전구 세포(조직 전구 세포) 등을 들 수 있다. 세포의 분화 정도나 세포를 채취하는 동물의 나이 등에 특별히 제한은 없고, 미분화의 전구 세포(체성 줄기 세포도 포함함)라도, 최종 분화된 성숙 세포라도, 마찬가지로 본원에 있어서의 체세포의 기원으로서 사용할 수 있다. 여기서 미분화되는 전구 세포로서는, 예를 들어 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포, 치수 줄기 세포 등의 조직 줄기 세포(체성 줄기 세포)를 들 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 체세포이다.
본 개시에 있어서, 인공 다능성 줄기 세포란, 체세포를 공지의 방법 등에 의해 초기화(reprogramming)함으로써 다능성을 유도한 세포이다. 구체적으로는, 섬유아세포, 또는 말초혈 단핵구 등의 분화된 체세포를, Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc(c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb 등을 포함하는 초기화 유전자군에서 선택되는 복수의 유전자의 조합의 어느 것의 발현에 의해 초기화하여, 다분화능을 유도한 세포를 들 수 있다.
본 개시에 있어서, 나이브형 인공 다능성 줄기 세포란, 착상 전 배에 유사한 성질을 갖는 인공 다능성 줄기 세포를 의미하고, 착상 전 배의 내세포괴와 동등한 유전자 발현 패턴(구체적으로는, 1 이상의 나이브형 특이적 마커의 발현, 또는 1 이상의 특정 유전자 산물의 나이브형 특이적 세포내 국재), 전 게놈에 걸치는 광범위한 DNA 탈메틸화, X 염색체의 재활성화, 중층이고 돔 형상인 콜로니 형태의 어느 하나 이상의 특징을 나타내는 인공 다능성 줄기 세포라고 정의될 수 있다. 여기서, 나이브형 특이적 마커로서는, 예를 들어 TCFP2L1, KLF17, TBX3, PRDM14, SSEA1, CD7, CD75, CD77, CD130, DPPA3, ESRRB, KLF4 및 KLF5를 들 수 있다. 또한, 특정한 유전자 산물의 나이브형 특이적인 세포내 국재로서는, 예를 들어 TFE3 단백질의 핵내 국재를 들 수 있다.
제조된 인공 다능성 줄기 세포가 나이브형인 것은, 상기 특징을 하나 이상 구비함으로써 확인해도 되도록, 바람직하게는 상기 나이브형 특이적 마커의 발현 및/또는 특정한 유전자 산물의 나이브형 특이적인 세포내 국재를 확인해도 된다. 또한, 신속성과 간편성으로부터, 돔 형상의 콜로니 형태로 확인해도 된다.
유전자 발현 패턴을 확인하는 방법으로서는, RNA-seq, qPCR, 면역 염색, FCM 등 자체 공지의 방법을 사용할 수 있고, 바람직하게는 RNA-seq가 사용될 수 있다.
한편, 프라임형 인공 다능성 줄기 세포란, 착상 후 배의 외배엽에 유사한 성질을 갖는 인공 다능성 줄기 세포를 의미하고, 착상 후 배의 외배엽과 동등한 유전자 발현 패턴(구체적으로는, 1 이상의 프라임형 특이적 마커의 발현, 또는 1 이상의 특정 유전자 산물의 프라임형 특이적 세포내 국재), 단층이고 편평한 콜로니 형태의 어느 하나 이상의 특징을 나타내는 인공 다능성 줄기 세포라고 정의될 수 있다. 여기서, 프라임형 특이적 마커로서는, 예를 들어 OTX2 또는 ZIC2를 들 수 있고, 특정한 유전자 산물의 프라임형 특이적인 세포내 국재로서는, 예를 들어 TFE3 단백질의 세포질 국재를 들 수 있다.
제조된 인공 다능성 줄기 세포가 프라임형인 것은, 상기 특징을 하나 이상 구비함으로써 확인해도 되고, 바람직하게는 상기 프라임형 특이적 마커의 발현 및/또는 특정한 유전자 산물의 프라임형 특이적인 세포내 국재의 확인이다. 또한, 신속성과 간편성으로부터, 단층이고 편평한 콜로니 형태로 확인해도 된다.
공정 (1)에 있어서, 인간 체세포에, 초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터를 도입한다.
초기화 인자로서는, 상기한 초기화 인자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 초기화 인자는, OCT 유전자, SOX 유전자, MYC 유전자 및 KLF 유전자를 포함하고 있어도 된다.
1개 이상의 벡터로서는, 상기한 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 벡터는, 예를 들어 염색체 비내장형 바이러스 벡터이고, 바람직하게는 파라믹소 바이러스 벡터이고, 보다 바람직하게는 센다이 바이러스 벡터여도 된다.
초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터는, 예를 들어 OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터, MYC 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터를 포함하고 있어도 된다.
세포를 초기화시키기 위해서는, 상기한 조합의 벡터를 세포에 도입한다. 복수의 벡터를 조합하여 도입하는 경우, 도입은 동시에 행하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 최초의 벡터 또는 화합물 등을 첨가하고 나서 48시간 이내, 바람직하게는 36시간 이내, 보다 바람직하게는 24시간 이내, 18시간 이내, 12시간 이내, 10시간 이내, 8시간 이내, 6시간 이내, 3시간 이내, 2시간 이내, 또는 1시간 이내에 초기화 인자를 포함하는 모든 벡터의 첨가를 완료하는 것이 바람직하다. 벡터의 용량은 적절히 조제할 수 있지만, 바람직하게는 MOI 0.3 내지 100, 보다 바람직하게는 MOI 0.5 내지 50, 보다 바람직하게는 MOI 1 내지 30, 보다 바람직하게는 MOI 1 내지 10, 보다 바람직하게는 MOI를 약 5에서 감염시킨다.
어느 양태에 있어서, 공정 (1)의 1 내지 15일, 1 내지 10일, 예를 들어 3 내지 9일 후에 공정 (2)가 개시된다. 공정 (2)가 개시될 때까지, 인간 체세포는 적절한 배양 조건 하에서 배양될 수 있다.
본원에 있어서, 배지는 동물 세포의 배양에 사용되는 기초 배지에 필요한 인자를 적절히 첨가하여 조제될 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들어 IMDM 배지, Medium 199 배지, 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium)(EMEM) 배지, αMEM 배지, MEM Zinc Option 배지, IMEM Zinc Option 배지, 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium)(DMEM) 배지, DMEM/F12 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지 및 이것들의 혼합 배지 등이 포함된다. 기초 배지에는, 혈청(예를 들어, 소 태아 혈청(FBS))이 함유되어 있어도 되고, 또는 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 예를 들어 알부민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, Knock Out Serum Replacement(KSR)(ES 세포 배양 시의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 등의 1개 이상의 혈청 대체물을 포함해도 되고, 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질(예를 들어, 스트렙토마이신, 페니실린, 퓨로마이신, 마이토마이신), 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류, 사이토카인 및 이것들의 동등물 등의 1개 이상의 물질도 함유할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 기초 배지는, DMEM 배지 또는 DMEM/F12 배지이다. 기초 배지로서 시판되고 있는 배지를 사용해도 되고, 예를 들어 인간 조혈 세포를 배양하는 경우, StemSpan ACF(STEMCELL Technologies사) 등의 배지를 사용할 수 있다. 인간 조혈 세포를 배양하는 경우, 기초 배지에 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), Flt3/Flk2, IL-6 및 IL-3 등의 인자를 더 추가해도 된다.
어느 양태에 있어서, 체세포는, 피더 세포와 함께 배양될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 피더 세포란, 체세포를 배양할 때 공존시키는 상기 체세포 이외의 세포를 의미한다. 피더 세포로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 섬유아세포(NIH-3T3 세포, MEF 세포, STO 세포, SNL 세포 등), 태아 신장 세포(HEK293 세포 등), 간질 세포(ST2 세포, OP9 세포, PA6 세포, MS-5 세포 등), 상피 세포(HeLa 세포 등), 태반 세포, 골수 세포, 자궁 내막 세포 등을 들 수 있다. 피더 세포는, 예를 들어 MEF 세포이다. 피더 세포는, 체세포와 동일한 종에서 유래하는 세포여도 되고, 다른 종에서 유래하는 세포여도 된다. 또한, 피더 세포는, 증식 억제제(예를 들어, 마이토마이신 C) 또는 방사선(예를 들어, X선 또는 γ선) 조사 등에 의해 세포 증식을 억제하도록 처리되어 있어도 된다. 본원에서 사용되는 피더 세포의 농도는, 상기 체세포의 증식이 가능한 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 약 5×103세포/㎠ 내지 약 1×105세포/㎠이다. 체세포는, 배양의 처음부터 피더 세포와 함께 배양되어도 되고, 배양의 도중부터 피더 세포와 함께 배양되어도 된다. 예를 들어, 체세포는, 배양의 2 내지 10일째, 또는 2 내지 5일째부터 피더 세포와 함께 배양될 수 있다. 다른 양태에 있어서, 체세포는, 피더 세포의 비존재 하에서 배양될 수 있다.
체세포의 배양에 있어서, 배양 온도는, 이하에 한정되지 않지만, 약 30 내지 40℃의 범위 내에서 벡터의 특성에 맞추어 결정하면 된다. 배양은, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 행해지고, CO2 농도는, 약 2 내지 8％, 바람직하게는 약 3 내지 7％, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 6％, 가장 바람직하게는 약 5％이다. 또한, (1)의 공정 후, 배양은 저산소 조건 하에서 행해도 되고, 산소 농도는, 약 3 내지 10％, 바람직하게는 약 4 내지 8％, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 6％, 가장 바람직하게는 약 5％이다.
어느 양태에 있어서, 체세포는 2차원 배양에 의해 배양된다. 피더 세포 존재 하에서 배양을 행하는 경우, 예를 들어 피더 세포를 배양 용기 저면 또는 배양 기질 등에 미리 파종 및 배양하고, 배양 용기의 저면 또는 배양 기질의 표면을 완전히 매립할 정도로 증식시킨 후, 체세포를 이 피더 세포 위에 파종하고, 배양해도 된다.
체세포를 배양하기 위한 배양 용기는, 예를 들어 코팅제로 처리된 것이 사용된다. 코팅제로서는, 예를 들어 젤라틴, 마트리겔(BD), Synthemax(Corning), 콜라겐, 라미닌, 헤파란황산프로테오글리칸, 엔탁틴, 이것들의 단편 및 이것들의 조합이 예시된다.
(2)의 공정에 있어서, 상기 체세포를 나이브용 배지의 존재 하에서 배양한다.
(2)의 공정에 있어서, 배양 온도는, 이하에 한정되지 않지만, 약 30 내지 40℃의 범위 내에서 벡터의 특성에 맞추어 결정하면 된다. 배양은, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 행해지고, CO2 농도는, 약 2 내지 8％, 바람직하게는 약 3 내지 7％, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 6％, 가장 바람직하게는 약 5％이다. 또한, 배양은 저산소 조건 하에서 행해도 되고, 산소 농도는, 약 3 내지 10％, 바람직하게는 약 4 내지 8％, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 6％, 가장 바람직하게는 약 5％이다.
본원에 있어서, 나이브용 배지는, 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 유도할 때 사용되는 배지를 의미한다. 나이브용 배지의 기초 배지로서는, 상기에 기재되는 기초 배지를 사용할 수 있고, 예를 들어 N2B27 배지(DMEM/F12 배지에 N2 서플리먼트를 첨가한 N2 배지와, Neurobasal 배지에 B27 서플리먼트를 첨가한 B27 배지를 1:1로 혼합한 배지)에, 비필수 아미노산(NEAA), L-글루타민, 2-머캅토에탄올, 항생 물질(예를 들어, 스트렙토마이신, 페니실린, 퓨로마이신, 마이토마이신), 소 혈청 알부민(BSA) 등의 첨가 성분을 임의로 조합하여 첨가한 배지를 들 수 있다.
어느 양태에 있어서, 나이브용 배지는, LIF(백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor)), MEK 저해제, GSK3 저해제, cAMP 산생 촉진제, TGF-β 저해제 및 PKC 저해제에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함한다. 나이브용 배지는, 특히 LIF를 포함하는 것이 바람직하고, 또한 LIF 및 GSK3 저해제를 포함하는 것이 바람직하다. 나이브용 배지는 또한, bFGF를 실질적으로 포함하지 않는 것이 바람직하다.
배지 중의 LIF의 농도는, 1ng/ml 내지 100ng/ml, 또는 5ng/ml 내지 50ng/ml일 수 있고, 예를 들어 약 10ng/ml이다.
본원에 있어서, MEK 저해제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 PD0325901(N-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-벤즈아미드; CAS 등록 번호: 391210-10-9), U0126(1,4-디아미노-2,3-디시아노-1,4-비스[2-아미노페닐티오]부타디엔; CAS 등록 번호: 109511-58-2), PD98059(2-(2-아미노-3-메톡시페닐)-4H-1-벤조피란-4-온; CAS 등록 번호: 167869-21-8), PD184352(2-(2-클로로-4-요오도페닐아미노)-N-시클로프로필메톡시-3,4-디플루오로벤즈아미드; CAS 등록 번호: 212631-79-3을 들 수 있다. 그 중에서도, PD0325901이 바람직하다. MEK 저해제로서 PD0325901을 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는, 50nM 내지 100μM, 또는 100nM 내지 10μM일 수 있고, 예를 들어 약 1μM이다.
본원에 있어서, GSK3 저해제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴; CAS 등록 번호: 252917-06-9), BIO(6-브로모인디루빈-3'-옥심; CAS 등록 번호: 667463-62-9), Kenpaullone(9-브로모-7,12-디히드로인돌로[3,2-d][1]벤즈아제핀-6(5H)-온; CAS 등록 번호: 142273-20-9), IM-16(3-(4-플루오로페닐에틸아미노)-1-메틸-4-(2-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온; CAS 등록 번호: 1129669-05-1)을 들 수 있다. 그 중에서도, CHIR99021이 바람직하다. GSK3 저해제로서 CHIR99021을 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는, 50nM 내지 100μM, 또는 100nM 내지 10μM일 수 있고, 예를 들어 약 1μM이다.
본원에 있어서, cAMP 산생 촉진제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 포르스콜린을 들 수 있다. cAMP 산생 촉진제로서 포르스콜린을 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는, 50nM 내지 100μM, 또는 100nM 내지 10μM일 수 있고, 예를 들어 약 1μM이다.
본원에 있어서, TGF-β 저해제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 A83-01(3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드), SB431542(4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아미드)를 들 수 있다. 그 중에서도, A83-01이 바람직하다. TGF-β 저해제로서 A83-01을 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는, 10nM 내지 100μM, 또는 100nM 내지 10μM일 수 있고, 예를 들어 약 1μM이다.
본원에 있어서, PKC 저해제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 Go6983(3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온; CAS 등록 번호: 133053-19-7), GF109203X(3-(1-(3-디메틸아미노)프로필)-1H-인돌-3-일)-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온; CAS 등록 번호: 133052-90-1)를 들 수 있다. 그 중에서도, Go6983이 바람직하다. PKC 저해제로서 Go6983을 사용하는 경우, 그 배지 중의 농도는, 50nM 내지 100μM, 또는 100nM 내지 10μM일 수 있고, 예를 들어 약 1μM 내지 3μM이다.
나이브용 배지는 시판되고 있는 배지를 사용해도 되고, 예를 들어 t2iLGo(N2B27+PD0325901(1μM)+CHIR99021(1μM)+LIF+Go6983(2-3μM)), 5iLAF(N2B27+PD0325901(1μM)+CHIR99021(1μM)+SB590885(0.5μM)+WH-4-023(1μM)+Y-27632(10μM)+LIF+ActivinA) 또는 tt2iLGo(N2B27+PD0325901(1μM)+LIF+Go6983(2μM)+XAV939(2μM))를 사용할 수 있다.
세포가 피더 세포의 비존재 하에서 배양되는 경우, 나이브용 배지는, 특정한 세포에서 미리 순화될 수 있다. 특정한 세포로서는, 상술한 피더 세포로서 사용 가능한 세포가 사용될 수 있고, 예를 들어 방사선 조사 후 마우스 태아 섬유아세포(iMEF)일 수 있다. 순화를 위한 배양 기간은, 예를 들어 약 12시간 내지 약 2일간일 수 있다. 배지는, 순화를 위한 배양 후에 통상의 방법에 의해 세포 성분을 제거함으로써 취득될 수 있다. 어느 실시 형태에 있어서, 세포가 피더 세포의 비존재 하에서 배양되는 경우, 나이브용 배지는, iMEF에서 순화된 t2iLGo일 수 있다.
공정 (2)에 있어서, 체세포의 배양 기간은, 1일 내지 20일, 3일 내지 10일, 예를 들어 4 내지 6일일 수 있다.
공정 (3)에 있어서, 얻어진 세포를 나이브용 배지의 존재 하, 상기 체세포당의 상기 벡터양이 공정 3 개시 시에 비해 30％ 이하로 감소하는 조건 하에서 배양한다.
어느 양태에 있어서, 얻어진 세포는 피더 세포와 함께 배양될 수 있다. 피더 세포로서는 상술한 세포를 사용할 수 있다. 다른 양태에 있어서, 얻어진 세포는, 피더 세포의 비존재 하에서 배양될 수 있다.
공정 (3)에 있어서, 나이브용 배지는 공정 (2)에서 사용한 나이브용 배지와 동일한 것을 사용할 수 있다. 나이브용 배지는, LIF(백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor)), MEK 저해제, GSK3 저해제, cAMP 산생 촉진제, TGF-β 저해제 및 PKC 저해제에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, t2iLGo, 5iLAF, 또는 tt2iLGo를 포함할 수 있다.
세포가 피더 세포의 비존재 하에서 배양되는 경우, 나이브용 배지는, 특정한 세포에서 미리 순화될 수 있다. 특정한 세포로서는, 상술한 피더 세포로서 사용 가능한 세포가 사용될 수 있고, 예를 들어 방사선 조사 후 마우스 태아 섬유아세포(iMEF)일 수 있다. 순화를 위한 배양 기간은, 예를 들어 약 12시간 내지 약 2일간일 수 있다. 배지는, 순화를 위한 배양 후에 통상의 방법에 의해 세포 성분을 제거함으로써 취득될 수 있다. 어느 실시 형태에 있어서, 세포가 피더 세포의 비존재 하에서 배양되는 경우, 나이브용 배지는, iMEF로 순화된 t2iLGo일 수 있다.
(3)의 공정에 있어서, 배양 온도는, 이하에 한정되지 않지만, 약 30 내지 40℃의 범위 내에서 벡터의 특성에 맞추어 결정하면 된다. 배양은, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 행해지고, CO2 농도는, 약 2 내지 8％, 바람직하게는 약 3 내지 7％, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 6％, 가장 바람직하게는 약 5％이다. 또한, 배양은 저산소 조건 하에서 행해도 되고, 산소 농도는, 약 3 내지 10％, 바람직하게는 약 4 내지 8％, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 6％, 가장 바람직하게는 약 5％이다.
어느 양태에 있어서, 상기 체세포당의 상기 벡터양은, 예를 들어 공정 3 개시 시부터 30일 이내, 20일 이내, 15일 이내, 12일 이내, 10일 이내, 8일 이내, 5일 이내, 3일 이내, 또는 1일 이내에, 공정 3 개시 시에 비해 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하, 5％ 이하, 또는 3％ 이하로 감소할 수 있다. 예를 들어, 상기 체세포당의 상기 벡터양은, 공정 3 개시 시부터 12일 이내에 공정 3 개시 시에 비해 30％ 이하로 감소할 수 있다.
어느 양태에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터를, 온도 감수성을 나타내는 벡터, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터, 또는 온도 감수성을 나타내고, 또한 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터로 하고, 얻어진 세포를 나이브용 배지의 존재 하에서 배양함으로써, 상기 체세포당의 상기 벡터양이 공정 3 개시 시에 비해 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하, 5％ 이하, 또는 3％ 이하로 감소할 수 있고, 예를 들어 공정 3 개시 시부터 30일 이내, 20일 이내, 15일 이내, 12일 이내, 10일 이내, 8일 이내, 5일 이내, 3일 이내, 또는 1일 이내에, 공정 3 개시 시에 비해 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하, 5％ 이하, 또는 3％ 이하로 감소할 수 있다.
온도 감수성을 나타내는 벡터로서는 상기한 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 온도 감수성을 나타내는 벡터는, 상기한 온도 감수성 변이를 포함하는 벡터일 수 있다. 어느 양태에 있어서, 온도 감수성을 나타내는 벡터는, 나이브형 다능성 줄기 세포를 수립하는 세포 배양 환경 하에서 온도 감수성을 나타내는 벡터이다. 나이브형 다능성 줄기 세포를 수립하는 세포 배양 환경 하에서 온도 감수성을 나타내는 벡터로서는, 예를 들어 TS7 변이(M 단백질의 G69E/T116A/A183S 변이, HN 단백질의 A262T/G264R/K461G 변이, P 단백질의 L511F 변이 및 L 단백질의 N1197S/K1795E 변이(이상을 「TS 변이」라고 함)에 더하여, L 단백질의 Y942H/L1361C/L1558I 변이), TS12 변이(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이), 또는 TS15 변이(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이 및 L 단백질의 L1361C/L1558I) 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터, 그리고 상당 부위를 마찬가지로 치환한 다른 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터를 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다.
초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터는, 예를 들어 OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터, MYC 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터, MYC 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터는, 센다이 바이러스 벡터일 수 있고, 예를 들어 TS7, TS12 또는 TS15 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터일 수 있다. 어느 실시 형태에 있어서, MYC 유전자를 포함하는 벡터는 TS15 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터일 수 있고, OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터는, TS12 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터일 수 있다.
어느 양태에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가 온도 감수성을 나타내는 벡터인 경우, 공정 (1) 및 (2)에서는 당해 벡터의 발현량이 높은 온도, 공정 (3)에서는 당해 벡터의 발현량이 낮은 온도에서 배양하면 된다. 예를 들어, 상기에 예시한 벡터의 경우, 공정 (1) 및 (2)를 30 내지 36.5℃, 34 내지 36℃, 예를 들어 약 35℃, 공정 (3)을 37℃ 이상, 38℃ 이상, 37℃ 내지 45℃, 37℃ 내지 40℃, 예를 들어 약 38℃에서 배양하면 된다. 일례로서, 공정 (1) 및 (2)를 약 35℃, 공정 (3)을 약 38℃에서 배양하는 양태를 들 수 있다.
인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열로서는, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA가 표적으로서 결합하는 서열이라면 특별히 한정되지 않는다. 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA로서는, 예를 들어 miR-367, miR-302, miR-371, miR-372, miR-373, miR-512, miR-517, miR-518, miR-519, miR-520, miR-525, miR-187, miR-299, miR-499, miR-628 및 miR-888을 들 수 있다.
마이크로 RNA 표적 서열이란, 마이크로 RNA가 표적으로서 결합하는 서열을 말한다. 본원에 있어서 마이크로 RNA 표적 서열은, 마이크로 RNA의 결합에 의해 발현이 억제되는 한, 천연의 마이크로 RNA 표적 서열이나 그 변이체를 사용할 수 있다. 또한 마이크로 RNA 표적 서열은, 마이크로 RNA에 완전히 상보적인 서열이어도 되고 아니어도 되고, 예를 들어 마이크로 RNA에 대하여, 적어도 10염기, 예를 들어 11염기 이상, 12염기 이상, 13염기 이상, 14염기 이상, 15염기 이상, 16염기 이상, 17염기 이상, 18염기 이상, 19염기 이상, 20염기 이상, 21염기 이상, 22염기 이상의 상보적인 염기를 연속 또는 비연속으로 포함한다. 마이크로 RNA 표적 서열의 서열 길이에 상한은 특별히 없지만, 예를 들어 약 30염기이다. 바람직하게는, 해당 상보적인 염기는 연속되어 있거나, 혹은 수개, 예를 들어 5염기 이하, 4염기 이하, 3염기 이하, 2염기 이하, 또는 1염기의 대합하지 않는 염기를 갖고 있어도 된다. 대합하지 않는 염기는, 마이크로 RNA 표적 서열측 및/또는 마이크로 RNA측에 포함되어 있어도 된다.
마이크로 RNA 표적 서열은, 바람직하게는 마이크로 RNA와 생리적 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열이다. 생리적 조건 하란, 예를 들어 150mM NaCl, 15mM 구연산 나트륨(sodium citrate), pH7.0, 37℃이다. 보다 바람직하게는, 마이크로 RNA 표적 서열은, 마이크로 RNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열이다. 엄격한 조건이란, 예를 들어 1×SSC(1×SSC는 150mM NaCl, 15mM 구연산 나트륨, pH7.0) 또는 0.5×SSC, 42℃의 조건이고, 보다 바람직하게는 1×SSC 또는 0.5×SSC, 45℃의 조건이고, 보다 바람직하게는 1×SSC 또는 0.5×SSC, 50℃의 조건이다. 하이브리다이제이션에 있어서는, 예를 들어 마이크로 RNA 서열을 포함하는 RNA 또는 마이크로 RNA 표적 서열을 포함하는 RNA의 어느 쪽인지를 표지하고, 필요에 따라 다른 쪽을 막 등에 고정하여 양자를 하이브리다이즈시킨다. 하이브리다이제이션의 조건은, 예를 들어 5xSSC, 7％(W/V)SDS, 100㎍/ml 변성 연어 정자 DNA, 5x덴하르트액(1x덴하르트 용액은 0.2％ 폴리비닐피롤리돈, 0.2％ 소 혈청 알부민 및 0.2％ 피콜을 포함함)을 포함하는 용액 중, 예를 들어 37℃, 또는 45℃, 또는 50℃에서 행하면 된다. 충분한 시간(예를 들어 3, 4, 5 또는 6시간 이상) 인큐베이트한 후, 상기한 조건에서 세정을 행하여, 표지한 핵산이 하이브리다이즈하고 있는지를 검출함으로써, 당해 조건에서 핵산이 하이브리다이즈하는지의 여부를 결정할 수 있다.
혹은 마이크로 RNA 표적 서열은, 바람직하게는 마이크로 RNA 서열의 상보 서열과 높은 호몰로지를 나타낸다. 높은 호몰로지란, 예를 들어 70％ 이상, 75％ 이상, 76％ 이상, 77％ 이상, 78％ 이상, 79％ 이상, 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 93％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상의 동일성을 갖는 염기 서열이다. 염기 서열의 동일성은, 예를 들어 BLAST 프로그램(Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, NCBI(National Center for Biothchnology Information)의 BLAST의 웹페이지에 있어서, 디폴트의 파라미터를 사용하여 검색을 행할 수 있다(Altschul S. F. et al., Nature Genet. 3: 266-272, 1993; Madden, T. L. et al., Meth. Enzymol. 266: 131-141, 1996; Altschul S. F. et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997; Zhang J. & Madden T. L., Genome Res. 7: 649-656, 1997). 예를 들어, 2개의 서열의 비교를 행하는 blast2sequences 프로그램(Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250, 1999)에 의해, 2서열의 얼라인먼트를 작성하여, 서열의 동일성을 결정할 수 있다. 마이크로 RNA 서열의 상보 서열의 염기 서열의 외측의 갭은 무시하고, 내측의 갭은, 예를 들어 미스매치와 마찬가지로 취급하여, 얼라인먼트에 있어서의 마이크로 RNA 서열의 상보 서열의 염기 서열 전체(서열의 내측에 넣은 갭을 가산한 전체의 염기의 길이)에 대한 동일성의 값을 계산한다.
혹은 마이크로 RNA 표적 서열은, 바람직하게는 마이크로 RNA 서열의 상보 서열에 대하여, 1 또는 수개의 염기를 삽입, 치환 및/또는 결실시킨 서열을 포함한다. 바람직하게는, 마이크로 RNA 표적 서열은, 마이크로 RNA 서열의 상보 서열에 대하여 8염기 이내, 7염기 이내, 6염기 이내, 5염기 이내, 4염기 이내, 3염기 이내, 2염기 이내, 또는 1염기의 삽입, 치환 및/또는 결실을 갖는 서열을 포함한다.
일반적으로, 마이크로 RNA 표적 서열에 변이를 도입할수록 마이크로 RNA와의 결합이 억제되어, 발현 억제 효과는 저하된다. 변이를 적절히 도입함으로써 억제 효과를 조절하는 것이 가능하다.
어느 양태에 있어서, 본원의 벡터가 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터인 경우, 마이크로 RNA 표적 서열은, NP 또는 P 유전자에 부가된다. NP 또는 P 유전자에 마이크로 RNA 표적 서열을 부가하는 경우, 부가하는 위치에 특별히 제한은 없고, 각 유전자의 번역 영역 또는 비번역 영역에 부가할 수 있다. 번역 영역에 부가하는 경우, N 말단 부위 혹은 C 말단 부위의 어느 위치에 부가해도 되지만, 예를 들어 C 말단에 계속해서 부가하는 것이 바람직하다. 비번역 영역으로서는, 게놈에 있어서의 5' 비번역 영역이어도 되고 3' 비번역 영역이어도 되지만, 5' 비번역 영역이 바람직하다. 비번역 영역에 부가하는 경우, 그 위치는 임의로 선택해도 되지만, 예를 들어 NP 유전자 및/또는 P 유전자의 게놈에 있어서의 5' 비번역 영역에 마이크로 RNA 표적 서열을 부가하는 경우는, 부가하는 유전자의 번역 영역의 종지 코돈과 E(End) 서열 사이에 있으면 어느 위치여도 된다. 게놈에 있어서의 3' 비번역 영역에 부가하는 경우는, 예를 들어 부가하는 유전자의 S(Start) 서열과 번역 개시 코돈 사이의 원하는 위치에 부가할 수 있다. 마이크로 RNA 표적 서열은, 1 카피 또는 복수 카피 부가할 수 있다. 또한, 1종류의 마이크로 RNA 표적 서열뿐만 아니라, 복수종의 마이크로 RNA 표적 서열을 부가해도 된다. 일례로서는, 예를 들어 1종 또는 복수종의 마이크로 RNA 표적 서열을 탠덤하게 2개 이상, 예를 들어 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 나열한 서열을 부가할 수 있다. 탠덤하게 부가하는 마이크로 RNA 표적 서열의 수에 상한은 특별히 없지만, 예를 들어 약 10개까지이다.
P 유전자를 개변하는 경우, P 단백질의 코드 영역 중의 핵산에 코드되는 C 단백질의 발현이 저해되는 경우는, 벡터로부터 C 단백질을 별도, 발현시키면 된다.
또한, P 단백질은 전체 길이가 아니어도, 적절히 단편을 사용할 수 있다. P 단백질로서 필수적인 것은 C 말단의 일부뿐이며, 그밖의 영역은 바이러스 벡터의 발현에 필수는 아니다. P 단백질은, 구체적으로는, L 단백질의 결합 부위와 N 단백질: RNA로의 결합 부위를 유지하는 단편이어도 된다. L 단백질의 결합 부위로서는, 예를 들어 SeV P 단백질의 411번째 내지 445번째의 아미노산 서열을 들 수 있고, N 단백질: RNA 결합 부위로서는, 예를 들어 SeV P 단백질(예를 들어, accession 번호 AAB06197.1, P04859.1, P14252.1, AAB06291.1, AAX07439.1, BAM62828.1, BAM62834.1, P04860.1, BAM62840.1, BAD74220.1, P14251.1, BAM62844.1, BAM62842.1, BAM62842.1, BAF73480.1, BAD74226.1, BAF73486.1, Q9DUE2.1, BAC79134.1, NP_056873.1, ABB00297.1 등)의 479번째 내지 568번째의 아미노산 서열을 들 수 있다. 더 구체적으로는, 예를 들어 SeV P 단백질의 320번째 내지 568번째의 아미노산 서열을 포함하는 단편은, 본원에 있어서 기능적인 P 단백질로서 적합하게 사용할 수 있다. 결실형의 P 단백질을 사용함으로써, 벡터의 사이즈를 소형화할 수 있음과 함께, 숙주의 면역 반응의 영향도 받기 어려워지는 것을 기대할 수 있다.
C 단백질의 코드 영역을 결실하는 P 단백질을 사용하는 경우는, 상술한 바와 같이, 적절히 C 단백질을 별도 발현시켜도 된다. 여기서 C 단백질에는, C', C, Y1 및 Y2 단백질이 포함된다(Irie T. et al., PLoS One.(2010) 5: e10719.). C 단백질을 발현시키기 위해서는, C 단백질의 코드 서열을 적절히 벡터 중에 삽입하면 된다. 삽입 위치에 특별히 제한은 없지만, P 단백질의 직전(게놈에 있어서의 P 단백질의 코드 서열의 3'측) 혹은 P 단백질의 직후(게놈에 있어서의 P 단백질의 코드 서열의 5'측)에 삽입할 수 있다. 삽입에 있어서는, 적절히 E-I-S 서열을 부가해도 된다.
NP 유전자 또는 P 유전자에 마이크로 RNA 표적 서열을 부가한 경우, 벡터를 도입한 세포에 있어서 이 마이크로 RNA가 발현되면, 그것에 맞추어 벡터의 발현은 저하되고, 벡터의 제거가 촉진된다. 예를 들어, 벡터의 도입 시에는 발현되어 있지 않지만, 어느 분화 상태(또는 미분화 상태)가 되었을 때 특이적으로 발현하는 마이크로 RNA의 표적 서열을 벡터에 부가해 둠으로써, 당해 벡터가, 목적이 달성되었을 때 자동적으로 발현이 억제되어, 제거된다.
다른 양태에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터를, P 유전자에 데그론이 부가된 벡터라고 하고, 얻어진 세포를 나이브용 배지의 존재 하에서 배양해도 된다. 이에 의해, 상기 체세포당의 상기 벡터양이 공정 3 개시 시에 비해 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하, 5％ 이하, 또는 3％ 이하로 감소될 수 있고, 예를 들어 공정 3 개시 시부터 30일 이내, 20일 이내, 15일 이내, 12일 이내, 10일 이내, 8일 이내, 5일 이내, 3일 이내, 또는 1일 이내에, 공정 3 개시 시에 비해 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하, 5％ 이하, 또는 3％ 이하로 감소할 수 있다.
본원에 있어서, 데그론이란 단백질에 부가함으로써 해당 단백질을 불안정화시키는 폴리펩티드를 의미한다. 데그론에는, 저분자와의 융합에 의해 안정화되는 서열, 저분자와의 결합에 의해 불안정화되는 서열, 저분자의 유무에 관계없이 불안정화되는 서열을 들 수 있다. 구체적으로는, mTOR 단백으로서 알려지는 FKBP12 유래의 DD-tag(US2009/0215169), 디히드로엽산 레다크타제(DHFR) 유래의 DDG-tag(US2012/0178168), TetR 변이체(WO2007/032555), 식물 유래의 옥신 유도가능 데그론(auxin-inducible degron)(AID) 시스템(WO2010/125620), 분해 촉진 서열로서 알려지는 PEST 서열(WO99/54348), CL1(WO2004/025264), 칼파인 유래 서열(일본 특허 공개 제2009-136154), NDS(일본 특허 공개 제2011-101639) 등을 들 수 있다. FKBP12는 라파마이신의 포유류 표적(mammalian target of rapamycin)(mTOR)으로서 알려지고, 라파마이신이나 쉴드1 등의 저분자와 결합함으로써 안정화되고, 제거함으로써 불안정화되고, 프로테아솜에 의해 분해된다. DHFR는 트리메소프림에 의해 안정화되고, TetR 변이체는 독시사이클린에 의해 안정화된다. PEST 서열은 Pro, Glu, Ser, Thr이 풍부한 서열이고, 예를 들어 마우스 오르니틴 디카르복실라아제(mouse ornithine decarboxylase)(mODC)의 C 말단측 422-461을 부가함으로써 불안정화시킬 수 있다. PEST 서열은 단백질의 반감기를 조절하고 있지만, 원하는 반감기 단축 서열을 사용할 수 있다(Rechsteiner M, et al., Trends Biochem. Sci. 21, 267-271, 1996). PEST 서열은 예를 들어 양단이 염기성 아미노산(H, K 또는 R)으로 둘러싸여 있고, (i) P, (ii) D 및 E 또는 (iii) S 및 E를 포함하여 유비퀴틴화 효소 E3과 결합하는 서열이고, 예를 들어 GENETYX(제네틱스사)에 의해 동정할 수 있다. PEST와 마찬가지의 효과가 얻어지는 서열로서 CL1, 칼파인 부분 서열, NDS 등을 들 수 있다. AID 서열은 식물의 유비퀴틴리가아제인 TIR1과 옥신(IAA)이 결합함으로써 불안정화된다.
본원에 있어서, P 유전자에 데그론이 부가되었다는 것은, 당해 P 유전자가, 데그론이 부가된 P 단백질을 코드하는 것을 의미한다. 본원에 있어서는 상기한 데그론을 P 단백질에 부가할 수 있고, 바람직한 데그론으로서는, 구체적으로는 mTOR 데그론, DHFR 데그론, TetR 데그론, PEST 및 AID를 들 수 있다. 또한 이들 데그론에는 천연의 서열 및 그것에서 유래하는 것이 포함된다. 특히 바람직한 데그론으로서는, mTOR 데그론, DHFR 데그론, TetR 데그론 및 PEST를 들 수 있고, 그 중에서 AID 서열 이외의 데그론이 적합하고, 구체적으로는 FKBP12 데그론(DD), DHFR 데그론(DDG), TetR 데그론 및 mODC PEST가 바람직하다. PEST에는 천연의 서열에서 유래하는 d2나 그 개변체인 d1이나 d4 등이 알려져 있지만(WO99/54348), 이것들은 모두 PEST에 포함되고, 본원에 있어서 사용할 수 있다. 데그론을 코드하는 핵산은, DNA 합성에 의해 적절히 제작할 수 있다.
데그론은, 적절히 P 단백질의 원하는 위치에 부가할 수 있고, 예를 들어 P 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 부가할 수 있다. P 단백질의 N 말단에 부가하는 경우이며, P 단백질의 코드 영역 중의 핵산에 코드되는 C 단백질의 발현이 저해되는 경우는, 벡터로부터 C 단백질을 별도, 발현시키면 된다. P 단백질로서 전체 길이 P 단백질이 아니라 단편을 사용하는 경우이며, C 단백질의 코드 영역을 포함하지 않는 단편인 경우는, N 말단에서도 C 말단에서도 임의의 위치에 데그론을 부가할 수 있다. 본 발명에 있어서 데그론은, 바람직하게는 P 단백질의 C 말단측에 부가된다. 데그론이 부가된 개변 P 단백질은 주지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 구체적으로는, P 단백질을 코드하는 바이러스 게놈의 서열에, 리딩 프레임이 일치하도록 데그론을 코드하는 서열을 삽입하면 된다.
본원의 P 유전자에 데그론이 부가된 벡터를 세포에 도입하여, 목적의 유전자를 발현시킨 후에는, 데그론의 성질에 맞추어 적절히 벡터를 제거할 수 있다. 예를 들어 DD나 DDG, TetR 변이체 등과 같이 리간드 제어성의 데그론(ligand controllable degron)을 사용하는 경우, 리간드를 첨가하지 않으면 제거를 촉진하지만, Shield-1 등의 리간드를 첨가함으로써 벡터의 발현을 연장할 수 있다. 또한, PEST 서열 등과 같이 리간드가 없어도 기능을 발휘하는 데그론이라면, 벡터를 도입한 세포의 배양을 계속함으로써 벡터의 제거를 촉진할 수 있다.
본원의 P 유전자에 데그론이 부가된 벡터는, 상술한 온도 감수성을 나타내는 벡터, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터, 또는 온도 감수성을 나타내고, 또한 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터여도 된다.
또한 다른 양태에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터를, 자살 유전자를 탑재한 벡터라고 하고, 얻어진 세포를 나이브용 배지의 존재 하에서 배양해도 된다. 이에 의해, 상기 체세포당의 상기 벡터양이 공정 3 개시 시에 비해 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하, 5％ 이하, 또는 3％ 이하로 감소할 수 있고, 예를 들어 공정 3 개시 시부터 30일 이내, 20일 이내, 15일 이내, 12일 이내, 10일 이내, 8일 이내, 5일 이내, 3일 이내, 또는 1일 이내에, 공정 3 개시 시에 비해 50％ 이하, 40％ 이하, 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하, 5％ 이하, 또는 3％ 이하로 감소할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터에 탑재되는 자살 유전자로서는, 세포사의 유도나 세포 독성을 나타내는 원하는 약제의 프로드러그 변환 효소 유전자가 포함된다. 프로드러그와 자살 유전자의 조합의 예로서는, 구체적으로는,
· 5-플루오로시토신과 시토신데아미나아제
· 시클로포스파미드와 시토크롬 P450
· 플루다라빈과 대장균 PNP(푸린뉴클레오시드포스포릴라아제)
· CB1954와 니트로리덕타아제
· 카페시타빈과 카르복시에스테라아제
등을 들 수 있다. 또한 자살 유전자로서는, 비활성형으로부터 활성형으로 변환함으로써 세포사의 유도나 세포 독성을 나타내는 원하는 단백질을 코드하는 유전자를 들 수 있고, 예를 들어 세포사를 유도하는 카스파아제를 코드하는 유전자를 적합하게 이용할 수 있다. 구체적으로는, 원하는 2량체화제와 그 결합 도메인을 부가한 카스파아제의 조합을 이용할 수 있고, 2량체화제와 카스파아제의 조합의 일례로서는,
· AP20187과 iCaspase-9
를 들 수 있다.
예를 들어, 본원의 자살 유전자를 탑재한 벡터를 세포에 도입하여 배양한 후에, 프로드러그를 첨가한다. 이에 의해, 벡터가 잔존하고 있는 세포를 사멸시켜, 벡터가 소실되어 있는 세포만을 취득할 수 있다.
본원의 자살 유전자를 탑재한 벡터는, 상술한 온도 감수성을 나타내는 벡터, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터, 또는 온도 감수성을 나타내고, 또한 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터여도 된다. 본원의 자살 유전자를 탑재한 벡터는 또한, 상술한 P 유전자에 데그론이 부가된 벡터여도 된다.
공정 (3)에 있어서, 배양 기간은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 4주일 이내, 3주일 이내, 2주일 이내, 또는 1주일 이내, 예를 들어 20일 이내, 15일 이내, 10일 이내, 5일 이내, 또는 3일 이내일 수 있다. 배양 기간의 하한은 특별히 없지만, 예를 들어 약 1일이다. 벡터양의 감소는, 리포터 유전자의 검출이나, 항체나 PCR을 사용한 바이러스의 검출에 의해, 그 레벨을 공정 (3)의 개시 시 비교함으로써 확인할 수 있다.
본원에 관한 방법으로 제조한 나이브형 인공 다능성 줄기 세포는, 초기화 인자를 포함하는 벡터의 잔존량이 매우 낮기 때문에, 장기에 걸쳐 배양해도 나이브형의 성질이 안정적으로 유지될 수 있다. 본원에 관한 방법에서는, 초기화 인자를 포함하는 벡터는, 당해 벡터 도입으로부터 약 30일 후에는 실질적으로 세포 내에서 소실될 수 있다. 따라서, 본원의 방법에 의해 얻어지는 나이브형 인공 다능성 줄기 세포는, 초기화 인자를 포함하는 벡터를 실질적으로 포함하지 않고, 형질 안정성이 높다.
[벡터 세트]
본원은 또한, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하기 위한 벡터 세트이며,
초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터를 포함하고,
상기 1개 이상의 벡터가, 온도 감수성을 나타내는 벡터, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터 및 온도 감수성을 나타내고, 또한 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는, 벡터 세트를 제공한다. 본 형태에서 사용되는 초기화 인자 및 벡터의 예는, 전술한 바와 같다.
[조성물]
본원은 또한, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하기 위한 조성물이며,
초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터를 포함하고,
상기 1개 이상의 벡터가, 온도 감수성을 나타내는 벡터, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터 및 온도 감수성을 나타내고, 또한 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는, 조성물을 제공한다. 본 형태에서 사용되는 초기화 인자 및 벡터의 예는, 전술한 바와 같다.
본원의 조성물은, 필요에 따라 증류수, pH 조정제, 현탁화제, 용해 보조제, 안정화제, 등장화제, 항산화제, 보존제 등을 첨가함으로써, 액상 제제로서 제조할 수 있다. pH 조정제로서는, 염산, 수산화나트륨, 유당, 락트산, 나트륨, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨 등이 예시된다. 현탁화제로서는, 메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트80, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아 고무, 트라가칸트말, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트 등이 예시된다. 용해 보조제로서는, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리소르베이트80, 니코틴산아미드, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트 등이 예시된다. 안정화제로서는, 아황산나트륨, 메타아황산나트륨, 에테르 등이 예시된다. 등장제로서는, 염화나트륨, 포도당 등이 예시된다. 보존제로서는, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로 크레졸 등이 예시된다.
[키트]
본원은 또한, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하기 위한 키트이며,
초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터 및
나이브용 배지를 포함하고,
상기 1개 이상의 벡터가, 온도 감수성을 나타내는 벡터, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터 및 온도 감수성을 나타내고, 또한 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는, 키트를 제공한다. 본 형태에서 사용되는 초기화 인자 및 벡터의 예는, 전술한 바와 같다.
본원의 키트에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터는 따로따로 패키지되어 있어도 되고, 통합하여 패키지되어 있어도 된다. 본원의 키트는 또한, 완충액, 사용 설명서 등을 포함하고 있어도 된다.
[배양 상청]
본원은 또한, 본원의 방법으로 제조된 나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 배양 상청을 제공한다. 배지에는 상술한 나이브용 배지를 사용할 수 있다. 나이브용 배지는, LIF(백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor)), MEK 저해제, GSK3 저해제, cAMP 산생 촉진제, TGF-β 저해제 및 PKC 저해제에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, t2iLGo, 5iLAF, 또는 tt2iLGo를 포함할 수 있다.
배양 상청을 얻기 위한 배양 기간은, 3 내지 72일간일 수 있고, 예를 들어 12 내지 48일간이다. 배양 개시 시의 나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 농도는, 예를 들어 3×103 내지 1×105세포/㎠일 수 있고, 예를 들어 1×104 내지 3×104세포/㎠이다.
배양 상청을 얻기 위한 배양 온도는, 이하에 한정되지 않지만, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 배양은, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 행해지고, CO2 농도는, 약 2 내지 8％, 바람직하게는 약 3 내지 7％, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 6％, 가장 바람직하게는 약 5％이다. 또한, 배양은 저산소 조건 하에서 행해도 되고, 산소 농도는, 약 3 내지 10％, 바람직하게는 약 4 내지 8％, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 6％, 가장 바람직하게는 약 5％이다.
배양 후에 세포 성분을 분리 제거함으로써, 나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 배양 상청을 얻을 수 있다. 본 개시에 있어서, 배양 상청은, 배양액으로부터 세포 성분을 분리 제거한 배양 상청뿐만 아니라, 각종 처리(예를 들어, 원심 처리, 농축, 용매의 치환, 투석, 동결, 건조, 동결 건조, 희석, 탈염, 보존 등)를 적절히 실시한 배양 상청도 포함한다.
[화장품]
본원은 또한, 본원의 방법으로 제조된 나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 배양 상청을 원료로서 포함하는 화장품을 제공한다. 본원의 방법으로 제조된 나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 배양 상청은, 상술한 바와 같다. 본원의 화장품은, 사용 시에 피부와 접촉시켜 사용하는 것이라면 어떤 제형, 형태여도 된다. 구체적으로는, 예를 들어 스킨 밀크, 스킨 크림, 파운데이션 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 면도 크림, 클렌징 폼, 화장수, 로션, 팩, 립스틱, 볼터치, 아이섀도, 매니큐어, 비누, 보디 샴푸, 핸드 소프, 샴푸, 린스, 헤어 토닉, 트리트먼트, 헤어 크림, 헤어 스프레이, 육모제, 양모제, 염모제, 정발제, 탈모제, 비듬 방지제, 치약, 의치 접착제, 양치질제, 퍼머넌트 웨이브제, 컬링제, 스타일링제, 연고제, 습포제, 테이프제 입용제, 발한 억제제, 자외선 차단제 등이 광의로는 포함되고, 사용 시에 피부에 접촉시키는 것이라면 종류는 상관없지만, 특히 화장품으로서 사용할 수 있는 형태인 것이 바람직하다. 또한 인간 외에, 동물류의 피부에 접촉시키는 것도 포함한다. 또한, 본원의 화장품은, 어떤 형상이어도 되고, 고체, 액체, 반고체, 기체 외에, 분체, 과립, 정제형, 겔상, 기포상 등 다수의 형태를 들 수 있지만, 특별히 이것에 한정되는 것은 아니다.
본원의 화장품은, 제제상 허용되는 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제 및 생리 식염수 등을 포함하고 있어도 된다. 부형제의 예로서는, 유당, 전분, 소르비톨, D-만니톨 및 백당을 들 수 있다. 붕괴제의 예로서는, 카르복시메틸셀룰로오스 및 탄산칼슘을 들 수 있다. 완충제의 예로서는, 인산염, 시트르산염 및 아세트산염을 들 수 있다. 유화제의 예로서는, 아라비아 고무, 알긴산나트륨 및 트라가칸트를 들 수 있다. 현탁제의 예로서는, 모노스테아르산글리세린, 모노스테아르산알루미늄, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스 및 라우릴황산나트륨을 들 수 있다. 무통화제의 예로서는, 벤질알코올, 클로로부탄올 및 소르비톨을 들 수 있다. 안정제의 예로서는, 프로필렌글리콜 및 아스코르브산을 들 수 있다. 보존제의 예로서는, 페놀, 염화벤잘코늄, 벤질알코올, 클로로부탄올 및 메틸파라벤을 들 수 있다. 방부제의 예로서는, 염화벤잘코늄, 파라옥시벤조산 및 클로로부탄올을 들 수 있다.
실시예
이하에 실시예를 나타내어 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
[재료 및 방법]
세포 배양
인폼드 컨센트에 기초하여 채취된 인간 피부 섬유아세포(HDF)를 도쿄도 노인 종합 연구소(Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology)로부터 입수했다. HDF 및 방사선 조사 후 마우스 태아 섬유아세포(iMEF)를, 10％ 소 태아 혈청(FBS, Japan Bio Serum)을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지(DMEM, Nacalai Tesque) 중에서 유지했다. Cellular Technology Limited(CTL)로부터 구입한 PBMC를, 제조자가 권장하는 조건 하에서 유지했다. 프라임형 및 나이브형 ES 세포(ESC) 클론을, WiCELL 및 교토 대학에서 입수했다. 프라임형 다능성 줄기 세포(PSC)를, 라미닌(511)-E8프래그먼트(iMatrix-511, Nippi)로 코팅된 플레이트 상에서 StemFit AK02N 배지(Ajinomoto) 중에 있어서 유지했다. 나이브형 PSC를 iMEF 상에서 배양하여, 1μM CHIR99021(Merck), 1μM PD0325901(Merck), 10㎍/mL 인간 LIF(Peprotech) 및 2.5μM Go6983(Merck)을 포함하는 N2B27 배지(NDiff227, Takara Bio)로 구성되는 t2iLGo2 배지 중에서 유지했다. 피더 프리의 나이브형 인공 다능성 줄기 세포(iPSC)를 마트리겔(hESC-qualified, Corning) 상에서 유지했다. 1일 간격으로 배지를 교환하고, 매회 배지를 교환하기 직전에 10μM Y27632(Wako)를 첨가했다. 나이브형 iPSC를, Accutase(Innovative Cell Technologies)를 사용하여 3 내지 4일마다 계대하고, 항상 5％ O2 하에서 배양했다. 본 실시예에 있어서의 재조합 DNA 실험을 교토 대학의 승인 하에서 행하였다.
개변형 SeV-KLF4 벡터의 구축
인간 KLF4 유전자의 오픈 리딩 프레임를 포함하는 삽입 서열을, SeV 특이적인 전사 제어 시그널 서열을 포함하는 NotI 태그를 갖는 유전자 특이적인 순방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 cDNA로부터 PCR에 의해 제작했다. 증폭된 단편을 SeV/TS12ΔF, SeV/PmiR367T2/TSΔF 및 SeV/PmiR367T2/TS12ΔF 벡터의 게놈 서열을 포함하는 플라스미드의 18+ 영역에 삽입하고, 플라스미드 pSeV18+KLF4/TS12ΔF, pSeV18+KLF4/PmiR367T2/TSΔF 및 pSeV18+KLF4/PmiR367T2/TS12ΔF(총칭하여 「SeV-KLF4 벡터 플라스미드」)를 각각 제작했다. miR367T2의 서열은, TCACCATTGCTAAAGTGCAATTcgatTCACCATTGCTAAAGTGCAATT(서열 번호 1)였다. SeV-KLF4 벡터의 회수 및 증식을 이하와 같이 행하였다. 최초에, SeV-KLF4 벡터 플라스미드, 그리고 T7 RNA 폴리메라아제, NP, P, F5R 및 L 유전자를 갖는 플라스미드를 293T 세포에 유전자 도입했다. 세포를 10％의 열불활성화 소 태아 혈청(FBS)을 첨가한 DMEM 중에서 유지하고, 1 내지 3일간 배양하여 SeV-KLF4 벡터의 시드를 생성시켰다. 시드를 클로닝하고, 트립신(2.5㎍/ml)을 포함하는 MEM 중에서 SeV F 발현 LLC-MK2/F7/A 세포를 사용하여 증식시켰다. 회수한 SeV-KLF4 벡터의 역가(세포 감염 단위/mL)를, 종전에 기재되어 있는 바와 같이 항SeV 토끼 폴리클로날 혈청을 사용한 면역 염색법에 의해 결정했다(Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K. & Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cell susing a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B 85, 348-362, doi: 10.2183/pjab. 85. 348(2009).).
인간 체세포로부터 나이브형 iPSC로의 초기화
종래의 방법에서는, CytoTune-iPS 2.0 또는 2.0L 초기화 키트를 사용하여 HDF 또는 PBMC를 초기화했다. 신규의 방법에서는, 키트에 포함되어 있던 KLF4/TS 벡터를 신규의 SeV-KLF4 벡터(KLF4/TS12, KLF4/PmiR367T2/TS, 또는 KLF4/PmiR367T2/TS12 등)로 치환했다. 나이브형 iPSC의 콜로니가 생성될 때까지 인큐베이션 온도를 35℃로 유지했다. 생성한 iPSC의 1회째의 계대의 후(통상, day14), 인큐베이션 온도를 38℃로 변경하여, SeV 벡터를 제거했다. SeV 벡터를 제거한 후(SeV-KLF4/PmiR367T2/TS12를 사용한 경우, day34), 온도를 37℃로 변경했다. SeV 벡터를 감염시킨 후, 인큐베이터를 5％ O2로 설정했다.
최초에, HDF를 10％ FBS를 첨가한 DMEM(Nacalai Tesque) 중에서 유지했다. day0에 세포를 계수하여, 3개의 SeV 벡터를 감염시켰다: 1) 폴리시스트로닉한 KLF4-OCT4-SOX2, 2) CMYC 또는 LMYC 및 3) KLF4(각각 감염 다중도는 5였음). day1부터 배지를 1일 간격으로 교환했다. day5에, 세포를 iMEF 피더 세포 상에 재파종했다. 다음날에 배지를 나이브용 배지로 교환했다.
PBMC의 초기화에서는, SeV 벡터 감염의 5일 전에, PBMC의 배양을 100ng/mL 인간 SCF(R&D), 100ng/mL 인간 TPO(R&D), 100ng/mL 인간 Flt3/Flk2(R&D), 50ng/mL 인간 IL-6(R&D) 및 20ng/mL 인간 IL-3(R&D)을 포함하는 StemSpan ACF(STEMCELL) 중에서 개시했다. day0에 세포를 계수하여, HDF와 동일한 초기화 수순을 사용하여 3개의 SeV 벡터를 감염시켰다. day1에 세포를 계수하여, HDF의 초기화와 동일 조건에서 재파종했다. day2부터, PBMC 배지와 동량의 PSC 배지를 1일 간격으로 첨가했다. day8에, 배지를 나이브용 배지로 완전히 교환했다.
RNA, DNA 및 miRNA의 추출, 그리고 정량적 리얼타임 PCR(qRT-PCR)
핵산 추출을 위한 시료 채취 전에, 나이브형 PSC를 젤라틴으로 코팅된 디쉬 상에서 37℃에 있어서 2시간 인큐베이트함으로써 iMEF를 제거했다. 전 RNA 및 DNA를 세포 용해물로부터 AllPrep DNA/RNA Mini Kit(QIAGEN)를 사용하여 추출하고, RNA를 RNase-Free DNase Set(QIAGEN)와 함께 인큐베이트하여 게놈 DNA를 제거했다. 마이크로 RNA(miRNA)를 NucleoSpin miRNA(MACHEREY-NAGEL)를 사용하여 추출했다. qRT-PCR을 위해, 올리고 dT 프라이머 및 랜덤한 6염기를 포함하는 PrimeScript RT Master Mix(Takara)를 사용하여, DNase로 처리된 1㎍의 RNA의 역전사 반응을 행하였다. cDNA를 TaqMan Advanced miRNA Assays(Applied Biosystems)를 사용하여 합성했다. qRT-PCR을, Fast SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems) 또는 TaqMan Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 StepOne Plus(Applied Biosystems) 또는 QuantStudio3(Applied Biosystems) 상에서 행하였다.
RNA 시퀀싱 및 데이터 해석
RNA 시퀀싱 라이브러리를, 100ng의 전 RNA를 출발 물질로 하여 제조자의 프로토콜에 따라 TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold(illumina)를 사용하여 작성했다. Hiseq2500을 위해, illumina cBot를 사용하여 HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot(illumina)에 의해 클러스터를 생성했다. 시퀀싱을, HiSeq2500(2x126 PE 모드)을 사용하여 HiSeq SBS Kitv 4에 의해 행하였다. 또한, 시퀀싱을 위해, NovaSeq 6000 S1 Reagent Kit v1.5(illumina)를 수반하여 NovaSeq 6000(2x101 PE 모드) 및 NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5를 수반하여 NextSeq 500(76 SE 모드)을 사용했다. FASTQ 파일을 bcl2fastq v2.17.1.14(illumina)를 사용하여 bcl 파일로부터 생성하고, ENCODE long-rna-seq-pipeline v2.3.4를 사용하여 처리했다. 간결하게 설명하면, 시퀀싱된 판독 데이터를 GENCODE v24의 유전자 애노테이션을 사용하여 STAR 2.5.1b에 의해 인간 참조 게놈(GRCh38)에 매핑하고, RSEM 1.2.23을 사용하여 정규화된 유전자 발현 데이터를 산출하여, Subread 1.5.1 내에 부속되어 있는 featureCounts를 사용하여 유전자수 데이터를 취득했다. 본 발명자들의 PSC주의 특성 평가를 위해, GEO로부터 입수한 GSE59435 및 GSE75868의 데이터 세트, 그리고 L. Yan et al.(Yan, L. et al. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nature structural & molecular biology 20, 1131-1139, doi: 10.1038/nsmb. 2660(2013).) 및 Y. Takashima et al.(Takashima, Y. et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell 158, 1254-1269, doi: 10.1016/j. cell. 2014. 08. 029(2014).)의 보충 데이터를 사용했다. 전 데이터에 포함되는 4,720 유전자의 발현값을 시료 사이의 분위수로 정규화하고, 각 유전자의 z스코어를 PCA에 사용했다. PSC 마커 및 산화적 인산화 관련 유전자의 발현 히트 맵을 위해, 분위수에 의해 정규화한 FPKM값을 Log2 스케일로 사용했다.
DNA 메틸화 해석
500ng의 게놈 DNA의 바이술피트 변환을 EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)를 사용하여 행하고, 제조자의 프로토콜에 따라 Infinium Human Methylation 450K 또는 EPIC BeadChip Kit(illumina)를 사용하여 글로벌 DNA 메틸화 상태를 프로파일링했다. GenomeStudio V2011.1을 사용하여 DNA 메틸화의 값을 익스포트한 후, R 3.6.3의 「minfi」 패키지를 사용하여 데이터 처리를 행하였다. 450K와 EPIC 사이에서 공통하고 있고, 공지의 SNP 부위에 위치하지 않는 합계 424,444개의 프로브를 PSC 시료의 PCA에 사용했다.
RNA-FISH
해리시킨 나이브형 iPSC를 젤라틴으로 코팅된 디쉬 상에서 37℃에 있어서 2시간 인큐베이트하여, iMEF 피더 세포를 제거했다. 이어서, 세포를 Matrigel로 코팅된 슬라이드 상의 PSC 배지 중에 파종했다. 다음날, 세포를 4％ 파라포름알데히드 중에서 15분간, 실온에서 고정했다. 슬라이드를 0.2M HCl로 20분간 처리하고, 0.2％ TritonX-100으로 10분간 투과 처리하고, 펩신 용액(0.1M HCl 중 0.005％)으로 37℃에 있어서 2 내지 6분간 소화하여, 탈수했다. 박테리아 인공 염색체(BAC) RP11-155O24 및 RP11-256P2를 사용하여, 각각 HUWE1 및 UTX RNA FISH 프로브를 생성했다. BAC DNA를 Cy5-dUTP(RP11-155O24) 및 Cy3-dUTP(RP11-256P2)를 사용한 닉 트랜슬레이션에 의해 표지했다. 표지한 프로브 및 XIST RNA FISH 프로브(Chromosome ScienceLabo)를, 초음파 처리한 연어 정자 DNA 및 Cot-1DNA와 함께 하이브리다이제이션 용액 중에서 혼합했다. 프로브를 85℃에서 10분간 변성시켜, 전처리한 슬라이드에 적용하고, 커버 유리로 덮고, 37℃에서 밤새 하이브리다이즈시켰다. 이어서, 슬라이드를 50％ 포름아미드/2xSSC로 37℃에 있어서 20분간, 1xSSC로 실온에 있어서 15분간 세정하고, DAPI를 사용하여 대비 염색하여, 마운트했다. FISH 화상을, Leica DMRA2 현미경 상에 설치한 냉각 CCD 카메라를 사용하여 CW4000 FISH 애플리케이션 프로그램(Leica Microsystems Imaging Solution)에 의해 촬영했다.
나이브형 PSC 유래의 원시 내배엽 분화
원시 내배엽 분화를 위해, 나이브형 PSC를 해리시켜, iMEF 피더 세포를 상술한 바와 같이 제거했다. 500,000개의 세포를, 초기 원시 내배엽 분화 배지(Ndiff227, 25ng/ml FGF4(Peprotech), 1ug/ml Heparin(Wako), 10ng/ml BMP4(R&D), 10ng/ml PDGFAA(Peprotech), 1uM XAV939(Sigma), 3μM A83-01(Wako), 0.1μM RA(Sigma))를 포함하는 라미닌 511-E8(0.4㎍/㎠ iMatrix 511; Nippi)로 코팅된 6웰 중에 파종했다. 다음날 상기와 동일한 배지에서 배지 교환을 행하였다. 3일째, 상기 배지에 10ng/ml IL-6(R&D)을 더한 배지로 교환했다. day3에 Trypsin/EDTA(Nacalai)를 5분간 사용하여 세포를 박리 회수하고, 플로 사이토메트리에 의해 PDGFRA 및 ANPEP의 발현을 해석했다.
나이브형 PSC 유래의 영양 외배엽(TE) 분화
TE 분화를 위해, 나이브형 PSC를 해리시켜, iMEF 피더 세포를 상술한 바와 같이 제거했다. 500,000개의 세포를, 초기 TE 분화 배지(Ndiff227, 2μM A83-01(Wako), 2μM PD0325921(Sigma) 및 10ng/mL BMP4(R&D))를 포함하는 라미닌 511-E8(0.15㎍/㎠ iMatrix 511; Nippi)로 코팅된 6웰 중에 파종했다. 다음날, 배지를 Ndiff227, 2μM A83-01(Wako), 2μM PD0325921(Sigma) 및 1㎍/ml JAK 저해제 I(Merck)로 교환했다. 다음날, 배지를 다시 교환했다. day3에 Accutase(Innovative Cell Technologies)를 30분간 사용하여 세포를 회수하고, 플로 사이토메트리에 의해 TACSTD2, ENPEP, HAVCR1 및 HLA-ABC의 발현을 해석했다.
플로 사이토메트리
해리시킨 세포를, Alexa Fluor 488 표지 TROP-2(TACSTD2), PE 표지 CD249(ENPEP), Tim-1(HAVCR1) 비오틴화 항체 및 Pacific Blue 표지 HLA-ABC 항체를 사용하여 빙상에서 20분간 염색했다. 세정 후, APC 스트렙트아비딘을 적용하여, 빙상에서 20분간 인큐베이트했다. 해석을, FACS Diva 소프트웨어(BD Biosciences)를 구비한 BD LSR Fortessa(BD Biosciences) 및 FACSAria II(BD Biosciences) 플로 사이토미터를 사용하여 행하였다. 데이터를, FlowJo 소프트웨어(LLC)를 사용하여 해석했다.
통계 및 재현성
정확한 n의 값을 관련하는 도면의 설명에 기재하고 있다. 통계적 유의성을, Prism 소프트웨어(GraphPad)를 사용한 대응이 없는 스튜던트의 양측 t 검정에 의해 결정했다. P<0.05를 유의미하다고 간주하고, 도면 중에 애스테리스크로 나타내고 있다. 에러 바는 평균값±s.d.를 나타낸다.
데이터의 입수 가능성
시퀀싱 및 어레이의 데이터는 GEO에 등록되어 있고, 액세션 번호는 GSE179476이다.
[실시예 1] 본 실시예에서 사용되는 센다이 바이러스 벡터(SeV)의 제조
본 실시예에서 사용되는 센다이 바이러스 벡터의 구조를 이하에 나타낸다. 또한, 본 명세서에 있어서 「18+」이란 NP 유전자 앞에 초기화 인자를 삽입하는 것을 나타내고, 「PM」란, P 유전자와 M 유전자 사이에 초기 인자를 삽입하는 것을 나타내고, 「HNL」란, HN 유전자와 L 유전자 사이에 초기화 인자를 삽입하는 것을 나타낸다. 또한 본 명세서에 있어서 「TS」란, M 단백질에 G69E, T116A 및 A183S의 변이를, HN 단백질에 A262T, G264R 및 K461G의 변이를, P 단백질에 L511F 변이를, 그리고 L 단백질에 N1197S 및 K1795E 변이를 갖는 것을 나타낸다. 또한 본 실시예에 있어서 「TS7」이란, TS 변이에 더하여 L 단백질에 Y942H, L1361C 및 L1558I의 변이를 더 갖는 것을 나타내고, 「TS12」란, TS 변이에 더하여 P 단백에 D433A, R434A 및 K437A의 변이를 더 갖는 것을 나타내고, 「TS15」란, TS12 변이에 더하여 L 단백에 L1361C 및 L1558I를 갖는 것을 나타낸다. 「ΔF」란, F 유전자를 결실하고 있는 것을 나타낸다. 또한, 「KOS」란, KLF4, Oct4 및 Sox2의 동시 탑재를 나타낸다. 예를 들어, P 유전자와 M 유전자 사이에 KLF4, Oct4 및 Sox2를 탑재하는 TS12 변이를 갖는 F 유전자 결실형 센다이 바이러스 벡터는 PM/KOS/TS12ΔF라고 기재한다. 마찬가지로, NP 유전자 앞에 KLF4를 탑재하는 TS 변이를 갖는 F 유전자 결실형 센다이 바이러스 벡터는 18+/KLF4/TSΔF라고 기재한다.
체세포로부터 나이브형 다능성 줄기 세포를 제조하기 위해 종래 사용되고 있는 센다이 바이러스 벡터(CytoTune-iPS2.0L)를 도 1에 나타낸다. 탑재되어 있는 cDNA를 백색으로 나타내고 있다. 본 실시예에서 사용되는 센다이 바이러스 벡터는, 도 1에 기재된 센다이 바이러스 벡터 중, KLF4 벡터로서 「18+/KLF4/TSΔF」 대신에 「18+/KLF4/TS7ΔF」, 「18+/KLF4/TS12ΔF」 또는 「18+/KLF4/PmiR367T2/TSΔF」의 어느 것을 사용한 시스템이다. 여기서, 「PmiR367T2」란, miR367 인식 서열을 P 유전자의 5'측에 탠덤하게 탑재되어 있는 것을 나타낸다.
KOS 벡터 「PM/KOS/TS12ΔF」 및 LMYC 벡터 「HNL/LMYC/TS15ΔF」를 통상의 방법에 의해 제작했다(WO2012/029770 및 WO2010/008054). 또한, 「18+/KLF4/TS7ΔF」 및 「18+/KLF4/TS12ΔF」는 각각 TS7, TS12 벡터 골격을 사용하여 「18+/KLF4/TSΔF」(WO2010/008054)와 마찬가지의 방법으로 제작했다. 또한 「18+/KLF4/PmiR367T2/TSΔF」는, 통상의 방법에 의해 제작했다(WO2017/082174).
[실시예 2] 인간 피부 섬유아세포(HDF)로부터의 나이브형 iPS 세포의 제조
인간 피부 섬유아세포(HDF)로부터 나이브형 iPS 세포를 제조하기 위한 프로토콜을 도 2에 나타낸다.
공정 (1)
인간 피부 섬유아세포를, 센다이 바이러스 벡터를 감염시키는 1일 전에 젤라틴 코트 완료의 12well 플레이트 또는 6well 플레이트에 SeV 감염용 및 세포수 계측용으로서 동일한 세포수 파종하고, 섬유아세포용 배지(섬유아세포 배지: DMEM+10％ FBS)를 사용하여 37℃에서 통상 산소 조건 하(약 20％)에서 배양했다. 다음날(day0)에 세포수 카운트용으로 파종한 세포를, 세포 박리액을 사용하여 박리하여 세포수 계측을 행하고, 세포수에 따른 양의 센다이 바이러스 벡터를 감염시키고, 이후는 35℃ 저산소(5％ O2) 환경에서 인큐베이트했다. 감염시키는 센다이 바이러스 벡터의 양은 하나의 기준으로서 KOS:MOI5, LMYC:MOI5, KLF4:MOI5이지만, 세포에 따라 적절히 조건 검토를 행하였다. 24시간 후(day1) 및 day2, day4에 새로운 섬유아세포용 배지에 배지 교환을 행하였다. day4에 iMEF(방사선 조사 후 마우스 태아 섬유아세포)를 파종한 세포 배양 용기를 준비했다. day5에 세포 박리액을 사용하여 세포를 박리하고, 세포수 계측을 행한 후 iMEF가 파종되어 있는 세포 배양 용기 상에 임의의 세포수를 파종했다. 본 실시예에서는, 5％의 CO2 농도 조건 하에서 배양을 행하였다.
공정 (2)
day6부터 나이브용 배지(t2iLGo+Y)로 변경하고, 이후 1일 간격으로 배지 교환을 행하였다.
t2iLGo+Y 배지의 조성을 이하에 나타낸다. 기재되어 있는 농도는 모두 최종 농도이다:
NDiff227(다카라 바이오사제)
CHIR99021(Sigma-Aldrich사제) 1μM
PD0325901(Sigma-Aldrich사제) 1μM
Go6983(Sigma-Aldrich사제) 1.25μM 또는 2.5μM
인간 재조합 백혈병 억제 인자(Human recombinant leukemia inhibitory factor)(후지 필름 와코 준야쿠사제) 10ng/ml
Y27632(후지 필름 와코 준야쿠사제) 10uM.
여기서, Y27632는 계대 다음날 이후는 첨가하지 않아도 된다.
day10경부터, 중층이고 돔형인 콜로니(나이브형 iPS 세포 콜로니)가 출현했다.
공정 (3)
Day10 이후, 상기 중층이고 돔형인 콜로니가 충분한 크기(직경 50 내지 200㎛ 정도)가 된 시점에서 계대를 행하고, 다음날부터 고온 배양(기본적으로 38℃)을 개시했다.
t2iLGo+Y 배지를 1일 간격으로 교환하여, 산소 농도 5％의 인큐베이터에서 배양을 행하였다. 또한 3 내지 4일마다 계대를 행하였다. 계대 시의 세포 박리는 배지를 제거 후 D-PBS(나카라이테스크사제)로 1회 세정하고, Accutase(Innovative Cell Technologies사제)를 더하여 7 내지 10분 37℃에서 인큐베이트하여 행하였다. 유지만이 목적인 경우, 하나의 기준으로 하여 박리하여 얻어진 세포수의 1/5 정도를 동 면적의 배양 용기에 파종했다.
45회 계대 후의 세포의 위상차 현미경 이미지를 도 3a에 나타낸다. 중층이고 돔 형상인 콜로니가 다수 인정되고, 단층이고 편평한 콜로니는 거의 확인되지 않았다. 또한, 도 3b에, 도 3a의 돔 형상 콜로니를 나이브형 특이적 마커(NANOG, KLF17) 및 나이브형과 프라임형이고 세포내 국재가 다른 유전자 산물(TFE3)로 면역 염색한 화상을 나타낸다. Hoechst는 핵 염색, PC는 위상차 현미경상을 나타낸다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 상기 돔 형상 콜로니의 구성 세포는 NANOG 및 KLF17에 대하여 강 염색되어, TFE3은 핵이 농염되어 있었다. 즉, 나이브형 특이적 마커를 발현하여, 특정 유전자 산물이 나이브형 특이적인 세포내 국재를 나타내고(착상 전 배의 내부 세포괴와 동등한 유전자 발현 패턴), 또한 중층이고 돔형인 콜로니(나이브형의 특징적인 콜로니 형태)를 형성하는 인공 다능성 줄기 세포가 얻어졌다.
따라서, 상기 공정 (1) 내지 (3)을 구비하는 방법에 의해, 인간 섬유아세포로부터 나이브형 iPS 세포가 제조되는 것이 나타났다.
이어서, 사용한 센다이 바이러스 벡터의 세포 내 잔존량을 해석했다. 비교 대상으로서, 종래 형 벡터(CytoTune-iPS2.0L)를 사용했다. 센다이 바이러스 벡터의 세포 내 게놈양을 정량적 PCR로 측정하고, Day14의 시점에서의 게놈양을 1.0으로 하여, 각각 상대값으로 나타낸 결과를 도 4에 나타낸다. 「Conv. Cocktail」은 CytoTune-iPS2.0L을 나타내고, 「KLF4/TS7ΔF」는, CytoTune-iPS2.0L의 KLF4 벡터를 「18+/KLF4/TS7ΔF」로 치환한 것을 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서 사용한 벡터는, Day38에는 이미 검출 한계 이하까지 감소하고 있었다. 즉, 38℃의 고온 배양에 의해 급속하게 소실된 것이 나타났다(KLF4/TS7ΔF_1 내지 3). 또한, KLF 벡터로서, 「18+/KLF4/TS12」 또는 「18+/KLF4/TS12/miR367T2」를 사용하여 38℃ 배양을 행한 경우는, 또한 8 내지 12일 빠르게 검출 한계 미만으로 되었다(데이터 나타내지 않음).
이에 비해, 종래형 벡터는, Day80의 시점에서도 Day14와 동일 정도 잔존하고 있었다(Conv. Cocktail_1 내지 3). 당해 벡터는, 통상의 프라임형 인공 다능성 줄기 세포 제조용 배지를 사용한 배양 조건 하에서는 일반적인 배양 온도(37℃)에서도 서서히 감소하고, Day80에는 거의 소실되는 것이 알려져 있기 때문에, 다른 세포 배양 환경에 의해 벡터의 소실 속도가 영향을 받을 가능성이 강하게 시사되었다.
따라서, 벡터 유래의 초기화 인자가 존재하지 않는 나이브형 다능성 줄기 세포를 조기에 얻기 위해서는, 나이브용 배지를 사용한 배양 하에서 온도 감수성을 나타내는 벡터, 또는 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터 등을 사용하면 되고, 상기 온도 감수성을 나타내는 벡터의 예로서, TS7, TS12 또는 TS15 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터를 사용할 수 있는 것이 나타났다.
[실시예 3] 인간 말초혈 단핵구(PBMC)로부터의 나이브형 iPS 세포의 제조
인간 말초혈 단핵구(PBMC)로부터 나이브형 iPS 세포를 제조하기 위한 프로토콜을 도 5에 나타낸다.
공정 (1)
센다이 바이러스 벡터 감염의 5일 전부터 PBMC를 PBMC용 배지를 사용하여 37℃에서 통상 산소 조건 하(약 20％)에서 배양했다. 배지 교환은 행하지 않았다. PBMC용 배지(PBMC medium)의 조성을 이하에 나타낸다. 기재되어 있는 농도는 모두 최종 농도이다:
StemSpan ACF(STEMCELL Technologies사제)
Recombinant Human SCF(R&D Systems사제) 100ng/ml
Recombinant Human TPO(R&D Systems사제) 100ng/ml
Recombinant Human Flt3/Flk2(R&D Systems사제) 100ng/ml
Recombinant Human IL-6(R&D Systems사제) 50ng/ml
Recombinant Human IL-3(R&D Systems사제) 20ng/ml.
감염 당일(day0)에 세포수를 계측하여 세포수에 따른 양의 센다이 바이러스를 감염시키고, 이후는 35℃ 저산소(5％ O2) 환경에서 인큐베이트했다. 감염시키는 센다이 바이러스의 양은 하나의 기준으로서 KOS:MOI5, LMYC:MOI5, KLF4:MOI5이지만, 세포에 따라 적절히 조건 검토를 행하였다. 감염 시에는 바이러스의 밀도를 높이기 위해 기본적으로 24well 혹은 그것보다도 작은 웰에서 감염시켰다. 또한 동일 일자에 iMEF를 파종한 세포 배양 용기(기본은 6well)를 준비했다. 감염 24시간 후(day1)에 세포를 회수하여 바이러스 포함 배지를 제거하고, 세포수 계측을 행한 후 임의의 세포수를, iMEF를 파종한 세포 배양 용기에 파종했다. 본 실시예에서는, 5％의 CO2 농도 조건 하에서 배양을 행하였다.
공정 (2)
day2에 PBMC용 배지를 절반량 제거하고, 절반량의 나이브용 배지(t2iLGo+Y)를 첨가했다. 이후 1일 간격으로 마찬가지로 하여 배지를 절반량 제거하고 새로운 배지를 절반량 첨가했다. day8에 완전히 배지를 흡인하고, 전량 나이브용 배지로 교환했다. 나이브용 배지(t2iLGo+Y)의 조성은, 실시예 2에 있어서 인간 피부 섬유아세포로부터 나이브형 iPS 세포를 제조했을 때 사용한 것과 동일하다.
공정 (3)
day10경부터 중층이고 돔 형상인 콜로니(나이브형 iPS 세포 콜로니)가 출현하고, Day10 이후 콜로니가 충분한 크기(직경 50 내지 200㎛ 정도)가 된 시점에서 계대를 행하고, 다음날부터 고온 배양(기본적으로 38℃)을 개시했다. 유지 배양 및 계대 방법은 실시예 2에 있어서 인간 피부 섬유아세포로부터 나이브형 iPS 세포를 제조했을 때 행한 방법과 동일하다.
38℃에서의 배양을 개시한 day14부터 계대마다 센다이 바이러스 벡터의 게놈양을 qPCR로 정량 평가했다(도 6). KLF4 벡터로서 18+/KLF4/TS7ΔF를 사용한 경우, 벡터양은 day38에 검출 한계 미만이 되었지만, 18+/KLF4/TS12ΔF 또는 18+/KLF4/PmiR367T2/TSΔF를 사용한 경우에는 day30에 검출 한계 미만이 되었다.
따라서, 상기 공정 (1) 내지 (3)을 구비하는 방법에 의해, 인간 말초혈 단핵구로부터도 나이브형 인공 다능성 줄기 세포가 제조되는 것, 또한, 약 30 내지 38일 후에는 초기화 인자를 실질적으로 포함하지 않는 나이브형 iPS 세포가 얻어지는 것이 나타났다.
따라서, 본원에 관한 방법을 사용함으로써, 인간의 다양한 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포(더욱 상세하게는, 초기화 인자를 실질적으로 포함하지 않는 나이브형 iPS 세포)를 신속히 제조할 수 있는 것이 명확해졌다.
[실시예 4] 나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 형질 안정성
실시예 2, 3에서 얻어진 나이브형 인공 다능성 줄기 세포에 대하여, 장기 계대 후의 형질 안정성에 대하여 해석했다.
나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 스탠더드인 리셋 나이브형 ES 세포(Reset Naive ESC(인 하우스)), 본 발명자가 수립한 HDF 유래 프라임형 iPS 세포 8클론, 본 발명을 사용하여 얻어진 장기 계대 후(P16 내지 P45)의 HDF 유래 나이브형 iPS 세포계 4클론, PBMC 유래 나이브형 iPS 세포계 2클론과, 기보 나이브형 ES 세포(Reset Naive ESC, 6/5/4iLA Naive ESC) 및 인간 배의 싱글 셀 데이터를 통합하여 주성분 분석을 행하였다(도 7). 적 프레임으로 둘러싼 부분에 본 발명자가 수립한 나이브형 iPS 세포가 존재하고, 동일한 군 내에 Reset Naive ESC(인 하우스)도 존재하고 있고, 글로벌한 유전자 발현은 Reset Naive ESC와 동등한 것이 나타났다.
도 7과 동일한 RNA-seq로부터 얻어진 데이터를 바탕으로, 각 세포종에 있어서의 인쇄 유전자 및 X 염색체 관련 유전자의 발현 양식을 SNP 해석으로 비교 검증했다(도 8). HDF, 프라임형 및 나이브형 iPS 세포는 모두 동일 여성의 HDF 유래이다. HDF 및 프라임형 iPS 세포에서는, MEG3으로 대표되는 인쇄 유전자의 발현은 원칙적으로 편측 알레르만으로부터의 발현 패턴을 나타냈지만, 나이브형에서는 인쇄가 소실되어 양측 알레르로부터의 발현 패턴을 나타냈다. 또한 본 검증에서 사용한 여성 유래 HDF 및 프라임형 iPS 세포에서는 한쪽의 X 염색체의 불활성화에 의해, X 염색체 관련 유전자의 발현은 편측 알레르만으로부터의 발현 패턴을 나타내지만, 나이브형에서는 X 염색체 재활성화에 수반하여 양측 알레르로부터의 발현 패턴을 나타냈다.
도 7의 RNA-seq에서 사용한 동일한 세포로부터 RNA와 동시에 얻어진 DNA를 사용하여 HDF 유래 및 PBMC 유래 나이브형 iPS 세포의 글로벌 메틸화를, 메틸화 어레이를 사용하여 밀도 빈 플롯(도 9a) 및 주성분 분석(도 9b)으로 나타냈다. Primed는 신청자가 수립한 프라임형 iPS 세포, Naive는 나이브형 iPS 세포를 나타낸다. 도 9a에 있어서 본 발명에서 얻어진 나이브형은 프라임형과 비교하여 모두 Beta value가 낮은(=Hypomethylated: 저메틸화) 경향이 있고, 또한 Reset Naive ESC(인 하우스)와 동등한 저메틸화를 나타내고 있었다. 도 9b에 있어서 프라임형과 나이브형은 명확하게 나뉘어져 있고, 다른 메틸화 패턴을 갖는 것이 나타났다. 또한, 본 실시예에서 얻어진 HDF 유래 나이브형 iPS 세포의 5-메틸시토신이 전 시토신에 차지하는 비율을 LC-MS/MS를 사용하여 해석했다(도 9c). 나이브형 iPS 세포는 Reset Naive ESC와 동등한 낮은 비율을 나타내고, 게놈에 있어서의 메틸화시토신의 비율이 저하되어 있는 것이 시사되었다.
RNA-seq 및 메틸화 어레이에서 사용한 장기 계대 후(P16 내지 45)의 HDF 유래 나이브형 iPS 세포계 2클론, PBMC 유래 나이브형 iPS 세포계 2클론 및 컨트롤로서 Reset Naive ESC(인 하우스)에 대하여, 3배엽 성분의 초기 분화능을 비교 해석했다(도 10). 96well 플레이트에 ES 세포/iPS 세포를 10×106개 파종하고, 분화 배지(DMEM+20％ FBS)를 사용하여 저산소(5％ O2) 환경 하에서 24일간 배양하여, 형성된 배양체를 회수했다. 회수 검체로부터 RNA를 추출하여 역전사에 의해 cDNA를 얻은 후, TaqManh PSC Scorecard Panel(ThermoFisher Scientific사제)을 사용하여 반망라적으로 3배엽 초기 분화능을 평가했다. 도면의 좌측 단부로부터 차례로 다능성 마커, 외배엽 마커, 중배엽 마커, 내배엽 마커의 발현량을 나타낸다. 또한 회색의 플롯은 Reset Naive ESC, 적색의 플롯은 본 발명에서 얻어진 나이브형 iPS 세포를 나타낸다. 어느 클론이든 Reset Naive ESC와 동등 혹은 특히 중배엽에 있어서는 더 양호한 다분화능을 나타냈다.
이와 같이, 본원에 관한 방법으로 얻어지는 나이브형 인공 다능성 줄기 세포는, 180일을 초과하는 장기 계대 후라도, 나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 스탠다드와 마찬가지의 글로벌인 유전자 발현 패턴, 전 게놈에 걸치는 광범위한 DNA 탈메틸화, X 염색체의 재활성화 및 3배엽 성분의 초기 분화능을 나타내는 것이 확인되었다.
따라서, 본원에 관한 방법에 의해, 참된 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 신속히 제조할 수 있는 것이 명확해졌다.
[실시예 5] 개변형 OSKL-SEV 벡터 초기화 시스템의 개발
시판되고 있는 CytoTune-iPS 2.0L SeV 초기화 키트(SeV(PM)KOS/TS12ΔF(SeV-KOS), SeV(HNL)LMYC/TS15ΔF(SeV-LMYC) 및 SeV18+KLF4/TSΔF(SeV-KLF4) 벡터를 포함함)를 사용하여 인간 피부 섬유아세포(HDF)로부터 나이브형 인간 iPS 세포(nCT2.0L_1-4)를 수립했다. SeV 도입으로부터 day94에 있어서, 수립한 나이브형 인간 iPSC 중에 잔존하는 SeV의 존재를 면역 염색에 의해 검증했다(도 11a). 도 11a의 우측 상단 도면에 나타나 있는 바와 같이, 대부분의 세포가 강양성을 나타내고 있고, SeV의 고도의 잔존이 시사되었다. 이어서, 각 계대에 있어서 세포를 채취하고, 잔존하는 SeV 게놈의 양을 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)에 의해 측정했다. 시판되고 있는 CytoTune-iPS 2.0(SeV-KOS, SeV(HNL)CMYC/TS15ΔF(SeV-CMYC) 및 SeV-KLF4 벡터를 포함하는; OSKM) 또는 CytoTune-iPS 2.0L(OSKL)의 어느 것을 사용해도, HDF 또는 인간 말초혈 단핵구(PBMC)에 있어서 계대를 겹칠 때마다 SeV의 양은 일단 감소하지만, 그 후 다시 증가하는 경향이 있기 때문에, 계대를 반복해도 SeV는 소실되지 않았다(도 11b). 또한, SeV 게놈의 발현은 모든 클론에서 잔존하고 있고, 몇 가지의 세포주에서는 하우스키핑 유전자 GAPDH와 동등 또는 그 이상의 발현 레벨이었다. 잔존하는 3개의 SeV 벡터 게놈의 각 발현 레벨을 정량화한 결과, SeV-KOS 및 SeV-CMYC/LMYC 벡터는 모든 클론 중에서 특히 높은 레벨로 잔존하고 있고, SeV-KLF4 벡터는 반수 이상의 클론 중에서 특히 높은 레벨로 잔존하고 있었다(도 11c).
이들 벡터가 잔존하는 이유를 검토했다. SeV 벡터는 혼합 감염에 있어서 바이러스 단백질을 공유하지만, SeV-KLF4/TS 벡터의 골격을 형성하는 SeV-TSΔF 벡터는 SeV-TS12ΔF 또는 SeV-TS15ΔF 벡터와는 달리 온도 감수성이 매우 낮기 때문에, 온도의 상승에 의해 감염 세포로부터 제거하는 것이 곤란한 것이 알려져 있다. SeV-TSΔF, SeV-TS12ΔF 또는 SeV-TS15ΔF 벡터 중의 각 유전자에 있어서의 점 변이의 유무를 표 1에 나타낸다.
따라서 본 발명자들은, 초기화 칵테일 중의 SeV18+KLF4/TSΔF(KLF4/TS) 벡터의 존재가, 모든 SeV 벡터 게놈의 지속의 주요한 원인이라고 가정했다.
이 가설을 검증하기 위해, SeV-KLF4/TS 벡터의 대체물로서 이하의 3종의 개변 SeV-KLF4 벡터를 적용했다(도 11d): SeV18+KLF4/TS12ΔF(SeV-KLF4/TS12), SeV18+KLF4/PmiR367T2/TSΔF(SeV-KLF4/miR/TS) 및 SeV18+KLF4/PmiR367T2/TS12(SeV-KLF4/miR/TS12) 벡터. SeV-KLF4/TS12 벡터는, 온도 감수성을 증강시키기 위해 P 유전자에 더 많은 점 변이를 갖는 SeV-TS12ΔF 벡터에 기초하여 형성되어 있다(도 11d). SeV-KLF4/miR/TS 벡터는, SeV 벡터 게놈의 P 유전자의 5'측에 탠덤하게 삽입된 hsa-microRNA-367(miR-367) 표적 서열(즉, miR-367 그 자체가 아니라, miR-367의 표적 서열)을 갖고 있다(도 11d). miR-367은 프라임형 인간 다능성 줄기 세포(PSC)에 있어서 특이적으로 대량 발현되어 있는 것이 확인되어 있지만, 본 발명자들은 miR-367이 나이브형 인간 PSC에 있어서도 HDF와 비교하여 대량 발현되어 있는 것을 확인했다(도 11e). 따라서, miR-367의 수용성은, 나이브형 인간 PSC에 있어서의 신속한 SeV 벡터의 제거에 유용하다고 생각되었다. SeV-KLF4/miR/TS12 벡터는 SeV-KLF4/TS12 및 SeV-KLF4/miR/TS의 양쪽의 특징을 내장하고 있고, 벡터의 제거를 더 신속화할 수 있는 것이 시사되었다(도 11d).
이들 벡터의 조합에 의한 초기화의 효율을 비교했다. 인간 섬유아세포로부터의 iPSC 제작에 있어서 KLF4 유전자를 갖는 온도 감수성 SeV 벡터를 사용한 경우, (아마 초기화가 완료되기 전에 대부분의 벡터가 소실되기 때문에) 감염 다중도가 높았던 경우를 제외하고 37℃에서는 iPSC를 제작할 수 없었던 것이 보고되어 있다. 따라서, 감염 시부터 충분한 나이브형 iPSC 콜로니가 출현하는 day14까지 세포를 35℃에서 배양하여, 1회째의 계대를 행하였다. 1회째의 계대 후, 배양 온도를 38℃로 높이고, SeV 벡터를 제거했다(도 11f). SeV-KOS, SeV-LMYC 및 개변형 SeV-KLF4 벡터를 사용한 HDF의 초기화는, 약 day10에 나이브형 iPSC 콜로니의 출현을 초래하고, 이것은 SeV-KLF4/TS 벡터를 사용하는 종래의 방법과 일치하고 있었다.
인간 말초혈 단핵구(PBMC)로부터 나이브형 인간 iPSC를 수립했다고 하는 보고는 없다. 실제로 본 발명자들도 CytoTune-iPS 2.0을 사용하여 PBMC로부터 나이브형 인간 iPSC를 수립할 수는 없었다(도 11g).
[실시예 6] SeV 소실 속도의 검증, 피더 프리의 나이브형 iPSC로의 응용
각 KLF4 벡터를 사용하여 HDF로부터 나이브형 인간 iPS 세포를 수립한 경우의 수립 효율을 비교했다(도 12a). 어느 벡터든 종래의 벡터(SeV-KLF4/TS)와 비교하여 수립 효율의 저하는 없고, SeV-KLF4/TS12 또는 SeV-KLF4/miR/TS12를 포함하는 OSKL(CMYC를 LMYC로 치환한 OSKM) 칵테일은 종래의 벡터와 비교하여 수립 효율이 현저하게 향상되었다.
이어서, 이들 벡터에 의해 제작된 나이브형 iPSC 중에 잔존하는 SeV 벡터를 검출했다. iPSC 유래의 분화 세포를 재생 의료에 응용하기 위해서는, 적어도 1x105개의 세포로부터 외래성 다능성 유전자의 잔존에 기인하는 단일의 미분화 세포를 검출하는 감도가 필요해진다. qRT-PCR 해석은 1x106개의 SeV 음성 세포로부터 단일의 SeV 양성 세포를 검출할 수 있는 감도를 갖는 것을 확인했다(도 12b). 계산상에서는 1,638,400개의 SeV 음성 세포 중에 1개라도 SeV 양성 세포가 있으면 검출 가능하고, 면역 염색 등의 방법보다도 훨씬 감도가 높다. 이 qRT-PCR 해석에 의해, SeV 게놈의 잔존량을 정량적으로 평가했다. day14에 온도를 변화시킨 후, SeV-KLF4/TS12, SeV-KLF4/miR/TS 및 SeV-KLF4/miR/TS12 벡터는 SeV 게놈의 현저한 클리어런스를 나타냈지만, SeV-KLF4/TS 레벨의 저하는 매우 늦었다. 특히, SeV-KLF4/miR/TS12는 day34에 qRT-PCR의 검출 한계에 도달하고, 이것은 SeV-KLF4 벡터 중에서 가장 빨랐다(도 12c). 이들 결과로부터, SeV-KLF4/miR/TS12 벡터가 초기화 효율 및 벡터의 클리어런스 속도에 관하여 가장 우수한 SeV-KLF4 벡터라고 결론지었다.
SeV-KLF4/miR/TS12 벡터를 사용한 초기화에 대하여 더 검증했다. SeV-KOS, SeV-LMYC 및 SeV-KLF4/miR/TS12 벡터를 사용하여, HDF(nOSKL_1, 2)뿐만 아니라 PBMC(nOSKL_3, 4)로부터도 나이브형 iPSC 클론을 제작할 수 있었다. day34에, 모든 nOSKL-iPSC 클론에 있어서 SeV가 소실된 것이 확인되었다(도 12d). 흥미롭게도, t2iLGo 배지에 방사선 조사 후 마우스 태아 섬유아세포(iMEF)를 접촉시킨 순화 배지를 초기화의 처음부터 사용함으로써, HDF로부터 피더 프리의 나이브형 iPSC를 수립 및 유지하는 데 성공했다(nOSKL_FF_1, 2)(도 12e). 이어서, nOSKL_1-4의 세포 증식 속도를 계측했다. 모든 클론에 있어서 계대를 겹쳐도 세포 증식 속도의 명확한 저하는 인정되지 않았다(도 12f).
[실시예 7] 수립한 나이브형 iPSC의 유전자 발현
이어서, 제작한 nOSKL-iPSC의 나이브형 다능성에 특이적인 특성을 검증했다. 비교를 위해, nOSKL-iPSC와 동일한 체세포로부터 유도한 프라임형 인간 iPSC(OSKL_1-4), 프라임형 WA09 H9 배아 줄기 세포(ESC; H9), 프라임형 201B7 iPSC(201B7), 그리고 KLF2 및 NANOG를 과잉 발현시킴으로써 프라임형으로부터 나이브형으로 리셋하고, nOSKL-iPSC와 동일한 조건에서 유지한 리셋 나이브형 H9 ESC(nH9)를 채취했다. 나이브형 iPSC 특이적인 마커의 발현을 qRT-PCR로 검증했다(도 13a). 여기서, NANOG는 프라임형 iPSC에서도 발현되어 있지만 나이브형 iPSC에서는 현저하게 증가하는 것이 알려져 있다. 어느 나이브형 iPSC주이든 프라임형 iPSC주와 비교하여 나이브형 iPSC 특이적인 마커를 우위하도록 높게 발현되어 있었다. 마찬가지로, 프라임형 iPSC 특이적인 마커의 발현을 qRT-PCR로 검증했다(도 13b). 어느 나이브형 iPSC주이든 프라임형 iPSC주에 비해 프라임형 iPSC 특이적인 마커를 우위하도록 낮게 발현되어 있었다. 이들 세포주에 대하여 RNA-seq를 행하여 대표적인 다능성 마커의 발현을 비교했다(도 13c). nOSKL-iPSC는 nH9와 거의 동등한 다능성 마커 발현을 나타냈다. 이어서, nOSKL-iPSC의 트랜스크립톰을, 프라임형 PSC, 그리고 이전에 공개된 리셋 나이브형 PSC 및 인간 내 세포괴의 데이터 세트와 비교했다(Takashima, Y. et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell 158, 1254-1269, doi: 10.1016/j. cell. 2014. 08. 029(2014).; Theunissen, T. W. et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell stem cell 15, 471-487, doi: 10.1016/j. stem. 2014. 07. 002(2014).; Yan, L. et al. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nature structural & molecular biology 20, 1131-1139, doi: 10.1038/nsmb. 2660(2013).). 주성분 분석(PCA)에 의해, nOSKL-iPSC가 프라임형 PSC와는 명확하게 구별되어, nH9와 거의 동일한 특징을 갖는 것이 명확해졌다(도 13d). 본 발명자들이 수립한 나이브형 인간 iPSC가 가장 외배엽에 가까웠다.
[실시예 8] 수립한 나이브형 iPSC의 메틸화 및 X 염색체의 재활성화의 검증
실시예 7의 RNA-seq에서 사용한 세포주에 있어서 메틸화 어레이를 행하였다(도 14a). 피더 프리의 나이브형 iPSC(FF_1-2)를 포함하는 nOSKL-iPSC는, 프라임형 PSC와 비교하여 글로벌한 DNA 탈메틸화 상태를 나타냈다. 또한, 메틸화 어레이 데이터의 PCA에서는, 프라임형 iPSC와 나이브형 iPSC가 명확하게 분리되었다(도 14b).
RNA-FISH에 의해 X 염색체 재활성화를 검증했다(도 14c). HUWE1은 활성화 X 염색체에서 발현이 인정되는 유전자이다. XIST는 원래 X 염색체를 불활성화시키는 방향으로 작용하는 lncRNA이지만, Naive형 iPSC와 유사한 특징을 갖는 착상 전 외배엽에서는 양쪽의 활성화 X 염색체에 있어서 XIST가 양성이 된다는 일견 모순된 소견을 인정한다(도 14c의 좌측단의 도면). 프라임형 iPSC에 근접함에 따라 도 14c의 우측의 도면에 유전자 발현 패턴이 변화되고, 프라임형 iPSC에서는 기본적으로 대부분의 세포가 도 14c의 우측단의 도면에 유전자 발현 패턴을 나타냈다(HUWEI+/-, XIST-/-). 또한, 수립한 클론에 있어서 RNA-FISH를 행하였다(도 14d). 클론에 의해 변동은 있지만, nOSKL-iPSC는 프라임형 PSC와 비교하여 명백하게 착상 전 외배엽에 유사한 패턴을 나타냈다. 이들 관찰에 의해, nOSKL-iPSC가 나이브형 상태인 것이 확인되었다.
[실시예 9] 수립한 나이브형 iPSC의 미토콘드리아 기능의 평가
실시예 7의 RNA-seq의 데이터에 기초하여, 산화적 인산화에 관련하는 미토콘드리아 유전자의 발현을 비교했다(도 15a). 나이브형 iPSC는 프라임형 iPSC와 비교하여 미토콘드리아유전자의 발현량이 높고, 이것은 호기성 대사 등의 미토콘드리아 기능이 활성화되어 있는 것을 시사하고 있다. 이어서, 세포 외 플럭스 애널라이저를 사용하여 나이브형 iPSC와 프라임형 iPSC의 대사능을 비교했다(도 15b). 나이브형 iPSC는 프라임형 iPSC와 비교하여 FCCP 투여 후에 산소 소비 속도(OCR)가 현저하게 상승하고 있고, 이것은 나이브형 iPSC의 우수한 예비 호흡능을 시사하고 있다. 나이브형 iPSC와 프라임형 iPSC에 대하여, 호기성 대사능의 지표의 하나인 예비 호흡능을 정량 비교했다(도 15c). nOSKL-iPSC는 nH9와 마찬가지로 프라임형 iPSC와 비교하여 높은 값을 나타냈다. 또한, 해당 계 대사 기능의 지표인 세포 외 산성화 속도(ECAR) 및 호기성 대사 기능의 지표인 OCR을 조사했다(도 15d). 나이브형 iPSC는, 프라임형 iPSC와 비교하여 ECAR 및 OCR이 모두 높은 값이고, 고에너지 대사 상태인 것이 시사되었다.
[실시예 10] 수립한 나이브형 iPSC의 원시 내배엽에 대한 분화능의 검증
나이브형 PSC는 착상 전 외배엽에 유사하고, 배외 조직에 분화되는 능력을 갖는다. 이 특징은 프라임형 PSC와는 다르다. 원시 내배엽은, 프라임형 iPSC로부터 분화시키는 것을 거의 할 수 없지만, 나이브형 iPSC로부터라면 분화 가능하다. 따라서, 본 발명자들은, nOSKL-iPSC가 규정의 분화 배지에 있어서 나이브형 PSC 유래의 원시 내배엽에 분화되는 능력을 조사했다(도 16a). 분화 유도 개시 후 day3의 프라임형 ESC 및 nOSKL-iPSC의 광 현미경상을 도 16b에 나타낸다. nOSKL-iPSC는, 프라임형 ESC와 비교하여 명백하게 내배엽계 세포에 유사한 형태를 나타냈다. 이어서, 플로 사이토메트리를 사용하여 원시 내배엽 특이적 마커인 PDGFRA 및 ANPEP의 발현량을 비교 검증했다(도 16c). n9 및 nOSKL-iPSC는, 원시 내배엽 특이적인 마커인 PDGFRA 및 ANPEP를 고발현하고 있고, 원시 내배엽에 대한 양호한 분화능을 나타냈다. 프라임형 PSC 및 종래의 SeV-KLF4/TS 벡터(CytoTune-iPS 2.0L)를 사용하여 수립한 SeV가 잔존하고 있는 나이브형 iPSC는, PDGFRA 및 ANPEP의 발현 레벨이 매우 낮고, 이것은 원시 내배엽에 대한 분화능이 현저하게 낮은 것을 나타내고 있다. PDGFRA/ANPEP 공양성 세포에 있어서의 시그널값의 중앙값을 조사했다(도 16d). 프라임형 iPSC 및 SeV가 잔존하고 있는 나이브형 iPSC는 도 16d의 좌측 하단측에 분포되어 있는 것에 비해, nH9 및 본법으로 수립한 나이브형 iPSC는 우측 상단측에 분포되어 있고, 이것은 본법으로 수립한 나이브형 iPSC가 nH9에 유사한 우수한 분화능을 갖는 것을 시사하고 있다.
[실시예 11] 수립한 나이브형 iPSC의 영양 외배엽에 대한 분화능의 검증
영양 외배엽(TE)도 또한, 프라임형 iPSC로부터 분화되도록 하는 것을 거의 할 수 없지만, 나이브형 iPSC로부터라면 분화 가능하다. 본 발명자들은, nOSKL-iPSC가 규정의 분화 배지에 있어서 나이브형 PSC 유래의 영양 외배엽(TE)에 분화되는 능력을 조사했다(도 17a). 분화 유도 개시 후 day3의 프라임형 ESC 및 nOSKL-iPSC의 광 현미경상을 도 17b에 나타낸다. 분화 유도 개시 후 day3의 양자 형태는 명확하게 다르게 되어 있었다. 이어서, 플로 사이토메트리를 사용하여 영양 외배엽 특이적 마커인 TACSTD2, ENPEP, HAVCR1 및 음성 마커인 HLA-ABC의 발현량을 비교 검증했다(도 17c). n9 및 nOSKL-iPSC는, TE 특이적인 마커인 HAVCR1을 고발현하고 있고, HLA-ABC를 발현하고 있지 않기 때문에, TE에 대한 양호한 분화능을 나타내고 있었다. 프라임형 PSC는 HAVCR1을 전혀 발현하지 않고, 반수 가까이가 HLA-ABC 양성이었기 때문에, 거의 TE에 분화되어 있지 않은 것이 시사되었다. 종래의 SeV-KLF4/TS 벡터(CytoTune-iPS 2.0L)를 사용하여 수립한 SeV가 잔존하고 있는 나이브형 iPSC는 TACSTD2, ENPEP 및 HAVCR1의 발현 레벨이 매우 낮고, 이것은 프라임형 PSC와 마찬가지로 TE에 대한 분화능이 현저하게 낮은 것을 나타내고 있다. 플로 사이토메트리에 의해, TACSTD2/ENPEP 공양성 및 HAVCR1 양성 세포의 비율을 조사했다(도 17d). 프라임형 iPSC 및 SeV가 잔존하고 있는 나이브형 iPSC는 도 17d의 좌측에 분포되어 있는 것에 비해, nH9 및 본법으로 수립한 나이브형 iPSC는 도 17d의 우측에 분포되어 있고, 이것은 본법으로 수립한 나이브형 iPSC가 nH9에 유사한 우수한 분화능을 갖는 것을 시사하고 있다. 또한, 흥미롭게도, nOSKL-iPSC의 몇 가지의 클론은 nH9보다도 높은 레벨에서 TACSTD2 및 ENPEP를 발현하고 있었다.
이상을 통합하면, 본 발명자들은, SeV-KLF4 벡터의 구성을 개량함으로써 체세포로부터 나이브형 인간 iPSC를 제작하기 위한 현저하게 고속인 SeV 게놈 제거 시스템을 개발했다. 그 결과, 종래의 방법으로 제작한 나이브형 iPSC와 비교하여, 초기 계대에 있어서 견고한 도입 유전자 비의존성을 갖고, 우수한 나이브형 특이적인 분화능을 갖는 나이브형 인간 iPSC를 취득할 수 있었다. 또한, 초기화 인자의 조합을 SeV-OSKL로 변경함으로써 PBMC로부터 나이브형 인간 iPSC로의 초기화에 성공했다. 본 발명자들은 또한, iMEF 순화 배지를 사용하여 피더 프리 환경에 있어서 피부 섬유아세포로부터 나이브형 인간 iPSC를 수립했다. 이들 기술 혁신은, 나이브형 인간 iPSC를 사용한 초기 발생의 연구 및 임상 응용을 크게 발전시킨다.
SEQUENCE LISTING <110> KYOTO UNIVERSITY ID PHARMA CO., LTD. <120> Method for producing naive human iPS cells from somatic cells <130> 676564 <150> JP2020-217472 <151> 2020-12-25 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 tcaccattgc taaagtgcaa ttcgattcac cattgctaaa gtgcaatt 48

Claims (40)

  1. 하기 공정 (1) 내지 (3)을 포함하는, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하는 방법;
    (1) 인간 체세포에, 초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터를 도입하는 공정,
    (2) 상기 체세포를 나이브용 배지의 존재 하에서 배양하는 공정 및
    (3) 공정 (2) 후, 얻어진 세포를 나이브용 배지의 존재 하, 상기 체세포당의 상기 벡터양이 공정 3 개시 시에 비해 30％ 이하로 감소하는 조건 하에서 배양하는 공정.
  2. 제1항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가 파라믹소 바이러스 벡터인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가 센다이 바이러스 벡터인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (1)의 1 내지 10일 후에 공정 (2)를 개시하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (2)를 1 내지 20일간 행하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가, 온도 감수성을 나타내는 벡터, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터 및 온도 감수성을 나타내고, 또한 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가 온도 감수성을 나타내는 벡터인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가, 나이브형 다능성 줄기 세포를 수립하는 세포 배양 환경 하에서 온도 감수성을 나타내는 벡터인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가, TS7 변이(TS 변이(M 단백질의 G69E/T116A/A183S 변이, HN 단백질의 A262T/G264R/K461G 변이, P 단백질의 L511F 변이 및 L 단백질의 N1197S/K1795E 변이)에 더하여, L 단백질의 Y942H/L1361C/L1558I 변이), TS12 변이(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이) 또는 TS15 변이(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이 및 L 단백질의 L1361C/L1558I)를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (3)이, 얻어진 세포를 38℃ 이상에서 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터가 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터이며, 상기 마이크로 RNA의 표적 서열이, NP 유전자 또는 P 유전자의, 번역 영역, 5'UTR, 또는 3'UTR에 존재하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 마이크로 RNA가 miR-367인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 초기화 인자가, OCT 유전자, SOX 유전자, MYC 유전자 및/또는 KLF 유전자를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가, OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터, MYC 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, MYC 유전자를 포함하는 벡터가, TS15 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터가, TS12 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (3)에 있어서, 상기 체세포당의 상기 벡터양이, 공정 3 개시 시부터 12일 이내에 공정 3 개시 시에 비해 30％ 이하로 감소하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나이브용 배지가, LIF(백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor)), MEK 저해제, GSK3 저해제, cAMP 산생 촉진제, TGF-β 저해제 및 PKC 저해제에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 나이브용 배지가, t2iLGo, 5iLAF 및 tt2iLGo로 이루어지는 군에서 선택되는 배지인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (2) 및 (3)을 피더 세포의 비존재 하에서 행하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 체세포가 단핵구 또는 섬유아세포인, 방법.
  23. 하기를 포함하는, 인간 체세포로부터 나이브형 인공 다능성 줄기 세포를 제조하기 위한 키트:
    초기화 인자를 포함하는 1개 이상의 벡터, 여기서 상기 1개 이상의 벡터는, 온도 감수성을 나타내는 벡터, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터 및 온도 감수성을 나타내고, 또한 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터로 이루어지는 군에서 선택됨; 및
    나이브용 배지.
  24. 제23항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터인, 키트.
  25. 제24항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가 파라믹소 바이러스 벡터인, 키트.
  26. 제25항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가 센다이 바이러스 벡터인, 키트.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가 온도 감수성을 나타내는 벡터인, 키트.
  28. 제27항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가, 나이브형 다능성 줄기 세포를 수립하는 세포 배양 환경 하에서 온도 감수성을 나타내는 벡터인, 키트.
  29. 제28항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가, TS7 변이(TS 변이(M 단백질의 G69E/T116A/A183S 변이, HN 단백질의 A262T/G264R/K461G 변이, P 단백질의 L511F 변이 및 L 단백질의 N1197S/K1795E 변이)에 더하여, L 단백질의 Y942H/L1361C/L1558I 변이), TS12 변이(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이) 또는 TS15 변이(TS 변이에 더하여, P 단백질의 D433A/R434A/K437A 변이 및 L 단백질의 L1361C/L1558I)를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 키트.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 다능성 줄기 세포에 특이적인 마이크로 RNA의 표적 서열을 포함하는 벡터가 마이너스쇄 RNA 바이러스 벡터이며, 상기 마이크로 RNA의 표적 서열이, NP 유전자 또는 P 유전자의, 번역 영역, 5'UTR, 또는 3'UTR에 존재하는, 키트.
  31. 제30항에 있어서, 상기 마이크로 RNA가 miR-367인, 키트.
  32. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 초기화 인자가, OCT 유전자, SOX 유전자, MYC 유전자 및/또는 KLF 유전자를 포함하는, 키트.
  33. 제32항에 있어서, 상기 1개 이상의 벡터가, OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터, MYC 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는, 키트.
  34. 제33항에 있어서, MYC 유전자를 포함하는 벡터가, TS15 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 키트.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, OCT 유전자, SOX 유전자 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터 및 KLF 유전자를 포함하는 벡터가, TS12 변이를 포함하는 센다이 바이러스 벡터인, 키트.
  36. 제23항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나이브용 배지가, LIF(백혈병 억제 인자(Leukemia inhibitory factor)), MEK 저해제, GSK3 저해제, cAMP 산생 촉진제, TGF-β 저해제 및 PKC 저해제에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함하는, 키트.
  37. 제36항에 있어서, 상기 나이브용 배지가, t2iLGo, 5iLAF 및 tt2iLGo로 이루어지는 군에서 선택되는 배지인, 키트.
  38. 제23항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 체세포가 단핵구 또는 섬유아세포인, 키트.
  39. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 배양 상청.
  40. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 나이브형 인공 다능성 줄기 세포의 배양 상청을 원료로서 포함하는 화장품.
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