JPWO2005001082A1 - 高変異領域が改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ｒｎａウイルスベクター - Google Patents

Abstract

本発明は、遺伝子配列中に含まれるマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列の部分配列が改変された外来遺伝子を有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスを提供する。Ｅ配列の一部を含む外来遺伝子は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスにおいて高頻度で変異が生じることが判明した。この配列を持たないように外来遺伝子の配列を改変することによって、マイナス鎖ＲＮＡウイルスにおいて搭載する遺伝子に変異が生じるのを防ぐことができる。

Description

本発明は、高変異領域が改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスに関する。

マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、搭載するウイルス遺伝子をアンチセンスにコードするＲＮＡゲノム（マイナス鎖ＲＮＡ）を持つウイルスである。マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、細胞に感染するとＲＮＡゲノム（マイナス鎖）を鋳型にアンチゲノムＲＮＡ（プラス鎖）が生成し、さらにアンチゲノムＲＮＡからゲノムＲＮＡが生じて、これがウイルス中に取り込まれて増殖する。マイナス鎖ＲＮＡウイルスは感染宿主細胞の細胞質で強力に遺伝子を発現する能力を有しており、その特徴を生かして近年、遺伝子導入ベクターとしての開発が進められている（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０）。しかしマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターにある種の外来遺伝子を組み込んだ場合に、高い頻度で変異が生じることについては、ほとんど知られていない。また、その変異が起こらないようにベクターを改変する手段も知られていない。

本発明は、高変異領域が改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスを提供することを課題とする。
センダイウイルス（ＳｅＶ）を用いたこれまでの研究において、外来遺伝子を組み込んだウイルスを連続多代継代しても殆ど塩基の変異は認められないことから、一般的にマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムの安定性は高く、組み込まれた外来遺伝子を長期間に渡って安定に発現すると考えられている（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２，４５７−４６６（１９９７））。本発明者らは、嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ；ＣＦ）の原因遺伝子であるヒトＣＦＴＲ遺伝子（ｈＣＦＴＲ）を発現するＳｅＶベクターを構築したが、野生型のｈＣＦＴＲを搭載したＳｅＶベクターは、ｈＣＦＴＲ遺伝子に高頻度で変異が生じ、正常な蛋白質が発現しなくなることを発見した。
全長ｈＣＦＴＲ遺伝子を搭載したＳｅＶベクターのウイルスゲノム上のｈＣＦＴＲ遺伝子配列を詳細に確認したところ、２ヶ所の領域に高頻度な塩基変異が生じていることを見出した（図１）。これらの塩基変異によってコードする蛋白質のアミノ酸配列が変わり、発現したｈＣＦＴＲ蛋白の活性が認められなくなった。本発明者らは、この２ヶ所の高変異領域がマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥＩ（Ｅｎｄ−Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ）配列との相同性が比較的高い配列を含むことが、変異のホットスポットになる原因だと考えた（図２）。そこで、アミノ酸配列を変えないように人為的にこの２ヶ所の塩基配列を改変してＥＩ配列との相同性を低下させ、ＳｅＶベクターに搭載した。その結果、この高変異領域改変型ヒトＣＦＴＲ遺伝子を搭載したＳｅＶベクターでは、ゲノム上のｈＣＦＴＲ遺伝子の変異がまったく見られなかった。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方において、ベクター導入細胞において正常なｈＣＦＴＲ蛋白の発現が安定して確認された。
このように本発明者らは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスにおいて外来遺伝子を搭載する場合に、高い頻度で変異が生じる配列を同定し、これを改変することによって変異頻度を低下させることに成功した。マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、遺伝子治療用ベクターとして有望だが、この際にウイルスベクターに搭載する遺伝子が変異せずに安定に保持されることは重要である。本発明により、搭載遺伝子の安定性がより向上したマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを提供することが可能となった。
すなわち本発明は、高変異領域が改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスおよびその製造方法に関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の１つまたは複数の組み合わせからなる発明は、それらの請求項に記載の発現に既に意図されている。すなわち本発明は、
〔１〕外来遺伝子を有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスであって、該外来遺伝子の野生型遺伝子のセンス鎖配列中に該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのアンチゲノムのＥ配列の一部を含み、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスが有する該外来遺伝子は、該センス鎖配列の該Ｅ配列の該一部が、Ｅ配列との同一性を下げるように他の配列に改変されている、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、
〔２〕外来遺伝子を有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスであって、該外来遺伝子の野生型遺伝子がセンス鎖の配列において５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’を含み、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスが有する該外来遺伝子は、センス鎖の配列において該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’が他の配列に改変されている、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、
〔３〕該外来遺伝子が蛋白質をコードしており、該野生型遺伝子が含む該５’−ＡＧＡ_{５− ６}Ｃ−３’配列が蛋白質コード配列の中にあり、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスが有する該外来遺伝子は、該野生型遺伝子が該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列によりコードするアミノ酸配列を維持するように、該外来遺伝子のセンス鎖の配列における該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が他の配列に改変されている、〔２〕に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、
〔４〕該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が、５’−ＡＧＡ_５−６ＣＴＴ−３’配列中の配列である、〔２〕に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、
〔５〕該外来遺伝子がヒトＣＦＴＲ遺伝子である、〔２〕に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、
〔６〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスがパラミクソウイルスである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、
〔７〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスがセンダイウイルスである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、
〔８〕〔１〕から〔７〕のいずれかに記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡまたはその相補鎖をコードするＤＮＡ、
〔９〕変異頻度が低下するように改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスの製造方法であって、
（ａ）該遺伝子の改変前の遺伝子のセンス鎖配列中に該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのアンチゲノムのＥ配列の一部を含む場合に、該センス鎖配列の該Ｅ配列の該一部を、Ｅ配列との同一性を下げるように他の配列に改変する工程、
（ｂ）改変された遺伝子が組み込まれた該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムまたはその相補鎖をコードするＤＮＡを調製する工程、
（ｃ）該ＤＮＡを転写して該マイナス鎖ＲＮＡウイルスを再構成させる工程、を含む方法、
〔１０〕変異頻度が低下するように改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスの製造方法であって、
（ａ）該遺伝子の改変前の遺伝子配列中に５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を含む場合に、該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を他の配列に改変する工程、
（ｂ）改変された遺伝子が組み込まれた該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムまたはその相補鎖をコードするＤＮＡを調製する工程、
（ｃ）該ＤＮＡを転写して該マイナス鎖ＲＮＡウイルスを再構成させる工程、を含む方法、
〔１１〕該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が、５’−ＡＧＡ_５−６ＣＴＴ−３’配列中の配列である、〔１０〕に記載の方法、
〔１２〕該遺伝子がヒトＣＦＴＲ遺伝子である、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法、
〔１３〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスがパラミクソウイルスである、〔９〕から〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１４〕マイナス鎖ＲＮＡウイルスがセンダイウイルスである、〔９〕から〔１２〕のいずれかに記載の方法、に関する。
また本発明は、その一態様において、
（１）外来遺伝子を有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスであって、該外来遺伝子の野生型遺伝子がセンス鎖の配列において５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’を含み、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスが有する該外来遺伝子は、センス鎖の配列において該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’が他の配列に改変されている、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、
（２）該外来遺伝子が蛋白質をコードしており、該野生型遺伝子が含む該５’−ＡＧＡ_{５− ６}Ｃ−３’配列が蛋白質コード配列の中にあり、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスが有する該外来遺伝子は、該野生型遺伝子が該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列によりコードするアミノ酸配列を維持するように、該外来遺伝子のセンス鎖の配列における該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が他の配列に改変されている、（１）に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、
（３）該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が、５’−ＡＧＡ_５−６ＣＴＴ−３’配列中の配列である、（１）に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、
（４）該外来遺伝子がヒトＣＦＴＲ遺伝子である、（１）に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、
（５）マイナス鎖ＲＮＡウイルスがパラミクソウイルスである、（１）に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、
（６）マイナス鎖ＲＮＡウイルスがセンダイウイルスである、（１）に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、
（７）（１）に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡまたはその相補鎖をコードするＤＮＡ、
（８）変異頻度が低下するように改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスの製造方法であって、
（ａ）該遺伝子の改変前の遺伝子配列中に５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を含む場合に、該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を他の配列に改変する工程、
（ｂ）改変された遺伝子が組み込まれた該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムまたはその相補鎖をコードするＤＮＡを調製する工程、
（ｃ）該ＤＮＡを転写して該マイナス鎖ＲＮＡウイルスを再構成させる工程、を含む方法、
（９）該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が、５’−ＡＧＡ_５−６ＣＴＴ−３’配列中の配列である、（８）に記載の方法、
（１０）該外来遺伝子がヒトＣＦＴＲ遺伝子である、（８）に記載の方法、
（１１）マイナス鎖ＲＮＡウイルスがパラミクソウイルスである、（８）に記載の方法、
（１２）マイナス鎖ＲＮＡウイルスがセンダイウイルスである、（８）に記載の方法、に関する。
本発明は、高変異領域が改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスを提供する。本発明者らは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列の一部を含む外来遺伝子をマイナス鎖ＲＮＡウイルスに搭載すると、高い頻度でこの配列に変異が生じることを見出した。そして、この配列を他の配列に変換することによって、変異の発生は有意に抑制された。従って、この配列を含む遺伝子を持つ組み換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスの作製時には、この配列を他の配列に変換してウイルスに組み込むことで、搭載遺伝子が変異するのを防ぐことができる。ここで組み換えウイルスとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウイルスである。組み換えポリヌクレオチドとは、組み換えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖の結合が改変（切断または結合）されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、その両端が自然の状態と同じようには連結されていない。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換えウイルスは、遺伝子操作により構築されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウイルスを再構築することによって生成させることができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２０００）３ｒｄｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ ＤＷ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、転写単位をコードする核酸を言う。本発明のウイルスに組み込む外来遺伝子は、改変前の遺伝子配列（例えば野生型遺伝子の配列）に、この遺伝子が搭載されるマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列の一部を含む限り特に制限はなく、蛋白質をコードするものおよびしないものが含まれる。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子とも呼ぶ。またリボザイムをコードする核酸をそのリボザイムの遺伝子という。例えばセンダイウイルスのＥ配列を一部を含む配列である５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’（アンチゲノム鎖（プラス鎖）におけるＥ配列を一部を含む配列）を例に挙げれば、本発明のウイルスは、センス鎖の配列において野生型遺伝子が持つ５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列［５’−ＡＧＡＡＡＡＡＣ−３’（但しマイナス鎖ウイルスゲノム上の配列では３’−ＵＣＵＵＵＵＵＧ−５’）または５’−ＡＧＡＡＡＡＡＡＣ−３’（但しマイナス鎖ウイルスゲノム上の配列では３’−ＵＣＵＵＵＵＵＵＧ−５’）］が他の配列に改変された改変型外来遺伝子を持つ（すなわち該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ上の該外来遺伝子においては、該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’の相補配列である３’−ＵＣＵ_５−６Ｇ−５’が他の配列に改変されている）。マイナス鎖ＲＮＡウイルスはマイナス鎖（アンチセンス鎖）ゲノムを持つウイルスであるので、ウイルスが持つ遺伝子はアンチセンスにコードされている。従って、ある野生型遺伝子に５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が含まれる場合、この遺伝子を改変しないままマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターに組み込んだ場合は、ベクターのマイナス鎖ゲノムが有する該遺伝子の配列（ゲノムはマイナス鎖であるので該遺伝子のアンチセンス鎖の配列である）には３’−ＵＣＵ_５−６Ｇ−５’配列（すなわち３’−ＵＣＵＵＵＵＵＧ−５’または３’−ＵＣＵＵＵＵＵＵＧ−５’）が含まれるが、本発明のウイルスにおいてはこの３’−ＵＣＵ_５−６Ｇ−５’配列は他の配列に改変されている。
本発明において、マイナス鎖ＲＮＡウィルスとは、マイナス鎖（ネガティブ鎖）をゲノムに持つＲＮＡウィルスを言う。マイナス鎖ＲＮＡウィルスとしては、例えばパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のセンダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウィルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウィルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウィルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウィルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、オルトミクソウィルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のインフルエンザウィルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ラブドウィルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）の水疱性口内炎ウィルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ−ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウィルス（Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）等が挙げられる。本発明において特に好適なウイルスは一本鎖のマイナス鎖をゲノムに持つウイルス（モノネガウイルス）であり、例えばパラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ，Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ，Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ，およびＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ，およびＥｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、フィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｉｎｆｕｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ａ，Ｂ，Ｃ，およびＴｈｏｇｏｔｏ−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ等を含む）、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ，Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ，Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ，およびＰｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）などの科に属するウイルスが含まれる。
本発明においてパラミクソウィルスとはパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウィルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウィルスは、非分節型ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウィルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）（レスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）を含む。本発明を適用可能なパラミクソウィルスとしては、具体的にはセンダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウィルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウィルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウィルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウィルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウィルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウィルス１，２，３型等が挙げられる。本発明のウィルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウイルス属（ｇｅｎｕｓ Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（パラミクソウィルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウィルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウィルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウィルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウィルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
本発明においてベクターとは、核酸を細胞に導入する担体である。マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターとは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスに由来する、核酸を細胞に導入する担体である。上記のように、ＳｅＶなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルスは遺伝子導入ベクターとして優れており、宿主細胞の細胞質でのみ転写・複製を行い、ＤＮＡフェーズを持たないため染色体への組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は起こらない。このため染色体異常による癌化または不死化などの安全面における問題が生じない。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。またこのウイルスにはカプシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）など性質上のメリットがある。例えば伝播能を有するＳｅＶベクターは、外来遺伝子を少なくとも４ｋｂまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する事が可能である。
また野生型センダイウイルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人に対しては病原性が認められない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １５：５３３−５４０，１９９７）。更に特筆すべき利点として以下の２点、すなわち「高感染性」及び「高発現量」を挙げることができる。ＳｅＶベクターは細胞膜蛋白糖鎖のシアル酸に結合して感染するが、このシアル酸はほとんどの細胞で発現しており、このことが感染スペクトルを広くする、則ち高感染性に繋がっている。ＳｅＶのレプリコンをベースにした伝播型ベクターは放出されたウイルスが周囲の細胞にも再感染し、感染細胞の細胞質で多コピーに複製されたＲＮＰが細胞の分裂に伴い娘細胞にも分配されるため持続発現が期待される。また、ＳｅＶベクターは非常に広い組織適用範囲を持つ。また、細胞質のみでの転写・複製という特徴的な発現機構であることから、搭載遺伝子の発現量が非常に高いことが示されている（Ｍｏｒｉｙａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２５（１）１０５−１１１ （１９９８）；ＷＯ００／７００７０）。更に、エンベロープ遺伝子を欠失して非伝播性にしたＳｅＶベクターの回収にも成功しており（ＷＯ００／７００７０；Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７４（１４）６５６４−６５６９（２０００））、「高感染性」及び「高発現量」を維持して、「安全性」をさらに高めるための改良が進行している。
これらの特徴は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスは有効な遺伝子治療用および遺伝子導入用ベクターであり、遺伝子治療における有望な選択肢の一つとなることを支持するものである。マイナス鎖ＲＮＡウイルスに治療用（または解析用）の遺伝子を搭載して局所投与することで、治療遺伝子の局所的な高い発現が可能となり、治療効果の確実性とともに副作用の軽減が期待される。このような効果は、一過的に強発現が誘導される、ＳｅＶを初めとするマイナス鎖ＲＮＡウイルスだからこそ、より有効であると考えられる。
マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡを含んでいる。ゲノムＲＮＡとは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルス蛋白質と共にＲＮＰを形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、該核酸が複製して娘ＲＮＰが形成される機能を持つＲＮＡを言う。マイナス鎖ＲＮＡウイルスはネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスであるので、このようなＲＮＡは搭載遺伝子をアンチセンスとしてコードしている。一般にマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムは、３’リーダー領域と５’トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンスとして並んだ構成をしている。各遺伝子のＯＲＦの間には、転写終結配列（Ｅ配列）−介在配列（Ｉ配列）−転写開始配列（Ｓ配列）が存在し、これにより各遺伝子が別々のシストロンとして転写される。本発明のウイルスに含まれるゲノムＲＮＡは、該ＲＮＡにコードされる遺伝子群の発現およびＲＮＡ自身の自律的な複製に必要なウイルス蛋白質であるＮ（ヌクレオキャプシド）、Ｐ（ホスホ）、およびＬ（ラージ）をアンチセンスにコードしている。また該ＲＮＡは、ウイルス粒子の形成に必要なＭ（マトリックス）蛋白質をコードしていてもよい。さらに該ＲＮＡは、ウイルス粒子の感染に必要なエンベロープ蛋白質をコードしていてもよい。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのエンベロープ蛋白質としては、細胞膜融合を起こす蛋白質であるＦ（フュージョン）蛋白質および細胞への接着に必要なＨＮ（ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）蛋白質が挙げられる。但し、ある種の細胞では感染にＨＮ蛋白質は必要なく（Ｍａｒｋｗｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（４）：９７８−９８２（１９８５））、Ｆ蛋白質のみで感染が成立する。また、Ｆ蛋白質および／またはＨＮ蛋白質以外のウイルスエンベロープ蛋白質をコードさせてもよい。
本発明のマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、例えばマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡとウイルス蛋白質からなる複合体、すなわちリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）であってもよい。ＲＮＰは、例えば所望のトランスフェクション試薬と組み合わせて細胞に導入することができる。このようなＲＮＰは、具体的には例えばマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質を含む複合体である。ＲＮＰは細胞内に導入されると、ウイルス蛋白質の働きによりゲノムＲＮＡからウイルス蛋白質をコードするシストロンが転写されると共に、ゲノム自身が複製され娘ＲＮＰが形成される。ゲノムＲＮＡの複製は、該ＲＮＡのコピー数の増加をＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーション等により検出することにより確認することができる。
また本発明のマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、好ましくはマイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルス粒子である。ウイルス粒子とは、ウイルス蛋白質の働きにより細胞から放出される、核酸を含む微小粒子を言う。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのウイルス粒子は、ゲノムＲＮＡとウイルス蛋白質を含む上記ＲＮＰが細胞膜由来の脂質膜（エンベロープという）に含まれた構造をしている。ウイルス粒子は、感染性を示すものであってよい。感染性とは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスが細胞への接着能および膜融合能を保持していることにより、接着した細胞の内部にウイルス内部の核酸を導入することのできる能力を言う。本発明のマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、伝播能を有していてもよく、あるいは伝播能を有さない欠損型ウイルスであってもよい。「伝播能を有する」とは、ウイルスが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
例えばパラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、Ｎ遺伝子は″ＮＰ″とも表記される。またノイラミニダーゼ活性を持たないヘマグルチニンは「Ｈ」と表記される。
レスピロウィルス属 ＮＰ Ｐ／Ｃ／Ｖ Ｍ Ｆ ＨＮ − Ｌ
ルブラウィルス属 ＮＰ Ｐ／Ｖ Ｍ Ｆ ＨＮ（ＳＨ）Ｌ
モービリウィルス属 ＮＰ Ｐ／Ｃ／Ｖ Ｍ Ｆ Ｈ − Ｌ
例えばセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、Ｎ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、Ｎ遺伝子については、ＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｘ７５９６１；ＨＰＩＶ−１，Ｄ０１０７０；ＨＰＩＶ−２，Ｍ５５３２０；ＨＰＩＶ−３，Ｄ１００２５；Ｍａｐｕｅｒａ，Ｘ８５１２８；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７２；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ０６４０９１；ＰＤＰＲ，Ｘ７４４４３；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｘ０００８７；ＳＶ５，Ｍ８１４４２；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｐ遺伝子については、ＣＤＶ，Ｘ５１８６９；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１，Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｘ０４７２１；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｍ５５９７５；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｍ５５９７６；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７３；ＭＶ，Ｍ８９９２０；ＮＤＶ，Ｍ２０３０２；ＰＤＶ，Ｘ７５９６０；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，Ｍ３０２０２；ＳＶ５，ＡＦ０５２７５５；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｃ遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ０１４９５３；ＤＭＶ，Ｚ４７７５８；ＨＰＩＶ−１．Ｍ７４０８１；ＨＰＩＶ−３，Ｄ０００４７；ＭＶ，ＡＢ０１６１６２；ＲＰＶ，Ｘ６８３１１；ＳｅＶ，ＡＢ００５７９６；およびＴｕｐａｉａ，ＡＦ０７９７８０、Ｍ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ１２６６９；ＤＭＶ Ｚ３００８７；ＨＰＩＶ−１，Ｓ３８０６７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６２７３４；ＨＰＩＶ−３，Ｄ００１３０；ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ１０２４１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ１０２４２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１７１；ＭＶ，ＡＢ０１２９４８；ＮＤＶ，ＡＦ０８９８１９；ＰＤＰＲ，Ｚ４７９７７；ＰＤＶ，Ｘ７５７１７；ＲＰＶ，Ｍ３４０１８；ＳｅＶ，Ｕ３１９５６；およびＳＶ５，Ｍ３２２４８、Ｆ遺伝子についてはＣＤＶ，Ｍ２１８４９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０４；ＨＰＮ−１．Ｍ２２３４７；ＨＰＩＶ−２，Ｍ６０１８２；ＨＰＩＶ−３．Ｘ０５３０３，ＨＰＩＶ−４ａ，Ｄ４９８２１；ＨＰＩＶ−４ｂ，Ｄ４９８２２；Ｍｕｍｐｓ，Ｄ８６１６９；ＭＶ，ＡＢ００３１７８；ＮＤＶ，ＡＦ０４８７６３；ＰＤＰＲ，Ｚ３７０１７；ＰＤＶ，ＡＪ２２４７０６；ＲＰＶ，Ｍ２１５１４；ＳｅＶ，Ｄ１７３３４；およびＳＶ５，ＡＢ０２１９６２、ＨＮ（ＨまたはＧ）遺伝子についてはＣＤＶ，ＡＦ１１２１８９；ＤＭＶ，ＡＪ２２４７０５；ＨＰＩＶ−１，Ｕ７０９４９８；ＨＰＩＶ−２．Ｄ０００８６５；ＨＰＩＶ−３，ＡＢ０１２１３２；ＨＰＩＶ−４Ａ，Ｍ３４０３３；ＨＰＩＶ−４Ｂ，ＡＢ００６９５４；Ｍｕｍｐｓ，Ｘ９９０４０；ＭＶ，Ｋ０１７１１；ＮＤＶ，ＡＦ２０４８７２；ＰＤＰＲ，Ｚ８１３５８；ＰＤＶ，Ｚ３６９７９；ＲＰＶ，ＡＦ１３２９３４；ＳｅＶ，Ｕ０６４３３；およびＳＶ−５，Ｓ７６８７６が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。
これらのウイルス蛋白質のＯＲＦは、ゲノムＲＮＡにおいて上記のＥ−Ｉ−Ｓ（Ｅｎｄ−Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ−Ｓｔａｒｔ）配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノムＲＮＡにおいて最も３’に近いＯＲＦは、３’リーダー領域と該ＯＲＦとの間にＳ配列のみが必要であり、ＥおよびＩ配列は必要ない。またゲノムＲＮＡにおいて最も５’に近いＯＲＦは、５’トレイラー領域と該ＯＲＦとの間にＥ配列のみが必要であり、ＩおよびＳ配列は必要ない。また２つのＯＲＦは、例えばＩＲＥＳ等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら２つのＯＲＦの間にはＥ−Ｉ−Ｓ配列は必要ない。野生型のパラミクソウイルスの場合、典型的なＲＮＡゲノムは、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ（またはＨ）、およびＬ蛋白質をアンチセンスにコードする６つのＯＲＦが順に並んでおり、それに続いて５’トレイラー領域を他端に有する。本発明のウイルスのゲノムＲＮＡにおいては、ウイルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生型ウイルスと同様に、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ（またはＨ）、およびＬ蛋白質をコードするＯＲＦが順に並び、それに続いて５’トレイラー領域が配置されることが好ましい。ある種のマイナス鎖ＲＮＡウイルスにおいては、ウイルス遺伝子は６つではないが、そのような場合でも上記と同様に各ウイルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることが好ましい。一般にＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子を保持しているウイルスは、細胞内で自律的にＲＮＡゲノムから遺伝子が発現し、ゲノムＲＮＡが複製される。さらにＦおよびＨＮ（またはＨ）遺伝子等のエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、およびＭ遺伝子の働きにより、感染性のウイルス粒子が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなウイルスは伝播能を有するウイルスベクターとなる。外来遺伝子は、後述するように、このゲノム中の蛋白質非コード領域等に挿入すればよい。
また、本発明のマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、野生型ウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってよい。例えば、Ｍ、Ｆ、またはＨＮ遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが不活化または欠失したマイナス鎖ＲＮＡウイルスも、本発明のウイルスとして好適である。このようなウイルスの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたウイルスゲノムはウイルス遺伝子に欠損を有するため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばＦ遺伝子および／またはＨＮ（またはＨ）遺伝子が挙げられる。例えば、Ｆ遺伝子が欠損した組み換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムを発現するプラスミドを、Ｆ蛋白質の発現ベクターならびにＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、組み換えウイルスの再構成を行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０；Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１４）６５６４−６５６９（２０００））。また、例えば、Ｆ遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いてウイルスを製造することもできる。これらの蛋白質群を外から供給する場合、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、本発明のウイルスとして、ウイルスゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含む組み換えウイルスを作製することもできる。例えば、ウイルス再構成の際に、ベースとなるウイルスのゲノムが元来コードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有する組み換えウイルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。例えば、他のウイルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）を挙げることができる。本発明のウイルスには、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウイルスが含まれる。ウイルスのゲノムＲＮＡにはこれらのエンベロープ蛋白質をゲノムにコードされないように設計すれば、ウイルス粒子が細胞に感染した後は、このウイルスからこの蛋白質が発現されることはない。
また、本発明のウイルスは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的として感染するウイルスベクターを作り出すこともできる。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子）の発現により供給されてもよい。
また本発明のウイルスは、例えばウィルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、あるいはＲＮＡの転写効率または複製効率を高めるために、ウイルスに含まれる任意のウィルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えばマイナス鎖ＲＮＡウイルスにおいては、複製因子であるＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、Ｆ蛋白質を改変することにより膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質またはＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めた組み換えウィルスを作製することもできる。
また本発明のウイルスにおいては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける毒性の低い遺伝子導入用ウィルスベクターとして特に有用である。
本発明のウイルスは、上記のマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノム中に、改変された外来遺伝子をコードしている（ゲノムはマイナス鎖であるので、搭載遺伝子をアンチセンスにコードしている）。ここで５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を含む外来遺伝子を例に挙げて説明すれば、ウイルスに搭載されている外来遺伝子の配列領域に対応する該外来遺伝子の改変前の遺伝子（例えば野生型遺伝子）の配列には５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が含まれているが、本発明のウイルスに搭載されている外来遺伝子においては、その配列が他の配列に改変されている。すなわち、ウイルスに含まれるマイナス鎖ゲノムが有する外来遺伝子のその部位の配列は、５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列の相補配列である５’−ＧＵ_５−６ＣＵ−３’から他の配列に改変されている。「野生型遺伝子」とは、正常な表現型を示す天然の生物が持つ遺伝子を言い、任意の多型が含まれる。また、ある抗原に対して生成した抗体をコードする遺伝子を含む。ここで、ウイルスに搭載しようとする外来遺伝子は、野生型遺伝子の５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列に対応する領域（但しベクターに搭載時には他の配列に改変されている）を含む限り、他の領域は野生型と同一である必要はない。すなわち、ウイルスが搭載する外来遺伝子は、５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’領域以外の部位において、野生型遺伝子の配列を塩基の付加、欠失、置換により改変した配列から構成されていてもよい。例えば、ある膜貫通型受容体の細胞外領域をコードする塩基配列が５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’を含む場合、この配列を他の配列に改変した細胞外領域のみをコードする外来遺伝子を搭載するウイルスは本発明に含まれる。また、ある抗体の可変領域をコードする塩基配列が５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’を含む場合、この配列を他の配列に改変したＦａｂ断片およびｓｃＦｖなどの合成蛋白質をコードするウイルスは本発明に含まれる。また、ある変異型遺伝子が、野生型遺伝子の５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列と相同な部位に関しては野生型遺伝子と同じように５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を含む場合、変異型遺伝子の５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を他の配列に改変した遺伝子を搭載するウイルスは本発明のウイルスに含まれる。上記は、Ｅ配列の一部を含む配列として５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を例に説明したものであり、マイナス鎖ＲＮＡウイルスの他のＥ配列の一部を含む場合についても、これと同様に、該一部と同一の配列を含む限り、他の部分は天然由来の配列であっても、改変された配列であってもよい。
本発明のマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、搭載する外来遺伝子において、該遺伝子の野生型配列（センス鎖）中に存在する該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのアンチゲノム（プラス鎖）におけるＥ配列の一部と同じ配列が、他の配列に置換されている。該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列の一部とは、具体的には、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列の部分配列であって、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列の連続した６塩基以上、より特定すれば７塩基以上、さらに特定すれば８塩基以上を含む配列である。より特定した範囲を示せば、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列の部分配列であって、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列の終端の塩基を含む連続した６塩基以上、より特定すれば７塩基以上、さらに特定すれば８塩基以上を含む配列である。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列を比較する場合は、Ｔ（チミン）とＵ（ウラシル）は同一塩基とみなして比較する。Ｅ配列の終端の塩基とは、ゲノム鎖（マイナス鎖）においては、ゲノム上の各ウイルス遺伝子の転写終結部位にあるオリゴＵストレッチの５’端のＵを言う。また、ここで言うＥ配列とは、該外来遺伝子が搭載されているマイナス鎖ＲＮＡウイルスと同種のウイルスが天然に保持する任意のウイルス蛋白質遺伝子のＥ配列を指す。すなわち好ましい態様では、本発明のマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターに搭載される外来遺伝子は、それらのいずれのＥ配列の終端の塩基を含む連続した６塩基以上、７塩基以上、または８塩基以上を含まないように改変されている。
マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列はよく知られている。例えばセンダイウイルスであれば、Ｅ配列として３’−ＵＮＡＵＵＣＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：５９）（図１参照）が挙げられ、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（ＨＰＩＶ−３）であれば、３’−ＵＷＷＹＷＢＵＵＵＵＵ−５’（ＮはＡ，Ｇ，Ｔ，またはＣ）（配列番号：６０）、具体的には３’−ＵＵＡＵＵＣＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：６１）、３’−ＵＡＵＵＡＧＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：６２）、３’−ＵＡＡＵＡＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：６３）、３’−ＵＵＡＵＡＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：６４）、３’−ＵＡＵＣＵＧＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：６５）が挙げられる（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｘ０３９６７，Ｍ１３８８６，Ｍ１３８８８，Ｍ２１６４９）。麻疹ウイルスでは、ＹＲＡＵＷＨＮＵＵＵＵ（配列番号：６６）、具体的には３’−ＣＡＡＵＡＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：、６７）、３’−ＵＡＡＵＡＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：６３））、３’−ＵＧＡＵＵＵＧＵＵＵＵ−５’（配列番号：６８）、３’−ＣＡＡＵＵＡＡＵＵＵＵ−５’（配列番号：６９）、３’−ＵＡＡＵＵＣＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：７０）、３’−ＵＡＡＵＵＵＣＵＵＵＵ−５’（配列番号：７１）が挙げられる（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｋ０１７１１）。Ｈｅｎｄｒａウイルスでは３’−ＷＡＡＫＹＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：７２）、具体的には３’−ＵＡＡＵＵＣＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：７０）、３’−ＡＡＡＵＧＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：７３）、Ｎｉｐａｈウイルスでは、３’−ＵＡＡＵＵＣＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：７０）が挙げられる（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ０１７１４９、ＡＦ２１２３０２）。ＲＳＶでは、３’−ＡＷＫＷＷＷＵＵＵＵ−５’（配列番号：７４）、具体的には３’−ＡＵＵＡＵＡＵＵＵＵ−５’（配列番号：７５）、３’−ＡＵＵＡＡＡＵＵＵＵ−５’（配列番号：７６）、３’−ＡＵＵＡＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：７７）、３’−ＡＵＧＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：７８）、３’−ＡＵＵＡＡＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：７９）、３’−ＡＵＧＡＡＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：８０）、３’−ＡＡＵＡＵＡＵＵＵＵ−５’（配列番号：８１）、３’−ＡＡＵＡＡＡＵＵＵＵ−５’（配列番号：８２）、３’−ＡＡＵＡＡＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：８３）が挙げられる（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｍ７４５６８）。またＳＶ５では３’−ＡＲＷＷＵＣＵ_{４− ７}−５’（配列番号：８４，８５，８６，８７）、具体的には３’−ＡＧＵＡＵＣＵ_４−７−５’（配列番号：８８，８９，９０，９１）、３’−ＡＡＡＵＵＣＵ_４−７−５’（配列番号：９２，９３，９４，９５）が挙げられ、ＮＤＶでは３’−ＡＷＵＣＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：９６）が挙げられるる（Ｋｕｏ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９６，７０（１０）：６８９２−９０１；Ｋｕｏ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９６，７０（９）：６１４３−５０）。
ラブドウイルス科ウイルスにおいては、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓでは、３’−ＡＵＡＣＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：９７）が挙げられる（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｊ０２４２８）、狂犬病ウイルスでは３’−ＹＷＲＨＷＣＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：９８）、具体的には３’−ＵＡＧＵＡＣＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：９９）、３’−ＵＵＧＵＡＣＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１００）、３’−ＣＵＡＣＡＣＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１０１）、３’−ＣＡＧＣＵＣＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１０２）、３’−ＵＡＧＡＡＣＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１０３）が挙げられる（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｍ３１０４６）。Ｎｏｖｉｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓの中では、Ｓａｌｍｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＩＨＮＶ）は、３’−ＵＣＵＲＵＳＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１０４）、具体的には３’−ＵＣＵＡＵＣＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１０５）、３’−ＵＣＵＧＵＣＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１０６）、３’−ＵＣＵＡＵＧＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１０７）（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｌ４０８８３）、Ｖｉｒａｌ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ（ＶＨＳＶ）は、３’−ＵＣＵＡＷＣＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１０８）（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｙ１８２６３）、ｈｉｒａｍｅ ｒａｈｂｄｏｖｉｒｕｓ，Ｓｎａｋｅｈｅａｄ ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ（ＳＨＲＶ）は、３’−ＵＣＵＲＵＣＵＵＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１０９）（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＦ１４７４９８）などが挙げられる（Ｓｃｈｎｅｌｌ ＭＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９６，７０（４）：２３１８−２３；Ｂａｒｒ ＪＮ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９７，７１（１１）：８７１８−２５；Ｂａｒｒ．ＪＮ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９７，７１（３）：１７９４−８０１；Ｔｏｒｄｏ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８６，８３（１１）：３９１４−８；Ｔｏｒｄｏ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９８８，１６５（２）：５６５−７６）。また、ＭａｒｂｕｒｇウイルスおよびＥｂｏｌａウイルス等のＦｉｌｏｖｉｒｕｓ科ウイルスにおいては、３’−ＵＭＡＵＵＣＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１１０）（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｚ１２１３２、ＡＦ０８６８３３）が挙げられる（Ｋｉｌｅｙ ＭＰ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９８６，１４９（２）：２５１−４）。（ここで、Ｒ：Ａ ｏｒ Ｇ、Ｙ：Ｃ ｏｒ Ｔ ｏｒ Ｕ、Ｗ：Ａ ｏｒ Ｔ ｏｒ Ｕ、Ｓ：Ｇ ｏｒ Ｃ、Ｍ：Ａ ｏｒ Ｃ、Ｋ：Ｇ ｏｒ Ｔ ｏｒ Ｕ、Ｄ：Ａ ｏｒ Ｇ ｏｒ Ｔ ｏｒ Ｕ、Ｈ：Ａ ｏｒ Ｃ ｏｒ Ｔ ｏｒ Ｕ、Ｖ：Ａ ｏｒ Ｃ ｏｒ Ｇ、Ｂ：Ｃ ｏｒ Ｇ ｏｒ Ｔ ｏｒ Ｕ、Ｎ：Ａ ｏｒ Ｃ ｏｒ Ｇ ｏｒ Ｔ ｏｒ Ｕ）。上記のＥ配列は、ウイルスゲノム（マイナス鎖）における配列で示した。Ｅ配列の終端は、これらの各配列の５’端の塩基の位置に相当する。
外来遺伝子のアンチセンス鎖の配列を、搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列と比較し、Ｅ配列の任意の連続した６、７、または８塩基、より特定した態様ではＥ配列の終端を含む連続した６、７、または８塩基と同じ配列を含む場合には、この配列を他の配列に改変することにより、該外来遺伝子を該マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターに搭載したときに変異が発生するのを抑制することができる。ここで他の配列に改変するとは、該配列中の塩基を欠失、他の塩基に置換、挿入、またはそれらの所望の組み合わせにより他の配列に変換することである。遺伝子のコード領域中であれば、通常他の塩基への置換により配列を改変する。これにより、Ｅ配列との同一性は低下し、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターに搭載したときの変異導入が抑制される。すなわち、配列を改変しない場合に比べ、変異発生の確率または割合を低下させることができる。
本発明においては、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列の一部と同じ配列を含む所望の配列が改変の対象となるが、特にセンス配列中に５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’を含む所望の配列が改変の標的として挙げられる。さらに特定すれば５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ［Ｃ／Ｔ］［Ｃ／Ｔ］−３’（［Ｃ／Ｔ］＝ＣまたはＴ）（配列番号：１または２）であり、より特定すれば５’−ＡＧＡ_{５− ６}ＣＴＴ−３’（配列番号：３または４）をセンス鎖に含む配列である。本発明においては、外来遺伝子を搭載させるマイナス鎖ＲＮＡウイルスの完全なＥ配列を含まない配列も好適な改変対象となり、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＥ配列の連続した１１塩基以下、より特定すれは１０塩基以下、さらに特定すれば９塩基以下、さらに特定すれば８塩基以下の部分配列を含む外来遺伝子である。例えば、ＳｅＶの完全なＥ配列を含む５’−ＡＮＴＡＡＧＡＡＡＡＡＣ−３’（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，またはＴ）（配列番号：５）とは一致しない配列も改変の標的となる。
外来遺伝子中のＥ配列の一部を改変する場合、改変配列としては特に制限はなく、例えば遺伝子の機能を維持するように適宜塩基の付加、置換、および／または欠失を行う。例えば、この配列が蛋白質のコード配列の一部である場合は、コードする蛋白質のアミノ酸配列を変えないように塩基配列を改変することが好ましい。コドンのリダンダンシーを利用すれば、通常、アミノ酸を維持して塩基配列を改変することは容易である。例えば、ＡＧＡ（Ａｒｇ）であれば、ＡＧＧ、またはＣＧＮ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｔ，またはＣ）に置換することができる。ＡＡＡ（Ｌｙｓ）であれば、ＡＡＧに置換することができる。ＡＡＣ（Ａｓｎ）であれば、ＡＡＴに置換することができる。ＡＣＴ（Ｔｈｒ）であれば、ＡＣＡ，ＡＣＣ，またはＡＣＧに置換することができる。例えば、ヒトＣＦＴＲ遺伝子のＯＲＦには、５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’に一致する箇所が２箇所存在する（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．Ｍ２８６６８，ＮＭ＿０００４９２；Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１０６６−１０７３（１９８９））。この２箇所の配列を改変することによって、マイナス鎖ＲＮＡウイルスに搭載させたときに変異が生じるのを防ぐことができる。５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が蛋白質をコードしていない場合は、この配列を欠失させても遺伝子の機能が保たれるなら、この配列を欠失させてよいし、あるいは他の配列に置換してもよい。ＲＮＡの２次構造等において塩基対を形成する配列は、例えば塩基対形成を維持するように改変する。配列の改変は、例えば合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより実施することができる（実施例参照）。
また本発明は、本発明のウイルスの製造方法に関する。本発明のウイルスの製造方法は、（ａ）マイナス鎖ＲＮＡウイルスに搭載させる遺伝子の改変前の遺伝子のセンス鎖配列中に該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのアンチゲノムのＥ配列の一部を含む場合に、該センス鎖配列の該Ｅ配列の該一部を、Ｅ配列との同一性を下げるように他の配列に改変する工程、（ｂ）改変された遺伝子が組み込まれた該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムまたはその相補鎖をコードするＤＮＡを調製する工程、および（ｃ）該ＤＮＡを転写して該マイナス鎖ＲＮＡウイルスを再構成させる工程、を含む方法である。これにより、変異頻度が低下するように改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスを得ることができる。また、本発明の一態様において、本発明のウイルスの製造方法は、（ａ）ウイルスに搭載させる遺伝子の改変前の遺伝子配列中に５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を含む場合に、該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を他の配列に改変する工程、（ｂ）改変された遺伝子が組み込まれた該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムまたはその相補鎖をコードするＤＮＡを調製する工程、および（ｃ）該ＤＮＡを転写して該マイナス鎖ＲＮＡウイルスを再構成させる工程、を含む。
外来遺伝子をコードする核酸の挿入位置は、例えばゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えば３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間、各ウイルス蛋白質ＯＲＦの間、および／または５’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦと５’トレイラー領域の間に挿入することができる。また、ＦまたはＨＮ（またはＨ）遺伝子などを欠失するゲノムでは、その欠失領域に外来遺伝子をコードする核酸を挿入することができる。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が６の倍数となるように挿入することが望ましい（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９９８；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３）。挿入した外来遺伝子とウイルス蛋白質ＯＲＦとの間に１つのＥ−Ｉ−Ｓ配列が構成されるようにする。Ｅ−Ｉ−Ｓ配列を介して外来遺伝子のコード配列を２つまたはそれ以上タンデムに並べて挿入することができる。あるいは、ＩＲＥＳを介して目的の遺伝子を挿入してもよい。
ウイルスに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（マイナス鎖（ネガティブ鎖）の３’側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（ＷＯ０１／１８２２３）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、マイナス鎖の３’の近くに挿入するほど発現レベルが高く、５’の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子の高い発現が得られることが有利と考えられるため、外来遺伝子をコードする遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、マイナス鎖ゲノムの３’端近くに挿入することが好ましい。具体的には、３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間に挿入される。あるいは、３’に一番近いウイルス蛋白質遺伝子と２番目のウイルス蛋白質遺伝子のＯＲＦの間、または３’から２番目と３番目のウイルス蛋白質遺伝子の間に挿入してもよい。例えば典型的なパラミクソウイルスにおいては、ゲノムの３’に最も近いウイルス蛋白質遺伝子はＮ遺伝子であり、２番目の遺伝子はＰ遺伝子、３番目の遺伝子はＭ遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、例えば外来遺伝子の挿入位置をマイナス鎖ゲノムのなるべく５’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウィルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
外来遺伝子をコードする核酸をゲノムに挿入するときに付加するＳ配列としては、例えばマイナス鎖ＲＮＡウイルスの所望のＳ配列を用いることができるが、センダイウイルスであれば、３’−ＵＣＣＣＷＶＵＵＷＣ−５’（Ｗ＝ＡまたはＣ；Ｖ＝Ａ，Ｃ，またはＧ）（配列番号：６）の配列を好適に用いることができる。特に３’−ＵＣＣＣＡＧＵＵＵＣ−５’（配列番号：７）、３’−ＵＣＣＣＡＣＵＵＡＣ−５’（配列番号：８）、および３’−ＵＣＣＣＡＣＵＵＵＣ−５’（配列番号：９）が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードするＤＮＡ配列で表すとそれぞれ５’−ＡＧＧＧＴＣＡＡＡＧ−３’（配列番号：１０）、５’−ＡＧＧＧＴＧＡＡＴＧ−３’（配列番号：１１）、および５’−ＡＧＧＧＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号：１２）である。センダイウイルスベクターのＥ配列としては、例えば３’−ＡＵＵＣＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：１３）（プラス鎖をコードするＤＮＡでは５’−ＴＡＡＧＡＡＡＡＡ−３’（配列番号：１４））を含むことが好ましい。Ｉ配列は、例えば任意の３塩基であってよく、具体的には３’−ＧＡＡ−５’（プラス鎖ＤＮＡでは５’−ＣＴＴ−３’）を用いればよい。
本発明のウイルスを製造するには、哺乳動物細胞において、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡを含むＲＮＰの再構成に必要なウイルス蛋白質、すなわちＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下、本発明のマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡまたはその相補鎖をコードするＤＮＡを転写させる。転写によりマイナス鎖ゲノム（ネガティブ鎖とも言う。ウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよく、あるいはアンチゲノム（ポジティブ鎖またはプラス鎖とも言う。ゲノムＲＮＡの相補鎖。）を生成させても、ウイルスＲＮＰを再構成することができる。ウイルスの再構成効率を高めるには、好ましくはプラス鎖を生成させる。ＲＮＡ末端は、天然のウイルスゲノムと同様に３’リーダー配列と５’トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。転写産物の５’端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位としてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を利用し、該ＲＮＡポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。また、転写産物の３’端は自己切断により正確に末端が切り出されるようにすることができる（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６）。
例えば組み換えセンダイウイルスは、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。
両端にクローニングのための制限酵素サイトを有する、Ｅ配列の一部を含む配列部位（例えば５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’部位）が改変された外来遺伝子をコードするＤＮＡを合成する。ウイルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子とその両側のウイルス遺伝子のＯＲＦとの間にＥ−Ｉ−Ｓ配列が１つずつ配置されるように、合成ＤＮＡ中にＥ−Ｉ−Ｓ配列を含めるようにする。合成ＤＮＡの長さは、付加したＥ−Ｉ−Ｓ配列を含む最終的な挿入断片の鎖長が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ ｏｆ ｓｉｘ）」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９９８；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３）。Ｅ−Ｉ−Ｓ配列は、例えば挿入断片のオリゴＤＮＡの３’側にセンダイウィルスのマイナス鎖のＳ配列、Ｉ配列、およびＥ配列、例えばそれぞれ５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号：１５）、５’−ＡＡＧ−３’、および５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号：１６）が用いられる。この断片をウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡに挿入する。例えばゲノム上のウイルス蛋白質をコードするＯＲＦとその上流（ゲノムの３’側）のＳ配列の間に挿入し、外来遺伝子の両側のウイルス蛋白質遺伝子のＯＲＦとの間に、それぞれＥ−Ｉ−Ｓ配列が１つずつ配置されるようにする。
例えば、組み換えセンダイウィルスゲノムｃＤＮＡであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６，１９９７；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７）。例えば、外来遺伝子のセンス鎖の３’側にＥ−Ｉ−Ｓ配列が連結した２本鎖ＤＮＡを合成する。これをゲノムのプラス鎖をコードするｃＤＮＡの所望のＳ配列のすぐ３’側に挿入する。例えばプラス鎖ゲノムをコードするｃＤＮＡにおいて、所望のウイルス蛋白質遺伝子のコード配列とこれを転写するＳ配列の間に予め制限酵素部位を作っておき、ここに外来遺伝子−Ｅ−Ｉ−Ｓ配列をコードするＤＮＡを制限酵素部位を利用して挿入することができる（Ｔｏｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ ８６（１−２），３３−８）。
このようにして作製した組み換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、上記のウイルス蛋白質（Ｌ、Ｐ、およびＮ）存在下で細胞内で転写させることにより、本発明のウイルスを再構成することができる。本発明は、本発明のウイルスの製造のための、本発明のウイルスのウィルスゲノムＲＮＡまたはその相補ＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。また本発明は、本発明のウイルスの製造に適用するための、該ウイルスのゲノムＲＮＡまたはその相補ＲＮＡをコードするＤＮＡの使用に関する。組み換えウイルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（ＷＯ９７／１６５３９；ＷＯ９７／１６５３８；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダーペストウィルス、センダイウィルスなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウィルスをＤＮＡから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のウイルスを再構成させることができる。ウイルスゲノムをコードするＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、ＨＮ（またはＨ）遺伝子、および／またはＭ遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である（Ｈｉｒａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０４：１２５−１３３；Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６４１９−６４２９）。
具体的な手順は、（ａ）マイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムＲＮＡ（マイナス鎖ＲＮＡ）またはその相補鎖（プラス鎖）をコードするＤＮＡを、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）該細胞またはその培養上清から該ゲノムＲＮＡを含む複合体を回収する工程、により製造することができる。転写のために、ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは適当なプロモーターの下流に連結される。転写されたゲノムＲＮＡはＮ、Ｌ、およびＰ蛋白質の存在下で複製されＲＮＰ複合体を形成する。そしてＭ、ＨＮ（またはＨ）、およびＦ蛋白質の存在下でエンベロープに包まれたウイルス粒子が形成される。ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えばＴ７プロモーターの下流に連結させ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡに転写させる。プロモーターとしては、Ｔ７ポリメラーゼの認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させたＲＮＡを細胞にトランスフェクトしてもよい。
ＤＮＡからのゲノムＲＮＡの最初の転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ等の酵素は、これを発現するプラスミドまたはウイルスベクターの導入によって供給することができるし、または、例えばこの遺伝子を細胞の染色体に、発現を誘導できるように組み込んでおき、ウイルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもできる。またゲノムＲＮＡ、およびウイルス再構成に必要なウイルス蛋白質は、例えばこれらを発現するプラスミドの導入によって供給する。
ゲノムＲＮＡを発現するＤＮＡを細胞内に導入する方法には、例えば次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ ＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，Ｊ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を２〜４％ＣＯ_２、３５℃、１５〜２４時間、２）ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）沈殿混液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ−９８８５ Ｍ．Ｗ．５×１０^５）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼および▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ウイルス再構成のためのＤＮＡの細胞への導入には、トランスフェクション試薬が適している。好適にはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ Ｎｏ．３０１３０５）、またはＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．１８１１１６９）などが用いられるが、これらに制限されない。
ｃＤＮＡからのウイルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿等で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ_２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７）をほぼ１００％コンフルエントになるまで培養し、例えば１μｇ／ｍｌ ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下 ＵＶ照射（ＰＬＷＵＶ）処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９，１９９６）を２ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ（ＰＦＵ）／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間は適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜２０μｇの組換えセンダイウィルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、ウィルスＲＮＰの生成に必須なトランスに作用するウィルス蛋白質を発現するプラスミド（０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．２５〜１２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９，１９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。Ｎ、Ｐ、およびＬをコードする発現ベクターの量比は、例えば２：１：２とすればよく、プラスミド量は、例えば１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５〜２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ程度で適宜調整する。
トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウィルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＲＮＰを含む破砕物をＬＬＣ−ＭＫ_２細胞に再度トランスフェクションして培養する。または、培養上清を回収し、ＬＬＣ−ＭＫ_２細胞の培養液に添加して感染させ培養する。トランスフェクションは、例えばリポフェクトアミンまたはポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ ＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３０１５）。ＲＮＰが導入された細胞では、ＲＮＰからのウイルス遺伝子の発現およびＲＮＰの複製の過程が進行しウイルスが増幅する。得られたウイルス溶液（培養上清）を希釈（例えば１０^６倍）して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウィルスｖＴＦ７−３は完全に除去することができる。再増幅は、例えば３回以上繰り返す。得られたウイルスは−８０℃で保存することができる。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した伝播能を持たないウイルスを再構成させるには、エンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ_２細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ_２細胞を重層して培養することによってエンベロープ遺伝子欠損型のウイルスを増幅することもできる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
回収されたウイルスの力価は、例えばＣＩＵ（Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｕｎｉｔ）測定または赤血球凝集活性（ＨＡ）を測定することにより決定することができる（ＷＯ００／７００７０；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆ Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ Ｂａｋｅｒ ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）。また、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したウイルスについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばＧＦＰ−ＣＩＵとして）。このようにして測定した力価は、ＣＩＵと同等に扱うことができる（ＷＯ００／７００７０）。ウイルスの力価の単位は、ＴＵ（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）で表わすこともある。
ウィルスが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウィルス等の再構成においては、サル腎由来のＬＬＣ−ＭＫ_２細胞およびＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７０）、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞（例えばＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、その蛋白質をエンベロープに含む感染性ウィルス粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウイルスを得るために、上記の宿主から得られたウイルスを発育鶏卵に感染させ、該ウイルスを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスの製造方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウイルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，ｐｐ．６８−７３，（１９９５））。
例えば、Ｆ遺伝子を欠失したセンダイウイルスの構築と調製は、以下のように行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
〈１〉Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡおよびＦ発現プラスミドの構築
センダイウイルス（ＳｅＶ）全長ゲノムｃＤＮＡ、ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２８１３−２８２０）（「ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）」は「ｐＳｅＶ１８^＋」ともいう）のｃＤＮＡをＳｐｈＩ／ＫｐｎＩで消化してフラグメント（１４６７３ｂｐ）を回収し、ｐＵＣ１８にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１８／ＫＳとする。Ｆ遺伝子欠損部位の構築はこのｐＵＣ１８／ＫＳ上で行う。Ｆ遺伝子の欠損は、ＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行い、結果としてＦ遺伝子のＯＲＦ（ＡＴＧ−ＴＧＡ＝１６９８ｂｐ）を除いて例えばａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ（配列番号：１７）で連結し、Ｆ遺伝子欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ）を構築する。ＰＣＲは、Ｆ遺伝子の上流には［ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ｇｔｔｇａｇｔａｃｔｇｃａａｇａｇｃ／配列番号：１８，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｔｔｇｃｃｇｇｃａｔｇｃａｔｇｔｔｔｃｃｃａａｇｇｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃ／配列番号：１９］、Ｆ遺伝子の下流には［ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ／配列番号：２０，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｇａｇａａｔｃａｇｃ／配列番号：２１］のプライマー対を用いたＰＣＲの産物をＥｃｏＴ２２Ｉで連結する。このように得られたプラスミドをＳａｃＩとＳａｌＩで消化して、Ｆ欠損部位を含む領域の断片（４９３１ｂｐ）を回収してｐＵＣ１８にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳとする。このｐＵＣ１８／ｄＦＳＳをＤｒａＩＩＩで消化して、断片を回収してｐＳｅＶ１８^＋のＦ遺伝子を含む領域のＤｒａＩＩＩ断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦを得る。外来遺伝子は、例えばｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ遺伝子欠失部位にある制限酵素ＮｓｉＩおよびＮｇｏＭＩＶ部位に挿入する。
〈２〉ＳｅＶ−Ｆ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウイルスのＦ遺伝子（ＳｅＶ−Ｆ）を発現するＣｒｅ／ｌｏｘＰ誘導型発現プラスミドの構築はＳｅＶ−Ｆ遺伝子をＰＣＲで増幅し、Ｃｒｅ ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現されるように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄｌｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，１９９８，ｐ１１１５−１１２１）のユニークサイトＳｗａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを構築する。
Ｆ遺伝子欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、ＳｅＶ−Ｆ蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばＳｅＶの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ_２細胞を用いることができる。ＬＬＣ−ＭＫ_２細胞は、１０％の熱処理した非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム５０単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ_２で培養する。ＳｅＶ−Ｆ遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、Ｃｒｅ ＤＮＡリコンビナーゼによりＦ遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを、リン酸カルシウム法（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により、周知のプロトコールに従ってＬＬＣ−ＭＫ_２細胞に遺伝子を導入する。
１０ｃｍプレートを用い、４０％コンフルエントまで生育したＬＬＣ−ＭＫ_２細胞に１０μｇのプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを導入後、１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で２４時間培養する。２４時間後に細胞をはがし、１０ｍｌ培地に懸濁後、１０ｃｍシャーレ５枚を用い、５ｍｌ １枚、２ｍｌ ２枚、０．２ｍｌ ２枚に蒔き、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１２００μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、１４日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたＧ４１８に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
Ｆ蛋白質の発現誘導は、細胞を６ｃｍシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスＡｘＣＡＮＣｒｅを斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３８１６−３８２１（１９９５）；Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２，１１１５−１１２１（１９９８））により例えばｍｏｉ＝３で感染させて行う。
〈３〉Ｆ遺伝子欠失ＳｅＶウイルスの再構築及び増幅
上記ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦに外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにしてＬＬＣ−ＭＫ_２細胞にトランスフェクションする。ＬＬＣ−ＭＫ_２細胞を５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播く。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりゲノムＲＮＡの転写を行わせる場合には、細胞培養２４時間後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，８１２２−８１２６（１９８６））をＭＯＩ ２程度で室温で１時間感染させる。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば１５ワットバルブを５本が装備されたＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（カタログ番号４００６７６（１００Ｖ），ストラタジーン社，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いることができる。細胞を無血清のＭＥＭで洗浄した後、ゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、およびＳｅＶのＮ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、およびＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミドを、適当なリポフェクション試薬を用いてこの細胞にトランスフェクトする。プラスミドの量比は、これに限定されないが、好適には順に６：２：１：２：２：２とすることができる。例えば、ゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、並びにＮ、Ｐ、Ｌ、およびＦプラスＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミド（ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ；ＷＯ００／７００７０，Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １，５６９−５７９（１９９６））を、それぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比トランスフェクトする。数時間培養後、血清を含まないＭＥＭで細胞を２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＣｙｔｏｓｉｎｅ β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭで培養する。これらの細胞を回収し、ペレットをＯｐｔｉＭＥＭに懸濁する（１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。凍結融解を３回繰り返してｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ｍａｎｎｈｅｉｍ）と混合し（１０^６ｃｅｌｌｓ／２５μｌ ＤＯＳＰＥＲ）室温で１５分放置した後、上記でクローニングしたＦ発現ヘルパー細胞にトランスフェクション（１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ １２−ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）し、血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ ＡｒａＣ，７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で培養し、上清を回収する。Ｆ以外の遺伝子、例えばＨＮまたはＭ遺伝子を欠損したウイルスも、これと同様の方法で調製することができる。
ウィルス遺伝子欠損型ウイルスを調製する場合、例えば、ウイルスに含まれるウィルスゲノム上で欠損しているウィルス遺伝子が異なる２種またはそれ以上のウイルスを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウィルス蛋白質が、他のウイルスからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウィルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウィルスが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のウイルスを、ウィルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのウィルス遺伝子欠損型ウィルスの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウィルスは、ウィルス遺伝子が欠損しているため、ウィルス遺伝子を欠損していないウィルスに比ベゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持することができる。また、ウィルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウィルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
なお、伝播性のマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを個体または細胞に投与後、治療が完了するなどウイルスベクターの増殖を抑止する必要が生じた際には、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、宿主に障害を与えずにウイルスベクターの増殖だけを特異的に抑止することもできる。
本発明のウイルスベクターに搭載させる外来遺伝子としては、特に制限はないが、天然由来の蛋白質としては、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体、細胞内シグナル分子、酵素、ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、または核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子としてアンチセンスＲＮＡ分子またはＲＮＡ切断型リボザイムなどを発現させて、特定の遺伝子の機能を抑制することもできる。また、外来遺伝子としては、遺伝子の導入効率または発現安定性等を評価するためのマーカー遺伝子であってもよい。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子、細胞表面分子、および抗体断片などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、または核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。外来遺伝子としてアンチセンスＲＮＡ分子またはＲＮＡ切断型リボザイムあるいはｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ）などを発現させて、特定の遺伝子の機能を抑制することもできる。
本発明の方法によれば、本発明のウイルスは、例えば１×１０^５ＣＩＵ／ｍＬ以上、好ましくは１×１０^６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０^６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０^７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０^７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０^８ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０^８ＣＩＵ／ｍＬ以上の力価でウイルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウイルスの力価は、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Ｋｉｙｏｔａｎｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７（１），６５−７４（１９９０）；ＷＯ００／７００７０）。
回収したマイナス鎖ＲＮＡウイルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウィルスは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーまたは安定剤などとして添加した蛋白質などは除く）のうち、ウィルス由来の蛋白質の割合が例えば１０％以上、好ましくは２０％以上、好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウィルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
本発明のウイルスを含む組成物の製造においては、該ウイルスは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ウイルスと共に投与することが可能であり、ウイルスによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えばウイルスを生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などで適宜希釈して組成物とすることができる。ウイルスを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。またウイルスを含む組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。本発明のウイルスを含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。
本発明のマイナス鎖ＲＮＡウイルスを生体に投与する場合の投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、脊髄腔内、または皮下等に行われうるがそれらに限定されない。また局所あるいは全身に投与し得る。投与されるウイルス量は好ましくは約１０^５ＣＩＵ／ｍｌから約１０^１１ＣＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約１０^７ＣＩＵ／ｍｌから約１０^９ＣＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約１×１０^８ＣＩＵ／ｍｌから約５×１０^８ＣＩＵ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては１回当たりの投与量は２×１０^５ＣＩＵ〜２×１０^１０ＣＩＵが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。本発明のウイルスを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。

図１は、ｈＣＦＴＲ遺伝子の２箇所の高変異領域を示す図である。ｈＣＦＴＲの開始コドンＡＴＧのＡを１番目とした位置で示した。図中の配列については、１２５７領域の正常配列および変異配列はそれぞれ配列番号：５０および５１、３９０５領域の正常配列および変異配列はそれぞれ配列番号：５２および５３に示されている。
図２は、ｈＣＦＴＲ遺伝子の２箇所の高変異領域とセンダイウイルスｃＤＮＡのＥＩ配列との比較を示す図である。図中の配列については、ＮＰおよびＬは配列番号：５４、ＰおよびＨＮは配列番号：５５、ＭおよびＦは配列番号：５６、１２５７領域および３９０５領域はそれぞれ配列番号：５０および５２に示されている。
図３は、ｈＣＦＴＲ遺伝子の高変異領域の改変を示す図である。図中の配列については、１２５７″および″１２５７ｍ″はそれぞれ配列番号：５０および５７、″３９０５″および″３９０５ｍ″はそれぞれ配列番号：５２および５８に示されている。
図４は、ｈＣＦＴＲ遺伝子の高変異領域の改変のためのプライマーの設計を示す図である。図中の配列については、上から順に配列番号：２４〜２９に示されている。
図５は、ｈＣＦＴＲ遺伝子の高変異領域が改変された遺伝子断片（ｈＣＦＴＲｍ）の構築スキームを示す図である。
図６は、Ｍ遺伝子とＦ遺伝子の間にｈＣＦＴＲｍが挿入されたＳｅＶゲノムをコードするｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ／ＣＦＴＲ）の構築スキームを示す図である。
図７は、ｈＣＦＴＲ蛋白質の発現の確認を示す写真である。一次抗体としてモノクローナル抗ヒトＣＦＴＲ（Ｃ末端特異的）抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を用いたウェスタンブロッティングの結果を示す。レーン１，分子量マーカー；レーン２，Ｔ８４細胞（陽性対照）；レーン３，ＢＨＫ−２１細胞（陰性対照１）；レーン４，野生型ＳｅＶ感染ＢＨＫ−２１細胞（陰性対照２）；レーン５，ＳｅＶ／ＣＦＴＲ感染ＢＨＫ−２１細胞；レーン６，分子量マーカー。
図８は、ｈＣＦＴＲ蛋白質の発現の確認を示す写真である。免疫細胞化学分析の結果を示す。一次抗体としてマウス由来抗ヒトＣＦＴＲモノクローナル抗体（Ｃ末端特異的）（１０μｇ／ｍｌ）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）を、２次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ヤギ由来抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）コンジュゲート（５μｇ／ｍｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いた。対照として、ＧＦＰ遺伝子を搭載する伝播型ＳｅＶ（ＳｅＶ／ＧＦＰ）を用いた。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］ 高変異領域改変型ｈＣＦＴＲ遺伝子を搭載したＳｅＶベクター
本実施例では、高変異領域を含む遺伝子としてヒトＣＦＴＲ（ｈＣＦＴＲ）を用いて、高変異領域改変型ｈＣＦＴＲ遺伝子を搭載したＳｅＶベクターの構築を行った。正常配列（野生型）の全長ｈＣＦＴＲ遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクターでは、５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’に合致する２ヶ所の領域に高頻度な塩基変異が生じ、これらの塩基変異によってアミノ酸配列が変わり、発現したｈＣＦＴＲ蛋白の活性が認められなくなる（図１）。そこでｈＣＦＴＲ遺伝子においてアミノ酸配列を変えないように人為的にこの２ヶ所の塩基配列を改変してＥＩ配列との相同性を低下させ、センダイウイルスベクターに搭載した。この高変異領域改変型ヒトＣＦＴＲ遺伝子を搭載したセンダイウイルスベクターでは、ゲノム上のｈＣＦＴＲ遺伝子の変異がまったく見られなかった。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方において、正常なｈＣＦＴＲ蛋白の活性が確認された。
１．ｈＣＦＴＲ遺伝子の高変異領域の改変
（１） ｈＣＦＴＲ遺伝子のＯＲＦを含むｐＱＢ６．２プラスミドをテンプレートとして、５’側はＮｏｔＩ−ｔａｉｌｅｄプライマーＣＦＴＲ−Ｎ（５’−ａｃｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃａａａｇｔｔｃａａｔｇｃａｇａｇｇｔｃｇｃｃｔｃｔｇｇａａａａｇｇｃｃａｇｃ／配列番号：２２）、３’側はＮｏｔＩ−ｔａｉｌｅｄプライマーＣＦＴＲ−Ｃ（５’−ａｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｔｇａａｃｔｔｔｃａｃｃｃｔａａｇｔｔｔｔｔｃｔｔａｃｔａｃｇｇｃｔａａａｇｃｃｔｔｇｔａｔｃｔｔｇｃａｃｃｔｃｔｔｃｔｔｃ／配列番号：２３）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｏｔＩで消化して回収し、ＳｅＶ全長ゲノムｃＤＮＡ，ｐＳｅＶ１８＋（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １，５６９−５７９（１９９６））のＮｏｔＩ制限酵素部位に挿入し、ｐＳｅＶ／ＣＦＴＲ’ＮＰが得られた。
（２） ｈＣＦＴＲの高変異領域のアミノ酸配列を変えないようにプライマーを設計した（図３および４）。

（３） ｐＳｅＶ／ＣＦＴＲ’ＮＰをテンプレートとして、プライマーＣＦ−ＮｏｔＩＦとＣＦ−１２５７Ｒを用いてｈＣＦＴＲｍ断片１、プライマーＣＦ−１２５７ＦとＣＦ−３９０５Ｒを用いてｈＣＦＴＲｍ断片２、プライマーＣＦ−３９０５ＦとＣＦ−ＮｏｔＩＲを用いてｈＣＦＴＲｍ断片３を増幅した（図５）。酵素はＫＯＤ ｐｌｕｓを用いた。１０ｘ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ｄＮＴＰ ５μｌ、ＭｇＳＯ_４ ２μｌ（最終１ｍＭ）、プライマー各３０μｍｏｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ １μｌ、鋳型５μｌ（５０ｎｇ）を含むＰＣＲ反応液５０μｌ中でＰＣＲを行なった。サイクル条件は、９８℃ ２ｍｉｎの後、９８℃ １５ｓｅｃ−５５℃ ３０ｓｅｃ−６８℃ ３ｍｉｎを３５サイクル、７２℃ ７ｍｉｎの後、４℃で保存とした。
（４） ＰＣＲでｈＣＦＴＲｍ断片１、２、３をテンプレートとし、プライマーＣＦ−ＮｏｔＩＦとＣＦ−ＮｏｔＩＲを用いてｈＣＦＴＲｍ／ＮｏｔＩ断片を増幅した（図５）。酵素はＫＯＤ ｐｌｕｓを用いた。１０ｘ ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、ｄＮＴＰ ５μｌ、ＭｇＳＯ_４ ３μｌ（最終１．５ｍＭ）、プライマー各３０μｍｏｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ １μｌ、鋳型６μｌ（５０ｎｇ）を含むＰＣＲ反応液５０μｌ中でＰＣＲを行なった。サイクル条件は、９８℃ ３ｍｉｎの後、９８℃ １５ｓｅｃ−５５℃ ３０ｓｅｃ−６８℃ ５ｍｉｎを３５サイクル、７２℃ ７ｍｉｎの後、４℃で保存とした。
２．高変異領域改変型ｈＣＦＴＲを搭載したＳｅＶ ｃＤＮＡプラスミドの構築
ＮｏｔＩ処理後のライゲーションでＳｅＶ ｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋）ＭＦ：Ｔｏｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｖｉｒｕｓ．Ｒｅｓ．８６：３３−３８）のＭ遺伝子とＦ遺伝子の間のＮｏｔＩサイトにｈＣＦＴＲｍ／ＮｏｔＩ断片を挿入し、ＳｅＶ／ＣＦＴＲのｃＤＮＡプラスミド（ｐＳｅＶ／ＣＦＴＲ）を構築した（図６）。
３．改変型全長ｈＣＦＴＲ遺伝子を搭載したＳｅＶの再構築
改変型ｈＣＦＴＲ遺伝子全長（ｈＣＦＴＲｍと名付けた）を搭載したＳｅＶｃＤＮＡを用いて再構築を行い、ウイルスベクターを回収した。再構築プロトコールを以下に示す。
６ウェルプレートで培養したＢＨＫ−２１細胞を血清を含まないＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／１１６６８−０１９）で洗い、３×１０^６ｐｆｕの長波長紫外線（ＰＬＷＵＶ）処理した組み換えワクシニアウイルス（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現）（ＰＬＷＵＶ−ｖＴＦ７−３）を含む０．８５％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ ２００μｌを各ウェルに加え１時間感染させた。５μｇ ｃＤＮＡ、１μｇ ｐＧＥＭ／ＮＰ、０．５μｇ ｐＧＥＭ／Ｐ、１μｇ ｐＧＥＭ／Ｌを２５０μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（無添加原液）に、１５μｌ ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ［ＧＩＢＣＯ／１１６６８−０１９］を２５０μｌ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（無添加原液）に懸濁後、両溶液を混合し、室温で２０〜３０分静置してトランスフェクション溶液を準備した。ＰＬＷＵＶ−ｖＴＦ７−３の感染から１時間後、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（無添加原液）で２回洗浄した後、トランスフェクション溶液に０．５ｍｌ／ｗｅｌｌの１０％ＦＢＳ Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを混合し、１ｍｌ／ｗｅｌｌを細胞へ添加した。３７℃で６〜８ｈ後Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，８０μｇ／ｍｌ ＡｒａＣ）を添加し、３７℃で一晩培養した。
翌日、培地を除いてから無血清ＭＥＭ培地で一回洗浄し、無血清培地ＶＰ−ＳＦＭ（７．５μｇ／ｍｌ ｔｒｙｐｓｉｎ，４０μｇ／ｍｌ ＡｒａＣ）１ｍｌ／ｗｅｌｌを細胞へ添加した。６時間後、１ｍｌ／ｗｅｌｌ Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ（５×１０^５ ＬＬＣ−ＭＫ_２ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，１０％ＦＢＳ，４０μｇ／ｍｌ ＡｒａＣ）を細胞へ重層した。
２日後、３ウェルの細胞を集め、３０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ遠心後、０．４５ｍｌ培地を残すよう余分な培地を吸い取った。細胞沈殿をボルテックスで懸濁し、エタノール／ドライアイスで凍らせ、５ｍｉｎ後３７℃で溶かし、ボルテックスした。以上の凍結融解を全部３回を行った。凍結融解した細胞懸濁液を１５０μｌ／ｅｇｇで十日培養した受精鶏卵３個へ接種を行った。
接種した鶏卵をさらに３日培養した後、４℃に３時間冷やしてから漿尿液を回収し、ＨＡ Ａｓｓａｙでウイルスの存在を確認した。また、一部回収した漿尿液を１５０μｌ／ｅｇｇで新しい十日培養した受精鶏卵３個へ接種を行った。ＨＡ Ａｓｓａｙで陽性結果が出るまで、この操作を１〜２回繰り返した。その結果、ＨＡ Ａｓｓａｙで２^６以上のウイルスが得られ、その組み換えウイルスをＳｅＶ／ＣＦＴＲと名付けた。
４．ウイルスゲノム上のｈＣＦＴＲ遺伝子全長の配列確認
ウイルスからＲＮＡゲノムを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲでｈＣＦＴＲを含む断片を増幅し、ｈＣＦＴＲ全長の配列を確認した。ＲＮＡゲノムの抽出はＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌに、また逆転写はＴＯＹＯＢＯ，ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ−α−^ＴＭ共通に従って実施した。ＰＣＲはＲＴ産物を鋳型として以下のプライマーセットを用いて実施した。
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ １：ＳｅＶＦ４００３／ｈＣＦＴＲ−Ｃ４

Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ２：ｈＣＦＴＲ−Ｎ４／ＳｅＶＲ４９９３

ｈＣＦＴＲ全長配列確認用Ｐｒｉｍｅｒ：
Ｆｏｒｗａｒｄ：

Ｒｅｖｅｒｓｅ：

その結果、それぞれのＰＣＲにおいて予想通りの断片が確認された。
５．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈＣＦＴＲ蛋白発現の確認
１）ウェスタンブロッティング（図７）
改変型ｈＣＦＴＲ遺伝子搭載ＳｅＶによるｈＣＦＴＲ蛋白の発現をウェスタンブロッティングを用いて確認した。サンプル調製のため、まずコンフルエントになったＢＨＫ−２１細胞へＳｅＶ／ＣＦＴＲを感染させた（１００ｍｍ ｄｉｓｈ）（ＭＯＩ＝３）。コントロールとして、ｈＣＦＴＲ発現細胞株Ｔ８４、未感染のＢＨＫ−２１細胞、野生型ＳｅＶ（ＳｅＶ／ｗ）で感染した（ＭＯＩ＝３）ＢＨＫ−２１細胞などを用いた。ウイルスベクターで感染４８時間後の細胞をｉｃｅ−ｃｏｌｄ ＰＢＳ（−）で３回洗い、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ，１０μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，１０μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｏｎｉｎ，２ｍＭ用時調製したＰＭＳＦ］で溶解した（５ｍｌ／ｄｉｓｈ）。遠心（３５００ｒｐｍ，４℃，３０ｓｅｃ）した後、上清を除き、細胞沈殿を１ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、４℃で１時間置いた。遠心（１５０００ｒｐｍ，４℃，３０ｍｉｎ）した後、上清を除き、沈殿へ８０μｌのｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ［０．２％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）を含むｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ］を加えて懸濁し、室温で３時間置いた。遠心（１５０００ｒｐｍ，４℃，３０ｍｉｎ）した後、上清を新しいチューブへ移し、上清に同量のｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ［２％ＳＤＳ（ｗ／ｖ），１５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ｗ／ｖ），２％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ｖ／ｖ），１ｍＭ ＥＤＴＡ，および０．０２％（ｗ／ｖ）ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅを含む、Ｈ_３ＰＯ_４含有５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ６．８］を加えてよく混合した後、４℃で一晩置いた。
サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離しメンブレンに転写したのち、一次抗体として２００倍希釈した抗ヒトＣＦＴＲ抗体（Ｃ−Ｔｅｍｉｎｕｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を、２次抗体として２０００倍希釈したＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ［Ｄａｉｉｃｈｉ ｐｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ］または１０００倍希釈したＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ［Ｄａｉｉｃｈｉ ｐｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ］を用いて反応させ、ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて検出した。
図７に示したように、ｈＣＦＴＲ蛋白発現のポジティブコントロール細胞のＴ８４では、１６０〜１８０ｋＤａのｈＣＦＴＲ蛋白のバンドが、改変型ｈＣＦＴＲ遺伝子搭載ＳｅＶが感染したＢＨＫ−２１細胞では、１４０ｋＤａのｈＣＦＴＲ蛋白が検出された。同様の結果はＬＬＣ−ＭＫ_２、ＢＥＡＳ−２Ｂなどの細胞でも得られた。
２）Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（図８）
改変型ｈＣＦＴＲ遺伝子搭載ＳｅＶによるｈＣＦＴＲ蛋白の発現を免疫染色法を用いて以下のように確認した。コンフルエントになったＬＬＣ−ＭＫ_２細胞へＳｅＶ／ＣＦＴＲを用いて感染した（ＭＯＩ＝３）。コントロールはＳｅＶ／ＧＦＰで感染した（ＭＯＩ＝３）ＬＬＣ−ＭＫ_２細胞を用いた。ウイルスベクターで感染４８時間後の細胞をｉｃｅ−ｃｏｌｄ ＰＢＳ（−）で３回洗い、−２０℃ｃｏｌｄアセトン／メタノール（１：１，ｗ／ｗ）を加えて、−２０℃で２０ｍｉｎ固定した。洗浄（ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＲＴ），ＰＢＳ，１０ｍｉｎ ｘ ３ ｔｉｍｅｓ）後、Ｇｌｙｃｉｎ処理（ＲＴ，ＰＢＳ／５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ，１０ｍｉｎ）を行い、再度洗浄（ＲＴ，ＰＢＳ，１０ｍｉｎ ｘ １ ｔｉｍｅ）後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ（ＲＴ，１０％ＦＢＳ／１０％Ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ／１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ，２ｈ）を行なった。洗浄（ＲＴ，ＰＢＳ，１０ｍｉｎ ｘ ２ ｔｉｍｅｓ）後、１０μｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＦＴＲ抗体（Ｃ−Ｔｅｍｉｎｕｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて一次抗体反応（ＲＴ，１ｈ）を行い、洗浄（ＲＴ，ＰＢＳ，１０ｍｉｎ ｘ ４ ｔｉｍｅｓ）後、５μｇ／ｍｌ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４）を用いて二次抗体反応（ＲＴ，３０ｍｉｎ）を行なった。洗浄（ＲＴ，ＰＢＳ，１０ｍｉｎ ｘ ４ ｔｉｍｅｓ）後、蛍光顕微鏡で観察、写真撮影を行なった。図８に示したように、改変型ｈＣＦＴＲ遺伝子を搭載したＳｅｖが感染したＬＬＣ−ＭＫ_２細胞が蛍光抗体反応によって特異的に染色された。同様の結果はＢＨＫ−２１およびＢＥＡＳ−２Ｂ細胞でも得られた。
産業上の利用の可能性
本発明により、高変異領域が改変された外来遺伝子を有する組み換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスが提供された。本発明のマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、外来遺伝子がもともと有する高い頻度で変異が生じる配列が改変されているので、標的組織において外来遺伝子を安定して発現することができる。本発明のウイルスは、インビボまたはエクスビボにより生体内に投与するための遺伝子治療ベクターとして有用である。

【配列表】

Claims (14)

1. 外来遺伝子を有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスであって、該外来遺伝子の野生型遺伝子のセンス鎖配列中に該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのアンチゲノムのＥ配列の一部を含み、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスが有する該外来遺伝子は、該センス鎖配列の該Ｅ配列の該一部が、Ｅ配列との同一性を下げるように他の配列に改変されている、マイナス鎖ＲＮＡウイルス。
2. 外来遺伝子を有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスであって、該外来遺伝子の野生型遺伝子がセンス鎖の配列において５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’を含み、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスが有する該外来遺伝子は、センス鎖の配列において該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’が他の配列に改変されている、マイナス鎖ＲＮＡウイルス。
3. 該外来遺伝子が蛋白質をコードしており、該野生型遺伝子が含む該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が蛋白質コード配列の中にあり、該マイナス鎖ＲＮＡウイルスが有する該外来遺伝子は、該野生型遺伝子が該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列によりコードするアミノ酸配列を維持するように、該外来遺伝子のセンス鎖の配列における該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が他の配列に改変されている、請求項２に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス。
4. 該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が、５’−ＡＧＡ_５−６ＣＴＴ−３’配列中の配列である、請求項２に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス。
5. 該外来遺伝子がヒトＣＦＴＲ遺伝子である、請求項２に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス。
6. マイナス鎖ＲＮＡウイルスがパラミクソウイルスである、請求項１または２に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス。
7. マイナス鎖ＲＮＡウイルスがセンダイウイルスである、請求項１または２に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルス。
8. 請求項１または２に記載のマイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡまたはその相補鎖をコードするＤＮＡ。
9. 変異頻度が低下するように改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスの製造方法であって、
   （ａ）該遺伝子の改変前の遺伝子のセンス鎖配列中に該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのアンチゲノムのＥ配列の一部を含む場合に、該センス鎖配列の該Ｅ配列の該一部を、Ｅ配列との同一性を下げるように他の配列に改変する工程、
   （ｂ）改変された遺伝子が組み込まれた該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムまたはその相補鎖をコードするＤＮＡを調製する工程、
   （ｃ）該ＤＮＡを転写して該マイナス鎖ＲＮＡウイルスを再構成させる工程、を含む方法。
10. 変異頻度が低下するように改変された遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスの製造方法であって、
    （ａ）該遺伝子の改変前の遺伝子配列中に５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を含む場合に、該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列を他の配列に改変する工程、
    （ｂ）改変された遺伝子が組み込まれた該マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムまたはその相補鎖をコードするＤＮＡを調製する工程、
    （ｃ）該ＤＮＡを転写して該マイナス鎖ＲＮＡウイルスを再構成させる工程、を含む方法。
11. 該５’−ＡＧＡ_５−６Ｃ−３’配列が、５’−ＡＧＡ_５−６ＣＴＴ−３’配列中の配列である、請求項１０に記載の方法。
12. 該遺伝子がヒトＣＦＴＲ遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
13. マイナス鎖ＲＮＡウイルスがパラミクソウイルスである、請求項９または１０に記載の方法。
14. マイナス鎖ＲＮＡウイルスがセンダイウイルスである、請求項９または１０に記載の方法。

Images