CN108473978B - 经过改良的副粘病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明的技术问题在于提供可以实现搭载于载体的基因的瞬时高表达及在该表达后载体的快速除去等的经过改良的负链RNA病毒载体及其利用。本发明发现，通过向负链RNA病毒载体所具有的NP、P或L基因添加微RNA目标序列，导入细胞可以依赖于进行表达的微RNA来对载体的表达进行调控。特别是在向NP、或P基因添加了微RNA目标序列的情况下，依赖于微RNA载体的表达降低，并促进载体的除去，另一方面，在向L基因添加的情况下，效果逆转。本发明的载体可以用于细胞疗法及再生医疗，以及作为以癌症为靶向的治疗用载体很有用。

Description

经过改良的副粘病毒载体
技术领域
本发明涉及经过改良的负链RNA病毒载体。更具体而言，涉及以向NP、P和/或L基因中添加微RNA目标序列的方式进行了修饰后的负链RNA病毒载体及其利用。
背景技术
仙台病毒(SeV)载体等负链RNA病毒载体为细胞质型RNA病毒载体(表达的全部阶段在细胞质中进行的载体)，因此即使在体内使用，也完全无需担心搭载基因向宿主染色体整合而产生遗传毒性。另外，它具有可以在体外和体内两者获得高的基因导入、表达效率；及可以在体外长期持续表达等多种优异的性能。因此，SeV载体广泛在多能干细胞的制备、基因治疗/基因疫苗或者抗体产生及功能分析等应用中作为基因导入载体而采用及利用，例如(专利文献1、2；非专利文献1、2)。
目前，报告有：通过缺陷SeV载体的P蛋白实现瞬时表达(专利文献3、非专利文献3)；通过向非复制型载体(专利文献4)、P蛋白或L蛋白插入温度敏感性突变和基于温度变动而除去SeV载体(专利文献1、2)；通过向L基因的3’非翻译区中添加miR-302a的目标序列或基于添加siRNA而除去SeV载体(专利文献5)。但是，P蛋白缺陷载体存在搭载基因表达低和表达时间短的技术问题(SeV载体的高表达能力受损)，而现有的温度敏感性突变载体存在除去所需时间较长(在39℃下培养数天)的技术问题。
而实际上，具有向SeV载体的L基因的3’非翻译区添加微RNA目标序列的例子(专利文献5)，但不存在向SeV载体的NP基因或P基因添加微RNA目标序列的例子。
现有技术文
专利文献
专利文献1：国际公开WO2010/008054
专利文献2：国际公开WO2012/029770
专利文献3：国际公开WO2008/133206
专利文献4：国际公开WO2008/007581
专利文献5：国际公开WO2012/063817
非专利文献
非专利文献1：Bitzer M,et al.,J Gene Med.(2003)5,543-553
非专利文献2：Griesenbach U,et al.,Curr Opin Mol Ther.(2005)7,346-352
非专利文献3：Abe T,et al.Exp Hematol.(2011)39,47-54
发明内容
发明想要解决的技术问题
本发明的技术问题在于提供通过向负链RNA病毒的NP、P和/或L基因添加微RNA目标序列来调控载体表达的方法以及该载体及其利用。具体而言，本发明的技术问题在于提供向负链RNA病毒的NP基因和/或P基因添加了微RNA目标序列而成的负链RNA病毒载体、该载体的制造方法及其使用。另外，本发明提供通过向负链RNA病毒的NP基因和/或P基因添加微RNA目标序列来负调控载体表达的方法。另外，本发明还涉及促进载体除去的方法，该方法使用向负链RNA病毒的NP基因和/或P基因添加了微RNA目标序列而得到的负链RNA病毒载体。
另外，本发明的技术问题在于提供向L基因添加了微RNA目标序列而得到的负链RNA病毒载体、该载体的制造方法及其使用。另外，本发明提供通过向负链RNA病毒的L基因添加微RNA目标序列来正调控载体表达的方法。
用于解决技术问题的技术方案
本发明人等探索了在维持负链RNA病毒载体的基因表达能力，并且改善载体除去速度的方法。
为了使用负链RNA病毒载体进行瞬间表达，本发明人等最初尝试了使用P基因缺陷载体。但是，将制备的载体导入细胞中并观察报告蛋白的表达，发现，在不表达P蛋白的HeLa细胞中，没有确认到报告蛋白的表达。非专利文献3中也报道了，与没有发生P基因的缺陷的载体相比，来自P基因缺陷载体的搭载基因的表达为1/10以下。另外，专利文献4的非复制型SeV载体为了获得充分的基因表达量，需要存在高滴度或者辅助(helper)载体，生产效率也比较低。另一方面，就专利文献2中记载的载体(TS12骨架及TS15骨架)而言，通过在培养条件39℃下培养感染细胞7天，除去了SeV载体，但在37℃下除去则需要更长时间，例如，在诱导iPS细胞时，从SeV载体感染至获得碱性磷酸酶阳性菌落经过了28天。另外，虽然假设iPS细胞的细胞增殖较快，载体容易除去，但仍不能立刻除去载体，从而可以想到，在HeLa细胞等普通细胞株中，除去载体需要更长时间。
另外，本发明人等也尝试了通过向P蛋白添加降解决定子(degron)来除去SeV载体(国际公开WO2016/125364)。在向温度敏感性P蛋白添加降解决定子(degron)而得到的载体中，可以实现比专利文献2中记载的载体更快地除去载体，但存在需要在比除去载体的温度更低的温度下使其感染(当在37℃下除去骨架的情况下，在32～35℃下进行感染)的技术问题。
针对这样的技术问题，本发明人等者人认为可以通过向负链RNA病毒载体的病毒基因添加RNA目标序列来促进载体的除去。因此，本发明人等首先尝试了通过向负链RNA病毒载体的L基因添加RNA目标序列来除去载体，其中，L基因是负链RNA病毒载体的病毒蛋白中被认为最适合促进通过微RNA目标序列除去载体的基因。然而，向L基因添加RNA目标序列之后，在表达微RNA的细胞中，载体的表达反而上升，难以通过向L基因添加RNA目标序列来有效调控导入基因的表达及载体的除去。
因此，本发明人等进行了向负链RNA病毒的P基因添加RNA目标序列的实验。结果发现，在向P基因的编码区或5’或者3’非翻译区添加了微RNA目标序列的情况下，在刚刚向微RNA非表达细胞导入载体之后，导入基因的表达可以实现极高水平，另一方面，在微RNA表达细胞中，发挥快速除去载体这一非常优异的性能。另外，在L基因的情况下，即使重复四次添加的微RNA目标序列，也不能获得降低导入基因的表达的效果，而在P基因的情况下，可以通过一个微RNA目标序列发挥效果。而且，与向NP基因添加微RNA目标序列而得到的载体相比，向P基因导入微RNA目标序列时，降低导入基因的表达的效果更高。对P基因的5’及3’非翻译区进行比较可知，3’端降低导入基因的表达的效果更高。
而且，在搭载有两个P基因的载体中，成功地通过微RNA目标序列细胞特异性地使一个P蛋白的表达降低，通过温度敏感性或者降解决定子(degron)使另一个P蛋白的表达降低。通过搭载两个表达调控特性不同的P基因，获得了可以在37℃下感染，且通过微RNA目标序列及温度敏感性或者降解决定子(degron)的多个系统调控表达的载体。
在iPS细胞中，通过多个微RNA确认了促进载体的除去。另外，还证明了，不仅iPS细胞，在用作中胚层模型的血管内皮细胞、用作内胚层模型的肝细胞、用作外胚层模型的神经细胞、用作正常细胞模型的BJ细胞中，搭载有进行特异性表达的微RNA的目标序列的载体在各个细胞中可以被除去。而且，进一步证明了，若向溶瘤病毒搭载在正常细胞中表达且在癌细胞中表达降低的微RNA的目标序列，则溶瘤病毒具有癌细胞选择性地进行增殖。即，可以实现：在作为iPS细胞材料的细胞中使搭载于载体上的转录因子等瞬间高表达，通过重编程之后表达的微RNA除去载体；在干细胞中使转录因子等瞬间高表达，通过分化诱导之后表达的微RNA除去载体；在溶瘤病毒中，抑制对正常细胞的影响，同时提高对癌细胞的选择性。因此，本发明的载体有望用作对于再生医疗或细胞疗法等中的细胞的性状修饰或者癌治疗等有用的基因表达载体。
另外，本发明提供以搭载多个P基因的方式进了修饰后的修饰副粘病毒载体。在本发明中，判断P基因的表达调控对于载体的表达调控及载体消失调控极其有用。通过在载体上搭载多个P基因，并对各自的P基因的表达进调控，可以更复杂且灵活地调整载体表达及调控载体的消失。特别是，为搭载多个P基因的修饰副粘病毒载体时，向至少一个P基因添加了微RNA调控序列而得到的载体，作为用于制备iPS细胞的载体发挥更优异的特性。
即，本发明涉及以向NP、P和/或L基因添加RNA目标序列的方式进行了修饰后的负链RNA病毒载体及其利用等，更具体而言，提供下述发明。
[1]一种修饰副粘病毒载体，其以添加微RNA的目标序列的方式对该病毒的NP基因、P基因或L基因进行了修饰，其中，在表达该微RNA的细胞中，就向NP基因或P基因添加了微RNA目标序列而得到的载体而言，该载体的表达被负调控；就向L基因添加了微RNA目标序列而得到的载体而言，该载体的表达被正调控。
[2]根据[1]所述的载体，其中，至少一个包膜蛋白质基因发生缺陷。
[3]根据[2]所述的载体，其中，至少F基因或M基因发生缺陷。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的载体，其中，NP基因、P基因或L基因的翻译区、5’或3’非翻译区中添加有微RNA目标序列。
[5]根据[1]～4]中任一项所述的载体，其中，副粘病毒为仙台病毒。
[6]根据[1]～5]中任一项所述的载体，其中，包含温度敏感性突变。
[7]根据[6]所述的载体，其中，该温度敏感性突变包含P蛋白的L511F突变。
[8]根据[6]或[7]所述的载体，其中，该温度敏感性突变包含P蛋白的D433A、R434A及K437A。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的载体，其中，微RNA目标序列选自miR-122、miR-124、miR-126、miR-138、miR-143、miR-218、miR-302簇、miR-367及miR-372各目标序列。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的载体，其搭载转录因子基因或自杀基因。
[11]一种用于促进除去副粘病毒载体的方法，其包括：使用[1]～[10]中任一项所述的载体，该载体向NP基因或P基因中添加微RNA目标序列。
[12]一种[1]～[10]中任一项所述的载体的制造方法，其包括如下工序：
使编码该载体的基因组RNA或其互补链的核酸与均未添加微RNA目标序列的NP基因、P基因及L基因共同表达。
[13]一种调控搭载基因的表达量的方法，其包括：使用[1]～[10]中任一项所述的载体。
[14]根据[13]所述的方法，其中，搭载基因编码转录因子。
[15]根据[13]或[14]所述的方法，其中，搭载基因编码诱导多能干细胞的重编程因子。
[16]根据[13]所述的方法，其中，搭载基因为自杀基因。
[17]根据[13]或[16]所述的方法，其用于溶解肿瘤细胞。
[18]一种促进除去副粘病毒或副粘病毒载体的方法，其包括如下工序：使该病毒或病毒载体与[1]～[10]中任一项所述的载体共感染，该载体是向NP基因或P基因添加了微RNA目标序列而得到的。
[19]一种副粘病毒或副粘病毒载体的除去促进剂，其包含[1]～[10]中任一项所述的载体。
[20]一种修饰副粘病毒载体，其搭载至少两个以上的P基因。
[21]根据[20]所述的载体，其中，至少一个P基因编码的P蛋白为温度敏感性和/或添加有降解决定子(degron)。
[22]根据[20]或[21]所述的载体，其中，NP基因、P基因或L基因的翻译区、5’或3’非翻译区添加有微RNA目标序列。
[23]根据[22]所述的载体，其是[1]～[10]中任一项所述的载体。
[24]一种调控载体的表达量和/或除去的方法，其包括：使用[20]～[23]中任一项所述的载体，该载体搭载有：编码温度敏感性和/或添加有降解决定子(degron)的P蛋白的至少一个P基因，和添加有微RNA目标序列的至少一个P基因。
另外，本发明也涉及以下发明。
[25]根据[1]～[10]中任一项所述的载体，其搭载编码转录因子的基因。
[26]根据[1]～[10]中任一项所述的载体，其搭载编码重编程因子的基因。
[27]根据[26]所述的载体，其中，重编程因子为KLF4。
[28]根据[1]～[10]中任一项所述的载体，其中，使M基因缺损。
[29]根据[28]所述的载体，其中，F蛋白质的裂解位点进行了修饰。
[30]根据[29]所述的载体，其中，F蛋白质通过癌特异性蛋白酶发生裂解。
[31]根据[28]～[30]中任一项所述的载体，其搭载自杀基因。
[32]根据[1]～[10]中任一项所述的载体，其搭载两个以上的P基因。
[33]根据[32]所述的载体，其中，至少一个P基因编码的P蛋白为温度敏感性和/或添加有降解决定子(degron)。
[34]根据[32]或[33]所述的载体，其中，NP基因、P基因或L基因的翻译区、5’或3’非翻译区添加有微RNA目标序列。
[35]根据[32]～[34]中任一项所述的载体，其中，全部P基因中添加有降解决定子(degron)和/或微RNA目标序列。
[36]一种对载体的表达量和/或载体的除去进行调控的方法，其包括：使用[32]～[35]中任一项所述的载体，并且该载体搭载：编码温度敏感性和/或添加有降解决定子(degron)的P蛋白的至少一个P基因，和添加有微RNA目标序列的至少一个P基因。
[37]一种该载体用于在细胞重编程中导入重编程因子基因的用途，其中，使用[32]～[35]中任一项所述的载体，并且该载体搭载：编码温度敏感性和/或添加有降解决定子(degron)的P蛋白的至少一个P基因，和添加有微RNA目标序列的至少一个P基因。
[38]一种[26]或[27]的载体在细胞在重编程中的用途。
[39]一种[28]～[31]中任一项所述的载体在癌治疗中的用途。
发明的效果
根据本发明，可以通过向NP或者P基因添加RNA目标序列来显著促进载体的除去。可以兼顾高的基因表达量和快速除去载体，无需高温培养即可在调控转录因子的表达、制备iPS细胞及细胞分化中促进载体除去，可以提高溶瘤载体感染时肿瘤细胞特异性感染。而且，可以通过向L基因添加微RNA目标序列提高载体的表达。若在例如M基因缺失型的溶瘤载体中向L基因添加微RNA目标序列，则可以提高溶瘤载体感染时载体的增殖。
附图说明
图1是表示微RNA目标序列的搭载位置的图。
图2A是表示可以通过添加微RNA目标序列调控载体的基因表达的图。当使HeLa细胞感染DGFPmiRT及PmiRT时，观察到DGFP的荧光，其中，DGFPmiRT及PmiRT为向DGFP或P基因添加miR302T4而得到的载体，该miR302T4通过重复miR-302簇的目标序列四次而得到；在表达miR-302的iPS细胞中，几乎观察不到荧光。另一方面，作为向L基因添加miR-302T4而得到的LmiRT#1载体，在表达miR-302的iPS细胞中观察到DGFP的荧光增加。使微RNA目标序列的搭载位置向L基因的3’侧偏移而得到的LmiRT#2的荧光为DGFP的6.5倍。
图2B是表示图2A的后续的图。
图3是通过SeV抗体染色表示采用添加微RNA目标序列来除去载体的图。载体感染22天之后进行SeV抗体染色，PmiRT为SeV抗体阴性，LmiRT#1及LmiRT#2为SeV抗体阳性。
图4A是表示添加微RNA目标序列的位置及载体骨架的研究的图。与未添加微RNA目标序列的DGFP相比，向NP基因添加miR-302T4的NPmiRT的表达被抑制，而与向P基因添加的情况相比，表达抑制较弱。向P基因的编码区添加miR-302T4而得到的PmiRTtag可以获得与PmiRT相同的效果。在温度敏感性得到了强化的TS12和TS15骨架的PmiRT中，也可以获得相同的表达抑制效果。
图4B是表示图4A的后续的图。
图5A是探讨微RNA目标序列的重复数量的图。PmiRTx2和PmiRTx1也显示出表达抑制效果，其中，PmiRTx2的P基因添加有miR-302的目标序列重复两次得到的miR302T2，PmiRTx1中的miR-302的目标序列为一个。在延长培养时间之后的day2，PmiRTx2显示出与微RNA目标序列的重复数量为4次的PmiRT相同的表达抑制效果。
图5B是表示图5A的后续的图。
图6是表示即使通过iPS细胞中进行表达的其它微RNA目标序列也可以获得效果的图。向P基因添加了miR367T2而得到的PmiR367T2也显示出表达抑制效果，重复miR-367的目标序列两次而得到miR367T2。
图7表示即使通过在分化细胞中进行表达的其它微RNA目标序列也可以获得效果的图。PmiR126T2也显示出表达抑制效果，PmiR126T2的P基因添加有miR-126的目标序列(两次重复)，该miR-126的目标序列已知在中胚层系统的血管内皮细胞中进行表达。
图8是表示即使在不包含温度敏感性突变的载体中也可以获得由微RNA目标序列产生的效果的图。通过向不包含温度敏感性突变的SeV载体的P基因添加miR-302T4，在38.5℃的培养环境下显示表达抑制效果。
图9是表示搭载miR-372、miR-218、miR-122或miR-143目标序列的载体在各种细胞中的表达抑制效果的图。示出搭载有下述目标序列的载体的表达抑制效果：已知在iPS细胞中进行表达的miR-372(A)、已知在正常细胞中进行表达的miR-143(B)、已知在内胚层系统的肝细胞进行表达的miR-122(C)、已知在外胚层系统的神经细胞进行表达的miR-218(D)的目标序列(两次重复)。
图10是表示搭载miR-124或miR-138目标序列的载体在神经细胞的分化阶段的特异性表达抑制效果的图。
图11是表示向各病毒基因的5’侧(基因组中为3’侧)添加微RNA目标序列时的效果的图。通过向NP及P的5’侧添加发挥了作为微RNA目标序列的功能(表达抑制效果)，而L5’侧的添加未发挥作为微RNA目标序列的细胞特异性效果。
图12是表示向微RNA目标序列导入的突变的图。
图13是表示向微RNA目标序列导入突变的效果的图。
图14是表示向微RNA目标序列导入突变的效果的图。示出了第5天的荧光信号比较(利用MetaMorph进解析)。基于miR367目标序列进行的表达抑制效果的强度的顺序为T2>T2m1>T1>T2m2>T2m3>T2m4。
图15是表示微RNA目标序列搭载载体的共感染的效果的图。通过使miR367目标序列搭载载体共感染，观察到DGFP的荧光衰减。示出第3天的结果。
图16是表示微RNA目标序列+HSV-TK的评价的图。向P基因的3’UTR添加miR302目标序列的四次重复序列，在第1天得到抑制效果(小组A)。将添加更昔洛韦(GCV)之后的细胞示于小组B(SeV感染第5天、GCV添加d第3天)。以25～100μg/mL探讨GCV。如图所示，通过向表达HSV-TK的细胞中添加GCV来诱发细胞死亡。其结果显示，可以除去载体残留细胞。例如，为了排除基于微RNA产生的未充分细胞的除去，可以将自杀基因搭载在载体上。
图17是表示搭载于M基因缺失型载体的微RNA目标序列的效果的图。在M基因缺失型载体中，在具有转移性癌细胞特异性地诱导细胞融合的BioKnife型载体(搭载F基因的载体，并且F基因的F蛋白质的裂解位点被修饰为uPA型)的P基因的3’侧搭载在正常细胞中进行表达的miR-143目标序列。微RNA目标序列的搭载载体及非搭载载体这两者均可以诱导癌细胞(PC-3)的细胞融合，但在搭载微RNA目标序列的载体(BioKnife/miR143T2)中，显著抑制正常细胞(BJ)中的表达(A及B)。BJ细胞通过感染未搭载微RNA目标序列的载体(BioKnife)显示出细胞毒性，但通过搭载微RNA目标序列(miR143T2)抑制细胞毒性。由于通过在正常细胞中表达的微RNA抑制表达，因此确认不显示正常细胞的细胞毒性(C及D)。
图18是表示使用miR367T2载体制备iPS细胞(ALP染色)的图。(A)表示使用Matrigel的分析中第21天的菌落的状况。在使用搭载miR367T2的载体的情况下，较大的ALP阳性菌落较多。(B)表示未向KLF4表达载体添加微RNA目标序列(KLF4)、向KLF4表达载体添加miR302T2或miR367T2时(分别为KLF4/miR302T2及KLF4/miR367T2)的ALP阳性菌落的状况。
图19是表示在iPS细胞制备过程中的载体表达変化(DGFP)的图。观察到miR367T2的DGFP表达降低(利用MetaMorph的解析)。在第21天，表达降低至现有载体TS的24％，确认到较快除去(A)。使用miR302T2时也相同(B)。
图20是表示搭载多个P基因的载体产生的效果的图。(A)为第二个P基因和微RNA目标序列的搭载位置的例子。一个P基因来自温度敏感性TS15、另一个P基因中添加有miR367T2的PsPmiR367T2在35℃下充分表达，但在37℃下，温度敏感性与微RNA目标序列一起发生作用，由此表达被抑制(B)。
图21是表示搭载多个P基因且添加有降解决定子(degron)得到的载体产生的效果。一个P基因添加有降解决定子(degron)，另一个P基因添加有微RNA目标序列的载体(Pd2sPmiR367T2、PddsPmiR367T2、PtetRsPmiR367T2)在不表达微RNA的细胞中得到充分表达，在表达微RNA的细胞中被除去。与未搭载降解决定子(degron)的PsPmiR367T2相比，搭载降解决定子(degron)的载体的除去效果得到促进。
图22是表示利用搭载多个P基因的载体制备iPS细胞的图。若在37℃下组合TS12骨架和TS15骨架的两种载体，几乎无法得到基因表达，与此相对，在搭载多个P基因的载体中，通过使用两种载体获得了较强的基因表达(A)。在搭载多个P基因的载体中，通过使用两种载体获得了ALP阳性的iPS细胞(B)。(C)表示在利用搭载多个P基因的载体制备iPS细胞的过程中的载体表达変化(DGFP)。与未搭载降解决定子(degron)的PsPmiR367T2相比，搭载有降解决定子(degron)的载体的除去效果得到促进。
具体实施方式
下面，对本发明的实施方式进行详细说明。
本发明提供向负链RNA病毒的NP、P、或L基因中添加微RNA目标序列而得到的负链RNA病毒载体、载体的制造方法、载体的用途及促进载体除去的方法等。特别是，本发明提供向NP、P或L基因添加了微RNA目标序列得到的负链RNA病毒载体且该载体缺失了该病毒的F基因或M基因、载体的制造方法、载体的用途及促进载体除去的方法等。在此，“或”中包含“及”的方式。即，向NP、P或L基因添加了微RNA目标序列是指，向NP、P或L基因中任意一个中至少添加了微RNA目标序列，不排除向其它基因添加微RNA目标序列。例如，可以向NP、P及L基因中的两个以上或全部基因添加了微RNA目标序列，另外，也可以向除此之外的基因进一步添加微RNA目标序列。
负链RNA病毒载体是指来自包含负链(病毒蛋白按照反义进行了编码的链)的RNA作为基因组的病毒的病毒载体。负链RNA也被称为负股RNA(negative RNA)。在本发明中，刻意特别示例单股负链RNA病毒(也称为非分段型(non-segmented)负链RNA病毒)。单链负股RNA病毒是指基因组中具有单链负股(即负链)RNA的病毒。作为这样的病毒，包含属副粘病毒(包含副粘病毒科(Paramyxoviridae)；副粘病毒(Paramyxovirus),麻疹病毒属(Morbillivirus)，腮腺炎病毒属(Rubulavirus)及肺炎病毒(Pneumovirus)属等)、弹状病毒(Rhabdoviruses)(包含弹状病毒科(Rhabdoviridae)；水疱病毒属(Vesiculovirus)，狂犬病病毒属(Lyssavirus)及短暂热病毒属(Ephemerovirus)属等)、丝状病毒(Filoviridae)等科的病毒，在分类学上，属于单股负链病毒目(Mononegavirales)(病毒第57卷第1号，pp29-36，2007；Annu.Rev.Genet.32,123-162,1998；Fields virology fourthedition,Philadelphia,Lippincott-Raven,1305-1340,2001；Microbiol.Immunol.43,613-624,1999；Field Virology,Third edition pp.1205-1241,1996)。
在本发明中，作为优选的负链RNA病毒载体，可以举出：副粘病毒载体及弹状病毒载体。在本发明中，副粘病毒是指属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒或其衍生物。副粘病毒科为基因组中具有非分段型负股RNA的病毒分组中的一种，包含副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)(包含呼吸道病毒属(也称为副粘病毒属)、腮腺炎病毒(Rubula virus)属及麻疹病毒(Morbilli virus)属)及肺病毒亚科(Pneumovirinae)(包含肺病毒属及变性肺病毒属)。作为副粘病毒科病毒中包含的病毒，具体而言，可以举出：仙台病毒(Sendaivirus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻疹病毒(Measles virus)、RS病毒(Respiratory syncytial virus)、牛疫病毒(rinderpestvirus)、瘟热病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(simian parainfluenza virus 5(SV5))、人副流感病毒1、2、3型等。更具体而言，包含：例如仙台病毒(Sendai virus)(SeV)、人副流感病毒-1(human parainfluenza virus-1)(HPIV-1)、人副流感病毒-3(humanparainfluenza virus-3)(HPIV-3)、海豹温热病毒(phocine distemper virus)(PDV)、犬瘟热病毒(canine distemper virus)(CDV)、dolphin molbillivirus(DMV)、小反刍动物瘟疫病毒(peste-des-petits-ruminants virus)(PDPR)、麻疹病毒(measles virus)(MeV)、牛瘟病毒(rinderpest virus)(RPV)、亨德拉病毒(Hendra virus)(Hendra)、尼帕病毒病(Nipah virus)(Nipah)、人副流感病毒-2(human parainfluenza virus-2)(HPIV-2)、猴副流感病毒(simian parainfluenza virus 5)(SV5)、人副流感病毒-4a(humanparainfluenza virus-4a)(HPIV-4a)、人副流感病毒-4b(human parainfluenza virus-4b)(HPIV-4b)、腮腺炎病毒(mumps virus)(Mumps)、及鸡新城疫病毒(Newcastle diseasevirus)(NDV)等。作为弹状病毒，包含弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)等。
本发明的病毒优选副粘病毒亚科(包含呼吸道病毒属，腮腺炎病毒属，及麻疹病毒属)的病毒或其衍生物，更优选为属于呼吸道病毒属(genus Respirovirus)(也称为副粘病毒属(Paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物中包含对病毒基因进行修饰的病毒及化学修饰后的病毒等而并不损害病毒导入基因的能力。作为可以适用本发明的呼吸道病毒属病毒，包含：例如人副流感病毒-1型(HPIV-1)、人副流感病毒-3型(HPIV-3)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、仙台病毒(Sendai virus；也称为小鼠副流感病毒-1型)、麻疹病毒、猴副流感病毒(SV5)及猴副流感病毒-10型(SPIV-10)等。在本发明中，副粘病毒最优选为仙台病毒。
负链RNA病毒通常包含在被膜的内部的含有RNA和蛋白质的复合体(核糖核蛋白；RNP)。RNP中所含的RNA为负链RNA病毒的基因组即(-)链(负股)的单链RNA，该单链RNA与NP蛋白质、P蛋白质及L蛋白质结合从而形成RNP。该RNP中所含的RNA形成用于病毒基因组转录及复制的模板(Lamb,R.A.,and D.Kolakofsky,1996,Paramyxoviridae:The viruses andtheir replication.pp.1177-1204.In Fields Virology,3rd edn.Fields,B.N.,D.M.Knipe,and P.M.Howley et al.(ed.),Raven Press,New York,N.Y.)。
负链RNA病毒的“NP、P、M、F、HN及L基因”分别是指：编码核壳体、磷酸、基质、融合、血凝素-唾液酸苷酶及大蛋白的基因。核衣壳(NP)蛋白质是与基因组RNA结合，且用于使基因组RNA具有模板活性而不可或缺的蛋白质。通常，NP基因也记作“N基因”。磷酸(P)蛋白质是作为RNA聚合酶的小亚基的磷酸化蛋白质。基质(M)蛋白质发挥从内侧维持病毒颗粒结构的功能。融合(F)蛋白质为与向宿主细胞入侵相关的膜融合蛋白质，血凝素-唾液酸苷酶(HN)蛋白质是与和宿主细胞结合相关的蛋白质。大(L)蛋白质是RNA聚合酶的大亚基。上述各基因具有单独的转录调控单元，从各基因转录单独的mRNA，并转录蛋白质。除P蛋白质以外，从P基因翻译非结构蛋白质(C)和蛋白质(V)，其中，上述非结构蛋白质(C)利用不同的ORF进行翻译；蛋白质(V)是通过在读取P蛋白质mRNA途中的RNA编辑制得的。属于例如副粘病毒亚科的各病毒中的各基因通常从3’开始依次如下记载。
呼吸道病毒属N P/C/V M F HN-L
腮腺炎病毒属N P/V M F HN(SH)L
麻疹病毒属N P/C/V M F H-L
作为例如仙台病毒的各基因的碱基序列的数据库的收录号，对于N基因参考M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046、X17218；对于P基因参考M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007、X17008；对于M基因参考D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584、X53056；对于F基因参考D00152、D11446,、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152,、X02131；对于HN基因参考D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808、X56131；对于L基因参考D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587、X58886。另外，作为其它病毒进行编码的病毒基因的示例，对于N基因可以例示：CDV,AF014953；DMV,X75961；HPIV-1,D01070；HPIV-2,M55320；HPIV-3,D10025；Mapuera,X85128；Mumps,D86172；MeV,K01711；NDV,AF064091；PDPR,X74443；PDV,X75717；RPV,X68311；SeV,X00087；SV5,M81442；及Tupaia,AF079780，对于P基因可以例示：CDV,X51869；DMV,Z47758；HPIV-l,M74081；HPIV-3,X04721；HPIV-4a,M55975；HPIV-4b,M55976；Mumps,D86173；MeV,M89920；NDV,M20302；PDV,X75960；RPV,X68311；SeV,M30202；SV5,AF052755；及Tupaia,AF079780，对于C基因可以例示：CDV,AF014953；DMV,Z47758；HPIV-1,M74081；HPIV-3,D00047；MeV,ABO16162；RPV,X68311；SeV,AB005796；及Tupaia,AF079780，对于M基因可以例示：CDV,M12669；DMV Z30087；HPIV-1,S38067；HPIV-2,M62734；HPIV-3,D00130；HPIV-4a,D10241；HPIV-4b,D10242；Mumps,D86171；MeV,AB012948；NDV,AF089819；PDPR,Z47977；PDV,X75717；RPV,M34018；SeV,U31956；及SV5,M32248，对于F基因可以例示：CDV,M21849；DMV,AJ224704；HPN-1,M22347；HPIV-2,M60182；HPIV-3,X05303,HPIV-4a,D49821；HPIV-4b,D49822；Mumps,D86169；MeV,AB003178；NDV,AF048763；PDPR,Z37017；PDV,AJ224706；RPV,M21514；SeV,D17334；及SV5,AB021962，对于HN(H或G)基因可以例示：CDV,AF112189；DMV,AJ224705；HPIV-1,U709498；HPIV-2.D000865；HPIV-3,AB012132；HPIV-4A,M34033；HPIV-4B,AB006954；Mumps,X99040；MeV,K01711；NDV,AF204872；PDPR,X74443；PDV,Z36979；RPV,AF132934；SeV,U06433；及SV-5,S76876，对于L基因可以例示：CDV,AF014953；DMV,AJ608288；HPIV-1,AF117818；HPIV-2,X57559；HPIV-3,AB012132；Mumps,AB040874；MeV,K01711；NDV,AY049766；PDPR,AJ849636；PDV,Y09630；RPV,Z30698；及SV-5,D13868。其中，各病毒已知有多个菌株，根据菌株的不同，存在由除上述所示例序列以外的序列构成的基因。具有来自这些中的任意一个基因的病毒基因的仙台病毒载体可以用作本发明的载体。另外，关于P蛋白，其功能位点为包含C端侧的N结合位点、L结合位点、低聚物形成位点的区域(在SeV的情况下，其为P蛋白的C端侧的320-568)(Blanchard L.et al.,Virology.(2004)319,201-211.)，本发明的P蛋白优选至少包含该区域。例如，本发明的载体包含上述任意一种病毒基因的编码序列(关于SeV的P基因，可以为例如C端侧的序列，例如，第479个～第568个氨基酸序列或第320个～第568个氨基酸序列)和具有90％以上、优选95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上同源性的碱基序列。另外，本发明的载体包含例如上述任意一种病毒基因的编码序列所编码的氨基酸序列(关于SeV的P蛋白，可以为例如C端侧的序列，例如第479个～第568个氨基酸序列或第320个～第568个氨基酸序列)和具有90％以上、优选95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上同源性的氨基酸序列所编码的碱基序列。另外，本发明的载体包含编码多肽的碱基序列，该多肽包含在例如上述任意一种病毒基因的编码序列所编码的氨基酸序列(关于SeV的P基因，可以为例如C端侧的序列，例如第479个～第568个氨基酸序列或第320个～第568个氨基酸序列)中取代、插入、缺损和/或添加10个以内、优选9个以内、8个以内、7个以内、6个以内、5个以内、4个以内、3个以内、2个以内或1个氨基酸而成的氨基酸序列。这样的载体进修饰，使得进行编码的NP、P和/或L基因中添加RNA目标序列而得到的载体优选用作本发明的载体。
需要说明的是，本说明书中记载的碱基序列及氨基酸序列等参照数据库收录号的序列为参照例如本申请的申请日期及优先日期的序列的序列，可以特定为本申请的申请日及优先权日期的任意时刻的序列，优选特定为本申请的申请日的序列。各时刻的序列可以参考数据库的修订历史记录来确定。
另外，本发明的负链RNA病毒来自天然株、野生株、突变株、实验室继代株及人工构建株等。例如，可以举出仙台病毒Z株(Medical Journal of Osaka University Vol.6,No.1,March 1955p1-15)。即，该病毒可以为与天然单离的病毒具有相同结构的病毒载体，也可以为通过基因重组进行人工修饰后的病毒。例如，可以为野生型病毒具备的任意基因上存在突变或缺损的病毒。例如，可以优选使用编码病毒的被膜蛋白或外壳蛋白的至少一个基因上具有突变或缺损的病毒。这样的病毒载体为可以在例如感染细胞中复制基因组但不能形成感染性病毒颗粒的病毒载体。这样的传播能力缺损型病毒载体无需担心向周围扩散感染，因此安全性很高。例如，可以使用不包含编码F和/或HN等被膜蛋白或刺突蛋白的至少一个基因、或者它们的组合的负链RNA病毒(WO00/70055及WO00/70070；Li,H.-O.et al.,J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。若将基因组复制所需的蛋白(例如N、P、及L蛋白)编码在基因组RNA中，则可以在感染细胞中扩大基因组。为了制造缺损型病毒，例如，从外部向病毒产生细胞提供所缺损的基因产物或补充其的蛋白(WO00/70055及WO00/70070；Li,H.-O.et al.,J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。另外，还已知有，将病毒载体作为非感染性的病毒颗粒(VLP)进行回收而无需完全补充所缺损的病毒蛋白的方法(WO00/70070)。另外，在将病毒载体作为RNP(例如由N、L、P蛋白及基因组RNA构成的RNP)进行回收的情况下，可以制造载体而无需补充被膜蛋白。
另外，本发明的病毒不限定于天然病毒，例如，也包含人工制备的病毒。例如，本发明的病毒也包含为优化密码子而向核酸序列导入突变的病毒及嵌合病毒(例如包含同源病毒之间的嵌合及异源病毒之间的嵌合病毒(例如包含PIV和SeV的嵌合等))等(J.Virol.1995,69,849-855)。
另外，在本发明中，N、L、P蛋白等病毒蛋白质只要保持在导入细胞中表达基因的功能即可，可以不为野生型。例如，可以适当使用：适当添加标识等肽的修饰蛋白、经过密码子修饰后的蛋白及缺失野生型蛋白的一部分氨基酸序列而不会丧失功能的蛋白质等。在本发明中，N、L、P蛋白也包含如上所述的修饰蛋白及缺失型蛋白。例如，P蛋白只要具备C端的一部分即可，其它区域不是病毒载体表达必须的。
在本发明中，负链RNA病毒载体为具有来自该病毒的基因组核酸，可以通向该核酸中整合导入基因而使该基因表达的载体。在本发明中，负链RNA病毒载体包含具有通过导入细胞而使所搭载的基因进行表达的能力的复合体，上述复合体为除感染病毒颗粒以外的病毒核心(viral core)、病毒基因组和病毒蛋白的复合体；或者为包含非感染性病毒颗粒等的复合体。
本发明的载体以添加微RNA目标序列的方式对NP基因、P基因或L基因进行了修饰，由此，关于向NP基因和/或P基因添加微RNA目标序列而得到的载体，在导入对该微RNA进表达的细胞的情况下，与未添加微RNA目标序列的情况相比，该载体的表达被负调控；关于向L基因添加微RNA目标序列而得到的载体，在导入对该微RNA进行表达的细胞的情况下，与未添加微RNA目标序列的情况相比，该载体为表达被正调控的载体。在此，载体的表达是指来自载体的基因的表达水平(mRNA和/或蛋白的表达水平)、导入细胞内的载体的基因组的拷贝数或导入基因的表达时间中的任意一项或它们的组合，优选至少来自载体的基因的表达水平被如上调控。作为向NP基因和/或P基因添加微RNA目标序列而得到的载体，优选直到载体从细胞中除去的时间缩短。
在本发明中，病毒载体为，例如，来自该病毒的(-)链单链RNA基因组的RNA，及与来自该病毒的(-)链单链RNA结合的病毒蛋白质且与该RNA结合的蛋白质的复合体，它通过导入细胞使搭载基因进行表达。在本发明中，与(-)链单链RNA结合的蛋白质是指与该(-)链单链RNA直接和/或间接地结合，从而与该(-)链单链RNA形成复合体的蛋白质。本发明的复合体包含：含有来自负链RNA病毒的(-)链单链RNA及来自与其结合的负链RNA病毒的蛋白质(例如NP、P及L蛋白质)的复合体。在本发明中，“来自负链RNA病毒”是指负链RNA病毒的构成物(包含蛋白质、RNA)为当前状态或一部分被修饰后的状态。例如，负链RNA病毒的蛋白质或对RNA进行了修饰而制得的蛋白质或RNA为“来自负链RNA病毒的”蛋白质或RNA。本发明的载体只要具有上述特征即可，其种类不限。例如，本发明的载体可以为具有包膜蛋白质(F、HN及M蛋白质)等且采用病毒颗粒结构的病毒载体。另外，也可以为作为RNP自身的RNP载体，但不具有病毒被膜。
在负链RNA病毒中，NP、P、L蛋白质与(-)链单链RNA结合，起到基因组RNA复制及蛋白质表达不可或缺的功能(下面有时将NP、P、L蛋白质称为“基因组RNA结合蛋白质”)。NP蛋白质是非常牢固地与基因组RNA结合，并赋予基因组RNA模板活性的蛋白质。基因组RNA仅在与NP蛋白质结合的状态下具有RNA合成的模板活性，在未与NP蛋白质结合的状态下，完全不具有模板活性。P蛋白质作为RNA聚合酶的小亚基与基因组RNA结合，L蛋白质作为RNA聚合酶的大亚基与基因组RNA结合。因此，在负链RNA病毒中，即使NP、P、L蛋白质中的一个缺损，也不会产生基因组RNA复制。
如上所述，本发明的载体的方式的特征在于包含复合体，该复合体含有(a)NP基因、P基因或L基因以添加微RNA目标序列的方式进行了修饰而得到的、来自负链RNA病毒的(-)链单链RNA；(b)NP蛋白质、P蛋白质及L蛋白质。本发明的载体也可以为包含复合体(RNP)的病毒颗粒，该复合体含有经过修饰的(-)链单链RNA(基因组RNA)和NP、P、L蛋白质。使本发明的载体感染宿主，通过本发明的载体中所含有的NP、P、L蛋白质的作用，由按照基因组RNA中进行编码的基因而使蛋白质表达。向NP基因和/或P基因添加微RNA目标序列而得到的载体在导入表达该微RNA的细胞的情况下，该载体的表达被负调控，细胞内的载体基因组的扩增被抑制，从而容易从细胞消失。如上所述地载体可以通过与温度敏感性突变适当组合来有效调控载体的表达及调控载体的除去。
按照本发明的载体的基因组RNA进行编码的基因可以为直接来自病毒的基因序列，也可以导入任意突变。例如，本领域技术人员可以通过公知方法将不会损害各蛋白质的功能的轻微突变导入基因组RNA上的各基因中。例如，可以通过PCR法或盒式突变法等位点特异性地导入突变或者通过化学试剂或随机核苷酸等导入随机突变。
例如，在被膜蛋白及刺突蛋白中，已知有包含减毒突变及温度敏感性突变的多种突变。在本发明中，可以优选使用具有这些突变蛋白基因的病毒。在本发明中，可以优选使用细胞毒性减弱的载体。载体的细胞毒性可以通过例如对从载体感染细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)进行定量而测定。LDH释放量越少，细胞毒性越低。例如，可以使用细胞毒性比野生型显著衰减的载体。就细胞毒性的衰减程度而言，例如，可以使用以MOI(感染滴度)3使人源HeLa细胞(ATCC CCL-2)或猴源CV-1细胞(ATCC CCL 70)感染，并在35～37℃(例如37℃)下培养3天之后，培养液中的LDH释放量相比野生型显著降低的载体，例如降低20％以上，25％以上，30％以上，35％以上，40％以上，或50％以上的载体。另外，使细胞毒性降低的突变也包含温度敏感性突变。
另外，温度敏感性可以通过测定病毒宿主在通常温度(例如37℃～38℃)下的病毒增殖速度或搭载基因的表达水平来确定。判断与不具有突变的情况相比，病毒的增殖速度和/或搭载基因的表达水平越低，温度敏感性越高。
在本发明中，所使用的病毒载体优选在至少一个、更优选在至少2、3、4、5个或5个以上的病毒基因上具有缺失或突变。缺失和突变可以任意组合导入各基因。在此，突变是指：功能降低型突变或温度敏感性突变，其至少在37℃下，使病毒的增殖速度或所搭载的任意基因的表达水平与野生型相比降低至优选1/2以下、更优选1/3以下、更优选1/5以下、更优选1/10以下、更优选1/20以下。特别是在降低宿主细胞中的细胞毒性或促进载体的除去方面，使用如上所述的修饰病毒载体是有用的。例如，在本发明中，可以优选使用的病毒载体的至少两个病毒基因发生了缺失或突变。这样的病毒包含：至少两个病毒基因发生了缺失的病毒；至少两个病毒基因发生了突变的病毒；至少一个病毒基因发生了突变且至少一个病毒基因发生了缺失的病毒。突变或缺失的至少两个病毒基因为优选编码被膜组成蛋白的基因。例如本发明的负链RNA病毒载体优选至少F基因或M基因发生了缺损。例如，在本发明中，优选使用F基因缺失并进一步删除M和/或HN基因、或者在M和/或HN基因进一步具有突变(例如温度敏感性突变)的载体。另外，在本发明中，使用的载体更优选至少三个病毒基因(优选编码被膜组成蛋白的至少三个基因；F,HN,及M)发生了缺失或突变。这样的病毒载体包含：至少三个基因发生了缺失的病毒载体；至少三个基因发生了突变的病毒载体；至少一个基因发生了突变且至少两个基因发生了缺失的病毒载体；至少两个基因发生了突变且至少一个基因发生了缺失的病毒载体。在本发明中，作为更优选的方式，例如，优选使用F基因缺失并M及HN基因进一步缺失；或者M及HN基因上进一步具有突变(例如温度敏感性突变)的载体。另外，在本发明中，例如，优选使用F基因缺失并且M或者HN基因进一步缺失，且剩余的M或者HN基因进一步具有突变(例如温度敏感性突变)的载体。这样的突变型病毒可以根据公知的方法制备。
例如，作为M基因的温度敏感性突变，可以举出：任意选自仙台病毒M蛋白上的69位(G69)、116位(T116)及183位(A183)中的位点或者负链RNA病毒M蛋白的相应位点的氨基酸取代(Inoue,M.et al.,J.Virol.2003,77:3238-3246)。在本发明中，优选使用具有编码突变M蛋白的基因组的病毒，其中，突变M蛋白是M蛋白上的上述三个位点中的任意一个、优选任意两个位点的组合、进一步优选三个位点的全部氨基酸被其它氨基酸取代而成的。
作为氨基酸突变，优选侧链的化学性质不同的其它氨基酸的取代，例如取代为BLOSUM62基质(Henikoff,S.and Henikoff,J.G.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919)的值为3以下、优选2以下、更优选1以下、更优选0的氨基酸。具体而言，若为仙台病毒M蛋白，则可以将G69、T116及A183分别取代为Glu(E)、Ala(A)及Ser(S)。关于其它的负链RNA病毒M蛋白，可以将相应位点的氨基酸分别取代为Glu(E)、Ala(A)及Ser(S)。另外，也可以利用麻疹病毒温度敏感性株P253-505(Morikawa,Y.et al.,KitasatoArch.Exp.Med.1991:64；15-30)的M蛋白的突变和同源的突变。作为突变的导入，只要利用例如寡核苷酸等，根据公知的突变导入方法实施即可。
另外，作为HN基因的温度敏感性突变，例如，可以举出：任意选自仙台病毒的HN蛋白的262位(A262)、264位(G264)及461位(K461)中的位点或者负链RNA病毒HN蛋白的相应位点的氨基酸取代(Inoue,M.et al.,J.Virol.2003,77:3238-3246)。在本发明中，优选使用具有编码突变HN蛋白的基因组的病毒，该突变HN蛋白是三个位点中的任意一个、优选任意两个以上的组合、进一步优选三个位点的全部氨基酸被其它氨基酸取代而成的。与上述相同，氨基酸的取代优选为侧链的化学性质不同的其它氨基酸的取代。作为优选例，将仙台病毒HN蛋白的A262、G264及K461分别取代为Thr(T)、Arg(R)及Gly(G)。关于其它负链RNA病毒M蛋白，可以将相应位点的氨基酸分别取代为Thr(T)、Arg(R)及Gly(G)。另外，例如，参考腮腺炎病毒的温度敏感性疫苗株Urabe AM9，也可以向HN蛋白第464及第468个的氨基酸导入突变(Wright,K.E.et al.,Virus Res.2000:67；49-57)。
另外，本发明的载体可以在P基因和/或L基因上具有突变。作为这样的突变，具体而言，可以举出：SeV P蛋白的第86个Glu(E86)的突变、SeV P蛋白的第511号的Leu(L511)取代为其它氨基酸。关于其它负链RNA病毒P蛋白，可以举出相应位点的取代。与上述相同，氨基酸的取代优选为侧链的化学性质不同的其它氨基酸的取代。具体而言，可以示例：第86个氨基酸取代为Lys、第511号的氨基酸取代为Phe等。另外，在L蛋白中，可以举出：SeV L蛋白的第1197号的Asn(N1197)和/或第1795号的Lys(K1795)取代为其它氨基酸，以及其它负链RNA病毒L蛋白的相应位点的取代，与上述相同，氨基酸的取代优选侧链的化学性质不同的其它氨基酸的取代。具体而言，可以示例：第1197号的氨基酸取代为Ser、第1795号的氨基酸取代为Glu等。P基因及L基因的突变可以显著提高持续性感染、对二次颗粒释放的抑制或对细胞毒性的抑制效果。而且，通过整合被膜蛋白基因的突变和/或缺损，可以显著提高它们的效果。另外，作为L基因，可以举出：SeV L蛋白的第1214号的Tyr(Y1214)和/或第1602号的Met(M1602)取代为其它氨基酸，以及其它负链RNA病毒L蛋白的相应位点的取代，与上述相同，氨基酸的取代优选侧链的化学性质不同的其它氨基酸的取代。具体而言，可以示例：第1214号的氨基酸取代为Phe、第1602号的氨基酸取代为Leu等。以上示例的突变可以任意组合。
例如，特别优选：SeV M蛋白的至少第69位的G、第116位的T及第183位的A、SeV HN蛋白的至少第262位的A、第264位的G及第461位的K、SeV P蛋白的至少第511位的L、SeV L蛋白的至少第1197位的N及第1795位的K分别被其它氨基酸取代，且F基因缺损或缺失的仙台病毒载体；以及细胞毒性与这些相同或在其以下，和/或温度敏感性与这些相同或在其以上的F基因缺损或缺失的仙台病毒载体。关于其它负链RNA病毒，优选通过在相应位点进行取代，且F基因缺损或缺失的载体、以及细胞毒性与这些相同或在其以下，和/或温度敏感性与这些相同或在其以上的F基因缺损或缺失载体。作为具体的取代例，例如，关于M蛋白，可以举出：G69E、T116A及A183S的取代；关于HN蛋白，可以举出：A262T、G264R及K461G的取代；关于P蛋白，可以举出L511F的取代；并且，关于L蛋白，可以举出：N1197S及K1795E的取代。
氨基酸突变可以为取代为所需的其它氨基酸，优选与上述相同的取代为侧链的化学性质不同的氨基酸。例如，氨基酸可以分类为下述组：碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等，关于氨基酸，可以举出：取代为该氨基酸所属的组中的氨基酸以外的氨基酸。具体而言，作为碱性氨基酸，可以举出取代为酸性或中性氨基酸；作为极性氨基酸，可以举出取代为非极性氨基酸；作为与二十种的天然氨基酸的平均分子量相比具有较大分子量的氨基酸，可以举出取代为小于该平均分子量的氨基酸；相反作为小于该平均分子量的氨基酸，可以举出取代为大于其的氨基酸等，但不限定于此。
另外，作为L蛋白的突变，可以举出：任意选自SeV L蛋白的第942位(Y942)、第1361位(L1361)及第1558位(L1558)的位点或者负链RNA病毒L蛋白的相应位点的氨基酸取代为其它氨基酸。与上述相同，氨基酸的取代优选为侧链的化学性质不同的其它氨基酸的取代。具体而言，可以示例：第942位的氨基酸取代为His，第1361位的氨基酸取代为Cys，第1558位的氨基酸取代为Ile等。特别优选使用至少第942位或第1558位进行了取代的L蛋白。例如，优选除第1558位以外，第1361位也被其它氨基酸取代的突变L蛋白。另外，优选除第942位以外，第1558位和/或第1361位被其它氨基酸取代的突变L蛋白。可以通过这些突变，提高L蛋白的温度敏感性。
另外，作为P蛋白的突变，可以举出：任意选自SeV P蛋白的第433位(D433)、第434位(R434)及第437位(K437)的位点或者负链RNA病毒P蛋白的相应位点的氨基酸取代为其它氨基酸。与上述相同，氨基酸的取代优选为侧链的化学性质不同的其它氨基酸的取代。具体而言，可以示例：第433位的氨基酸取代为Ala(A)，第434位的氨基酸取代为Ala(A)，第437位的氨基酸取代为Ala(A)等。可以特别优选使用以上三个位点全部被取代的P蛋白。通过这些突变，可以提高P蛋白的温度敏感性。
本发明的载体可以包含的温度敏感性突变已经在WO2012/029770、WO2010/008054、WO2003/025570中详细叙述。优选P蛋白为至少第433位的D、第434位的R及第437位的K这三个位置被其它氨基酸取代的突变P蛋白质。而且，在本发明中，可以使用：编码L蛋白的至少第1558位的L被取代的突变L蛋白质(优选至少第1361位的L也被其它氨基酸取代的突变L蛋白)且缺损或缺失F基因的仙台病毒载体；以及细胞毒性与这些相同或在其以下，和/或温度敏感性与其相同或在其以上的缺损或缺失F基因的仙台病毒载体。除上述突变以外，各病毒蛋白的其他氨基酸(例如10个以内、5个以内、4个以内、3个以内、2个以内或1个氨基酸)可以具有突变。上述具有突变的载体显示高温度敏感性。
本发明的载体所含的基因组RNA可以编码全部包膜蛋白质基因，也可以编码一部分或全部包膜蛋白质基因。被基因组RNA编码的包膜蛋白质基因(M基因、F基因、HN基因)可以为野生型，也可以导入有温度敏感性突变。包膜蛋白质的温度敏感性突变已经在WO2012/029770、WO2010/008054、WO2003/025570中详细叙述。
制造病毒载体时，可以通过在病毒产生细胞中使所需外源性被膜蛋白进行表达，从而制备包含其的病毒载体。对这样的蛋白没有特别限制，可以使用赋予哺乳动物细胞感染能力的所需的粘附因子、配体、受体等蛋白。具体而言，例如，可以举出水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus；VSV)的G蛋白(VSV-G)。VSV-G蛋白可以为来自任意VSV株的蛋白，例如可以使用来自印第安那型(Indiana)血清型株(J.Virology 39:519-528(1981))的VSV-G蛋白，但不限定于此。本发明的病毒载体可以包含来自其它病毒的被膜蛋白的任意组合。
在本发明中，温度敏感性是指与低温(例如30～36℃)相比，通常的细胞培养温度(例如37～38℃)下，活性显著降低。更优选温度敏感性是指与35℃相比，37℃下活性显著降低。例如，在表达载体的情况下，温度敏感性载体是指与低温(例如30～36℃)下的表达量相比，通常细胞培养温度(例如37～38℃)下的表达量显著降低。例如，与35℃相比，37℃下的温度敏感性载体的增殖速度或基因表达水平为例如2/3以下、优选1/2以下、更优选1/3以下、更优选1/5以下、更优选1/10以下、更优选1/20以下。另外，与具有野生型蛋白的载体相比，温度敏感性载体在37℃下的增殖速度或基因表达水平为例如1/2以下、更优选1/3以下、更优选1/5以下、更优选1/10以下、更优选1/20以下。例如，WO2012/029770、WO2010/008054中详细叙述的仙台病毒的TS 7(L蛋白的Y942H/L1361C/L1558I突变)、TS 12(P蛋白的D433A/R434A/K437A突变)、TS 13(P蛋白的D433A/R434A/K437A突变及L蛋白的L1558I突变)、TS 14(P蛋白的D433A/R434A/K437A突变及L蛋白的L1361C)、TS 15(P蛋白的D433A/R434A/K437A突变及L蛋白的L1361C/L1558I)等的突变为优选的温度敏感性突变。
作为载体的具体示例，例如，可以为M蛋白上具有G69E、T116A及A183S的突变，HN蛋白上具有A262T、G264R及K461G突变，P蛋白上具有L511F突变，而且L蛋白上具有N1197S及K1795E突变的F基因缺失型仙台病毒载体(例如Z strain)，更优选向该载体进一步导入TS7、TS 12、TS 13、TS 14或TS 15突变的载体。具体而言，可以举出下述载体等：对SeV18+/TSΔF(WO2010/008054、WO2003/025570)或SeV(PM)/TSΔF及向其中进一步导入TS 7、TS 12、TS 13、TS 14或TS 15突变的载体进行修饰而得到的载体，并使得微RNA目标序列添加至NP基因、P基因或L基因中，但不限定于这些。
需要说明的是，“TSΔF”是指在M蛋白上具有G69E、T116A及A183S的突变，在HN蛋白质上具有A262T、G264R及K461G的突变，在P蛋白上具有L511F突变，而且，在L蛋白上具有N1197S及K1795E突变且使F基因缺损。
优选本发明的载体为来自仙台病毒Z株的仙台病毒载体。Z株的基因组序列是已知的，例如，作为来自Z株的F基因缺失型仙台病毒载体的基因组序列，可以举出ACCESSION：AB855655。在此，来自Z株是指在位于载体基因组中的仙台病毒基因组的序列中，Z株的序列占有的比例最高。即，当在载体的基因组序列中，除去非仙台病毒性的序列(限制酶识别部位及简单的间隔序列、来自其它种类病毒的序列、所导入的基因的序列等)，仅仙台病毒的序列聚集的情况下，其中，SeV Z株的序列的占有最高比例。更优选来自Z株是指，在来自位于载体的基因组中的负链RNA病毒的序列中，SeV Z株的序列占有的比例最高。即，当在载体的基因组序列中，除不是从负链RNA病毒获取的序列的序列(限制酶识别部位及简单的间隔序列、来自负链RNA病毒以外的病毒的序列、所导入的基因的序列等)以外，仅负链RNA病毒的序列聚集的情况下，其中，SeV Z株的序列占有的比例最高。该比例为优选30％以上、更优选40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上。另外，就来自Z株的仙台病毒载体而言，优选基因组中仅包含：连续的不是Z株的仙台病毒的基因组序列(除去与Z株相同的序列)，例如为1000个碱基以下、500个碱基以下、300个碱基以下、200个碱基以下、100个碱基以下、50个碱基以下、30个碱基以下或20碱基以下。更优选来自Z株的仙台病毒载体的基因组中不包含不是Z株的仙台病毒的基因组序列(除去与Z株相同的序列)。
另外，优选本发明的载体不是来自仙台病毒Cl.151株(Yoshida,et al.(1979)Virology,92,139-154)，另外，优选也不是与Cl.151株的嵌合载体。Cl.151株的全长基因cDNA是已知的(Accession AB275416)。另外，优选本发明的载体不是来自仙台病毒Nagoya株，另外，优选也不是与Nagoya株的嵌合载体。
本发明的载体进行了修饰，并使微RNA的目标序列添加至NP基因、P基因和/或L基因中。在此，进行修饰并使微RNA的目标序列添加至基因的是指，以该基因的转录区中包含微RNA的目标序列的方式进行修饰。这样的修饰可以通过例如向该基因的转录区中插入微RNA的目标序列来实施。
在本发明中，添加的微RNA目标序列没有特别限制，可以添加与所需微RNA相对应的目标序列。作为这样的微RNA目标序列，例如，可以举出：与在特定的分化状态或未分化状态的细胞(多能干细胞等)中特异性进行表达的微RNA或在癌症及所需疾患中特异性进行表达的微RNA相对应的目标序列。具体而言，例如，可以举出：let7、miR-7、miR-21、miR-106a/b、miR-122、miR-124、miR-125、miR-126、miR-138、miR-130a/b、miR-132、miR-143、miR-145、miR-155、miR-182、miR-199a、miR-217、miR-218、miR-301、miR-302簇、miR-367、miR-372、miR-375、及miR-721各目标序列，但不限定于此。在此，miR-302簇中包含miR302a、miR302b、miR302c及miR302d。与这些微RNA相对应的目标序列是已知的(Mol Cell Biol.2008,28,6426-6438.)。如实施例所示，已经证实在调查的全部微RNA的目标序列中均发挥本发明的效果，可以使用所需的微RNA的目标序列进行载体表达调控。例如，也可以优选使用除miR-302a以外的微RNA的目标序列。
例如，miR-126在血管内皮细胞中进行表达(PNAS.2008,105,1516-1521)。因此，可以通过使用miR-126的目标序列来构建能够具有血管内皮细胞特异性地调控表达的载体。另外，miR-124、miR-138、miR-218在神经细胞中进行表达(Nature Cell Biol.2009,11,705-716.)，miR的表达根据细胞的分化程度而不同(Mol Cell Biol.2009,29,5290-5305)。因此，可以通过使用miR-124、miR-138、miR-218目标序列来构建可以根据细胞的分化阶段对神经细胞特异性地进行表达调控的载体。另外miR-122在肝细胞中进行了表达(Science2005,309,1577-1581.)。因此，可以通过使用miR-122目标序列来构建可以对肝细胞特异性地进行表达调控的载体。另外，在ES/iPS细胞中，除miR-302簇以外，还表达miR-367等各种微RNA(PLoS One.2013,8,e73532.)。因此，除miR-302簇以外，可以通过使用相对于miR-367等的目标序列来构建可以对ES/iPS细胞胞特异地进表达调控的载体。另外，miR-143在正常细胞中进行了表达，在癌细胞中表达降低(Oncol Rep.2006,16,845-850)。因此，可以通过使用miR-143的目标序列对癌细胞选择性进行表达的载体。
微RNA目标序列是指微RNA作为目标所结合的序列。在本发明中，作为微RNA目标序列，只要通过微RNA的结合抑制表达即可，可以使用天然的微RNA目标序列及其突变体。另外，微RNA目标序列可以不是与微RNA完全互补的序列，例如，相对于微RNA，连续或非连续地包含至少10个碱基的互补碱基，例如11个碱基以上、12个碱基以上、13个碱基以上、14个碱基以上、15个碱基以上、16个碱基以上、17个碱基以上、18个碱基以上、19个碱基以上、20个碱基以上、21个碱基以上、22个碱基以上。优选该互补碱基是连续的，或者具有数个不配对的碱基，例如5个碱基以下、4个碱基以下、3个碱基以下、2个碱基以下或1个碱基。不配对的碱基可以包含在微RNA目标序列侧和/或微RNA侧。
微RNA目标序列优选为在生理条件下与微RNA杂交的序列。生理条件下是指例如150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、pH 7.0、37℃。更优选微RNA目标序列为在严谨的条件下与微RNA进行杂交的序列。严谨的条件是指例如1×SSC(1×SSC为150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、pH7.0)或0.5×SSC、42℃的条件，更优选为1×SSC或0.5×SSC、45℃的条件，更优选为1×SSC或0.5×SSC、50℃的条件。进行杂交时，例如对包含微RNA序列的RNA或包含微RNA目标序列的RNA中任意一者进行标记，并根据需要将另一个固定在膜等之上使两者杂交。作为杂交的条件，例如5×SSC、7％(W/V)SDS、包含100μg/ml变性鲑鱼精子DNA、5×(1×邓哈特溶液包含0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白及0.2％聚蔗糖)的溶液中，例如在37℃或45℃或50℃下进行即可。以充分时间(例如，3、4、5或6小时以上)进行培育之后，在上述条件下清洗，并检测所标记的核酸是否进行了杂交，由此可以确定在该条件下是否核酸。
或者，微RNA目标序列优选与微RNA序列的互补序列显示较高的同源性。较高的同源性是指具有例如70％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上同源性的碱基序列。碱基序列的同源性可以使用例如BLAST程序(Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.215:403-410,1990)确定。例如，可以在NCBI(National Center forBiothchnology Information)的BLAST的网页上，使用默认参数进行检索(AltschulS.F.et al.,Nature Genet.3:266-272,1993；Madden,T.L.et al.,Meth.Enzymol.266:131-141,1996；Altschul S.F.et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；ZhangJ.&Madden T.L.,Genome Res.7:649-656,1997)。例如，可以通过用于进行两个序列的比较的blast2sequences程序(Tatiana A et al.,FEMS Microbiol Lett.174:247-250,1999)，制备两个序列的比对，并确定序列的同源性。忽视微RNA序列的互补序列的碱基序列的外侧的间隙，内侧的间隙与例如进行与错配时相同地处理，计算相对于比对中的微RNA序列的互补序列的全部碱基序列(加上放入序列的内侧的间隙的碱基总长)的同源性的值。
或者，微RNA目标序列优选包含向微RNA序列的互补序列插入、取代和/或删除的一个或数个碱基而得到的序列。优选微RNA目标序列包含：向微RNA序列的互补序列插入、取代和/或删除8个碱基以内、7个碱基以内、6个碱基以内、5个碱基以内、4个碱基以内、3个碱基以内、2个碱基以内或1个碱基的序列。
一般而言，越向微RNA目标序列导入突变，越会抑制与微RNA的结合，表达抑制效果降低(图13、14)。可以通过适当导入突变来调控抑制效果。
在向NP、P或L基因添加RNA目标序列的情况下，添加位置没有特别限制，可以在各基因的翻译区或非翻译区中添加。在向翻译区添加的情况下，位置没有限制，向从N端位点起至C端位点中的任意一个位置添加即可，优选邻接例如在C端添加。作为非翻译区，可以为5’非翻译区，也可以为3’非翻译区，优选3’非翻译区。在向非翻译区添加的情况下，其位置任意选择即可，在向例如NP基因和/或P基因的3’非翻译区添加RNA目标序列的情况下，只要在所添加的基因的翻译区和E(End)序列之间即可，可以为任意位置。在向5’非翻译区添加的情况下，可以向例如所添加的基因的S(Start)序列和翻译开始位点之间的所需位置添加。
另外，在向L基因添加RNA目标序列的情况下，可以通过向尽可能远离翻译区的位置添加，即，向E序列相邻且基因组的Trailer序列的附近添加RNA目标序列，进一步提高载体的表达。例如，向距离翻译区1个碱基以上、优选10个碱基以上、20个碱基以上、30个碱基以上、40个碱基以上、50个碱基以上、或56个碱基以上的位置添加RNA目标序列。
微RNA目标序列可以添加1个拷贝或多个拷贝。另外，不仅一种微RNA目标序列，也可以添加多种微RNA目标序列。作为一个例子，例如，可以添加2个以上一种或多种微RNA目标序列随机排列而成的序列，例如3个以上、4个以上、5个以上。
在对P基因进行修饰的情况下，当按照P蛋白的编码区中的核酸编码的C蛋白的表达发生障碍时，从载体对C蛋白另行进行表达即可。
需要说明的是，P蛋白即使不是全长，也可以适当使用片段。作为P蛋白，所必须的仅为C端的一部分，其它区域不是病毒载体的表达所必须的。具体而言，P蛋白可以为保持L蛋白的结合位点和N蛋白：RNA结合的位点的片段。作为L蛋白的结合位点，例如，可以举出：SeV P蛋白的第411位～第445位氨基酸序列，作为N蛋白：RNA结合位点，例如，可以举出：SeVP蛋白(例如accession编号AAB06197.1,P04859.1,P14252.1,AAB06291.1,AAX07439.1,BAM62828.1,BAM62834.1,P04860.1,BAM62840.1,BAD74220.1,P14251.1,BAM62844.1,BAM62842.1,BAM62842.1,BAF73480.1,BAD74226.1,BAF73486.1,Q9DUE2.1,BAC79134.1,NP_056873.1,ABB00297.1等)第479个～第568个氨基酸序列。更具体而言，例如，在本发明中，包含SeV P蛋白的第320个～第568个氨基酸序列的片段可以优选用作功能性P蛋白。通过使用缺失型的P蛋白，有望使载体的大小小型化，同时不易受到宿主免疫反应的影响。
在使用是C蛋白的编码区缺失的P蛋白的情况下，如上所述，可以另行适当表达C蛋白。在此，C蛋白包含C’、C、Y1及Y2蛋白(Irie T.et al.,PLoS One.(2010)5:e10719.)。为了表达C蛋白，向载体中适当插入C蛋白的编码序列即可。插入位置没有特别限制，可以插入紧邻P蛋白的前方(基因组中的P蛋白的编码序列的3’侧)或者紧邻P蛋白的后方(基因组中的P蛋白的编码序列的5’侧)。插入时，可以适当添加E-I-S序列。
在向NP基因或P基因中添加微RNA目标序列的情况下，若在导入载体的细胞中该微RN进行表达，则载体的表达与之相应地降低，促进载体的除去。例如，将进行载体导入时未表达但当进入某分化状态(或未分化状态)时进行特异性表达的微RNA的目标序列预先添加至载体，由此，当实现目的时，主动抑制该载体的表达并将其除去。另外，通过在温度敏感性载体中应用本发明，可以更快速地除去载体。例如，本发明的载体优选按照P基因编码温度敏感性P蛋白。具体而言，优选包含P蛋白上的L511F突变的载体或者具有D433A/R434A/K437A突变的载体等(WO2012/029770、WO2010/008054)。可以包含全部L511F突变及D433A/R434A/K437A突变，也可以进一步包含在P蛋白或其病毒蛋白上的其它突变。例如，可以优选使用如下L基因，该L基因编码具有L1361C/L1558I突变作为温度敏感性突变的L蛋白。
从开始除去至除去完成的培养期间适当确定即可，若使用本发明的载体，则载体在例如4周以内、3周以内、2周以内、或1周以内、例如20天以内、15天以内、10天以内、5天以内或3天以内被除去。该培养时间为例如3天～3周或5天～20天、5天～2周。通过检测报告基因或使用抗体或PCR检测病毒，确定病毒水平降低至与病毒非导入细胞相同的水平(或与导入病毒之后的最大值相比，为1/100以下、优选1/500以下、1/1000以下或1/5000以下)，由此，可以确认病毒被除去。
在使用温度敏感性的载体(编码包含温度敏感性突变的蛋白的载体)的情况下，促进载体的除去可以在例如35℃～39℃下进行。优选在36℃～38.5℃、更优选在约37℃下进行。
需要说明的是，在向NP基因和/或P基因添加微RNA目标序列而得到的载体中，优选不向L基因添加微RNA目标序列。即本发明提供修饰仙台病毒载体，在该载体中，该病毒的NP基因和/或P基因以添加微RNA的目标序列的方式进行了修饰，该病毒的L基因上未添加任何微RNA的目标序列，对添加于NP基因和/或P基因的微RNA进行表达的细胞中，该载体的表达被负调控。该载体优选为F基因缺损的载体。该载体优选来自Z株的载体。
另外，本发明的载体优选不具有除Z株的F、M及HN基因以外的功能性F、M及HN基因。即，在该载体未缺损F基因并具有功能性F基因的情况下，该F基因优选为Z株的F基因，在该载体未缺损M基因并具有功能性M基因的情况下，该M基因优选为Z株的F基因，在该载体未缺损HN基因并具有功能性HN基因的情况下，该HN基因优选为Z株的HN基因。另外，作为本发明的载体，优选基因组的Leader序列和/或Trailer序列均为Z株的序列。
在向L基因添加微RNA目标序列的情况下，若在导入载体的细胞中该微RNA进行表达，则与此对应载体的表达也升高，载体的基因组复制也亢进。这样的载体可以用于在对特定微RNA进行表达的细胞中载体进行特异性表达和/或扩大。例如，作为向L基因添加与在肿瘤中特异性表达的微RNA相对的目标序列而得到的载体，肿瘤细胞中的特异性表达亢进。因此，通过向这样的载体上搭载细胞毒性的导入基因或者使载体自身具备细胞毒性效果，有望特异性破坏肿瘤。
例如，已知使M基因缺失的仙台病毒向导入细胞的周围的细胞侵袭，从而使细胞溶解(WO00/09700)。而实际上也证实了，通过将这样的载体注入肿瘤，肿瘤细胞溶解，肿瘤尺寸缩小(WO2003/093476)。通过在这样的载体中应用本发明，并特异性提高肿瘤细胞内的载体的表达，可以防止对周围非癌组织的伤害，同时肿瘤特异性地对细胞进行攻击。即，进行修饰，使M基因缺损且向L基因添加RNA目标序列，并通过细胞所具有的微RNA正调控该载体的表达的载体可以用于特异性溶解对该微RNA进行表达的细胞。
这样的载体具有F基因及HN基因，由此可以向周围细胞侵袭。即，本发明涉及以缺损M基因且向L基因添加微RNA目标序列的方式进行了修饰后的负链RNA病毒载体，该载体具有F基因及HN基因。这样的载体不具备形成感染性病毒颗粒的能力，但具有侵袭与导入了载体的细胞相邻的细胞的能力(接触侵袭力)。就F蛋白而言，F蛋白的裂解位点可以适当地被作为其它蛋白酶的底物的序列取代(WO2003/093476)，使通过在目标细胞中特异性表达的蛋白酶活性化。
另外，若向副粘病毒载体添加在正常细胞中进行表达但在癌细胞中不表达或表达降低的微RNA的目标序列，则可以制作在癌细胞中特异性表达但在正常细胞表达被抑制或载体消失的副粘病毒载体。例如，将在正常细胞中表达但在癌细胞中不表达或表达降低的微RNA的目标序列添加至NP基因或P基因而得到的本发明的载体，其可以用作癌症靶向载体。本发明提供本发明的载体用于癌症靶向的用途，本发明的载体是通过将在正常细胞中表达但在癌细胞中不表达或表达降低的微RNA的目标序列添加至NP基因或P基因而得到的。另外，本发明提供癌症的靶向方法，其特征在于，使用本发明的载体，其中本发明的载体通过将在正常细胞中表达但在癌细胞中不表达或表达降低的微RNA的目标序列添加至NP基因或P基因而得到的。例如，若向该载体搭载自杀基因及显示细胞毒性的基因，可以杀灭癌症细胞。作为自杀基因，没有特别限制，可以使用例如来自疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-tk)，在该情况下，可以通过给药更昔洛韦(GCV)来杀灭表达HSV-tk的细胞。本发明提供本发明的载体用于癌症治疗的用途，本发明的载体的NP基因或P基因中添加有在正常细胞中表达但在癌症细胞中不表达或表达降低的微RNA的目标序列，且本发明的载体搭载自杀基因和/或显示细胞毒性的基因。另外，本发明提供癌症的治疗方法，其特征在于，该方法使用本发明的载体，其中本发明的载体将在正常细胞中表达但在癌细胞中不表达或表达降低的微RNA的目标序列添加至NP基因或P基因而得到的，且本发明的载体搭载自杀基因和/或显示细胞毒性的基因。
例如，作为搭载于本发明的载体的自杀基因，包含诱导细胞死亡或显示细胞毒性的所需药剂的前药的转化酶基因。作为前药和自杀基因的组合的例子，具体而言，可以举出：
■5-氟胞嘧啶和胞嘧啶脱氨酶
■环磷酰胺和细胞色素P450
■氟达拉滨和大肠杆菌PNP(嘌呤核苷磷酸化酶)
■CB1954和硝基还原酶
■卡培他滨和羧酸酯酶
另外，作为自杀基因，可以举出对所需蛋白进行编码的基因，其中，该蛋白质通过从非活性型向活性型转换而诱导细胞死亡及显示细胞毒性，例如，可以优选使用对诱导细胞死亡的半胱天冬酶进行编码的基因。具体而言，可以利用所需二聚化剂和添加有其的结合结构域的半胱天冬酶的组合，作为二聚化剂和半胱天冬酶的组合的一个例子，可以举出：
■AP20187和iCaspase-9。
另外，上述M基因缺损的载体不具备颗粒形成能力，但具备通过F基因的作用使周围的细胞融合的能力。通过向该载体添加在正常细胞中表达但在癌症细胞中不表达或表达降低的微RNA的目标序列，可以获得使癌症细胞融合，同时扩大感染，而在正常细胞中感染不会扩散的副粘病毒载体。即，本发明提供本发明的载体用于癌症靶向的用途，本发明的载体的NP基因或P基因中添加有在正常细胞中表达但在癌症细胞中不表达或表达降低的微RNA的目标序列，为缺损M基因的载体。另外，本发明提供癌症的靶向方法，其特征在于，该方法使用本发明的载体，本发明的载体的NP基因或P基因中添加有在正常细胞中表达但在癌症细胞中不表达或表达降低的微RNA的目标序列。另外,本发明提供本发明的载体用于癌症治疗的用途，本发明的载体的NP基因或P基因中添加有在正常细胞中表达但在癌症细胞中不表达或表达降低的微RNA的目标序列，且，本发明的载体缺损M基因。另外，本发明提供癌症的治疗方法，其特征在于，该方法使用本发明的载体，本发明的载体的NP基因或P基因中添加有正常细胞中表达但在在癌症细胞中不表达或表达降低的微RNA的目标序列，且本发明的载体缺损M基因。
一般而言，副粘病毒的F蛋白质以前体蛋白质(F0)的形式进行表达，通过利用蛋白酶裂解为F1和F2而发挥融合能力。通过将该蛋白酶裂解位点修饰为通过在癌症细胞中特异性表达的蛋白酶裂解的氨基酸序列上，可以在癌症细胞中特异性发挥细胞融合活性(WO03/093476)。通过在F蛋白质的裂解位点进行如上所述的修饰而得到的M基因缺损型副粘病毒载体中使用本发明，可以提供在正常细胞中快速消失的副粘病毒载体。即，作为上述缺损M基因的载体，可以优选使用搭载F基因的载体，在该载体中，F蛋白质的裂解位点被修饰为在癌症细胞中特异性表达的蛋白酶裂解的氨基酸序列(参见实施例17)。另外，如上所述，通过在该载体上搭载自杀基因和/或显示细胞毒性的基因，可以进一步提高抗症效果。
另外，本发明提供搭载多个P基因的副粘病毒载体。在通过降低P基因的表达、P蛋白质的活性或稳定性等来调控载体表达及调控载体消失的情况下，P基因的初始表达量可能过低，或P基因的表达时间过短。本发明发现可以通过向载体搭载多个P基因并抑制各P基因来解决该问题。
通过搭载多个P基因，可以在刚刚导入载体之后提高P基因的表达，从而可以提高搭载基因的表达量。另外，通过进行抑制载体所搭载的各个P基因的表达的调控，抑制P基因的表达，抑制来自载体的搭载基因的表达，促进载体的消失。多个P基因可以同样地进行表达抑制，也可以进行不同的表达抑制。例如，在向载体搭载两个P基因的情况下，一个P基因对具有温度敏感性突变的P蛋白质编码，另一个P基因对非温度敏感性P蛋白质进行编码，可以向对非温度敏感性P蛋白质编码的P基因添加RNA目标序列。在该情况下，基于微RNA受到表达抑制，代替由一个P基因表达的P蛋白质仅可以在低温下发挥功能，从另一个P基因表达的P蛋白质即使不在低温下也可以发挥功能。由此，与仅搭载一个P基因的情况相比，可以进行更为复杂且灵活的表达调控。
另外，也可以由一个P基因编码添加有降解决定子(degron)的P蛋白质，另一个P基因也添加微RNA目标序列。在该情况下，从一个P基因表达的P蛋白质受到降解决定子(degron)的抑制，另一个P基因的表达因微RNA而受到抑制。添加降解决定子(degron)的P蛋白质可以采用温度敏感性P蛋白质，添加微RNA目标序列的P基因可以采用非温度敏感性P蛋白质。需要说明的是，向P基因添加降解决定子(degron)是指该P基因编码添加降解决定子(degron)的P蛋白质。
在细胞分化及重编程的诱导时，若使用在诱导后的细胞中进行表达的微RNA的目标序列构建上述载体，则由于在重编程被诱导后的细胞中进行表达的微RNA，一个P基因(添加有微RNA的目标序列的P基因)的表达消失，然后另一个P基因(使温度敏感性P蛋白质及添加有降解决定子(degron)的P蛋白质表达的P基因)进行表达的P蛋白质的活性由于温度或降解决定子(degron)的作用而被抑制，载体消失。通过这样的双重调控，可以更自由地调控初始表达水平及表达时间。
优选所搭载的P基因进行了修饰，并使得与野生型相比表达可以得到抑制，优选具有例如选自温度敏感性突变、降解决定子(degron)的添加、微RNA的目标序列的添加等的修饰。它们可以任意组合。优选所搭载的多个P基因以彼此完全不相同的方式进行修饰，作为优选例，可以举出：搭载添加有降解决定子(degron)的P基因、添加有微RNA的目标序列的P基因的载体及搭载对温度敏感性突变P蛋白质编码的P基因和添加有微RNA的目标序列的P基因的载体等。
例如，通过向副粘病毒载体搭载多个P基因，可以获得具有如下优异性质的副粘病毒载体，即，即使不对导入载体后的细胞进行低温培养，也能够以充分的水平表达搭载基因，且通过该搭载基因的表达对细胞发挥规定效果之后，载体从细胞快速除去。例如，在iPS细胞的诱导时，目前为了快速除去载体，一直使用温度敏感性比较高的副粘病毒载体(特别是搭载具有温度敏感性突变的P基因的副粘病毒载体)。在该情况下，若在通常培养温度(例如37℃)下培养，载体将被快速除去，因此为了在细胞内表达搭载基因，需要在将载体导入细胞之后，在低温(例如约35℃)下培养一定时间。
通过向副粘病毒载体搭载多个P基因，可以克服该问题。在本发明的一种方式中，作为搭载多个P基因的副粘病毒载体，所搭载的P基因中的至少一个为非温度敏感性P基因。例如，作为搭载两个P基因的副粘病毒载体，两个P基因可以均为非温度敏感性或者一个P基因为温度敏感性，另一个P基因为非温度敏感性。如上所述，可以向非温度敏感性的P基因中的至少一个添加微RNA的目标序列。另一个P基因可以采用温度敏感性和/或添加有降解决定子(degron)的基因。
所搭载的基因没有特别限制，只要为用于诱导iPS细胞的载体即可，可以适当搭载一个或多个所需的重编程基因。作为优选搭载基因的示例，可以举出：例如KOS(同时搭载KLF4、SOX2、OCT4)或者MYC基因。为搭载有两个或两个以上P基因的副粘病毒载体，搭载KOS或者MYC基因的载体可以用于有效诱导iPS细胞。该载体搭载有至少一个非温度敏感性P基因，可以向该非温度敏感性P基因添加微RNA的目标序列。另外，除该非温度敏感性P基因以外，也可以搭载编码添加有降解决定子(degron)的P蛋白的P基因。需要说明的是，重编程基因可以为导入突变的基因。例如KLF4、SOX2及OCT4不仅包含野生型，只要可以诱导重编程即可，也可以包含突变型。另外，MYC中包含cMYC及L-MYC以及它们的突变体。
需要说明的是，在本发明中，降解决定子(degron)是指通过添加在蛋白中使该蛋白不稳定的多肽，是本领域技术人员所熟知的。作为降解决定子(degron)，可以举出：通过与低分子结合而稳定化的序列、通过与低分子结合而不稳定化的序列、无论有无低分子均不稳定化的序列。具体而言，可以举出：来自作为mTOR蛋白已知的来自FKBP12的DD-tag(US2009/0215169)、来自二氢叶酸还原酶(DHFR)的DDG-tag(US2012/0178168)、TetR突变体(WO2007/032555)、来自植物的auxin-inducible降解决定子(degron)(AID)系统(WO2010/125620)、作为分解促进序列而被熟知的PEST序列(WO99/54348)、CL1(WO2004/025264)、来自钙蛋白酶的序列(日本特开2009-136154)、NDS(日本特开2011-101639)等。FKBP12作为mammalian target of rapamycin(mTOR)而被熟知，通过与rapamycin及shield1等低分子结合而稳定，通过除去而不稳定，被蛋白酶体分解。DHFR通过trimethoprim稳定，TetR突变体通过doxycycline稳定。PEST序列为富含Pro、Glu、Ser、Thr的序列，可以通过向例如mouseornithine decarboxylase(mODC)的C端侧添加422-461而不稳定。虽然PEST序列调控蛋白的半衰期，但也可以使用所需的半衰期缩短序列(Rechsteiner M,et al.,TrendsBiochem.Sci.21,267-271,1996)。PEST序列例如为两端被碱性氨基酸(H、K或R)包围，包含(i)P、(ii)D及E或(iii)S及E且与泛素化酶E3结合的序列，例如可以通过GENETYX(Genetics公司)鉴定。作为可以取得与PEST相同的效果的序列，可以举出：CL1、钙蛋白酶部分序列、NDS等。AID序列通过作为植物的泛素连接酶的TIR1和生长素(IAA)结合而不稳定。
在本发明中，可以将这些降解决定子(degron)添加至P蛋白，作为优选的降解决定子(degron)，具体而言，可以举出：mTOR降解决定子(mTORdegron)、DHFR降解决定子(DHFRdegron)、TetR降解决定子(TetR degron)、PEST及AID。需要说明的是，这些降解决定子(degron)包含天然序列及来自天然序列的物质。作为特别优选的降解决定子(degron)，可以举出：mTOR降解决定子(mTOR degron)、DHFR降解决定子(DHFR degron)、TetR降解决定子(TetR degron)及PEST，其中，优选除AID序列以外的降解决定子(degron)，具体而言，优选FKBP12降解决定子(FKBP12degron)(DD)、DHFR降解决定子(DHFR degron)(DDG)、TetR降解决定子(TetR degron)及mODC PEST。作为PEST，已知有来自天然序列的d2及其修饰体d1或d4等(WO99/54348)，它们均包含在PEST中，可以用于本发明(参见实施例)。
下面将具体示例优选的降解决定子(degron)序列的例子。
mODC PEST序列(WO99/54348)
d2tag：mODC422-461：ACCESSION：P00860的C端侧422-461(SEQ ID NO：58)(DNA:SEQ ID NO：57)
d4tag：mODC422-461(T436A)(SEQ ID NO：59)
d1tag：mODC422-461(E428A/E430A/E431A)(SEQ ID NO：60)
另外，也可以为WO99/54348中记载的其它突变体。具体而言，作为优选的PEST序列，可以示例：包含相对于WO99/54348中记载的MODC376-461、MODC376-456及MODC422-461(SEQ IDNO：58)、以及MODC422-461的突变序列P426A/P427A、P438A、E428A/E430A/E431A、E444A、S440A、S445A、T436A、D433A/D434A、D448A及它们的组合的突变的序列等。另外，可以使用多肽，该多肽包含在这些氨基酸序列中取代、缺损和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，且具有使蛋白不稳定的活性。特别优选的序列为MODC422-461(SEQ ID NO：58)及其突变体mODC422-461(T436A)(SEQ ID NO：59)。另外，在本发明中，也可以优选使用P438A及S440A等。
DD-tag的序列(US2012/0178168)
DD-tag：FKBP(L106P)：ACCESSION：NP_000792的突变体(F37V/L107P)(SEQ ID NO：62)(DNA:SEQ ID NO：61)
另外，也可以为US2012/0178168中记载的其它突变体。需要说明的是，在US2012/0178168中，不计数N端侧的Met而记作L106P，该突变与NP_000792的L107P的位置相同。
具体而言，例如，可以举出：ACCESSION：NP_000792的2-108(FKBP2-108)(SEQ ID NO：63)及其突变体，作为突变体，可以举出：包含F36V、F15S、V24A、H25R、E60G、L106P、D100G、M66T、R71G、D100N、E102G、K105I(均表示不计数N端侧的Met而将第二个氨基酸作为1的位置)及这些的组合的突变的突变体。另外，可以使用多肽，该多肽包含在这些氨基酸序列中取代、缺损和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，且具有使蛋白不稳定的活性。
DDG-tag的序列(US2012/0178168)
DDG-tag：DHFR(H12L/Y100I)：ACCESSION：B7MAH1[UniParc](SEQ ID NO：65)(DNA:SEQ ID NO：64)的突变体(R12L/G67S/Y100I)(SEQ ID NO：66)
另外，也可以为US2012/0178168中记载的其它突变体。具体而言，例如，可以举出：DFHR蛋白的氨基酸序列(ACCESSION：B7MAH1，SEQ ID NO：64)及其突变体，作为突变体，可以举出：包含N18T/A19V、F103L、Y100I、G121V、H12Y/Y100I、H12L/Y100I、R98H/F103S、M42T/H114R、I61F/T68S及它们组合突变的突变体。另外，可以使用多肽，该多肽包含在这些氨基酸序列中取代、缺损和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，且具有使蛋白不稳定的活性。需要说明的是，可以不具有第一个氨基酸的Met。
TetR-tag的序列(WO2007/032555)
TetR-tag：TetR(R28Q/D95N/L101S/G102D)：ACCESSION：NP_941292(SEQ ID NO：68)(DNA:SEQ ID NO：67)的突变体(R28Q/D95N/L101S/G102D)(SEQ ID NO：69)
另外，可以为WO2007/032555中记载的其它突变体。具体而言，例如，可以举出：TetR蛋白的氨基酸序列(ACCESSION：NP_941292，SEQ ID NO：68)及其突变体，作为突变体，可以举出：包含D95N、L101S、G102D及它们的组合的突变的突变体。可以进一步包含R28Q的突变。另外，可以使用多肽，该多肽包含在这些氨基酸序列中取代、缺损和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列，其而具有使蛋白不稳定的活性。需要说明的是，可以不具有第一个氨基酸的Met。
编码降解决定子(degron)的核酸可以通过DNA合成适当制备。另外，天然的降解决定子(degron)序列可以通过将上述所示的编码降解决定子(degron)序列的DNA(例如SEQID NO：57、61、64或67等)或其的互补序列作为探针，在严谨的条件下进行杂交法而分离。严谨的杂交条件可以由本领域技术人员适当选择。例如，可以在本说明书中记载的清洗液及温度条件下实施。利用这样的杂交技术单离的多聚核苷酸及其编码的多肽通常与作为探针的多聚核苷酸及其编码的多肽的碱基序列及氨基酸序列分别具有较高的同源性。较高的同源性是指至少70％以上、进一步优选80％以上、进一步优选90％以上、进一步优选至少95％以上、进一步优选至少97％以上(例如，98％以上或99％以上)的序列的同源性。序列的同源性可以通过例如Karlin and Altschul开发的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877,1993)来确定。在通过基于该算法开发的BLAST(Altschul et al.J.Mol.Biol.215:403-410,1990)解析序列的情况下，使用各程序的默认参数。这些解析方法的具体方式是公知的(www.ncbi.nlm.nih.gov.)。在修饰氨基酸序列的情况下，所修饰的氨基酸优选为1～多个氨基酸，更优选为1～10、1～8、1～5、1～4、1～3或1～2。
降解决定子(degron)可以适当添加在P蛋白的所需位置，例如，可以添加在P蛋白的N末端或C末端。在添加在P蛋白的N末端，且被P蛋白质对编码区中的核酸编码的C蛋白质的表达进行阻碍的情况下，从载体另行使C蛋白质表达即可。在P蛋白质使用片段而不使用全长P蛋白，且该断片为不包含C蛋白的编码区的片段的情况下，在N末端或C末端，均可以在任意位置添加添加降解决定子(degron)。在本发明中，降解决定子(degron)优选被添加在P蛋白质的C末端侧。添加有降解决定子(degron)的修饰P蛋白可以通过公知的方法制备。具体而言，向编码P蛋白的病毒基因组的序列中以阅读框一致的方式插入编码降解决定子(degron)的序列即可。
需要说明的是，如上所述，P蛋白质即使不是全长，也可以适当使用片段。作为P蛋白质，必须部分仅为C端的一部分，其它区域不是病毒载体表达必须的。具体而言，P蛋白质可以为保持L蛋白的结合位点和N蛋白：与RNA结合的位点的片段。作为L蛋白的结合位点，例如，可以举出：SeV P蛋白质的第411个～第445个氨基酸序列，作为N蛋白质：RNA结合位点，例如，可以举出：SeV P蛋白质(例如accession编号AAB06197.1,P04859.1,P14252.1,AAB06291.1，AAX07439.1，BAM62828.1，BAM62834.1，P04860.1BAM62840.1,BAD74220.1,P14251.1,BAM62844.1,BAM62842.1,BAM62842.1,BAF73480.1,BAD74226.1,BAF73486.1,Q9DUE2.1,BAC79134.1,NP_056873.1,ABB00297.1等)的第479位～第568位的氨基酸序列。更具体而言，在本发明中，包含例如SeV P蛋白质的第320位～第568位的氨基酸序列的片段可以优选用作功能性P蛋白质。通过使用缺失型P蛋白质，有望减小载体的大小，同时不易受到宿主的免疫反应的影响。
在使用C蛋白质的编码区缺失的P蛋白的情况下，如上所述，可以另行适当表达C蛋白。在此，C蛋白包含C’、C、Y1及Y2蛋白(Irie T.et al.,PLoSOne.(2010)5:e10719.)。为了表达C蛋白，向载体中适当插入C蛋白的编码序列即可。插入位置没有特别限制，可以插入紧邻P蛋白的前方(基因组中的P蛋白的编码序列的3’侧)或者紧邻P蛋白的后方(基因组中的P蛋白的编码序列的5’侧)。插入时，可以适当添加E-I-S序列。
在本发明中，向P蛋白添加降解决定子(degron)而得到的载体、特别是向温度敏感性P蛋白添加降解决定子(degron)而成的载体具体在P蛋白上具有D433A/R434A/K437A突变(WO2012/029770、WO2010/008054)，降解决定子(degron)为DD-tag、DDG-tag、TetR-tag、mODC的PEST序列或者其分解速度不同的突变体(WO99/54348)。作为温度敏感性突变，更优选L蛋白上具有L1361C/L1558I突变。
在本发明中，低温培养是指在低于36.5℃的温度下培养。优选低温培养是指在低于36.4℃、更优选36.3℃、36.2℃、36.1℃、36℃、35.9℃、35.8℃、35.7℃、35.6℃、35.5℃、35.4℃、35.3℃、35.2℃、35.1℃，更优选低于35℃的温度下培养。下限为例如30℃，优选31℃，更优选32℃、33℃或34℃。另外，在本发明中，约37℃具体是指36.5～37.5℃，优选36.6～37.4℃，更优选36.7℃～37.3℃。
在导入本发明的载体并表达目标基因之后，可以根据降解决定子(degron)的性质来适当除去载体。例如在如DD及DDG、TetR突变体等那样使用配体调控性降解决定子(degron)(ligand controllable降解决定子(degron))的情况下，若不添加配体，则促进除去，但通过添加Shield-1等配体可以延长载体的表达。另外，若为如PEST序列等那样即使无配体也发挥功能的降解决定子(degron)，则可以通过继续培养导入有载体的细胞来促进载体的除去。从开始除去至除去完成的培养时间适当确定即可，若使用本发明的载体，则载体在例如4周以内、3周以内、2周以内或1周以内、例如20天以内、15天以内、10天以内、5天以内或3天以内被除去。该培养时间为例如3天～3周或5天～20天、5天～2周。通过检测报告基因或使用抗体或PCR检测病毒，确定病毒水平降低至与病毒非导入细胞相同的水平(或与导入病毒后的最大值相比，为1/100以下、优选1/500以下、1/1000以下或1/5000以下)，由此，可以确认病毒被除去。
本发明的负链RNA病毒载体使用公知的方法制造即可。作为具体的工序，通常可以通过下述工序制造：(a)将编码负链RNA病毒基因组RNA(负链)或其互补链(正链)的cDNA通过表达形成病毒颗粒所需的病毒蛋白(NP、P及L)的细胞进行转录；(b)回收所生成的病毒。作为病毒，不限定于感染性颗粒，只要通过将其导入细胞而保持表达基因的能力即可，也可以包含非感染性颗粒及RNP等。形成病毒所需的病毒蛋白可以从进行转录的病毒基因组RNA表达，可以由基因组RNA以外的物质提供。例如，可以将编码NP、P及L蛋白的表达质粒导入细胞中来提供。在基因组RNA中形成病毒所需的病毒基因发生了缺损的情况下，也可以在病毒产生细胞中另外使该病毒基因表达，从而辅助病毒形成。为了使病毒蛋白及RNA基因组在细胞内表达，向宿主细胞导入载体，该载体将编码该蛋白及基因组RNA的DNA连结于在宿主细胞中起作用的适当的启动子的下游。被转录的基因组RNA在病毒蛋白的存在下复制并形成病毒子。在制造被膜蛋白等基因缺损的缺损型病毒的情况下，可以在病毒产生细胞中使可以对所缺损的蛋白质或其功能进行相辅助的其它病毒蛋白质等进行表达。在本发明中，优选使用至少F基因缺失的载体或在F基因上具有突变的载体。
通过在NP、P及L蛋白质的存在下使本发明的载体所含的基因组RNA(正股或负股)进行转录，可以制造本发明的RNP。RNP形成可以通过例如，BHK-21或LLC-MK2细胞等进行。就NP、P及L蛋白质的供给而言，可以通过病毒载体提供，也可以通过除外的各种方法提供。例如，如上所述，可以通过将编码各基因的表达载体导入细胞来进行。另外，各基因可以整合至宿主细胞的染色体中。为了形成RNP而进行表达的NP、P及L基因无需与编码至载体的基因组中的NP、P及L基因完全相同。即，这些基因所编码的蛋白质的氨基酸序列即使不是RNP基因组所编码的蛋白质的氨基酸序列的原来序列状态，只要与基因组RNA结合，且在细胞内具有向基因组转录复制的活性即可，可以导入突变或者代替其它病毒的同源基因使用。另外，可以使野生型蛋白质(野生型NP、P和/或L蛋白质)表达。
在被膜蛋白基因缺损的载体的情况下，若在细胞内重建载体时，在细胞内使F、HN和/或M蛋白质等被膜蛋白进行表达，则这些蛋白质被整合至病毒载体中，可以生产保持感染性的病毒载体。这样的载体一旦感染至细胞，即使可以通过细胞内导入的RNP的作用从基因组RNA来表达蛋白质，由于其自身不能表达被膜蛋白，从而不能形成感染性病毒颗粒。并且，通过添加微RNA目标序列，可以依赖该微RNA的表达来对载体的表达进行调控。作为这样的载体，特别是通过搭载转录因子基因，对于细胞修饰非常有用。例如在添加有微RNA目标序列的本发明的载体中搭载编码所需分化因子或去分化因子的基因，可以高效和/或特异性地诱导细胞的分化及去分化。
例如，本发明的负链RNA病毒的制造可以利用以下现有的方法来实施(WO97/16539；WO97/16538；WO00/70055；WO00/70070；WO01/18223；WO03/025570；WO2005/071092；WO2006/137517；WO2007/083644；WO2008/007581；Hasan,M.K.et al.,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997，Kato,
A.et al.,1997,EMBO J.16:578-587及Yu,D.et al.,1997,Genes Cells 2:457-466；Durbin,A.P.et al.,1997,Virology 235:323-332；Whelan,S.P.et al.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8388-8392；Schnell.M.J.et al.,1994,EMBO J.13:4195-4203；Radecke,F.et al.,1995,EMBO J.14:5773-5784；Lawson,N.D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4477-4481；Garcin,D.et al.,1995,EMBO J.14:6087-6094；Kato,A.et al.,1996,Genes Cells 1:569-579；Baron,M.D.and Barrett,T.,1997,J.Virol.71:1265-1271；Bridgen,A.and Elliott,R.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:15400-15404；Tokusumi,T.et al.Virus Res.2002:86；33-38，Li,H.-O.et al.,J.Virol.2000:74；6564-6569)。另外，关于病毒的增殖方法及重组病毒的制造方法，也可以参见病毒学实验学详细论述、修订第二版(国立予防卫生研究所学友会编著、丸善、1982)。
在构建本发明的载体时，在添加有微RNA目标序列的病毒基因的表达降低的情况下，优选使用使该基因另行进行表达的细胞(辅助细胞)来制造。例如在添加有微RNA目标序列的基因为P基因的情况下，可以使用P蛋白表达细胞。另外，在这样的载体为F基因也缺损的载体的情况下，使用P蛋白质和F蛋白质进行表达的细胞(PF表达细胞)来制造即可。
本发明的载体可以搭载所需基因。所搭载的基因没有特别限制，可以搭载所需的外源基因(载体原本不具备的基因)。所搭载的外源基因的数量没有特别限制，可以搭载1个、2个或2个以上。也可以向外源基因中适当添加微RNA目标序列。
在本发明的载体中，外源基因一般可以插入紧邻任意病毒基因(例如NP、P、M、F、HN或L)的前方(基因组的3’侧)或后方(基因组的5’侧)。外源基因可以被适当地被仙台病毒S(Start)序列和E(End)序列夹持。S序列为开始转录的信号序列，转录在E序列处结束。被S序列和E序列夹持的区域形成一个转录单位。某基因当E序列和下一个基因的S序列之间可以适当地插入形成间隔的序列(间插序列；intervening sequence)。
作为S序列，可以使用仙台病毒所需的S序列，例如，可以优选使用3’-UCCCWVUUWC-5’(W＝A或U；V＝A,C,或G)(SEQ ID NO：1)序列。特别优选3’'-UCCCAGUUUC-5’(SEQ ID NO：2)、3’-UCCCACUUAC-5’(SEQ ID NO：3)及3’-UCCCACUUUC-5’(SEQ ID NO：4)。若通过编码正链的DNA序列表示，这些序列分别为5’-AGGGTCAAAG-3'(SEQ ID NO：5)、5'-AGGGTGAATG-3'(SEQ ID NO：6)及5’-AGGGTGAAAG-3'(SEQ ID NO：7)。作为仙台病毒载体的E序列，例如，优选3’-AUUCUUUUU-5’(在编码正链的DNA中为5’-TAAGAAAAA-3’)。I序列可以为例如任意的三个碱基，具体而言，使用3’-GAA-5’(在正链DNA中，使用5’-CTT-3’)即可。
就本发明的载体而言，可以通过搭载编码转录因子等重编程因子的基因，将该载体用于多能干细胞的制备，可以促进此时载体的除去。例如，在WO2012/029770、WO2010/008054中，cMYC搭载于温度敏感性TS15载体上，但也可以通过将其搭载于本发明的载体来代替，从而促进使用KLF4、OCT4、SOX2、cMYC制备多能干细胞时的载体的除去。作为制备多能干细胞时使用的转录因子，可以使用L-MYC、Glis1、Lin28、NANOG等除上述分子以外的物质。搭载于载体的转录因子基因可以进行适当修饰。例如，通过向由野生型cMYC导入选自a378g，t1122c，t1125c，a1191g，及a1194g中的一个以上，优选2以上、3以上、4以上或全部5个突变，能够从载体稳定地表达基因(例如WO2010/008054的SEQ ID NO：45)。
本发明提供本发明的载体用于细胞重编程的用途，更具体而言，提供用于制造诱导多能干细胞的用途，其中本发明的载体的NP基因或P基因上添加有添加有微RNA目标序列，且本发明的载体搭载有KOS或者MYC基因。另外，本发明提供使用本发明的载体来制造诱导多能干细胞的方法，本发明的载体的NP基因或P基因上添加有微RNA目标序列，且本发明的载体搭载KOS或者MYC基因。
该载体为NP基因或P基因上添加有微RNA目标序列的载体即可，优选为P基因上添加有微RNA目标序列的载体，更优选在P基因的3’非翻译区(在基因组上时，为翻译区的5’侧)添加有微RNA目标序列。KOS或者MYC基因的搭载位置没有特别限制，例如，在KOS基因的情况下，优选搭载于M基因的上游(即，基因组上的M基因的3’侧，例如P基因和M基因之间)，在MYC基因的情况下，优选搭载于L基因的上游(即，基因组上的L基因的3’侧，例如HN基因和L基因之间)。另外，该载体优选F基因缺失。在P基因的3’非翻译区添加有微RNA目标序列且搭载KOS或者MYC基因的F基因缺失型副粘病毒载体对于有效诱导重编程非常有用。
另外，优选使用本发明的载体使KLF4表达。例如，本发明的载体在NP基因或P基因上添加有微RNA目标序列，且搭载KLF4基因，其可以用作用于iPS细胞诱导的载体。本发明提供本发明的载体的用于细胞重编程的用途，更具体而言，提供本发明的载体用于制造诱导多能干细胞的用途，本发明的载体的NP基因或P基因添加有微RNA目标序列，且本发明的载体搭载KLF4基因，另外，本发明提供使用本发明的载体制造诱导多能干细胞的方法，其中本发明的载体的NP基因或P基因上添加有微RNA目标序列，且本发明的载体搭载KLF4基因。通过使用本发明的载体，与使用未添加微RNA的目标序列的对照载体的情况相比，可以促进多能干细胞的菌落的形成。在此，促进多能干细胞的菌落的形成可以为促进菌落的形成效率提高和/或菌落的成长，优选为存进菌落成长。例如，通过测量ALP阳性菌落的大小，可以观察菌落的成长是否提前。另外，即使忽视促进菌落形成的效果，通过使用本发明的载体，也可以在诱导iPS细胞之后快速地除去载体。
作为该载体，只要向NP基因或P基因添加微RNA目标序列即可，优选向P基因添加微RNA目标序列，更优选向P基因的3’非翻译区(在基因组上，为翻译区的5’侧)添加微RNA目标序列。KLF4基因的搭载位置没有特别限制，例如，优选搭载于NP基因的下游(即NP基因和P基因之间)或NP基因的上游(即Leader序列和NP基因之间)。另外，该载体优选F基因缺失。F基因缺失型副粘病毒载体对于有效诱导重编程非常有用，该F基因缺失型副粘病毒载体在P基因的3’非翻译区添加有微RNA目标序列，在Leader序列和NP基因之间搭载KLF4基因。
作为微RNA目标序列，可以使用例如在所诱导的多能干细胞中特异性表达的所需微RNA的目标序列，具体而言，可以使用miR-302及miR-367的目标序列，但不限定于这些。另外，目标序列可以使用多个复制或向目标序列中适当地导入突变从而调控抑制作用。
作为对用于诱导多能干细胞的重编程因子进行编码的基因，只要为对于用于诱导重编程起作用的基因即可，没有特别限制，可以举出：在ES细胞中显示特异性表达或高表达的基因；对通过Wnt信号或LIF信号活化的因子进行编码的基因；维持ES细胞的分化多能性所必须的基因及通过由这些的同族基因向体细胞导入而使内源性的Oct3/4基因及Nanog基因表达的以及它们的组合(WO2007/069666；JP5467223)。作为具体的示例，如上所述，可以举出：KLF4、OCT4、SOX2、cMYC、L-MYC、Glis1、Lin28、NANOG等，但不限定于这些。
在本发明中，多能干细胞是指由动物的胚泡期的胚胎的内细胞团制作的干细胞或具有与其类似的表型的细胞。具体而言，在本发明中，所诱导的多能干细胞为表达作为ES样细胞的指標的碱性磷酸酶的细胞。在此，ES样细胞是指具有与ES细胞类似的性质和/或形态的多能干细胞。另外，优选多能干细胞通过培养而形成由核的容量比率高于细胞质的细胞构成的扁平菌落。培养时，可以适当地与饲养细胞一起培养。另外，相对于MEF等培养细胞停止增殖数周，多能干细胞可以长时间传代，例如，可以通过即使每3天的传代持续15次以上、优选20次以上、25次以上、30次以上、35次以上或40次以上，也不会丧失增殖性来确认。另外，多能干细胞优选对内源性的NANOG进表达。另外，多能干细胞优选表达TERT，并显示端粒酶活性(合成端粒重复序列的活性)。另外，多能干细胞优选具有分化为三胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的能力(例如，可以在形成畸胎瘤和/或形成胚状体中确认)。更优选多能干细胞通过移植到胚泡中来合成生殖系嵌合体。可以进行Germline transmission的多能干细胞称为germline-competent的多能干细胞。这些表型可以通过公知的方法来确认(WO2007/69666；Ichisaka T et al.,Nature 448(7151):313-7,2007)。另外，也可以在本发明的载体上搭载分化诱导因子基因，导入未分化细胞及干细胞等从而分化所需的细胞及组织。
通过导入本发明的载体所制造的细胞可以用于分化为各种组织及细胞，可以用于所需的试验、研究、诊断、检查、治疗等。例如，所诱导的干细胞有望用于干细胞疗法。例如，可以使用从患者采集的体细胞诱初始化(reprogramming)，然后，将分化诱导得到的体干细胞及其它体细胞移植给患者。细胞的分化诱导方法没有特别限定，例如，可以通过视黄酸处理或各种生长因子、细胞因子处理，利用荷尔蒙的处理来诱导分化。另外，得到的细胞可以用于对所需药剂及化合物的效果进行检测，可以由此筛选药剂及化合物。本发明可以用于医疗用途及非医疗用途，在医学及非医学的方式中是有用的。例如，本发明可以用于治疗、手术和/或诊断或者非治疗、非手术和/或非诊断的目的。
导入载体的细胞没有特别限制，可以为分化后的体细胞，也可以为造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、皮肤表皮干细胞等体干细胞或生殖干细胞。另外，细胞可以来自例如胚胎、胎儿、新生儿、儿童、成人或老人的细胞。另外，动物源没有特别限制，包含：含有人类及非人类灵长类(猴子等)、小鼠、大鼠等啮齿类及牛、猪、山羊等非啮齿类的哺乳动物等。
作为本发明的载体，与未添加微RNA目标序列的情况相比，在向NP基因或P基因添加微RNA目标序列的情况下，来自载体的基因表达或载体量显著降低，具体而言，例如，降低至70％以下、优选60％以下、50％以下、40％以下、30％以下或者1/5以下、优选1/8以下、优选1/10以下、1/20以下、1/30以下、或1/50以下。另外，作为本发明的载体，与未添加微RNA目标序列的情况相比，在向NP基因或P基因添加微RNA目标序列的情况下，来自载体的报告蛋白的表达量的报告蛋白的表达量显著降低，具体而言，例如其为2/3以下、优选1/2以下、优选1/3以下、1/5以下、1/8以下、优选1/10以下、1/20以下、1/30以下、或1/50以下。就细胞而言，可以使用表达该微RNA所需的细胞。另外，只要微RNA在细胞中表达该即可，来自载体的基因表达的测定时间没有特别限制，可以为例如导入病毒载体在24小时后、48小时后、3天后、5天后、1周后、2周后或3周后中的任意一个时刻。
另外，就本发明的载体而言，与未添加微RNA目标序列的情况相比，在向L基因中添加微RNA目标序列的情况下，将载体导入细胞之后，来自载体的基因表达或载体量显著提高，具体而言，例如其为1.2倍以上、优选1.3倍以上、优选1.4倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、优选1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、或6倍以上。就细胞而言，使用表达该微RNA所需的细胞。另外，只要在该微RNA在细胞中表达即可，来自载体的基因表达的测定时间没有特别限制，例如可以为导入病毒载体的24小时后、48小时后、3天后、5天后或1周后或2周后中的任意一个时刻。
另外，本发明涉及促进其它负链RNA病毒载体的除去的方法，该方法包括下述工序：将向NP基因或P基因中添加有微RNA目标序列而得到的本发明的负链RNA病毒载体与该其它负链RNA病毒载体进行共感染。该其它负链RNA病毒载体只要为与本发明的负链RNA病毒载体同种的负链RNA病毒的载体即可，没有特别限制，可以为野生型负链RNA病毒载体或基因缺损或基因修饰后的负链RNA病毒载体。在本发明中，本发明的负链RNA病毒载体不仅在感染细胞中促进自身的除去，还有望促进共存的其它负链RNA病毒载体的除去。即本发明的载体不仅可以用于促进本发明载体自身及搭载于该载体的基因的除去，还可以用于促进共存的其它负链RNA病毒或负链RNA病毒载体以及搭载于该载体的基因的除去。
即，本发明涉及促进其它负链RNA病毒或其它负链RNA病毒载体的除去的方法，该方法包括下述工序：使NP基因或P基因中添加有微RNA目标序列而得到的本发明的负链RNA病毒载体与该其它负链RNA病毒或其它负链RNA病毒载体共感染。就共感染而言，只要在细胞内存在共存的期间即可，无需同时感染。在最初需要使其它负链RNA病毒或其它负链RNA病毒载体感染细胞并将其除去时，也可以感染本发明的载体。
另外，本发明提供负链RNA病毒或负链RNA病毒载体的除去促进剂，该负链RNA病毒或负链RNA病毒载体包含在NP基因或P基因中添加有微RNA目标序列而得到的本发明的负链RNA病毒载体。另外，本发明提供通过负链RNA病毒载体导入的基因的除去促进剂，该除去促进剂包含本发明的负链RNA病毒载体。另外，本发明提供本发明的负链RNA病毒载体在促进通过负链RNA病毒载体和/或负链RNA病毒载体导入的基因的除去中的用途。另外，本发明提供本发明的负链RNA病毒载体在通过负链RNA病毒载体和/或负链RNA病毒载体导入的基因的除去促进剂的制造中的用途。除可以使用本发明的载体调控本发明的载体的搭载基因的表达以外，也可以调控其它负链RNA病毒载体的搭载基因的表达。
实施例
下面，通过实施例对本发明进行更详细说明，但本发明不限定于这些实施例。另外，本说明书中所引用的文献及其它参照全部可以作为本说明书的一部分而纳入本发明。
<本发明中所使用的具有外源基因的仙台病毒载体的制备>
将本发明中所使用的具有外源基因的仙台病毒载体的制备方法示于以下。需要说明的是，在本发明中，“18+”是指在NP基因之前插入GOI，“(PM)”表示在P基因和M基因之间插入GOI，“(F)”表示在代替F基因而在(M基因和HN基因之间)插入GOI，“(HNL)”是指在HN基因和L基因之间插入GOI。另外，在本发明中，仙台病毒全部使用Z株的病毒。另外，在本发明中，“TS”表示在M蛋白上具有G69E、T116A及A183S的突变，在HN蛋白上具有A262T、G264R及K461G的突变，在P蛋白上具有L511F突变，并且，在L蛋白上具有N1197S及K1795E突变，“ΔF”表示F基因缺失。例如，在NP基因前插入GOI的F基因缺失型仙台病毒载体记作SeV18+/ΔF，具有TS突变的相同载体记作SeV18+/TSΔF。同理，作为使NP基因前插入GOI的M基因缺失，且F蛋白的蛋白酶方向性被修饰后的载体，蛋白酶方向性被修饰为MMP类型的载体记作SeV18+/Fct14(MMP)-HN/ΔM，蛋白酶方向性被修饰为uPA类型的载体记作SeV18+/Fct14(uPA)-HN/ΔM。只要没有特别说明，用于插入GOI的限制酶则为NotI。另外，TS12是指P蛋白上除上述TS突变之外还包含D433A、R434A及K437A的突变的仙台病毒载体，TS15为除上述TS12突变之外在L蛋白上还包含L1361C及L1558I的突变的仙台病毒载体。其中，这些仅为示例，本发明不限定于这些例子。
1)SeV18+DGFP/TSΔF载体的构建
将DasherGFP(DNA2.0公司)作为模板，使用NotI-DGFP-F(5’-ATAGCGGCCGCGACATGACTGCCCTGACCG-3’)(SEQ ID NO：8)及DGFP-EIS-NotI-R(5’-TATGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACTGATAGGTATCGAGATCGAC-3’)(SEQ ID NO：9)的引物，进行PCR反应，利用NotI酶切，并克隆至pSeV18+TSΔF中，得到pSeV18+DGFP/TSΔF。将由pSeV18+DGFP/TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称为SeV18+DGFP/TSΔF。
2)SeV18+DGFPmiRT/TSΔF载体的构建
将pSeV18+DGFP/TSΔF作为模板，使用EcoRI-DGFP(5’-ATATGAATTCGCGGCCGCTCGCCACCATGACTGCCCTGACCG-3’)(SEQ ID NO：10)及DGFP-HindIII(5’-ATATAAGCTTCTATTACTGATAGGTATC-3’)(SEQ ID NO：11)的引物，进行PCR反应，利用EcoRI及HindIII酶切，得到EcoRI-DGFP-HindIII片段。接着，对miR302-1+(5’-ATATAAGCTTGGTACCTTATCACCAAAACATGGAAGCACTTACGATTCACCAAAACATGGAAGCACTTAGAGCTCATAT-3’)(SEQ ID NO：12)及miR302-2+(5’-ATATGAGCTCTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATAAGGTACCAAGCTTATAT-3’)(SEQ ID NO：13)退火，利用HindIII及SacII进行酶切，得到HindIII-miR302-SacII片段。接着，对miR302-3+(5’-ATATGAGCTCTCACCAAAACATGGAAGCACTTACGATTCACCAAAACATGGAAGCACTTAAGTATGGTACCTCTAGAATAT-3’)(SEQ ID NO：14)及miR302-4+(5’-ATATTCTAGAGGTACCATACTTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAGAGCTCATAT-3’)(SEQ ID NO：15)退火，利用SacII及XbaI进行酶切，得到SacII-miR302-XbaI片段。接着，对XbaI-EIS-NotI-BamHI-F(5’-
ATATTCTAGAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCGCGGCCGCGGATCCATAT-3’)(SEQ ID NO：16)及XbaI-EIS-NotI-BamHI-R(5’-ATATGGATCCGCGGCCGCGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTCTAGAATAT-3’)(SEQ ID NO：17)退火，利用XbaI及BamHI进行酶切，得到XbaI-EIS-BamHI片段。接着，克隆至将这些利用BamHI及EcoRI酶切后的pBlueScript II-SK+(Stratagene公司)中，得到pBS-DGFP-miR302T4。接着，将pBS-DGFP-miR302T4利用NotI进行酶切，并克隆至pSeV18+TSΔF中，得到pSeV18+DGFPmiRT/TSΔF。将由pSeV18+DGFPmiRT/TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称为SeV18+DGFPmiRT/TSΔF。
3)SeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF载体的构建
首先，如下构建pSeV18+/PLmutTSΔF。将pSeV18+/TSΔF作为模板，使用BamHI-P-F(5’-ATATGGATCCAGTTCACGCGGCCGCA-3’)(SEQ ID NO：41)及XhoI-P-R(5’-ATATCTCGAGTCGGTGCAGGCCTTTA-3’)(SEQ ID NO：42)的引物，进行PCR反应。将该PCR产物利用BamHI及XhoI酶切，将得到的DNA片段克隆至pBlueScript II-SK+(Stratagene公司)，得到pBS-P。将该pBS-P作为模板，使用Pmut-F1(5’-GGATCATACGGCGCGCCAAGGTACTTG-3’)(SEQID NO：43)、Pmut-R1(5’-CAAGTACCTTGGCGCGCCGTATGATCC-3’)(SEQ ID NO：44)、Pmut-F2(5’-CAACTAGATCCTGCAGGAGGCATCCTAC-3’)(SEQ ID NO：45)及Pmut-R2(5’-GTAGGATGCCTCCTGCAGGATCTAGTTG-3’)(SEQ ID NO：46)的引物，进行PCR反应，P在基因的上游导入AscI位点，在P基因的下游导入SbfI位点，得到pBS-Pmut。接着，将pSeV18+TSΔF作为模板，使用BamHI-L-F(5’-ATATGGATCCGTACGATCGCAGTCCACCAT-3’)(SEQ ID NO：47)及XhoI-L-R(5’-ATATCTCGAGCAGCTAGCTCAACTGA-3’)(SEQ ID NO：48)的引物，进行PCR反应。将该PCR产物利用BamHI及XhoI进行酶切，将得到的DNA片段克隆至pBlueScript II-SK+，得到pBS-L。将该pBS-L作为模板，使用Lmut-F(5’-GTGAATGGGAGGCCGGCCATAGGTC-3’)(SEQ ID NO：49)及Lmut-R(5’-GACCTATGGCCGGCCTCCCATTCAC-3’)(SEQ ID NO：50)的引物，进行PCR反应，向L基因的上游导入FseI位点，得到pBS-Lmut。接着，将pSeV18+/TSΔF利用SalI及PvuI进行酶切，将pBS-Lmut利用PvuI及KpnI进行酶切，并克隆至pBlueScript II-SK+，得到pBS-LmutSeV。接着，将pBS-LmutSeV利用NheI及SalI进行酶切，并克隆至pSeV18+/TSΔF，得到pSeV18+/LmutTSΔF。接着，将pSeV18+/LmutTSΔF利用NotI、NheI及StuI进行酶切，将pBS-Pmut利用NotI及StuI进行酶切，将这些DNA片段缀合，得到pSeV18+/PLmutTSΔF。
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(5’-CTGCAACCCATGGAGATGAAGG-3’)(SEQ ID NO：18)及P-miR302T4-C(5’-CCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTG-3’)(SEQ IDNO：19)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-P-miRT片段。接着，将pSeV18+DGFPmiRT/TSΔF作为模板，使用P-miR302T4-N(5’-CACTGACCAACTAGATAATAGAAGCTTGG-3’)(SEQ ID NO：20)及P-miR302T4-SbfI-C(5’-TATACCTGCAGGCTCTAGAGGTACCATAC-3’)(SEQ ID NO：21)的引物，进行PCR反应，得到P-miRT-SbfI片段。接着，将SeVF1603-P-miRT片段及P-miRT-SbfI片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR302T4-SbfI-C(SEQ ID NO：21)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+/PLmutTSΔF，得到pSeV18+/PmiRT-TSΔF。接着，将pSeV18+DGFP/TSΔF利用NotI酶切，将得到的DGFP-NotI片段克隆至pSeV18+/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF。
4)SeV18+DGFP/LmiRT#2-TSΔF载体的构建
将pBS-DGFP-miR302T4利用KpnI进酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/TSΔF，得到pSeV18+DGFP/LmiRT#2-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/LmiRT#2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称为SeV18+DGFP/LmiRT#2-TSΔF。
5)SeV18+DGFP/LmiRT#1-TSΔF载体的构建
将pSeV18+DGFPmiRT/TSΔF作为模板，使用SeVF13201(5’-TCGTGGAACCTGTGTATGGGCC-3’)(SEQ ID NO：22)及L-miR302T4-C(5’-GGTACCAAGCTTCTATTATTACGAGCTGTC-3’)(SEQ ID NO：23)的引物，进行PCR反应，得到SeVF13201-LmiRT片段。接着，将pSeV18+DGFPmiRT/TSΔF作为模板，使用L-miR302T4-N(5’-GACAGCTCGTAATAATAGAAGCTTGGTACC-3’)(SEQ ID NO：24)及L-miR302T4-SacII-C(5’-ATATCCGCGGAGCTTCGATCGTTCTGCACGATAGGGACTAATTCTCTAGAGGTACCATAC-3’)(SEQ ID NO：25)的引物，进行PCR反应，得到LmiRT-SacII片段。接着，将SeVF13201-LmiRT片段及LmiRT-SacII片段作为模板，使用SeVF13201(SEQ ID NO：22)及L-miR302T4-SacII-C(SEQ ID NO：25)的引物，进行PCR反应，利用XhoI及SacII酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/TSΔF，得到pSeV18+DGFP/LmiRT#1-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/LmiRT#1-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/LmiRT#1-TSΔF。
6)SeV18+DGFP/NPmiRT-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF426(5’-ATCTACAACATAGAGAAAGACC-3’)(SEQ ID NO：26)及NP-miR302T4-C(5’-AGCTTCTATTATCTAGATTCCTCCTATCCC-3’)(SEQ IDNO：27)的引物，进行PCR反应，得到SeVF426-NPmiRT片段。接着，将pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF作为模板，使用NP-miR302T4-N(5’-GGAGGAATCTAGATAATAGAAGCTTGGTAC-3’)(SEQ ID NO：28)及miR302T4-AscI-C(5’-ATATGCGCGCCGTATGATCATATCTCTAGAGGTACC-3’)(SEQ ID NO：29)的引物，进行PCR反应，得到NPmiRT-AscI片段。接着，将SeVF426-NPmiRT片段及NPmiRT-AscI片段作为模板，使用SeVF426(SEQ ID NO：26)及miR302T4-AscI-C(SEQ ID NO：29)的引物，进行PCR反应，利用SphI及AscI进行酶切，并克隆至pSeV18+/PLmutTSΔF，得到pSeV18+/NPmiRT-TSΔF。将DGFP-NotI片段克隆至pSeV18+/NPmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/NPmiRT-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/NPmiRT-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/NPmiRT-TSΔF。
7)SeV18+DGFP/PmiRTtag-TSΔF载体的构建
将pSeV18+DGFP/TSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR302T4tag-C(5’-GCTTCTATTAATGTTGGTCAGTGACTCTAT-3’)(SEQ ID NO：30)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-P-miR302T4tag片段。接着，将pSeV18+DGFP/TSΔF作为模板，使用P-miR302T4tag-N(5’-GACCAACATTAATAGAAGCTTGGTACCTTA-3’)(SEQ ID NO：31)及P-miR302T4tag-SbfI-C(5’-ATATCCTGCAGGTATTACTACTCTAGAGGTACCATAC-3’)(SEQ ID NO：32)的引物，进行PCR反应，得到P-miR302T4tag-SbfI片段。接着，将SeVF1603-P-miR302T4tag片段及P-miR302T4tag-SbfI片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR302T4tag-SbfI-C(SEQ ID NO：32)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiRTtag-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiRTtag-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称为SeV18+DGFP/PmiRTtag-TSΔF。
8)SeV18+DGFP/PmiRTx1-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR302T1-C1(5’-GTACCATACTTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATAAGGTACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGAC-3’)(SEQ ID NO：33)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-PmiR302T1片段。接着，将SeVF1603-PmiR302T1片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR302T1-C2-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGTATCTCTAGAGGTACCATACTTAAG-3’)(SEQ ID NO：34)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiRTx1-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiRTx1-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称为SeV18+DGFP/PmiRTx1-TSΔF。
9)SeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR302T2-C1(5’-CATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATAAGGTACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC-3’)(SEQ ID NO：35)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-PmiR302T2片段。接着，将SeVF1603-PmiR302T2片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR302T2-C2-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGATCTCTAGAGGTACCATACTTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGT-3’)(SEQ ID NO：36)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔF。
10)SeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR367T2-C1(5’-CTTTAGCAATGGTGATAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC-3’)(SEQ ID NO：37)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-PmiR367T2片段。接着，将SeVF1603-PmiR367T2片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR367T2-C2-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAATTGCACTTTAGCAATGGTGAATCGAATTGCACTTTAGCAATGGTGATAATCCACC-3’)(SEQ IDNO：38)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF。
11)SeV18+DGFP/PmiR126T2-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR126T2-C1(5’-GAGTAATAATGCGTAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC-3’)(SEQ ID NO：39)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-PmiR126T2片段。接着，将SeVF1603-PmiR126T2片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR126T2-C2-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGTCGTACCGTGAGTAATAATGCGATCGTCGTACCGTGAGTAATAATGCGTAATCCACC-3’)(SEQ ID NO：40)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR126T2-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR126T2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR126T2-TSΔF。
12)SeV18+DGFP/PmiRTΔF载体的构建
将pSeV18+ΔF作为模板，使用BamHI-P-F(SEQ ID NO：41)及Pmut-R1(SEQ ID NO：44)的引物，进行PCR反应，得到BamHI-PmutdF片段。接着，将pSeV18+ΔF作为模板，使用Pmut-F1(SEQ ID NO：43)及Pmut-R2(SEQ ID NO：46)的引物，进行PCR反应，得到PmutdF片段。接着，将pSeV18+ΔF作为模板，使用Pmut-F2(SEQ ID NO：45)及XhoI-P-R(SEQ ID NO：42)的引物，进行PCR反应，得到PmutdF-XhoI片段。接着，将BamHI-PmutdF片段、PmutdF片段及PmutdF-XhoI片段作为模板，使用BamHI-P-F(SEQ ID NO：41)及XhoI-P-R(SEQ ID NO：42)的引物，进行PCR反应，并将得到的DNA片段克隆至pBlueScript II-SK+，得到pBS-PmutdF。接着，将pBS-PmutdF利用NotI、StuI及XhoI进行酶切，得到3878bp片段。接着，将pSeV18+ΔF利用NotI及NheI酶切，得到6321bp片段。接着，将pSeV18+ΔF利用NotI、StuI及NheI，得到6161bp片段。接着，将3878bp片段、6321bp片段及6161bp片段缀合，得到pSeV18+/PmutΔF。接着，将pSeV18+/PmutΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR302T4-C(SEQID NO：19)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-PdF-miRT片段。接着，将SeVF1603-PdF-miRT片段及P-miRT-SbfI片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR302T4-SbfI-C(SEQ ID NO：21)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+/PmutΔF，得到pSeV18+/PmiRTΔF。接着，将DGFP-NotI片段克隆至pSeV18+/PmiRTΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiRTΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiRTΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiRTΔF。
13)SeV18+DGFP/PmiR372T2-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR372T2-C1(5’-CGACATTTGAGCGTAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC-3’)(SEQ ID NO：70)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-PmiR372T2片段。接着，将SeVF1603-PmiR124T2片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR372T2-C2-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAAAGTGCTGCGACATTTGAGCGTACGAAAGTGCTGCGACATTTGAGCGTAATCCACC-3’)(SEQ ID NO：71)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR372T2-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR372T2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR372T2-TSΔF。
14)SeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR143T2-C1(5’-GCACTGTAGCTCATAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC-3’)(SEQ ID NO：72)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-PmiR143T2片段。接着，将SeVF1603-PmiR143T2片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR143T2-C2-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGTGAGATGAAGCACTGTAGCTCAATCGTGAGATGAAGCACTGTAGCTCATAATCCACC-3’)(SEQ ID NO：73)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔF。
15)SeV18+DGFP/PmiR122T2-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR122T2-C1(5’-CAATGGTGTTTGTAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC-3’)(SEQ ID NO：74)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-PmiR122T2片段。接着，将SeVF1603-PmiR122T2片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR122T2-C2-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGATCGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTAATCCACC-3’)(SEQ ID NO：75)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR122T2-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR122T2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR122T2-TSΔF。
16)SeV18+DGFP/PmiR218T2-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR218T2-C1(5’-GATCTAACCATGTGTAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC-3’)(SEQ ID NO：76)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-PmiR218T2片段。接着，将SeVF1603-PmiR218T2片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR218T2-C2-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGTTGTGCTTGATCTAACCATGTGATCGTTGTGCTTGATCTAACCATGTGTAATCCACC-3’)(SEQ IDNO：77)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR218T2-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR218T2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR218T2-TSΔF。
17)SeV18+DGFP/PmiR124T2-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR124T2-C1(5’-CGGTGAATGCCAATAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC-3’)(SEQ ID NO：78)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-PmiR124T2片段。接着，将SeVF1603-PmiR124T2片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR124T2-C2-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAATCGTAAGGCACGCGGTGAATGCCAATAATCC-3’)(SEQ ID NO：79)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR124T2-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR124T2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR124T2-TSΔF。
18)SeV18+DGFP/PmiR138T2-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR138T2-C1(5’-GTGAATCAGGCCGTAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC-3’)(SEQ ID NO：80)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-PmiR138T2片段。接着，将SeVF1603-PmiR138T2片段作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及P-miR138T2-C2-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTAGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCGATCAGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCGTAATCCACC-3’)(SEQ ID NO：81)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR138T2-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR138T2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR138T2-TSΔF。
19)SeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔF载体的构建
将pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及miR367T1-C-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTATCGAATTGCACTTTAGCAATGGTGATAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC-3’)(SEQ ID NO：82)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔF。
20)SeV18+DGFP/miR367T1-NP-TSΔF载体的构建
首先，如下构建pSeV18+/PLmutTSΔFver2。以pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF3208(5’-AGAGAACAAGACTAAGGCTACCAGGTTTGACC-3’)(SEQ ID NO：83)及AsiSI-C(5’-AGGCGATCGCTCTTTCACCCTAAGTTTTTC-3’)(SEQ ID NO：84)的引物，进行PCR反应，得到SeVF3208-AsiSI-C片段。接着，将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用AsiSI-N(5’-GAAAGAGCGATCGCCTAACACGGCGCAATG-3’)(SEQ ID NO：85)及SeVR4246(5’-TTTGGGATCTTGGCTATGGTGAT-3’)(SEQ ID NO：86)的引物，进行PCR反应，得到AsiSI-N-SeVR4246片段。接着，将SeVF3208-AsiSI-C片段及AsiSI-N-SeVR4246片段作为模板，使用SeVF3208及SeVR4246的引物，进行PCR反应，并克隆至pGEM-T Easy(Promega公司)，得到pGEM/P-SbfI-AsiSI。接着，将pGEM/P-SbfI-AsiSI利用StuI及SbfI进行酶切，将pSeV18+/PLmutTSΔF利用NheI及SbfI进行酶切，将pSeV18+/PLmutTSΔF利用StuI及NheI酶切，对三个片段退火，得到pSeV18+/PLmutTSΔFver2。将DGFP-NotI片段克隆至pSeV18+/PLmutTSΔFver2，得到pSeV18+DGFP/PLmutTSΔFver2。
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用NotI-miR367T1-NP-N(5’-ATATGCGGCCGCATCACCATTGCTAAAGTGCAATTCAGATCTTCACGATGGCCGGGTTGTTGAGC-3’)(SEQ ID NO：87)及SeVR744(5’-CGTCTTGTCTGAACGCCTCTAAC-3’)(SEQ ID NO：88)的引物，进行PCR反应，并克隆至pSeV18+DGFP/PLmutTSΔFver2，得到pSeV18+DGFP/miR367T1-NP-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/miR367T1-NP-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/miR367T1-NP-TSΔF。
21)SeV18+DGFP/miR367T1-P-TSΔF载体的构建
首先，如下构建pSeV18+/PLmutTSΔFver3。将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及AscI-AsiSI-SalI-C(5’-GCCTTGCGATCGCCGATCGGTGGATGAACT-3’)(SEQ ID NO：89)的引物，进行PCR反应，得到SeVF1603-AscI-AsiSI-SalI-C片段。接着，将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用AscI-AsiSI-SalI-N(5’-CCGATCGGCGATCGCAAGGCCACACCCAAC-3’)(SEQ ID NO：90)及SeVR2231(5’-CAGAGTTTGTACCAGTTCTTCCCC-3’)(SEQ ID NO：91)的引物，进行PCR反应，得到AscI-AsiSI-SalI-N-SeVR2231片段。接着，将SeVF1603-AscI-AsiSI-SalI-C片段及AscI-AsiSI-SalI-N-SeVR2231片段作为模板，使用SeVF1603及SeVR2231的引物，进行PCR反应，利用AscI及SalI酶切，并克隆至pSeV18+/PLmutTSΔF，得到pSeV18+/PLmutTSΔFver3。
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用AscI-miR-N(5’-ATATGGCGCGCCAAGGTACTTGATCCGTAG-3’)(SEQ ID NO：92)及miR367T1-AsiSI-C(5’-ATATGCGATCGCGAATTGCACTTTAGCAATGGTGATCGATCGGTGGATGAACTTTC-3’)(SEQ ID NO：93)的引物，进行PCR反应，利用AscI及AsiSI进行酶切，并克隆至pSeV18+/PLmutTSΔFver3，得到pSeV18+/miR367T1-P-TSΔF。将DGFP-NotI片段克隆至pSeV18+/miR367T1-P-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/miR367T1-P-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/miR367T1-P-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称为SeV18+DGFP/miR367T1-P-TSΔF。
22)SeV18+DGFP/miR367T1-L-TSΔF载体的构建
将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用FseI-miR367T1-L-N(5’-ATATGGCCGGCCATCACCATTGCTAAAGTGCAATTCATAGGTCATGGATGGGCAGGAGTCC-3’)(SEQ ID NO：94)及SeVR12508(5’-GAATATTTATCGAAGGTTCAGAGGTGTG-3’)(SEQ ID NO：95)的引物，进行PCR反应，利用FseI及NheI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PLmutTSΔFver2，得到pSeV18+/miR367T1-L-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/miR367T1-L-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称为SeV18+DGFP/miR367T1-L-TSΔF。
23)SeV18+DGFP/PmiR367T2m1-TSΔF载体的构建
将pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及miR367T2m1-C-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAATTGCACTTTATCAATGGTGAATCGAATTGCACTTTATCAATGGTGATAATCCACCA-3’)(SEQ ID NO：96)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR367T2m1-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR367T2m1-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR367T2m1-TSΔF。
24)SeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔF载体的构建
将pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及miR367T2m2-C-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAATTGCACTTTATTAATGGTGAATCGAATTGCACTTTATTAATGGTGATAATCCACCA-3’)(SEQ ID NO：97)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称为SeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔF。
25)SeV18+DGFP/PmiR367T2m3-TSΔF载体的构建
将pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF作为模板，使用SeVF1603(SEQ ID NO：18)及miR367T2m3-C-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAATTGCACTTTCTTAATGGTGAATCGAATTGCACTTTCTTAATGGTGATAATCCACCA-3’)(SEQ ID NO：98)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR367T2m3-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR367T2m3-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR367T2m3-TSΔF。
26)SeV18+DGFP/PmiR367T2m4-TSΔF载体的构建
将pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF作为模板，SeVF1603(SEQ ID NO：18)及miR367T2m4-C-SbfI(5’-ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAATTGCACTTACTTAATGGTGAATCGAATTGCACTTACTTAATGGTGATAATCCACCA-3’)(SEQ ID NO：99)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，并克隆至pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF，得到pSeV18+DGFP/PmiR367T2m4-TSΔF。将由pSeV18+DGFP/PmiR367T2m4-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP/PmiR367T2m4-TSΔF。
27)SeV18+DGFP(HNL)HSV-TK/PmiR302T4-TSΔF载体的构建
将pSELECT-zeo-HSV1tk(InvivoGen公司)作为模板，使用NotI-HSVtk-N(5’-ATATGCGGCCGCGACGTCACCATGGCTTCTTACCCTGGAC-3’)(SEQ ID NO：100)及HSVtk-EIS-NotI-C(5’-ATATGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAGTTGGCCTCTCCCATCTCCC-3’)(SEQID NO：101)的引物，进行PCR反应，得到HSVtk-NotI片段。接着，利用AscI及SbfI对pSeV18+/PmiRT-TSΔF进行酶切，将得到的PmiR302T4片段克隆至pSeV(HNL)AG/d2PTS15ΔF(WO2016/125364)，得到pSeV(HNL)AG/PmiR302T4-TS15ΔF。接着，利用NheI及SacI对pSeV18+/PLmutTSΔF进行酶切，将得到的L基因(TS)克隆至pSeV(HNL)AG/PmiR302T4-TS15Δ，得到pSeV(HNL)AG/PmiR302T4-TSΔF。接着，利用NotI对HSVtk-NotI片段进行酶切，并克隆至pSeV(HNL)AG/PmiR302T4-TSΔF，得到pSeV(HNL)HSVtk/PmiR302T4-TSΔF。接着，将pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF及pSeV(HNL)HSVtk/PmiR302T4-TSΔF利用AscI及SacII酶切，缀合这些片段，得到pSeV18+DGFP(HNL)HSV-TK/PmiR302T4-TSΔF。将由eV18+DGFP(HNL)HSV-TK/PmiR302T4-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP(HNL)HSV-TK/PmiR302T4-TSΔF。
28)SeV(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)载体的构建
将pSeV18+(WO97/16539)作为模板，使用iSI-F-N(5’-ATATGCGATCGCAAACATGACAGCATATATCCAGAGATCACAG-3’)(SEQ ID NO：102)及F-SwaI-C(5’-CAATTTAAATTCATCTTTTCTCAGCCATTG-3’)(SEQ ID NO：103)的引物，进行PCR反应，得到iSI-F-SwaI片段。接着，将pSeV18+/PLmutTSΔF作为模板，使用SwaI-N(5’-GAAAAGATGAATTTAAATTGTGCACCCATC-3’)(SEQ ID NO：104)及PacI-C(5’-ATATTTAATTAACCAAGCACTCACAAGGG-3’)(SEQ ID NO：105)的引物，进行PCR反应，得到SwaI-PacI片段。接着，将siSI-F-SwaI片段及F-SwaI-PacI片段作为模板，使用AsiSI-F-N及PacI-C的引物，进行PCR反应，利用AsiSI及PacI进行酶切，并克隆至pSeV18+/PLmutTSΔFver2，得到pSeV18+/PLmutTSΔM-SwaI。接着，将pSeV18+/PLmutTSΔM-SwaI作为模板，使用AsiSI-F-N及F-SwaI-Cver2(5’-GTGCACATTTAAATTCATCTTTTCTCAGCC-3’)(SEQ ID NO：106)的引物，进行PCR反应，得到iSI-F-SwaIver2片段。接着，将pSeV18+/PLmutTSΔM-SwaI作为模板，使用F-SwaI-Nver2(5’-ATGAATTTAAATGTGCACCCATCAGAGACC-3’)(SEQ ID NO：107)及PacI-C的引物，进行PCR反应，得到F-SwaI-PacIver2片段。接着，将AsiSI-F-SwaIver2片段及F-SwaI-PacIver2片段作为模板，使用AsiSI-F-N及PacI-C的引物，进行PCR反应，利用iSI及PacI进行酶切，并克隆至pSeV18+/PLmutTSΔFver2，得到pSeV18+/PLmutTSΔM-SwaIver2。接着，将pSeV18+/Fct14(uPA#2)dM-GFP(Gene Therapy(2009)16,392-403)作为模板，使用
AsiSI-Fct14(uPA#2)-N(5’-ATATGCGATCGCCACCATGACAGCATATAT-3’)(SEQ ID NO：108)及Fct14(uPA#2)-SwaI-C(5’-ATATATTTAAATTCAGCGGTCATCTGGATT-3’)(SEQ ID NO：109)的引物，进行PCR反应，利用iSI酶切，并克隆至pSeV18+/PLmutTSΔM-SwaIver2，得到pSeV18+/TSΔM-Fct14(uPA#2)。接着，将DasherGFP作为模板，使用AsiSI-DGFP-N(5’-ATATGCGATCGCGACATGACTGCCCTGACCGAAGGTGC-3’)(SEQ ID NO：110)及DGFP-EIS-AsiSI-C(5’-ATATGCGATCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACTGATAGGTATCGAGATCG-3’)(SEQID NO：111)的引物，进行PCR反应，利用AsiSI进行酶切，并克隆至pSeV18+/TSΔM-Fct14(uPA#2)，得到pSeV18+(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)。将由pSeV18+(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)。
29)SeV(PF)DGFP/PmiR143T2-TSΔM-Fct14(uPA#2)载体的构建
利用AscI及SbfI对pSeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔF进行酶切，并克隆至pSeV18+(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)，得到pSeV18+(PF)DGFP/PmiR143T2-TSΔM-Fct14(uPA#2)。将由pSeV18+(PF)DGFP/PmiR143T2-TSΔM-Fct14(uPA#2)载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV(PF)DGFP/PmiR143T2-TSΔM-Fct14(uPA#2)。
30)SeV18+KLF4/PmiR367T1-TSΔF载体的构建
利用NotI对pSeV18+KLF4/TSΔF(WO2010/008054)进行酶切，并将得到的KLF4-NotI片段克隆至pSeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔF，得到pSeV18+KLF4P/PmiR367T1-TSΔF。将由pSeV18+KLF4P/PmiR367T1-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+KLF4P/PmiR367T1-TSΔF。
31)SeV18+KLF4/PmiR367T2-TSΔF载体的构建
将KLF4-NotI片段克隆至pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF，得到pSeV18+KLF4P/PmiR367T2-TSΔF。将由pSeV18+KLF4P/PmiR367T2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+KLF4P/PmiR367T2-TSΔF。
32)SeV18+KLF4/PmiR367T2m2-TSΔF载体的构建
将KLF4-NotI片段克隆至pSeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔF，得到pSeV18+KLF4P/PmiR367T2m2-TSΔF。将由pSeV18+KLF4P/PmiR367T2m2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+KLF4P/PmiR367T2m2-TSΔF。
33)SeV18+KLF4/PmiR302T2-TSΔF载体的构建
将KLF4-NotI片段克隆至pSeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔF，得到pSeV18+KLF4P/PmiR302T2-TSΔF。将由pSeV18+KLF4P/PmiR302T2-TSΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+KLF4P/PmiR302T2-TSΔF。
34)SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔF载体的构建
首先，如下构建pSeV18+/PLmutTS12ΔF。将pSeV18+/TS12ΔF(WO2010/008054)作为模板，使用AscI-N(5’-ATTGGCGCGCCAAGGTACTTGATCCGTAG-3’)(SEQ ID NO：112)及P-SbfI-C(5’-AATCCTGCAGGATCTAGTTGGTCAGTGAC-3’)(SEQ IDNO：113)的引物，进行PCR反应，利用AscI及SbfI进行酶切，克隆至pSeV18+/PLmutTSΔFver2，得到pSeV18+/PLmutTS12ΔFver2。
将通过人工基因合成而合成得到的P基因(sP)(SEQ ID NO：114)作为模板，使用AsiSI-sP4Cmut-N(5’-GCGATCGCGCCACCATGGATCAAGACGCCT-3’)(SEQ ID NO：115)及sP4Cmut-miR367T2-C1(5’-AATGGTGATAATCCACCAAGCTTCTATCTATCAATTGGTCAGGC-3’)(SEQID NO：116)的引物，进行PCR反应，得到AsiSI-sPmiR367T2-C1片段。接着，将AsiSI-sPmiR367T2-C1片段作为模板，使用AsiSI-sP4Cmut-N及miR367T2-C2ver3(5’-TCTTACTCGACTGAATTGCACTTTAGCAATGGTGAATCGAATTGCACTTTAGCAATGGTGATAATCCACC-3’)(SEQ ID NO：117)的引物，进行PCR反应，得到AsiSI-sPmiR367T2-C2片段。接着，将AsiSI-sPmiR367T2-C2片段作为模板，使用AsiSI-sP4Cmut-N及miR-EIS-AsiSI-C(5’-GCGATCGCGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTCGACTGAATTGCACTT-3’)(SEQ ID NO：118)的引物，进行PCR反应，并克隆至pGEM-T Easy，得到sPmiR367T2-AsiSI。接着，利用AsiSI对sPmiR367T2-AsiSI进行酶切，并克隆至pSeV18+/PLmutTS12ΔFver2，得到pSeV18+/PsPmiR367T2-TS12ΔF。接着，将DGFP-NotI片段克隆至pSeV18+/PsPmiR367T2-TS12ΔF，得到pSeV18+DGFP/PsPmiR367T2-TS12ΔF。接着，将pSeV18+DGFP/PsPmiR367T2-TS12ΔF及pSeV(HNL)cMYC/TS15ΔF(WO2010/008054)利用MluI及PacI酶切并缀合，得到pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔF。将由pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔF。
35)SeV18+DGFP(HNL)cMYC/Pd2sPmiR367T2-TS15ΔF载体的构建
利用AscI及PacI对pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔF进行酶切，利用AscI及SbfI对pSeV18+d2AG/d2PTS15ΔF(WO2016/125364)进行酶切，利用SbfI及PacI对pSeV18+DGFP/PsPmiR367T2-TS15ΔF进行酶切，并将它们缀合，得到pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/Pd2sPmiR367T2-TS15ΔF。将pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/Pd2sPmiR367T2-TS15ΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP(HNL)cMYC/Pd2sPmiR367T2-TS15ΔF。
36)SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PddsPmiR367T2-TS15ΔF载体的构建
利用AscI及PacI对pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔF进行酶切，利用AscI及SbfI对pSeV18+d2AG/PddTS15ΔF(WO2016/125364)进行酶切，利用SbfI及PacI对pSeV18+DGFP/PsPmiR367T2-TS15ΔF进行酶切，并将它们缀合，得到pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PddsPmiR367T2-TS15ΔF。将由pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PddsPmiR367T2-TS15ΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PddsPmiR367T2-TS15ΔF。
37)SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PtetRsPmiR367T2-TS15ΔF载体的构建
利用AscI及PacI对pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔF进行酶切，利用AscI及SbfI对pSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔF(WO2016/125364)进行酶切，利用SbfI及PacI对pSeV18+DGFP/PsPmiR367T2-TS15ΔF进行酶切并将它们缀合得到pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PtetRsPmiR367T2-TS15ΔF。将由pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PtetRsPmiR367T2-TS15ΔF载体的转录产物制备的仙台病毒称作SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PtetRsPmiR367T2-TS15ΔF。
需要说明的是，在实施例1～7中，除非另有说明，否则将添加有具有一个微RNA目标序列(miR-302目标序列)的序列(miR302T1)的载体记作“miRTx1”，将添加有两次重复序列(miR302T2)的载体记作“miRTx2”(图5中，分别我“miRT(x1)”及“miRT(x2)”)，将添加有四次重复序列(miR302T4)的载体记作“miRT”。
[实施例1]
以1x105cells/well将HeLa细胞接种在12well plate中，将来自BJ细胞的iPS细胞接种在12well plate中。将添加有SeV18+DGFP/TSΔF(DGFP)、miR-302簇的目标序列重复四次的miR302T4的载体SeV18+DGFPmiRT/TSΔF(DGFPmiRT)、SeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF(PmiRT)、SeV18+DGFP/LmiRT#1-TSΔF(LmiRT#1)、SeV18+DGFP/LmiRT#2-TSΔF(LmiRT#2)在35℃下，以MOI＝5，在HeLa细胞及iPS细胞中感染，第1天利用荧光显微镜，及利用荧光成像读板仪测定。结果，在HeLa细胞中，观察到DGFP、DGFPmiRT、PmiRT、LmiRT#1、LmiRT#2的荧光，而在表达miR-302的iPS细胞中，观察到DGFPmiRT和PmiRT的荧光消失。另一方面，作为向L基因添加miR-302T4而得到的LmiRT#1载体，在表达miR-302的iPS细胞中，观察到DGFP的荧光增加。而且，与DGFP相比，使微RNA目标序列的搭载位置向L基因的3’侧偏移后的LmiRT#2观察到6.5倍的荧光(图2)。
[实施例2]
在35℃下，使iPS细胞感染PmiRT、LmiRT#1、LmiRT#2，第1天观察荧光表达之后，在37℃下培养22天。在第22天进行SeV抗体染色，发现PmiRT为SeV抗体阴性，LmiRT#1及LmiRT#2为SeV抗体阳性(图3)。
[实施例3]
在35℃下，使HeLa细胞及iPS细胞感染DGFP、PmiRT、SeV18+DGFP/NPmiRT-TSΔF(NPmiRT)、SeV18+DGFP/PmiRTtag-TSΔF(PmiRTtag)、SeV18+DGFP/PmiRT-TS12ΔF(PmiRT/TS12)、SeV18+DGFP/PmiRT-TS15ΔF(PmiRT/TS15)，在第1天利用荧光显微镜观察，并利用MetaMorph(Molecular Devices公司)进行图像分析。结果，在HeLa细胞中观察到DGFP、NPmiRT、PmiRT、PmiRTtag、PmiRT/TS12、PmiRT/TS15的荧光，而在iPS细胞中，与未添加微RNA目标序列的DGFP相比，向NP基因添加miR-302T4而得到的NPmiRT的表达被抑制至40％左右，与向P基因添加的情况相比，表达抑制较弱。与DGFP相比，向P基因的编码区添加miR-302T4而得到的PmiRTtag为10％以下的荧光，可以获得与PmiRT相同的表达抑制效果。在温度敏感性增强的TS12和TS15骨架PmiRT中也可以获得与TS骨架的PmiRT相同的表达抑制效果(图4)。
[实施例4]
在35℃下，使HeLa细胞及iPS细胞感染DGFP、SeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔF(PmiRTx2)、SeV18+DGFP/PmiRTx1-TSΔF(PmiRTx1)，第1天及第2天利用荧光显微镜观察，并利用MetaMorph进行图像分析。结果，在HeLa细胞中观察到DGFP、PmiRTx2、PmiRTx1的荧光，而在iPS细胞中，与DGFP相比，第1天中PmiRTx2的荧光降低至40％以下，第2天中PmiRTx2的荧光降低至1成以下。观察到PmiRTx1的荧光也在第2天降低至DGFP的30％以下(图5)。向P基因中添加miR-302的目标序列重复两次的miR302T2而得到的PmiRTx2和添加miR-302的目标序列为一个的miR302T1而得到的PmiRTx1也显示出表达抑制效果。作为PmiRTx2，在培养时间延长的第2天，显示出与微RNA目标序列的重复数量为四次的PmiRT相同的表达抑制效果。
[实施例5]
在35℃下，使HeLa细胞及iPS细胞感染DGFP、SeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF(PmiR367T2)，第1天利用荧光显微镜进行了观察。PmiR367T2的P基因上添加有miR-367的目标序列重复两次的miR367T2。结果，在HeLa细胞中，观察到DGFP、PmiR367T2的荧光，而在iPS细胞中，与DGFP相比，观察到PmiR367T2的荧光降低(图6)。这表明除在iPS细胞中表达的miR-302簇以外的微RNA目标序列也可以获得效果。
[实施例6]
在35℃下，使HeLa细胞及血管内皮细胞HUVEC感染DGFP、SeV18+DGFP/PmiR126T2-TSΔF(PmiR126T2)(向P基因添加miR-126的目标序列重复两次的miR126T2而成的载体)，第1天利用荧光显微镜观察。结果，在HeLa细胞中，观察到DGFP、PmiR126T2的荧光，而在HUVEC中，与DGFP相比，观察到PmiR126T2的荧光降低(图7)。这表明向P基因添加在中胚层系统的血管内皮细胞中表达的miR-126的目标序列而得到的PmiR126T2显示出表达抑制效果，且可以通过在分化细胞中各个进行细胞特异性表达的微RNA对载体进行调控。
[实施例7]
在35℃及38.5℃下，使HeLa细胞及iPS细胞感染SeV18+DGFP/PmiRT-ΔF(PmiRTdF)，第1天利用荧光显微镜观察。向不包含温度敏感性突变的SeV载体的P基因添加了miR-302T4。结果，在HeLa细胞中，在35℃及38.5℃下观察到PmiRTdF的荧光，而在iPS细胞中，与35℃相比，在38.5℃下观察到PmiRTdF的荧光降低(图8)。这表明在不包含温度敏感性突变的载体中可以通过微RNA目标序列对载体进行调控。
[实施例8]
在35℃下，使HeLa细胞及iPS细胞感染DGFP、SeV18+DGFP/PmiR372T2-TSΔF(PmiR372T2)，第2天利用荧光显微镜进了观察。PmiR372T2的P基因添加有miR-372的目标序列重复两次的miR372T2。结果，在HeLa细胞中，观察到DGFP、PmiR372T2的荧光，而在iPS细胞中，与DGFP相比，观察到PmiR372T2的荧光降低(图9A)。这表明通过在iPS细胞中表达的miR-302簇以外的微RNA目标序列也可以获得效果。
[实施例9]
在37℃下，使HeLa细胞及BJ细胞感染DGFP、SeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔF(PmiR143T2)，第2天利用荧光显微镜进行了观察。PmiR143T2的P基因添加有miR-143的目标序列重复两次的miR143T。结果，在HeLa细胞中，观察到DGFP、PmiR143T2的荧光，而在BJ细胞中，与DGFP相比，观察到PmiR143T2的荧光降低(图9B)。BJ细胞用作未癌变的正常细胞的模型，这表明向P基因添加在正常细胞中表达的miR-143的目标序列而得到的PmiR143T2也显示出表达抑制效果，且可以通过在正常细胞和癌细胞中表达不同的微RNA对载体进行调控。
[实施例10]
在37℃下，使HeLa细胞及大鼠肝细胞感染DGFP、SeV18+DGFP/PmiR122T2-TSΔF(PmiR122T2)，第1天利用荧光显微镜进行了观察。PmiR122T2的P基因添加了miR-122的目标序列重复两次的miR122T2。结果，在HeLa细胞中，观察到DGFP、PmiR122T2的荧光，而在肝细胞中，与DGFP相比，观察到PmiR122T2的荧光降低(图9C)。这表明向P基因添加在内胚层系统的肝细胞中表达的miR-122的目标序列而得到的PmiR122T2也显示出表达抑制效果，且可以通过在分化细胞中分别进行细胞特异性表达的微RNA对载体进行调控。
[实施例11]
在35℃下，使HeLa细胞及SH-SY5Y细胞感染DGFP、SeV18+DGFP/PmiR218T2-TSΔF(PmiR218T2)，第1天利用荧光显微镜进行了观察。PmiR218T2的P基因添加有miR-218的目标序列重复两次的miR218T2。结果，在HeLa细胞中，观察到DGFP、PmiR218T2的荧光，而在SH-SY5Y细胞中，与DGFP相比，观察到PmiR218T2的荧光降低(图9D)。来自神经母细胞瘤的SH-SY5Y细胞用作神经细胞模型，这表明向P基因添加有在外胚层系统的神经细胞中表达的miR-218的目标序列而得到的PmiR218T2也显示出表达抑制效果，且可以通过在分化细胞中分别进行细胞特异性表达的微RNA对载体进行调控。
[实施例12]
在35℃下，使SH-SY5Y细胞及在10μM视黄酸(RA)、10％FBS、DMEM/F12下进行3天神经分化的SH-SY5Y细胞感染DGFP、SeV18+DGFP/PmiR124T2-TSΔF(PmiR124T2)，SeV18+DGFP/PmiR138T2-TSΔF(PmiR138T2)，第3天利用荧光显微镜进行了观察。神经分化细胞在感染的同时，与10μM RA、2％FBS、DMEM/F12进行培养基交换，第二天，与10ng/mL BDNF、无血清的DMEM/F12进行培养基交换。PmiR124T2及PmiR138T2的P基因添加有miR-124、miR-138的目标序列重复两次的miR124T2、及miR138T2。结果，在未分化的SH-SY5Y细胞中，观察到DGFP、PmiR124T2、PmiR138T2的荧光，在神经分化后的SH-SY5Y细胞中，与DGFP相比，观察到PmiR124T2及PmiR138T2的荧光降低(图10)。这表明向P基因添加在分化后的神经细胞中表达的miR-124及miR-138的目标序列而得到的PmiR124T2、PmiR138T2也显示出表达抑制效果，且可以通过在分化阶段不同的细胞中分别进行细胞特异性表达的微RNA对载体进行调控。PmiR218T2为未分化的神经细胞模型，PmiR124T2及PmiR138T2在分化后的神经细胞模型中显示出表达抑制效果。
[实施例13]
在37℃下，使HeLa细胞及iPS细胞感染DGFP、SeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔF(PmiR367T1)、SeV18+DGFP/miR367T1-P-TSΔF(miR367T1-P)、SeV18+DGFP/miR367T1-NP-TSΔF(miR367T1-NP)、SeV18+DGFP/miR367T1-L-TSΔF(miR367T1-L)，第5天利用荧光显微镜进行了观察。结果，miR367T1-L未显示出细胞特异性表达抑制效果。在HeLa细胞中，观察到DGFP、miR367T1-NP、miR367T1-P、PmiR367T1的相同程度的荧光，在iPS细胞中，miR367T1-NP、miR367T1-P及PmiR367T1的表达被抑制(图11)。在iPS细胞中，向L基因的5’侧添加微RNA目标序列时，P基因的情况不同，可能不显示细胞特异性的表达抑制效果。向P基因的5’侧添加miR-367目标序列时，与3’侧相比，显示出较弱的表达抑制效果。
[实施例14]
在37℃下，使HeLa细胞及iPS细胞感染DGFP、PmiR367T1、PmiR367T2、SeV18+DGFP/PmiR367T2m1-TSΔF(PmiR367T2m1)、SeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔF(PmiR367T2m2)、SeV18+DGFP/PmiR367T2m3-TSΔF(PmiR367T2m3)SeV18+DGFP/PmiR367T2m4-TSΔF(PmiR367T2m4)，第1天～第5天利用荧光显微镜进行了观察(图12)。结果，在第5天的HeLa细胞中显示出相同程度的荧光表达，而在iPS细胞中，以PmiR367T2>PmiR367T2m1>PmiR367T1>PmiR367T2m2>PmiR367T2m3>PmiR367T2m4的顺序显示出细胞特异性的表达抑制效果(图13，14)。在iPS细胞中，与PmiR367T2相比，导入一个碱基突变的PmiR367T2m1的表达抑制效果稍微衰减。在iPS细胞中，导入2个碱基以上的突变的PmiR367T2m2、PmiR367T2m3及PmiR367T2m4在第2天表达提高，之后在第5天显示出表达抑制效果。这表明除微RNA目标序列的重复数量之外，通过向目标序列导入一个以上的突变也可以对表达抑制程度进行调控。
[实施例15]
在37℃下，使iPS细胞感染DGFP、PmiR367T2或者DGFP和PmiR367T2(共感染)，第3天利用荧光显微镜进行了观察。结果，在HeLa细胞中，观察到相同程度的荧光表达，而在iPS细胞中，观察到通过与DGFP共感染的PmiR367T2抑制表达(图15)。这表明与微RNA目标序列搭载载体共感染的载体的表达也可以进行调控。
[实施例16]
在37℃下，使HeLa细胞及iPS细胞感染DGFP及SeV18+DGFP(HNL)HSV-TK/PmiR302T4-TSΔF(HSV-TK/PmiR302T4)，第1天利用荧光显微镜进行了观察。接着，第2天向这些细胞添加25～100μg/mL更昔洛韦(GCV)，第5天，利用荧光显微镜进了观察。结果，在第1天的iPS细胞中，观察到HSV-TK/PmiR302T4的细胞特异性的表达抑制(图16A)。在添加有GCV的第5天的HeLa细胞中，DGFP感染细胞在100μg/mL的GCV的情况也未观察到影响，而感染HSV-TK/PmiR302T4的细胞在25μg/mLGCV下全部死亡(图16B)。这表明未通过微RNA除去载体的细胞也可以通过组合使用自杀基因而除去。
[实施例17]
在37℃下，使BJ细胞及PC-3细胞感染SeV(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)(BioKnife)、SeV(PF)DGFP/TSΔM-PmiR143T2Fct14(uPA#2)(BioKnife/PmiR143T2)，第2天利用显微镜及荧光显微镜进行了观察。接着，使用Cell Counting Kit-8(DOJINDOLABORATORIES)测定第3天的细胞毒性。结果，在感染BioKnife及BioKnife/PmiR143T2的PC-3细胞中，观察到细胞融合和细胞溶解(图17A及B)。BJ细胞在第3天通过BioKnife感染观察到细胞毒性。与此相对，在感染BioKnife/PmiR143T2之后的BJ细胞中，不仅荧光表达，细胞毒性也被抑制(图17B～D)。这表明可以通过微RNA目标序列提高对癌症细胞的表达选择性，抑制对正常细胞影响，同时破坏癌症细胞。
[实施例18]
在37℃下，使BJ细胞感染SeV18+KLF4/TSΔF(KLF4)、以及SeV(PM)KOS/TS12ΔF(KOS)及SeV18+DGFP(HNL)cMYC/TS15ΔF(cMYC)的组合，或者使用SeV18+KLF4/PmiR367T1-TSΔF(KLF4-PmiR367T1)、SeV18+KLF4/PmiR367T2-TSΔF(KLF4-PmiR367T2)、SeV18+KLF4/PmiR367T2m2-TSΔF(KLF4-PmiR367T2m2)、SeV18+KLF4/PmiR302T2-TSΔF(KLF4-PmiR302T2)中的一种代替KLF4(WO2015/046229)，从而制备iPS细胞。第6天接种在基质凝胶上，第21天进行碱性磷酸酶(ALP)染色，并利用荧光显微镜随时间进行观察。结果，第21天得到ALP阳性的iPS细胞(图18)。通过比较KLF4、KLF4-PmiR367T1、KLF4-PmiR367T2、KLF4-PmiR367T2m2可知，第2天的荧光表达为相同程度，第21天荧光表达降低最大的为KLF4-PmiR367T2(图19A)。比较KLF4、KLF4-PmiR367T2、KLF4-PmiR302T2可知，与KLF4相比，第21天的KLF4-PmiR367T2及KLF4-PmiR302T2的荧光为20％以下(图19B)。第35天比较KLF4和KLF4-PmiR302T2发现，KLF4-PmiR302T2为KLF4的荧光信号的1/84。这表明通过向iPS细胞制备用的载体搭载微RNA目标序列，利用在细胞初始化时进行表达的微RNA促进载体除去。
[实施例19]
在35℃或者37℃下，使HeLa细胞及iPS细胞感染DGFP、SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔF(cMYC/PsPmiR367T2)、SeV18+DGFP(HNL)cMYC/Pd2sPmiR367T2-TS15ΔF(cMYC/Pd2sPmiR367T2)SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PddsPmiR367T2-TS15ΔF(cMYC/PddsPmiR367T2)或者SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PtetRsPmiR367T2-TS15ΔF(cMYC/PtetRsPmiR367T2)(载体结构如图20A所示)，第1天～第3天利用荧光显微镜进行了观察。结果，在第3天的iPS细胞中，在35℃下感染的cMYC/PsPmiR367T2显示出充分的表达，而35℃下感染的cMYC/PsPmiR367T2观察到表达抑制(图20B)。在37℃下感染添加有降解决定子(degron)的载体cMYC/Pd2sPmiR367T2、cMYC/PddsPmiR367T2或者cMYC/PtetRsPmiR367T2时，在未表达特异性微RNA的HeLa细胞中观察到充分的表达，而在特异性表达微RNA的iPS细胞中，观察到快速除去(图21)。这表明这是搭载两个P基因，且可以对一个基因进行温度调控或者降解决定子(degron)调控，通过微RNA目标序列对另一个基因进行调控的载体。通常，TS15骨架的载体在37℃下感染之后，未获得充分的表达，通过采用可以在37℃下同时对所搭载的P基因进行表达的序列(TS骨架的P蛋白)，可以获得如下系统，该系统可以在37℃下进行感染，通过随感染后的细胞修饰表达得到提高的微RNA，使TS骨架的P基因灭活，通过添加有降解决定子(degron)的另一个P蛋白而除去载体。
[实施例20]
在37℃下，使BJ细胞感染KOS及cMYC的组合或利用cMYC/PsPmiR367T2或cMYC/Pd2sPmiR367T2中的一个代替cMYC，从而制备iPS细胞。Day6接种在饲养细胞(小鼠成纤维细胞细胞)上，第21天进行ALP染色，并利用荧光显微镜随时间进行观察。结果，第2天未观察到KOS及cMYC的组合的荧光表达，但观察到cMYC/PsPmiR367T2或者cMYC/Pd2sPmiR367T2的荧光表达(图22A)。第21天得到ALP阳性的iPS细胞(图22B)。通过KOS及cMYC的组合，未得到iPS细胞，而通过搭载有两个P基因的载体，获得了iPS细胞。并且，第21天，与cMYC/PsPmiR367T2相比，观察到添加有降解决定子(degron)的cMYC/Pd2sPmiR367T2的荧光表达降低(图22C)。这表明通过使用搭载两个P基因的载体，可以获得能够在37℃下进行感染并在得到目标细胞之后除去载体的系统。
工业实用性
根据本发明，可以依赖于微RNA的表达来调控载体的表达及除去。本发明的载体可以用于在分化诱导细胞及制备iPS细胞时，实现目标之后快速降低载体的表达，并除去载体。另外，若使用在肿瘤细胞中通过特异性微RNA表达得到提高的载体，在将肿瘤作为靶导入载体时，可以在肿瘤中使载体更为特异性地进表达并增殖。
序列表
<110> 株式会社爱迪药业
<120> 经过改良的副粘病毒载体
<130> D4-A1501P
<150> JP 2015-223133
<151> 2015-11-13
<160> 118
<170> PatentIn version 3.5
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<212> RNA
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<223> 人工制造 序列
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<212> RNA
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<212> RNA
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agtatggtac ctctagaata t 81
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tgttttggtg agagctcata t 81
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<213> 人工制造
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<213> 人工制造
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<223> 人工制造序列
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<213> 人工制造
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<223> 人工制造序列
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<212> DNA
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<213> 人工制造
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<223> 人工制造序列
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<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 39
gagtaataat gcgtaatcca ccaagcttct attatctagt tggtcagtga ctc 53
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<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
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taataatgcg taatccacc 79
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<212> DNA
<213> 人工制造
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<212> DNA
<213> 人工制造
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<213> 人工制造
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 44
caagtacctt ggcgcgccgt atgatcc 27
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 45
caactagatc ctgcaggagg catcctac 28
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 46
gtaggatgcc tcctgcagga tctagttg 28
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 47
atatggatcc gtacgatcgc agtccaccat 30
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 48
atatctcgag cagctagctc aactga 26
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 49
gtgaatggga ggccggccat aggtc 25
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 50
gacctatggc cggcctccca ttcac 25
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工制造序列
<400> 51
tcaccattgc taaagtgcaa tt 22
<210> 52
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工制造序列
<400> 52
tcaccattgc taaagtgcaa ttcgattcac cattgctaaa gtgcaatt 48
<210> 53
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工制造序列
<400> 53
tcaccattga taaagtgcaa ttcgattcac cattgataaa gtgcaatt 48
<210> 54
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工制造序列
<400> 54
tcaccattaa taaagtgcaa ttcgattcac cattaataaa gtgcaatt 48
<210> 55
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工制造序列
<400> 55
tcaccattaa gaaagtgcaa ttcgattcac cattaagaaa gtgcaatt 48
<210> 56
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工制造序列
<400> 56
tcaccattaa gtaagtgcaa ttcgattcac cattaagtaa gtgcaatt 48
<210> 57
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 57
agccatggct tcccgccgga ggtggaggag caggatgatg gcacgctgcc catgtcttgt 60
gcccaggaga gcgggatgga ccgtcaccct gcagcctgtg cttctgctag gatcaatgtg 120
<210> 58
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 58
Ser His Gly Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Asp Asp Gly Thr Leu
1 5 10 15
Pro Met Ser Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala
20 25 30
Cys Ala Ser Ala Arg Ile Asn Val
35 40
<210> 59
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 59
Ser His Gly Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Asp Asp Gly Ala Leu
1 5 10 15
Pro Met Ser Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala
20 25 30
Cys Ala Ser Ala Arg Ile Asn Val
35 40
<210> 60
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 60
Ser His Gly Phe Pro Pro Ala Val Ala Ala Gln Asp Asp Gly Thr Leu
1 5 10 15
Pro Met Ser Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala
20 25 30
Cys Ala Ser Ala Arg Ile Asn Val
35 40
<210> 61
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 61
ggagtgcagg tggaaaccat ctccccagga gacgggcgca ccttccccaa gcgcggccag 60
acctgcgtgg tgcactacac cgggatgctt gaagatggaa agaaatttga ttcctcccgg 120
gacagaaaca agccctttaa gtttatgcta ggcaagcagg aggtgatccg aggctgggaa 180
gaaggggttg cccagatgag tgtgggtcag agagccaaac tgactatatc tccagattat 240
gcctatggtg ccactgggca cccaggcatc atcccaccac atgccactct cgtcttcgat 300
gtggagcttc taaaactgga a 321
<210> 62
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 62
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Pro Glu
100 105
<210> 63
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 63
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 64
<211> 497
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 64
gcggccgcgc caccatgatc agtctgattg cggcgttagc ggtagatctc gttatcggca 60
tggaaaacgc catgccgtgg aacctgcctg ccgatctcgc ctggtttaaa cgcaacacct 120
taaataaacc cgtgattatg ggccgccata cctgggaatc aatcggtcgt ccgttgccag 180
gacgcaagaa tattatcctc agcagtcaac cgagtacgga cgatcgcgta acgtgggtga 240
agtcggtgga tgaagccatc gcggcgtgtg gtgacgtacc agaaatcatg gtgattggcg 300
gcggtcgcgt tattgaacag ttcttgccaa aagcgcagaa actgtatctg acgcatatcg 360
acgcagaagt ggaaggcgac actcatttcc cggattacga gccggatgac tgggaatcgg 420
tattcagcga gttccacgat gctgatgcgc agaactctca cagctattgc tttgagattc 480
tggagcggcg actcgag 497
<210> 65
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 65
Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met
1 5 10 15
Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys
20 25 30
Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu
35 40 45
Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser
50 55 60
Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu
65 70 75 80
Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly
85 90 95
Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu
100 105 110
Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr
115 120 125
Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp
130 135 140
Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Cys Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg
145 150 155
<210> 66
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 66
Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Leu Val Ile Gly Met
1 5 10 15
Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys
20 25 30
Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu
35 40 45
Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser
50 55 60
Gln Pro Ser Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu
65 70 75 80
Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly
85 90 95
Gly Arg Val Ile Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu
100 105 110
Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr
115 120 125
Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp
130 135 140
Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Cys Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg
145 150 155
<210> 67
<211> 621
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 67
atgtctaggc tggacaagag taaggtgatt aacagcgcac tggagctgct taatgaggtc 60
ggaatcgaag gtttgacaac ccagaaactc gcccagaagc tgggtgtgga gcagcctaca 120
ttgtattggc atgtgaagaa taagcgggct ttgctcgacg ccttggccat tgagatgttg 180
gataggcacc atactcactt ttgccctttg gaaggggaaa gctggcaaga cttcttgcgc 240
aataacgcta agagttttag atgtgctttg ctgagtcatc gcaatggagc aaaggtgcat 300
tctgacacac ggcctacaga gaagcagtat gaaactctgg agaatcaatt ggccttcttg 360
tgccaacaag gtttctcact ggagaatgca ttgtatgcac tcagcgctgt gggacatttt 420
actttgggtt gcgtgttgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480
cctactactg atagtatgcc gcccttgttg cggcaagcta tcgaattgtt tgatcaccaa 540
ggtgcagagc cagccttctt gttcggcctt gaattgatca tctgcggatt ggagaaacaa 600
cttaaatgtg aaagtgggtc t 621
<210> 68
<211> 207
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 68
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser
195 200 205
<210> 69
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 69
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 15
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Gln Lys Leu Ala Gln
20 25 30
Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His
50 55 60
Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg
65 70 75 80
Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asn Gly
85 90 95
Ala Lys Val His Ser Asp Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr
100 105 110
Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu
115 120 125
Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr
145 150 155 160
Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu
165 170 175
Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser
195 200 205
<210> 70
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 70
cgacatttga gcgtaatcca ccaagcttct attatctagt tggtcagtga ctc 53
<210> 71
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 71
atatcctgca ggctctcgac tgaaagtgct gcgacatttg agcgtacgaa agtgctgcga 60
catttgagcg taatccacc 79
<210> 72
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 72
gcactgtagc tcataatcca ccaagcttct attatctagt tggtcagtga ctc 53
<210> 73
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 73
atatcctgca ggctctcgac tgtgagatga agcactgtag ctcaatcgtg agatgaagca 60
ctgtagctca taatccacc 79
<210> 74
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 74
caatggtgtt tgtaatccac caagcttcta ttatctagtt ggtcagtgac tc 52
<210> 75
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 75
atatcctgca ggctctcgac tgtggagtgt gacaatggtg tttgatcgtg gagtgtgaca 60
atggtgtttg taatccacc 79
<210> 76
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 76
gatctaacca tgtgtaatcc accaagcttc tattatctag ttggtcagtg actc 54
<210> 77
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 77
atatcctgca ggctctcgac tgttgtgctt gatctaacca tgtgatcgtt gtgcttgatc 60
taaccatgtg taatccacc 79
<210> 78
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 78
cggtgaatgc caataatcca ccaagcttct attatctagt tggtcagtga ctc 53
<210> 79
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 79
atatcctgca ggctctcgac tgtaaggcac gcggtgaatg ccaaatcgta aggcacgcgg 60
tgaatgccaa taatcc 76
<210> 80
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 80
gtgaatcagg ccgtaatcca ccaagcttct attatctagt tggtcagtga ctc 53
<210> 81
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 81
atatcctgca ggctctcgac tagctggtgt tgtgaatcag gccgatcagc tggtgttgtg 60
aatcaggccg taatccacc 79
<210> 82
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 82
atatcctgca ggctatcgaa ttgcacttta gcaatggtga taatccacca agcttctatt 60
atctagttgg tcagtgactc 80
<210> 83
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 83
agagaacaag actaaggcta ccaggtttga cc 32
<210> 84
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 84
aggcgatcgc tctttcaccc taagtttttc 30
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 85
gaaagagcga tcgcctaaca cggcgcaatg 30
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 86
tttgggatct tggctatggt gat 23
<210> 87
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 87
atatgcggcc gcatcaccat tgctaaagtg caattcagat cttcacgatg gccgggttgt 60
tgagc 65
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 88
cgtcttgtct gaacgcctct aac 23
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 89
gccttgcgat cgccgatcgg tggatgaact 30
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 90
ccgatcggcg atcgcaaggc cacacccaac 30
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 91
cagagtttgt accagttctt cccc 24
<210> 92
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 92
atatggcgcg ccaaggtact tgatccgtag 30
<210> 93
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 93
atatgcgatc gcgaattgca ctttagcaat ggtgatcgat cggtggatga actttc 56
<210> 94
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 94
atatggccgg ccatcaccat tgctaaagtg caattcatag gtcatggatg ggcaggagtc 60
c 61
<210> 95
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 95
gaatatttat cgaaggttca gaggtgtg 28
<210> 96
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 96
atatcctgca ggctctcgac tgaattgcac tttatcaatg gtgaatcgaa ttgcacttta 60
tcaatggtga taatccacca 80
<210> 97
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 97
atatcctgca ggctctcgac tgaattgcac tttattaatg gtgaatcgaa ttgcacttta 60
ttaatggtga taatccacca 80
<210> 98
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 98
atatcctgca ggctctcgac tgaattgcac tttcttaatg gtgaatcgaa ttgcactttc 60
ttaatggtga taatccacca 80
<210> 99
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 99
atatcctgca ggctctcgac tgaattgcac ttacttaatg gtgaatcgaa ttgcacttac 60
ttaatggtga taatccacca 80
<210> 100
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 100
atatgcggcc gcgacgtcac catggcttct taccctggac 40
<210> 101
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 101
atatgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggttag ttggcctctc 60
ccatctccc 69
<210> 102
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 102
atatgcgatc gcaaacatga cagcatatat ccagagatca cag 43
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 103
caatttaaat tcatcttttc tcagccattg 30
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 104
gaaaagatga atttaaattg tgcacccatc 30
<210> 105
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 105
atatttaatt aaccaagcac tcacaaggg 29
<210> 106
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 106
gtgcacattt aaattcatct tttctcagcc 30
<210> 107
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 107
atgaatttaa atgtgcaccc atcagagacc 30
<210> 108
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 108
atatgcgatc gccaccatga cagcatatat 30
<210> 109
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 109
atatatttaa attcagcggt catctggatt 30
<210> 110
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 110
atatgcgatc gcgacatgac tgccctgacc gaaggtgc 38
<210> 111
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 111
atatgcgatc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggttac tgataggtat 60
cgagatcg 68
<210> 112
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 112
attggcgcgc caaggtactt gatccgtag 29
<210> 113
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 113
aatcctgcag gatctagttg gtcagtgac 29
<210> 114
<211> 1750
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 114
gcggccgcgc caccatggat caagacgcct tcatcctcaa agaagactcc gaggtggaga 60
gagaggctcc tggcggcaga gagagcctga gcgacgtcat cggcttcctg gacgccgtgc 120
tgtccagcga gcctacagac attggcggcg ataggagctg gctgcacaat accattaaca 180
ccccccaggg ccccggatcc gctcacagag ctaagtccga gggcgaggga gaagtgagca 240
caccctccac ccaggacaac aggagcggcg aggaaagcag ggtgtccggc agaacaagca 300
agcctgaggc tgaggcccac gccggcaacc tggataagca gaatatccac agggccttcg 360
gcggcagaac cggcaccaac tccgtgtccc aggatctggg agacggaggc gacagcggaa 420
tcctggagaa cccccctaat gagagaggct accccaggag cggcatcgag gacgagaaca 480
gggagatggc cgcccacccc gacaagagag gcgaggacca ggctgagggc ctgcctgagg 540
aagtcagagg cagcacctcc ctccctgatg aaggcgaggg cggagccagc aataacggca 600
gatccatgga gcctggctcc tcccacagcg ccagagtcac cggagtgctg gtgattccct 660
cccctgagct ggaggaggct gtgctgagga ggaacaaaag aagacccacc aactccggaa 720
gcaagcctct gacccccgct acagtgcctg gcacaaggag cccccctctg aataggtaca 780
atagcacagg cagccccccc ggaaaacccc ctagcaccca ggacgagcac atcaacagcg 840
gcgacacacc cgctgtgagg gtgaaggaca gaaagccccc cattggcacc aggagcgtga 900
gcgactgtcc tgccaacggc aggcctatcc accctggcct ggagacagac agcaccaaaa 960
agggcatcgg cgagaacacc tcctccatga aggagatggc caccctgctc acaagcctgg 1020
gagtgatcca gagcgcccaa gagttcgaat cctccagaga cgccagctat gtgtttgcta 1080
ggagggccct gaagtccgcc aactacgccg agatgacctt taatgtctgc ggcctcatcc 1140
tgagcgctga gaagagcagc gccaggaaag tggacgagaa caagcagctg ctcaagcaga 1200
ttcaggaaag cgtcgagagc ttcagggaca tctataagag gttcagcgag taccagaaag 1260
agcagaactc cctgctgatg agcaacctca gcaccctgca catcatcacc gacagaggcg 1320
gcaagaccga taacaccgac agcctgacaa gatccccctc cgtgttcgcc aagtccaagg 1380
agaacaagac caaagccaca aggtttgacc ctagcatgga gaccctggag gatatgaagt 1440
acaagcccga cctcatcagg gaggacgagt ttagagacga aatcaggaat cccgtgtacc 1500
aagagaggga taccgagcct agagcctcca acgccagcag actgctgcct tccaaggaga 1560
aacccacaat gcactccctc agactggtga ttgagagctc ccctctgagc agggccgaaa 1620
aggtggccta tgtcaagtcc ctgtccaagt gcaagaccga tcaggaggtg aaggctgtga 1680
tggagctggt ggaggaggac atcgaaagcc tgaccaattg atagggtacc taatgactcg 1740
aggcggccgc 1750
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 115
gcgatcgcgc caccatggat caagacgcct 30
<210> 116
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 116
aatggtgata atccaccaag cttctatcta tcaattggtc aggc 44
<210> 117
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 117
tcttactcga ctgaattgca ctttagcaat ggtgaatcga attgcacttt agcaatggtg 60
ataatccacc 70
<210> 118
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工制造
<220>
<223> 人工制造序列
<400> 118
gcgatcgcga actttcaccc taagtttttc ttactcgact gaattgcact t 51

Claims (14)

1.一种来自仙台病毒Z株的修饰的仙台病毒载体，其搭载两个以上的P基因，
其中该载体搭载编码P蛋白的P基因，其中该P蛋白为温度敏感性和/或添加有降解决定子(degron)，并且
其中该载体搭载另一个P基因，其中其编码区或5’或3’非编码区添加有微RNA目标序列。
2.一种调控载体的表达量和/或除去的方法，其中该方法的特征在于：使用权利要求1所述的载体，并且该载体搭载有：编码温度敏感性和/或添加有降解决定子(degron)的P蛋白的至少一个P基因，和其编码区或5’或3’非编码区添加有微RNA目标序列的至少一个P基因，其中该方法不是用于治疗疾病的方法。
3.一种来自仙台病毒Z株的修饰的仙台病毒载体，其中对该病毒的L基因进行了修饰，使得L基因的3’-非编码区添加有miR-302簇的目标序列，其中，在表达该微RNA的细胞中，该载体的表达被正调控。
4.根据权利要求3所述的载体，其中，至少一个包膜蛋白质基因发生缺陷。
5.根据权利要求3或4所述的载体，其中该载体包含温度敏感性突变。
6.根据权利要求5所述的载体，其中，该温度敏感性突变包含P蛋白的L511F突变。
7.根据权利要求5或6所述的载体，其中，该温度敏感性突变包含P蛋白的D433A、R434A及K437A。
8.根据权利要求3～7中任一项所述的载体，其搭载转录因子基因或自杀基因。
9.一种权利要求3～8中任一项所述的载体的制造方法，其包括如下工序：
使编码该载体的基因组RNA或其互补链的核酸与均未添加微RNA目标序列的NP基因、P基因及L基因共同表达。
10.一种调控搭载基因的表达量的方法，其中该方法的特征在于：使用权利要求3～8中任一项所述的载体，其中该方法不是用于治疗疾病的方法。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，搭载基因编码转录因子。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，该搭载基因编码诱导多能干细胞的重编程因子。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，搭载基因为自杀基因。
14.根据权利要求10或13所述的方法，其用于溶解肿瘤细胞。
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Sequence of Events in Measles Virus Replication: Role of Phosphoprotein-Nucleocapsid Interactions;Joanna Brunel等;《Journal of Virology》;20140930;第88卷(第18期);第10857页右栏第2段，图6 *

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