KR20050062634A - Ｔ 세포에 유전자를 도입하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 파라믹소바이러스 벡터와 활성화한 T 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는, T 세포에 유전자를 도입하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 외래 유전자가 도입된 T 세포의 제조방법으로서, 파라믹소바이러스 벡터와 활성화한 T 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 이 방법에 의해 제조된, 외래 유전자가 도입된 T 세포를 제공한다. 본 발명에 의해 효율적인 활성화 T 세포 특이적인 유전자 송달이 가능해지고, T 세포를 지향한 유전자 송달에 의한 면역학적인 개변전략으로의 적용이 기대된다.

Description

Ｔ 세포에 유전자를 도입하는 방법{Method of transferring gene into T cells}

본 발명은 T 세포에 유전자를 도입하는 방법에 관한 것이다.

조혈세포의 유전적 개변은, 자기면역질환, 면역부전, 나아가서는 항종양면역의 활성화를 매개로 한 종양에 대한 치료의 매력적 전략이다. 다양한 혈액세포 중에서도 T 림프구는, 아데노신 데아미나아제(adenosine deaminase; ADA) 결손증에 의한 중증복합형 면역부전(ADA-SCID)에 대한 유전자치료의 초기단계부터 유전자 송달 표적의 하나로 되어 왔다(Blaese, R.M. et al., Science, 1995, 270: 475-480; Altenschmidt, U. et al., J. Mol. Med., 1997, 75: 259-266; Misaki, Y. et al., Mol. Ther., 2001, 3: 24-27). 그러나, 레트로바이러스(retrovirus) 등의 현재 사용 가능한 벡터에 의한 유전자 송달에 대해서, T 세포는 비교적 저항성을 나타내는 것이, 현재의 장벽으로 되어 있다.

자기면역질환, 이식 후의 알로(allo)기관거절, 또는 종양 등의 치료에 있어서의 임상 장면을 생각하면, 활성화 T 림프구의 서브세트는 유전적 개변의 표적으로서 이상적임에 틀림없다(Altenschmidt, U. et al., J. Mol. Med., 1997, 75: 259-266; Hege, K. M. and Roberts, M.R., Curr. Opin. Biotechnol., 1996, 7: 629-634; Tuohy, V.K. et al., J. Neuroimmunol., 2000, 107: 226-232). 유전자 마킹에 관한 초기의 임상보고에 의해, 종양항원에 의해 활성화되는 종양침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocytes; TILs)가 종양을 갖는 개체 내에 있어서 종양으로 이동하는 것이 실증되었기 때문에, TILs는 치료 유전자를 종양으로 이동시키는 이상적인 담체 비히클(vehicle)인 것이 시사된다(Rosenberg, S.A. et al., N. Engl. J. Med., 1990, 323: 570-578). 활성화 림프구의 유사한 특징은, 자기면역 및 기관이식에 있어서도 기대되기는 하지만, 그 연구는 최근 10년 거의 이루어지고 있지 않고, 그것은 현재 벡터의 활성화 T 세포로의 유전자 송달의 효율이 낮은 것이 원인으로 예상된다.

최근에는, 새로 등장한 T 림프구로의 유전자 송달 비히클, 즉 인간 면역부전 바이러스(HIV)를 베이스로 하는 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)에 많은 주목이 모아지고 있지만, 이것은 HIV가 CD4 림프구에 지향한 트로피즘(tropism)을 갖기 때문이다. 최근 노력의 결과, 벡터 게놈의 핵으로의 임포트(import) 및 염색체로의 인테그레이션(integration)을 촉진하는 센트럴 DNA 플랩(flap)을 구축하는 것을 매개로 하여, HIV의 활성화 T 세포로의 유전자 송달효율은 비약적으로 향상되었다(종래의 HIV 벡터에서는 평균 15%에 대해서, 이 벡터에서는 평균 51%)(Dardalhon, V. et al., Gene Ther., 2001, 8: 190-198). 그러나, 특히 HIV를 포함하는 병원성 바이러스를 베이스로 한 렌티바이러스의 경우에는, 잠재적인 안전성에 관한 관심이 임상적용을 늦추고 있다(Buchschacher, G.L. Jr. and Wong-Staal, F., Blood 2000, 95: 2499-2504). 보다 효율적으로 유전자 송달이 가능하고, 보다 안전한 다른 선택지를 개발하는 노력을 계속하는 것이 필요한 것은 명백하다.

발명의 개시

T 세포로 효율적으로 유전자 도입이 가능한 벡터를 찾아내기 위해, T 세포에 대해 여러가지의 조건으로 벡터의 도입을 행하고, 유전자 도입효율을 측정하였다. 그 결과, 본 발명자 등은, 파라믹소바이러스 벡터(paramyxovirus vector)가 항원활성화 T 세포에 대해 높은 유전자 도입효율을 나타내는 것을 발견하였다. 유전자 도입은 활성화 T 세포에 특이적, 즉 벡터의 유전자 도입효율은 나이브 T 세포(naive t cell)와 비교하여 활성화 T 세포에 대해 현저하게 높았다. 파라믹소바이러스 벡터는, 항원활성화 T 세포로의 유전자 도입을 위한 벡터로서 적합하게 사용된다.

T 림프구를 지향한 유전자치료는, 다양한 면역학적 질환에 대한 치료의 가능성을 갖고 있지만, 지금가지의 T 세포의 유전자치료에 있어서는, 복잡한 조작을 행하는데도 불구하고 유전자 도입(유전자 형질도입(gene transduction))의 효율이 낮은 것이 큰 제약으로 되어 있었다. 본 발명에 의해, 파라믹소바이러스 벡터는, 매우 단순한 절차로 활성화 T 세포에 특이적으로 외래 유전자를 발현할 수 있는 것이 실증되어, T 세포의 유전자치료에 있어서의 상기 문제를 극복하는 것이 가능해졌다. 본 발명에 의해, 활성화 T 세포 특이적인 유전자 송달을 효율적으로 실시하는 것이 가능해져, 면역질환에 있어서의 T 세포를 지향한 유전자 송달에 의한 개변전략으로의 적용이 기대된다.

즉 본 발명은, T 세포에 유전자를 도입하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는,

(1) T 세포에 유전자를 도입하는 방법으로서, 상기 유전자를 보유하는 파라믹소바이러스 벡터와 활성화된 T 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법,

(2) (1)에 있어서, 파라믹소바이러스 벡터가 센다이 바이러스 벡터(Sendai virus vector)인 방법,

(3) 외래 유전자가 도입된 T 세포의 제조방법으로서, 상기 유전자를 보유하는 파라믹소바이러스 벡터와 활성화된 T 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법,

(4) (3)에 있어서, 파라믹소바이러스 벡터가 센다이 바이러스 벡터인 방법,

(5) (3) 또는 (4)의 방법에 의해 제조된, 외래 유전자가 도입된 T 세포,

(6) 활성화 T 세포로의 유전자 송달을 위해 사용하는, 파라믹소바이러스 벡터,

(7) (6)에 있어서, 파라믹소바이러스 벡터가 센다이 바이러스 벡터인 벡터에 관한 것이다.

본 발명은, 파라믹소바이러스 벡터를 사용하는 T 세포로의 유전자 도입방법을 제공한다. 이 방법은, 도입하고자 하는 유전자를 보유하는 파라믹소바이러스 벡터를, 활성화된 T 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는 방법이다. 본 발명자 등은, 파라믹소바이러스 벡터가 매우 높은 효율로 활성화 T 세포로 유전자를 도입할 수 있는 것을 발견하였다. 나이브 T 세포에 대해서는, 파라믹소바이러스 벡터에 의한 유전자 도입효율은 낮고, 이 벡터에 의한 유전자 도입은 항원활성화 T 세포에 특이적인 것이 판명되었다. 따라서 본 발명의 방법은, 활성화 T 세포로의 선택적인 유전자 도입에 적합하게 이용할 수 있다. T 세포는 암 및 그 외 질환의 치료에 있어서 면역계를 제어하기 위한 표적으로서 중요하여, 본 발명의 방법은 이들 질환의 유전자치료에 적합하게 사용될 수 있다. 유전자 도입은 배양액, 생리식염수, 혈액, 체액 등 목적으로 하는 생리적 수용액 중에서 행할 수 있다.

또한 본 발명은, T 세포에 목적으로 하는 유전자를 도입하는 방법으로서, (a) 상기 T 세포를 활성화시키는 공정 및 (b) 상기 유전자를 보유하는 파라믹소바이러스 벡터를 활성화시킨 T 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 이 방법도, 본 발명에 있어서의 T 세포에 유전자를 도입하는 방법에 포함된다. T 세포는, 항원자극에 의해 활성화 할 수 있다. T 세포를 활성화시키는 공정은, 파라믹소바이러스 벡터에 의한 효율적인 유전자 도입을 가능하게 한다. T 세포의 활성화는, 파라믹소바이러스 벡터를 이 T 세포에 접촉시키기 전에 행해도 되고, 파라믹소바이러스 벡터의 존재하에서 행해도 된다.

단순한 기술에 의해 높은 효율로 유전자 송달이 일어나는 것은, 파라믹소바이러스 벡터를 매개로 한 T 세포 표적화 유전자 송달의 중요한 우위성의 하나이다. 이전에 보고되어 있는 바와 같이, 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 매개로 한 T 세포로의 유전자 송달은, 최적의 유전자 송달을 위해서는 원심으로 농축해야만 하고, 독성이 있는 약제인 폴리브렌(polybrene) 등을 필요로 한다(Bunnell, B.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1995, 92: 7739-7743; Chuck, A.S., Hum. Gene Ther., 1996, 7: 743-750; Chinnasamy, D. et al., Blood 2000, 96: 1309-1316; Fehse, B. et al., Br. J. Haematol., 1998, 102: 566-574). 한편으로 파라믹소바이러스 벡터 용액은 특별한 약제에 도움받지 않고, 단순히 첨가하는 것만으로 보다 우수한 유전자 송달을 달성할 수 있었다. 더욱이, 활성화 T 세포로의 센다이 바이러스 벡터(SeV)를 매개로 하는 최적의 유전자 송달은, 비강점막(nasal mucosa)(Yonemitsu, Y. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18: 970-973), 혈관(vasculature)(Masaki, I. et al., FASEB J., 2001, 15: 1294-1296), 망막조직(retinal tissue)(Ikeda, Y. et al., Exp. Eye Res., 2002, 75: 39-48) 등에서 보여진 대표적인 결과와 마찬가지로, 비교적 짧은 폭로(exposure)로 행할 수 있었다(30분 미만, 데이터 생략). 임상 장면을 생각하면, 파라믹소바이러스 벡터를 매개로 한 유전자 송달의 이들 특징은, 본 발명에 있어서도 T 림프구의 ex vivo에서의 유전적 개변을 단순화하여, 조작에 의존한 세포생존성의 상실을 최소화할 수 있는 것이다.

본 발명자 등은, in vitro에서 인간 림프구의 세포농도를 낮게할수록, 유전자 도입세포의 비율이 낮아지는 것을 발견하였지만, 이 결과는 마우스세포에서도 보여졌다. 따라서, 유전자 도입에 있어서는, 세포농도는 비교적 높은 것이 바람직하다. 세포농도는, 예를 들면 1×10⁶/㎖~4×10⁶/㎖, 바람직하게는 4×10⁶/㎖~8×10⁶/㎖, 바람직하게는 8×10⁶/㎖~1×10⁷/㎖ 정도로 하면 된다.

MOI는 1~500 사이로 투여하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2~300, 더욱 바람직하게는 3~200이다. 벡터와 T 세포의 접촉은 짧은 시간으로도 충분하고, 예를 들면 1분 이상, 바람직하게는 3분 이상, 5분 이상, 10분 이상, 또는 20분 이상 접촉시키면 되고, 예를 들면 1~60분 정도, 보다 특정하면 5분~30분 정도여도 된다. 물론, 그 이상의 시간 접촉시켜도 되고, 예를 들면 수일간 또는 그 이상 접촉시켜도 된다.

최근, 면역학적 시냅스(immunological synaps)를 사용하여 항CD3, 항CD28 및 4-1BB 리간드에 의해 T 세포를 자극할 수 있는 유니버설 아티피셜 항원제시세포(APC) 시스템(Maus, M.V. et al., Nat. Biotechnol., 2002, 20: 143-148)을 포함하는 몇가지 세련된 효율적인 기술에 의해, 충분한 양의 T 세포주를 보다 용이하게 조제하는 것이 가능해졌다. 그와 같은 기술을 조합시키면 SeV에 유래하는 벡터계는 다양한 면역학적 질환에 대한 T 세포 지향성의 유전자치료의 임상 적용을 위한 중요한 치료적 가능성을 가진다.

또한 본 발명은, 활성화 T 세포에 선택적으로 유전자를 도입하는 방법으로서, 상기 유전자를 보유하는 파라믹소바이러스 벡터를 활성화 T 세포 및 나이브 T 세포를 포함하는 세포집단 중에 공존시키는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 활성화 T 세포에 선택적이란, 나이브 T 세포에 비해 활성화 T 세포로 유의(有意)하게 유전자가 도입되는 것을 말한다. 예를 들면 본 발명은, 상기 유전자를 보유하는 파라믹소바이러스 벡터를, 활성화 T 세포 및 나이브 T 세포를 포함하는 세포집단 중에 첨가하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 파라믹소바이러스 벡터는, 나이브 T 세포에 비해 활성화 T 세포로 우선적으로 유전자를 도입하기 때문에, 이 방법에 의해 활성화 T 세포에 선택적으로 유전자를 도입할 수 있다. 또는, 미리 T 세포와 벡터를 공존시켜 둔 다음, 이 T 세포를 활성화시키는 처리를 행함으로써, 활성화된 T 세포에 선택적으로 벡터를 도입할 수 있다. 이들 방법도, 본 발명에 있어서의 T 세포에 유전자를 도입하는 방법에 포함된다.

T 세포는 T 림프구라고도 하고, 조직 주요 적합항원(Major Histocompatibility Complex; MHC) 위에 올려진 항원의 펩티드 복합체를 인식하는 리셉터(receptor)인 T 세포 리셉터를 발현한 림프구이다. 주로, 골수의 간세포(幹細胞)보다 분화하고, 흉선에서 양성 선택(positive selection)(자기 MHC를 인식할 수 있는 레퍼토리(repertory)의 선택), 음성 선택(negative selection)(자기항원을 인식하는 레퍼토리 배제)을 받아, 성숙 나이브 T 세포로서 말초혈액 및 림프조직에 출현한다. T 세포는 단백항원, 종양항원, 알로항원, 병원체 등으로부터 유래하는 펩티드를 인식하고, 항원 특이적인 개체의 면역응답(적응면역)을 발생시키는 주된 림프구로 펩티드에 대한 항체생산을 원조(액성면역), 또는 그 자신이 무장화(武裝化) T 세포가 되어 세포성 면역을 발동한다.

활성화 T 세포란, 항원 또는 마이토젠(mitogen) 등의 자극에 의해 증식분화로 유도되는 상태가 된 T 림프구를 말한다. 즉, T 세포 리셉터의 결합, 또는 직접적인 효소활성화에 의해 세포 내 티로신 인산화 효소의 활성화, 이것에 이은 이노시톨(inositol) 인지질대사의 항진(亢進), 세포 내 칼슘농도의 상승을 거쳐, 인터루킨(IL)-2 생산, IL-2 리셉터의 발현 및 그것에 수반하는 세포 시그널에 의해 DNA 합성, 세포분열을 개시하여, 증식분화하고 있는 T 세포를 말한다. 활성화시의 생체환경에 의해 여러가지의 사이토카인(cytokine)을 생산하는 여러가지의 T 세포로 분화한다.

또한, 본 발명에 있어서 활성화 T 세포는, 바람직하게는 항원에 의해 활성화된 T 세포이다. 센다이 바이러스 벡터에 의한 도입은 항원활성화 T 세포에 선택적이고, 항원 비특이적 T 세포에는, ex vivo에 있어서 항원에 응답한 특이적 T 세포로부터 바이스텐더(bystander)에 활성화되는 경우에 있어서는 유전자 도입효율은 낮다. 따라서, T 세포를 항원에 의해 활성화함으로써, 또는 이것과 동등한 활성화를 행함으로써, 벡터에 의한 유전자 도입효율을 극적으로 향상시킬 수 있다.

항원활성화 T 세포란, 앞서 기술한 항원제시세포의 MHC와, 어떤 특정한 항원 유래의 펩티드 등과의 복합체와 적절한 친화도(affinity)가 있는 T 세포 리셉터를 가진 T 세포가, 양자의 결합을 매개로 하여 활성화 시그널을 전달한 T 세포를 말하고, 바람직하게는 CD28, 4-1BB 등의 적절한 공리셉터(co-receptor)로부터의 시그널을 전달함으로써 활성화한 T 세포이다. 항원활성화 T 세포는, 바람직하게는 증식, 아구화(blast formation), IL-2, IL-4, IFN-γ 등의 각종 사이토카인 생산, Fas Ligand, perforin 등의 세포 상해분자 발현, 및 CD40 Ligand 등의 항원제시세포 및/또는 B 세포를 활성화하는 등의 능력을 갖는다. 항원 특이적 T 세포는 림프절 등에서는 MHC와 펩티드를 제시한 항원제시세포 하에서, 항원제시세포의 활성화 및/또는 B 세포의 활성화, 항체생산자극을 행하고, 말초조직의 국소에서는 그 생산 사이토카인 및 세포 상해분자에 의한 세포 상해, 염증의 촉진 등의 작용에 의해 생체로부터 비 자기단백, 비 자기세포, 병원체의 배제에 주요한 작용을 미친다.

활성화 T 세포는, 분획(fractionation)에 의해 조제할 수 있다. 예를 들면 인간 T 세포는, 활성화에 수반하여 CD 항원의 표현벡터를 변화시킨다고 하는 특징이 있기 때문에, 이것에 의해 활성화 T 세포와 나이브 T 세포를 선별하는 것이 가능하다. 구체적 방법으로서, T 세포를 음성 선택으로 채취하고, 활성화 T 세포에 표출하는 CD45RO에 대한 항체를 사용하여, 마그네틱 비드 분리법 또는 플로우 사이토메트리(flow cytometry)에 의한 소팅(sorting)을 행함으로써, 바람직하게는 CD45RA 및 CD62L 더블 양성 T 세포는 나이브 T 세포, 그 이외는 활성화 또는 메모리 T 세포로 생각되고 있기 때문에, 양자에 대한 항체를 사용하여 마그네틱 비드 분리법 또는 플로우 사이토메트리에 의한 소팅을 행함으로써, 활성화 T 세포 또는 나이브 T 세포를 분획할 수 있다. 분획에 사용하는 항체는, 기지의 활성화 관련 마커를 조합시킨 모든 방법으로 가능하다. 또한, 케모카인 리셉터, 사이토카인 리셉터 등의 활성화 T 세포 중의 어떤 특수한 기능을 가진 포퓰레이션을 분획하는 방법도 포함된다. 분획법에 관해서는, 그 외, 비중을 사용한 방법 등 기존의 방법을 포함한다.

또한 활성화 T 세포는, 나이브 T 세포를 항원자극에 의해 활성화하여 조제하는 것도 가능하다. 예를 들면 나이브 T 세포는, 항CD3 항체(10 ㎍/㎖)와 항CD28 항체(10 ㎍/㎖)를 고착(固着)시킨 플레이트에 이하에 기술하는 농도로 배양함으로써, 바람직하게는 말초혈 단구로부터 분화시킨 성숙 수상세포(dendritic cell)를 동시에 첨가함으로써 활성화시킬 수 있다. 또한, 종양항원에 의한 활성화의 항목에서 기술하는 바와 같이, 수상세포와 펩티드, 또는 단백항원이 첨가된 배양에서도 활성화시킬 수 있다.

항원활성화 T 세포의 조제는, 예를 들면 인간 알로항원을 사용하는 경우는, 도너(donor), 레시피언트(recipient) 말초혈을 채취하고, 각각을 말초혈 림프구 분리액으로 림프구를 분리하여, 각각 1×10⁷/㎖의 농도로 조정, 도너 유래의 세포 부유액을 30 Gy의 방사선조사를 행하여 24웰의 플레이트에 각 웰에 각각 500 ㎕씩 주입하고, 인간 IL-2(5~100 U/㎖)로 약 7일간 배양함으로써 얻어진다. 계대(subcultur)는 약 7일 간격의 도너 방사선조사 림프구로 재자극함으로써 가능하다. 항원 특이적 T 세포주로서는, 적어도 3회의 항원자극(첫회를 포함하여)을 받은 것이 바람직하다. 또는, 2회의 항원자극 이후는 항CD3 항체와 항CD28 항체가 고착화된 비드 또는 세포 등을 사용하여 자극, 증식시킨 것도 항원활성화 T 세포에 포함된다.

종양 항원 등에 의한 활성화의 경우는, 4회 이상의 신속한 동결융해를 반복하여 종양세포를 용해한 용액을 말초혈로부터 분화시킨 수상세포에 첨가한 후, 방사선조사 20 Gy~30 Gy를 조사한 것을 항원제시세포로 하고, 그것에 말초혈로부터 분리한 T 세포를 IL-2(5~100 U/㎖) 단독 또는, 그 외 IL-7 등의 적합한 사이토카인의 존재 하에서 7일간 공배양, 7일 간격의 재자극을 3회 행함으로써 얻어진다(Fields, R.C. et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 1998, 95: 9482-9487). 여기에서 사용되는 수상세포는, 말초혈 단구 또는 골수, 제대혈, 동화(動化)말초혈 등의 조혈간세포로부터 GM-CSF, IL-4 등의 사이토카인을 사용하여 증식분화시키는 기지의 방법에 의해 얻어진 것 전부를 포함한다.

말초혈의 T 세포 분리는, T 세포 분리액으로의 분리여도 되고, 항원 내의 유효한 펩티드가 알려져 있다면 Class I 또는 Class II의 테트라머와 펩티드 복합체에 의한 항원 특이적 T 세포의 분리방법에 의해 얻어진 것이어도 된다.

활성화 T 세포의 조제에 관하여 이상의 것 외에, 기지의 특이적 항원이 명백한 것에 관해서, 그 항원 또는 항원 유래의 단백, 펩티드를 사용하여 T 세포를 활성화하는 방법에 의해 조제하는 것도 가능하다. 그 외, 활성화 T 세포의 작성에는, 렉틴 등을 사용한 비특이적인 활성화방법 등, 기지의 T 세포 활성화방법이 사용 가능하다. 본 발명에 있어서 항원활성화 T 세포에는, 이와 같이 하여 얻어진 세포도 포함된다.

이들 활성화된 T 세포는, 적절한 증식인자, 사이토카인과 항원 및 항원제시세포(피더세포, 분화시킨 수상세포, 아티피셜 APC 등을 포함한다)에서의 공배양, 또는 항원이 없는 항원제시세포 등과의 공배양으로 계대가 가능하다. 그 외, 여러가지의 치료대상 질환에 있었던 계대법을 사용해도 된다. 예를 들면, 감염면역 등에 대한 이입(移入)면역치료의 경우는, 한창 항원으로 활성화되어 있는 도중의 T 세포는 다양한 사이토카인을 생산하고 있기 때문에, 생체 내로 이입했을 때, 발열 등의 부작용이 나타날 가능성이 있다. 또한, 이입면역으로서의 T 세포는 생체의 감염시에만 그 기능을 발현해야만 한다. 그 때문에, 항원으로 활성화된 T 세포에 파라믹소바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 도입한 후, 일단 항원이 없는 상태에서 APC와 공배양으로 계대하고, 정지상태의 활성화 T 세포(소위 메모리 T 세포)를 계대에 의해 작성하는 방법 등이 있다.

본 발명에 있어서 파라믹소바이러스 벡터란, 파라믹소바이러스를 베이스로 하는 감염력을 갖는 바이러스 입자로서, 유전자를 세포에 도입하기 위한 담체이다. 여기에서「감염력」이란, 파라믹소바이러스 벡터가 세포로의 접착능을 보유하고 있어, 접착한 세포의 내부에 벡터에 포함되는 유전자를 도입할 수 있는 능력을 말한다. 바람직한 태양에서는, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는, 벡터의 게놈 RNA 중에 외래 유전자가 발현할 수 있도록 삽입되어 있다. 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는, 복제능을 갖고 있어도 되고, 복제능을 갖지 않는 결손형 벡터여도 된다. 「복제능을 갖는다」란, 바이러스 벡터가 숙주세포에 감염한 경우, 상기 세포에 있어서 바이러스가 복제되고, 감염성 바이러스 입자가 생산되는 것을 가리킨다.

재조합 바이러스란, 재조합 폴리뉴클레오티드를 매개로 하여 생성한 바이러스를 말한다. 재조합 폴리뉴클레오티드란, 양쪽 끝 또는 한쪽 끝이 자연 상태와 동일하게는 결합되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드를 말한다. 구체적으로는, 재조합 폴리뉴클레오티드는, 사람의 손에 의해 폴리뉴클레오티드 사슬의 결합이 개변(절단 및/또는 결합)된 폴리뉴클레오티드이다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 합성, 뉴클레아제(neuclease) 처리, 리가아제(ligase) 처리 등을 조합하여, 공지의 유전자 재조합 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 재조합 바이러스는 유전자 조작에 의해 구축된 바이러스 게놈을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키고, 바이러스를 재구축함으로써 생성할 수 있다. 예를 들면, 재조합 파라믹소바이러스는, cDNA로부터 재구성하여 생성할 수 있다(Y. Nagai, A. Kato, Microbiol. Immunol., 43, 613-624(1999)).

본 발명에 있어서 유전자란 유전물질을 가리키고, 전사(轉寫)단위를 코드하는 핵산을 말한다. 유전자는 RNA여도 DNA여도 된다. 본 발명에 있어서 단백질을 코드하는 핵산은, 상기 단백질의 유전자라고 부른다. 또한 유전자는 단백질을 코드하고 있지 않아도 되고, 예를 들면 유전자는 리보자임 또는 안티센스 RNA 등의 기능적 RNA를 코드하는 것이어도 된다. 유전자는 천연 유래 또는 인위적으로 설계된 서열일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 「DNA」란, 단일 가닥(single-stranded) DNA 및 이중 가닥(double-stranded) DNA를 포함한다. 또한 단백질을 코드한다는 것은, 폴리뉴클레오티드가 상기 단백질을 적당한 조건하에서 발현할 수 있도록, 상기 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 ORF를 센스 또는 안티센스에 포함하는 것을 말한다.

본 발명에 있어서 파라믹소바이러스란 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체를 가리킨다. 파라믹소바이러스는, 비분절형 음성가닥(non-segmented negative strand) RNA를 게놈에 갖는 바이러스 그룹의 하나로, 파라믹소바이러스아과(Paramyxovirinae)(레스피로바이러스(Respirovirus)속(파라믹소바이러스속이라고도 한다), 루브라바이러스(Rubulavirus)속 및 모빌리바이러스(morbillivirus)속을 포함한다) 및 뉴모바이러스아과(Pneumovirinae)(뉴모바이러스속 및 메타뉴모바이러스속을 포함한다) 바이러스를 포함한다. 본 발명을 적용 가능한 파라믹소바이러스로서는, 구체적으로는 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(New castle disease virus), 유행성 이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measles virus), RS 바이러스(Respiratory syncytial virus), 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(SV5), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 2, 3형 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 Sendai virus(SeV), human parainfluenza virus-1(HPIV-1), human parainfluenza virus-3(HPIV-3), phocine distemper virus(PDV), canine distemper virus(CDV), dolphin molvillivirus(DMV), peste-des-petits-ruminants virus(PDPR), meales virus(MV), rinderpest virus(RPV), Hendra virus(Hendra), Nipah virus(Nipah), human parainfluenza virus-2(HPIV-2), simian parainfluenza virus 5(SV5), human parainfluenza virus-4a(HPIV-4a), human parainfluenza virus-4b(HPIV-4b), mumps virus(Mumps) 및 Newcastle disease virus(NDV) 등이 포함된다. 보다 바람직하게는, Sendai virus(Sev), human parainfluenza virus-1(HPIV-1), human parainfluenza virus-3(HPIV-3), phocine distemper virus(PDV), canine distemper virus(CDV), dolphin molvillivirus(DMV), peste-des-petits-ruminants virus(PDPR), meales virus(MV), rinderpest virus(RPV), Hendra virus (Hendra) 및 Nipah virus(Nipah)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스를 예시할 수 있다. 본 발명의 바이러스는, 바람직하게는 파라믹소바이러스아과(레스피로바이러스속, 루브라 바이러스속, 및 모빌리바이러스속을 포함한다)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체이고, 보다 바람직하게는 레스피로바이러스속(geus Respirovirus)(파라믹소바이러스속(Paramyxovairus)이라고도 한다)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체이다. 본 발명을 적용 가능한 레스피로바이러스속 바이러스로서는, 예를 들면 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형(HPIV-3), 소 파라인플루엔자 바이러스 3형(BPIV-3), 센다이 바이러스(Sendai virus;마우스 파라인플루엔자 1형이라고도 불린다) 및 원숭이 파라인플루엔자 바이러스 10형(SPIV-10) 등이 포함된다. 본 발명에 있어서 파라믹소바이러스는, 가장 바람직하게는 센다이 바이러스이다. 이들 바이러스는 천연주, 야생주, 변이주, 라보계대주(laboratory-passaged strain) 및 인위적으로 구축된 주 등에 유래해도 된다.

파라믹소바이러스 벡터는 게놈 RNA에 탑재 유전자를 안티센스에 코드하고 있다. 게놈 RNA란, 파라믹소바이러스의 바이러스 단백질과 함께 리보뉴클레오프로틴(RNP)을 형성하고, 상기 단백질에 의해 게놈 중의 유전자가 발현하고, 이 RNA가 복제되어 딸 RNP가 형성되는 기능을 갖는 RNA이다. 일반적으로 파라믹소바이러스의 게놈은, 3'리더영역(3'-leader region)과 5'트레일러영역(5'-trailer region) 사이에 바이러스 유전자가 안티센스로서 늘어선 구성을 하고 있다. 각 유전자의 ORF 사이에는 전사종결서열(E서열)-개재서열(I서열)-전사개시서열(S서열)이 존재하고, 이로써 각 유전자의 ORF를 코드하는 RNA가 별도의 시스트론으로서 전사된다.

파라믹소바이러스의 바이러스 단백질을 코드하는 유전자로서는, NP, P, M, F, HN 및 L 유전자가 포함된다. 「NP, P, M, F, HN 및 L 유전자」란, 각각 뉴클레오캡시드(nucleocapside), 포스포(phospho), 매트릭스(matrix), 퓨전(fusion), 헤마글루티닌 뉴라미니다아제(hamagglutinin neuraminidase) 및 라지 단백질을 코드하는 유전자를 가리킨다. 파라믹소바이러스아과에 속하는 각 바이러스에 있어서의 각 유전자는, 일반적으로 다음과 같이 표기된다. 일반적으로, NP 유전자는 「N 유전자」로 표기되는 경우도 있다.

레스피로바이러스속 NP P/C/V M F HN - L

루브라바이러스속 NP P/V M F HN (SH) L

모빌리바이러스속 NP P/C/V M F H - L

예를 들면 센다이 바이러스의 각 유전자 염기서열의 데이터베이스의 엑세션번호(accession number)는, NP 유전자에 대해서는 M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P 유전자에 대해서는 M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M 유전자에 대해서는 D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F 유전자에 대해서는 D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN 유전자에 대해서는 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, L 유전자에 대해서는 D00053, M30202, M30203, M30204, M69046, X00587, X58886을 참조할 것. 또한 그 외의 바이러스가 코드하는 바이러스 유전자를 예시하면, N 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, Z74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; 및 Tupaia, AF079780, P 유전자에 대해서는 CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; 및 Tupaia, AF079780, C 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, D00047; MV, AB016162; RPV, X68311; SeV, AB005796; 및 Tupaia, AF079780, M 유전자에 대해서는 CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; 및 SV5, M32248, F 유전자에 대해서는 CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; 및 SV5, AB021962, HN(H 또는 G) 유전자에 대해서는 CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2, D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; 및 SV-5, S76876을 예시할 수 있다. 단, 각 바이러스는 복수의 주(strain)가 알려져 있고, 주의 차이에 의해 상기에 예시한 것 이외의 서열로 되는 유전자도 존재한다.

이들의 바이러스 단백질을 코드하는 ORF 및 외래 유전자의 ORF는, 게놈 RNA에 있어서 상기의 E-I-S 서열을 매개로 하여 안티센스에 배치된다. 게놈 RNA에 있어서 가장 3'에 가까운 ORF는 3'리더영역과 상기 ORF의 사이에 S서열만이 필요하고, E 및 I서열은 필요없다. 또한 게놈 RNA에 있어서 가장 5'에 가까운 ORF는, 5'트레일러영역과 상기 ORF 사이에 E서열만이 필요하고, I 및 S서열은 필요없다. 또한 2개의 ORF는, 예를 들면 IRES 등의 서열을 사용하여 동일 시스트론으로서 전사시키는 것도 가능하다. 이와 같은 경우는, 이들 2개의 ORF 사이에는 E-I-S서열은 필요없다. 야생형 파라믹소바이러스의 경우, 전형적인 RNA 게놈은 3'리더영역에 계속해서, N, P, M, F, HN 및 L 단백질을 안티센스에 코드하는 6개의 ORF가 순서대로 늘어서 있고, 그것에 계속해서 5'트레일러영역을 다른쪽 끝에 갖는다. 본 발명의 게놈 RNA에 있어서는, 바이러스 유전자의 배치는 이것에 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 야생형 바이러스와 동일하게 3'리더영역에 계속해서, N, P, M, F, HN 및 L 단백질을 코드하는 ORF가 순서대로 늘어서, 그것에 계속해서 5'트레일러영역이 배치되는 것이 바람직하다. 어떤 종의 파라믹소바이러스에 있어서는, 바이러스 유전자가 상이하지만, 그와 같은 경우에도 상기와 동일하게 각 바이러스 유전자를 야생형과 동일한 배치로 하는 것이 바람직하다. 일반적으로 N, P 및 L 유전자를 보유하고 있는 벡터는, 세포 내에서 자율적으로 RNA 게놈으로부터 유전자가 발현되고, 게놈 RNA가 복제된다. 더욱이 F 및 HN 유전자 등의 엔벨로프 단백질을 코드하는 유전자 및 M 유전자의 작용에 의해, 감염성의 바이러스 입자가 형성되고, 세포 밖으로 방출된다. 따라서, 이와 같은 벡터는 복제능을 갖는 바이러스 벡터가 된다. T 세포에 도입하고자 하는 외래 유전자는, 후술하는 바와 같이, 이 게놈 중의 단백질 비 코드영역에 삽입하면 된다.

또한, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터는, 야생형 파라믹소바이러스가 갖는 유전자 중 어느 하나를 결손한 것이어도 된다. 예를 들면, M, F 또는 HN 유전자, 또는 그들의 조합이 포함되어 있지 않은 파라믹소바이러스 벡터도, 본 발명의 파라믹소바이러스 벡터로서 적합하게 사용할 수 있다. 이와 같은 바이러스 벡터의 재구성은, 예를 들면 결손되어 있는 유전자 산물을 외래적으로 공급함으로써 행할 수 있다. 이와 같이 하여 제조된 바이러스 벡터는, 야생형 바이러스와 동일하게 숙주세포에 접착하여 세포융합을 일으키지만, 세포에 도입된 벡터 게놈은 바이러스 유전자에 결손을 갖기 때문에, 처음과 동일한 감염력을 갖는 딸 바이러스입자는 형성되지 않는다. 이 때문에, 1회 한정의 유전자 도입력을 갖는 안전한 바이러스 벡터로서 유용하다. 게놈으로부터 결손시키는 유전자로서는, 예를 들면 F 유전자 및/또는 HN 유전자를 들 수 있다. 예를 들면, F 유전자가 결손된 재조합 파라믹소바이러스 벡터 게놈을 발현하는 플라스미드를, F 단백질의 발현 벡터 및 NP, P 및 L 단백질의 발현 벡터와 함께 숙주세포에 트랜스펙션(transfection)함으로써, 바이러스 벡터의 재구성을 행할 수 있다(WO00/70055 및 WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569(2000)). 또한, 예를 들면, F 유전자가 염색체에 삽입된 숙주세포를 사용하여 바이러스를 제조하는 것도 가능하다. 이들의 단백질군은, 그 아미노산 서열은 바이러스 유래의 서열 그대로가 아니어도, 핵산의 도입에 있어서의 활성이 천연형인 그것과 동등하거나 그 이상이라면, 변이를 도입하거나 또는 다른 바이러스의 상동유전자(homologous gene)로 대용해도 된다.

또한, 본 발명의 바이러스 벡터로서, 벡터 게놈이 유래하는 바이러스의 엔벨로프 단백질과는 상이한 단백질을 엔벨로프에 포함하는 벡터를 제작하는 것도 가능하다. 예를 들면, 바이러스 재구성시에, 벡터의 베이스가 되는 바이러스의 게놈이 코드하는 엔벨로프 단백질 이외의 엔벨로프 단백질을 세포에서 발현시킴으로써, 목적으로 하는 엔벨로프 단백질을 갖는 바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 이와 같은 단백질에 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 다른 바이러스의 엔벨로프 단백질, 예를 들면 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus; VSV)의 G 단백질(VSV-G)을 들 수 있다. 본 발명의 바이러스 벡터에는, VSV-G 단백질 등과 같이, 게놈이 유래하는 바이러스 이외의 바이러스에 유래하는 엔벨로프 단백질을 포함하는 슈도타입 바이러스 벡터(pseudotype viral vector)가 포함된다. 바이러스의 게놈 RNA에는 이들의 엔벨로프 단백질을 게놈에 코드되지 않도록 설계하면, 바이러스 입자가 세포에 감염한 후는 바이러스 벡터로부터 이 단백질이 발현되는 경우는 없다.

또한, 본 발명의 바이러스 벡터는, 예를 들면 엔벨로프 표면에 특정 세포에 접착할 수 있는 접착인자, 리간드, 수용체 등의 단백질, 항체 또는 그 단편, 또는 이들의 단백질을 세포외영역에 갖고, 바이러스 엔벨로프 유래의 폴리펩티드를 세포내영역에 갖는 키메라 단백질(chimeric protein) 등을 포함하는 것이어도 된다. 이것에 의해, 벡터의 T 세포로의 특이성을 제어할 수 있다. 이들은 바이러스 게놈에 코드되어 있어도 되고, 바이러스 벡터의 재구성시에, 바이러스 게놈 이외의 유전자(예를 들면 별도의 발현 벡터 또는 숙주 염색체상 등에 있는 유전자)의 발현에 의해 공급되어도 된다.

또한 본 발명의 벡터는, 예를 들면 바이러스 단백질에 의한 면역원성을 저하시키기 위해, 또는 RNA의 전사효율 또는 복제효율을 높이기 위해, 벡터에 포함되는 임의의 바이러스 유전자가 야생형 유전자로부터 개변되어 있어도 된다. 구체적으로는, 예를 들면 파라믹소바이러스 벡터에 있어서는 복제인자인 N, P 및 L 유전자 중의 적어도 1개를 개변하여, 전사 또는 복제의 기능을 높이는 것이 생각된다. 또한, 엔벨로프 단백질의 하나인 HN 단백질은, 적혈구 응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin) 활성과 뉴라미니다아제(neuraminidase) 활성의 양자의 활성을 갖지만, 예를 들면 전자의 활성을 약화시킬 수 있으면, 혈액 중에서의 바이러스의 안정성을 향상시키는 것이 가능할 것이고, 예를 들면 후자의 활성을 개변함으로써 감염능을 조절하는 것도 가능하다. 또한, F 단백질을 개변함으로써 막융합능을 조절하는 것도 가능하다. 또한, 예를 들면 세포표면의 항원분자로 될 수 있는 F 단백질 또는 HN 단백질의 항원제시 에피토프 등을 해석하고, 이것을 이용해서 이들의 단백질에 관한 항원제시능을 약화시킨 바이러스 벡터를 제작하는 것도 가능하다.

또한 본 발명의 벡터에 있어서는, 액세서리 유전자가 결손된 것이어도 된다. 예를 들면 SeV의 액세서리 유전자의 하나인 V 유전자를 녹아웃(knocking out) 함으로써, 배양세포에 있어서의 유전자 발현 및 복제는 장해되지 않고, 마우스 등의 숙주에 대한 SeV의 병원성이 현저하게 감소한다(Kato, A, et al., 1997, J. virol. 71:7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16:578-587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179). 이와 같은 약독화 벡터는(attenuated vector) in vivo 또는 ex vivo에 있어서의 독성이 없는 유전자 도입용 바이러스 벡터로서 특히 유용하다.

파라믹소바이러스는 유전자 도입 벡터로서 우수하고, 숙주세포의 세포질에서만 전사·복제를 행하며, DNA 페이즈(phase)를 갖지 않기 때문에 염색체로의 통합(integration)은 일어나지 않는다(Lamb, R.A. and Kolakofsky, D., Paramyxoviridae: The viruses and their replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds). Fields of virology. Vol. 2. Lippincott - Raven Publishers: Philadelphia, 1996, pp. 1177-1204). 이 때문에 염색체 이상에 의한 암화(癌化) 및 불사화(不死化) 등의 안전면에 있어서의 문제가 발생하지 않는다. 파라믹소바이러스의 이 특징은, 벡터화했을 때의 안전성에 크게 기여하고 있다. 이종(異種) 유전자 발현의 결과에서는, 예를 들면 센다이 바이러스(SeV)를 연속 다대계대해도 거의 염기의 변이가 인정되지 않고, 게놈의 안정성이 높으며, 삽입 이종 유전자를 장기간에 걸쳐 안정하게 발현하는 것이 나타내어져 있다(Yu, D. et al., Genes Cells 2, 457-466(1997)). 또한, 캡시드구조 단백질을 갖지 않는 것에 의한 도입 유전자의 사이즈 또는 팩키징의 유연성(flexibility) 등 성질상의 장점이 있다. 이와 같이, 파라믹소바이러스 벡터는, 인간의 유전자치료를 위한 고효율 벡터의 새로운 클래스로 되는 것이 시사된다. 복제능을 갖는 SeV 벡터는 외래 유전자를 적어도 4 kb까지 도입 가능하고, 전사 유닛을 부가함으로써 2종류 이상의 유전자를 동시에 발현하는 것도 가능하다.

또한 센다이 바이러스는, 설치류에 있어서는 병원성으로 폐렴을 발생시키는 것이 알려져 있지만, 인간에 대해서는 병원성이 없다. 이것은 또한, 야생형 센다이 바이러스의 경비적(經鼻的) 투여에 의해 비 인간 영장류에 있어서 심각한 유해작용을 나타내지 않는다고 하는 지금까지의 보고에 의해서도 지지되고 있다(Hurwitz, J.L. et al., Vaccine 15:533-540, 1997). 센다이 바이러스의 이들 특징은, 센다이 바이러스 벡터가 인간의 치료에 응용할 수 있는 것을 시사하고, 센다이 바이러스 벡터가 인간 T 세포를 표적으로 한 유전자치료의 유망한 선택지의 하나로 되는 것을 결론짓는 것이다.

본 발명의 바이러스 벡터는, 게놈 RNA 중에 외래 유전자를 코드할 수 있다. 외래 유전자를 포함하는 재조합 파라믹소바이러스 벡터는, 상기 파라믹소바이러스 벡터 게놈에 외래 유전자를 삽입함으로써 얻어진다. 외래 유전자로서는, 표적으로 하는 T 세포에 있어서 발현시키고자 하는 목적으로 하는 유전자를 사용할 수 있다. 외래 유전자는 천연형 단백질을 코드하는 유전자여도 되고, 또는 결손, 치환 또는 삽입에 의해 천연형 단백질을 개변한 단백질을 코드하는 유전자여도 된다. 외래 유전자의 삽입위치는, 예를 들면 바이러스 게놈의 단백질 비 코드영역의 목적으로 하는 부위를 선택할 수 있고, 예를 들면 게놈 RNA의 3'리더영역과 3'말단에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF의 사이, 각 바이러스 단백질 ORF의 사이 및/또는 5'말단에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF와 5'트레일러영역 사이에 삽입할 수 있다. 또한, F 또는 HN 유전자 등을 결실하는 게놈에서는, 그 결실영역에 외래 유전자를 코드하는 핵산을 삽입할 수 있다. 파라믹소바이러스에 외래 유전자를 도입하는 경우는, 게놈으로의 삽입 단편의 폴리뉴클레오티드의 사슬길이가 6의 배수로 되도록 삽입하는 것이 바람직하다(Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 4822-4830, 1993). 삽입한 외래 유전자와 바이러스 ORF의 사이에는 E-I-S서열이 구성되도록 한다. E-I-S서열을 매개로 하여 2 또는 그 이상의 유전자를 직렬로 나란히 놓아 삽입할 수 있다.

벡터에 탑재하는 외래 유전자의 발현 레벨은, 그 유전자의 상류(음성가닥의 3'측)에 부가하는 전사개시서열의 종류에 따라 조절할 수 있다(WO01/18223). 또한, 게놈 위의 외래 유전자의 삽입위치에 따라 제어할 수 있고, 음성가닥의 3'의 근방에 삽입할수록 발현 레벨이 높고, 5'의 근방에 삽입할수록 발현 레벨이 낮아진다. 이와 같이, 외래 유전자의 삽입위치는 상기 유전자의 목적으로 하는 발현량을 얻기 위해, 또한 전후의 바이러스 단백질을 코드하는 유전자와의 조합이 최적으로 되도록 적절히 조절할 수 있다. 일반적으로, 외래 유전자의 높은 발현이 얻어지는 것이 유리하다고 생각되기 때문에, 외래 유전자는 효율이 높은 전사개시서열에 연결하여, 음성가닥 게놈의 3' 말단 근방에 삽입하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 3'리더영역과 3'에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF의 사이에 삽입된다. 또는, 3'에 가장 가까운 바이러스 유전자와 2번째 유전자의 ORF 사이에 삽입해도 된다. 야생형 파라믹소바이러스에 있어서는, 게놈의 3'에 가장 가까운 바이러스 단백질 유전자는 N 유전자이고, 2번째 유전자는 P 유전자이다. 반대로, 도입 유전자의 고발현이 바람직하지 않은 경우는, 예를 들면 벡터에 있어서의 외래 유전자의 삽입위치를 음성가닥의 되도록 5'측에 설정하거나, 전사개시서열을 효율이 낮은 것으로 하는 등, 바이러스 벡터로부터의 발현 레벨을 낮게 억제함으로써 적절한 효과가 얻어질 수 있도록 하는 것도 가능하다.

본 발명의 벡터를 제조하기 위해서는, 포유동물세포에 있어서 파라믹소바이러스의 성분인 RNP의 재구성에 필요한 바이러스 단백질, 즉 N, P 및 L 단백질의 존재하, 파라믹소바이러스의 게놈 RNA를 코드하는 cDNA를 전사시킨다. 전사에 의해 음성가닥 게놈(즉 바이러스 게놈과 동일한 안티센스가닥)을 생성시켜도 되고, 또는 양성가닥(바이러스 단백질을 코드하는 센스가닥)을 생성시켜도, 바이러스 RNP를 재구성할 수 있다. 벡터의 재구성효율을 높이기 위해서는, 바람직하게는 양성가닥을 생성시킨다. RNA 말단은 천연 바이러스 게놈과 동일하게 3'리더서열과 5'트레일러서열의 말단을 되도록 정확하게 반영시키는 것이 바람직하다. 전사산물의 5' 말단을 정확하게 제어하기 위해서는, 예를 들면 전사개시부위로서 T7 RNA 폴리머라아제(polymerase) 인식서열을 이용하여, 상기 RNA 폴리머라아제를 세포 내에서 발현시키면 된다. 전사산물의 3' 말단을 제어하기 위해서는, 예를 들면 전사산물의 3' 말단이 자기절단형 리보자임을 코드시켜 두고, 이 리보자임에 의해 정확하게 3' 말단이 잘라내어지도록 할 수 있다(Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 및 Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466).

예를 들면 외래 유전자를 갖는 재조합 센다이 바이러스 벡터는, Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 및 Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466의 기재 등에 준하여, 다음과 같이 하여 구축할 수 있다.

먼저, 목적의 외래 유전자의 cDNA 염기서열을 포함하는 DNA 시료를 준비한다. DNA 시료는 25 ng/㎕ 이상의 농도로 전기영동적으로 단일 플라스미드로 확인할 수 있는 것이 바람직하다. 이하 Not I 부위를 이용하여 바이러스 게놈 RNA를 코드하는 DNA에 외래 유전자를 삽입하는 경우를 예로 들어 설명한다. 목적으로 하는 cDNA 염기서열 중에 Not I 인식부위가 포함되는 경우는, 부위 특이적 변이도입법 등을 사용해서, 코드하는 아미노산서열을 변화시키지 않도록 염기 서열을 개변하고, Not I 부위를 미리 제거해 두는 것이 바람직하다. 이 시료로부터 목적의 유전자 단편을 PCR에 의해 증폭하고 회수한다. 2개의 프라이머의 5'부분에 Not I 부위를 부가해 둠으로써, 증폭된 단편의 양 말단을 Not I 부위로 한다. 바이러스 게놈 위에 삽입된 후의 외래 유전자의 ORF와 그 양쪽 바이러스 유전자의 ORF 사이에 E-I-S서열이 배치되도록, 프라이머 중에 E-I-S서열을 포함하도록 설계한다.

예를 들면, 포워드측 합성 DNA 서열은 Not I에 의한 절단을 보증하기 위해 5'측에 임의의 2 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 GCG 및 GCC 등의 Not I 인식부위 유래의 서열이 포함되지 않는 4 염기, 더욱 바람직하게는 ACTT)를 선택하고, 그 3'측에 Not I 인식부위 gcggccgc를 부가하고, 추가로 그 3'측에 스페이서 서열로서 임의의 9 염기 또는 9에 6의 배수를 가한 수의 염기를 부가하고, 추가로 그 3'측에 목적으로 하는 cDNA의 개시코돈 ATG로부터 이것을 포함하여 ORF의 약 25 염기 상당의 서열을 부가한 형태로 한다. 마지막 염기는 G 또는 C가 되도록 상기 목적으로 하는 cDNA로부터 약 25 염기를 선택하여 포워드측 합성 올리고 DNA의 3'의 말단으로 하는 것이 바람직하다.

리버스측 합성 DNA 서열은 5'측으로부터 임의의 2 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 GCG 및 GCC 등의 Not I 인식부위 유래의 서열이 포함되지 않는 4 염기, 더욱 바람직하게는 ACTT)를 선택하고, 그 3'측에 Not I 인식부위 gcggccgc를 부가하고, 추가로 그 3'측에 길이를 조절하기 위한 삽입단편의 올리고 DNA를 부가한다. 이 올리고 DNA의 길이는, 최종적인 PCR 증폭산물의 Not I 단편의 사슬길이가 6의 배수로 되도록 염기수를 설계한다(소위 「6의 룰(rule of six)」; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-899, 1998; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67:4822-4830, 1993; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993). 이 프라이머에 E-I-S서열을 부가하는 경우에는, 삽입단편의 올리고 DNA의 3'측에 센다이 바이러스의 S서열, I서열 및 E서열의 상보가닥서열(complementary strand sequence), 바람직하게는 각각 5'-CTTTCACCCT-3'(서열번호: 1), 5'-AAG-3' 및 5'-TTTTTCTTACTACGG-3'(서열번호: 2)를 부가하고, 추가로 그 3'측에 목적으로 하는 cDNA 서열의 종지코돈(termination codon)으로부터 반대로 세어 약 25 염기 상당의 상보가닥의 마지막 염기가 G 또는 C가 되도록 길이를 선택해서 서열을 부가하여, 리버스측 합성 DNA의 3'의 말단으로 한다.

PCR은, Taq 폴리머라아제 또는 그외의 DNA 폴리머라아제를 사용하는 통상의 방법을 사용할 수 있다. 증폭한 목적 단편은 Not I로 소화한 후, pBluescript 등의 플라스미드 벡터의 Not I 부위에 삽입한다. 얻어진 PCR 산물의 염기서열을 시퀀서로 확인하고, 바른 서열의 플라스미드를 선택한다. 이 플라스미드로부터 삽입단편을 Not I로 잘라내고, 게놈 cDNA를 포함하는 플라스미드의 Not I 부위에 클로닝한다. 또한 플라스미드 벡터를 매개로 하지 않고 게놈 cDNA의 Not I 부위에 직접 삽입하여, 재조합 센다이 바이러스 cDNA를 얻는 것도 가능하다.

예를 들면, 재조합 센다이 바이러스 게놈 cDNA라면, 문헌기재의 방법에 준하여 구축할 수 있다(Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997). 예를 들면, Not I 제한부위를 갖는 18bp의 스페이서서열(5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3')(서열번호: 3)을 클로닝된 센다이 바이러스 게놈 cDNA(pSeV(+))의 리더서열과 N 단백질 ORF의 사이에 삽입하고, 델타 간염 바이러스의 안티게놈 가닥(antigenomic strand) 유래의 자기 개열(開裂) 리보자임 부위를 포함하는 플라스미드 pSeV18⁺b(+)를 얻는다(Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820). pSeV18⁺b(+)의 Not I 부위에 외래 유전자 단편을 삽입하여, 목적으로 하는 외래 유전자가 삽입된 재조합 센다이 바이러스 cDNA를 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 제작한 재조합 파라믹소바이러스의 게놈 RNA를 코드하는 DNA를 상기 바이러스 단백질(L, P 및 N) 존재하에서 세포 내에서 전사시킴으로써, 본 발명의 벡터를 재구성할 수 있다. 본 발명은, 본 발명의 벡터의 제조를 위한, 본 발명의 벡터의 바이러스 게놈 RNA를 코드하는 DNA를 제공한다. 또한 본 발명은, 본 발명의 벡터의 제조에 적용하기 위한, 상기 벡터의 게놈 RNA를 코드하는 DNA의 사용에 관한 것이다. 재조합 바이러스의 재구성은 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있다(WO97/16539; WO97/16538; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404). 이들의 방법에 의해, 파라인플루엔자, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스(rabies virus), 홍역 바이러스, 우역 바이러스, 센다이 바이러스 등을 포함하는 음성가닥 바이러스를 DNA로부터 재구성시킬 수 있다. 이들의 방법에 준하여 본 발명의 벡터를 재구성시킬 수 있다. 바이러스 벡터 DNA에 있어서 F 유전자, HN 유전자 및/또는 M 유전자를 결실시킨 경우에는, 그대로는 감염성 바이러스 입자를 형성하지 않지만, 숙주세포에 이들 결실시킨 유전자 및/또는 다른 바이러스의 엔벨로프 단백질을 코드하는 유전자 등을 별도로 세포에 도입하고 발현시킴으로써, 감염성 바이러스 입자를 형성시키는 것이 가능하다.

구체적인 절차는, (a) 파라믹소바이러스 게놈 RNA(음성가닥 RNA) 또는 그 상보가닥(양성가닥)을 코드하는 cDNA를 N, P 및 L 단백질을 발현하는 세포에서 전사시키는 공정, (b) 생성한 파라믹소바이러스를 포함하는 배양상청을 회수하는 공정에 의해 제조할 수 있다. 전사를 위해 게놈 RNA를 코드하는 DNA는 적당한 프로모터의 하류에 연결된다. 전사된 게놈 RNA는 N, L 및 P 단백질의 존재하에서 복제되어 RNP 복합체를 형성한다. 그리고 M, HN 및 F 단백질의 존재하에서 엔벨로프에 싸여진 바이러스 입자가 형성된다. 게놈 RNA를 코드하는 DNA는 예를 들면 T7 프로모터의 하류에 연결시키고, T7 RNA 폴리머라아제에 의해 RNA에 전사시킨다. 프로모터로서는, T7 폴리머라아제의 인식서열을 포함하는 것 이외에도 목적으로 하는 프로모터를 이용할 수 있다. 또는, 인비트로(in vitro)에서 전사시킨 RNA를 세포에 트랜스펙트해도 된다.

DNA로부터의 게놈 RNA의 최초의 전사에 필요한 T7 RNA 폴리머라아제 등의 효소는, 이것을 발현하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 도입에 의해 공급할 수 있고, 또는, 예를 들면 세포의 염색체에 RNA 폴리머라아제 유전자를 발현을 유도할 수 있도록 삽입해 두고, 바이러스 재구성시에 발현을 유도함으로써 공급하는 것도 가능하다. 또한 게놈 RNA 및 벡터 재구성에 필요한 바이러스 단백질은, 예를 들면 이들을 발현하는 플라스미드의 도입에 의해 공급한다. 이들의 바이러스 단백질의 공급에 있어서, 야생형 또는 어떤 종의 변이 파라믹소바이러스 등의 헬퍼 바이러스를 사용한다.

게놈 RNA를 발현하는 DNA를 세포 내에 도입하는 방법에는, 예를 들면 다음과 같은 방법, ① 목적의 세포를 함입(internalization)할 수 있는 DNA 침전물을 만드는 방법, ② 목적의 세포에 의한 함입에 적합하고, 또한 세포 독성이 적은 양전하 특성을 갖는 DNA를 포함하는 복합체를 만드는 방법, ③ 목적의 세포막에 DNA 분자가 빠져나갈 수 있을 만큼 충분한 구멍을 전기 펄스(pulse)에 의해 순간적으로 뚫는 방법 등이 있다.

②로서는, 여러가지의 트랜스펙션 시약을 이용할 수 있다. 예를 들면 DOTMA(Roche), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Roche #1811169) 등을 들 수 있다. ①로서는 예를 들면 인산 칼슘을 사용한 트랜스펙션법을 들 수 있고, 이 방법에 의해 세포 내에 들어간 DNA는 빈식소포(phagosome)에 함입되지만, 핵 내에도 충분한 양의 DNA가 들어가는 것이 알려져 있다(Graham, F. L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223). Chen 및 Okayama는 트렌스퍼 기술의 최적화를 검토하고, 1) 세포와 공침전물의 인큐베이션 조건을 2~4% CO₂, 35℃, 15~24시간, 2) DNA는 직쇄형상보다 고리형상의 것이 활성이 높고, 3) 침전혼액 중의 DNA 농도가 20~30 ㎍/㎖일 때 최적인 침전이 얻어진다고 보고하고 있다(Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745). ②의 방법은, 일과적인(transient) 트랜스펙션에 적합하다. 오래된 것으로서는 DEAE-덱스트란(dextran)(Sigma #D-9885 M.W. 5×10⁵) 혼액을 목적으로 하는 DNA 농도비로 조제하여, 트랜스펙션을 행하는 방법이 알려져 있다. 복합체의 대부분은 엔도솜(endosome) 중에서 분리되어 버리기 때문에, 효과를 높이기 위해 클로로퀸(chloroquine)을 가하는 것도 가능하다(Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). ③의 방법은 전기천공법(electroporation)이라고 불리는 방법으로, 세포 선택성이 없다고 하는 점에서 ① 또는 ②의 방법에 비해 범용성이 높다. 효율은 펄스 전류의 지속시간, 펄스의 형태, 전계(전극간의 갭, 전압)의 강도, 완충제의 도전율, DNA 농도, 세포밀도의 최적 조건하에서 좋은 것으로 되어 있다.

이상, 3개의 범주 중에서 ②의 방법은 조작이 간편하고 다량의 세포를 사용하여 다수의 검체를 검토할 수 있기 때문에, 벡터 재구성을 위한 DNA 세포로의 도입에는 트랜스펙션 시약이 적합하다. 적합하게는 Superfect Transfection Reagent(QIAGEN, Cat No. 301305), 또는 DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Roche, Cat No. 1811169)가 사용되지만, 이들에 제한되지 않는다.

cDNA로부터의 바이러스의 재구성은 구체적으로는, 예를 들면 이하와 같이 하여 행할 수 있다.

24웰에서 6웰 정도의 플라스틱 플레이트 또는 100 ㎜ 페트리접시 등에서, 10 % 소태아혈청(FCS) 및 항생물질(100 units/㎖ 페니실린 G 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신)을 포함하는 최소필수배지(MEM)를 사용하여 원숭이 신장 유래 세포주 LLC-MK2를 거의 100% 콘플루언트(confluency)가 될 때까지 배양하고, 예를 들면 1 ㎍/㎖ 소랄렌(psoralen) 존재하, 자외선(UV) 조사 처리를 20분 처리로 불활성화시킨, T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 제조합 백시니아 바이러스(vaccinia virus) vTF7-3(Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)을 2 PFU/세포로 감염시킨다. 소랄렌의 첨가량 및 UV 조사시간은 적절히 조정할 수 있다. 감염 1시간 후, 2~60 ㎍, 보다 바람직하게는 3~20 ㎍의 재조합 센다이 바이러스의 게놈 RNA를 코드하는 DNA를, 바이러스 RNP의 생성에 필수인 트랜스로 작용하는 바이러스 단백질을 발현하는 플라스미드(0.5~24 ㎍의 pGEM-N, 0.25~12 ㎍의 pGEM-P 및 0.5~24 ㎍의 pGEM-L)(Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)와 함께 Superfect(QIAGEN사)를 사용한 리포펙션법 등에 의해 트랜스펙션한다. N, P 및 L을 코드하는 발현 벡터의 양비는 예를 들면 2:1:2로 하는 것이 바람직하고, 플라스미드 양은 예를 들면 1~4 ㎍의 pGEM-N, 0.5~2 ㎍의 pGEM-P 및 1~4 ㎍의 pGEM-L 정도로 적절히 조정한다.

트랜스펙션을 행한 세포는, 목적에 따라 100 ㎍/㎖의 리팜피신(rifampicin)(Sigma) 및 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside)(AraC), 보다 바람직하게는 40 ㎍/㎖의 시토신 아라비노시드(AraC)(Sigma) 만을 포함하는 혈청 불함유의 MEM에서 배양하여, 백시니아 바이러스에 의한 세포 독성을 최소한으로 억제하고, 바이러스의 회수율을 최대로 하도록 약제의 최적 농도를 설정한다(Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579). 트랜스펙션으로부터 48~72시간 정도 배양 후, 세포를 회수하고 동결융해를 3회 반복하여 세포를 파쇄한 후, RNP를 포함하는 파쇄물을 LLC-MK2 세포에 다시 트랜스펙션하여 배양한다. 또는, 배양상청을 회수하고, LLC-MK2 세포의 배양액에 첨가하여 감염시켜 배양한다. 트랜스펙션은, 예를 들면 리포펙트아민(lipofectamine) 또는 폴리양이온 리포좀(polycationic liposome) 등과 함께 복합체를 형성시켜 세포에 도입하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 여러가지의 트랜스펙션 시약을 이용할 수 있다. 예를 들면 DOTMA(Roche), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Roche #1811169) 등을 들 수 있다. 엔도솜 중에서의 분해를 방지하기 위해, 클로로퀸을 가하는 것도 가능하다(Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). RNP가 도입된 세포에서는, RNP로부터의 바이러스 유전자의 발현 및 RNP의 복제과정이 진행되어 벡터가 증폭된다. 얻어진 바이러스 용액을 희석(예를 들면 10⁶ 배)하여 재증폭을 반복함으로써, 백시니아 바이러스 vTF7-3은 완전하게 제거할 수 있다. 재증폭은, 예를 들면 3회 이상 반복한다. 얻어진 벡터는 -80℃에서 보존할 수 있다. 엔벨로프 단백질을 코드하는 유전자를 결손한 복제능을 갖지 않는 바이러스 벡터를 재구성시키기 위해서는, 엔벨로프 단백질을 발현하는 LLC-MK2 세포를 트랜스펙션에 사용하거나, 또는 엔벨로프 발현 플라스미드를 함께 트랜스펙션하면 된다. 또한, 트랜스펙션을 행한 세포에 엔벨로프 단백질을 발현하는 LLC-MK2 세포를 중층(重層)하여 배양함으로써 결손형 바이러스 벡터를 증폭하는 것도 가능하다(국제공개번호 WO00/70055 및 WO00/70070 참조).

회수된 바이러스의 역가(titer)는, 예를 들면 CIU(Cell-Infected Unit) 측정 또는 적혈구 응집활성(HA)을 측정함으로써 결정할 수 있다(WO00/70070; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999). 또한, GFP(녹색형광 단백질) 등의 마커 유전자를 탑재한 벡터에 대해서는, 마커를 지표로 직접적으로 감염세포를 카운트함으로써 역가를 정량할 수 있다(예를 들면 GFP-CIU로서). 이와 같이 하여 측정한 역가는, CIU와 동등하게 취급할 수 있다(WO00/70070).

바이러스 벡터가 재구성하는 한, 재구성에 사용하는 숙주세포는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 센다이 바이러스 벡터 등의 재구성에 있어서는, 원숭이 신장 유래의 LLCMK2 세포 및 CV-1 세포, 햄스터 신장 유래의 BHK 세포 등의 배양세포, 인간 유래 세포 등을 사용할 수 있다. 이들의 세포에 적당한 엔벨로프 단백질을 발현시킴으로써, 그 엔벨로프를 갖는 감염성 바이러스 입자를 얻는 것도 가능하다. 또한, 대량으로 센다이 바이러스 벡터를 얻기 위해, 상기의 숙주로부터 얻어진 바이러스 벡터를 발육계란에 감염시켜 상기 벡터를 증폭할 수 있다. 계란을 사용한 바이러스 벡터의 제조방법은 이미 개발되어 있다(나카니시 등 편, (1993), 「신경과학연구의 첨단기술 프로토콜 III, 분자신경세포생리학」, 고세이샤, 오사카, pp. 153-172). 구체적으로는, 예를 들면 수정란을 배양기에 넣고 9~12일간 37~38℃에서 배양하고, 배(胚)를 성장시킨다. 바이러스 벡터를 요막강(尿膜腔)으로 접종하고, 수일간(예를 들면 3일간) 계란을 배양하여 바이러스 벡터를 증식시킨다. 배양기간 등의 조건은, 사용하는 재조합 센다이 바이러스에 따라 바뀔 수 있다. 그 후, 바이러스를 포함한 요액(尿液)을 회수한다. 요액으로부터 센다이 바이러스 벡터의 분리·정제는 통상적인 방법에 따라 행할 수 있다(다시로 마비토, 「바이러스 실험 프로토콜」, 나가이, 이시하마 감수, 메티컬뷰사, pp.68-73, (1995)).

예를 들면, F 유전자를 결실한 센다이 바이러스 벡터의 구축과 조제는, 이하와 같이 행할 수 있다(WO00/70055 및 WO00/70070 참조).

<1> F 유전자 결실형 센다이 바이러스 게놈 cDNA 및 F 발현 플라스미드의 구축

센다이 바이러스(SeV) 전장(full-length) 게놈 cDNA, pSeV18⁺b(+)(Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820)(「pSeV18⁺b(+)」는 「pSeV18⁺」라고도 한다)의 cDNA를 SphI/KpnI로 소화하여 프래그먼트(fragment)(14673 bp)를 회수하고, pUC18에 클로닝하여 플라스미드 pUC18/KS로 한다. F 유전자 결손부위의 구축은 이 pUC18/KS 위에서 행한다. F 유전자의 결손은, PCR-라이게이션(PCR-ligation)방법의 조합으로 행하고, 결과로서 F 유전자의 ORF(ATG-TGA=1698 bp)를 제거하고 예를 들면 atgcatgccggcagatga(서열번호: 4)로 연결하여, F 유전자 결실형 SeV 게놈 cDNA(pSeV18⁺/ΔF)를 구축한다. PCR은, F의 상류에는 [forward: 5'-gttgagtactgcaagagc/서열번호: 5, reverse: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/서열번호: 6], F 유전자의 하류에는 [ forward: 5'-atgcatgccggcagatga/서열번호: 7, reverse: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc/서열번호: 8]의 프라이머쌍을 사용한 PCR의 산물을 EcoT22I로 연결한다. 이와 같이 얻어진 플라스미드를 SacI와 SalI로 소화하고, F 유전자 결손부위를 포함하는 영역의 단편(4931 bp)을 회수하여 pUC18에 클로닝하고, pUC18/dFSS로 한다. 이 pUC18/dFSS를 DraIII로 소화하고, 단편을 회수하여 pSeV18⁺의 F 유전자를 포함하는 영역의 DraIII 단편과 치환하고, 라이게이션하여 플라스미드 pSeV18⁺/ΔF를 얻는다.

외래 유전자는, 예를 들면 pUC18/dFSS의 F 유전자 결실부위에 있는 Nsi I 및 Ngo MIV 부위에 삽입한다. 이를 위해서는, 예를 들면 외래 유전자 단편을 Nsi I-tailed 프라이머 및 Ngo MIV-tailed 프라이머로 증폭하면 된다.

<2> SeV-F 단백을 유도 발현하는 헬퍼 세포의 제작

센다이 바이러스의 F 유전자(SeV-F)를 발현하는 Cre/loxP 유도형 발현 플라스미드의 구축은 SeV-F 유전자를 PCR로 증폭하고, Cre DNA 리콤비나아제(recombinase)에 의해 유전자 산물이 유도 발현되도록 설계된 플라스미드 pCALNdlw(Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, p1115-1121)의 유니크사이트 Swa I 부위에 삽입하여, 플라스미드 pCALNdLw/F를 구축한다.

F 유전자 결손 게놈으로부터 감염 바이러스 입자를 회수하기 위해서, SeV-F 단백을 발현하는 헬퍼 세포주를 수립한다. 세포는, 예를 들면 SeV의 증식에 자주 사용되고 있는 원숭이 신장 유래 세포주 LLC-MK2 세포를 사용할 수 있다. LLC-MK2 세포는, 10%의 열처리한 부동화 소태아혈청(FBS), 페니실린 G 나트륨 50 단위/㎖ 및 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖를 첨가한 MEM에서 37℃, 5% CO²로 배양한다. SeV-F 유전자 산물은 세포 상해성을 갖기 때문에, Cre DNA 리콤비나아제에 의해 F 유전자 산물이 유도 발현되도록 설계된 상기 플라스미드 pCALNdLw/F를, 인산칼슘법(mammalian transfection kit (Stratagene))에 의해, 주지의 프로토콜에 따라서 LLC-MK2 세포에 유전자 도입을 행한다.

10 ㎝ 플레이트를 사용하여 40% 콘플루언트까지 생육한 LLC-MK2 세포에 10 ㎍의 플라스미드 pCALNdLw/F를 도입 후, 10 ㎖의 10% FBS를 포함하는 MEM 배지에서 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 중에서 24시간 배양한다. 24시간 후에 세포를 박리하고, 10 ㎖ 배지에 현탁 후, 10 ㎝ 샬레 5장을 사용하여 5 ㎖ 1장, 2 ㎖ 2장, 0.2 ㎖ 2장에 뿌리고, G418(GIBCO-BRL)을 1200 ㎍/㎖를 포함하는 10 ㎖의 10% FBS를 포함하는 MEM 배지에서 배양을 행하고, 2일마다 배지 교환하면서 14일간 배양하여, 유전자의 안정도입주의 선택을 행한다. 상기 배지에 의해 생육해온 G418에 내성을 나타내는 세포는 클로닝링(cloning ring)을 사용하여 회수한다. 회수한 각 클론은 10 ㎝ 플레이트에서 콘플루언트가 될 때까지 확대배양을 계속한다.

F 단백질의 발현 유도는 세포를 6 ㎝ 샬레에서 콘플루언트까지 생육시킨 후, 아데노바이러스 AxCANCre를 사이토 등의 방법(Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821(1995); Arai, T. et al., J. Virol 72, 1115-1121(1998))에 의해 예를 들면 moi=3으로 감염시켜 행한다.

<3> F 유전자 결실 SeV 바이러스의 재구축 및 증폭

상기 pSeV18⁺/ΔF의 외래 유전자가 삽입된 플라스미드를 이하와 같이 하여 LLC-MK2 세포에 트랜스펙션한다. LLC-MK2 세포를 5×10⁶ cells/dish로 100 ㎜의 샬레에 뿌린다. T7 RNA 폴리머라아제에 의해 게놈 RNA의 전사를 행하게 하는 경우에는, 세포 배양 24시간 후, 소랄렌(psoralen)과 장파장 자외선(365 nm)으로 20분간 처리한 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 리콤비넌트 백시니아 바이러스(PLWUV-VacT7 : Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126(1986))를 MOI 2 정도로 실온에서 1시간 감염시킨다. 백시니아 바이러스로의 자외선 조사에는, 예를 들면 15 와트 벌브(watt-bulb) 5개가 장비(裝備)된 UV Stratalinker 2400(카탈로그번호 400676(100 V), 스트라타진사, La Jolla, CA, USA)을 사용할 수 있다. 세포를 무혈청의 MEM으로 세정한 후, 게놈 RNA를 발현하는 플라스미드 및 파라믹소바이러스의 각각 N, P, L, F 및 HN 단백질을 발현하는 발현 플라스미드를, 적당한 리포펙션 시약을 사용하여 이 세포에 트랜스펙트한다. 플라스미드의 양비는 이것에 한정되지 않지만, 적합하게는 순서대로 6:2:1:2:2:2로 할 수 있다. 예를 들면, 12 ㎍의 게놈 RNA를 발현하는 플라스미드 및 N, P, L 및 F 플러스 HN 단백질을 발현하는 발현 플라스미드(pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L 및 pGEM/F-HN; WO00/70070, Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579, (1996))를, 각각 12 ㎍, 4 ㎍, 2 ㎍, 4 ㎍ 및 4 ㎍/dish의 양비 트랜스펙트한다. 수시간 배양 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 세포를 2회 세정하고, 40 ㎍/mL의 시토신 β-D-아라비노후라노시드(Cytosine β-D-arabinofuranoside)(AraC:Sigma, St.Louis, MO) 및 7.5 ㎍/mL의 트립신(Trypsin)(Gibco-BRL, Rockville, MD)을 포함하는 MEM에서 배양한다. 이들의 세포를 회수하여, 펠릿(pellet)을 OptiMEM에 현탁한다(10⁷ cells/㎖). 동결융해를 3회 반복하여 리포펙션 시약(lipofection reagent) DOSPER(Boehringer mannheim)와 혼합하고(10⁶ cells/ 25 ㎕ DOSPER) 실온에서 15분 방치한 후, 상기에서 클로닝한 F 발현 헬퍼 세포에 트렌스펙션(10⁶ cells/well 12-well-plate)하고, 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/㎖ AraC, 7.5 ㎍/㎖ 트립신을 포함한다)에서 배양하여 상청을 회수한다. F 이외의 유전자, 예를 들면 HN 또는 M 유전자를 결손한 바이러스도, 이것과 동일한 방법으로 조제할 수 있다.

바이러스 유전자 결손형 벡터를 조제하는 경우, 예를 들면, 벡터에 포함되는 바이러스 게놈 위에서 결손하고 있는 바이러스 유전자가 상이한 2종류 또는 그 이상의 벡터를 동일한 세포로 도입하면, 각각에서 결손되는 바이러스 단백질이 다른 벡터로부터의 발현에 의해 공급되기 때문에, 서로 상보하여 감염력이 있는 바이러스 입자가 형성되고, 복제 사이클이 돌아 바이러스 벡터가 증폭된다. 즉, 2종류 또는 그 이상의 본 발명의 벡터를, 바이러스 단백질을 상보하는 조합으로 접종하면, 각각의 바이러스 유전자 결손형 바이러스 벡터의 혼합물을 대량으로 또한 저비용으로 생산할 수 있다. 이들의 바이러스는, 바이러스 유전자가 결손되어 있기 때문에, 바이러스 유전자를 결손하고 있지 않은 바이러스에 비해 게놈 사이즈가 작아져 사이즈가 큰 외래 유전자를 보유할 수 있다. 또한 바이러스 유전자의 결손에 의해 증식성이 없는 이들 바이러스는 세포 밖에서 희석되어 공감염(coinfection)의 유지가 곤란하여 멸균화하기 때문에, 환경방출 관리상의 이점이 있다.

본 발명의 파라믹소바이러스에 의해 도입하는 외래 유전자로서는, 특별히 제한은 없지만, 천연 단백질로서는 예를 들면 호르몬, 사이토카인, 증식인자, 수용체, 세포 내 시그널 분자, 효소, 펩티드 등을 들 수 있다. 단백질은 분비 단백질, 막 단백질, 세포질 단백질, 핵 단백질 등이 있을 수 있다. 인공적인 단백질로서는 예를 들면, 키메라 독소 등의 융합 단백질, 도미넌트 음성 단백질(수용체의 가용성 분자 또는 막 결합형 도미넌트 음성 수용체를 포함한다), 결실형 세포 접착분자 및 세포 표면분자 등을 들 수 있다. 또한, 분비 시그널, 막 국재화 시그널, 핵이행 시그널 등을 부가한 단백질이어도 된다. 도입 유전자로서 안티센스 RNA 분자 또는 RNA 절단형 리보자임 등을 발현시켜서, T 세포에서 발현하는 특정 유전자의 기능을 억제하는 것도 가능하다. 외래 유전자로서 질환의 치료용 유전자를 사용하여 바이러스 벡터를 조제하면, 이 벡터를 투여하여 유전자치료를 행하는 것이 가능해진다. 본 발명의 바이러스 벡터의 유전자치료로의 응용으로서는, 직접 투여에 의한 유전자 발현, 간접(ex vivo) 투여에 의한 유전자 발현 중 어느 방법으로도, 치료효과를 기대할 수 있는 외래 유전자 또는 환자의 체내에서 공급이 부족한 내재 유전자 등을 발현시키는 것이 가능하다. 또한 본 발명의 방법은, 재생의료에 있어서의 유전자치료 벡터로서도 이용할 수 있다.

또한, 복제성 파라믹소바이러스 벡터를 개체 또는 세포에 투여 후, 치료가 완료되는 등 바이러스 벡터의 증식을 억제할 필요가 발생한 때에는, RNA 의존성 RNA 폴리머라아제 저해제를 투여하면, 숙주에 장해를 부여하지 않고 바이러스 벡터의 증식만을 특이적으로 억제하는 것도 가능하다.

본 명세서에 기재한 바이러스 제조방법에 따르면, 본 발명의 바이러스 벡터는 예를 들면 1×10⁵ CIU/mL 이상, 바람직하게는 1×10⁶ CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 5×10⁶ CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 1×10⁷ CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 5×10⁷ CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 1×10⁸ CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 5×10⁸ CIU/mL 이상의 역가로 바이러스 생산세포의 세포 외액 중에 방출시키는 것이 가능하다. 바이러스의 역가는, 본 명세서 및 다른 기재의 방법에 의해 측정할 수 있다(Kiyotani, K. et al., Virology 177(1), 65-74(1990); WO00/70070).

회수한 파라믹소바이러스 벡터는 실질적으로 순수해지도록 정제할 수 있다. 정제방법은 여과(filtration), 원심분리 및 칼럼 정제 등을 포함하는 공지의 정제·분리방법 또는 그 조합에 의해 행할 수 있다. 「실질적으로 순수」란, 바이러스 벡터가, 그것이 존재하는 시료 중의 성분으로서 주요한 비율을 차지하는 것을 말한다. 전형적으로는, 실질적으로 순수한 바이러스 벡터는 시료 중에 포함되는 전체 단백질(단 캐리어 또는 안정제로서 가한 단백질은 제외한다) 중, 바이러스 벡터 유래의 단백질의 비율이 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상을 차지하는 것에 의해 확인할 수 있다. 파라믹소바이러스의 구체적인 정제방법으로서는, 예를 들면 셀룰로오스 황산에스테르 또는 가교 폴리사카라이드 황산에스테르를 사용하는 방법(일본국 특허공고 제(소)62-30752호 공보, 일본국 특허공고 제(소)62-33879호 공보 및 일본국 특허공고 제(소)62-30753호 공보), 및 푸코오스 황산 함유 다당 및/또는 그 분해물에 흡착시키는 방법(WO97/32010) 등을 예시할 수 있다.

벡터를 포함하는 조성물의 제조에 있어서는, 벡터는 필요에 따라 약리학적으로 허용되는 목적으로 하는 담체 또는 매체와 조합시킬 수 있다. 「약리학적으로 허용되는 담체 또는 매체」란, 벡터와 함께 투여하는 것이 가능하고, 벡터에 의한 유전자 도입을 유의하게 저해하지 않는 재료이다. 예를 들면 벡터를 생리식염수, 인산완충 생리식염수(PBS), 또는 배양액 등으로 적절히 희석하여 조성물로 할 수 있다. 벡터를 계란에서 증식시킨 경우 등에 있어서는 요액을 포함해도 된다. 또한 벡터를 포함하는 조성물은, 탈 이온수, 5% 덱스트로오스 수용액 등의 담체 또는 매체를 포함하고 있어도 된다. 추가로, 그 밖에도, 식물유, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 살생물제 등이 함유되어 있어도 된다. 또한 보존제 또는 그 밖의 첨가제를 첨가할 수 있다. 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물은 시약으로서 및 의약으로서 유용하다.

본 발명의 벡터를 사용한 T 세포로의 유전자 도입은, 다양한 질환에 대한 유전자치료에 적용하는 것이 기대된다. 이와 같은 유전자치료에는, 예를 들면, 유전자 결손에 의한 세포에서의 발현 이상(異常)을 보정하기 위해, 또한, 외래 유전자를 세포에 도입함으로써 새로운 기능을 부가시키기 위해, 또는 어떤 유전자에 대해 억제적으로 작용하는 유전자를 도입함으로써 세포에 있어서의 바람직하지 않은 작용을 억제하기 위해 행할 수 있다.

본 발명의 방법은, 예를 들면 자기면역질환 등에 있어서 거절반응을 억제하기 때문에 유용하다. 예를 들면 알로항원(alloreaction), 또는 자기면역질환의 원인으로 되는 주요한 항원을 인식하는 활성화 T 세포 수립주를 사용하여, 그 T 세포에 본 발명의 방법에 따라 억제성 사이토카인, 예를 들면 IL-10 등을 강발현시킴으로써, 생체 내의 T 세포의 알로반응을 억제, 또는 억제성 수상세포의 유도에 의해, 거절반응을 조절할 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 본 발명의 방법에 의한 T 세포로의 유전자 도입을 매개로 한 암치료도 기대된다. 예를 들면, 종양 특이적 항원을 인식하는 T 세포에 혈관 증식억제 유전자를 코드하는 벡터를 도입함으로써, 국소의 종양 증식억제 효과가 기대된다. 또는 탈수초성 질환(demyelinating disease)인 다발성 경화증 등의 경우에는 그 타겟이 되는 항원으로 활성화한 T 세포를 사용하여, 희돌기아교세포(oligodendrocyte)를 간세포로부터 분화시킬 수 있는 PDGF(platelet derived growth factor-A) 등의 유전자를 도입하고, 국소에서의 희돌기아교세포(oligodendrocyte) 재생을 촉진하여, 병세의 조절이 가능할 것으로 예상된다(Vincent, K. T. et al., Journal of Neuroimmunology, 2000, 107: 226-232). 그 밖에도, 항원활성화 T 세포 또는 항원 비특이적 활성화 T 세포(항체 또는 마이토젠을 사용하는 활성화 T 세포)를 사용하여, 유전자 도입함으로써 치료효과가 기대되는 모든 질환·상해에 대해서, 본 발명의 방법을 적용하는 것이 가능하다.

파라믹소바이러스에 의해 도입된 유전자의 전사는, 인터페론(IFNs) 등의 숙주 유래의 인자에 의해 영향을 받는다(Kato, A. et al., J. Virol., 2001, 75: 3802-3810). 알로항원으로 자극한 T 세포주로부터는 대량의 IFN이 생산되기 때문에, IFN-γ 등의 IFN이 파라믹소바이러스 벡터로부터의 유전자 전사에 영향을 줄 가능성이 있다(Biron, C.A. and Sen, G.C., Interferons and other cytokine. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds). Fields of virology. Vol. 2. Lippincott-Raven Publishers: Philadelphia, 1996. 321-351). 실제, 본 발명자 등은, IFN-γ 수용체 결손 마우스로부터의 알로활성화 T 세포주는, 3주일 이상에 걸쳐 EGFP의 비교적 높은 발현이 지속되는 것을 발견하였다. 따라서, T 세포를 지향한 유전자치료에 있어서, 표적 유전자의 높은 레벨의 발현이 필요한 경우에는, IFN-γ의 시그널 전달을 억제하는 것이 유효하다고 생각된다.

벡터의 투여량은 질환, 환자의 체중, 연령, 성별, 증상, 투여 목적, 투여 조성물의 형태, 투여방법, 도입 유전자 등에 따라 상이하지만, 당업자라면 적절히 결정하는 것이 가능하다. 투여 경로는 적절히 선택할 수 있다. 또한 국소 또는 전신에 투여할 수 있다. 투여되는 벡터는 바람직하게는 약 10⁵ CIU/㎖에서 약 10¹¹ CIU/㎖, 보다 바람직하게는 약 10⁷ CIU/㎖에서 약 10⁹ CIU/㎖, 가장 바람직하게는 1×10⁸ CIU/㎖에서 약 5×10⁸ CIU/㎖ 범위 내의 양을 약학상 용인 가능한 담체 중에서 투여하는 것이 바람직하다. 인간에 있어서는 1회당 투여량은 2×10⁵ CIU~2×10¹¹ CIU가 바람직하고, 투여 횟수는 1회 또는 임상상 용인 가능한 부작용의 범위에서 복수회 가능하며, 1일 투여 횟수에 대해서도 동일하다. 인간 이외의 동물에 대해서도, 예를 들면 목적의 동물과 인간의 체중비 또는 투여 표적 부위의 용적비(예를 들면 평균값)로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 엑스비보(ex vivo) 투여의 경우는, 체외(예를 들면 시험관 또는 샬레 내)에서 T 세포에 벡터를 접촉시킨다. MOI는 1~500 사이로 투여하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2~300, 더욱 바람직하게는 3~200이다. 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물의 투여 대상으로서는 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 소, 개 등 모든 포유 동물이 포함된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 마우스 T 세포에 있어서의 SeV에 의한 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다. 활성화 또는 나이브 T 세포에 있어서의 유전자 도입효율을 나타낸다. 마우스 림프구를 2.5×10⁷ PFU(MOI 62.5)의 SeV-EGFP의 존재하 또는 비존재하에서 2일간 배양하고, 세포를 회수하여 APC 결합 항CD3 및 PE 결합 항CD4(위 패널) 또는 항CD8(아래 패널) 항체로 염색하였다. 도트 플롯(dot plot)은, 생존하고 있는 CD3⁺ CD4⁺ 또는 CD3⁺ CD8⁺ 림프구 중의 각각 CD4 또는 CD8과, GFP의 발현을 나타낸다. 4분할한 각각의 오른쪽 위 모서리에, EGFP 양성세포의 비율로서 유전자 도입효율을 나타내었다. 왼쪽의 패널:항체를 코트하지 않은 웰에서 세포를 배양하였다. 중앙의 패널: 활성화 항체(항CD3 및 항CD28 항체)를 코트한 웰에서 세포를 배양하였다. 오른쪽 패널:활성화 항체(항CD3 및 항CD28 항체)를 코트한 웰에서, SeV-EGFP 없이 세포를 배양하였다. 음성대조로서, 루시페라아제(luciferase)를 발현하는 SeV-luci와 함께 배양한 세포로부터도 유사한 데이터를 취득하였다. 4회보다 많은 독립된 실험으로부터, 재현성이 있는 데이터가 얻어졌다.

도 2는 T 세포주로의 SeV에 의한 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다. T 세포주를 2.5×10⁷ PFU(MOI 62.5)의 SeV-EGFP의 존재하 또는 비존재하에서 2일간 배양하고, 세포를 회수하여 APC 결합 항CD3 및 PE 결합 항CD4(위 패널) 또는 항CD8(아래 패널) 항체로 염색하였다. 가장 왼쪽 패널의 도트 플롯은 게이트(구분)된 생존하고 있는 림프구 중의 CD3 및 CD4 또는 CD8의 발현을 나타낸다. 각각의 4분할의 비율이 나타내어져 있다. 다른 패널의 도트 플롯은 게이트된 CD3 양성의 생존 림프구 중의 CD4 또는 CD8 T 세포의 EGFP의 발현을 나타낸다. 왼쪽에서 2번째의 패널에서는, 세포를 조사 B6 스티뮬레이터(자극세포)와 함께 배양하였다. 3번째의 패널에서는, 세포를 조사 Balb/c 스티뮬레이터(자극세포)와 함께 배양하였다. 마지막 패널에서는, 세포를 조사 Balb/c 스티뮬레이터(자극세포)와 함께 SeV-EGFP 없이 배양하였다. 4회보다 많은 독립된 실험으로부터, 재현성이 있는 데이터가 얻어졌다.

도 3은, 나이브 T 세포 및 T 세포주의 알로항원 특이적 활성화에 있어서의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다. 나이브 2C 림프구(위 패널:"1x"의 문자) 또는 2C T 세포주(아래 패널:"3x"의 문자)를 2.5×10⁷ PFU의 SeV-EGFP의 존재하 또는 비존재하에서 2일간 배양하고, 세포를 회수하여 APC 결합 항CD8 및 비오틴 결합 항클론타입 T 세포 리셉터 mAb(1B2)로 염색하고, 추가로 PE 스트렙트아비딘(streptavidin)으로 염색하였다. 가장 왼쪽 패널은, 게이트된 생존 림프구 중의 CD8⁺ 1B2⁺ T 세포의 비율을 나타낸다. 다른 패널의 도트 플롯은, 생존하고 있는 클론타입 T 세포의 EGFP의 발현을 나타낸다. 왼쪽에서 2번째의 패널에서는, 세포를 조사 B6 스티뮬레이터(자극세포)와 함께 배양하였다. 3번째의 패널에서는, 세포를 조사 Balb/c 스티뮬레이터(자극세포)와 함께 배양하였다. 마지막 패널에서는, 세포를 조사 Balb/c 스티뮬레이터(자극세포)와 함께 SeV-EGFP 없이 배양하였다. 2회의 독립된 실험으로부터, 재현성이 있는 데이터가 얻어졌다.

도 4는 SeV에 의한 유전자 도입에 있어서의 바이스탠더 활성화 효과를 나타내는 도면이다. 50 ㎕의 2C 나이브 림프구(1×10⁷/㎖) 및 50 ㎕의 B6 나이브 림프구(1×10⁷/㎖)를 2.5×10⁷ PFU의 SeV-EGFP의 존재하(X축의 표시가 +인 것) 또는 비존재하(X축의 표시가 -인 것), 100 ㎕를 조사한 Balb/c(검은색 바), B6(회색 바), 또는 C3H(체크무늬 바) 림프구(1×10⁷/㎖) 또는 림프구 없이(흰색 바) 2일간 자극하였다. 게이트된 생존하고 있는 CD8⁺ 1B2⁺ T 세포로부터 EGFP 양성세포의 비율을 얻었다. Y축은 EGFP 양성 클론타입 세포의 비율을 나타낸다. 각각의 데이터는 3연속으로 한 웰(n=3)의 평균±표준오차(SEM)으로서 나타내고, 2회의 독립된 실험에서 유사한 결과를 얻었다. C3H로 자극한 2C T 세포와 Balb/c로 자극한 2C T 세포 사이에는 통계학적 유의차(p<0.01)가 있었지만, C3H로 자극한 2C T 세포와 B6으로 자극한 2C T 세포 사이에는 그것이 없었다. 통계학적 유의성은 일원배치 분산분석법(one-way anaylysis) 및 피셔 PLSD 시험(Fisher's PLSD test)을 사용하여 결정하였다.

도 5는 SeV-EGFP에 의해 유전자 도입된 T 세포의 GFP 발현의 유지를 나타내는 도면이다. 2C-tg 마우스로부터의 T 세포주를, SeV-EGFP의 존재하, B6(왼쪽 칼럼) 또는 Balb/c(오른쪽 칼럼)를 조사한 림프구로 6일간 자극하고, 유전자 도입한 T 세포를 새로운 배지로 세정 후, SeV 없이 조사한 B6 또는 Balb/c 스티뮬레이터로 6 또는 7일간 재자극하였다. 도트 플롯은, 생존하고 있는 클론타입 T 세포 중의 EGFP의 발현을 나타낸다. 4분할의 각 오른쪽 위 모서리의 숫자는 day 13(위 패널) 및 day 20(중앙 패널)에 있어서의 EGFP 양성 또는 음성 클론타입 T 세포의 비율을 나타낸다. 음성대조로서, 20일간 자극한 비감염 2C T 세포주로부터의 데이터를 나타내었다(아래 패널). 데이터는 2회의 독립된 실험의 대표예이다.

도 6은 인간 T 세포로의 SeV에 의한 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다. 활성화 또는 나이브 T 세포에 있어서의 유전자 도입효율을 나타낸다. 200 ㎕의 인간 림프구(4×10⁶/㎖)를 2.5×10⁷ PFU(MOI 31)의 SeV-EGFP의 존재하 또는 비존재하, 2일간 배양하고, 세포를 회수하여 APC 결합 항CD3 및 PE 결합 항CD4(위 패널) 또는 항CD8(아래 패널) 항체로 염색하였다. 도트 플롯은, 생존하고 있는 CD3⁺ CD4⁺ 또는 CD3⁺ CD8⁺ T 림프구 중의 각각 CD4 또는 CD8과 GFP의 발현을 나타낸다. 유전자 도입효율은 나타내어지고 있는 T 세포 중의 EGFP 양성세포의 비율로서 나타내었다. 왼쪽의 패널:항체를 코트하지 않은 웰에서 세포를 배양하였다. 중앙의 패널: 활성화 항체(항CD3 및 항CD28 항체)를 코트한 웰에서 세포를 배양하였다. 오른쪽의 패널:활성화 항체(항CD3 및 항CD28 항체)를 코트한 웰에서, SeV-EGFP 없이 세포를 배양하였다. 음성대조로서, SeV-luci와 함께 배양한 세포로부터도 동일하게 데이터를 취득하였다. 4분할의 각 오른쪽 모서리의 숫자는 그 집단의 비율을 나타낸다. 4회보다 많은 독립된 실험으로부터 재현성이 있는 데이터가 얻어졌다.

도 7은 인간 나이브 또는 메모리/활성화 T 세포로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다. 새로 단리한 T 세포를 항체를 코트하지 않은 웰에서 SeV-EGFP와 함께 2일간 배양하고, 세포를 회수하여 APC 결합 항CD62L, PE 결합 항CD3 및 비오틴화 항CD45RA 항체로 염색하고, 계속해서 스트렙트아비딘 PerCP로 염색하였다. 왼쪽의 패널에서 도트 플롯은 게이트(구분)된 생존 CD3 양성 T 세포 중의 CD62L 및 CD45RA의 발현을 나타낸다. 오른쪽의 패널에서 도트 플롯은, 나이브 T 세포인 CD62L^high 및 CD45RA^high T 세포 중(위 패널) 또는 메모리/활성화 T 세포인 그 밖의 세포 중(아래 패널)의 CD3 및 EGFP의 발현을 나타낸다. 건강한 정상인 도너로부터의 3회의 실험에 있어서 재현성이 있는 데이터가 얻어졌다.

도 8은 인간 T 세포주로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다. 인간 T 세포주를 도 6과 같이 SeV-EGFP의 존재하 또는 비존재하에서, 2일간 배양하고, 도 6과 같이 분석하였다. CD4(위 패널) 또는 CD8(아래 패널) T 세포 중의 EGFP 발현비율을 나타내었다. 왼쪽의 패널;항체를 코트하지 않은 웰에서 세포를 배양하였다. 중앙 패널;항체(인간 항CD3 및 인간 항CD28 항체)를 코트한 웰에서 세포를 배양하였다. 오른쪽 패널;항체(인간 항CD3 및 인간 항CD28 항체)를 코트한 웰에서, SeV-EGFP 비존재하에 세포를 배양하였다.

도 9는 나이브 또는 활성화 T 세포로의 SeV의 침입(entry)의 평가를 나타내는 도면이다. B6 림프구(4×10⁶/㎖)를 UV로 불활성화한 SeV-luci의 존재하(흰색 및 회색 바) 또는 비존재하(검은색 바)에서 30분 37℃에서 인큐베이트한 후, 세포를 잘 세정하고, SeV-EGFP(MOI=62.5)를 함께 30분 37℃에서 인큐베이트하였다. 세포를 3회 세정한 후, 200 ㎕의 세포 현탁액(2×10⁶/㎖)을 마우스 항CD3 및 마우스 항CD28 항체를 코트한 활성화 웰 중에서 바이러스 없이 2일간 배양하였다. 양성대조로서, 조제한 세포를 2.5×10⁷ PFU의 SeV-EGFP와 함께 활성화 웰 중에서 2일간 배양하였다(흰색 바). 회수한 세포는 APC 결합 항CD3 및 PE 결합 항CD8 항체로 염색하였다. 게이트(구분)된 생존 CD3⁺ CD4⁺ 또는 CD3⁺ CD8⁺ T 세포로부터 EGFP 양성세포의 비율을 얻었다. Y축은 EGFP 양성의 CD4(왼쪽의 3개의 바) 또는 CD8(오른쪽의 3개의 바) T 세포의 비율을 나타낸다. 개개의 데이터는 3연속으로 한 웰(n=3)의 평균비율±SEM으로서 나타내었다. 각 군간에서 통계학적 유의차가 있었다(p<0.01). 통계학적 유의성은 일원배치 분산분석법 및 피셔 PLSD 시험(Fisher's PLSD test)을 사용하여 결정하였다.

도 10은 나이브 또는 활성화 T 세포로의 SeV의 침입(entry)의 평가를 나타내는 도면이다. B6 림프구를 SeV-EGFP(MOI=100)의 비존재하(X축의 가장 왼쪽 스케일) 또는 존재하(X축의 그 밖의 스케일), 30분 4℃에서 인큐베이트하고, 세포를 잘 세정하고, SeV 없이 0, 15, 30, 45 및 90분 37℃에서 인큐베이트하였다. 3회 세정 후, 각각 도시한 기간 인큐베이트한 세포를, 마우스 항CD3 및 마우스 항CD28 항체를 코트한 활성화 웰 중에서 2일간 배양하였다. 세포를 회수하고, 도 9에 기재한대로 염색하였다(CD4 T 세포는 검은색 원, CD8 T 세포는 검은색 사각). 양성대조로서, 조재한 2.5×10⁷ PFU(MOI=62.5)의 SeV-EGFP와 함께 배양하였다. (CD4 T 세포는 흰색 원, CD8 T 세포는 흰색 사각). 값은 3연속으로 한 웰(n=3)의 평균 비율±SEM으로서 나타내었다. CD4 T 세포 및 CD8 T 세포의 양쪽에 있어서, 37℃ 0분의 인큐베이션에 있어서의 값과 15분의 인큐베이션에 있어서의 값 사이에 통계학적 유의차가 있었다(p<0.01). 더욱이, 37℃ 0분의 인큐베이션에 있어서의 값과 90분의 인큐베이션에 있어서의 값 사이에도 통계학적 유의차가 있었다(p<0.01). 통계학적 유의성은 일원배치 분산분석법 및 피셔 PLSD 시험(Fisher's PLSD test)을 사용하여 결정하였다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서 중에 인용된 문헌은, 본 명세서의 일부로서 삽입된다. 통계적 유의성은 일원배치 분산분석법 및 피셔 PLSD 시험(Fisher's PLSD test)을 사용하여 결정하였다. p<0.05를 통계적 유의로 하였다.

동물

근교계(近交係) 암컷 C57BL/6(H-2^b)(B6이라고 약기한다), C3H(H-2^k) 및 암컷 Balb/c(H-2^d) 마우스(Charles River 그레이드 마우스)는 KBT 오리엔탈(Tosu, Japan)으로부터 얻었다. 클래스 I MHC 항원 L^d 반응성 T 세포 리셉터(TCR)의 트렌스제닉(transgenic) 마우스인 2C 트랜스제닉 마우스(2c-tg, H-2^b)는 문헌 Sha, W. C. et al., Nature, 1988, 335: 271-274에 기재되어 있다. 마우스는 모두 인도적으로 다루고, 특정 병원균 프리(specific-pathogen-free)로 유지하고, 표준적인 설치류용 먹이 및 수돗물을 주었다. 7~9주령의 마우스를 사용하였다. 동물실험은, 규슈대학에 있어서의 동물실험윤리위원회(Commitee of Ethics on Animal Experiments) 및 재조합 DNA 실험위원회(Commitee of Recombinant DNA Experiments)의 검사를 받아, 규슈대학의 「동물실험 가이드라인」에 따라 실시하였다. 또한, 아메리카 국립위생연구소(National Institute of Health)의 「연구실 동물의 케어(care) 원칙」(Principles of Laboratory Animal Care) 및 「연구실 동물의 케어 및 사용을 위한 지침」(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에도 따랐다.

재조합 SeV의 구축

EGFP(해파리 증강 녹색형광 단백질) 유전자 또는 반딧불이 루시페라아제 유전자를 갖는 SeV(각각 SeV-EGFP 또는 SeV-luci)는, 문헌 기재대로 구축하였다(Kato, A. et al., Genes Cells, 1996, 1: 569-579; Sakai, Y. et al., FEBS Lett., 1999, 456: 221-226). 구체적으로는, Not I 제한효소부위를 포함하는 18 bp의 스페이서서열 5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'(서열번호: 3)을, SeV의 게놈을 코드하는 cDNA를 포함하는 벡터의 5' 비번역영역과 뉴클레오캡시드(N) 유전자의 개시코돈 사이에 삽입한다. 클론화된 SeV 게놈 cDNA를 포함하는 이 벡터에는, 델타 간염 바이러스의 안티게놈 가닥의 자기 절단형 리보솜 부위도 포함되어 있다. Not I 부위와 외래 유전자의 발현을 위한 새로운 SeV의 E 및 S 시그널 서열 태그(tag)세트를 포함하는 프라이머를 사용하여, EGFP(SeV-EGFP에 대해서) 또는 루시페라아제(SeV-luci에 대해서)를 코드하는 전체 cDNA를 PCR에 의해 증폭하고, 상기 클론화한 게놈의 Not I 부위에 삽입하였다. 주형(鑄型)이 되는 SeV 게놈의 전장은 외래 유전자를 포함하여 6의 배수의 염기로 되도록 하였다(이른바 "6의 룰"(rule of six))(Kolakofsky, D. et al., J. Virol. 1998, 72: 891-899). 외래 유전자를 갖는 주형 SeV 게놈, 및 N, 포스포(P) 및 라지(L) 단백질을 코드하는 플라스미드(각각 플라스미드 pGEM-N, pGEM-P 및 pGEM-L)를 상업적으로 입수 가능한 양이온성 리피드(cationic lipid)와 복합체를 형성시켜, 백시니아 바이러스 vT7-3과 함께 CV-1 또는 LLCMK 세포에 공트랜스펙트하였다(Fuerst, T.R., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1986, 83: 8122-8126). 40시간 후, 동결융해를 3회 반복하여 세포를 파쇄하고, 10일령(10-day-old)의 발육계란의 요낭(chorioallantoic cavity)에 주입하였다. 그 후 바이러스를 회수하고, 계란 중에서 2회 계대하여 백시니아 바이러스를 제거하였다. 닭 적혈구를 사용한 헤마글루티네이션 어세이(hemagglutination assay)에 의해 바이러스의 역가를 결정하고(Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999), 바이러스는 사용할 때까지 -80℃에서 보존하였다.

단일클론항체(mAb)

비오틴화 인간 CD45RA(HI100)mAb, 알로피코시아닌(allophycocyanin; APC) 결합 항마우스CD3(145-2C11), 마우스 CD8(53-6.7) 및 인간 CD62L(DREG-56)mAb, 피코에리스린(PE) 결합 항인간 CD3(UCHT1), 인간 CD4(RPA-T4), 마우스 CD4(GK1.5) 및 마우스 CD8(53.67)mAb, PE 결합 스트렙트아비딘 및 페리디닌 클로로필 α 프로틴(peridinin chlorophyll α protein; perPC) 결합 스트렙트아비딘은 PharMingen(San Diego, CA, USA)으로부터 구입하였다.

APC 결합 항인간 CD3(UCHT1)mAb는 DAKO(Kyoto, Japan)로부터 구입하였다. PE 결합 항인간 CD8(NU-Ts/c) mAb는 니치레이(Tokyo, Japan)로부터 구입하였다. 항2C 클론타입 TCR 결정인자(anti 2C clontypic TCR determinant)mAb는, 본 발명자 등이 하이브리도마(hybridoma)(1B2)(Sha, W.C. et al., Nature, 1988, 335: 271-274)의 배양상청으로부터 HiTrap protein G 칼럼(Amersham Pharmacia Bioscience Inc., Buckinghamshire UK)을 사용하여 정제하고, EZ-Link™ NHS-LC Biotin(PIERCE Biotechnology Inc., Rockfold, IL, U.S.A)을 사용하여 비오틴화 하였다.

T 세포의 활성화를 위해, PharMingen(San Diego, CA, USA)으로부터 구입한 정제 항마우스 CD3(145-2C11), 마우스 CD28(37.51), 인간 CD3(HIT3a), 항인간 CD28(CD28.2)을 사용하였다.

세포의 조제

20 mM N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)(HEPES), 0.2% 나트륨 중탄산염(sodium bicarbonate), 50 μM 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol)(2-ME), 10 ㎍/㎖ 겐타마이신 나트륨(gentamicine sodium) 및 10% 열부동화 소태아혈청(FBS)(ICN Biomedicals, Inc., Arora, OH, U.S.A.)을 가한 RPMI 1640(SIGMA, St. Louis, MO, U.S.A.) 배지를 완전배지로서 사용하였다.

마우스 림프구의 조제를 위해, 비장, 림프절을 회수하여 완전배지 중, 얼음 위에 유지하였다. 비장 및 림프절은 배지 중, 2장의 슬라이드글라스 사이에서 조직단편에 압력을 가하여 파쇄하였다. 세포현탁액을 스테인리스 메쉬로 여과하고, 배지로 2회 세정하였다. 적혈구는 염화암모늄 탄산칼륨 리시스 완충액(ammonium chloride potassium carbonate lysing buffer)을 사용하여 리시스시켰다. 인간 말초혈 림프구(PBL)에 대해서는, 건강한 정상인 도너로부터 혈액을 채취하고, Ficoll Paque™ Plus(Pharmacia Biotech Inc., Wikstroms, Sweden)에 의해 림프구를 분리하였다. 표준적인 트리판블루 색소 배제 어세이계를 사용하여 생존하고 있는 유핵세포를 카운트하였다.

마우스 및 인간 T 세포주의 수립

알로반응성 T 세포주를 조제하기 위해, B6 또는 2C-tg 마우스의 림프구(5×10⁷)를 30 Gy(¹³⁷Cs; Gammacell 40, Atomic Energy of Canada Limited, Ottawa, Canada)를 조사한 Balb/c 림프구(5×10⁷)와 함께, 50 ㎖ 플라스크(35-3014; FALCON, Beckton Dickinson Bioscience, Inc., Franklin Lake, NJ, U.S.A.) 중, 총량 10 ㎖의 RPMI 1640 완전배지 중에서 6일간 공배양하였다. 활성화한 알로반응성 T 세포는, 10 ng/㎖의 인간 IL-2(Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd, Fujioka, Japan)를 첨가하고, 조사 Balb/c 림프구에 의해 주마다 자극하였다. 이 방법에서는, B6으로부터 얻어지는 T 세포주는 대부분이 CD8 T 세포로 되기 때문에, CD4 T 세포주를 얻기 위해서 B6의 CD8을 고갈시킨(CD8-depleted) 림프구를 조사 림프구로 자극하였다. CD8을 고갈시킨 림프구의 조제를 위해, 새로 단리한 림프구를 항마우스CD8(Lyt-2.2:Meiji, Tokyo, Japan)mAb와 함께 30분 4℃에서 인큐베이트하고, 계속해서 Low-Tox™-M Rabbit completent (Cedarlane, Ontario, Canada)와 함께 50분 37℃에서 인큐베이트하였다. 3회 이상 자극한, B6 또는 2C-tg의 알로항원활성화 T 세포를 마우스 T 세포주로서 사용하였다.

인간 T 세포를 조제하기 위해, 어떤 건강인의 말초혈 림프구(5×10⁶)를 다른 건강인의 방사선 조사(30 Gy) 말초혈 림프구(5×10⁶)와 10 ng/㎖의 human IL-2 존재하에 1 ㎖의 RPMI-1640 감염배지 중에서 7일간 공배양하였다. 그 후, 7일간마다 적어도 2회의 림프구에 의한 재자극을 행한 것을 T 세포주로서 사용하였다.

플로우 사이토메트리 해석

회수한 마우스 세포를 원심분리하고, 항마우스 CD16/32 mAb를 생산하는 배양 하이브리도마(2.4G2; American type culture colletion, Manassas, VA, U.S.A)의 상청 50 ㎕와 30분 4℃에서 인큐베이트하였다. 인간 림프구에서는 이 단계는 배제하였다. 세포를 완전배지로 세정하고, mAb를 다양하게 조합시켜 30분 4℃에서 인큐베이트한 후, 완전배지에서 2회 세정하였다. 비오틴화 mAb는 PE 스트렙트아비딘 또는 PerCP 스트렙트아비딘으로 검출하였다. 표지한 세포는 FACS Caliber에 의해 CellQuest 프로그램(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 및 FLOWJO 프로그램(TREE STAR, Inc., San Carlos, CA, USA)을 사용하여 해석하였다. 사이토미터에 어플라이하기 직전에, 사(死)세포를 검출하여 배제하기 위해 250 ㎕의 세포 현탁액에 125 ng의 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)(PI)을 가하였다. 이 단계는, 인간 활성화/메모리 T 세포로부터의 나이브 T 세포의 인식에 있어서는 제외하였다. EGFP는 형광 1(fluorescence 1)로 검출하였다. 마우스 또는 인간의 실험에 있어서 CD3⁺ CD4⁺ PI^- 세포의 집단을 생존 CD4 T 세포로 표시하고, CD3⁺ CD8⁺ PI^- 세포의 집단을 생존 CD8 T 세포로 표시하였다. 트랜스제닉 클론타입 T 세포인 CD8⁺ 1B2⁺ PI^- 세포를 생존 2c T 세포로 표시하였다. 나이브 인간 T 세포 또는 활성화/메모리 인간 T 세포는 각각 CD62L⁺ CD45RA⁺ CD3⁺세포로서 게이트(구분)된 것 또는 CD3⁺세포 중의 그 외로서 게이트(구분)된 것으로 하였다(Picker, L.J. et al., J. Immunol., 1993, 150: 1105-1121; Ostrowski, M.A. et al., J. Virol., 1999, 73: 6430-6435).

마우스 또는 인간 T 세포로의 SeV에 의한 유전자 송달

활성화 또는 나이브 T 세포에 있어서의 유전자 도입효율을 평가하기 위해, 항마우스 CD3 mAb(15 ㎍/㎖) 및 항마우스 CD28 mAb(20 ㎍/㎖)로 코트하거나 또는 코트하지 않은 96웰 바닥이 평평한 플레이트(3860-096; IWAKI, Tokyo, Japan) 중에서 200 ㎕의 마우스 림프구(2×10⁶/㎖)의 현탁액을 2.5×10⁷ plaque forming unit(PFU)의 SeV-EGFP와 함께 2일간 배양하였다. 인간 림프구에서는, 항인간 CD3 mAb(10 ㎍/㎖) 및 항인간 CD28 mAb(10 ㎍/㎖)로 코트하거나, 또는 코트하지 않은 96웰 바닥이 평평한 플레이트 중에서, 200 ㎕의 인간 말초혈 림프구(PBL)(4×10⁶/㎖) 또는 인간 T 세포주(4×10⁶/㎖)의 현탁액을 2.5×10⁷ PFU의 SeV-EGFP와 함께 2일간 배양하였다. 알로활성화 T 세포주의 도입효율의 평가에서는, 2.5×10⁷ PFU의 SeV-EGFP와 함께 100 ㎕의 B6 또는 2C-tg 마우스의 T 세포주(2×10⁶/㎖)를 B6 또는 Balb/c 마우스의 30 Gy를 조사한 림프구(1×10⁷/㎖) 100 ㎕와 2일간 공배양하거나, 또는 200 ㎕의 B6 또는 2C-tg 마우스 T 세포주(2×10⁶/㎖)를 항체(항CD3 항체 및 항CD28 항체)를 코트한 96웰 바닥이 평평한 플레이트에서 2일간, 2.5×10⁷ PFU의 SeV-EGFP와 공배양해서 행하였다. 나이브 T 세포의 알로항원 특이적 활성화에 있어서의 유전자 도입효율의 평가에서는, 2C-tg 마우스로부터 새로 단리한 림프구를 사용하였다. 별도의 실험에서는 6×10⁸ PFU의 SeV-EGFP 존재하, 2C-tg 마우스로부터의 T 세포주(2×10⁶/㎖) 2.5 ㎖를 B6 또는 Balb/c 마우스로부터의 30 Gy 조사림프구(1×10⁷/㎖) 2.5 ㎖로 6일간 자극하고(3 또는 4일마다, 절반의 배지를 새로운 배지로 교환하였다), 유전자 도입을 행한 T 세포를 새로운 배지로 세정하고, SeV 없이 6 또는 7일간, 조사 B6 또는 Balb/c 림프구로 재자극하였다(재자극은 6 또는 7일마다 행하였다). 바이스탠더 활성화 효과를 평가하기 위해서는 50 ㎕의 2C 나이브 림프구(1×10⁷/㎖) 및 50 ㎕의 B6 나이브 림프구(1×10⁷/㎖)의 혼합액을 2.5×10⁷ PFU의 SeV-EGFP 존재하, 100 ㎕의 조사Balb/c, B6 또는 C3H 림프구(1×10⁷/㎖) 100 ㎕로 2일간 자극하였다.

각 샘플을 3개의 웰에 중복시키고, 5% CO₂를 포함하는 습한 대기중에서 37℃에서 배양하였다. SeV의 감염 후 48시간에서 EGFP의 발현은 최대로 되었다. 적당한 농도의 활성화 mAB 또는 최적화한 용량의 SeV를, 적정화(titration) 실험에 의해 결정하였다. 최대의 비율로 T 세포에 EGFP를 도입하는 SeV의 최저 용량은, 다중감염도(Multiplicity of infection; MOI) 12.5로, 500보다 높은 MOI의 SeV는 T 세포에 대해 세포 변성효과(cytopathic effect)를 갖고 있다.

나이브 또는 활성화 세포로의 SeV 침입(entry)의 평가

B6 림프구(4×10⁶/㎖)를 2000 mj의 UV(UV crosslinker; Pharmacia Biotech Inc., San Francisco, CA, USA)로 불활성화한 SeV-luci(5×10⁸ PFU/㎖)의 1:1 비에서의 존재하 또는 비존재하, 30분 37℃에서 인큐베이트한 후, 세포를 완전배지로 잘 세정하고, SeV-EGFP(2.5×10⁸ PFU/㎖)와 1:1 비로 30분 37℃에서 인큐베이트하였다. 3회 세정한 후, 200 ㎕의 세포 현탁액(2×10⁶/㎖)을 항마우스 CD3 mAb(15 ㎍/㎖) 및 항마우스 CD28 mAb(20 ㎍/㎖)로 코트한 96웰 바닥이 평평한 플레이트 중에서 2일간 배양하였다. 마지막 세정을 행한 배지 중에 혼입되어 있는 SeV는 활성화 웰 중의 전처리하지 않은 T 세포에 대해 대부분 EGFP를 도입하는 능력이 없었기 때문에, 이 세정 과정은 충분했던 것이 확인되었다. 양성대조로서, 제조한 세포를 활성화 웰에서 2.5×10⁷ PFU의 SeV-EGFP와 함께 2일간 배양하였다. 나이브 T 세포로부터의 접착한 SeV의 해리를 조사하기 위해, 10 ㎖의 B6 림프구(2×10⁶/㎖)를 2×10⁹ PFU의 SeV-EGFP 존재하 또는 비존재하, 30분 4℃에서 인큐베이트하고, 세포를 완전배지로 잘 세정한 후, SeV 없이 0, 15, 30, 45 및 90분 37℃에서 인큐베이트하였다. 3회 세정한 후, 세포를 활성화 웰 중에서 37℃에서 2일간 배양하였다. 양성대조로서, 조제한 세포를 2.5×10⁷ PFU의 SeV-EGFP와 함께 배양하였다.

[실시예 1] 재조합 SeV는 높은 효율로 EGFP를 활성화 T 세포에 도입한다

센다이 바이러스 벡터가 T 세포에 EGFP 유전자를 도입할 수 있는지를 조사하였다. 먼저, 마우스 림프구를 SeV-EGFP(MOI=62.5)와 함께 48시간 배양하였다. EGFP 양성의 비자극 마우스 CD3⁺ CD4⁺ 또는 CD3⁺ CD8⁺ T 세포(각각 CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포라고도 칭한다)의 비율은 낮았던 한편(각각 0.5~1.5% 또는 0.8~2.0%), 고착화한 항CD3 항체 및 항CD28 항체를 사용하여 비특이적으로 활성화한 CD3⁺ CD4⁺ 또는 CD3⁺ CD8⁺ T 세포는 높은 강도로 EGFP를 발현하여, EGFP 양성세포의 비율은 극적으로 상승하였다(각각 65~85% 또는 70~92%)(도 1). CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 양쪽의 경우에서, EGFP 양성세포의 비율은 SeV의 용량 의존적으로 상승하여, MOI가 12.5일 때 거의 플래토 레벨(plateau level)에 도달하였다.

이어서, 항원으로 활성화한 T 세포주로의 유전자 송달이 가능한지의 여부를 조사하기 위해, in vivo에서 면역하지 않고 초대 배양에 있어서 나이브 T 림프구가 응답하여 증식할 수 있는 T 세포 자극항원으로서 알로항원을 사용하였다. C57BL/6으로부터의 비개변 림프구와 Balb/c로부터의 조사 림프구의 공배양에 의해 생성한 T 세포주는, 대부분은 CD8 T 세포로 되기 때문에, CD8 T 세포를 고갈시킨 림프구를 조사한 자극 림프구와 공배양하여 CD4 T 세포주를 얻었다. 또한 이것과는 별도로, 2c-tg 마우스로부터의 T 세포(2c T 세포)를 사용하였지만, 이것은 L^d 특이적 TCR을 발현하는 나이브 T 세포 클론을 대량으로 갖고 있어, 항원 특이적인 초대 T 세포의 응답에 있어서의 유전자 도입을 관찰하는 것이 가능하였다. 기대한 바와 같이, 알로항원으로 자극한 T 세포주는, 조사를 행한 알로제닉(allogenic)한 림프구의 존재하 SeV에 의해 효율적으로 EGFP가 도입되었다(도 2). 더욱이, 자극하는 알로제닉한 림프구의 비존재하에서 조차도 활성화 T 세포는 효율적으로 유전자 도입되었다(도 2). 이 효과는, CD4 T 세포 및 CD8 T 세포 양자에서 공통하고 있지만, EGFP 발현 레벨 및 양성세포의 비율은 CD8 T 세포주 보다도 CD4 T 세포주 쪽이 약간 낮은 경향이 있었다. 이들의 사실은, SeV는 T 세포에 대해서, T 세포가 활성화상태라면 표적 유전자를 송달할 수 있는 것을 나타내고 있다.

이들의 사실을 T 세포의 항원 특이적 응답에 있어서 확인하기 위해, L^d 에 특이적으로 응답하고, 나이브한 상태에서도 CD8⁺ 1B2⁺ 집단으로서 벌크의 림프구 중으로부터 구별하는 것이 가능한, 2c-tg 마우스로부터의 T 세포를 사용하였다. 나이브 2c T 세포는 알로인 Balb/c 자극세포 존재하에서만 EGFP를 매우 강하게 발현하고, 신제닉(syngenic)한 B6 자극세포에서는 거의 발현이 보이지 않았지만, Balb/c 자극세포로 3회 이상 자극하고, 활성화한 2c T 세포에 대해서는 B6 또는 Balb/c의 자극세포 중 어느쪽의 존재하에서도 SeV는 효율적으로 EGFP를 도입하였다(도 3). 그것에 더하여, 단순히 T 세포주를 SeV와 함께 단지 30분 37℃에서 인큐베이트해도, EGFP를 최대로 발현시키는데에 충분하였다(데이터 생략).

더욱이, SeV에 의한 이 매우 강한 도입이 항원 특이적으로 활성화한 T 세포에 한정되는 것인가를 명백히 하기 위해, 이하와 같은 실험을 행하였다. 비항원 특이적 T 세포는 in vitro에서의 강력한 알로응답의 바이스탠더 효과에 의해 활성화될 수 있다. C3H 스티뮬레이터가 아니라 Balb/c 스티뮬레이터에 응답할 수 있는 항원 특이적 T 세포로서 나이브 2c T 세포를 사용하였다. C57BL/6 및 2C 나이브 T 세포의 혼합물로 되는 리스폰더(응답세포)를 Balb/c, C57BL/6, C3H 자극세포, 또는 아무것도 없이 공배양하고, 2.5×10⁷ PFU의 SeV-EGFP를 배양 웰에 첨가하였다. 이 배양계에 있어서 혼합 림프구 배양 중에서 C57BL/6 마우스로부터의 T 세포가 C3H 스티뮬레이터에 강하게 응답하고 있을 때, SeV-EGFP에 의해 2c T 세포에 EGFP 유전자가 도입되는지를 조사할 수 있었다. C3H 자극세포를 사용하면, C57BL/6 T 세포의 C3H 스티뮬레이터에 대한 응답은 일어나도, 2c T 세포에 EGFP는 도입되지 않고, C57BL/6 자극세포를 사용한 경우 또는 자극세포를 아무것도 사용하지 않은 경우와 동일하였다(도 4). 그것에 대해, Balb/c 스티뮬레이터를 사용한 경우, 2c T 세포는 EGFP를 매우 강하게 발현하였다(도 4). 따라서, SeV에 의한 이 유전자 도입은 특이적인 항원으로 활성화된 T 세포에 한정되어 있다.

[실시예 2] 활성화 T 세포에 있어서의 SeV에 의한 도입 유전자의 발현기간

이어서, 도입 유전자의 in vitro에서의 유지에 대해서 조사하였다. 활성화 2c T 세포를 센다이 바이러스와 공배양하고, 유전자 도입된 T 세포를 Balb/c 스티뮬레이터 또는 C57BL/6 스티뮬레이터와 in vitro에서 유지하였다. EGFP의 발현은 48시간째에 발현이 피크로 된 후에는, 발현 레벨은 급속하게 저하되지만, 적어도 20일간 유지되었다(도 5 및 생략한 데이터). EGFP의 발현 레벨은 Balb/c 스티뮬레이터에 의해 항원 재자극을 행해도 상승하지 않았다. 이들 사실은, 알로 특이적 활성화 T 세포주에 있어서도 관찰되었다(데이터 생략).

[실시예 3] 활성화 인간 T 세포 및 T 세포주로의 유전자 송달

건강한 정상인으로부터 새로 단리한 인간 PBL을 2.5×10⁷ PFU의 EGFP 발현 SeV 벡터(MOI=30)과 함께 48시간 배양하였다. 마우스 T 세포의 경우와는 대조적으로 EGFP의 발현강도는 비교적 낮지만, 자극하지 않은 인간 CD3⁺ CD4⁺ 및 CD3⁺ CD8⁺ T 세포에 있어서 비교적 높은 EGFP 양성율이 얻어졌다(각각 평균=23.1%, 범위 15~45% 및 평균=34.0%, 범위 18~50%)(도 6).

본 발명자 등은 활성화/메모리 T 세포 집단은, 특정 병원균 프리(Specific-Pathogen-Free)의 조건하에서 유지된 마우스 림프계 조직에 있어서 보다도, 인간 PBL에 있어서의 쪽이 높다고 하는 가설을 세웠다. 활성화/메모리 T 세포로부터 나이브 T 세포(CD45RA⁺, CD62L⁺)를 식별하고, 이들 각 T 세포 집단의 EGFP의 발현을 해석하였다. 기대한 바와 같이, EGFP 양성의 활성화/메모리 T 세포 중의 EGFP 양성세포의 비율은, 나이브 T 세포 중의 EGFP 양성세포 보다도 매우 높고, 나이브 T 세포 중의 EGFP 양성세포의 비율은 4% 보다도 낮았다(도 7). 마우스 실험에서 나타낸 바와 같이, 이미 항원으로 활성화한 T 세포는 항원자극이 없어도 효율 좋게 EGFP가 도입되었기 때문에, 활성화/메모리의 표현형을 갖는 T 세포 중의 활성화 T 세포가 EGFP를 발현했다고 생각되었다. 그것에 대해, 고착화한 항CD3 항체 및 항CD28 항체로 자극한 CD3⁺ CD4⁺ 또는 CD3⁺ CD8⁺ T 세포는 강한 강도로 EGFP를 발현하여, EGFP 양성세포의 비율은 높았다(각각 범위 30~69% 또는 50~70%)(도 6).

인간 알로항원 자극 T 세포주에 있어서는, CD4 또는 CD8 T 세포와 함게 고착화 항체 존재하에서는, 각각 97% 또는 98%로 매우 효율이 좋은 도입을 나타내었다(도 8). 이 T 세포주에 대해서도, 단순히 30분 37℃의 인큐베이트로 EGFP를 최대로 발현시키는데 충분하였다.

[실시예 4] 벡터 접착 후의 SeV 침입(entry)은 활성화 T 세포에서는 일어나지만, 나이브 T 세포에서는 일어나지 않는다

SeV를 매개로 한 활성화 T 세포 특이적인 유전자 송달이 생각되는 기구를 조사하였다. 유전자 도입의 효율에 영향을 미칠 수 있는 요인으로서는, 이하와 같은 것이 있을 수 있다. (i) SeV 특이적인 리셉터(Markwell, M.A. and Paulson, J.C., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1980, 77: 5693-5697), (ii) 융합을 위해 생각되는 공리셉터(Kumar, M. et al., J. Virol., 1997, 71: 6398-6406; Eguchi, A. et al., J. Biol. Chem., 2000, 275: 17549-17555), (iii) T 세포의 활성화에 의한 시그날 전달의 유도, 이것은 SeV가 침입(entry)한 후의 SeV의 전사에 영향일 미칠 수 있다 (Collins, P.L. et al., Parainfluenza viruses. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds). Fields of virology. Vol. 2. Lippincott-Raven Publishers: Philadelphia, 1996: 1205-1241). 이들을 조사하기 위해, 마우스 T 세포를 사용하였다. 활성화한 마우스 T 림프구는 SeV에 의해 효율적으로 유전자 도입되지만, 새로 단리한 마우스 T 림프구는 SeV에 의해 거의 유전자 도입되지 않기 때문에, 마우스 T 세포를 사용한 이들의 실험에서는, 활성화/메모리 T 세포로부터 나이브 T 세포를 세포분리하는 프로세스는 행하지 않았다.

먼저, 새로 단리한 림프구를 자외선(UV)으로 불활성화한 SeV-luci 존재하(전처리한 나이브 T 세포) 또는 비존재하(전처리하지 않은 나이브 T 세포)에서 60분 37℃에서 인큐베이트하고, T 세포의 특이적 리셉터를 간섭시켜, SeV의 HN 뉴라미니다아제 활성에 의해 시알산 잔기를 유리(遊離)시켰다. 그 후, 그들 T 세포를 SeV-EGFP(MOI=62.5)와 함께 30분 37℃에서 인큐베이트하였다. 계속해서 그들 T 세포를, 고착화한 항CD3 및 항CD28 항체로 자극하고, 2일 후에 EGFP의 발현 레벨을 조사하였다. SeV-EGFP로 전처리한 나이브 T 세포에 있어서는, 계속되는 활성화에 있어서의 CD4 또는 CD8 T 세포의 EGFP 양성세포의 경우는, 각각 35% 또는 50%로 되었다(도 9). 그러나, UV로 불활성화한 SeV-luci와 함께 인큐베이트하면, 활성화 T 세포로의 EGFP 유전자 도입은 방해되었다. 불활성화 SeV-luci와 프리인큐베이션해도, 활성화 배양기간 동안 SeV-EGFP와 함께 T 세포를 인큐베이트하면 대부분의 림프구는 EGFP를 발현했기 때문에, 전처리한 T 세포에서 EGFP가 발현하지 않았던 것은 T 세포의 생존이 저하되었기 때문은 아니다(도 9). 이 결과는, 계속되는 인큐베이션 기간에 있어서 SeV를 위한 특이적 리셉터가 회복되었기 때문이라고 생각된다. 더욱이, 마지막 세정 배양액은, 개변하고 있지 않은 활성화 T 세포에 대부분 EGFP를 도입하지 않았기(데이터 생략) 때문에, 세정의 과정이 불충분했을 가능성은 배제할 수 있었다. 이들 사실은, SeV는 유전자 도입을 위해 T 세포상의 특이적 리셉터를 사용하고 있는 것을 시사하고 있다.

T 세포와 SeV-EGFP의 인큐베이션 시간을 결정하는 예비적 실험에 있어서, 인큐베이션 시간을 연장하면, EGFP 양성 T 세포의 비율이 저하되는 것이 관찰되었다. 이 관찰로부터, 본 발명자 등은 SeV는 나이브 T 세포에 접착하는 것은 가능하지만, 아마도 공리셉터의 결손에 의해 융합할 수 없어, 37℃라고 하는 뉴라미니다아제가 잘 작용하는 온도에서의 인큐베이션에 있어서, 자신이 갖는 HN의 뉴라미니다아제 활성에 의해 나이브 T 세포로부터 SeV가 떨어져 버린다고 하는 가설을 세웠다. 따라서, 새로 단리한 림프구를 뉴라미니다아제가 거의 작용하지 않지만, SeV가 시알산 잔기에 접착하는 것은 가능한 4℃에서 SeV-EGFP(MOI=100)와 인큐베이트한 후, 그들의 림프구를 새로운 배지로 도시한 기간 37℃에서 인큐베이트하였다(도 10). 그 후, 세포를 3회 세정하고, 그들 T 세포를 고착화한 항CD3 및 항CD28 항체로 자극하고, 2일 후, GFP의 발현 레벨을 조사하였다. 이 실험에서는, 모든 T 세포가 균일하게 활성화되었기 때문에, 데이터는 세포의 키나아제 활성 등과 같은 SeV의 유전자 발현에 관련한 요인에는 영향을 미치지 않고, 침입(entry)에 관련한 요인에 의해서만 영향을 받았다. 기대한 바와 같이, T 세포를 4℃에서 한번 인큐베이트한 후에 활성화하면, EGFP 양성의 CD4 또는 CD8 T 세포의 비율은 각각 50% 또는 70%였다. 이것에 대해, 4℃의 인큐베이션에 계속하여 37℃에서 인큐베이트하면, EGFP 양성 T 세포의 비율은 시간 의존적으로 감소하였다(도 10). 37℃에서 90분의 인큐베이션에 의해 EGFP 양성 T 세포의 비율은 최저가 되고, 이것은 마지막 세정 후의 배양액에 혼입되어 있는 SeV와 활성화 웰 중에서 공배양한 전처리 없는 T 세포의 비율과 동등하였다. 활성화를 위한 배양기간 동안 SeV-EGFP와 함께 인큐베이트한 양성대조의 T 세포는 모두 효율적으로 유전자 도입되었다. 더욱이, 활성화 T 세포를 사용한 경우, 30분 37℃에서 인큐베이트하는 것만으로, EGFP 양성 T 세포의 비율은 양성대조와 동일한 정도로 높았다(데이터 생략). 침입(enter)한 SeV가 나이브 T 세포로부터 방출되는 경우는 있을 것 같지 않기 때문에, 이들의 현상은, SeV는 활성화 T 세포에 침입(enter)할 수 있는 한편, 나이브 T 세포에 접착하는 것은 가능하지만 융합할 수 없다고 설명할 수 있다. 벡터 입자는 나이브 T 림프구가 아니고 활성화 T 림프구에 특이적으로 내부화(internalization)가 일어날 가능성이 높다.

본 발명에 의해, T 세포에 효율적으로 유전자를 도입하는 것이 가능해졌다. T 세포로의 유전자 도입은, 면역계가 관여하는 다양한 질환의 치료에 있어서 중요하기 때문에, 이들의 질환에 있어서의 T 세포를 지향한 유전자 송달에 의한 개변 전략으로의 본 발명의 적용이 기대된다.

SEQUENCE LISTING <110> DNAVEC RESEARCH INC. <120> Methods of transducing a gene into T cells <130> D3-A0205P <140> <141> <150> JP 2002-310053 <151> 2002-10-24 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 1 ctttcaccct 10 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 2 tttttcttac tacgg 15 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 3 cggccgcaga tcttcacg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 4 atgcatgccg gcagatga 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 5 gttgagtact gcaagagc 18 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 6 tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc 42 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 7 atgcatgccg gcagatga 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 8 tgggtgaatg agagaatcag c 21

Claims (7)

1. T 세포에 유전자를 도입하는 방법으로서, 상기 유전자를 보유하는 파라믹소바이러스 벡터와 활성화한 T 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 파라믹소바이러스 벡터가 센다이 바이러스 벡터인 방법.
3. 외래 유전자가 도입된 T 세포의 제조방법으로서, 상기 유전자를 보유하는 파라믹소바이러스 벡터와 활성화한 T 세포를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 파라믹소바이러스 벡터가 센다이 바이러스 벡터인 방법.
5. 제3항 또는 제4항의 방법에 의해 제조된, 외래 유전자가 도입된 T 세포.
6. 활성화 T 세포로의 유전자 송달을 위해 사용하는, 파라믹소바이러스 벡터.
7. 제6항에 있어서, 파라믹소바이러스 벡터가 센다이 바이러스 벡터인 벡터.