CN116802275A - 从体细胞制备幼稚型人iPS细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法，其包括下述步骤(1)～(3)：(1)向人的体细胞导入包含重编程因子的1个以上的载体的步骤，(2)在幼稚培养基的存在下，培养前述体细胞的步骤，和(3)在步骤(2)之后，在幼稚培养基的存在下，在每前述体细胞的前述载体量与步骤3开始时相比减少至30％以下的条件下，培养得到的细胞的步骤。

Description

从体细胞制备幼稚型人iPS细胞的方法
技术领域
本申请涉及从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法。
背景技术
已知的是，小鼠的诱导性多能干(iPS)细胞和胚胎干(ES)细胞接近着床前胚囊的状态，是高度未分化状态的幼稚型(naive-type)，与此相对，由常规方法制备的人iPS细胞和人ES细胞接近着床后胚胎的状态，保有比幼稚型发生更后期状态的始发型(primed-type)的特征。
已指出，人iPS细胞与幼稚型的小鼠iPS细胞比较，多分化能力受到限制，基因操作困难，细胞株间的基因表达和多分化能力等质量偏差大等，作为这些的主要原因之一，已指出，人iPS细胞是比幼稚型发生更后期的始发型。因此，为了再生医疗的发展，迫切期望具有幼稚型的性质的人多能干细胞的制备方法。
迄今，作为人幼稚型多能干细胞的制备方法，已报告：(1)通过在始发型多能干细胞中表达特定基因、由含有特定成分的培养基培养，转换为幼稚型多能干细胞的方法(专利文献1、非专利文献1)，(2)通过由含有特定成分的培养基培养始发型多能干细胞，转换为幼稚型多能干细胞的方法(专利文献2～4)，(3)在重编程体细胞(成纤维细胞)时，通过从途中由含有特定成分的培养基培养，制备幼稚型iPS细胞的方法(非专利文献2～4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2016/148253
专利文献2：特开2015-136349
专利文献3：WO2016/179243
专利文献4：WO2017/170849
非专利文献
非专利文献1：Takashima Y et al.,Cell,158:1254-1269,2014
非专利文献2：Theunissen T et al.,Cell Stem Cell,15:471-487,2014
非专利文献3：Kilens S et al.,Nature Communications,9:360-,2018
非专利文献4：Liu X et al.,Nature Methods,14:1055-,2017
发明内容
发明要解决的课题
本申请的目的在于提供从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法。
用于解决课题的手段
本申请提供下述实施方式。
[1]
从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法，其包括下述步骤(1)～(3)：
(1)向人的体细胞导入包含重编程因子的1个以上的载体的步骤，
(2)在幼稚培养基的存在下，培养前述体细胞的步骤，和
(3)在步骤(2)之后，在幼稚培养基的存在下，在每前述体细胞的前述载体量与步骤3开始时相比减少至30％以下的条件下，培养得到的细胞的步骤。
[2]
前述[1]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是负链RNA病毒载体。
[3]
前述[2]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是副粘病毒载体。
[4]
前述[3]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是仙台病毒载体。
[5]
前述[1]～[4]的任一项记载的方法，其中，在步骤(1)的1～10日后开始步骤(2)。
[6]
前述[1]～[5]的任一项记载的方法，其中，在1～20日期间进行步骤(2)。
[7]
前述[1]～[6]的任一项记载的方法，其中，前述1个以上的载体选自由显示温度敏感性的载体，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体，和显示温度敏感性、并且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体组成的组中。
[8]
前述[7]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是显示温度敏感性的载体。
[9]
前述[8]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是在建立幼稚型多能干细胞的细胞培养环境下显示温度敏感性的载体。
[10]
前述[9]记载的方法，其中，前述1个以上的载体是包含以下的仙台病毒载体：TS7突变(TS突变(M蛋白的G69E/T116A/A183S突变、HN蛋白的A262T/G264R/K461G突变、P蛋白的L511F突变、和L蛋白的N1197S/K1795E突变)、加上L蛋白的Y942H/L1361C/L1558I突变)、TS12突变(TS突变、加上P蛋白的D433A/R434A/K437A突变)或TS15突变(TS突变、加上P蛋白的D433A/R434A/K437A突变和L蛋白的L1361C/L1558I)。
[11]
前述[7]～[10]的任一项记载的方法，其中，步骤(3)包含在38℃以上培养得到的细胞。
[12]
前述[7]～[11]的任一项记载的方法，其中，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体是负链RNA病毒载体，前述微小RNA的目标序列存在于NP基因或P基因的翻译区、5’UTR、或3’UTR。
[13]
前述[12]记载的方法，其中，前述微小RNA是miR-367。
[14]
前述[1]～[13]的任一项记载的方法，其中，重编程因子包含OCT基因、SOX基因、MYC基因和/或KLF基因。
[15]
前述[14]记载的方法，其中，前述1个以上的载体包括：包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体，包含MYC基因的载体，和包含KLF基因的载体。
[16]
前述[15]记载的方法，其中，包含MYC基因的载体是包含TS15突变的仙台病毒载体。
[17]
前述[15]或[16]记载的方法，其中，包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体、和包含KLF基因的载体是包含TS12突变的仙台病毒载体。
[18]
前述[1]～[17]的任一项记载的方法，其中，在步骤(3)中，每前述体细胞的前述载体量在自步骤3开始时12日以内与步骤3开始时相比减少至30％以下。
[19]
前述[1]～[18]的任一项记载的方法，其中，前述幼稚培养基包含选自白血病抑制因子(LIF)、MEK抑制剂、GSK3抑制剂、cAMP产生促进剂、TGF-β抑制剂和PKC抑制剂中的1种以上的化合物。
[20]
前述[19]记载的方法，其中，前述幼稚培养基是选自t2iLGo、5iLAF、和tt2iLGo中的培养基。
[21]
前述[1]～[20]的任一项记载的方法，其中，在饲养细胞不存在下进行步骤(2)和(3)。
[22]
前述[1]～[21]的任一项记载的方法，其中，前述人的体细胞是单核细胞或成纤维细胞。
[23]
用于从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的试剂盒，其包含：
包含重编程因子的1个以上的载体，其中前述1个以上的载体选自由显示温度敏感性的载体，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体，和显示温度敏感性、并且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体组成的组中；和
幼稚培养基。
[24]
前述[23]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是负链RNA病毒载体。
[25]
前述[24]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是副粘病毒载体。
[26]
前述[25]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是仙台病毒载体。
[27]
前述[23]～[26]的任一项记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是显示温度敏感性的载体。
[28]
前述[27]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是在建立幼稚型多能干细胞的细胞培养环境下显示温度敏感性的载体。
[29]
前述[28]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体是包含以下的仙台病毒载体：TS7突变(TS突变(M蛋白的G69E/T116A/A183S突变、HN蛋白的A262T/G264R/K461G突变、P蛋白的L511F突变、和L蛋白的N1197S/K1795E突变)、加上L蛋白的Y942H/L1361C/L1558I突变)、TS12突变(TS突变、加上P蛋白的D433A/R434A/K437A突变)或TS15突变(TS突变、加上P蛋白的D433A/R434A/K437A突变和L蛋白的L1361C/L1558I)。
[30]
前述[23]～[29]的任一项记载的试剂盒，其中，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体是负链RNA病毒载体，前述微小RNA的目标序列存在于NP基因或P基因的翻译区、5’UTR、或3’UTR。
[31]
前述[30]记载的试剂盒，其中，前述微小RNA是miR-367。
[32]
前述[23]～[31]的任一项记载的试剂盒，其中，重编程因子包含OCT基因、SOX基因、MYC基因和/或KLF基因。
[33]
前述[32]记载的试剂盒，其中，前述1个以上的载体包括：包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体，包含MYC基因的载体，和包含KLF基因的载体。
[34]
前述[33]记载的试剂盒，其中，包含MYC基因的载体是包含TS15突变的仙台病毒载体。
[35]
前述[33]或[34]记载的试剂盒，其中，包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体、和包含KLF基因的载体是包含TS12突变的仙台病毒载体。
[36]
前述[23]～[35]的任一项记载的试剂盒，其中，前述幼稚培养基包含选自由白血病抑制因子(LIF)、MEK抑制剂、GSK3抑制剂、cAMP产生促进剂、TGF-β抑制剂和PKC抑制剂组成的组中的1种以上的化合物。
[37]
前述[36]记载的试剂盒，其中，前述幼稚培养基是选自由t2iLGo、5iLAF、和tt2iLGo组成的组中的培养基。
[38]
前述[23]～[37]的任一项记载的试剂盒，其中，前述人的体细胞是单核细胞或成纤维细胞。
[39]
由前述[1]～[22]的任一项记载的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液。
[40]
化妆品，其包含由前述[1]～[22]的任一项记载的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液作为原料。
发明效果
根据本申请，提供从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法。此外，提供用于从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的载体组和试剂盒。由本申请的方法得到的幼稚型诱导性多能干细胞实质上不含包含重编程因子的载体，性状稳定性高。
附图简述
[图1]用于从体细胞制备幼稚型iPS细胞的以往使用的仙台病毒载体(CytoTune-iPS2.0L)的结构。
[图2]用于从人皮肤成纤维细胞(HDF)制备幼稚型iPS细胞的方案。纵向的条显示培养基更换的时机的一个实例。
[图3A]45次传代的HDF来源的幼稚型iPS细胞的通过相差显微镜的图像。
[图3B]45次传代的HDF来源的幼稚型iPS细胞的通过多能性标记物的免疫染色图像。横向排列的3张图像分别是同视野的图像。
[图4]高温培养对仙台病毒载体的基因组量的效果。
[图5]用于从人外周血单核细胞(PBMC)制备幼稚型iPS细胞的方案。纵向的条显示培养基更换的时机的一个实例。
[图6]PBMC来源的幼稚型iPS细胞中仙台病毒载体的基因组量的从第14日的每一传代的定量评价。
[图7]综合各细胞种的单细胞数据的主成分分析。
[图8]各细胞种中印记基因和X染色体相关基因的表达模式。
[图9A]显示各细胞种的总的甲基化的密度豆荚图(Density bean plot)。
[图9B]显示各细胞种的总的甲基化的主成分分析。
[图9C]由本实施例得到的HDF来源的幼稚型iPS细胞中5-甲基胞嘧啶占总胞嘧啶的比例。
[图10]长期传代后(P16～45)的HDF或PBMC来源的幼稚型iPS细胞的三胚层成分的初期分化能力。作为对照，应用Reset Naive ESC(in-house)。
[图11A]从SeV感染94日后的由CytoTune-iPS 2.0L(nCT2.0L_1)重编程的幼稚型人iPSC中的相差图像和由SeV的免疫荧光染色。比例尺表示100μm。
[图11B]应用CytoTune 2.0或2.0L SeV重编程试剂盒重编程的幼稚型iPSC中SeV基因组表达的qRT-PCR分析。值用GAPDH表达量标准化，由平均值±s.d.表示。对于各点n＝3。
[图11C]由CytoTune2.0或2.0L重编程的幼稚型人iPSC中用GAPDH表达标准化的各SeV载体基因组表达的qRT-PCR分析。数据由平均值±s.d.表示。对于各点n＝3。本实验中，应用设计为特异性检测各SeV载体的引物和SYBR Green。
[图11D]SeV载体和改变型重编程混合物(cocktail)的模式图。将CytoTune-2.0或2.0L重编程试剂盒中SeV18+KLF4/TSΔF(KLF4/TS)载体变更为以下的3个改变型载体中的1个：SeV18+KLF4/TS12ΔF(KLF4/TS12)、SeV18+KLF4/PmiR367T2/TSΔF(KLF4/miR/TS)、或SeV18+KLF4/PmiR367T2/TS12ΔF(KLF4/miR/TS12)。KLF4/miR/TS12是本实施例中新开发的。
[图11E]由hsa-miRNA423-3p表达标准化的HDF和PSC中hsa-miRNA367-3p表达的qRT-PCR分析。数据由平均值±s.d.表示。n＝3。ND表示40次扩增循环后也未检测到。
[图11F]关于应用改变型SeV-OSKL混合物的从HDF或PBMC的幼稚型人iPSC的诱导、和幼稚型人iPSC生成后的温育温度的变化的实验计划。
[图11G]从CytoTune-iPS 2.0SeV载体感染14日后的PBMC的代表性相差图像。比例尺表示200μm。
[图12A]第14日从HDF制备的幼稚型人iPSC集落的数目。使SeV-KLF4/TS和3个改变型SeV-KLF4载体分别与SeV-KOS和SeV-LMYC共感染。数据由平均值±s.d.表示。n＝3，*表示P<0.05。
[图12B]通过qRT-PCR分析的、从SeV载体感染14日后的细胞中SeV基因组的检测灵敏度。X轴显示SeV阴性细胞中SeV阳性细胞的比例。
[图12C]由SeV-KOS、SeV-LMYC和各SeV-KLF4载体重编程的HDF来源的幼稚型iPSC中SeV基因组表达的qRT-PCR分析。数据由平均值±s.d.表示。对于各点n＝3。
[图12D]第14日和第34日由SeV-KOS、SeV-LMYC和SeV-KLF4/miR/TS12载体重编程的HDF来源的幼稚型iPSC(nOSKL_1、2)和PBMC来源的幼稚型iPSC(nOSKL_3、4)中SeV基因组表达的qRT-PCR分析。数据由平均值±s.d.表示。n＝3。
[图12E]由SeV-KOS、SeV-LMYC和SeV-KLF4/miR/TS12载体重编程的iMEF饲养细胞上的幼稚型iPSC和无饲养的幼稚型iPSC的代表性相差图像。比例尺表示200μm。
[图12F]建立的nOSKL_1-4的细胞增殖速度。
[图13A]由GAPDH表达标准化、通过qRT-PCR分析的幼稚型多能性标记物的相对表达。nH9的值设为1.0。数据由平均值±s.d.表示。n＝3。
[图13B]由GAPDH表达标准化、通过qRT-PCR分析的始发型多能性标记物的相对表达。数据由平均值±s.d.表示。n＝3。
[图13C]显示幼稚型和始发型人PSC中共同、始发型和幼稚型的多能性相关标记物基因的表达水平的RNA-seq数据的热图。
[图13D]与各文献(Takashima,Y.et al.Resetting transcription factorcontrol circuitry toward ground-state pluripotency in human.Cell 158,1254-1269,doi:10.1016/j.cell.2014.08.029(2014).；Theunissen,T.W.et al.Systematicidentification of culture conditions for induction and maintenance of naivehuman pluripotency.Cell stem cell 15,471-487,doi:10.1016/j.stem.2014.07.002(2014).；Yan,L.et al.Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantationembryos and embryonic stem cells.Nature structural&molecular biology 20,1131-1139,doi:10.1038/nsmb.2660(2013).)的复位幼稚型人iPSC和着床前胚胎样品比较的本实施例中始发型和幼稚型人PSC的RNA-seq数据的PCA。
[图14A]应用DNA甲基化阵列分析的始发型和幼稚型人PSC中总的DNA甲基化水平的豆荚图。豆荚图中的横线表示甲基化β值的平均值。
[图14B]应用DNA甲基化阵列的始发型和幼稚型人PSC中总的DNA甲基化的PCA。
[图14C]检测X连锁基因UTX(回避X染色体的失活)、HUWE1(接受X染色体的失活)和XIST的幼稚型和始发型人iPSC的代表性RNA-FISH图像。为了保证仅保有正常的X染色体的PSC在定量化中包含，分析UTX。比例尺表示20μm。
[图14D]具有两等位基因UTX表达的细胞中XIST和HUWE1的RNA-FISH模式的定量化。分析各细胞株中100个细胞。大多数的幼稚型人iPSC显示由两等位基因HUWE1表达显示的X再活化。nOSKL 3和4的几个细胞显示两等位基因HUWE1表达加上两等位基因XIST表达，这与着床前外胚层的表达模式类似。
[图15A]编码线粒体的内膜中存在的电子传递系统的蛋白的基因的热图。这些基因反映氧化磷酸化的活性，通过线粒体复合物分类，分级聚类。
[图15B]应用细胞外通量分析仪的幼稚型iPSC和始发型iPSC的代谢能力的比较。
[图15C]幼稚型iPSC和始发型iPSC的备用呼吸能力的定量化。
[图15D]幼稚型iPSC和始发型iPSC中的细胞外酸性化速度(ECAR)和氧消耗速度(OCR)。
[图16A]向原始内胚层的分化的模式图。
[图16B]始发型ESC(H9；左图)和SeV(-)幼稚型iPSC(nOSKL_4；右图)来源的原始内胚层的代表性相差图像。比例尺表示100μm。
[图16C]通过流式细胞术的、始发型ESC(H9)、幼稚型ESC(nH9)、SeV(-)幼稚型iPSC(nOSKL_4)、和SeV(+)幼稚型iPSC(nCT2.0L_4)中PDGFRA和ANPEP表达的定量化。
[图16D]通过流式细胞术的、PDGFRA/ANPEP共阳性细胞中信号值的中值。
[图17A]向滋养外胚层的分化的模式图。
[图17B]始发型ESC(H9；左图)和SeV(-)幼稚型iPSC(nOSKL_4；右图)来源的滋养外胚层的代表性相差图像。比例尺表示200μm。
[图17C]通过流式细胞术的、始发型ESC(H9)、幼稚型ESC(nH9)、SeV(-)幼稚型iPSC(nOSKL_4)、和SeV(+)幼稚型iPSC(nCT2.0L_4)中TACSTD2、ENPEP、HAVCR1和HLA-ABC表达的定量化。
[图17D]通过流式细胞术的TACSTD2(+)/ENPEP(+)和HAVCR1(+)细胞的比例。各图显示一次实验。
用于实施发明的方式
在本说明书和专利请求范围内，在数值伴有“约”的术语的情形中，意图包含其值的±10％的范围。例如，“约20”包含“18～22”。数值的范围包含两端点间全部的数值和两端点的数值。与范围有关的“约”适用其范围的两端点。因此，例如，“约20～30”包含“18～33”。
[载体]
在本申请中，载体只要是能够向体细胞导入基因的载体即可，可为病毒载体或非病毒载体，例如病毒载体。在本公开中，病毒载体是具有该病毒来源的基因组核酸、通过向该核酸整合导入基因能够表达该基因的载体。本申请的载体是例如染色体非整合型病毒载体。染色体非整合型病毒载体指来源于病毒、能够将基因导入目标细胞的病毒载体，即导入的基因没有整合入宿主的染色体(核来源的染色体)的危险性的转运体。在本申请中，病毒载体中除感染性病毒粒子外包含由非感染性病毒粒子、病毒核心、或病毒基因组与病毒蛋白的复合物等组成的复合物，即保有通过导入细胞表达搭载的基因的能力的复合物。例如在RNA病毒中，由病毒基因组和与其结合的病毒蛋白组成的核糖核酸蛋白(病毒的核心部分)能够通过导入细胞在细胞内表达导入基因(WO00/70055)。向细胞的导入只要应用适当的转染试剂等即可。这样的核糖核酸蛋白(RNP)也包含在本申请中的病毒载体中。
在本说明书中，没有整合入宿主的染色体的危险性意味着在导入病毒载体的情形中整合入宿主染色体的频率十分低。优选地，向宿主的染色体的整合频率在例如人纤维肉瘤来源的细胞株HT1080(ATCC CCL121)中以10PFU/细胞感染的情形中是5×10-4以下，更优选10-4以下，更优选10-5以下，更优选10-6以下，更优选10-7以下。染色体非整合型病毒载体优选RNA病毒。在本公开中，RNA病毒意味着具有RNA基因组、生命周期中不保有DNA的阶段的病毒。本公开中的RNA病毒不保有逆转录酶(即不含逆转录病毒)。即，在病毒增殖中，病毒基因组不经由DNA、通过RNA依赖性RNA聚合酶复制。由于RNA病毒不保有DNA阶段，通过应用RNA病毒载体，向宿主染色体的整合的风险可抑制为最小限度。RNA病毒中包含单链RNA病毒(包含正链RNA病毒和负链RNA病毒)、和双链RNA病毒。此外，包含具有包膜的病毒(包膜病毒；enveloped virus)和不具有包膜的病毒(非包膜病毒；non-enveloped virus)，但优选应用包膜病毒来源的载体。本申请中的RNA病毒中具体地包含属于以下的科的病毒。
拉沙病毒等的沙粒病毒科(Arenaviridae)
流感病毒等的正粘病毒科(Orthomyxoviridae)
SARS病毒等的冠状病毒科(Coronaviridae)
风疹病毒等的披膜病毒科(Togaviridae)
腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙台病毒、RS病毒等的副粘病毒科(Paramyxoviridae)
脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒等的小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)
马尔堡病毒、埃博拉病毒等的丝状病毒科(Filoviridae)
黄热病病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒等的黄病毒科(Flaviviridae)
布尼亚病毒科(Bunyaviridae；包含布尼亚病毒(Bunyavirus)、汉坦病毒(Hantavirus)、内罗病毒(Nairovirus)和白蛉病毒(Phlebovirus)属等)
狂犬病病毒等的弹状病毒科(Rhabdoviridae)
呼肠孤病毒科(Reoviridae)
染色体非整合型病毒载体是例如负链RNA病毒载体。负链RNA病毒载体是由包含负链(与编码病毒蛋白的有义链相对的反义链)的RNA作为基因组的病毒组成的载体。负(minus)链RNA也称为负(negative)链RNA。负链RNA病毒例如单链负链RNA病毒(也称为非分节型(non-segmented)负链RNA病毒)。“单链负链RNA病毒”意味着基因组中具有单链负链[即负链]RNA的病毒。作为这样的病毒，包含属于副粘病毒(副粘病毒科；包含副粘病毒(Paramyxovirus)、麻疹病毒(Morbillivirus)、腮腺炎病毒(Rubulavirus)和肺病毒(Pneumovirus)属等)、弹状病毒(弹状病毒科；包含水疱病毒(Vesiculovirus)、狂犬病病毒(Lyssavirus)和短暂热病毒(Ephemerovirus)属等)、丝状病毒(丝状病毒科)等的科的病毒，在分类学上属于单股负链病毒目(Mononegavirales)(病毒第57卷第1号、pp29-36、2007；Annu.Rev.Genet.32,123-162,1998；Fields virologyfourth edition,Philadelphia,Lippincott-Raven,1305-1340,2001；Microbiol.Immunol.43,613-624,1999；Field Virology,Third edition pp1205-1241 1996)。
负链RNA病毒载体例如副粘病毒载体。副粘病毒载体是副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒来源的病毒载体。例如，可以列举副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的仙台病毒(Sendai virus)。作为其它的实例，列举新城疫病毒(Newcastle diseasevirus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻疹病毒(Measles virus)、RS病毒(Respiratorysyncytial virus)、牛瘟病毒(rinderpest virus)、瘟热病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1,2,3型、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水疱性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)等。
若进一步示例本申请中可使用的病毒，包含例如仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟热病毒(PDV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反刍兽疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)、尼帕病毒(Nipah)、人副流感病毒-2(HPIV-2)、猴副流感病毒5(SV5)、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒-4b(HPIV-4b)、腮腺炎病毒(Mumps)、和新城疫病毒(NDV)等。更优选地，列举选自由仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟热病毒(PDV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反刍兽疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)、和尼帕病毒(Nipah)组成的组中的病毒。
本申请中应用的载体例如属于副粘病毒亚科(包含呼吸道病毒属、风疹病毒属、和麻疹病毒属)的病毒或其衍生物，例如属于呼吸道病毒属(genus Respirovirus)(也称为副粘病毒属(Paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物中以不损害通过病毒的基因导入能力的方式包含病毒基因被改变的病毒、和被化学修饰的病毒等。作为可适用本发明的呼吸道病毒属病毒，包含例如人副流感病毒1型(HPIV-1)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、仙台病毒(Sendai virus；也称为小鼠副流感病毒1型)、和猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。副粘病毒最优选仙台病毒。
负链RNA病毒通常在包膜内部包含由RNA与蛋白组成的复合物(核糖核酸蛋白；RNP)。RNP中包含的RNA是作为负链RNA病毒的基因组的(-)链(负链)的单链RNA，该单链RNA与NP蛋白、P蛋白、和L蛋白结合，形成RNP。该RNP中包含的RNA成为用于病毒基因组的转录和复制的模板(Lamb,R.A.,and D.Kolakofsky,1996,Paramyxoviridae:The viruses andtheir replication.pp.1177-1204.In Fields Virology,3rd edn.Fields,B.N.,D.M.Knipe,and P.M.Howley et al.(ed.),Raven Press,New York,N.Y.)。
负链RNA病毒的“NP、P、M、F、HN、和L基因”分别指编码核衣壳、磷酸、基质、融合物、血凝素-神经氨酸酶和大蛋白的基因。核衣壳(NP)蛋白与基因组RNA结合，是基因组RNA具有模板活性所不可缺的蛋白。通常，NP基因也标记为“N基因”。磷酸(P)蛋白是作为RNA聚合酶的小亚基的磷酸化蛋白。基质(M)蛋白执行从内侧维持病毒粒子结构的功能。融合(F)蛋白是与向宿主细胞的侵入有关的膜融合蛋白，血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白是与宿主细胞的结合有关的蛋白。大(L)蛋白是RNA聚合酶的大亚基。上述各基因具有各自的转录控制单元，从各基因转录单独的mRNA，转录蛋白。除P蛋白外，从P基因还翻译利用不同ORF翻译的非结构蛋白(C)、和在读取P蛋白mRNA途中通过RNA编辑产生的蛋白(V)。例如，属于副粘病毒亚科的各病毒中的各基因通常从3'按顺序如下标记。
呼吸道病毒属N P/C/V M F HN-L
风疹病毒属N P/V M F HN(SH)L
麻疹病毒属N P/C/V M F H-L
例如，对于仙台病毒的各基因的碱基序列的数据库的登录编号，对于N基因参照M29343,M30202,M30203,M30204,M51331,M55565,M69046,X17218，对于P基因参照M30202,M30203,M30204,M55565,M69046,X00583,X17007,X17008，对于M基因参照D11446,K02742,M30202,M30203,M30204,M69046,U31956,X00584,X53056，对于F基因参照D00152,D11446,D17334,D17335,M30202,M30203,M30204,M69046,X00152,X02131，对于HN基因参照D26475,M12397,M30202,M30203,M30204,M69046,X00586,X02808,X56131，对于L基因参照D00053,M30202,M30203,M30204,M69040,X00587,X58886。此外，若示例编码其它的病毒的病毒基因，对于N基因可示例CDV,AF014953；DMV,X75961；HPIV-1,D01070；HPIV-2,M55320；HPIV-3,D10025；Mapuera,X85128；Mumps,D86172；MeV,K01711；NDV,AF064091；PDPR,X74443；PDV,X75717；RPV,X68311；SeV,X00087；SV5,M81442；和Tupaia,AF079780，对于P基因可示例CDV,X51869；DMV,Z47758；HPIV-l,M74081；HPIV-3,X04721；HPIV-4a,M55975；HPIV-4b,M55976；Mumps,D86173；MeV,M89920；NDV,M20302；PDV,X75960；RPV,X68311；SeV,M30202；SV5,AF052755；和Tupaia,AF079780，对于C基因可示例CDV,AF014953；DMV,Z47758；HPIV-1,M74081；HPIV-3,D00047；MeV,ABO16162；RPV,X68311；SeV,AB005796；和Tupaia,AF079780，对于M基因可示例CDV,M12669；DMV Z30087；HPIV-1,S38067；HPIV-2,M62734；HPIV-3,D00130；HPIV-4a,D10241；HPIV-4b,D10242；Mumps,D86171；MeV,AB012948；NDV,AF089819；PDPR,Z47977；PDV,X75717；RPV,M34018；SeV,U31956；和SV5,M32248，对于F基因可示例CDV,M21849；DMV,AJ224704；HPN-1,M22347；HPIV-2,M60182；HPIV-3,X05303,HPIV-4a,D49821；HPIV-4b,D49822；Mumps,D86169；MeV,AB003178；NDV,AF048763；PDPR,Z37017；PDV,AJ224706；RPV,M21514；SeV,D17334；和SV5,AB021962，对于HN(H或G)基因可示例CDV,AF112189；DMV,AJ224705；HPIV-1,U709498；HPIV-2.D000865；HPIV-3,AB012132；HPIV-4A,M34033；HPIV-4B,AB006954；Mumps,X99040；MeV,K01711；NDV,AF204872；PDPR,X74443；PDV,Z36979；RPV,AF132934；SeV,U06433；和SV-5,S76876，对于L基因可示例CDV,AF014953；DMV,AJ608288；HPIV-1,AF117818；HPIV-2,X57559；HPIV-3,AB012132；Mumps,AB040874；MeV,K01711；NDV,AY049766；PDPR,AJ849636；PDV,Y09630；RPV,Z30698；和SV-5,D13868。但是，各病毒已知多个株，因株的差异也存在由上述示例以外的序列组成的基因。保有这些任一基因来源的病毒基因的仙台病毒载体作为本申请的载体有用。此外，关于P蛋白，其功能部位是包含C末端侧的N结合部位、L结合部位、寡聚物形成部位的区(SeV的情形中是P蛋白的C末端侧的320-568)(Blanchard L.et al.,Virology.(2004)319,201-211.)，本申请中优选P蛋白至少包含该区。例如，本申请的载体包含与上述任一病毒基因的编码序列(关于SeV的P基因，可为例如C末端侧的序列，例如第479个～第568个的氨基酸序列或第320个～第568个的氨基酸序列)保有90％以上、优选95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的同一性的碱基序列。此外，本申请的载体包含编码例如与上述任一病毒基因的编码序列所编码的氨基酸序列(关于SeV的P蛋白可为例如C末端侧的序列，例如第479个～第568个的氨基酸序列或第320个～第568个的氨基酸序列)保有90％以上、优选95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的同一性的氨基酸序列的碱基序列。此外，本申请的载体包含编码多肽的碱基序列，该多肽包含例如上述任一病毒基因的编码序列所编码的氨基酸序列(关于SeV的P基因，可为例如C末端侧的序列，例如第479个～第568个的氨基酸序列或第320个～第568个的氨基酸序列)中10个以内、优选9个以内、8个以内、7个以内、6个以内、5个以内、4个以内、3个以内、2个以内、或1个氨基酸被置换、插入、缺失、和/或添加的氨基酸序列。
另外，本说明书记载的碱基序列和氨基酸序列等的数据库登录编号所参照的序列参照例如本申请的申请日和优先权日的序列，可以指定为本申请的申请日和优先权日的任一时间点的序列，优选指定为本申请的申请日的序列。各时间点的序列可以通过参照数据库的修订历史指定。
此外，本申请的负链RNA病毒可来源于天然株、野生株、突变株、实验室传代株、和人工构建的株等。例如，列举仙台病毒Z株(Medical Journal of Osaka UniversityVol.6,No.1,March 1955p1-15)。即，该病毒可为与从天然分离的病毒保有同样的结构的病毒载体，也可为通过基因重组人工改变的病毒。例如，野生型病毒保有的任一基因中可具有突变或缺陷。例如，可以优选应用编码病毒的包膜蛋白或外壳蛋白的至少1个基因中具有突变或缺陷的病毒。这样的病毒载体例如能够在感染细胞中复制基因组、但无法形成感染性病毒粒子的病毒载体。这样的传播能力缺陷型的病毒载体不担心将感染扩大至周围，因此安全性高。例如，可以应用不含编码F和/或HN等的包膜蛋白或刺突蛋白的至少1个基因、或者它们的组合的负链RNA病毒(WO00/70055和WO00/70070；Li,H.-O.et al.,J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。若基因组RNA中编码基因组复制所必需的蛋白(例如N、P、和L蛋白)，可以在感染细胞中扩增基因组。在制备缺陷型病毒中，例如，在病毒产生细胞中外源供给缺陷的基因产物或可以补充其的蛋白(WO00/70055和WO00/70070；Li,H.-O.et al.,J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。此外，也已知不完全补充缺陷的病毒蛋白、作为非感染性的病毒粒子(VLP)回收病毒载体的方法(WO00/70070)。此外，在作为RNP(例如由N、L、P蛋白、和基因组RNA组成的RNP)回收病毒载体的情形中，可以不补充包膜蛋白而制备载体。
此外，本申请的病毒不限于天然的病毒，也包含例如人工制备的病毒。例如，本申请的病毒也包含为了将密码子最优化在核酸序列中导入突变的那种、和嵌合病毒(例如，包含同种病毒间的嵌合体、和异种病毒间的嵌合病毒(例如PIV与SeV的嵌合体等))等(J.Virol.1995,69,849-855)。
此外，本申请中的N、L、P蛋白等的病毒蛋白只要保持在导入细胞中表达基因的功能则可不为野生型。例如，可以适当应用适当附加了标签等的肽的改变蛋白、改变了密码子的蛋白、和以不失去功能的方式使野生型蛋白的氨基酸序列的一部分缺失的蛋白等。在本申请中，N、L、P蛋白也包含这样的改变蛋白和缺失型蛋白。例如，若P蛋白具有C末端的一部分，则其它的区对于病毒载体的表达不是必需的。
病毒载体是例如该病毒的(-)链单链RNA基因组来源的RNA、和与该病毒的(-)链单链RNA结合的病毒蛋白来源的并与该RNA结合的蛋白的复合物，是通过导入细胞表达搭载基因的载体。与(-)链单链RNA结合的蛋白意味着与该(-)链单链RNA直接和/或间接结合、与该(-)链单链RNA形成复合物的蛋白。复合物包含由负链RNA病毒来源的(-)链单链RNA和与其结合的负链RNA病毒来源的蛋白(例如NP、P、和L蛋白)组成的复合物。在本申请中，“负链RNA病毒来源的”意味着负链RNA病毒的组分(包含蛋白、RNA)是原样状态、或改变了一部分的状态。例如，改变负链RNA病毒的蛋白或RNA而配制的蛋白或RNA是“负链RNA病毒来源的”蛋白或RNA。本申请的载体可为具有例如包膜蛋白(F、HN、和M蛋白)等、采取病毒粒子的结构的病毒载体。此外，可为没有病毒包膜、为RNP自身的RNP载体。
负链RNA病毒中的NP、P、L蛋白与(-)链单链RNA结合，发挥对基因组RNA复制和蛋白表达不可缺的功能(以下，根据情形，将NP、P、L蛋白称为“基因组RNA结合蛋白”)。NP蛋白是与基因组RNA非常强地结合、给予基因组RNA模板活性的蛋白。基因组RNA仅在与NP蛋白的结合状态具有RNA合成的模板活性，在不与NP蛋白结合的状态完全没有模板活性。P蛋白作为RNA聚合酶的小亚基、L蛋白作为RNA聚合酶的大亚基与基因组RNA结合。因此，在负链RNA病毒中，即使缺少NP、P、L蛋白中之一，也不发生基因组RNA复制。
本申请的载体的基因组RNA中包含的基因可为病毒来源的基因序列原样，也可导入某种突变。例如，本领域技术人员可以将不损害各蛋白的功能的轻微突变通过公知方法导入基因组RNA上的各基因。例如，可通过PCR法或盒式突变法等位点特异性地导入突变、或通过化学试剂或随机核苷酸等导入随机突变。
例如，包膜蛋白和刺突蛋白中已知包含弱毒化突变和温度敏感性突变的多个突变。可以在本申请中优选应用具有这些突变蛋白基因的病毒。在本申请中，可期望应用减弱了细胞毒性的载体。载体的细胞毒性可以通过例如定量从载体感染细胞的乳酸脱氢酶(LDH)的放出而测定。LDH放出量越少，细胞毒性越低。例如，可以应用细胞毒性与野生型相比显著减弱的载体。对于细胞毒性的减弱的程度，例如，可以应用使人来源的HeLa细胞(ATCC CCL-2)或猴来源的CV-1细胞(ATCC CCL 70)以MOI(感染效价)3感染，在35～37℃(例如37℃)培养3日的培养液中的LDH放出量与野生型相比显著降低、例如降低20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、或50％以上的载体。此外，使细胞毒性降低的突变也包含温度敏感性突变。
通过测定病毒宿主的通常的温度中病毒的增殖速度或搭载基因的表达水平，可以确定与低温(例如30～36.5℃)相比在通常的温度(例如37～38℃)中活性显著降低的温度敏感性。与没有突变的那种相比，病毒的增殖速度和/或搭载基因的表达水平越降低，判断为温度敏感性越高。
本申请中可使用的病毒载体在优选至少1个、更优选至少2、3、4、5或其以上的病毒基因中具有缺失或突变。缺失和突变可对各基因任意组合导入。此处，突变可为功能降低型的突变或温度敏感性突变。应用这样的改变病毒载体在特别是能够降低宿主细胞中的细胞毒性、促进载体的除去方面可以有用。例如，本申请中优选应用的病毒载体的至少2个病毒基因缺失或突变。这样的病毒包含至少2个病毒基因缺失的那种、至少2个病毒基因突变的那种、至少1个病毒基因突变且至少1个病毒基因缺失的那种。突变或缺失的至少2个病毒基因优选编码包膜组成蛋白的基因。例如，本申请的负链RNA病毒载体优选缺陷至少F基因或M基因。例如，本申请中优选应用缺失F基因、进一步缺失M和/或HN基因、或M和/或HN基因中进一步具有突变(例如温度敏感性突变)的载体。此外，本申请中应用的载体更优选地缺失或突变至少3个病毒基因(优选编码包膜组成蛋白的至少3个基因；F、HN、和M)。这样的病毒载体包含至少3个基因缺失的那种、至少3个基因突变的那种、至少1个基因突变且至少2个基因缺失的那种、至少2个基因突变且至少1个基因缺失的那种。若列举更优选的方式，本申请中优选应用例如缺失F基因、进一步缺失M和HN基因、或M和HN基因中进一步具有突变(例如温度敏感性突变)的载体。此外，本申请中优选应用例如缺失F基因、进一步缺失M或者HN基因、剩余的M或者HN基因中进一步具有突变(例如温度敏感性突变)的载体。这样的突变型的病毒可按照公知的方法制备。
例如，作为M基因的温度敏感性突变，列举任意选自由仙台病毒M蛋白中69位(G69)、116位(T116)、和183位(A183)组成的组中的部位、或者负链RNA病毒M蛋白的相应部位的氨基酸置换(Inoue,M.et al.,J.Virol.2003,77:3238-3246)。本申请中优选应用具有编码M蛋白中上述的3个部位的任一、优选任意的2部位的组合、进一步优选3个部位全部的氨基酸被置换为其它氨基酸的突变M蛋白的基因组的病毒。
氨基酸突变优选置换为侧链的化学性质不同的其它氨基酸，例如置换为BLOSUM62矩阵(Henikoff,S.and Henikoff,J.G.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919)的值为3以下、优选2以下、更优选1以下、更优选0的氨基酸。具体地，若为仙台病毒M蛋白，可以将G69、T116、和A183分别置换为Glu(E)、Ala(A)、和Ser(S)。关于其它的负链RNA病毒M蛋白，可以将相应部位的氨基酸分别置换为Glu(E)、Ala(A)、和Ser(S)。此外，也可利用与麻疹病毒温度敏感性株P253-505(Morikawa,Y.et al.,Kitasato Arch.Exp.Med.1991:64；15-30)的M蛋白的突变相同的突变。突变的导入只要例如应用寡核苷酸等、按照公知的突变导入方法实施即可。
本说明书中，仙台病毒的氨基酸序列以GenBank ACCESSION编号：AB855655记载的Z株来源的F基因缺陷型仙台病毒的氨基酸序列为基准。因而，仙台病毒的第X个的氨基酸残基意味着，相应于GenBank ACCESSION编号：AB855655记载的氨基酸序列中第X个氨基酸残基的氨基酸残基。本说明书中，与某氨基酸序列的规定的位置“相应的位置”意味着，在某氨基酸序列与其它氨基酸序列的比对中，与某氨基酸序列的规定的位置相应的其它氨基酸序列的位置。比对可以利用例如公知的基因分析软件实施。作为具体的基因分析软件，列举Hitachi Solutions制的DNASIS、Genetics制的GENETYX、DDBJ公开的FASTA、BLAST、ClustalW等。
此外，作为HN基因的温度敏感性突变，列举例如任意选自由仙台病毒的HN蛋白的262位(A262)、264位(G264)、和461位(K461)组成的组中的部位、或者负链RNA病毒HN蛋白的相应部位的氨基酸置换(Inoue,M.et al.,J.Virol.2003,77:3238-3246)。本申请中优选应用具有编码3个部位的任1、优选任意的2部位的组合、进一步优选3个部位全部的氨基酸置换为其它氨基酸的突变HN蛋白的基因组的病毒。与上述同样，氨基酸的置换优选置换为侧链的化学性质不同的其它氨基酸。若列举优选的一个实例，将仙台病毒HN蛋白的A262、G264、和K461分别置换为Thr(T)、Arg(R)、和Gly(G)。关于其它的负链RNA病毒HN蛋白，可以将相应部位的氨基酸分别置换为Thr(T)、Arg(R)、和Gly(G)。此外，例如，也可以参考腮腺炎病毒的温度敏感性疫苗株Urabe AM9，向HN蛋白的第464和468个的氨基酸导入突变(Wright,K.E.et al.,Virus Res.2000:67；49-57)。
此外，本申请的载体可在P基因和/或L基因中具有突变。作为这样的突变，具体地，列举SeV P蛋白的第86个的Glu(E86)的突变、SeV P蛋白的第511个的Leu(L511)置换为其它氨基酸。关于其它的负链RNA病毒P蛋白也列举相应部位的置换。与上述同样，氨基酸的置换优选置换为侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地，可以示例第86个的氨基酸置换为Lys、第511个的氨基酸置换为Phe。此外，在L蛋白中，列举SeV L蛋白的第1197个的Asn(N1197)和/或第1795个的Lys(K1795)置换为其它氨基酸、和其它的负链RNA病毒L蛋白的相应部位的置换，与上述同样，氨基酸的置换优选置换为侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地，可以示例第1197个的氨基酸置换为Ser、第1795个的氨基酸置换为Glu。P基因和L基因的突变可以显著提高持续感染性、2次粒子放出的抑制、或细胞毒性的抑制效果。进一步，通过组合包膜蛋白基因的突变和/或缺陷，可以急剧提高这些效果。此外，对于L基因，列举SeV L蛋白的第1214个的Tyr(Y1214)和/或第1602个的Met(M1602)置换为其它氨基酸、和其它的负链RNA病毒L蛋白的相应部位的置换，与上述同样，氨基酸的置换优选置换为侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地，可以示例第1214个的氨基酸置换为Phe、第1602个的氨基酸置换为Leu等。以上示例的突变可以任意组合。
例如，SeV M蛋白的至少69位的G、116位的T、和183位的A、SeV HN蛋白的至少262位的A、264位的G、和461位的K、SeV P蛋白的至少511位的L、SeV L蛋白的至少1197位的N和1795位的K分别置换为其它氨基酸、并且缺陷或缺失F基因的仙台病毒载体，以及细胞毒性与这些同样或在其以下、和/或温度敏感性与这些同样或在其以上的F基因缺陷或缺失仙台病毒载体是特别优选的。关于其它的负链RNA病毒，将相应部位同样置换、缺陷或缺失F基因的载体、以及细胞毒性与这些同样或在其以下、和/或温度敏感性与这些同样或在其以上的F基因缺陷或缺失载体是优选的。若示例具体的置换实例，例如，可以列举，关于M蛋白G69E、T116A、和A183S的置换、关于HN蛋白A262T、G264R、和K461G的置换、关于P蛋白L511F的置换、并且关于L蛋白N1197S和K1795E的置换。
氨基酸突变可为向期望的其它氨基酸的置换，优选地，与上述同样，向侧链的化学性质不同的氨基酸的置换。例如，氨基酸可以分类为碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非荷电极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等的组，关于某氨基酸，列举置换为该氨基酸所属的组的氨基酸以外的氨基酸等。具体地，列举：若为碱性氨基酸，置换为酸性或中性氨基酸，若为极性氨基酸，置换为非极性氨基酸，若为保有比20种天然氨基酸的平均分子量大的分子量的氨基酸，置换为比其平均分子量小的氨基酸，相反，若为比其平均分子量小的氨基酸，置换为比其大的氨基酸等，但不限于此。
此外，作为L蛋白的突变，也列举任意选自SeV L蛋白的942位(Y942)、1361位(L1361)、和1558位(L1558)的部位、或者负链RNA病毒L蛋白的相应部位的氨基酸置换为其它氨基酸。与上述同样，氨基酸的置换优选置换为侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地，可以示例第942个的氨基酸置换为His、第1361个的氨基酸置换为Cys、第1558个的氨基酸置换为Ile。特别地，可以优选应用至少942位或1558位被置换的L蛋白。例如，也优选除1558位、1361位也置换为其它氨基酸的突变L蛋白。此外，也优选除942位、1558位和/或1361位也置换为其它氨基酸的突变L蛋白。通过这些突变，可以提高L蛋白的温度敏感性。
此外，作为P蛋白的突变，列举任意选自SeV P蛋白的433位(D433)、434位(R434)、和437位(K437)的部位、或者负链RNA病毒P蛋白的相应部位的氨基酸置换为其它氨基酸。与上述同样，氨基酸的置换优选置换为侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地，可以示例第433个的氨基酸置换为Ala(A)、第434个的氨基酸置换为Ala(A)、第437个的氨基酸置换为Ala(A)。特别地，可以优选应用这3个部位全部被置换的P蛋白。通过这些突变，可以提高P蛋白的温度敏感性。
本申请的载体中可包含的温度敏感性突变在WO2012/029770、WO2010/008054、WO2003/025570中详述。优选地，关于P蛋白，是至少433位的D、434位的R、和437位的K的3个位置置换为其它氨基酸的突变P蛋白。此外，本申请中也优选应用关于L蛋白编码至少1558位的L被置换的突变L蛋白(优选至少1361位的L也置换为其它氨基酸的突变L蛋白)、缺陷或缺失F基因的仙台病毒载体，以及细胞毒性与其同样或在其以下、和/或温度敏感性与其同样或在其以上的缺陷或缺失F基因的仙台病毒载体。各病毒蛋白除上述的突变以外在其它氨基酸(例如10以内、5以内、4以内、3以内、2以内、或1个氨基酸)中可具有突变。具有上述突变的载体显示高的温度敏感性。
本申请的载体中包含的基因组RNA可全部包含包膜蛋白基因，也可不包含一部分或全部的包膜蛋白基因。基因组RNA中包含的包膜蛋白基因(M基因、F基因、HN基因)可为野生型，也可导入温度敏感性突变。包膜蛋白的温度敏感性突变在WO2012/029770、WO2010/008054、WO2003/025570中详述。
制备病毒载体时，通过用病毒产生细胞表达期望的外来性包膜蛋白，可以制备包含其的病毒载体。这样的蛋白没有特别限制，应用给予对哺乳动物细胞的感染能力的期望的粘附因子、配体、受体等的蛋白。具体地，例如，可以列举水疱性口炎病毒(vesicularstomatitis virus；VSV)的G蛋白(VSV-G)。VSV-G蛋白可为任意的VSV株来源的那种，例如，可以应用Indiana血清型株(J.Virology39:519-528(1981))来源的VSV-G蛋白，但不限于此。本申请的病毒载体可以任意组合地包含其它的病毒来源的包膜蛋白。
本申请中的温度敏感性意味着根据培养温度而活性变化。例如在表达载体的情形中，温度敏感性载体是根据培养温度而表达量改变的载体，优选应用在30～36.5℃的范围内的某温度的表达量与比该温度高0.5～5℃、优选1～4℃、例如约3℃的温度的表达量相比显著高的那种。例如，WO2012/029770、WO2010/008054中详述的仙台病毒的TS7(M蛋白的G69E/T116A/A183S突变、HN蛋白的A262T/G264R/K461G突变、P蛋白的L511F突变、和L蛋白的N1197S/K1795E突变(以上称为“TS突变”)、加上L蛋白的Y942H/L1361C/L1558I突变)、TS12(TS突变、加上P蛋白的D433A/R434A/K437A突变)、TS13(TS突变、加上P蛋白的D433A/R434A/K437A突变和L蛋白的L1558I突变)、TS14(TS突变、加上P蛋白的D433A/R434A/K437A突变和L蛋白的L1361C)、TS15(TS突变、加上P蛋白的D433A/R434A/K437A突变和L蛋白的L1361C/L1558I)等的突变是优选的温度敏感性突变。
若示例具体的载体，可为保有例如TS7突变、TS12突变、TS13突变、TS14突变、或TS15突变的F基因缺失型仙台病毒载体(例如Z株)。具体地，列举SeV18+/TSΔF(WO2010/008054、WO2003/025570)或SeV(PM)/TSΔF中除TS突变外进一步导入TS7、TS12、TS13、TS14、或TS15的突变的载体等，但不限于这些。
另外，“TSΔF”指M蛋白中保有G69E、T116A、和A183S的突变、HN蛋白中保有A262T、G264R、和K461G的突变、P蛋白中保有L511F突变、并且L蛋白中保有N1197S和K1795E突变、缺失F基因。
优选地，本申请的载体是仙台病毒Z株来源的仙台病毒载体。Z株的基因组序列是已知的，例如，作为Z株来源的F基因缺陷型仙台病毒载体的基因组序列，列举ACCESSION：AB855655。此处Z株来源指载体的基因组中的仙台病毒基因组的序列中、Z株的序列占最高比例。即，在载体的基因组序列中、除外非仙台病毒性的序列(限制酶识别位点、简单的间隔子序列、其它种的病毒来源的序列、导入的基因的序列等)、仅集中仙台病毒的序列的情形中，指其中SeV Z株的序列占最高比例。更优选地，Z株来源指载体的基因组中的负链RNA病毒来源的序列中、SeV Z株的序列占最高比例。即，在载体的基因组序列中、除外不是取自负链RNA病毒的序列的序列(限制酶识别位点、简单的间隔子序列、负链RNA病毒以外的病毒来源的序列、导入的基因的序列等)、仅集中负链RNA病毒的序列的情形中，指其中SeVZ株的序列占最高比例。其比例优选30％以上、更优选40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上。此外，优选地，Z株来源的仙台病毒载体在基因组中连续包含例如仅1000碱基以下、500碱基以下、300碱基以下、200碱基以下、100碱基以下、50碱基以下、30碱基以下、或20碱基以下的不是Z株的仙台病毒的基因组序列(除与Z株相同的序列)。更优选地，Z株来源的仙台病毒载体在基因组中不包含不是Z株的仙台病毒的基因组序列(除与Z株相同的序列)。
本申请的载体的制备只要利用公知的方法进行即可。例如，在负链RNA病毒的情形中，作为具体顺序，典型地，可以通过(a)将编码负链RNA病毒基因组RNA(负链)或其互补链(正链)的cDNA在表达病毒粒子形成所必需的病毒蛋白(NP、P、和L)的细胞中转录的步骤、(b)回收生成的病毒的步骤而制备。作为病毒不限于感染性粒子，只要保持通过导入细胞表达基因的能力，也包含非感染性粒子、RNP等。病毒的形成所必需的病毒蛋白可从转录的病毒基因组RNA表达，也可从基因组RNA以外供给。例如，可以将编码NP、P、和L蛋白的表达质粒导入细胞而供给。在基因组RNA中病毒的形成所必需的病毒基因缺陷的情形中，也可以在病毒产生细胞中单独表达该病毒基因，补充病毒形成。为了使病毒蛋白、RNA基因组在细胞内表达，向宿主细胞导入将编码该蛋白、基因组RNA的DNA连接于在宿主细胞中发挥功能的适当启动子的下游的载体。转录的基因组RNA在病毒蛋白的存在下复制形成病毒粒子。在制备缺陷包膜蛋白等的基因的缺陷型病毒的情形中，也可以在病毒产生细胞中表达缺陷的蛋白或能够补充其功能的其它的病毒蛋白等。在本申请中，可以优选应用缺失至少F基因的载体或F基因中具有突变的载体。
通过在NP、P、和L蛋白的存在下转录本申请的载体中包含的基因组RNA(正链或负链)，可以制备本申请的RNP。RNP的形成可以由例如BHK-21或LLC-MK2细胞等进行。NP、P、和L蛋白的供给可以通过病毒载体供给，也可以通过其以外的各种方法进行。例如，可通过如上述将包含各基因的表达载体导入细胞而进行。此外，各基因可整合到宿主细胞的染色体。为了形成RNP，表达的NP、P、和L基因不必与载体的基因组中编码的NP、P、和L基因完全相同。即，这些基因编码的蛋白的氨基酸序列即使不是RNP基因组编码的蛋白的氨基酸序列原样，但只要与基因组RNA结合、保有在细胞内对基因组的转录复制活性，则可导入突变，或者可用其它的病毒的相同基因取代。此外，也可以表达野生型蛋白(野生型NP、P、和/或L蛋白)。
例如，本申请的负链RNA病毒的制备可以利用以下的以往方法实施(WO97/16539；WO97/16538；WO00/70055；WO00/70070；WO01/18223；WO03/025570；WO2005/071092；WO2006/137517；WO2007/083644；WO2008/007581；Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997、Kato,A.et al.,1997,EMBO J.16:578-587和Yu,D.et al.,1997,Genes Cells2:457-466；Durbin,A.P.et al.,1997,Virology 235:323-332；Whelan,S.P.et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8388-8392；Schnell.M.J.et al.,1994,EMBO J.13:4195-4203；Radecke,F.et al.,1995,EMBO J.14:5773-5784；Lawson,N.D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4477-4481；Garcin,D.et al.,1995,EMBO J.14:6087-6094；Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1:569-579；Baron,M.D.and Barrett,T.,1997,J.Virol.71:1265-1271；Bridgen,A.and Elliott,R.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:15400-15404；Tokusumi,T.et al.Virus Res.2002:86；33-38、Li,H.-O.et al.,J.Virol.2000:74；6564-6569)。此外，关于病毒的增殖方法和重组病毒的制备方法，也参照病毒学实验学各论、修订二版(国立预防卫生研究所学友会编、丸善、1982)。
[重编程因子]
本申请中的重编程因子指单独或与多个因子共同、为了诱导为比某细胞的分化状态更未分化状态而应用的基因或其产物，例如，包含为了诱导分化的细胞的脱分化而应用的基因或其产物。本申请中的重编程因子包含核的重编程所必需的因子、和提高核重编程的效率的辅助的因子(辅助因子)。在本申请中，可在载体中搭载用于在核重编程中应用的期望基因。例如，可以搭载用于在多能干细胞的制备中应用的基因。作为用于诱导多能干细胞的重编程因子，具体地，例如，可以应用在ES细胞、初期胚胎等中表达但在分化的多个体细胞中不表达、或表达降低的基因(ES细胞特异性基因等)。这样的基因优选编码转录因子、核蛋白等的基因。鉴定核重编程基因的方法是已知的(WO2005/80598)，实际上显示，应用该方法鉴定的基因对重编程(reprogramming)为多能干细胞是有用的(WO2007/69666)。
若列举这样的基因的实例，列举DPPA5(发育多能性相关5,ES细胞特异性基因1(ESG1)；登录编号NM_001025290,NM_025274,XM_236761)、F-盒蛋白15(Fbx15,NM_152676,NM_015798)、Nanog(NM_024865,AB093574)、ECAT1(ES细胞相关转录物1；AB211062,AB211060)、ERAS(ES细胞表达的Ras；NM_181532,NM_181548)、DNMT3L(DNA (胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3-样；NM_013369,NM_019448)、ECAT8(AB211063,AB211061)、GDF3(生长分化因子3；NM_020634,NM_008108)、SOX15(SRY(性别决定区Y)-盒15；NM_006942,NM_009235)、DPPA4(发育多能性相关4；NM_018189,NM_028610)、DPPA2(NM_138815,NM_028615)、FTHL17(铁蛋白，重多肽-样17；NM_031894,NM_031261)、SALL4(sal-样4；NM_020436,NM_175303)、Oct3/4(也称为POU5F1；NM_002701,NM_203289,NM_013633,NM_001009178)、Sox2(NM_003106,NM_011443,XM_574919)、Rex-1(ZFP42(锌指蛋白42同系物)；NM_174900,NM_009556)、Utf1(未分化的胚胎细胞转录因子1；NM_003577,NM_009482)、TCL1A(T-细胞白血病/淋巴瘤1A；NM_021966,NM_009337)、DPPA3(也称为Stella,NM_199286,NM_139218,XM_216263)、KLF4(Kruppel-样因子4；NM_004235,NM_010637)、连环蛋白β1(钙粘蛋白相关蛋白β1；NM_001904,NM_007614；包含S33Y突变体)、c-Myc(NM_002467,NM_010849；包含T58A突变体)、STAT3(信号转导物和转录激活剂3；NM_139276,NM_213659)、GRB2(生长因子受体结合蛋白2；NM_002086,NM_008163)、以及这些基因所属家族的其它成员的基因等。显示这些基因可以通过导入细胞诱导多能干细胞(WO2007/69666)。这些基因可以一个接一个地整合到另一载体，也可以组合多个基因整合到1个载体。此外，可以将各个基因整合到一种载体，或者可以将不同种类的载体(包含染色体整合型病毒载体和/或非病毒载体)与染色体非整合型病毒载体组合应用。此外，本申请的重编程的细胞的制备方法不限于应用病毒载体进行全部的基因导入的方法。即，本申请的方法只要应用至少一种染色体非整合型病毒载体即可，包括联用表达重编程因子的其它载体(染色体整合型病毒载体和/或非病毒载体)和/或诱导重编程的化合物等。
此处重编程可为从例如分化的细胞诱导多能干细胞。载体整合编码用于重编程的因子的基因而使用。作为重编程因子，例如，列举上述、或者以下示例的任一基因。
若示例用于诱导细胞的重编程的特别优选的基因，列举F-盒蛋白15(Fbx15,NM_152676,NM_015798)、Nanog(NM_024865,AB093574)、ERAS(ES细胞表达的Ras；NM_181532,NM_181548)、DPPA2(NM_138815,NM_028615)、Oct3/4(也称为POU5F1；NM_002701,NM_203289,NM_013633,NM_001009178)、Sox2(NM_003106,NM_011443,XM_574919)、TCL1A(T-细胞白血病/淋巴瘤1A；NM_021966,NM_009337)、KLF4(Kruppel-样因子4；NM_004235,NM_010637)、连环蛋白β1(钙粘蛋白相关蛋白β1；NM_001904,NM_007614；包含S33Y突变体)、和c-Myc(NM_002467,NM_010849；包含T58A突变体)、以及这些基因所属家族的其它成员的基因等。各个病毒载体在使用时可以组合应用。
特别优选的基因的组合之一是至少包含Sox基因、KLF基因、Myc基因、和Oct基因的4种基因的组合(Takahashi,K.and Yamanaka S.,Cell 126,663-676,2006；Lowry WE etal.,Proc Natl Acad Sci U S A,105(8):2883-8,2008；Masaki,H.et al.,Stem CellRes.1:105-115,2008；WO2007/69666)。此处Sox蛋白、KLF蛋白、Myc蛋白、和Oct蛋白、以及它们的基因指分别属于Sox家族、KLF家族、Myc家族、和Oct家族的成员的蛋白和基因。只要调整这4个家族的成员使得分别表达1个以上即可。例如，关于Sox家族的基因，可应用Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Sox17的任一基因。此外，关于KLF家族，只要使用KLF4或KLF2即可。关于Myc家族，不仅可以使用野生型c-Myc，也可以使用T58A突变体、N-Myc、L-Myc。如此，由于可选择各种家族的基因而使用，可以适当选择上述4种家族基因，诱导重编程。
例如，判定野生型c-Myc从仙台病毒载体等的RNA病毒载体的表达量少。但通过在野生型c-Myc中导入选自a378g、t1122c、t1125c、a1191g、和a1194g的1个以上、优选2个以上、3个以上、4个以上、或5个全部突变，使来自载体的基因稳定且高表达成为可能。基因在载体中的插入位置可以选择期望的部位。
例如，Myc基因可配置于负链RNA基因组的后方(5'侧)，即基因组上配置的多个蛋白编码序列中与从3'侧计数相比从5'侧计数更早的位置。Myc基因可以配置于例如最5'侧(即从5'侧第1位)、或者从5'侧第2或3位。Myc基因可以配置于例如基因组的5'侧至第2位，具体地，在基因组的最5'侧具有L基因、随后有HN基因的情形中，可以配置于其间。Myc基因可以适当导入沉默突变使得不改变编码的氨基酸序列，置换连续的A或T的碱基序列。
Myc基因配置于负链RNA基因组的后方(5'侧)的负链RNA病毒载体可以与包含其它重编程因子的负链RNA病毒载体组合应用。该情形中，在包含其它重编程因子的负链RNA病毒载体中，这些重编程因子可以配置于各自载体的负链RNA基因组中前方(3'侧)，即基因组上配置的多个蛋白编码序列中、与从5'侧计数相比从3'侧计数更早的位置。例如，可配置于最3'侧(即从3'侧第1位)、或者从3'侧第2或3位。例如，Myc以外的重编程因子(例如Oct基因、Klf基因和Sox基因)配置于各自的负链RNA病毒载体中从基因组的3'侧第1位或第2位，更优选第1位。具体地，可以在基因组的NP基因的3'侧的最3'端侧配置重编程因子。
具体地，作为KLF家族，包含Klf1(NM_006563,NM_010635)、Klf2(NM_016270,NM_008452)、Klf4(NM_004235,NM_010637)、Klf5(NM_001730,NM_009769)，作为Myc家族，包含c-Myc(包含NM_002467,NM_010849,T58A突变体)、NMyc(NM_005378,NM_008709)、L-Myc(NM_005376,NM_005806)，作为Oct家族，包含Oct1A(NM_002697,NM_198934)、Oct3/4(NM_002701,NM_203289,NM_013633,NM_001009178)、Oct6(NM_002699,NM_011141)，作为Sox家族，包含Sox1(NM_005986,NM_009233)、Sox2(NM_003106,NM_011443,XM_574919)、Sox3(NM_005634,NM_009237)、Sox7(NM_031439,NM_011446)、Sox15(NM_006942,NM_009235)、Sox17(NM_022454,NM_011441)、Sox18(NM_018419,NM_009236)。搭载这些基因的任一的染色体非整合型病毒载体对于在本申请中细胞的脱分化的诱导中应用是有用的。
搭载Sox基因、KLF基因、和Oct基因的各基因的任一、或者Sox基因、Myc基因、和Oct基因的各基因的任一、或者Sox基因、Myc基因、和Klf基因的组合的1个以上的病毒载体对于在本申请中细胞的重编程的诱导中应用是有用的。在不表达Myc基因的情形中，可替代性使用例如p53 siRNA和UTF1。包含各自的基因的病毒载体可分别作为单体制备。它们可以在使用时组合应用。
另外，在原始的分化细胞中、上述基因中1个或几个例如已经内源性表达的情形中，可以省略该基因的导入。包含重编程因子的病毒载体可仅使用适当、必要的那种。此外，若内源性的重编程因子的内源性的表达通过另一基因的表达或化合物处理等诱导，组合表达该另一基因的载体的导入和化合物处理，可仅导入包含仅此无法诱导的重编程因子的病毒载体。在本申请中，组合载体使得至少Oct基因、Klf基因和Sox基因的3种、至少Oct基因、Klf基因、Sox基因和Myc基因的4种、或者至少Oct基因、Sox基因、Nanog基因、Lin28基因的4种内源性或外源性表达，不仅包括例如某重编程因子在自然状态内源性表达的状态，也包括在通过表达其它基因的载体的导入和化合物、蛋白处理等能够诱导内源性的重编程因子的表达的情形中，组合该处理、组合病毒载体使得仅外源性表达不足的因子的情形。
此外，除上述4种或3种的组合以外，包含Oct基因、Sox基因、NANOG基因(NM_024865,AB093574)、和LIN28基因(NM_024674)的4种的各基因的组合也是有用的。此外，这些中进一步组合Myc基因和KLF基因也是优选的。搭载这些任一基因的病毒载体对于在本申请中细胞的脱分化的诱导中应用是有用的。包含这些基因的任意的组合(或全部)的1个以上的病毒载体也可以在细胞的重编程中优选应用。另外与上述同样，在成为对象的细胞已经表达这些基因中一部分的情形中，表达该基因的载体可导入也可不导入。
也可以在以上记载的基因的组合中进一步组合另一基因，提高重编程的诱导效率。作为这样的基因，列举TERT(NM_198253,NM_009354)和/或SV40大T抗原(NC_001669.1,Fiers,W.(05-11-1978)Nature273:(5658)113-120)。此外，可进一步组合选自HPV16 E6、HPV16 E7、Bmil(NM_005180,NM_007552)中的1个以上的基因。此外，可表达选自由Fbx15(Mol Cell Biol.23(8):2699-708,2003)、Nanog(Cell 113:631-642,2003)、ERas(Nature423,541-545,2003)、DPPA2(Development 130:1673-1680,2003)、TCL1A(Development130:1673-1680,2003)、β-Catenin(Nat Med 10(1):55-63,2004)组成的组中的1个或任意的组合。进一步，可组合选自由ECAT1(AB211062,AB211060)、DPPA5(NM_001025290,NM_025274,XM_236761)、DNMT3L(NM_013369,NM_019448)、ECAT8(AB211063,AB211061)、GDF3(NM_020634,NM_008108)、SOX15(NM_006942,NM_009235)、DPPA4(NM_018189,NM_028610)、FTHL17(NM_031894,NM_031261)、SALL4(NM_020436,NM_175303)、Rex-1(NM_174900,NM_009556)、Utf1(NM_003577,NM_009482)、DPPA3(NM_199286,NM_139218,XM_216263)、STAT3(NM_139276,NM_213659)、和GRB2(NM_002086,NM_008163)组成的组中的1个以上的基因。这些因子可以应用本申请中的染色体非整合型病毒载体表达。
另外，导入的因子只要适应要重编程的细胞的来源适当选择即可，可为人来源，也可为其它的哺乳动物来源，例如小鼠、大鼠、兔、猪、猴等灵长类来源，优选人来源。此外，基因和蛋白的序列可不一定为野生型序列，只要能够诱导重编程，可具有任何突变。例如，编码1个或少数(例如数个、3个以内、5个以内、10个以内、15个以内、20个以内、25个以内)的氨基酸被附加、缺失、置换、和/或插入的氨基酸序列的基因、即能够诱导重编程的基因可以在本申请中使用。此外，只要维持生物学活性(重编程的诱导能力)，也可以使用例如N末端和/或C末端的1～数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸被缺失或附加的多肽、和1～数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸被置换的多肽等。作为可使用的变体，包含例如天然的蛋白的片段、类似物、衍生物、和与其它多肽的融合蛋白(例如附加了异种信号肽或抗体片段的那种等)。具体地，包含含有置换、缺失、和/或附加了野生型的氨基酸序列的1个或其以上的氨基酸的序列、具有与野生型蛋白同等的生物学活性(例如诱导重编程的活性)的多肽。在应用野生型蛋白的片段的情形中，通常，包含野生型多肽(在分泌蛋白的情形中为成熟型的形式)的70％以上、优选80％以上、85％以上、更优选90％以上、95％以上或98％以上的连续区。
氨基酸序列的变体可以通过例如向编码天然的多肽的DNA导入突变而配制(Walker and Gaastra,eds.Techniques in Molecular Biology(MacMillan PublishingCompany,New York,1983)；Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492,1985；Kunkelet al.,Methods Enzymol.154:367-382,1987；Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.),1989；U.S.Pat.No.4,873,192)。作为用于置换氨基酸使得对生物学活性不造成影响的指南，列举例如Dayhoff等(Dayhoff et al.,in Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.),1978)。
改变的氨基酸数目没有特别限制，例如天然的成熟型多肽的总氨基酸的30％以内、优选25％以内、更优选20％以内、更优选15％以内、更优选10％以内、5％以内、或3％以内，例如15氨基酸以内、优选10氨基酸以内、更优选8氨基酸以内、更优选5氨基酸以内、更优选3氨基酸以内。在置换氨基酸的情形中，通过置换为侧链的性质类似的氨基酸，可以期待维持蛋白的活性。这样的置换指本申请中的保守性置换。保守性置换列举例如碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非荷电极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等的各组内的氨基酸间的置换等。此外，例如，列举BLOSUM62置换矩阵(S.Henikoff andJ.G.Henikoff,Proc.Acad.Natl.Sci.USA 89:10915-10919,1992)中正相关的氨基酸间的置换。
改变的蛋白显示与野生型蛋白的氨基酸序列的高同源性。高同源性是具有例如70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、95％以上、或96％以上的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可以应用例如BLASTP程序(Altschul,S.F.etal.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990)确定。例如，在NCBI(National Center forBiothchnology Information)的BLAST的网页中，可以应用默认的参数进行检索(AltschulS.F.et al.,Nature Genet.3:266-272,1993；Madden,T.L.et al.,Meth.Enzymol.266:131-141,1996；Altschul S.F.et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；ZhangJ.&Madden T.L.,Genome Res.7:649-656,1997)。例如，通过进行2个序列的比较的blast2sequences程序(Tatiana A et al.,FEMS Microbiol Lett.174:247-250,1999)，可以制成2序列的比对，确定序列的同一性。空位与错配同样处理，例如，对于天然型细胞因子(分泌后的成熟型的形式)的氨基酸序列全体计算同一性的值。具体地，计算野生型蛋白(在分泌蛋白的情形中是成熟型)的总氨基酸数目中一致的氨基酸数目的比例。
此外，基因可以导入沉默突变使得不改变编码的氨基酸序列。特别地，在富含AT的基因中，关于5个以上的连续A或T的碱基，通过置换为G或C使得不改变编码的氨基酸序列，可以稳定得到基因的高表达。
此外，改变蛋白或者重编程中应用的蛋白是与编码野生型蛋白的基因的编码区的一部分或全部在严格条件下杂交的核酸所编码的蛋白，列举与野生型蛋白具有同等活性(诱导重编程的活性)的蛋白。在杂交中，例如，可以通过从包含野生型蛋白基因的编码区的序列或其互补序列的核酸、或成为杂交的对象的核酸的任一配制探针，检测其是否与另一方的核酸杂交而鉴定。严格的杂交条件是在例如包含5xSSC、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑精DNA、5xDenhardt液(1xDenhardt溶液包含0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白、和0.2％Ficoll)的溶液中、在60℃、优选65℃、更优选68℃进行杂交，其后在与杂交相同的温度在2xSSC中、优选1xSSC中、更优选0.5xSSC中、更优选0.1xSSC中，边振荡边洗涤2小时的条件。
[幼稚型诱导性多能干细胞的制备方法]
本申请提供从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法，其包括下述步骤(1)～(3)：
(1)向人的体细胞导入包含重编程因子的1个以上的载体的步骤、
(2)在幼稚培养基的存在下，培养前述体细胞的步骤、和
(3)在步骤(2)之后，在幼稚培养基的存在下，在每前述体细胞的前述载体量与步骤3开始时相比减少至30％以下的条件下，培养得到的细胞的步骤。
在本公开中，作为体细胞，没有特别限定，可以利用任意的体细胞。例如，列举角化的上皮细胞(例如，角化表皮细胞)、粘膜上皮细胞(例如，舌表层的上皮细胞)、外分泌腺上皮细胞(例如，乳腺细胞)、激素分泌细胞(例如，肾上腺髄质细胞)、代谢·储存用的细胞(例如，肝细胞)、构成界面的内腔上皮细胞(例如，I型肺胞细胞)、内链管的内腔上皮细胞(例如，血管内皮细胞)、具有保有转运能力的纤毛的细胞(例如，气道上皮细胞)、细胞外基质分泌用细胞(例如，成纤维细胞)、收缩性细胞(例如，平滑肌细胞)、血液和免疫系统的细胞(例如，外周血单核细胞、脐带血、T淋巴细胞)、与感觉有关的细胞(例如，视杆细胞)、自主神经系统神经元(例如，胆碱能神经元)、感觉器官和外周神经元的支持细胞(例如，伴随细胞)、中枢神经系统的神经细胞和神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞)、色素细胞(例如，视网膜色素上皮细胞)、和它们的前体细胞(组织前体细胞)等。细胞的分化的程度和采集细胞的动物的年龄等没有特别限制，即使未分化的前体细胞(也包含体性干细胞)、最终分化的成熟细胞，都可以同样地作为本申请中体细胞的起源使用。此处作为未分化前体细胞，例如，列举神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等的组织干细胞(体性干细胞)。优选人来源的体细胞。
在本公开中，诱导性多能干细胞是通过经公知的方法等重编程(重编程(reprogramming))体细胞而诱导多能性的细胞。具体地，列举将成纤维细胞、或外周血单核细胞等的分化的体细胞通过选自包含Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等的重编程基因组的多个基因的组合的任一的表达而重编程、诱导多分化能力的细胞。
在本公开中，幼稚型诱导性多能干细胞意味着保有与着床前胚胎类似的性质的诱导性多能干细胞，可定义为呈现下列任1以上的特征的诱导性多能干细胞：与着床前胚胎的内细胞团相同的基因表达模式(具体地，1个以上的幼稚型特异性标记物的表达、或1个以上的特定基因产物的幼稚型特异性细胞内定位)、跨全基因组的广泛DNA脱甲基化、X染色体的再活化、多层圆顶状的集落形态。此处，作为幼稚型特异性标记物，例如，列举TCFP2L1、KLF17、TBX3、PRDM14、SSEA1、CD7、CD75、CD77、CD130、DPPA3、ESRRB、KLF4、和KLF5。此外，作为特定的基因产物的幼稚型特异性细胞内定位，例如，列举TFE3蛋白的核内定位。
制备的诱导性多能干细胞是幼稚型可通过具备1个以上前述特征而确认，优选地，可确认前述幼稚型特异性标记物的表达和/或特定的基因产物的幼稚型特异性细胞内定位。进一步，从迅速性和方便性而言，可由圆顶状的集落形态确认。
作为确认基因表达模式的方法，可以使用RNA-seq、qPCR、免疫染色、FCM等自身公知的方法，优选可使用RNA-seq。
另一方面，始发型诱导性多能干细胞意味着保有与着床后胚胎的外胚层类似的性质的诱导性多能干细胞，可定义为呈现下列任1以上的特征的诱导性多能干细胞：与着床后胚胎的外胚层相同的基因表达模式(具体地，1个以上的始发型特异性标记物的表达、或1个以上的特定基因产物的始发型特异性细胞内定位)、单层扁平的集落形态。此处，作为始发型特异性标记物，例如，列举OTX2或ZIC2，作为特定的基因产物的始发型特异性细胞内定位，例如，列举TFE3蛋白的细胞质定位。
制备的诱导性多能干细胞是始发型可通过具备1个以上前述特征而确认，优选是前述始发型特异性标记物的表达和/或特定的基因产物的始发型特异性细胞内定位的确认。进一步，从迅速性和方便性而言，可由单层扁平的集落形态确认。
在步骤(1)中，向人的体细胞导入包含重编程因子的1个以上的载体。
作为重编程因子，可以使用上述的重编程因子。例如，重编程因子可包含OCT基因、SOX基因、MYC基因和KLF基因。
作为1个以上的载体，可以使用上述的载体。例如，1个以上的载体可为例如染色体非整合型病毒载体，优选副粘病毒载体，更优选仙台病毒载体。
包含重编程因子的1个以上的载体可包含例如：包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体，包含MYC基因的载体，和包含KLF基因的载体。
在重编程细胞中，将上述的组合的载体导入细胞。在组合多个载体导入的情形中，优选导入同时进行，具体地，优选在添加最初的载体或化合物等起48小时以内、优选36小时以内、更优选24小时以内、18小时以内、12小时以内、10小时以内、8小时以内、6小时以内、3小时以内、2小时以内、或1小时以内，完成包含重编程因子的全部的载体的添加。载体的用量可以适当调节，优选以MOI 0.3～100、更优选MOI 0.5～50、更优选MOI 1～30、更优选MOI1～10、更优选MOI约5感染。
在某一方式中，在步骤(1)的1～15日、1～10日、例如3～9日后开始步骤(2)。至步骤(2)开始为止，可在适当培养条件下培养人的体细胞。
在本申请中，可向动物细胞的培养中应用的基本培养基适当添加必需的因子而配制培养基。作为基本培养基，例如，包含IMDM培养基、Medium199培养基、Eagle's最小必需培养基(EMEM)培养基、αMEM培养基、MEM Zinc Option培养基、IMEM Zinc Option培养基、Dulbecco's改良Eagle's培养基(DMEM)培养基、DMEM/F12培养基、Ham's F12培养基、RPMI1640培养基、Fischer's培养基、和它们的混合培养基等。基本培养基中可含有血清(例如，胎牛血清(FBS))，或可为无血清。按需要，例如，可含有白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES细胞培养时的血清替代物)(Invitrogen)、N2补充剂(Invitrogen)、B27补充剂(Invitrogen)、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油等的1种以上的血清替代物，也可含有脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMAX(Invitrogen)、非必需氨基酸、维生素、生长因子、小分子化合物、抗生素(例如，链霉素、青霉素、嘌呤霉素、丝裂霉素)、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、细胞因子和它们的等价物等的1种以上的物质。在1个实施方式中，基本培养基是DMEM培养基或DMEM/F12培养基。作为基本培养基，可使用市售的培养基，例如在培养人造血细胞的情形中，可以使用StemSpanACF(STEMCELL Technologies公司)等的培养基。在培养人造血细胞的情形中，可向基本培养基进一步追加干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、Flt3/Flk2、IL-6和IL-3等的因子。
在某一方式中，体细胞可与饲养细胞共同培养。本说明书中，饲养细胞意味着培养体细胞时共存的前述体细胞以外的细胞。作为饲养细胞，没有特别限定，例如，列举成纤维细胞(NIH-3T3细胞、MEF细胞、STO细胞、SNL细胞等)、胎儿肾细胞(HEK293细胞等)、间质细胞(ST2细胞、OP9细胞、PA6细胞、MS-5细胞等)、上皮细胞(HeLa细胞等)、胎盘细胞、骨髄细胞、子宫内膜细胞等。饲养细胞为例如MEF细胞。饲养细胞可为与体细胞相同种来源的细胞，也可为不同种来源的细胞。此外，饲养细胞可通过增殖抑制剂(例如丝裂霉素C)或放射线(例如X线或γ线)照射等处理使得抑制细胞增殖。本申请中使用的饲养细胞的浓度只要前述体细胞可增殖则没有特别限定，为例如约5×103细胞/cm2～约1×105细胞/cm2。体细胞可从培养的最初与饲养细胞共同培养，也可从培养途中与饲养细胞共同培养。例如，体细胞可从培养第2～10日、或第2～5日与饲养细胞共同培养。在另一方式中，体细胞可在饲养细胞不存在下培养。
在体细胞的培养中，培养温度不限于以下，只要在约30～40℃的范围内按照载体的特性确定即可。培养在含CO2空气的气氛下进行，CO2浓度是约2～8％、优选约3～7％、进一步优选约4～6％、最优选约5％。此外，在(1)的步骤后，培养可在低氧条件下进行，氧浓度是约3～10％、优选约4～8％、进一步优选约4～6％、最优选约5％。
在某一方式中，体细胞通过2维培养而培养。在饲养细胞存在下进行培养的情形中，例如，可将饲养细胞在培养容器底面或培养基质等中预先接种和培养，增殖至填充培养容器的底面或培养基质的表面的程度后，将体细胞接种于该饲养细胞上而培养。
用于培养体细胞的培养容器使用例如由包衣剂处理的那种。作为包衣剂，例如，示例明胶、基质胶(BD)、Synthemax(Corning)、胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白、它们的片段和它们的组合。
在(2)的步骤中，在幼稚培养基的存在下，培养前述体细胞。
在(2)的步骤中，培养温度不限于以下，只要可在约30～40℃的范围内按照载体的特性确定即可。培养在含CO2空气的气氛下进行，CO2浓度是约2～8％、优选约3～7％、进一步优选约4～6％、最优选约5％。此外，培养可在低氧条件下进行，氧浓度是约3～10％、优选约4～8％、进一步优选约4～6％、最优选约5％。
在本申请中，幼稚培养基意味着从体细胞诱导幼稚型诱导性多能干细胞时使用的培养基。作为幼稚培养基的基本培养基，可以使用上述记载的基本培养基，例如，列举向N2B27培养基(将向DMEM/F12培养基添加N2补充剂的N2培养基、与向Neurobasal培养基添加B27补充剂的B27培养基1：1混合的培养基)任意组合添加非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、抗生素(例如，链霉素、青霉素、嘌呤霉素、丝裂霉素)、牛血清白蛋白(BSA)等的添加成分的培养基。
在某一方式中，幼稚培养基包含选自白血病抑制因子(LIF)、MEK抑制剂、GSK3抑制剂、cAMP产生促进剂、TGF-β抑制剂、和PKC抑制剂中的1种以上的化合物。幼稚培养基特别优选包含LIF，进一步优选包含LIF和GSK3抑制剂。此外，幼稚培养基优选实质上不含bFGF。
培养基中的LIF的浓度可为1ng/ml～100ng/ml、或5ng/ml～50ng/ml，例如约10ng/ml。
在本申请中，作为MEK抑制剂，没有特别限定，例如，列举PD0325901(N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺；CAS登录编号：391210-10-9)、U0126(1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双[2-氨基苯硫基]丁二烯；CAS登录编号：109511-58-2)、PD98059(2-(2-氨基-3-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；CAS登录编号：167869-21-8)、PD184352(2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-环丙基甲氧基-3,4-二氟苯甲酰胺；CAS登录编号：212631-79-3。其中，优选PD0325901。在应用PD0325901作为MEK抑制剂的情形中，其培养基中的浓度可为50nM～100μM、或100nM～10μM，例如约1μM。
在本申请中，作为GSK3抑制剂，没有特别限定，例如，列举CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈；CAS登录编号：252917-06-9)、BIO(6-溴靛玉红-3'-肟；CAS登录编号：667463-62-9)、Kenpaullone(9-溴-7,12-二氢吲哚并[3,2-d][1]苯并氮杂卓-6(5H)-酮；CAS登录编号：142273-20-9)、IM-16(3-(4-氟苯基乙基氨基)-1-甲基-4-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮；CAS登录编号：1129669-05-1)。其中，优选CHIR99021。在应用CHIR99021作为GSK3抑制剂的情形中，其培养基中的浓度可为50nM～100μM、或100nM～10μM，例如约1μM。
在本申请中，作为cAMP产生促进剂，没有特别限定，例如，列举佛司可林。在应用佛司可林作为cAMP产生促进剂的情形中，其培养基中的浓度可为50nM～100μM、或100nM～10μM，例如约1μM。
在本申请中，作为TGF-β抑制剂，没有特别限定，例如，列举A83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)、SB431542(4-[4-(1,3-苯并二噁茂-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺)。其中，优选A83-01。在应用A83-01作为TGF-β抑制剂的情形中，其培养基中的浓度可为10nM～100μM、或100nM～10μM，例如约1μM。
在本申请中，作为PKC抑制剂，没有特别限定，例如，列举Go6983(3-[1-[3-(二甲基氨基)丙基]-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基]-4-(1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮；CAS登录编号：133053-19-7)、GF109203X(3-(1-(3-二甲基氨基)丙基)-1H-吲哚-3-基)-4-(1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮；CAS登录编号：133052-90-1)。其中，优选Go6983。在应用Go6983作为PKC抑制剂的情形中，其培养基中的浓度可为50nM～100μM、或100nM～10μM，例如约1μM～3μM。
幼稚培养基可使用市售的培养基，例如，可以使用t2iLGo(N2B27+PD0325901(1μM)+CHIR99021(1μM)+LIF+Go6983(2-3μM))、5iLAF(N2B27+PD0325901(1μM)+CHIR99021(1μM)+SB590885(0.5μM)+WH-4-023(1μM)+Y-27632(10μM)+LIF+Activin A)或tt2iLGo(N2B27+PD0325901(1μM)+LIF+Go6983(2μM)+XAV939(2μM))。
在饲养细胞不存在下培养细胞的情形中，幼稚培养基可用特定的细胞预先适应。作为特定的细胞，可使用可作为上述的饲养细胞使用的细胞，例如，可为放射线照射后小鼠胎儿成纤维细胞(iMEF)。用于适应的培养时期可为例如约12小时～约2日。可通过用于适应的培养后经常规方法除去细胞成分而取得培养基。在某一实施方式中，在饲养细胞不存在下培养细胞的情形中，幼稚培养基可为用iMEF适应的t2iLGo。
在步骤(2)中，体细胞的培养时期可为1日～20日、3日～10日，例如4～6日。
在步骤(3)中，在幼稚培养基的存在下，在每前述体细胞的前述载体量与步骤3开始时细胞减少至30％以下的条件下，培养得到的细胞。
在某一方式中，得到的细胞可与饲养细胞共同培养。作为饲养细胞，可以使用上述细胞。在另一方式中，得到的细胞可在饲养细胞不存在下培养。
在步骤(3)中，幼稚培养基可以使用与步骤(2)中使用的幼稚培养基相同的那种。幼稚培养基可包含选自白血病抑制因子(LIF)、MEK抑制剂、GSK3抑制剂、cAMP产生促进剂、TGF-β抑制剂、和PKC抑制剂中的1种以上的化合物。例如，可包含t2iLGo、5iLAF、或tt2iLGo。
在饲养细胞不存在下培养细胞的情形中，幼稚培养基可用特定的细胞预先适应。作为特定的细胞，可使用可作为上述的饲养细胞使用的细胞，例如，可为放射线照射后小鼠胎儿成纤维细胞(iMEF)。用于适应的培养时期可为例如约12小时～约2日。可通过用于适应的培养后经常规方法除去细胞成分而取得培养基。在某一实施方式中，在饲养细胞不存在下培养细胞的情形中，幼稚培养基可为用iMEF适应的t2iLGo。
在(3)的步骤中，培养温度不限于以下，只要在约30～40℃的范围内按照载体的特性确定即可。培养在含CO2空气的气氛下进行，CO2浓度是约2～8％、优选约3～7％、进一步优选约4～6％、最优选约5％。此外，培养可在低氧条件下进行，氧浓度是约3～10％、优选约4～8％、进一步优选约4～6％、最优选约5％。
在某一方式中，每前述体细胞的前述载体量在例如自步骤3开始时30日以内、20日以内、15日以内、12日以内、10日以内、8日以内、5日以内、3日以内、或1日以内，与步骤3开始时相比可减少至50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或3％以下。例如，每前述体细胞的前述载体量在自步骤3开始时12日以内与步骤3开始时相比可减少至30％以下。
在某一方式中，通过将前述1个以上的载体设为显示温度敏感性的载体、包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体、或显示温度敏感性并且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体，将得到的细胞在幼稚培养基的存在下培养，每前述体细胞的前述载体量与步骤3开始时相比可减少至50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或3％以下，例如自步骤3开始时30日以内、20日以内、15日以内、12日以内、10日以内、8日以内、5日以内、3日以内、或1日以内，与步骤3开始时相比可减少至50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或3％以下。
作为显示温度敏感性的载体，可以使用上述的载体。例如，显示温度敏感性的载体可为包含上述的温度敏感性突变的载体。在某一方式中，显示温度敏感性的载体是在建立幼稚型多能干细胞的细胞培养环境下显示温度敏感性的载体。作为在建立幼稚型多能干细胞的细胞培养环境下显示温度敏感性的载体，例如，列举包含TS7突变(M蛋白的G69E/T116A/A183S突变、HN蛋白的A262T/G264R/K461G突变、P蛋白的L511F突变、和L蛋白的N1197S/K1795E突变(以上称为“TS突变”)、加上L蛋白的Y942H/L1361C/L1558I突变)、TS12突变(TS突变、加上P蛋白的D433A/R434A/K437A突变)、或TS15突变(TS突变、加上P蛋白的D433A/R434A/K437A突变和L蛋白的L1361C/L1558I)突变的仙台病毒载体、以及将相应部位同样置换的其它的负链RNA病毒载体，但不限于这些。
包含重编程因子的1个以上的载体可包含例如：包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体，包含MYC基因的载体，和包含KLF基因的载体。包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体、包含MYC基因的载体、和包含KLF基因的载体可为仙台病毒载体，例如，可为包含TS7、TS12或TS15突变的仙台病毒载体。在某一实施方式中，包含MYC基因的载体可为包含TS15突变的仙台病毒载体，包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体、和包含KLF基因的载体可为包含TS12突变的仙台病毒载体。
在某一方式中，在前述1个以上的载体是显示温度敏感性的载体的情形中，只要在步骤(1)和(2)中该载体的表达量高的温度、步骤(3)中该载体的表达量低的温度培养即可。例如，在上述示例的载体的情形中，只要步骤(1)和(2)在30～36.5℃、34～36℃、例如约35℃、步骤(3)在37℃以上、38℃以上、37℃～45℃、37℃～40℃、例如约38℃培养即可。作为一个实例，列举步骤(1)和(2)在约35℃、步骤(3)在约38℃培养的方式。
作为对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列，只要是对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA作为目标而结合的序列则没有特别限定。作为对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA，例如，列举miR-367、miR-302、miR-371、miR-372、miR-373、miR-512、miR-517、miR-518、miR-519、miR-520、miR-525、miR-187、miR-299、miR-499、miR-628、和miR-888。
微小RNA目标序列指微小RNA作为目标而结合的序列。本申请中的微小RNA目标序列只要通过微小RNA的结合而表达被抑制，则可以应用天然的微小RNA目标序列及其突变体。此外，微小RNA目标序列可为与微小RNA完全互补的序列，也可不为该序列，例如，对于微小RNA，至少10碱基、例如11碱基以上、12碱基以上、13碱基以上、14碱基以上、15碱基以上、16碱基以上、17碱基以上、18碱基以上、19碱基以上、20碱基以上、21碱基以上、22碱基以上的互补碱基被连续或非连续地包含。微小RNA目标序列的序列的长度没有特定上限，例如约30碱基。优选地，该互补的碱基连续，或者可具有数个、例如5碱基以下、4碱基以下、3碱基以下、2碱基以下、或1碱基的未配对碱基。未配对碱基可在微小RNA目标序列侧和/或微小RNA侧包含。
微小RNA目标序列优选是与微小RNA在生理条件下杂交的序列。生理条件下是例如150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、pH7.0、37℃。更优选地，微小RNA目标序列是与微小RNA在严格条件下杂交的序列。严格条件是例如1×SSC(1×SSC是150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、pH7.0)或0.5×SSC、42℃的条件，更优选1×SSC或0.5×SSC、45℃的条件，更优选1×SSC或0.5×SSC、50℃的条件。在杂交中，例如，将包含微小RNA序列的RNA或包含微小RNA目标序列的RNA的任一标记，按需要将另一方固定于膜等使两者杂交。杂交的条件只要在例如包含5xSSC、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑精DNA、5xDenhardt液(1xDenhardt溶液包含0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白、和0.2％Ficoll)的溶液中、例如在37℃、或45℃、或50℃进行即可。温育足够时间(例如3、4、5或6小时以上)后，在上述的条件进行洗涤，通过检测标记的核酸是否杂交，可以确定在该条件核酸是否杂交。
或者，微小RNA目标序列优选地显示与微小RNA序列的互补序列高的同源性。高的同源性是具有例如70％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的同一性的碱基序列。碱基序列的同一性可以应用例如BLAST程序(Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990)确定。例如，可以在NCBI(National Center forBiothchnology Information)的BLAST的网页中，应用默认的参数进行检索(AltschulS.F.et al.,Nature Genet.3:266-272,1993；Madden,T.L.et al.,Meth.Enzymol.266:131-141,1996；Altschul S.F.et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；ZhangJ.&Madden T.L.,Genome Res.7:649-656,1997)。例如，通过进行2个序列的比较的blast2sequences程序(Tatiana A et al.,FEMS Microbiol Lett.174:247-250,1999)，可以制成2序列的比对，确定序列的同一性。忽略微小RNA序列的互补序列的碱基序列的外侧的空位，内侧的空位与例如错配同样处理，计算对比对中微小RNA序列的互补序列的碱基序列全体(合计放入序列的内侧的空位的总的碱基长度)的同一性的值。
或者，微小RNA目标序列优选由对微小RNA序列的互补序列插入、置换、和/或缺失1或数个碱基的序列组成。优选地，微小RNA目标序列包含对微小RNA序列的互补序列具有8碱基以内、7碱基以内、6碱基以内、5碱基以内、4碱基以内、3碱基以内、2碱基以内、或1碱基的插入、置换、和/或缺失的序列。
通常，越向微小RNA目标序列导入突变，与微小RNA的结合越被抑制，表达抑制效果降低。通过适当导入突变可调节抑制效果。
在某一方式中，在本申请的载体是负链RNA病毒载体的情形中，微小RNA目标序列附加于NP或P基因。在向NP或P基因附加微小RNA目标序列的情形中，附加的位置没有特别限制，可以附加于各基因的翻译区或非翻译区。在附加于翻译区的情形中，可附加于N末端部位或者C末端部位的任一位置，优选例如连续附加于C末端。作为非翻译区，可为基因组中5'非翻译区或3'非翻译区，优选5'非翻译区。在附加于非翻译区的情形中，其位置可任意选择，例如，在NP基因和/或P基因的基因组中的5'非翻译区附加微小RNA目标序列的情形中，只要是附加的基因的翻译区的终止密码子与E(End)序列间则可为任何位置。在附加于基因组中的3'非翻译区的情形中，例如，可以附加于附加的基因的S(Start)序列与翻译起始密码子间的期望的位置。微小RNA目标序列可以附加1个拷贝或多个拷贝。此外，不仅可附加1种微小RNA目标序列，也可附加多种微小RNA目标序列。作为一个实例，例如，可以将1种或多种微小RNA目标序列串联地附加2个以上、例如3个以上、4个以上、5个以上排列的序列。串联地附加的微小RNA目标序列的数目没有特定上限，例如约10个为止。
在改变P基因的情形中，在P蛋白的编码区中的核酸所编码的C蛋白的表达被抑制的情形中，只要将C蛋白与载体分开表达即可。
另外，即使P蛋白不是全长，也可以应用适当片段。作为P蛋白必需的是C末端的仅一部分，其它的区对病毒载体的表达不必需。P蛋白具体地可为保持L蛋白的结合部位和与N蛋白：RNA的结合部位的片段。作为L蛋白的结合部位，列举例如SeV P蛋白的第411个～第445个的氨基酸序列，作为N蛋白：RNA结合部位，列举例如SeV P蛋白(例如登录编号AAB06197.1,P04859.1,P14252.1,AAB06291.1,AAX07439.1,BAM62828.1,BAM62834.1,P04860.1,BAM62840.1,BAD74220.1,P14251.1,BAM62844.1,BAM62842.1,BAM62842.1,BAF73480.1,BAD74226.1,BAF73486.1,Q9DUE2.1,BAC79134.1,NP_056873.1,ABB00297.1等)的第479个～第568个的氨基酸序列。更具体地，例如，包含SeV P蛋白的第320个～第568个的氨基酸序列的片段可以作为本申请中的功能性P蛋白优选应用。通过应用缺失型的P蛋白，可以将载体的尺寸小型化，同时也可以期待难以受到宿主的免疫反应的影响。
在应用缺失C蛋白的编码区的P蛋白的情形中，如上述，可以单独适当表达C蛋白。此处C蛋白包含C'、C、Y1、和Y2蛋白(Irie T.et al.,PLoS One.(2010)5:e10719.)。在表达C蛋白中，只要将C蛋白的编码序列插入适当载体中即可。插入位置没有特别限制，可以在紧接P蛋白前(基因组中P蛋白的编码序列的3'侧)或者紧接P蛋白后(基因组中P蛋白的编码序列的5'侧)插入。插入时可适当附加E-I-S序列。
在向NP基因或P基因附加微小RNA目标序列的情形中，该微小RNA在导入载体的细胞中表达时，与其配合的载体的表达降低，载体的除去被促进。例如，通过将载体的导入时不表达、但变为某分化状态(或未分化状态)时特异性表达的微小RNA的目标序列附加于载体，该载体在实现目的时自动地表达被抑制、被除去。
在另一方式中，可将前述1个以上的载体设为向P基因附加降解子的载体，将得到的细胞在幼稚培养基的存在下培养。由此，每前述体细胞的前述载体量与步骤3开始时相比可减少至50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或3％以下，例如自步骤3开始时30日以内、20日以内、15日以内、12日以内、10日以内、8日以内、5日以内、3日以内、或1日以内，与步骤3开始时相比可减少至50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或3％以下。
在本申请中，降解子意味着通过附加于蛋白使该蛋白不稳定的多肽。降解子列举通过与低分子的融合稳定化的序列、通过与低分子的结合不稳定化的序列、与低分子的有无无关不稳定化的序列。具体地，列举已知为mTOR蛋白的FKBP12来源的DD-标签(US2009/0215169)、二氢叶酸还原酶(DHFR)来源的DDG-标签(US2012/0178168)、TetR突变体(WO2007/032555)、植物来源的生长素可诱导的降解子(auxin-inducible degron，AID)系统(WO2010/125620)、已知为分解促进序列的PEST序列(WO99/54348)、CL1(WO2004/025264)、钙蛋白酶来源的序列(特开2009-136154)、NDS(特开2011-101639)等。FKBP12已知为雷帕霉素的哺乳动物靶(mTOR)，通过与雷帕霉素、shield1等的低分子结合而稳定化，通过除去而不稳定化，通过蛋白酶体分解。DHFR通过甲氧苄啶(trimethoprim)稳定化，TetR突变体通过多西环素(doxycycline)稳定化。PEST序列是富含Pro、Glu、Ser、Thr的序列，例如，可以通过附加小鼠鸟氨酸脱羧酶(mODC)的C末端侧422-461不稳定化。PEST序列调节蛋白的半衰期，但可以应用期望的半衰期缩短序列(Rechsteiner M,et al.,TrendsBiochem.Sci.21,267-271,1996)。PEST序列例如两端被碱基性氨基酸(H、K或R)包围、包含(i)P、(ii)D和E、或(iii)S和E且与泛素化酶E3结合的序列，例如可以由GENETYX(Genetics公司)鉴定。作为得到与PEST同样的效果的序列，列举CL1、钙蛋白酶部分序列、NDS等。AID序列通过作为植物的泛素连接酶的TIR1与生长素(IAA)结合而不稳定化。
在本申请中，向P基因附加降解子意味着该P基因编码附加了降解子的P蛋白。本申请中，可以将上述的降解子附加于P蛋白，作为优选的降解子，具体地，列举mTOR降解子、DHFR降解子、TetR降解子、PEST、和AID。另外，这些降解子包含天然的序列和来源于其的那种。作为特别优选的降解子，列举mTOR降解子、DHFR降解子、TetR降解子、和PEST，其中优选AID序列以外的降解子，具体地优选FKBP12降解子(DD)、DHFR降解子(DDG)、TetR降解子、和mODC PEST。PEST中已知来源于天然的序列的d2及作为其改变体的d1、d4等(WO99/54348)，但它们都包含在PEST中，可以在本申请中使用。编码降解子的核酸可以通过DNA合成适当制备。
降解子可以适当附加于P蛋白的期望的位置，例如可以附加于P蛋白的N末端或C末端。在附加于P蛋白的N末端的情形、即P蛋白的编码区中的核酸所编码的C蛋白的表达被抑制的情形中，只要从载体分开表达C蛋白即可。在作为P蛋白应用片段而不是全长P蛋白的情形、即不含C蛋白的编码区的片段的情形中，可以在不论N末端还是C末端的任意的位置附加降解子。本发明中的降解子优选附加于P蛋白的C末端侧。附加了降解子的改变P蛋白可以通过公知的方法制备。具体地，只要向编码P蛋白的病毒基因组的序列插入编码降解子的序列使得阅读框一致即可。
将向本申请的P基因附加降解子的载体导入细胞、表达目的基因后，可以配合降解子的性质适当除去载体。例如，在应用如DD和DDG、TetR突变体等的配体控制性降解子(ligand controllable degron)的情形中，若不添加配体则促进除去，但通过添加Shield-1等的配体，可以延长载体的表达。此外，若是如PEST序列等即使没有配体也发挥功能的降解子，则通过继续培养导入了载体的细胞，可以促进载体的除去。
向本申请的P基因附加降解子的载体可为：上述的显示温度敏感性的载体，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体，或显示温度敏感性且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体。
在又一方式中，可将前述1个以上的载体设为搭载自杀基因的载体，将得到的细胞在幼稚培养基的存在下培养。由此，每前述体细胞的前述载体量与步骤3开始时相比可减少至50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或3％以下，例如自步骤3开始时30日以内、20日以内、15日以内、12日以内、10日以内、8日以内、5日以内、3日以内、或1日以内，与步骤3开始时相比可减少至50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或3％以下。
例如，作为本发明的载体中搭载的自杀基因，包含显示细胞死亡的诱导、细胞毒性的期望的药剂的前药的转换酶基因。作为前药和自杀基因的组合的实例，具体地，列举：
·5-氟胞嘧啶和胞嘧啶脱氨酶
·环磷酰胺和细胞色素P450
·氟达拉滨和大肠杆菌PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)
·CB1954和硝基还原酶
·卡培他滨和羧酯酶等。
此外，作为自杀基因，列举编码通过从非活性型转换为活性型显示细胞死亡的诱导、细胞毒性的期望的蛋白的基因，例如，可以优选利用编码诱导细胞死亡的半胱天冬酶的基因。具体地，可以利用期望的二聚体化剂和附加了其结合结构域的半胱天冬酶的组合，作为二聚体化剂和半胱天冬酶的组合的一个实例，可以列举：
·AP20187和iCaspase-9。
例如，在将本申请的搭载自杀基因的载体导入细胞培养后，添加前药。由此，可以使载体残留的细胞死亡，仅取得载体消失的细胞。
本申请的搭载自杀基因的载体可为：上述的显示温度敏感性的载体，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体，或显示温度敏感性且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体。此外，本申请的搭载自杀基因的载体可为向上述的P基因附加降解子的载体。
在步骤(3)中，培养时期没有特别限定，可为例如4周以内、3周以内、2周以内、或1周以内，例如20日以内、15日以内、10日以内、5日以内、或3日以内。培养时期的下限没有特别限定，例如约1日。载体量的减少可以通过报告基因的检测、应用抗体或PCR的病毒的检测、将其水平与步骤(3)开始时比较而确认。
由本申请牵涉的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞由于包含重编程因子的载体的残存量非常低，即使经长期培养，幼稚型的性质也可稳定地维持。在本申请牵涉的方法中，包含重编程因子的载体在从该载体导入约30日后可实质性地从细胞内消失。因此，通过本申请的方法得到的幼稚型诱导性多能干细胞实质上不含包含重编程因子的载体，性状稳定性高。
[载体组]
此外，本申请提供用于从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的载体组，
其包含含有重编程因子的1个以上的载体，
前述1个以上的载体选自由以下组成的组中：显示温度敏感性的载体，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体，和显示温度敏感性且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体。本方式中应用的重编程因子和载体的实例如上所述。
[组合物]
此外，本申请提供用于从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的组合物，
其包含含有重编程因子的1个以上的载体，
前述1个以上的载体选自由以下组成的组中：显示温度敏感性的载体，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体，和显示温度敏感性且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体。本方式中应用的重编程因子和载体的实例如上所述。
本申请的组合物通过按需要添加蒸馏水、pH调节剂、悬浮剂、助溶剂、稳定剂、等渗剂、抗氧化剂、防腐剂等，可以制备为液体制剂。作为pH调节剂，示例盐酸、氢氧化钠、乳糖、乳酸、钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠等。作为悬浮剂，示例甲基纤维素、聚山梨醇酯80、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、黄蓍胶粉、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯等。作为助溶剂，示例聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨醇酯80、烟酰胺、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯等。作为稳定剂，示例亚硫酸钠、偏亚硫酸钠、醚等。作为等渗剂，示例氯化钠、葡萄糖等。作为防腐剂，示例对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。
[试剂盒]
本申请进一步提供用于从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的试剂盒，
其包含含有重编程因子的1个以上的载体、和
幼稚培养基，
前述1个以上的载体选自由以下组成的组中：显示温度敏感性的载体，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体，和显示温度敏感性且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体。本方式中应用的重编程因子和载体的实例如上所述。
在本申请的试剂盒中，前述1个以上的载体可单独包装，也可以一起包装。此外，本申请的试剂盒可包含缓冲液、使用说明书等。
[培养上清液]
此外，本申请提供用本申请的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液。培养基可以使用上述的幼稚培养基。幼稚培养基可包含选自白血病抑制因子(LIF)、MEK抑制剂、GSK3抑制剂、cAMP产生促进剂、TGF-β抑制剂、和PKC抑制剂中的1种以上的化合物。例如，可包含t2iLGo、5iLAF、或tt2iLGo。
用于得到培养上清液的培养时期可为3～72日期间，例如12～48日期间。培养开始时的幼稚型诱导性多能干细胞的浓度可为例如3×103～1×105细胞/cm2，例如1×104～3×104细胞/cm2。
用于得到培养上清液的培养温度不限于以下，为约30～40℃、优选约37℃。培养在含CO2空气的气氛下进行，CO2浓度是约2～8％、优选约3～7％、进一步优选约4～6％、最优选约5％。此外，培养可在低氧条件下进行，氧浓度是约3～10％、优选约4～8％、进一步优选约4～6％、最优选约5％。
通过培养后分离除去细胞成分，可以得到幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液。在本公开中，培养上清液不仅包含从培养液分离除去细胞成分的培养上清液，也包含适当实施各种处理(例如，离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐、防腐等)的培养上清液。
[化妆品]
此外，本申请提供包含用本申请的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液作为原料的化妆品。用本申请的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液如上所述。本申请的化妆品只要是使用时与皮肤接触应用的那种，则可为任何剂型、形式。具体地，例如，广义地包含护肤乳、护肤霜、粉底霜、按摩霜、卸妆霜、剃须膏、卸妆泡沫、化妆水、润肤乳、面膜、口红、腮红、眼影、指甲油、肥皂、沐浴露、洗手液、洗发水、护发素、生发液、发膜、发乳、发胶、生发剂、养发剂、染发剂、整发剂、脱毛剂、去屑剂、牙膏、义齿粘合剂、漱口剂、电烫剂、卷发剂、定型剂、软膏剂、泥敷剂、胶带浴盐、止汗剂、防晒剂等，只要在使用时与皮肤接触，则不受种类限制，但特别优选可以作为化妆品使用的形式。进一步除了人，还包含与动物类的皮肤接触的那种。此外，本申请的化妆品可为任何形状，除固体、液体、半固体、气体还列举粉末、颗粒、片剂、凝胶状、泡沫状等多个形式，但并不特别限于此。
本申请的化妆品可包含制剂上容许的载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、镇痛剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、和生理盐水等。作为赋形剂的实例，列举乳糖、淀粉、山梨醇、D-甘露醇、和白糖。作为崩解剂的实例，列举羧甲基纤维素、和碳酸钙。作为缓冲剂的实例，列举磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐。作为乳化剂的实例，列举阿拉伯胶、海藻酸钠、和黄蓍胶。作为悬浮剂的实例，列举单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、和十二烷基硫酸钠。作为镇痛剂的实例，列举苯甲醇、氯丁醇、和山梨醇。作为稳定剂的实例，列举丙二醇和抗坏血酸。作为保存剂的实例，列举苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、和对羟基苯甲酸甲酯。作为防腐剂的实例，列举苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、和氯丁醇。
实施例
以下显示实施例进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
[材料和方法]
细胞培养
在知情同意(informed consent)的基础上采集的人皮肤成纤维细胞(HDF)得自东京都老人综合研究所(Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology)。在添加10％胎牛血清(FBS、Japan Bio Serum)的Dulbecco's改良Eagle's培养基(DMEM、Nacalai Tesque)中维持HDF和放射线照射后小鼠胎儿成纤维细胞(iMEF)。在制造商推荐的条件下维持购自Cellular Technology Limited(CTL)的PBMC。始发型和幼稚型ES细胞(ESC)克隆得自WiCELL和京都大学。在用层粘连蛋白511-E8片段(iMatrix-511、Nippi)包被的板上在StemFit AK02N培养基(Ajinomoto)中维持始发型多能干细胞(PSC)。在iMEF上培养幼稚型PSC，在由包含1μM CHIR99021(Merck)、1μM PD0325901(Merck)、10μg/mL人LIF(Peprotech)和2.5μM Go6983(Merck)的N2B27培养基(NDiff227、Takara Bio)构成的t2iLGo2培养基中维持。在Matrigel(hESC-qualified、Corning)上维持无饲养的幼稚型诱导性多能干细胞(iPSC)。每隔1日更换培养基，紧接每次更换培养基前添加10μM Y27632(Wako)。将幼稚型iPSC应用Accutase(Innovative Cell Technologies)每3～4日传代，始终在5％O2下培养。在京都大学的承认下进行本实施例中的重组DNA实验。
改变型SeV-KLF4载体的构建
应用附带包含SeV特异性转录控制信号序列的NotI标签的基因特异性正向和反向引物，从cDNA通过PCR制备包含人KLF4基因的可读框的插入序列。将扩增的片段插入包含SeV/TS12ΔF、SeV/PmiR367T2/TSΔF和SeV/PmiR367T2/TS12ΔF载体的基因组序列的质粒的18+区，分别制备质粒pSeV18+KLF4/TS12ΔF、pSeV18+KLF4/PmiR367T2/TSΔF、和pSeV18+KLF4/PmiR367T2/TS12ΔF(总称“SeV-KLF4载体质粒”)。miR367T2的序列是TCACCATTGCTAAAGTGCAATTcgatTCACCATTGCTAAAGTGCAATT(序列编号1)。SeV-KLF4载体的回收和增殖如下进行。最初，将SeV-KLF4载体质粒以及具有T7 RNA聚合酶、NP、P、F5R和L基因的质粒基因导入293T细胞。在添加10％的热失活胎牛血清(FBS)的DMEM中维持细胞，培养1～3日生成SeV-KLF4载体的种子。克隆种子，在包含胰蛋白酶(2.5μg/ml)的MEM中应用SeV F表达LLC-MK2/F7/A细胞增殖。如从前记载，应用抗SeV兔多克隆血清通过免疫染色法确定回收的SeV-KLF4载体的效价(细胞感染单位/mL)(Fusaki,N.,Ban,H.,Nishiyama,A.,Saeki,K.&Hasegawa,M.Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using avector based on Sendai virus,an RNA virus that does not integrate into thehost genome.Proceedings of the Japan Academy,Series B 85,348-362,doi:10.2183/pjab.85.348(2009).)。
从人的体细胞重编程为幼稚型iPSC
在以往的方法中，应用CytoTune-iPS 2.0或2.0L重编程试剂盒重编程HDF或PBMC。在新的方法中，将试剂盒中包含的KLF4/TS载体置换为新的SeV-KLF4载体(KLF4/TS12、KLF4/PmiR367T2/TS、或KLF4/PmiR367T2/TS12等)。将温育温度维持在35℃，直至幼稚型iPSC的集落生成。生成的iPSC的第1次传代后(通常，第14日)，将温育温度变为38℃，除去SeV载体。除去SeV载体后(在使用SeV-KLF4/PmiR367T2/TS12的情形中，第34日)，将温度变为37℃。感染SeV载体后，将培养箱设定为5％O2。
最初，在添加10％FBS的DMEM(Nacalai Tesque)中维持HDF。在第0日计数细胞，感染3个SeV载体：1)多顺反子KLF4-OCT4-SOX2、2)CMYC或LMYC、和3)KLF4(各自的感染复数是5)。从第1日每隔1日更换培养基。在第5日，在iMEF饲养细胞上再接种细胞。次日，将培养基更换为幼稚培养基。
在PBMC的重编程中，在SeV载体感染的5日前，在包含100ng/mL人SCF(R&D)、100ng/mL人TPO(R&D)、100ng/mL人Flt3/Flk2(R&D)、50ng/mL人IL-6(R&D)和20ng/mL人IL-3(R&D)的StemSpan ACF(STEMCELL)中开始PBMC的培养。在第0日计数细胞，应用与HDF相同的重编程顺序感染3个SeV载体。在第1日计数细胞，在与HDF的重编程相同的条件再接种。从第2日，每隔1日添加与PBMC培养基等量的PSC培养基。在第8日，将培养基完全更换为幼稚培养基。
RNA、DNA和miRNA的提取以及定量的实时PCR(qRT-PCR)
在用于核酸提取的样品采集之前，通过在用明胶包被的皿上在37℃温育幼稚型PSC 2小时，除去iMEF。应用AllPrep DNA/RNA Mini Kit(QIAGEN)从细胞溶解物提取总RNA和DNA，将RNA与RNase-Free DNase Set(QIAGEN)共同温育，除去基因组DNA。应用NucleoSpin miRNA(MACHEREY-NAGEL)提取微小RNA(miRNA)。为了qRT-PCR，应用包含寡dT引物和随机6碱基的PrimeScript RT Master Mix(Takara)，进行用DNase处理的1μg的RNA的逆转录反应。应用TaqMan Advanced miRNA Assays(Applied Biosystems)合成cDNA。应用Fast SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)或TaqMan Fast Advanced MasterMix(Applied Biosystems)在StepOne Plus(Applied Biosystems)或QuantStudio3(Applied Biosystems)上进行qRT-PCR。
RNA测序和数据分析
以100ng的总RNA为起始物质，按照制造商的方案，应用TruSeq Stranded TotalRNA Library Prep Gold(illumina)制备RNA测序文库。为了Hiseq2500，应用illuminacBot通过HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot(illumina)生成聚类。应用HiSeq2500(2x126 PE模式)通过HiSeq SBS Kit v4进行测序。此外，为了测序，伴随NovaSeq 6000S1 ReagentKit v1.5(illumina)使用NovaSeq 6000(2x101 PE模式)，伴随NextSeq 500/550HighOutput Kit v2.5使用NextSeq 500(76SE模式)。应用bcl2fastq v2.17.1.14(illumina)从bcl文件生成FASTQ文件，应用ENCODE long-rna-seq-pipeline v2.3.4处理。简言之，将测序的读取数据应用GENCODE v24的基因注释通过STAR2.5.1b映射到人参照基因组(GRCh38)，应用RSEM 1.2.23计算标准化的基因表达数据，应用Subread 1.5.1内所附featureCounts取得基因数数据。为了本发明人的PSC株的特性评价，应用得自GEO的GSE59435和GSE75868的数据组以及L.Yan et al.(Yan,L.et al.Single-cell RNA-Seqprofiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells.Naturestructural&molecular biology 20,1131-1139,doi:10.1038/nsmb.2660(2013).)和Y.Takashima et al.(Takashima,Y.et al.Resetting transcription factor controlcircuitry toward ground-state pluripotency in human.Cell 158,1254-1269,doi:10.1016/j.cell.2014.08.029(2014).)的补充数据。将全部数据中包含的4,720基因的表达值用样品间的分位数标准化，将各基因的z评分用于PCA。为了PSC标记物和氧化磷酸化相关基因的表达热图，以Log2刻度应用通过分位数标准化的FPKM值。
DNA甲基化分析
应用EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)进行500ng的基因组DNA的亚硫酸氢盐转化，按照制造商的方案应用Infinium Human Methylation 450K或EPIC BeadChipKit(illumina)绘制总DNA甲基化状态。应用GenomeStudio V2011.1输出DNA甲基化的值后，应用R 3.6.3的“minfi”包进行数据处理。将450K与EPIC间共同、不位于公知的SNP部位的总计424,444个探针用于PSC样品的PCA。
RNA-FISH
在用明胶包被的皿上在37℃温育解离的幼稚型iPSC2小时，除去iMEF饲养细胞。随后，在用Matrigel包被的载玻片上的PSC培养基中接种细胞。次日，在4％多聚甲醛中在室温固定细胞15分钟。用0.2M HCl处理载玻片20分钟，用0.2％Triton X-100透化处理10分钟，用胃蛋白酶溶液(0.1M HCl中0.005％)在37℃消化2～6分钟、脱水。应用细菌人工染色体(BAC)RP11-155O24和RP11-256P2，分别生成HUWE1和UTX RNA FISH探针。应用Cy5-dUTP(RP11-155O24)和Cy3-dUTP(RP11-256P2)通过切口移位标记BAC DNA。将标记的探针和XISTRNA FISH探针(Chromosome Science Labo)与超声处理的鲑精DNA和Cot-1 DNA共同在杂交溶液中混合。使探针在85℃变性10分钟，用于预处理的载玻片，用盖玻片覆盖，在37℃杂交一夜。随后，将载玻片用50％甲酰胺/2xSSC在37℃中洗涤20分钟，用1xSSC在室温洗涤15分钟，用DAPI复染，裱贴。应用安装于Leica DMRA2显微镜上的冷却CCD相机通过CW4000 FISH应用程序(Leica Microsystems Imaging Solution)拍摄FISH图像。
幼稚型PSC来源的原始内胚层分化
为了原始内胚层分化，使幼稚型PSC解离，如上述除去iMEF饲养细胞。在用包含初期原始内胚层分化培养基(Ndiff227、25ng/ml FGF4(Peprotech)、1ug/ml Heparin(Wako)、10ng/ml BMP4(R&D)、10ng/ml PDGFAA(Peprotech),1uM XAV939(Sigma)、3μM A83-01(Wako)、0.1μM RA(Sigma))的层粘连蛋白511-E8(0.4μg/cm2 iMatrix 511；Nippi)包被的6个孔中接种500,000个细胞。次日，用与上述同样的培养基进行培养基更换。次日，更换为向上述培养基中加入10ng/ml IL-6(R&D)的培养基。在第3日应用胰蛋白酶/EDTA(Nacalai)剥离回收细胞5分钟，通过流式细胞术分析PDGFRA和ANPEP的表达。
幼稚型PSC来源的滋养外胚层(TE)分化
为了TE分化，使幼稚型PSC解离，如上述除去iMEF饲养细胞。在用包含初期TE分化培养基(Ndiff227、2μM A83-01(Wako)、2μM PD0325921(Sigma)和10ng/mL BMP4(R&D))的层粘连蛋白511-E8(0.15μg/cm2 iMatrix 511；Nippi)包被的6个孔中接种500,000个细胞。次日，将培养基更换为Ndiff227、2μM A83-01(Wako)、2μM PD0325921(Sigma)和1μg/ml JAK抑制剂I(Merck)。次日，再次更换培养基。在第3日应用Accutase(Innovative CellTechnologies)回收细胞30分钟，通过流式细胞术分析TACSTD2、ENPEP、HAVCR1和HLA-ABC的表达。
流式细胞术
应用Alexa Fluor 488标记TROP-2(TACSTD2)、PE标记CD249(ENPEP)、Tim-1(HAVCR1)生物素化抗体、和Pacific Blue标记HLA-ABC抗体，在冰上染色解离的细胞20分钟。洗涤后，应用APC链酶抗生物素，在冰上温育20分钟。应用具备FACS Diva软件(BDBiosciences)的BD LSR Fortessa(BD Biosciences)和FACSAria II(BD Biosciences)流式细胞仪，进行分析。应用FlowJo软件(LLC)分析数据。
统计和再现性
正确的n值记载于相关的图的说明中。通过应用Prism软件(GraphPad)的未配对student's双侧t检验确定统计学显著性。P<0.05视为显著性，图中用星号表示。误差条表示平均值±s.d.。
数据的可得性
测序和阵列的数据在GEO登录，登录编号是GSE179476。
[实施例1]本实施例中使用的仙台病毒载体(SeV)的制备
本实施例中使用的仙台病毒载体的结构在下文显示。另外，本说明书中的“18+”表示在NP基因之前插入重编程因子，“PM”表示在P基因与M基因之间插入初始因子，“HNL”表示在HN基因与L基因之间插入重编程因子。此外，本说明书中的“TS”表示M蛋白中保有G69E、T116A和A183S的突变，HN蛋白中保有A262T、G264R和K461G的突变，P蛋白中保有L511F突变，以及L蛋白中保有N1197S和K1795E突变。此外，本实施例中的“TS7”表示除TS突变在L蛋白中进一步保有Y942H、L1361C和L1558I的突变，“TS12”表示除TS突变在P蛋白中进一步保有D433A、R434A和K437A的突变，“TS15”表示除TS12突变在L蛋白中还保有L1361C和L1558I。“ΔF”表示缺失F基因。此外，“KOS”表示KLF4、Oct4和Sox2的同时搭载。例如，P基因与M基因之间搭载KLF4、Oct4和Sox2的具有TS12突变的F基因缺失型仙台病毒载体记载为PM/KOS/TS12ΔF。同样，NP基因之前搭载KLF4的具有TS突变的F基因缺失型仙台病毒载体记载为18+/KLF4/TSΔF。
用于从体细胞制备幼稚型多能干细胞的以往使用的仙台病毒载体(CytoTune-iPS2.0L)示于图1。搭载的cDNA示为白色。本实施例中使用的仙台病毒载体是图1记载的仙台病毒载体中、应用“18+/KLF4/TS7ΔF”、“18+/KLF4/TS12ΔF”或“18+/KLF4/PmiR367T2/TSΔF”的任一种替代“18+/KLF4/TSΔF”作为KLF4载体的系统。此处，“PmiR367T2”表示将miR367识别序列在P基因的5’侧串联搭载。
KOS载体“PM/KOS/TS12ΔF”和LMYC载体“HNL/LMYC/TS15ΔF”按照常规方法制备(WO2012/029770和WO2010/008054)。此外，“18+/KLF4/TS7ΔF”和“18+/KLF4/TS12ΔF”分别使用TS7、TS12载体骨架用与“18+/KLF4/TSΔF”(WO2010/008054)同样的方法制备。此外，“18+/KLF4/PmiR367T2/TSΔF”通过常规方法制备(WO2017/082174)。
[实施例2]从人皮肤成纤维细胞(HDF)制备幼稚型iPS细胞
用于从人皮肤成纤维细胞(HDF)制备幼稚型iPS细胞的方案示于图2。
步骤(1)
将人皮肤成纤维细胞在感染仙台病毒载体1日前接种于完成明胶包被的12孔板或6孔板，作为SeV感染用和细胞数计算用，接种相同细胞数，应用成纤维细胞用培养基(成纤维细胞培养基:DMEM+10％FBS)在37℃在常氧条件下(约20％)培养。次日(第0日)，将细胞数计数用中接种的细胞应用细胞剥离液剥离，进行细胞数计算，感染与细胞数相应的量的仙台病毒载体，以后在35℃低氧(5％O2)环境中温育。感染的仙台病毒载体的量作为一个基准为KOS:MOI5、LMYC:MOI5、KLF4:MOI5，但相应于细胞进行了适当条件研究。24小时后(第1日)和第2日、第4日进行向新成纤维细胞用培养基的培养基更换。在第4日准备接种了iMEF(放射线照射后小鼠胎儿成纤维细胞)的细胞培养容器。在第5日应用细胞剥离液剥离细胞，进行细胞数计算后在接种iMEF的细胞培养容器上接种任意细胞数。在本实施例中，在5％的CO2浓度条件下进行培养。
步骤(2)
在第6日更换为幼稚培养基(t2iLGo+Y)，以后每隔1日进行培养基更换。
t2iLGo+Y培养基的组成在以下显示。记载的浓度全部为终浓度：
NDiff227(Takara Bio公司制)
CHIR99021(Sigma-Aldrich公司制)1μM
PD0325901(Sigma-Aldrich公司制)1μM
Go6983(Sigma-Aldrich公司制)1.25μM或2.5μM
人重组白血病抑制因子(富士胶片和光纯药公司制)10ng/ml
Y27632(富士胶片和光纯药公司制)10uM。
此处，Y27632在传代次日以后也可不添加。
从第10日左右，出现多层圆顶型的集落(幼稚型iPS细胞集落)。
步骤(3)
第10日以后，在前述多层圆顶型的集落变得非常大(直径50～200μm左右)的时间点进行传代，从次日开始高温培养(基本上38℃)。
每隔1日更换t2iLGo+Y培养基，用氧浓度5％的培养箱进行培养。此外，每3～4日进行传代。除去培养基后用D-PBS(Nacalai Tesque公司制)洗涤1次，加入Accutase(Innovative Cell Technologies公司制)在37℃温育7～10分钟，进行传代时的细胞剥离。在目的仅为维持的情形中，作为一个基准，将剥离得到的细胞数的1/5左右接种于相同面积的培养容器。
45次传代后的细胞的相差显微镜图像示于图3A。见到多个多层圆顶状的集落，几乎未确认单层扁平的集落。此外，图3B中显示将图3A的圆顶状集落以幼稚型特异性标记物(NANOG、KLF17)和幼稚型与始发型中细胞内定位不同的基因产物(TFE3)免疫染色的图像。Hoechst表示核染色，PC表示相差显微镜图像。如图3B所示，前述圆顶状集落的组成细胞对于NANOG和KLF17强染色，TFE3的核浓染色。即，得到诱导性多能干细胞，其表达幼稚型特异性标记物，特定基因产物显示幼稚型特异性细胞内定位(与着床前胚胎的内部细胞团相同的基因表达模式)，进一步，形成多层圆顶型的集落(幼稚型的特征性集落形态)。
因此显示，通过具备前述步骤(1)～(3)的方法，从人成纤维细胞制备幼稚型iPS细胞。
然后，分析使用的仙台病毒载体的细胞内残存量。作为比较对象，应用常规型载体(CytoTune-iPS2.0L)。图4示出用定量PCR测定仙台病毒载体的细胞内基因组量、以第14日的时间点的基因组量为1.0、以各个相对值表示的结果。“Conv.Cocktail”表示CytoTune-iPS2.0L，“KLF4/TS7ΔF”表示将CytoTune-iPS2.0L的KLF4载体置换为“18+/KLF4/TS7ΔF”。
如图4所示，本实施例中使用的载体在第38日已经减少至检测界限以下。即，显示通过38℃的高温培养急速消失(KLF4/TS7ΔF_1～3)。此外，在应用“18+/KLF4/TS12”或“18+/KLF4/TS12/miR367T2”作为KLF载体进行38℃培养的情形中，更早8～12日未达检测界限(数据未显示)。
与之相对，常规型载体即使在第80日的时间点也与第14日同程度残存(Conv.Cocktail_1～3)。已知该载体在应用通常的始发型诱导性多能干细胞制备用培养基的培养条件下即使在通常的培养温度(37℃)也逐渐减少，在第80日几乎消失，由此，强烈提示载体的消失速度因不同细胞培养环境受到影响的可能性。
因此显示，为了早期得到不存在载体来源的重编程因子的幼稚型多能干细胞，只要应用在使用幼稚培养基的培养下显示温度敏感性的载体、或包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体等即可，作为前述显示温度敏感性的载体的实例，可以使用包含TS7、TS12或TS15突变的仙台病毒载体。
[实施例3]从人外周血单核细胞(PBMC)制备幼稚型iPS细胞
用于从人外周血单核细胞(PBMC)制备幼稚型iPS细胞的方案示于图5。
步骤(1)
从仙台病毒载体感染的5日前应用PBMC用培养基在37℃在常氧条件下(约20％)培养PBMC。不进行培养基更换。PBMC用培养基(PBMC medium)的组成在以下显示。记载的浓度全部为终浓度：
StemSpan ACF(STEMCELL Technologies公司制)
Recombinant Human SCF(R&D Systems公司制)100ng/ml
Recombinant Human TPO(R&D Systems公司制)100ng/ml
Recombinant Human Flt3/Flk2(R&D Systems公司制)100ng/ml
Recombinant Human IL-6(R&D Systems公司制)50ng/ml
Recombinant Human IL-3(R&D Systems公司制)20ng/ml。
感染当日(第0日)计算细胞数、感染与细胞数相应量的仙台病毒，以后在35℃低氧(5％O2)环境温育。感染的仙台病毒的量作为一个基准是KOS:MOI5、LMYC:MOI5、KLF4:MOI5，但与细胞相应进行了适当条件研究。感染时为了提高病毒的密度，基本上用24孔或比其小的孔感染。此外，在同日准备接种了iMEF的细胞培养容器(基本为6孔)。感染24小时后(第1日)回收细胞除去含病毒培养基，进行细胞数计算后将任意的细胞数接种于接种了iMEF的细胞培养容器。在本实施例中，在5％的CO2浓度条件下进行培养。
步骤(2)
在第2日半量除去PBMC用培养基，添加半量的幼稚培养基(t2iLGo+Y)。以后每隔1日同样半量除去培养基，半量添加新的培养基。在第8日完全吸入培养基，更换为总量幼稚培养基。幼稚培养基(t2iLGo+Y)的组成与实施例2中从人皮肤成纤维细胞制备幼稚型iPS细胞时使用的那种相同。
步骤(3)
从第10日左右出现多层圆顶状的集落(幼稚型iPS细胞集落)，第10日以后在集落变得非常大(直径50～200μm左右)的时间点进行传代，从次日开始高温培养(基本上38℃)。维持培养和传代方法与实施例2中从人皮肤成纤维细胞制备幼稚型iPS细胞时进行的方法相同。
从开始38℃的培养的第14日，用qPCR定量评价每一传代仙台病毒载体的基因组量(图6)。在应用18+/KLF4/TS7ΔF作为KLF4载体的情形中，载体量在第38日变得不足检测界限，但在应用18+/KLF4/TS12ΔF或18+/KLF4/PmiR367T2/TSΔF的情形中，在第30日变得不足检测界限。
因此显示，通过具备前述步骤(1)～(3)的方法，也从人外周血单核细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞，进一步，在约30～38日后得到实质上不含重编程因子的幼稚型iPS细胞。
因此知晓，通过应用本申请牵涉的方法，可以从人的各种体细胞迅速制备幼稚型诱导性多能干细胞(进一步详细地，实质上不含重编程因子的幼稚型iPS细胞)。
[实施例4]幼稚型诱导性多能干细胞的性状稳定性
对于实施例2、3中得到的幼稚型诱导性多能干细胞，关于长期传代后的性状稳定性进行分析。
将作为幼稚型诱导性多能干细胞的标准的复位幼稚型ES细胞(Reset Naive ESC(in-house))、本发明人建立的HDF来源的始发型iPS细胞8克隆、应用本发明得到的长期传代后(P16～P45)的HDF来源的幼稚型iPS细胞计4克隆、PBMC来源的幼稚型iPS细胞计2克隆、和已报告的幼稚型ES细胞(Reset Naive ESC,6/5/4iLA Naive ESC)和人胚胎的单细胞数据整合进行主成分分析(图7)。显示出，由红框包围的部分存在本发明人建立的幼稚型iPS细胞，在同一组内也存在Reset Naive ESC(in-house)，总的基因表达与Reset Naive ESC相同。
基于与图7相同从RNA-seq得到的数据，用SNP分析比较验证各细胞种中印记基因和X染色体相关基因的表达模式(图8)。HDF、始发型和幼稚型iPS细胞全部来源于同一女性的HDF。在HDF和始发型iPS细胞中，如由MEG3代表的印记基因的表达作为原则显示仅从单侧等位基因的表达模式，但在幼稚型中，显示印记消失从两侧等位基因的表达模式。此外，在本验证中应用的女性来源的HDF和始发型iPS细胞中，通过一方的X染色体的失活，X染色体相关基因的表达显示仅从单侧等位基因的表达模式，但在幼稚型中，显示伴随X染色体再活化从两侧等位基因的表达模式。
应用从图7的RNA-seq中应用的相同细胞与RNA同时得到的DNA，应用甲基化阵列，由密度豆荚图(图9A)和主成分分析(图9B)表示HDF来源的和PBMC来源的幼稚型iPS细胞的总的甲基化。Primed表示申请人建立的始发型iPS细胞，Naive表示幼稚型iPS细胞。图9A中，本发明中得到的幼稚型与始发型比较均有β值低(＝Hypomethylated:低甲基化)的倾向，并且显示与Reset Naive ESC(in-house)同等的低甲基化。图9B中显示，始发型与幼稚型明确分开，具有不同的甲基化模式。此外，应用LC-MS/MS分析本实施例中得到的HDF来源的幼稚型iPS细胞的5-甲基胞嘧啶占总胞嘧啶的比例(图9C)。幼稚型iPS细胞显示与Reset NaiveESC同等低的比例，提示基因组中甲基化胞嘧啶的比例降低。
对于RNA-seq和甲基化阵列中应用的长期传代后(P16～45)的HDF来源的幼稚型iPS细胞计2克隆、PBMC来源的幼稚型iPS细胞计2克隆、和作为对照的Reset Naive ESC(in-house)，比较分析三胚层成分的初期分化能力(图10)。在96孔板中接种10×106个ES细胞/iPS细胞，应用分化培养基(DMEM+20％FBS)在低氧(5％O2)环境下培养24日，回收形成的胚状体。从回收样本提取RNA，通过逆转录得到cDNA后，应用TaqMan hPSC Scorecard Panel(ThermoFisher Scientific公司制)半综合评价三胚层初期分化能力。从图的左端按顺序显示多能性标记物、外胚层标记物、中胚层标记物、内胚层标记物的表达量。此外，灰色的图表示Reset Naive ESC，红色的图表示本发明中得到的幼稚型iPS细胞。任一克隆都显示与Reset Naive ESC同等或特别是在中胚层中更好的多分化能力。
如此确认了，本申请牵涉的方法中得到的幼稚型诱导性多能干细胞即使在超过180日的长期传代后，也显示与幼稚型诱导性多能干细胞的标准同样的总的基因表达模式、跨全基因组的广泛DNA脱甲基化、X染色体的再活化、和三胚层成分的初期分化能力。
因此知晓，通过本申请牵涉的方法，可以迅速制备真正的幼稚型诱导性多能干细胞。
[实施例5]改变型OSKL-SEV载体重编程系统的开发
应用市售的CytoTune-iPS 2.0L SeV重编程试剂盒(包含SeV(PM)KOS/TS12ΔF(SeV-KOS)、SeV(HNL)LMYC/TS15ΔF(SeV-LMYC)和SeV18+KLF4/TSΔF(SeV-KLF4)载体)，从人皮肤成纤维细胞(HDF)建立幼稚型人iPS细胞(nCT2.0L_1-4)。在从SeV导入的第94日，通过免疫染色验证建立的幼稚型人iPSC中残存的SeV的存在(图11A)。如图11A的右上图所示，大多数的细胞显示强阳性，提示SeV的高度残存。然后，采集各传代中的细胞，通过定量RT-PCR(qRT-PCR)测定残存的SeV基因组的量。即使应用市售的CytoTune-iPS 2.0(包含SeV-KOS、SeV(HNL)CMYC/TS15ΔF(SeV-CMYC)和SeV-KLF4载体；OSKM)或CytoTune-iPS 2.0L(OSKL)的任一，由于HDF或人外周血单核细胞(PBMC)中每次重复传代SeV的量暂时减少，但有其后有再度增加的倾向，因此即使反复传代SeV也不消失(图11B)。此外，SeV基因组的表达在全部克隆中残存，在几个细胞株中为与管家基因GAPDH相同或其以上的表达水平。定量残存的3个SeV载体基因组的各表达水平，结果是，SeV-KOS和SeV-CMYC/LMYC载体在全部克隆中以特别高的水平残存，SeV-KLF4载体在半数以上的克隆中以特别高的水平残存(图11C)。
研究这些载体残存的理由。已知的是，SeV载体在混合感染中共有病毒蛋白，但形成SeV-KLF4/TS载体的骨架的SeV-TSΔF载体与SeV-TS12ΔF或SeV-TS15ΔF载体不同，温度敏感性非常低，因此难以通过温度的升高从感染细胞除去。SeV-TSΔF、SeV-TS12ΔF或SeV-TS15ΔF载体中的各基因中点突变的有无示于表1。
[表1]
因而本发明人假设，重编程混合物中的SeV18+KLF4/TSΔF(KLF4/TS)载体的存在是全部SeV载体基因组的持续的主要原因。
为了验证该假设，作为SeV-KLF4/TS载体的替代物，应用以下的3种改变SeV-KLF4载体(图11D)：SeV18+KLF4/TS12ΔF(SeV-KLF4/TS12)、SeV18+KLF4/PmiR367T2/TSΔF(SeV-KLF4/miR/TS)、和SeV18+KLF4/PmiR367T2/TS12(SeV-KLF4/miR/TS12)载体。SeV-KLF4/TS12载体是为了增强温度敏感性基于在P基因中具有更多的点突变的SeV-TS12ΔF载体形成的(图11D)。SeV-KLF4/miR/TS载体具有在SeV载体基因组的P基因的5'侧串联插入的hsa-microRNA-367(miR-367)目标序列(即，不是miR-367本身，而是miR-367的目标序列)(图11D)。已确认miR-367在始发型人多能干细胞(PSC)中特异性地大量表达，但本发明人确认，miR-367在幼稚型人PSC中与HDF比较也大量表达(图11E)。因而认为，miR-367的接受性在幼稚型人PSC中迅速的SeV载体除去中是有用的。SeV-KLF4/miR/TS12载体整合SeV-KLF4/TS12和SeV-KLF4/miR/TS两方的特征，提示可进一步加速载体的除去(图11D)。
比较通过这些载体的组合重编程的效率。据报告，在使用从人成纤维细胞制备iPSC中具有KLF4基因的温度敏感性SeV载体的情形中，(大概由于重编程结束前大多数载体消失)除感染复数提高的情形在37℃无法制备iPSC。因而，从感染时至出现足够幼稚型iPSC集落的第14日，在35℃培养细胞，进行第1次传代。第1次的传代后，将培养温度提高至38℃，除去SeV载体(图11F)。应用SeV-KOS、SeV-LMYC和改变型SeV-KLF4载体的HDF的重编程导致大约第10日幼稚型iPSC集落的出现，这与应用SeV-KLF4/TS载体的以往的方法一致。
不存在从人外周血单核细胞(PBMC)建立幼稚型人iPSC的报告。实际上，本发明人也无法使用CytoTune-iPS 2.0从PBMC建立幼稚型人iPSC(图11G)。
[实施例6]SeV消失速度的验证、对无饲养的幼稚型iPSC的应用
比较应用各KLF4载体从HDF建立幼稚型人iPS细胞的情形的建立效率(图12A)。任一载体与以往的载体(SeV-KLF4/TS)比较都没有建立效率的降低，包含SeV-KLF4/TS12或SeV-KLF4/miR/TS12的OSKL(将CMYC置换为LMYC的OSKM)混合物与以往的载体比较建立效率显著提高。
然后，检测通过这些载体制备的幼稚型iPSC中残存的SeV载体。为了在再生医疗中应用iPSC来源的分化细胞，从至少1x105个细胞检测起因于外来性多能性基因的残存的单一的未分化细胞的灵敏度成为必要。qRT-PCR分析确认具有能够从1x106个SeV阴性细胞检测单一的SeV阳性细胞的灵敏度(图12B)。在计算上，即使在1,638,400个的SeV阴性细胞中有1个SeV阳性细胞也可检测，比免疫染色等方法灵敏度高得多。通过该qRT-PCR分析，定量评价SeV基因组的残存量。在第14日使温度变化后，SeV-KLF4/TS12、SeV-KLF4/miR/TS和SeV-KLF4/miR/TS12载体显示SeV基因组的显著清除，但SeV-KLF4/TS水平的降低非常慢。特别地，SeV-KLF4/miR/TS12在第34日达到qRT-PCR的检测界限，这在SeV-KLF4载体中最快(图12C)。根据这些结果，结论是，SeV-KLF4/miR/TS12载体是与重编程效率和载体的清除速度有关的最优SeV-KLF4载体。
对于应用SeV-KLF4/miR/TS12载体的重编程进行进一步验证。应用SeV-KOS、SeV-LMYC和SeV-KLF4/miR/TS12载体，能够不仅从HDF(nOSKL_1、2)也从PBMC(nOSKL_3、4)制备幼稚型iPSC克隆。在第34日，确认全部的nOSKL-iPSC克隆中SeV消失(图12D)。有趣的是，通过从重编程的最初应用使放射线照射后小鼠胎儿成纤维细胞(iMEF)与t2iLGo培养基接触的条件培养基，成功地从HDF建立和维持无饲养的幼稚型iPSC(nOSKL_FF_1、2)(图12E)。然后，计算nOSKL_1-4的细胞增殖速度。即使在全部的克隆中重复传代，也未见到细胞增殖速度的明显降低(图12F)。
[实施例7]建立的幼稚型iPSC的基因表达
然后，验证制备的nOSKL-iPSC对幼稚型多能性的特异性特性。为了比较，采集从与nOSKL-iPSC相同的体细胞诱导的始发型人iPSC(OSKL_1-4)，始发型WA09 H9胚胎干细胞(ESC；H9)，始发型201B7iPSC(201B7)，以及通过过量表达KLF2和NANOG从始发型复位为幼稚型、在与nOSKL-iPSC相同的条件维持的复位幼稚型H9 ESC(nH9)。用qRT-PCR验证幼稚型iPSC特异性标记物的表达(图13A)。此处，已知NANOG在始发型iPSC中也表达但在幼稚型iPSC中显著增加。任一幼稚型iPSC株与始发型iPSC株相比都优先地高表达幼稚型iPSC特异性标记物。同样，用qRT-PCR验证始发型iPSC特异性标记物的表达(图13B)。任一幼稚型iPSC株与始发型iPSC株相比都优先地低表达始发型iPSC特异性标记物。对于这些细胞株进行RNA-seq，比较代表性多能性标记物的表达(图13C)。nOSKL-iPSC显示与nH9几乎相同的多能性标记物表达。然后，将nOSKL-iPSC的转录组与始发型PSC以及以前公开的复位幼稚型PSC和人内细胞团的数据组比较(Takashima,Y.et al.Resetting transcription factorcontrol circuitry toward ground-state pluripotency in human.Cell 158,1254-1269,doi:10.1016/j.cell.2014.08.029(2014).；Theunissen,T.W.et al.Systematicidentification of culture conditions for induction and maintenance of naivehuman pluripotency.Cell stem cell 15,471-487,doi:10.1016/j.stem.2014.07.002(2014).；Yan,L.et al.Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantationembryos and embryonic stem cells.Nature structural&molecular biology 20,1131-1139,doi:10.1038/nsmb.2660(2013).)。通过主成分分析(PCA)知晓，nOSKL-iPSC与始发型PSC明确地区分，具有与nH9几乎相同的特征(图13D)。本发明人建立的幼稚型人iPSC最接近外胚层。
[实施例8]建立的幼稚型iPSC的甲基化和X染色体的再活化的验证
在实施例7的RNA-seq中使用的细胞株中进行甲基化阵列(图14A)。包含无饲养的幼稚型iPSC(FF_1-2)的nOSKL-iPSC与始发型PSC比较显示总的DNA脱甲基化状态。此外，在甲基化阵列数据的PCA中，始发型iPSC与幼稚型iPSC被明确地分离(图14B)。
通过RNA-FISH验证X染色体再活化(图14C)。HUWE1是活化X染色体中表达的基因。XIST是本来在使X染色体失活的方向工作的lncRNA，但在具有与Naive型iPSC类似的特征的着床前外胚层中，见到在两方的活化X染色体中XIST变为阳性的看似矛盾的发现(图14C的左端的图)。随着与始发型iPSC接近，图14C的右侧的图中基因表达模式变化，在始发型iPSC中基本上大多数细胞显示图14C的右端的图的基因表达模式(HUWEI+/-、XIST-/-)。进一步，在建立的克隆中进行RNA-FISH(图14D)。因克隆存在偏差，但nOSKL-iPSC与始发型PSC比较明显显示与着床前外胚层类似的模式。通过这些观察，确认nOSKL-iPSC是幼稚型状态。
[实施例9]建立的幼稚型iPSC的线粒体功能的评价
基于实施例7的RNA-seq的数据，比较与氧化磷酸化相关的线粒体基因的表达(图15A)。幼稚型iPSC与始发型iPSC比较线粒体基因的表达量高，这提示有氧代谢等的线粒体功能被活化。然后，应用细胞外通量分析仪比较幼稚型iPSC与始发型iPSC的代谢能力(图15B)。幼稚型iPSC与始发型iPSC比较在FCCP施用后氧消耗速度(OCR)显著提高，这提示幼稚型iPSC的优异的备用呼吸能力。对于幼稚型iPSC与始发型iPSC，定量比较作为有氧代谢能力的指标之一的备用呼吸能力(图15C)。nOSKL-iPSC与nH9同样显示与始发型iPSC比较高的值。进一步，研究作为糖酵解代谢功能的指标的细胞外酸性化速度(ECAR)和作为有氧代谢功能的指标的OCR(图15D)。幼稚型iPSC与始发型iPSC比较ECAR和OCR均为高值，提示高能量代谢状态。
[实施例10]建立的幼稚型iPSC向原始内胚层的分化能力的验证
幼稚型PSC与着床前外胚层类似，具有分化为胚外组织的能力。该特征与始发型PSC不同。原始内胚层几乎无法从始发型iPSC分化，但只要从幼稚型iPSC则可分化。因而，本发明人研究nOSKL-iPSC在规定的分化培养基中分化为幼稚型PSC来源的原始内胚层的能力(图16A)。分化诱导开始后第3日的始发型ESC和nOSKL-iPSC的光学显微镜图像示于图16B。nOSKL-iPSC与始发型ESC比较明显显示与内胚层系细胞类似的形态。然后，应用流式细胞术比较验证作为原始内胚层特异性标记物的PDGFRA和ANPEP的表达量(图16C)。n9和nOSKL-iPSC高表达作为原始内胚层特异性标记物的PDGFRA和ANPEP，显示向原始内胚层的良好分化能力。应用始发型PSC和以往的SeV-KLF4/TS载体(CytoTune-iPS 2.0L)建立的残存SeV的幼稚型iPSC的PDGFRA和ANPEP的表达水平非常低，这显示向原始内胚层的分化能力显著低。研究PDGFRA/ANPEP共阳性细胞中信号值的中值(图16D)。始发型iPSC和残存SeV的幼稚型iPSC在图16D的左下侧分布，与之相对，nH9和用本方法建立的幼稚型iPSC在右上侧分布，这提示用本方法建立的幼稚型iPSC具有与nH9类似的优异分化能力。
[实施例11]建立的幼稚型iPSC向滋养外胚层的分化能力的验证
此外，滋养外胚层(TE)也几乎无法从始发型iPSC分化，但只要从幼稚型iPSC则可分化。本发明人研究nOSKL-iPSC在规定的分化培养基中分化为幼稚型PSC来源的滋养外胚层(TE)的能力(图17A)。分化诱导开始后第3日的始发型ESC和nOSKL-iPSC的光学显微镜图像示于图17B。分化诱导开始后第3日的两者的形态明确不同。然后，应用流式细胞术比较验证作为滋养外胚层特异性标记物的TACSTD2、ENPEP、HAVCR1和作为阴性标记物的HLA-ABC的表达量(图17C)。由于n9和nOSKL-iPSC高表达作为TE特异性标记物的HAVCR1、不表达HLA-ABC，显示向TE的良好分化能力。由于始发型PSC完全不表达HAVCR1、近半数为HLA-ABC阳性，提示几乎不分化为TE。应用以往的SeV-KLF4/TS载体(CytoTune-iPS2.0L)建立的残存SeV的幼稚型iPSC的TACSTD2、ENPEP和HAVCR1的表达水平非常低，这显示与始发型PSC同样向TE的分化能力显著低。通过流式细胞术，研究TACSTD2/ENPEP共阳性和HAVCR1阳性细胞的比例(图17D)。始发型iPSC和残存SeV的幼稚型iPSC在图17D的左侧分布，与之相对，nH9和用本方法建立的幼稚型iPSC在图17D的右侧分布，这提示用本方法建立的幼稚型iPSC具有与nH9类似的优异分化能力。此外，有趣的是，nOSKL-iPSC的几个克隆以比nH9高的水平表达TACSTD2和ENPEP。
综上，本发明人开发了用于通过改良SeV-KLF4载体的构成从体细胞制备幼稚型人iPSC的显著高速的SeV基因组除去系统。其结果，与用以往的方法制备的幼稚型iPSC比较，能够取得在初期传代中具有强的导入基因非依赖性、具有优异的幼稚型特异性分化能力的幼稚型人iPSC。进一步，通过将重编程因子的组合变更为SeV-OSKL，成功地从PBMC重编程为幼稚型人iPSC。此外，本发明人应用iMEF条件培养基在无饲养环境从皮肤成纤维细胞建立幼稚型人iPSC。这些技术革新使应用幼稚型人iPSC的初期发生的研究和临床应用大大发展。
序列表
<110> 国立大学法人京都大学
株式会社爱迪药业
<120> 从体细胞制备幼稚型人iPS细胞的方法
<130> 676564
<150> JP2020-217472
<151> 2020-12-25
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸(Synthetic polynucleotide)
<400> 1
tcaccattgc taaagtgcaa ttcgattcac cattgctaaa gtgcaatt 48

Claims (40)

1.从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的方法，其包括下述步骤(1)～(3)：
(1)向人的体细胞导入包含重编程因子的1个以上的载体的步骤、
(2)在幼稚培养基的存在下，培养所述体细胞的步骤、和
(3)在步骤(2)之后，在幼稚培养基的存在下，在每所述体细胞的所述载体量与步骤3开始时相比减少至30％以下的条件下，培养得到的细胞的步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述1个以上的载体是负链RNA病毒载体。
3.权利要求2所述的方法，其中，所述1个以上的载体是副粘病毒载体。
4.权利要求3所述的方法，其中，所述1个以上的载体是仙台病毒载体。
5.权利要求1～4的任一项所述的方法，其中，在步骤(1)的1～10日后开始步骤(2)。
6.权利要求1～5的任一项所述的方法，其中，在1～20日期间进行步骤(2)。
7.权利要求1～6的任一项所述的方法，其中，所述1个以上的载体选自由显示温度敏感性的载体，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体，和显示温度敏感性、并且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体组成的组中。
8.权利要求7所述的方法，其中，所述1个以上的载体是显示温度敏感性的载体。
9.权利要求8所述的方法，其中，所述1个以上的载体是在建立幼稚型多能干细胞的细胞培养环境下显示温度敏感性的载体。
10.权利要求9所述的方法，其中，所述1个以上的载体是包含以下的仙台病毒载体：TS7突变，其具有TS突变(M蛋白的G69E/T116A/A183S突变、HN蛋白的A262T/G264R/K461G突变、P蛋白的L511F突变、和L蛋白的N1197S/K1795E突变)和L蛋白的Y942H/L1361C/L1558I突变；TS12突变，其具有TS突变和P蛋白的D433A/R434A/K437A突变；或TS15突变，其具有TS突变、P蛋白的D433A/R434A/K437A突变和L蛋白的L1361C/L1558I。
11.权利要求7～10的任一项所述的方法，其中，步骤(3)包括在38℃以上培养得到的细胞。
12.权利要求7～11的任一项所述的方法，其中，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体是负链RNA病毒载体，所述微小RNA的目标序列存在于NP基因或P基因的翻译区、5’UTR、或3’UTR。
13.权利要求12所述的方法，其中，所述微小RNA是miR-367。
14.权利要求1～13的任一项所述的方法，其中，重编程因子包含OCT基因、SOX基因、MYC基因和/或KLF基因。
15.权利要求14所述的方法，其中，所述1个以上的载体包括：包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体，包含MYC基因的载体，和包含KLF基因的载体。
16.权利要求15所述的方法，其中，包含MYC基因的载体是包含TS15突变的仙台病毒载体。
17.权利要求15或16所述的方法，其中，包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体、和包含KLF基因的载体是包含TS12突变的仙台病毒载体。
18.权利要求1～17的任一项所述的方法，其中，在步骤(3)中，每所述体细胞的所述载体量在自步骤3开始时12日以内与步骤3开始时相比减少至30％以下。
19.权利要求1～18的任一项所述的方法，其中，所述幼稚培养基包含选自白血病抑制因子(LIF)、MEK抑制剂、GSK3抑制剂、cAMP产生促进剂、TGF-β抑制剂和PKC抑制剂中的1种以上的化合物。
20.权利要求19所述的方法，其中，所述幼稚培养基是选自t2iLGo、5iLAF、和tt2iLGo中的培养基。
21.权利要求1～20的任一项所述的方法，其中，在饲养细胞不存在下进行步骤(2)和(3)。
22.权利要求1～21的任一项所述的方法，其中，所述人的体细胞是单核细胞或成纤维细胞。
23.用于从人的体细胞制备幼稚型诱导性多能干细胞的试剂盒，其包含：
包含重编程因子的1个以上的载体，其中所述1个以上的载体选自由显示温度敏感性的载体，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体，和显示温度敏感性、并且包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体组成的组中；和
幼稚培养基。
24.权利要求23所述的试剂盒，其中，所述1个以上的载体是负链RNA病毒载体。
25.权利要求24所述的试剂盒，其中，所述1个以上的载体是副粘病毒载体。
26.权利要求25所述的试剂盒，其中，所述1个以上的载体是仙台病毒载体。
27.权利要求23～26的任一项所述的试剂盒，其中，所述1个以上的载体是显示温度敏感性的载体。
28.权利要求27所述的试剂盒，其中，所述1个以上的载体是在建立幼稚型多能干细胞的细胞培养环境下显示温度敏感性的载体。
29.权利要求28所述的试剂盒，其中，所述1个以上的载体是包含以下的仙台病毒载体：TS7突变，其具有TS突变(M蛋白的G69E/T116A/A183S突变、HN蛋白的A262T/G264R/K461G突变、P蛋白的L511F突变、和L蛋白的N1197S/K1795E突变)和L蛋白的Y942H/L1361C/L1558I突变；TS12突变，其具有TS突变和P蛋白的D433A/R434A/K437A突变；或TS15突变，其具有TS突变、P蛋白的D433A/R434A/K437A突变和L蛋白的L1361C/L1558I。
30.权利要求23～29的任一项所述的试剂盒，其中，包含对诱导性多能干细胞特异性的微小RNA的目标序列的载体是负链RNA病毒载体，所述微小RNA的目标序列存在于NP基因或P基因的翻译区、5’UTR、或3’UTR。
31.权利要求30所述的试剂盒，其中，所述微小RNA是miR-367。
32.权利要求23～31的任一项所述的试剂盒，其中，重编程因子包含OCT基因、SOX基因、MYC基因和/或KLF基因。
33.权利要求32所述的试剂盒，其中，所述1个以上的载体包括：包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体，包含MYC基因的载体，和包含KLF基因的载体。
34.权利要求33所述的试剂盒，其中，包含MYC基因的载体是包含TS15突变的仙台病毒载体。
35.权利要求33或34所述的试剂盒，其中，包含OCT基因、SOX基因和KLF基因的载体、和包含KLF基因的载体是包含TS12突变的仙台病毒载体。
36.权利要求23～35的任一项所述的试剂盒，其中，所述幼稚培养基包含选自由白血病抑制因子(LIF)、MEK抑制剂、GSK3抑制剂、cAMP产生促进剂、TGF-β抑制剂和PKC抑制剂组成的组中的1种以上的化合物。
37.权利要求36所述的试剂盒，其中，所述幼稚培养基是选自由t2iLGo、5iLAF、和tt2iLGo组成的组中的培养基。
38.权利要求23～37的任一项所述的试剂盒，其中，所述人的体细胞是单核细胞或成纤维细胞。
39.由权利要求1～22的任一项所述的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液。
40.化妆品，其包含由权利要求1～22的任一项所述的方法制备的幼稚型诱导性多能干细胞的培养上清液作为原料。
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Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
KR100552387B1 (ko) 1995-10-31 2006-04-21 가부시끼가이샤 디나벡 겡뀨쇼 자율 복제 능력을 갖는 (-)쇄 rna 바이러스 벡터
ATE470704T1 (de) 1995-11-01 2010-06-15 Dnavec Research Inc Rekombinantes sendai-virus
US6130313A (en) 1997-10-02 2000-10-10 Clontech Laboratories, Inc. Rapidly degrading GFP-fusion proteins
CN100352925C (zh) 1999-05-18 2007-12-05 株式会社载体研究所 副粘病毒衍生的rnp
ATE367445T1 (de) 1999-05-18 2007-08-15 Dnavec Research Inc Viraler paramyxoviridae vektor mit einem defekten hüllprotein-gen
WO2003025570A1 (en) 2001-09-18 2003-03-27 Dnavec Research Inc. Method of examining (-) strand rna virus vector having lowered ability to form grains and method of constructing the same
JP3748535B2 (ja) 1999-09-06 2006-02-22 株式会社ディナベック研究所 改変された転写開始配列を有するパラミクソウイルス
WO2004025264A2 (en) 2002-09-16 2004-03-25 Promega Corporation Rapidly degraded reporter fusion proteins
KR101279677B1 (ko) 2004-01-22 2013-06-27 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 사이토메갈로바이러스 인핸서 및 닭 β­액틴 프로모터를 포함하는 하이브리드 프로모터를 이용한 마이너스 가닥 ＲＮＡ 바이러스 벡터의 제조방법
JP4901471B2 (ja) 2004-02-19 2012-03-21 国立大学法人京都大学 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
WO2006137517A1 (ja) 2005-06-24 2006-12-28 Dnavec Corporation 幼少個体への遺伝子導入用ベクター
US20090130763A1 (en) 2005-09-15 2009-05-21 Yoshihiro Miwa Method of Controlling Degradation of Protein by Tetracycline Antibiotic
CN103113463B (zh) 2005-12-13 2015-02-18 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
CA2636600A1 (en) 2006-01-17 2007-07-26 Dnavec Corporation Novel protein expression system
US20100209974A1 (en) 2006-07-13 2010-08-19 Dnavec Corporation Non-replicating paramyxoviridae virus vector
US8173792B2 (en) 2007-02-09 2012-05-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for regulating protein function in cells using synthetic small molecules
JP5278942B2 (ja) 2007-12-03 2013-09-04 独立行政法人産業技術総合研究所 タンパク質短寿命化ペプチドをコードする遺伝子及びその使用方法
CA2731007A1 (en) 2008-07-16 2010-01-21 Dnavec Corporation Method for production of reprogrammed cell using chromosomally unintegrated virus vector
WO2010125620A1 (ja) 2009-04-30 2010-11-04 国立大学法人大阪大学 哺乳類細胞におけるタンパク質分解誘導方法
JP2011101639A (ja) 2009-10-16 2011-05-26 Kumamoto Univ タンパク質低発現化ペプチドをコードする遺伝子およびその使用方法
EP2537930A4 (en) * 2010-02-18 2013-10-02 Univ Osaka METHOD FOR MANUFACTURING INDUCED PLURIPOTENT STRAIN CELL
WO2012029770A1 (ja) 2010-08-30 2012-03-08 ディナベック株式会社 多能性幹細胞を誘導するための組成物およびその使用
AU2014324233B2 (en) * 2013-09-24 2020-07-23 Id Pharma Co., Ltd. Method for improving efficiency of inducing pluripotent stem cell
JP6366944B2 (ja) 2014-01-24 2018-08-01 国立大学法人 東京大学 プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法並びにそのための組成物および組合せ
WO2016027099A2 (en) * 2014-08-22 2016-02-25 Cambridge Enterprise Limited Resetting pluripotent stem cells
EP3272858A4 (en) 2015-03-18 2018-08-08 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. Method for producing naïve pluripotent stem cells
WO2016179243A1 (en) 2015-05-05 2016-11-10 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Reversion of primed pluripotent stem cells to naive pluripotent stem cells
CN108473978B (zh) 2015-11-13 2022-11-01 株式会社爱迪药业 经过改良的副粘病毒载体
US20190127707A1 (en) 2016-03-30 2019-05-02 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Medium for culturing naive pluripotent stem cells and method for culturing pluripotent stem cells
WO2019093340A1 (ja) * 2017-11-07 2019-05-16 国立大学法人京都大学 ナイーブ型多能性幹細胞からの原始内胚葉誘導方法
CN111684063A (zh) * 2018-01-31 2020-09-18 富士胶片株式会社 细胞的制造方法
JP7406257B2 (ja) * 2019-01-25 2023-12-27 国立研究開発法人産業技術総合研究所 人工マイクロｒｎａ前駆体およびそれを含む改良されたマイクロｒｎａ発現ベクター

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