JPWO2008096811A1

JPWO2008096811A1 - 弱毒化マイナス鎖ｒｎａウイルス

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Publication number: JPWO2008096811A1
Application number: JP2008557149A
Authority: JP
Inventors: 真理子吉崎; 井上　誠; 誠井上; 長谷川　護; 護長谷川
Original assignee: Dnavec Corp
Current assignee: Dnavec Corp
Priority date: 2007-02-07
Filing date: 2008-02-07
Publication date: 2010-05-27
Also published as: CN101646768A; CA2677659A1; KR20090114431A; EP2123755A1; WO2008096811A1; US20100323428A1

Abstract

本発明は、弱毒化しているマイナス鎖ＲＮＡウイルスを提供することを課題とする。本発明者らは、センダイウイルスのＬ蛋白質のアミノ酸配列における１２１４番目のアミノ酸の変異（Ｙ１２１４Ｆ）が、ウイルスのゲノム複製活性および／または転写活性を抑制することを見出した。またウイルスゲノムからのある特定の遺伝子を欠失させることで、従来に比べ更に細胞傷害性や免疫反応の軽減を図れることを見出し、本発明を完成させた。

Description

本発明は、弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスに関する。

1994年にリバースジェネティクス法が開発されてから、マイナス鎖RNAゲノムをもつウイルスのcDNAをもとに、in vitroで感染性粒子としてウイルス分子を生成できるようになった。この技術により、ウイルスcDNAを任意に改変することが可能になり、現在ではいくつかの遺伝子導入用ベクターとしてマイナス鎖非分節型RNAウイルスベクターが開発されている（非特許文献１参照）。

ウイルスベクターをヒトへ応用する場合、弱毒化は重要な条件である。ウイルス弱毒化の方法は大きく分けて、2つある。第1はウイルスゲノムから遺伝子を欠失する方法である。たとえば、呼吸器病幼児患者の原因ウイルスとしてヒト・メタニューモウイルス(HMPV)、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)がある。2歳以下の児童の場合、そのウイルスに感染するリスクが非常に高く、感染後、重篤な細気管支炎や肺炎を引き起こす（非特許文献２、３参照）。そのため、小児用ワクチンの開発が必要であった。そこで、HMPVではエンベロープ遺伝子であるSH・G遺伝子を欠失させたHMPVベクターが開発された（非特許文献４参照）。また、構成遺伝子が類似しているRSVでも同様にSH遺伝子を欠失させた生ワクチンが開発された（非特許文献５参照）。双方共に弱毒化され、ワクチンベクター投与後の気管上部、下部では感染性粒子の増殖が抑制されていた。また、これらのベクターの目的はウイルスそのものに対する免疫誘導であるため、ワクチンベクター投与後はそれらに対する中和抗体が産生され、野生型ウイルスからの保護作用が確認された。センダイウイルス（SeV）では、F遺伝子の欠失（非特許文献６参照）、M/F遺伝子の欠失（非特許文献７参照）、M/F/HN遺伝子の欠失（非特許文献８参照）に関する報告がある。エンベロープ関連遺伝子欠失によって、非伝搬性になるという長所がある。また、in vivoで感染性SeV粒子を抑制し、免疫反応の惹起を弱くする効果があった。しかしながら、遺伝子を欠失しても、生産細胞からトランスにベクター粒子へ欠失した蛋白質は供給されている。ゲノム上に、その遺伝子があって転写されるときよりも大幅な分子数の減少はあるものの、細胞傷害性や免疫反応の軽減をはかるには限界のある方法であった。

2番目の方法はウイルスの細胞傷害性を軽減する表現型をもつ突然変異の同定である。例えば、パラインフルエンザウイルスもヒト呼吸器疾患を引き起こすウイルスであるが、弱毒ワクチンの開発を目指し、全てのウイルス成分をバランスよく減少することを目的としてRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)の活性を低下させる点突然変異の解析が非常によく進んでいる（非特許文献９〜１１参照）。パラインフルエンザウイルスベクターも先に述べたRSVと構成遺伝子が類似しているため、ワクチン開発には、「点変異は近縁ウイルスへ移行できる」という利点を生かした改良型が多く報告されている（非特許文献１２、１３参照）。

RNAウイルスは、そのゲノムが一回複製するあいだでの塩基置換率は10^-5から10^-3の高い突然変異率である。in vitroの培養細胞系などでのウイルスの継代過程で、しばしば弱毒ウイルスの自然発生が観察できる。たとえば、human immunodeficiency virus（非特許文献１４、１５参照）、hepatitis A virus（非特許文献１６参照）、Japanese encephalitis virus（非特許文献１７参照）で、このような弱毒化ウイルスを同定しワクチン株としての応用が提唱される報告がある。センダイウイルスにおいても、今までに多数の持続感染ウイルス株が同定され、突然変異した部位の決定、およびその性状解析が行われてきた（非特許文献１８〜２４参照） (http://br.expasy.org/uniprot/P06447)。

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本発明は、弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスを提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。
本発明者らは、最も有効な弱毒化ベクターの開発として、ウイルスの特定成分の生産を抑え非伝搬性にする遺伝子欠失の方法に加えて、L（Large; ラージ）蛋白質の活性を有意に低下させる突然変異を利用することを考えた。

そこで本発明では、in vitroでの培養細胞系を用いて、持続感染性を指標にセンダイウイルス(Sendai virus; SeV)の転写・複製活性が著しく抑制された変異SeVウイルス株をクローニングし、有意に細胞傷害性を減少したL遺伝子の変異について突き止めた。

M（Matrix; マトリックス）遺伝子欠失SeVベクター(SeV/ΔM)は、そのゲノムからM遺伝子を除去してあるので、感染細胞からのVLP（Virus like particle; 2次粒子）の放出がほとんどない。よってSeV/ΔMベクターを使用することで、感染細胞から放出された子ベクター粒子が再感染することはない。また、細胞質内にSeV RNAが蓄積するため、SeV側、細胞側はそれを回避しようとするため何らかの変異が挿入される可能性が高いと予想した。そこで、このベクターの性質を利用し、LLC-MK2細胞へEGFP（増強緑色蛍光蛋白質）遺伝子搭載SeV/ΔMベクター(SeV/ΔM-GFP)をMOI 3で感染させ、持続感染している74クローンの細胞株を取得した。このうち60クローンについては感染細胞質から子ベクターが回収可能であり、それらのHA活性を親ベクター(SeV/ΔM-GFP)と比較した。その結果、59クローンは親ベクターと同等のHA活性を示した。しかし、1クローン(clone #37)は、37℃培養においてHA活性が検出されなかった。32℃培養では、親ベクターとほぼ同等のHA活性を示した。今までに同定された弱毒ウイルス(attenuated virus)は、温度感受性の報告が多いことから、このクローンも温度感受性である可能性がある。そこで、このclone#37について、さらにその性状解析を行ったところ、EGFP遺伝子の発現量は減少していたが、細胞傷害性も著しく減弱していた。このことから、clone#37は温度感受性と同時に転写・複製速度が遅くなった突然変異株であることが示唆された。

同定したSeV/ΔM-GFP-clone#37のゲノム全長を、ジデオキシヌクレオチドを用いたサンガー法の変法により塩基配列を決定した。センダイウイルスの各遺伝子についてZ株のNP,P,F,HN,Lと比較したところ、L遺伝子(6687塩基、2228アミノ酸)の1214番目のアミノ酸がチロシンからフェニルアラニンに、1602番目のアミノ酸がメチオニンからロイシンに置換していた。

L遺伝子は、RdRpとして機能する多機能酵素をコードしている。Lの活性は、キャップ酵素活性、転写、複製があり、SeVのRNPと結合した状態で細胞質に局在する。Lは、6684 bp、200 kDaの巨大蛋白質であり、6つのドメインが報告されている（Chandrika, R.et al. (1995) Virology 213, p352-363.、Cortese, C. K.et al. (2000) Virology 277, p387-396.、Feller, J. A.et al. (2000) Virology 269, p426-439.、Horikami, S. M., and Moyer, S. A. (1995) Virology 211, p577-582.、Smallwood, S.et al. (1999) Virology 262, p375-383.、Smallwood, S.et al. (2002) Virology 304, p135-145.、Smallwood, S. et al. (2002) Virology 304, p235-245.）。このうちL遺伝子の1214番目のアミノ酸の変異（チロシンからフェニルアラニン：Y1214F）はドメインVに位置している。

突然変異の種類は、(1) 点突然変異 (2) 逆位 (3) 転座に分類できる。最も多いのは点突然変異で、置換、欠失、挿入がある。欠失、挿入ではフレームシフトがおこり、その遺伝子産物は機能不全に帰結する。置換によりアミノ酸が入れ換わるものをミスセンス変異、また置換の場合でも、3番目のコドン変異で、3種類の終止コドン(TAA, TAG, TGA)のいずれかに変異したものをナンセンス変異という。変異していたのは、Y1214F、M1602Lの2残基のみで、他に塩基の欠失や追加した点突然変異は検出されなかった。

Y1214Fの塩基置換コドンは、チロシン（TaT）からフェニルアラニン（TtT）に変わっていた。一般的にtransversion(ピリミジン塩基がプリン塩基またはその逆の置換を起こす変化)は、transition(ピリミジン塩基が別のピリミジン塩基に、またはプリン塩基が別のプリン塩基に変化)よりも起こりにくい。Yoshitakeら（Yoshitake, J. et al. (2004) J Virol 78, p8709-8719.）は、EGFP遺伝子を搭載したセンダイウイルス (SeV-GFP)をCV-1細胞へ感染し、継代後の突然変異出現率を調べた。その結果、GFP遺伝子内の突然変異は、AからGのtransitionは、継代している間に自然発生していた。実際に、本発明で同定した60クローンのうち17クローンの表現型は親ベクターと同等であったが、FあるいはHN遺伝子に点突然変異が見いだされ、それらのうち大半がコドンの一番目の塩基、もしくは二番目の塩基のAからGあるいはGからAへのtransitionであった。

一方、L遺伝子内にY1214F、M1602Lの2変異をもつclone#37が示す搭載遺伝子の発現量減少、細胞傷害性の減弱、温度感受性といった表現型変化は、いずれの変異に起因しているかを明らかにするため、非伝播型ベクターであり、実際に遺伝子治療・遺伝子ワクチンへの応用が検討されているF遺伝子欠失SeVベクター(SeV/ΔF)のL遺伝子に部位特異的塩基配列変異法によってそれぞれの変異を導入したSeV/ΔF-GFP-1214、SeV/ΔF-GFP-1602、また双方を同時導入したSeV/ΔF-GFP-1214-1602 の3種類のSeVベクターを作製した。最近の知見より推察して、同定した突然変異のうちM1602Lの寄与が大きいことを予想した。西尾ら（Nishio, M. et al. (2004) Virology 329, p289-301.）は、センダイウイルスの変異としてL遺伝子内の1618番目のアミノ酸であるロイシンをバリンに置換した場合に持続感染が成立し、細胞傷害性が減弱することを報告している。その1618番目の点変異に加えて、1169番目のアミノ酸がトレオニンならば、温度感受性を示すことを報告している。

しかしながら、M1602Lをもつベクター(SeV/ΔF-GFP-1602)は、野生型L遺伝子を持つベクターと変わらない細胞傷害性を示し、mRNAの転写量は30%減少したにとどまった。ゲノム複製活性では温度間で差が確認されたが、表現型変化には至らなかった。この結果から、表現型変化を来すに必要な点変異は、Y1214Fであることが示唆された。

一方、Y1214Fをもつベクター(SeV/ΔF-GFP-1214, SeV/ΔF-GFP-1214-1602)は、ベクター感染による細胞傷害性をほとんど認めず、持続感染性が観察された(図12, 13)。このことは、ベクター感染細胞から細胞質RNAを精製し、cDNAに変換後に測定したリアルタイムPCRの結果（図10）からも証明された。SeV/ΔF-GFP-1214 mRNAの転写活性は、32℃では、SeV/ΔF-GFPの13%、37℃では1.5%まで減少していた。それをうけ、ゲノム複製も感染後20時間が経過しても、1細胞あたり7本のゲノムしか存在しなかった。また、同定したSeV/ΔM-GFP clone#37の突然変異は、別の欠失型センダイウイルスベクター (SeV/ΔF)に導入しても機能し、その表現型はY1214Fによることがわかった。

遺伝学における突然変異の同定ではY→Fの置換は多い。チロシンとフェニルアラニンは水酸基の違いだけで構造的に類似している。シグナル伝達の分野では、チロシンキナーゼの基質のチロシンをフェニルアラニンに置換して調べる方法がある（Yurchak, L. K. et al. (1996) J Biol Chem 271, p12549-12554.）。このY→Fによって、1214番目のチロシン残基の水酸基が他のアミノ酸あるいはペプチドと相互作用する可能性があると仮定する。その場合、相互作用に関与した水酸基がフェニルアラニンに置換され消失すれば、ウイルスRdRpの三次構造に影響をあたえ、結果としてLの転写・複製を行うポリメラーゼ活性が減少したことが理由のひとつとして考えられる。温度感受性を示したことは、32℃ではチロシンの水酸基なしの状態（=フェニルアラニン）でもLの三次構造は維持できるためであると推測した。また、チロシンキナーゼによるLの活性を上昇させる制御機構が存在する場合は、Y→Fにより大きな影響があることが予想できるが、そのような報告は今のところない。

弱毒化ウイルスの変異として、McAuliffeら（McAuliffe, J. M. et al. (2004) J Virol 78, p2029-2036.）はリコンビナントヒトパラインフルエンザ1型 (rHPIV 1)を使用し、L遺伝子がコードするアミノ酸における942番目のチロシン→ヒスチジン変異の細胞継代における突然変異安定性を解析している。その結果、6継代後、cACからtACへと元の塩基に容易に戻ることが示唆された。この報告から、HPIVやRSVウイルスの弱毒化に点変異を用いる場合には、2つ以上の塩基置換によるミスセンス変異を用いることを推奨している（Murphy, B. R., and Collins, P. L. (2002) J Clin Invest 110, p21-27.）。しかし、本発明で得られたY1214Fは1塩基置換であるにも関わらず、その変異は12継代後でも安定であった。

RNA依存性RNAポリメラーゼ(RNA-dependent RNA polymerase; RdRp)は、多機能蛋白質である。RdRpの酵素活性を制御する因子として、ウイルスの増殖を制御している。Sue A. Moyerら（Chandrika, R. et al. (1995) Virology 213, p352-363.、Cortese, C. K. et al. (2000) Virology 277, p387-396.、Feller, J. A. et al. (2000) Virology 269, p426-439.、Horikami, S. M., and Moyer, S. A. (1995) Virology 211, p577-582.、Smallwood, S. et al. (1999) Virology 262, p375-383.、Smallwood, S. et al. (2002) Virology 304, p135-145.、Smallwood, S. et al. (2002) Virology 304, p235-245.）は、L蛋白質の機能について6つのドメインの区分を提唱している。各ドメインの特徴、およびこれまでに報告された推測は、ドメインI-疎水性残基から構成されている（Smallwood, S. et al. (1999) Virology 262, p375-383.）。ドメインII-推定上のRNA結合モチーフがある（Malur, A. G. et al. (2002) Gene Expr 10, p93-100.、Schnell, M. J., and Conzelmann, K. K. (1995) Virology 214, p522-530.）。ドメインIII-VQGDNQという非常によく保存されたアミノ酸配列があり、RNAポリメラーゼ活性部分、RNA結合モチーフと予測されている。ドメインVI-6つの不変的なプロリン残基をもつと同時に、RNIGDPという保存されたアミノ酸配列がある。このアミノ酸配列がプリン結合ドメインである。ドメインV-ヒスチジンとシステイン残基が保存されており、それらは金属結合に関与する。ドメインVI-プリン塩基結合に関与し、メチル化酵素活性をもっている（Ferron, F. et al. (2002) Trends Biochem Sci 27, p222-224.）。このうちY1214Fは、ドメインV(1129aa - 1378aa)に位置している。現在のところ、ドメインVの機能は不明（Cortese, C. K. et al. (2000) Virology 277, p387-396.）な点がまだ多い。そこで、今までにジーンバンクに登録している情報をもとにレスピロウイルス、モービリウイルス、ルブラウイルスのRdRpの塩基配列、アミノ酸配列を比較・検討した(表１)。

GenBank Accession No.
YP_138518 SeV(Sendai virus)、AAL89409 HPIV 1(Human parainfluenza virus 1)、P12577 HPIV 3(Human parainfluenza virus 3)、P12576 MeV(Measles virus)、BAA12219 BPIV 3(Bovine parainfluenza virus 3)、AAK54670 CDV(Canine distemper virus)、NP_054714 MuV(Mumps virus)、P11205 NDV(Newcastle disease virus)、YP_138518 SV5(Simian parainfluenza virus 5)

表１から、Y1214、M1602いずれのアミノ酸配列も、10種類のウイルスでよく保存されていた。特にY1214における保存性が高いことがわかった。これらの情報から、Y1214をフェニルアラニンに変異する突然変異の表現型には普遍性・一般性があることが示唆された。すなわち、センダイウイルスのLと同様に、他のウイルスのRdRpにY1214Fまたはそれに対応する変異を導入することによって、弱毒化、あるいはRdRpの活性を減少できる可能性があることを強く示唆している。

臨床的に重要なインフルエンザやパラインフルエンザでは、弱毒化ウイルスを利用して、生ワクチンの開発が進められている。センダイウイルスのY1214F変異同定と同じように、RdRpの活性を低減するような突然変異の報告がある（Skiadopoulos, M. H. et al. (1999) J Virol 73, p1374-1381.、Haller, A. A. et al. (2001) Virology 288, p342-350.、McAuliffe, J. M. et al. (2004) J Virol 78, p2029-2036.）。センダイウイルスを使用して今回同定したY1214F変異は、RdRpの活性を約1/10に抑制し、しかも継代数を重ねても安定であった。このY1214Fをパラインフルエンザなど他のワクチン開発用のウイルスに導入すれば、効果的な弱毒化が期待できることが推察できる。

搭載遺伝子としてLacZ遺伝子を使用すると、β-gal染色とともにβ-gal発現蛋白質量の定量ができる。そこで、LLC-MK2細胞へSeVベクター感染させ、時間経過に伴うSeVベクターの動態をLacZのmRNA量とLacZ蛋白質量で測定した(図14, 15, 16)。感染後の時間経過を感染初期(0から10時間)、感染中期(10から22時間)、感染後期(22から32時間)にわけた。野生型のL遺伝子をもつSeVベクターとして、LacZ遺伝子を搭載するF遺伝子欠失型ベクターであるSeV¹⁸⁺LacZ/ΔFを使用した。

37℃におけるセンダイウイルスの野生型Lの感染初期のmRNA合成速度を計算したところ、1.5ヌクレオチド/秒であった。この数値は、Gubbayら（Gubbay, O. et al. (2001) J Gen Virol 82, p2895-2903.）が測定した感染初期のLのmRNA伸長速度1.7ヌクレオチド/秒と同じであった。感染中期(10から22時間)にはLの転写活性が急激に上昇する時期であり、それに伴いLacZ蛋白質の細胞質内への蓄積がおこっていることがわかった。また、この時期にゲノムの複製が開始していた。図15に示すように細胞傷害性があらわれはじめる感染後期(22から32時間) にはmRNAの減少がみられた。これはSeVによる強い細胞毒性により細胞が溶解したことによる。感染初期（感染後、0-10時間）のY1214F変異を有するSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214におけるLの転写伸長速度は0.3ヌクレオチド/秒で、SeV¹⁸⁺LacZ/ΔFの1/5の速度であった。また、そのゲノムの複製開始は感染後22時間後であった。複製によってゲノム分子数が増加すれば、転写合成されるmRNA分子数が増え、結果としてL, Pの転写因子の分子数も増える。従って、このような状態にある感染中期ではLacZ mRNA分子数は直線的に増加していた。

搭載遺伝子の発現レベルの水準を比較検討するために、5型アデノウイルスベクター（Ad 5）の遺伝子発現量をコントロールとして使用した。その結果、Y1214F-Lの活性はアデノウイルスベクター由来β-ガラクトシダーゼ発現量と同等以上であった。すなわち、このことはLの突然変異によって有意にウイルスの抗原性が減少したにも関わらず、遺伝子治療にとって重要な因子である搭載遺伝子の発現量は十分に保たれていることを意味する。

32℃における細胞内に蓄積するLacZ mRNAの定量結果では、LacZ mRNAの蓄積は感染後10時間に検出できた。SeV¹⁸⁺LacZ /ΔF-1214の転写速度は、SeV¹⁸⁺LacZ/ΔFの40%の活性を示した。しかしながら、Y1214F-Lの転写速度は感染後22時間から32時間の感染後期においても、その蓄積速度の直線性はよく保たれていた。これに対し、野生型のLでは感染後期でのmRNAの蓄積は37℃の場合と同様、減少傾向にあった。このことはやはり細胞傷害性の影響によるものと考えられた。搭載遺伝子の発現量は感染初期ではほとんど検出できなかったが、感染中期になると細胞内に蓄積が観察された。さらに感染後期には、LacZ mRNA、蛋白質量は野生型Lをもつベクターの80%までになった。これは、32℃でも細胞傷害性が抑制され、細胞の溶解が起こっていないことによるものと考えられた。LacZ染色においても、変異の許容温度32℃におけるLacZ蛋白質の発現は野生型Lをもつベクターと遜色ない程度であることがわかった（図16）。全エンベロープ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターによる遺伝子導入では、細胞傷害性および強い免疫惹起反応によって、in vivoにおける搭載遺伝子の発現期間は数日で、その後、その発現はすみやかに消失した（Yoshizaki, M., Hironaka, T., Iwasaki, H., Ban, H., Tokusumi, Y., Iida, A., Nagai, Y., Hasegawa, M., and Inoue, M. (2006) Naked Sendai virus vector lacking all of the envelope-related genes: reduced cytopathogenicity and immunogenicity. J Gene Med 8, p1151-1159.）。このことはゲノムからの遺伝子欠失による改良には限界があることを示している。遺伝子欠失によるSeV改良は、ある程度の効果は期待できる。さらに、Lの活性制御と遺伝子の欠失を組み合わせた弱毒化（Attenuation）が有望である。in vivoにおいても、センダイウイルスの強い毒性が減弱し、搭載遺伝子の発現、免疫反応からの回避において著しい優位性を発揮することが期待できる。

LacZの蛋白質は組み換え型β-ガラクトシダーゼを使用した。コントロールのβ-ガラクトシダーゼの分子数は、分子量と質量から算出し、この検量線からSeVベクター、およびAd 5ベクターによるLacZ遺伝子の発現量をLacZ蛋白質量から測定した。細胞あたりのLacZ量は、野生型L-SeVベクター（SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF）で6 pg/細胞、Y1214F変異を有するL-SeVベクター(SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214)では1.5〜4 pg/細胞であった。Adベクターでは0.3 pg/細胞の発現量であった。例えば、ポリクローナルあるいはモノクローナル抗体を作製するときのマウスへの免疫をモデル系として考えてみる。マウスでは、ポリクローナルあるいはモノクローナル抗体を作製するときの必要抗原量は5〜50μgである（Harlow, E., 1998, Antibodies, chapter6, p152）。SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214の抗原発現量は1.5〜4 pg/細胞であるから、3 x 10⁶ 個の細胞に遺伝子導入できれば、必要量の抗原を免疫マウス体内に供給できる計算になる。しかも、変性した抗原を含む組換え精製抗原とは違い、SeVは細胞内で本来の蛋白質の高次構造で産生された抗原で免疫できる。また、治療遺伝子産物を供給する場合にも、本来の高次構造を持つ蛋白質を効率よく産生させることができる。この数字は、ヒトへの適用において、ベクター発現能の目標値を設定するための目安ともなる。Lの活性を低下する点突然変異、Y1214Fの導入は、少なくともマウスを使用したワクチンなどの応用を考慮した前臨床試験において、有望であることを示唆している。

センダイウイルスベクターは高い遺伝子発現能をもつことが特徴である（Tokusumi, T. et al. (2002) Virus Res 86, p33-38.）。従って、弱毒化ウイルス（Attenuated virus）ベクターの開発では、ウイルスゲノムの改変により、細胞傷害性が減弱すると同時に搭載遺伝子発現量が減少してしまう懸念がある。実用性を考えると、最低限の遺伝子発現量を維持しながら、最大限にSeV抗原量を減少すること、細胞の自然免疫反応の対象になるウイルスRNA量を減少することが必要である。この点を考慮すると、Y1214FはRdRpの活性を低下させるが、アデノウイルスと同等以上の搭載遺伝子発現を示し、同時にLの活性を減少してSeV抗原量およびウイルスRNA量の減少を実現した。遺伝子治療、ワクチン開発のみならず、基礎研究における発現ベクターを開発するにあたっても、SeVベクターの構造蛋白質遺伝子の欠失（たとえば、F遺伝子欠失、M/F遺伝子欠失、M/F/HN遺伝子欠失）と組み合わせて、L遺伝子にY1214F変異を導入することは有効なウイルスベクターになることを明らかにした。また、RdRpのアミノ酸配列には高い類似性があり、今回性状解析したセンダイウイルスのLにおける点突然変異；Y1214Fは、パラインフルエンザウイルスなどのワクチン開発にも利用できる普遍性・安定性がある。

即ち本発明は、弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスに関し、詳しくは
〔１〕配列番号：１（SeV 野生型L蛋白質）に記載のアミノ酸配列における1214番目に相当する位置のアミノ酸が野生型から置換されている変異L蛋白質をコードする遺伝子を有するマイナス鎖RNAウイルスであって、弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルス、
〔２〕弱毒化がゲノム複製活性および／または転写活性の低下である、〔１〕に記載のマイナス鎖RNAウイルス、
〔３〕置換が、チロシンからフェニルアラニンへの置換である、〔１〕または〔２〕に記載のマイナス鎖RNAウイルス、
〔４〕エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子のうち少なくとも１つ以上の遺伝子が欠失または不活化している、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルス、
〔５〕該欠失または不活化している遺伝子が、F、HN、およびM蛋白質をコードする遺伝子のうちいずれか１つ、または２つ以上の組み合わせである、〔４〕に記載のマイナス鎖RNAウイルス、
〔６〕マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルス科ウイルスである、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルス、
〔７〕パラミクソウイルス科ウイルスがセンダイウイルスである、〔６〕に記載のマイナス鎖RNAウイルス、
〔８〕〔１〕から〔７〕のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルスからなるウイルスベクター、
〔９〕外来遺伝子を発現可能に保持する、〔８〕に記載のウイルスベクター、
〔１０〕マイナス鎖RNAウイルスのL蛋白質をコードする遺伝子において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における1214番目に相当する位置のアミノ酸を置換する変異を導入することにより、マイナス鎖RNAウイルスを弱毒化する方法、
〔１１〕弱毒化がゲノム複製活性および／または転写活性の低下である、〔１０〕に記載の方法、
〔１２〕導入される細胞の細胞傷害性を低下させるために実施する、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法、
〔１３〕外来遺伝子の発現の持続性を向上させるために実施する、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法、
〔１４〕免疫反応を軽減させるために実施する、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法、
〔１５〕置換が、チロシンからフェニルアラニンへの置換である、〔１０〕から〔１４〕のいずれかに記載の方法、
〔１６〕マイナス鎖RNAウイルスにおけるエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子のうち少なくとも１つ以上の遺伝子が欠失または不活化している、あるいは欠失または不活化される工程をさらに含む、〔１０〕から〔１５〕のいずれかに記載の方法、
〔１７〕該欠失または不活化している、あるいは欠失または不活化される遺伝子が、F、HN、およびM蛋白質をコードする遺伝子のうちいずれか１つ、または２つ以上の組み合わせである、〔１６〕に記載の方法、
〔１８〕マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルス科ウイルスである、〔１０〕から〔１７〕のいずれかに記載の方法、
〔１９〕パラミクソウイルス科ウイルスがセンダイウイルスである、〔１８〕に記載の方法、に関する。

さらに本発明は、
〔２０〕マイナス鎖RNAウイルスのL蛋白質をコードする遺伝子において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における1214番目に相当する位置のアミノ酸を置換する変異を導入する工程を含む、弱毒化マイナス鎖RNAウイルスの製造方法、
〔２１〕弱毒化がゲノム複製活性および／または転写活性の低下である、〔２０〕に記載の製造方法、
〔２２〕置換が、チロシンからフェニルアラニンへの置換である、〔２０〕または〔２１〕に記載の製造方法、
〔２３〕マイナス鎖RNAウイルスにおけるエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子のうち少なくとも１つ以上の遺伝子が欠失または不活化している、あるいは欠失または不活化される工程をさらに含む、〔２０〕から〔２２〕のいずれかに記載の製造方法、
〔２４〕該欠失または不活化している、あるいは欠失または不活化される遺伝子が、F、HN、およびM蛋白質をコードする遺伝子のうちいずれか１つ、または２つ以上の組み合わせである、〔２３〕に記載の製造方法、
〔２５〕マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルス科ウイルスである、〔２０〕から〔２４〕のいずれかに記載の製造方法、
〔２６〕パラミクソウイルス科ウイルスがセンダイウイルスである、〔２５〕に記載の製造方法、に関する。

SeV/ΔM-GFPベクター感染後のLLC-MK2細胞におけるGFP発現を示す写真である（MOI 3）。 SeV/ΔM-GFPベクター感染後のCV-1細胞におけるGFP発現を示す写真である（MOI 3）。 SeV/ΔM-GFPベクター感染後のLLC-MK2細胞におけるGFP発現強度を示す図である（MOI 1）。 SeV/ΔM-GFPベクター持続感染細胞が有していた変異挿入部分を示す図である。 SeV/ΔF-GFP、SeV/ΔF-GFP-1602、SeV/ΔF-GFP-1214、あるいはSeV/ΔF-GFP-1214-1602ベクター感染後のCV-1細胞における細胞傷害性を示す図である。 SeV/ΔF-GFP、SeV/ΔF-GFP-1602、SeV/ΔF-GFP-1214、あるいはSeV/ΔF-GFP-1214-1602ベクター感染後のCV-1細胞における細胞形態を示す写真である。 SeV/ΔF-GFP、SeV/ΔF-GFP-1602、SeV/ΔF-GFP-1214、あるいはSeV/ΔF-GFP-1214-1602ベクター感染後のLLC-MK2/F7細胞におけるベクター生産能を示す図である。 SeV/ΔF-GFP、あるいはSeV/ΔF-GFP-1214ベクター感染後のC57BL/6マウス骨髄由来間葉系細胞におけるGFP発現を示す写真である（感染後7日目、MOI 100）。 SeV/ΔF-GFP、あるいはSeV/ΔF-GFP-1214ベクター感染後のC57BL/6マウス骨髄由来間葉系細胞におけるGFP発現を示す写真である（感染後14日目、MOI 100）。 SeV/ΔF-GFP(Y1214F)、SeV/ΔF-GFP(M1602)、及びSeV/ΔF-GFPベクター感染後のLLC-MK2細胞におけるゲノムRNA、アンチゲノムRNA、及びmRNA発現量を示す図である。 SeV/ΔF-GFP,あるいはSeV/ΔF-GFP-1214ベクター感染後のCV-1細胞における細胞増殖速度を示す図である。 SeV/ΔF-GFP,あるいはSeV/ΔF-GFP-1214ベクター感染後のLLC-MK2細胞における細胞増殖速度を示す図である。 Sev/ΔF-GFP-1214ベクター感染後5継代後のLLC-MK2細胞におけるGFP発現レベルを示す写真である。 SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF、SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214、あるいはAdeno-LacZベクター感染後のLLC-MK2細胞における搭載遺伝子（LacZ）の発現動態を示す図である。（A）SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF、あるいはSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214ベクター感染後のLLC-MK2細胞におけるLacZ mRNAコピー数、及びSeVゲノムコピー数を示す図である（37℃培養）。感染後0〜10時間におけるmRNAコピー数について、より詳細に示すために拡大したグラフを、図左下に示す。（B）ベクター感染後のLLC-MK2細胞におけるLacZ染色を示す写真である（37℃培養）。 (A）SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF、あるいはSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214ベクター感染後のLLC-MK2細胞におけるLacZmRNAコピー数、及びSeVゲノムコピー数を示す図である（32℃培養）。感染後0〜10時間におけるmRNAコピー数について、より詳細に示すために拡大したグラフを、図左下に示す。（B）ベクター感染後のLLC-MK2細胞におけるLacZ染色を示す写真である（32℃培養）。

本発明は、弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスを提供する。具体的には、センダイウイルスの野生型L蛋白質のアミノ酸配列における1214番目に相当する位置のアミノ酸が野生型から置換されている変異L蛋白質をコードする遺伝子を有するマイナス鎖RNAウイルスであって、弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスに関する（以下本発明では、「弱毒化マイナス鎖RNAウイルス」と記載する場合がある）。

本発明者らは、センダイウイルスの野生型L蛋白質のアミノ酸配列における1214番目のアミノ酸が、野生型と比較して置換されている場合に、センダイウイルスが弱毒化することを初めて見出した。例えば本願実施例において示されるように、Y1214Fを持つセンダイウイルス（SeV/ΔF-GFP-1214）mRNAの転写活性は、アミノ酸置換の無いセンダイウイルスと比較して減少が確認され、ゲノム複製も感染後20時間が経過しても１細胞あたり７本のゲノムしか存在しないことが確認された。ゲノム複製の低下によってゲノム分子数が低下すれば、転写合成されるmRNAの分子数も減る。即ち、本発明において「弱毒化」とは、マイナス鎖RNAウイルスのゲノム複製活性および／または転写活性が低下していることを指す。

センダイウイルスの野生型L蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：１に、また当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号：２に記載する。
本発明において「相当する位置」とは、L蛋白質における相同な位置のことであり、具体的には、配列番号：１のアミノ酸配列と整列させた場合に、同じ位置となるアミノ酸配列の位置を言う。マイナス鎖RNAウイルスのL蛋白質は高度に保存されており、配列番号：１の1214番目に相当する位置は、各アミノ酸配列を公知の手法により整列させることにより同定することが可能である。アミノ酸配列の整列は、例えばBLAST (Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990; Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993; Altschul SF, et al., J. Mol. Biol., 215: 403, 1990) や、CLUSTAL W (Thompson JD, et al., Nucleic Acids Res 22:4673-4680, 1994) 等を利用することにより容易に行なうことができる。配列番号：１の1214番目に相当する位置について、GenBankにおけるアクセッション番号と共に以下に具体例を示す。

・YP_138518 SeV （センダイウイルス）のアミノ酸配列における1214番目
・AAL89409 HPIV 1 (ヒトパラインフルエンザウイルス1)のアミノ酸配列における1214番目
・P12577 HPIV 3 (ヒトパラインフルエンザウイルス3) のアミノ酸配列における1214番目
・P12576 MeV (ミンク腸炎ウイルス) のアミノ酸配列における1212番目
・BAA12219 BPIV 3 (ウシパラインフルエンザウイルス3) のアミノ酸配列における1214番目
・AAK54670 CDV (イヌジステンパーウイルス) のアミノ酸配列における1212番目
・NP_054714 MuV (おたふくかぜウイルス) のアミノ酸配列における1222番目
・P11205 NDV (ニューカッスル病ウイルス) のアミノ酸配列における1192番目
・YP_138518 SV5 (サルパラインフルエンザウイルス5) のアミノ酸配列における1216番目

本発明における「マイナス鎖RNAウイルス」とは、マイナス鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）のRNAをゲノムとして含むウイルスである。マイナス鎖RNAはネガティブ鎖RNAとも呼ばれる。本発明において用いられるマイナス鎖RNAウイルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖RNAウイルス（非分節型（non-segmented）マイナス鎖RNAウイルスとも言う）が挙げられる。「一本鎖ネガティブ鎖RNAウイルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖［すなわちマイナス鎖］RNAをゲノムに有するウイルスを言う。

上記マイナス鎖RNAウイルスとしては、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等を含む）、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, および Ephemerovirus属等を含む）、エボラ出血熱ウイルスを含むフィロウイルス（Filoviridae）、オルソミクソウイルス（Orthomyxoviridae; Influenza virus A, B, C, および Thogoto-like viruses 等を含む）、ブンヤウイルス（Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, および Phlebovirus属等を含む）、アレナウイルス（Arenaviridae）などの科に属するウイルスが含まれる。

本発明において用いられるマイナス鎖RNAウイルスを具体的に挙げれば、例えばパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスのセンダイウイルス(Sendai virus)、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RSウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1,2,3型、オルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)のインフルエンザウイルス(Influenza virus)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病ウイルス(Rabies virus)、フィロウイルス科のエボラ出血熱ウイルス（Ebola virus）等が例示できる。DI粒子（J. Virol. 68, 8413-8417(1994)）等の不完全ウイルスや、合成したオリゴヌクレオチド等も使用することができる。

なお本発明におけるマイナス鎖RNAウイルスとしては、好ましくはパラミクソウイルス科のウイルスであり、より好ましくはパラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）のウイルス、最も好ましくはレスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）のウイルスである。

また本発明における配列番号：１に記載のアミノ酸配列における1214番目に相当する位置のアミノ酸の置換は、好ましくはチロシンからフェニルアラニンへの置換（点突然変異）である。配列番号：１に記載のアミノ酸配列における1214番目に相当する位置のアミノ酸がチロシンであるマイナス鎖RNAウイルスとしては、例えば、レスピロウイルス属に属するヒトパラインフルエンザウイルス（HPIV）、ウシパラインフルエンザウイルス（BPIV）、モービリウイルス属に属するミンク腸炎ウイルス（MeV）、イヌジステンパーウイルス（CDV）、ルブラウイルス属に属するおたふくかぜウイルス（MuV）、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）等を挙げることができる。

本発明においては、チロシンからフェニルアラニンへのアミノ酸の置換であれば、該アミノ酸をコードする塩基の置換部位や置換数については特に限定されない。好ましくは、１つ以上のtransversion変異 (ピリミジン塩基がプリン塩基またはその逆の置換を起こす変化) を含む。また、2塩基以上の変異を含むものも好ましい。この場合、少なくとも１つはtransversion変異であることが好ましい。置換の一態様として、チロシン（TaT）からフェニルアラニン（TtT）という塩基の置換を例示することができる。また、該アミノ酸が野生型から置換されている変異L蛋白質をコードする遺伝子とは、他の位置のアミノ酸にも変異を有するものを含む。例えば、1214番目に相当する位置に加え、1602番目に相当する位置にさらに変異を有していてもよい。また、当該変異L蛋白質をコードする遺伝子を有するマイナス鎖RNAウイルスは、他の遺伝子に変異および/または欠損があってもよく、また、別の遺伝子が付加されていてもよい。

変異は周知の部位特異的変異導入法によって導入することができ、例えば、PCR法やカセット変異法等を用いることができる（Deng, W. P. & Nickoloff, J. A., Anal. Biochem. 200:81, 1992; Haught, C., et al., BioTechniques 16(1):47-48, 1994; Zhu, L. & Holtz, A., Methods Mol. Biol. 57:119-137, 1996; Zhu, L., Methods Mol. Biol. 57:13-29, 1995; GeneEditor^TM System, Altered Sites(R) II System, Promega Co. WI, USA; KOD - Plus-Mutagenesis Kit, Toyobo Co., Ltd. Osaka, Japan; Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit, Takara Bio Inc., Otsu, Japan）。例えば、マイナス鎖RNAウイルスのゲノムcDNAを調製し、L遺伝子をサブクローニングする。得られたL遺伝子に対して、1214番目に相当する位置のアミノ酸をコードするコドンに変異を導入することで、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における1214番目に相当する位置のアミノ酸が野生型から置換されている変異L蛋白質をコードする核酸および該核酸を含むベクターを得ることができる。この核酸を発現させることで、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における1214番目に相当する位置のアミノ酸が野生型から置換されている変異L蛋白質を産生することができる。得られた変異Ｌ蛋白質をコードする核酸をマイナス鎖RNAウイルスのゲノムcDNAのL遺伝子部分と交換することで、L蛋白質をコードする遺伝子に変異を有するウイルスゲノムcDNAが得られる。これを基にウイルスを製造することで、本発明の弱毒化マイナス鎖RNAウイルスを調製することができる。

本発明における弱毒化マイナス鎖RNAウイルスには、天然のウイルスにおいて、L遺伝子のみに上記の変異を導入したものが含まれる。病原性ウイルスのL遺伝子の1214番目のアミノ酸コード領域に変異を導入することにより、ウイルスを弱毒化することが可能である。また本発明における弱毒化マイナス鎖RNAウイルスは、エンベロープを構成するウイルス蛋白質（エンベロープ構成蛋白質）をコードする遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子が欠失または不活化していることも好ましい。遺伝子治療などにおいて用いるベクターを作製する場合には、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子を欠損させることで、感染粒子を複製する能力を欠いたベクターを得ることができる。

本発明における「エンベロープ構成蛋白質」には、ウイルスのエンベロープを構成するスパイク蛋白質およびエンベロープの裏打ち蛋白質が含まれる。具体的には、ウイルスの種類によっても異なるが、F（Fusion; フュージョン）、H（Hemagglutinin; ヘマグルチニン）、HA（同）、HN（Hemagglutinin-Neuraminidase; ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ）、G（Glycoprotein; グリコプロテイン）、M（Matrix; マトリックス）、M1（Matrix 1; マトリックス1）などの蛋白質を挙げることができる。

本発明におけるエンベロープ構成蛋白質は、上記F、H、HN、G、M、M1等の蛋白質だけでなく、例えば他のマイナス鎖RNAウイルスにおいて、上記エンベロープ構成蛋白質に相当する蛋白質であれば、例え名称が異なっていても本発明に含まれる。

例えばパラミクソウイルスにおけるエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子としては、M（マトリックス）、F（フュージョン）、およびHN（ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ）遺伝子（またはH (ヘマグルチニン) 遺伝子）が知られている。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。
レスピロウイルス属 M F HN
ルブラウイルス属 M F HN
モービリウイルス属 M F H

例えばパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）のレスピロウイルス属（genus Respirovirus）（パラミクソウイルス属（genus Paramyxovirus）とも言う）に分類されるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131を参照のこと。

またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; および SV5, M32248、F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; および SV5, AB021962、HN（HまたはG）遺伝子については CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; および SV-5, S76876、L遺伝子についてはCDV, AF014953; DMV, AJ608288; HPIV-1, AF117818; HPIV-2, X57559; HPIV-3, AB012132; Mumps, AB040874; MV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV,Z30698; およびSV-5, D13868が例示できる。
但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。

本発明の弱毒化マイナス鎖RNAウイルスは、上記F、HN、およびM蛋白質をコードする遺伝子のうちいずれか１つ、または２つ以上組み合わせた遺伝子が欠失または不活化していることが好ましい。
例えばM蛋白質をコードする遺伝子が欠失または不活化された弱毒化マイナス鎖RNAウイルスは、本発明における弱毒化という特長に加えて、さらにウイルス感染後の粒子形成に必須であるM蛋白質が産生されないためにウイルス粒子が放出されず、つまり子ウイルスによる再感染がなくなるという特長を有することができる。
またF蛋白質をコードする遺伝子が欠失または不活化された弱毒化マイナス鎖RNAウイルスは、本発明における弱毒化という特長に加えて、さらに非伝播型ウイルスとなり、安全性が確保されたウイルスとなることができる。
またHN蛋白質をコードする遺伝子が欠失または不活化された弱毒化マイナス鎖RNAウイルスは、本発明における弱毒化という特長に加えて、さらに細胞表面の糖鎖をシアル酸残基の部分で切断する活性が阻害されるため、新たに作られたウイルス粒子が感染した細胞から遊離しなくなるという特長を有することができる。
本発明においては、F、HN、およびM蛋白質をコードする遺伝子の組み合わせについては特に制限されない。

また本発明は、本発明の弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスからなるベクター（以下、「本発明のベクター」と記載する場合がある）を提供する。
本発明のベクターは、弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスに由来するウイルスゲノムを含み、自己複製能を欠如し、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子である。即ち、弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスを利用した運び屋を言い、細胞または宿主に核酸を導入するために用いられる担体のことを指し、ベクターが弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスのバックボーンを有することを指す。「弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスのバックボーンを有する」とは、該ベクターを構成するウイルス粒子に含まれる核酸分子が弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスのゲノムに基づくことを言う。例えば、ウイルス粒子に含まれる核酸分子が弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルスゲノム由来のパッケージングシグナル配列を有するベクターは、本発明のベクターに含まれる。また本発明のベクターには、遺伝子組み換え技術により構築されたウイルスベクターも含まれる。ウイルスゲノムをコードするDNAとパッケージング細胞を用いて構築したウイルスベクターは、組み換えウイルスベクターとして本発明のベクターに含まれる。

本発明のベクターとしては、例えばマイナス鎖RNAウイルスがセンダイウイルスである、センダイウイルスベクターを挙げることができる。センダイウイルスベクターは、高い遺伝子発現能を有することが特徴であり、この点からY1214Fは、RdRpの活性を低下させるが、アデノウイルスと同等以上の外来遺伝子（本発明においては「搭載遺伝子」と記載する場合もある）の発現を示し、同時にL蛋白質の活性を減少させセンダイウイルスの抗原量およびウイルスRNA量の減少を実現した。遺伝子治療、ワクチン開発のみならず、基礎研究における発現ベクターを開発するにあたっても、センダイウイルスベクターの構造蛋白質遺伝子の欠失（例えば、F遺伝子欠失、M/F遺伝子欠失、M/F/HN遺伝子欠失）と組み合わせて、L遺伝子にY1214F変異を導入することは有効なウイルスベクターになることを明らかにした。

よって欠失によるセンダイウイルス改良は、ある程度の効果は期待できる。さらに、Lの活性制御と遺伝子の欠失を組み合わせた弱毒化が有望である。in vivoにおいても、センダイウイルスの強い毒性が減弱し、外来遺伝子の発現、免疫反応からの回避において著しい優位性を発揮することが期待できる。

また本発明のベクターは、外来遺伝子を発現可能に保持していてもよい。本発明のベクターが保持する外来遺伝子としては特に制限はなく、標的細胞中で発現させたい所望の遺伝子を用いることが可能である。例えば、蛋白質をコードする核酸であってもよく、また、例えば、アンチセンスまたはリボザイムなどの蛋白質をコードしない核酸であってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であってもよい。人工的な蛋白質としては、例えば、他の蛋白質との融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および可溶型細胞表面分子などであってよい。

また、本発明における外来遺伝子としては、遺伝子の導入効率や発現安定性等を評価するためのマーカー遺伝子であってもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、グリーン蛍光蛋白質（以下、GFPともいう）、ベータ-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどをコードする遺伝子が挙げられる。
あるいは、本発明の外来遺伝子としては、例えば、遺伝子治療などを目的とする場合には、本発明のベクターに対象となる疾患の治療用遺伝子を挿入する。外来遺伝子を導入する場合は、例えば、センダイウイルスベクターにおいては、転写開始(S)配列と転写終結(E)配列との間などに、ゲノムの総塩基数が6の倍数となるように考慮して配列を挿入することが必要である（Journal of Virology, Vol.67, No.8, 1993, p.4822-4830）。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外来遺伝子の前または後ろに適宜 E-I-S配列（転写開始配列−介在配列−転写終結配列）またはその部分を挿入してもよい。挿入した外来性遺伝子の発現量は、外来遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（WO01/18223）。また、遺伝子挿入の位置、また遺伝子の前後の塩基配列により調節しうる。例えば、センダイウイルスにおいては、挿入位置が（−）鎖RNAの3'端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、NP遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が高い。外来遺伝子の高い発現を得るためには、外来遺伝子をネガティブ鎖ゲノムにおいて上流領域（マイナス鎖においては3'側）に挿入することが好ましい。逆に、挿入位置がネガティブ鎖RNAの5'端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、L遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低くなる。外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、例えばネガティブ鎖の最も5'側、すなわち野生型ウイルスゲノムにおいてはL遺伝子の下流（ネガティブ鎖においてはL遺伝子の5'隣接部位）、またはL遺伝子の上流（ネガティブ鎖においてはL遺伝子の3'隣接部位）に外来遺伝子を挿入する。外来遺伝子を容易に挿入できるようにするために、挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。ゲノムをコードするベクターDNA中の当該制限酵素部位に外来遺伝子断片を挿入することができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。本発明のベクターは、このように他の外来遺伝子を保持していてもよい。

組み換えマイナスRNAウイルスの再構成は公知の方法を利用して行えばよい。具体的には、（ａ）哺乳動物細胞において、マイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAを含むRNPを構成するウイルス蛋白質の存在下、マイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖（アンチゲノムRNA。プラス鎖）をコードするDNAを転写させる工程、（ｂ）生成したマイナス鎖RNAウイルスまたは該ゲノムRNAを含むRNPを回収する工程、により製造することができる。上記のRNPを構成するウイルス蛋白質(viral proteins)とは、ウイルスゲノムRNAと共にRNPを形成し、ヌクレオカプシドを構成する蛋白質を言う。これらはゲノムの複製および遺伝子発現に必要な蛋白質群であり、典型的には、N（ヌクレオキャプシド (またはヌクレオプロテイン (NP) とも言う)）、P（ホスホ）、およびL（ラージ）蛋白質である。ウイルス種によっては、表記は異なることもあるが、対応する蛋白質群は当業者には知られている (Anjeanette Robert et al., Virology 247:1-6 (1998))。例えば、NはNPと表記されることもある。

ウイルス再構成に際しては、上記のように、マイナス鎖RNAゲノム（すなわちウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させても、プラス鎖RNA（アンチゲノム。ゲノムRNAの相補鎖）を生成させてもよいが、ウイルスの再構成効率を高めるには、好ましくはプラス鎖を生成させる。ウイルスゲノムRNAとしては、RNPの再構成に必要なウイルス蛋白質をコードしていれば、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子は欠失していても感染細胞においてゲノムRNAを複製できる。具体的には、例えば、N、P、およびL蛋白質をコードしていれば、F、HN、Mなどのウイルス蛋白質はコードしないように構築する。このような欠損型ウイルスは、細胞内でゲノムRNAを増幅できるが、感染性ウイルス粒子を放出しないため、安全性の高い遺伝子導入ベクターとして有用である（WO00/70055、WO00/70070、および WO03/025570; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。組み換えウイルスを製造する場合は、これらのエンベロープ構成蛋白質を、ウイルス産生細胞内で別途発現させ、粒子形成を相補する。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、適当なプロモーターの下流に該蛋白質またはゲノムをコードするDNAが連結された発現ベクターを、宿主細胞に導入する。プロモーターとしては、例えばCMVプロモーターやCAGプロモーターなどが用いられる（Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199、特開平3-168087）。

RNA末端は、天然のウイルスゲノムと同様に3'リーダー配列と5'トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。このためには、例えば転写産物の5'端に自己切断型のリボザイムを付加しておき、リボザイムによりマイナス鎖RNAウイルスゲノムの末端を正確に切り出させる（Inoue, K. et al. J. Virol. Methods 107, 2003, 229-236）。あるいは、転写産物の5'端を正確に制御するために、転写開始部位にバクテリオファージのRNAポリメラーゼ認識配列を利用し、該RNAポリメラーゼを細胞内で発現させて転写を誘導する。バクテリオファージのRNAポリメラーゼとしては、例えば大腸菌T3ファージおよびT7ファージ、およびサルモネラSP6ファージ等が用いられる (Krieg, P.A. and Melton, D.A. 1987, Methods Enzymol. 155: 397-15; Milligan, J.F. et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 8783-798; Pokrovskaya, I.D. and Gurevich, V.V., 1994, Anal. Biochem. 220: 420-23)。バクテリオファージのRNAポリメラーゼは、例えばこれを発現するワクシニアウイルス (Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) を用いて供給することができるし、あるいはプラスミドなどの発現ベクターから供給することもできる。転写産物の3'端を制御するには、例えば転写産物の3'端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に3'端が切り出されるようにする方法も知られている（Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 1997: 78; 2813-2820、Kato, A. et al., EMBO J. 1997,: 16; 578-587 及び Yu, D. et al., Genes Cells. 1997: 2; 457-466）。リボザイムとしては、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（antigenomic strand）由来の自己開裂リボザイムが使用できる。

エンベロープ構成蛋白質の遺伝子を欠失させたウイルスの再構成においては、欠失させたエンベロープ構成蛋白質でウイルスの感染性を相補してもよいが、例えば、欠失させた蛋白質とは別のエンベロープ蛋白質でシュードタイプ化することもできる。このようなエンベロープ蛋白質としては、例えば水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）（J. Virology 39: 519-528 (1981)）を用いることができる（Hirata, T. et al., 2002, J. Virol. Methods, 104:125-133; Inoue, M. et al., 2003, J. Virol. 77:6419-6429; Inoue M. et al., J Gene Med. 2004;6:1069-1081）。また、ウイルスのエンベロープ蛋白質以外にも、例えば、特定の細胞に接着しうるような、接着因子、リガンド、受容体等由来のポリペプチドで修飾したり、または、それらを細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを用いることが可能である。これにより、特定の組織を標的とするベクターを作り出すこともできる。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばF、HN、H、Gなどのスパイク蛋白質遺伝子、Mなどのエンベロープ裏打ち蛋白質遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。スパイク蛋白質遺伝子の欠失は、マイナス鎖RNAウイルスを非伝播性にするために有効であり、また、M蛋白質などのエンベロープの裏打ち蛋白質遺伝子の欠失は、感染細胞からの粒子形成を不能にするために有効である。例えば、F遺伝子欠失型マイナス鎖RNAウイルス（Li, H.-O. et al., J.Virol. 74, 6564-6569 (2000)）、M遺伝子欠失型マイナス鎖RNAウイルス（Inoue, M. et al., J.Virol. 77, 6419-6429 (2003)）などは好適に用いられる。また、F、HN (またはH)、およびMの少なくとも２つの遺伝子の任意の組み合わせを欠損するウイルスは、より安全性が保障される。例えば、MおよびF遺伝子両欠失型ウイルスは、高レベルの感染性および遺伝子発現能を保ったまま、非伝播性でかつ粒子形成を欠くウイルスとなる。これらのウイルスは、ウイルスベクターとして用いる場合に高い安全性を確保できるため特に有用である。

F遺伝子欠失型の組み換えウイルスの製造を具体的に例示すれば、例えばF遺伝子が欠損したマイナス鎖RNAウイルスゲノムまたはその相補鎖を発現するプラスミドを、F蛋白質を発現する発現ベクター、ならびにN、P、およびL蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションする。または、F遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いれば、より効率的にウイルスを製造することができる（WO00/70070）。この場合は、F遺伝子を誘導発現できるように、Cre/loxPやFLP/FRTなどの配列特異的組み換え酵素とその標的配列を用いて、発現を誘導できるようにしておくことが好ましい（WO00/70055 および WO00/70070；Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820参照）。具体的には、例えばCre/loxP誘導型発現プラスミドpCALNdlw（Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, p1115-1121）等の組み換え酵素標的配列を持つベクターにエンベロープ蛋白質遺伝子を組み込む。発現の誘導は、例えばアデノウイルスAxCANCreをmoi=3〜5 で感染させて行う（Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T.et al., J. Virol 72,1115-1121 (1998)）。

本発明において用いるマイナス鎖RNAウイルスは、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばセンダイウイルス（SeV）のアクセサリー遺伝子の１つであるV遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するSeVの病原性が顕著に減弱する（Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71:7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16:578-587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179）。

またマイナス鎖RNAウイルスは、感染の持続性を高めるために、上記のL遺伝子の変異部位に加え、P遺伝子またはL遺伝子にさらに変異を有するものを使用してもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の86番目のGlu（E86）の変異、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質の相同部位の置換が挙げられる。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeV L蛋白質の1197番目のAsn（N1197）および/または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換、または他のマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相同部位の置換が挙げられ、具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、2次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることが期待できる。

より具体的な組み換えウイルスの再構成は、例えば以下の文献を参照することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570； WO2005/071092; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖RNAウイルスを、DNAから再構成させることができる。

本発明においてマイナス鎖RNAウイルスには、感染性ウイルス粒子、非感染性ウイルス粒子（ウイルス様粒子；VLPとも言う）およびウイルスのコア（ゲノムおよびゲノム結合ウイルス蛋白質を含むRNP複合体）を含む。すなわち本発明のマイナス鎖RNAウイルスは、マイナス鎖RNAウイルス由来のゲノムRNAおよび該RNAの複製および搭載遺伝子の発現に必要なウイルス蛋白質を有するリボヌクレオプロテイン（RNP）複合体を含む複合体を言う。該RNPは、例えばマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖(アンチゲノムRNA)と、N、L、P蛋白質とを含む複合体である。ウイルス粒子からエンベロープを除去したRNP（ウイルスコア）であっても、細胞に導入されれば、細胞内においてウイルスゲノムRNAを複製することができる（WO97/16538; WO00/70055）。RNPまたはVLPは、例えばトランスフェクション試薬などと共に宿主に投与するとよい（WO00/70055; WO00/70070）。

ウイルス産生には所望の哺乳動物細胞などを用いることができるが、具体的には、例えば、サル腎由来のLLC-MK2細胞（ATCC CCL-7）およびCV-1細胞 (例えばATCC CCL-70)、ハムスター腎由来のBHK細胞 (例えばATCC CCL-10) などの培養細胞、ヒト由来細胞等が挙げられる。また、大量にウイルスを得るために、上記の宿主から得られたウイルスを発育鶏卵に感染させ、ウイルスを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスの製造方法は既に開発されている（中西ら編,(1993),「神経科学研究の先端技術プロトコールIII, 分子神経細胞生理学」, 厚生社, 大阪, pp.153-172）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ9〜12日間 37〜38℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人,「ウイルス実験プロトコール」, 永井、石浜監修, メジカルビュー社, pp.68-73,(1995)）。

回収したウイルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスを含む溶液中で該ウイルスの成分が主要な割合を占めることを言う。例えば実質的に純粋なウイルス組成物は、溶液中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスの成分として含まれる蛋白質の割合が10%(重量/重量)以上、好ましくは20%以上、より好ましくは50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウイルスであれば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭62-30752号公報、特公昭62-33879号公報、および特公昭62-30753号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法（WO97/32010）等を例示することができるが、これらに制限されない。

本発明のマイナス鎖RNAウイルスは目的に応じた組成物として調製することができる。該ウイルスを含む組成物の製造においては、ウイルスは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、例えばウイルスまたはその処理物の投与対象に使用できる所望の溶液等が挙げられ、本発明のウイルスをベクターとして用いる場合には、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えば本発明のウイルスを生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）などで適宜希釈して組成物とすることができる。また該ウイルスを含む組成物は、脱イオン水、5%デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。また、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などを担体として組み合わせることもできる。本発明のマイナス鎖RNAウイルスを含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。

外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてベクターを調製すれば、このベクターを投与して遺伝子治療を行なうことが可能となる。本発明のウイルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接（ex vivo）投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。例えば、外来遺伝子として、感染症に関する細菌またはウイルスの抗原をコードする遺伝子を用いれば、これを動物に投与することにより、該動物において免疫を誘導することができる。即ち、ワクチンとして利用することができる。このように本発明のベクターは、遺伝子治療等の臨床に応用できる可能性がある。

ベクターの投与量や投与回数は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、脊髄腔内、または皮下等に行われうるがそれらに限定されない。また局所あるいは全身に投与し得る。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。

また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを弱毒化する方法を提供する。具体的には、マイナス鎖RNAウイルスのL蛋白質をコードする遺伝子において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における1214番目に相当する位置のアミノ酸を置換する変異を導入することにより、マイナス鎖RNAウイルスを弱毒化することができる。

上記本発明のマイナス鎖RNAウイルスを弱毒化する方法におけるアミノ酸の置換は、上述の弱毒化マイナス鎖RNAウイルスにおける場合と同じく、好ましくはチロシンからフェニルアラニンへの置換（点突然置換）である。

上記本発明のマイナス鎖RNAウイルスを弱毒化する方法においては、マイナス鎖RNAウイルスにおけるエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子のうち少なくとも１つ以上の遺伝子が欠失または不活化している、あるいは欠失または不活化される工程をさらに含んでいることが好ましい。本発明における「欠失または不活化している、あるいは欠失または不活化される」遺伝子としては、F、HN、およびM蛋白質をコードする遺伝子のうちいずれか１つ、または２つ以上の組み合わせである遺伝子を挙げることができる。

本発明者らは、本発明のマイナス鎖RNAウイルスを弱毒化する方法を用いることにより、実際にY1214Fをもつセンダイウイルスベクターが、ベクター感染による細胞傷害性をほとんど認めず、有意に細胞傷害性を減少させることを見出した。また、Y1214F変異によって、有意にウイルスの抗原性が減少したにも関わらず、アデノウイルスと同等以上の外来遺伝子発現能を示し、外来遺伝子の発現量が十分に保たれていることを見出した。さらに、Y1214F変異によって、L蛋白質の活性を減少してSeV抗原量およびウイルスRNA量の減少を実現し、免疫反応を軽減させ得ることを見出した。即ち、本発明のマイナス鎖RNAウイルスを弱毒化する方法は、導入される細胞の細胞傷害性を低下させるため、外来遺伝子の発現の持続性を向上させるため、あるいは免疫反応を軽減させるために実施することができる。

本発明のマイナス鎖RNAウイルスを弱毒化する方法によって弱毒化されるマイナス鎖RNAウイルスとしては、好ましくはパラミクソウイルス科ウイルスを挙げることができ、より好ましくはセンダイウイルスを挙げることができる。

また本発明は、弱毒化マイナス鎖RNAウイルスの製造方法を提供する。具体的には、マイナス鎖RNAウイルスのL蛋白質をコードする遺伝子において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における1214番目に相当する位置のアミノ酸を置換する変異を導入する工程を含む、弱毒化マイナス鎖RNAウイルスの製造方法である。

上記本発明の弱毒化マイナス鎖RNAウイルスの製造方法におけるアミノ酸の置換は、上述の弱毒化マイナス鎖RNAウイルスあるいはマイナス鎖RNAウイルスを弱毒化する方法における場合と同じく、好ましくはチロシンからフェニルアラニンへの置換（点突然置換）である。

上記本発明の弱毒化マイナス鎖RNAウイルスの製造方法においては、マイナス鎖RNAウイルスにおけるエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子のうち少なくとも１つ以上の遺伝子が欠失または不活化している、あるいは欠失または不活化される工程をさらに含んでいることが好ましい。本発明における「欠失または不活化している、あるいは欠失または不活化される」遺伝子としては、F、HN、およびM蛋白質をコードする遺伝子のうちいずれか１つ、または２つ以上の組み合わせである遺伝子を挙げることができる。

本発明の弱毒化マイナス鎖RNAウイルスの製造方法におけるマイナス鎖RNAウイルスとしては、好ましくはパラミクソウイルス科ウイルスを挙げることができ、より好ましくはセンダイウイルスを挙げることができる。

なお、本明細書に引用された文献は、全て本明細書の一部として組み込まれる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。

材料および方法
［実施例１］遺伝子
1-1. センダイウイルス
センダイウイルスはＺ株 15 kbを使用し、各遺伝子の欠失、アミノ酸変異の挿入を行った。

1-2. レポーター遺伝子
EGFP 発光オワンクラゲ由来の塩基配列を改変した緑色蛍光蛋白質、720 b(Accession No.U57606)をセンダイウイルスゲノムへ搭載した。
LacZ βガラクトシダーゼ、3.1 kb（Accession No.U13184）をセンダイウイルスゲノムへ搭載した。

［実施例2］細胞培養
2-1. 細胞株
LLC-MK2 アカゲザル腎由来細胞株
CV-1 アフリカミドリザル腎由来細胞株
HEK 293 ヒト胎児由来腎細胞株
マウス骨髄由来間葉系細胞 C57BL/6マウス大腿より採取

2-2．細胞培養
サル腎由来細胞株であるLLC-MK2細胞（ATCC CCL-7）、CV-1（ATCC CCL-70）は、10% ウシ胎仔血清(fetal bovine serum; FBS, GIBCO-BRL，Cat.No.10099-141)、100μg/mlペニシリン／100 units/mlストレプトマイシン（Nakarai Tesque， Cat.No.26253-84）を含むMinimal essential medium (MEM) (Invitrogen-GIBCO，Cat.No.11095-080)培地に懸濁し、5% 二酸化炭素存在下、37℃で培養した。HEK 293細胞株 (ATCC CRL-1573)は、10% FBS, 100μg/mlペニシリン／100 units/mlストレプトマイシンを含むDulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen-GIBCO，Cat.No.11995-065)培地に懸濁し、同条件で培養した。マウス骨髄細胞は、C57BL/6マウス大腿より採取した。採取後、10% FBSを含むRPMI1640（Invitrogen-GIBCO，Cat.No.11875-093）培地に懸濁し、同条件で培養した。

［実施例3］ウイルス調製
3-1. センダイウイルスベクター調製
F遺伝子欠失型ベクター（SeV/ΔF）、M遺伝子欠失型ベクター（SeV/ΔM）はそれぞれ欠失させた遺伝子がコードする蛋白質を安定に供給するパッケージング細胞株LLC-MK2/F7（F蛋白質発現細胞）(Li, H. O., Zhu, Y. F., Asakawa, M., Kuma, H., Hirata, T., Ueda, Y., Lee, Y. S., Fukumura, M., Iida, A., Kato, A., et al. (2000), J Virol 74, p6564-6569.)、LLC-MK2/F7/M62（M蛋白質発現細胞）(Inoue, M., Tokusumi, Y., Ban, H., Kanaya, T., Shirakura, M., Tokusumi, T., Hirata, T., Nagai, Y., Iida, A., and Hasegawa, M. (2003), J Virol 77, p6419-6429.)を用いて回収した。

3-2. アデノウイルスベクター調製
Creリコンビナーゼを発現するアデノウイルスベクター（AxCANCre）(中野, 2003, P147)を用いて、それぞれの欠失した遺伝子がコードする蛋白質の誘導に使用した。LacZを発現する5型アデノウイルスベクター(AdenoCALacZ)はHEK 293細胞を用いて回収し、Adeno-X^TM Rapid Titer Kit（BD Bioscience, Cat.No.K1653-1）を用いてその力価を測定した。

［実施例4］変異SeV株の取得
4-1. SeV/ΔM-GFP持続感染細胞の樹立
6 wellプレートに飽和状態で準備しておいたLLC-MK2細胞（1 x 10⁶cells/well）にGFP遺伝子搭載M遺伝子欠失型SeVベクター（SeV/ΔM-GFP）をMOI 3で感染し37℃、無血清MEM培地で細胞を培養した。その2日後、2 x 10⁵ cellsを新しく準備しておいた血清を含むMEM培地へ継代した。継代は5回くり返した。5回目に継代した細胞がコンフルエント状態になった時点で、感染細胞は限界希釈法を用いて96 wellプレートへ1 cell/wellになるように播種した。播種2週間後、生存細胞は増殖し、コロニーを形成した。GFPポジティブ細胞クローンだけを選択し、SeV/ΔM-GFP持続感染細胞とした。

4-2. 持続感染細胞からのウイルス分離
SeV/ΔM-GFP持続感染細胞から以下の手順でウイルスを分離した。12 wellプレートへ拡大培養したSeV/ΔM-GFP持続感染細胞クローンが飽和状態になった時点で、その細胞と培養上清をエッペンドルフチューブに全て回収し、凍結融解を3回繰り返した。そこで細胞質内に含まれるRNPs（ribonucreoproteins）と初生ウイルスを得た。得られた初生ウイルスを再度、新たに準備しておいたM蛋白質誘導後のLLC-MK2/F7/M62へ感染させ、5日間トリプシンを含むMEM培地を加え32℃で培養し、培養上清中の子ウイルスベクターを回収した。回収した培養上清中の子ウイルスベクター粒子はHAアッセイ法により確認した。

4-2-1. HAアッセイ
子ウイルスを含む培養上清をラウンドボトム96 wellプレート（Iwaki, Cat.No.3870-096）上でPBSを用い段階希釈し、50μl/wellにした。ニワトリ赤血球はPBSで5回洗浄し、8 x 10⁷/mlになるよう調整した。段階希釈後のプレートへ50μlのニワトリ赤血球を加え、4℃で1時間放置し、その凝集反応をみた。

4-3. 分離ウイルスの選択
分離した子ウイルスベクターを、再度12 wellプレートに飽和状態で準備しておいたM蛋白質誘導後のLLC-MK2/F7/M62へ一定量感染し、5日間トリプシンを含むMEM培地を加え32℃および37℃で5日間培養し、培養上清を回収した。両温度から回収した培養上清のHAアッセイを行い、親株SeV/ΔM-GFPと同じ傾向を示すものを変異 - とし、差があるものを変異 + とした。
分離した子ウイルスベクターを、12 wellプレートに飽和状態で準備しておいたLLC-MK2細胞（5 x 10⁶cells/well）へ一定量感染し、32℃および37℃でトリプシンを含むMEM培地を加え32℃および37℃で5日間培養し、その細胞の形態変化を観察した。細胞傷害性、細胞融合が親株SeV/ΔM-GFP同様に観察された場合は変異 - とし、その形態変化が少ないものは程度に応じて変異±〜＋、全く観察されないものは変異 ++ とした。

4-3-1. フローサイトメトリー
変異++と判定したものに関して、LLC-MK2へ分離ウイルスをMOI 1で感染後、FACS Calibur^TMフローサイトメーター（Becton Dickinson）にてGFPの発現を測定した。ネガティブコンロールは、非感染細胞を使用した。

［実施例5］変異株同定
変異++、+、±と予想されたウイルスの変異有無特定は、ウイルスゲノムの塩基配列解読により判定した。回収したウイルスベクターからQIAamp viral RNA minikit（QIAGEN, Cat.No.52906）を用いRNA抽出を行った。RT（Reverse Transcription）PCRは、Superscript^TM RT-PCR system（Invitrogen, Cat.No.10928-042）とrandomヘキサマー、SeV特異的プライマーを用いて行った。その後、ABI PRISM^TM 377（Applied Biosystem Japan）で塩基配列解読を行った。変異 ++と予想されたクローンは全ウイルスゲノムを解読し、変異+、±と予想されたクローンは細胞融合に関与するF、HN遺伝子の解読を行った。

［実施例6］ EGFP搭載変異挿入型F遺伝子欠失型SeVプラスミドの構築
6-1. EGFP搭載2変異挿入型F遺伝子欠失型SeVプラスミド（pSeV/ΔF-GFP-1214-1602）の構築
L遺伝子内に確認された2変異（Y1214F、M1602L）をもつSeV/ΔM-GFP clone#37から以下の手順でEGFP搭載2変異挿入型F遺伝子欠失型SeVプラスミド（pSeV/ΔF-GFP-1214-1602）を構築した。SeV/ΔM-GFP clone#37からSeV RNAゲノムを抽出・精製後、Superscript^TM II（Invitrogen, Cat.No.18064-041）とrandomヘキサマーを用いてcDNAを合成した。合成したcDNAを鋳型として、以下のSeV特異的プライマーを用いて2変異を含むPCR断片の増幅を行った。
5’-ATCACTGCTAGATCTGTGCTGC-3’ (sense)（配列番号：３）
5’-GGACTCCTATACCTCTTGTCCT-3’ (anti sense)（配列番号：４）

増幅されたL遺伝子内部の2 kb断片にはSeVユニークサイトであるNhe I、Xho Iを含む。よって、このPCR断片を制限酵素Nhe I、Xho Iで消化し、pSeV/ΔF-GFPのL遺伝子内部同サイトへ挿入した。構築されたpSeV/ΔF-GFP-1214-1602は変異挿入部分の塩基配列確認を行った。

6-2. EGFP搭載1変異挿入型F遺伝子欠失型SeVプラスミド（pSeV/ΔF-GFP-1214、pSeV/ΔF-GFP-1602）の構築
L遺伝子内に確認された2変異（Y1214F、M1602L）をそれぞれにもつEGFP搭載F遺伝子欠失型SeVプラスミド(pSeV/ΔF-GFP-1214、pSeV/ΔF-GFP-1602)を以下の手順で構築した。まず、野生型SeV-L遺伝子を鋳型として、6-1.で使用したプライマーセットを用い、野生型L遺伝子の一部を増幅した。その後、増幅断片はpGEM-Tベクター（Promega, Cat.No.A1360）内に挿入し、SeV-Lの一部（2 kb）を持つpGEM-L（2 kb）を構築した。これを鋳型にして、以下のプライマーを用いPCRを行い、pGEM-L-1214、pGEM-L-1602を構築した。

Y1214F
5’-gctataagcctcccctTttttggatcagccactgatg-3’ (sense)（配列番号：５）
5’-catcagtggctgatccaaaaAaggggattcttatagc-3’ (anti sense)（配列番号：６）
M1602L
5’-cagatgtggccgacTtgaggaggtcctctttcttg- 3’ (sense)（配列番号：７）
5’-caagaaagaggacctcctcaAgtcggccacatctg- 3’ (anti sense)（配列番号：８）
構築されたpGEM-L-1214、pGEM-L-1602は塩基配列確認を行った。

次にpGEM-L-1214、pGEM-L-1602を制限酵素Nhe I、Xho Iで消化し得られた断片1.5 kbを、pSeV/ΔF-GFPの同じサイトへそれぞれ挿入した。構築されたpSeV/ΔF-GFP-1214、pSeV/ΔF-GFP-1602は変異挿入部分の塩基配列確認を行った。

6-3. LacZ遺伝子の挿入
SeVゲノムへ搭載した外来遺伝子発現量を定量するため、LacZ遺伝子をNP遺伝子の翻訳領域上流へ以下の手順で挿入した。pSeV¹⁸⁺LacZ /ΔMΔF(Inoue, M., Tokusumi, Y., Ban, H., Shirakura, M., Kanaya, T., Yoshizaki, M., Hironaka, T., Nagai, Y., Iida, A., and Hasegawa, M. (2004), J Gene Med 6, p1069-1081.)を制限酵素Not Iを用いて消化し、転写終結-介在-転写開始（transcription end-intervening-transcription start；EIS）エレメント付きLacZ遺伝子Not Iフラグメントを取り出し、そのフラグメントをNP遺伝子とスタートシグナルの間に存在するNot Iサイトヘ挿入することでpSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF、pSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214を構築した。

［実施例7］変異挿入型F遺伝子欠失型SeVベクターの作製
約1 x 10⁷ cells/10 cmディッシュで播種されたLLC-MK2細胞へEGFP遺伝子搭載変異挿入型F遺伝子欠失型SeVプラスミド（pSeV/ΔF-GFP-1214, pSeV/ΔF-GFP-1602, pSeV/ΔF-GFP-1214-1602）およびLacZ遺伝子搭載変異挿入型F遺伝子欠失型SeVプラスミド（pSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214, pSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214-1602）と各SeV遺伝子NP, P, F, HN, Lが搭載されたpCAGGSプラスミド（WO2005/71085）を同時にトランスフェクションした。LLC-MK2細胞は7.5μg/mlのトリプシンを含むMEM培地で24時間培養した。その後、AxCANCreをMOI 5で感染させF蛋白質を誘導させておいたLLC-MK2/F7を重層し培養した。重層48時間後、共培養した細胞をすべて回収し、凍結融解を3回Opti-MEM培地中で繰り返すことで細胞質内に含まれるRNPs（ribonucreoprotein）と初生ウイルスを得た。得られた初生ウイルスを再度、新たに準備しておいたF蛋白質誘導後のLLC-MK2/F7へ感染させ、5日から10日間トリプシンを含むMEM培地を加え32℃で培養した。F遺伝子欠失型SeVベクターへGFP遺伝子を搭載しているため、隣接する細胞へGFP発現が伝播する像が観察されると、ウイルスベクターは培養上清に放出されている。ウイルスベクターを含む培養上清を回収し、再度新たなパッケージング細胞へ感染させるという作業を繰り返し、増幅させた。本実験では、2回の増幅を繰り返し得られたウイルスベクターに最終濃度1%となるBSAを添加し-80℃にて保管したものを使用した。
回収したウイルスベクターの力価は、1 mlあたりのGFP発現細胞およびLacZ染色ポジティブ細胞の割合を算出し求めた。

［実施例8］細胞傷害性定量
約4 x 10⁴ cells/ウェル（96 wellプレート飽和状態）のCV-1細胞へ、SeV/ΔF-GFP、SeV/ΔF-GFP-1214、SeV/ΔF-GFP-1602、およびSeV/ΔF-GFP-1214-1602をMOI 0.1、0.3、1、3、10で6時間感染させ32℃および37℃、無血清MEM培地で細胞を培養した。その培養上清を感染3日目に回収し、上清中のLDH（lactase dehydrogenase）をCytotoxicity Detection Kit（Roche Cat. No. 1664793）を用いて測定した（Decker, T., and Lohmann-Matthes, M. L. (1988), J Immunol Methods 115, p61-69.）。

［実施例9］持続感染能評価
6 wellプレートに準備しておいたLLC-MK2細胞（5 x 10⁴cells/well）、CV-1細胞（1 x 10⁵cells/well）へSeV/ΔF-GFPおよびSeV/ΔF-GFP-1214をMOI 100で感染させ、37℃、10% FBSを含むMEM培地中で培養した。感染細胞は毎日回収し、GFPポジティブ生存細胞数をカウントした。
感染後5日目蛍光顕微鏡下で撮影を行い、2 x 10⁵ cellsの各ベクター感染LLC-MK2細胞を継代した。継代は5回繰り返し、5継代目細胞を同条件で蛍光顕微鏡下撮影した。

［実施例10］初代培養細胞での遺伝子発現能
C57BL/6マウス大腿より採取した骨髄由来間葉系細胞を1 x 10⁵ cells/wellでポリLリジンコート6 wellプレート（SUMILON, Cat.No.MS-0006L）に播種した。1週間の培養後、SeV/ΔF-GFPおよびSeV/ΔF-GFP-1214をMOI 100で24時間感染させ、50μM 2-メルカプトエタノール、100μM MEM NEAA（Non-Essencial Amino Acid solution; GIBCO, Cat.No.11140-050）、1 mM Sodium pyruvate（SIGMA, Cat.No.S8636）、2 mM L-Glutamine solution（GIBCO, Cat.No.25030-081）、10% FBSを含むRPMI1640培地中で培養した。感染後7日目、14日目のGFP発現を蛍光顕微鏡下で観察した。

［実施例11］リアルタイムPCRによる細胞質内SeV RNAの定量
11-1. 感染細胞の調製
12 wellプレートに飽和状態で準備しておいたLLC-MK2細胞（5 x 10⁶cells/well）へ、SeV/ΔF-GFP、SeV/ΔF-GFP-1214、SeV/ΔF-GFP-1602、およびSeV/ΔF-GFP-1214-1602をMOI 3で感染し、32℃および37℃、無血清MEM培地で細胞を培養した。感染後、2時間から32時間までその細胞を回収した。回収時に生存細胞数をカウントし、1 wellあたりの細胞数を算出した。LacZ遺伝子搭載変異挿入型F遺伝子欠失型SeVについても、同様の作業を行った。

11-2. 細胞質RNA調製
回収した感染細胞から細胞質RNAをGoughの方法(Gough, N. M. (1988), Anal Biochem 173, p93-95.)に従い調製した。100μlの可溶化バッファー（10 mM Tris-HCl, pH 7.5、150 mM NaCl、1.5 mM MgCl₂、0.65%(w/v) NP-40）に回収した細胞ペレットを懸濁、遠心することで細胞核を除去した。得られた細胞質液に抽出バッファー(10 mM Tris-HCl, pH 7.5、350 mM NaCl、10 mM EDTA、7 M Urea、1%(w/v) SDS)を等量加えた後、フェノール/クロロフォルム精製を行い、細胞蛋白質を除去した。細胞質RNAを含む水層を取り出し、3倍量のエタノールを用いてエタノール沈殿したペレットを風乾し、細胞質RNA 1μg/μlになるよう滅菌水に溶解した。
精製細胞質RNA 1μgに由来する細胞数＝
細胞質RNA調製に使用した細胞数 (cells)/全細胞質RNA量 (μg)
として計算した。

11-3. 精製細胞質RNAからのSeV cDNA合成
精製後の細胞質RNA 1μgを鋳型として、RT（Reverse Transcription）をSuperscript^TM II（Invitrogen, Cat.No.18064-041）とoligo dTプライマー（12-18）（SeV mRNA用プライマー）、randomヘキサマー（SeV全RNA用プライマー）、または以下のプライマーを用いてSeV cDNA合成を行った。合成後のSeV cDNAは20μlとした。
5’-caagagaaaaaacatgtatgg-3’ (SeVゲノム用プライマー)（配列番号：９）
5’-agagtttaagagatatgtagcc-3’ (SeVアンチゲノム用プライマー)（配列番号：１０）
合成SeV cDNA 20μlを作製するために使用した細胞数＝精製細胞質RNA 1μgの細胞数
とした。

11-4. 合成SeV cDNAを用いたRNA定量
合成された一定量の各SeV cDNAを鋳型として、リアルタイムPCRを以下のプライマーとQuantiTect^TM SYBR Green Kit（QIAGEN Cat.No.204143）、ABI PRISM^TM 7700（Applied Biosystem Japan）を用いて行った。反応量は50μlとした。

SeV-L遺伝子内
5’-cctccactaatctatctcatagg-3’ (sense) 配列番号：１１）
5’-ataacaatacttggctgaacgtg-3’ (anti sense)（配列番号：１２）
LacZ遺伝子内
5’-cggattggcctgaactgc-3’ (sense)（配列番号：１３）
5’-aacaggcggcagtaaggc- 3’ (anti sense)（配列番号：１４）

リアルタイムPCR 1チューブあたりに相当する細胞数＝
精製細胞質RNA 1μgの細胞数 × (リアルタイムPCRに使用したSeV cDNA (μl)/全SeV cDNA 20μl)
1細胞あたりに存在するSeV RNAコピー数＝
リアルタイムPCR検出値 (mean)/リアルタイムPCR 1チューブあたりに相当する細胞数
プラスミドpSeV¹⁸⁺LacZ/ΔFを検量線のためのスタンダードとした。

［実施例12］ LacZ蛋白質発現の検出および定量
12-1. LacZ染色
6 wellプレートに準備しておいた飽和状態のLLC-MK2細胞 (1 x 10⁶cells/well)へSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF, SeV⁸⁺LacZ/ΔF-1214をMOI 3で感染させ、32℃および37℃、無血清MEM培地で細胞を培養した。22時間後、感染細胞のLacZ染色を以下の手順で行った。感染細胞をPBSで洗浄し、固定液 (0.05% グルタアルデヒド、2% ホルムアミド)を用い4℃で10分固定した。その後、X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase)染色液 (1 mg/ml X-gal、5 mM K₃Fe(CN)₆、5 mM K₄Fe(CN)₆、2 mM MgCl₂)を用い37℃で12時間反応させた。

12-2. LacZ活性測定
LacZ染色時同様、感染後22時間の感染細胞を用意した。感染細胞を回収後、細胞数をカウントし1 wellあたりの細胞数を算出した。250 mM Tris-HCl, pH 8.0バッファーに細胞を懸濁後、ソニケーションにより細胞を破砕した。細胞蛋白質はBradford試薬 (BIOLAD, Cat.No.500-0006)を用い、OD 595 nmで蛋白質量を測定した。一定量の細胞蛋白質分画へsolution A (1 mM MgCl₂、45 mM 2-mercaptoethanol)と88μg o-nitrophenyl-β-D-galactosidaseを添加し、37℃で30分反応させた。反応は停止液(100 mM sodium phosphate pH 7.5、1 M Na₂Co₃)を反応液と等量加えて停止させ、OD 420 nmで測定した。検量線は既知の濃度を示すLacZ(Sigma, Cat.No.G4155)を段階希釈したものを使用した。

結果
［実施例13］ SeV変異株 (SeV/ΔM-GFP clone#37)の取得
細胞傷害性が減弱したSeV変異株を得るためには、持続感染細胞を樹立するのがひとつの手段である。そこで、SeV/ΔM-GFPベクターをLLC-MK2細胞に感染させる方法を用いて、持続感染細胞を選択した。持続感染細胞取得は、通常、野生型を用いて行われる。この場合、感染後に完全エンベロープを持つ子ウイルス、孫ウイルス粒子が培養上清中に放出され、細胞は再感染をくり返していく。しかし、遺伝子導入ベクターを想定した場合、初めに導入した細胞での目的遺伝子の持続的発現を目的とするために、感染後に放出された粒子を介した持続感染が成立する系では本来の目的に合致しているとは言い難い。一方、M遺伝子欠失型ベクター（SeV/ΔM）は、M遺伝子をゲノムから欠失しているため、感染後は粒子形成に必須であるM蛋白質が産生されず、培養上清中にウイルス粒子は放出されない。すなわち、子ウイルスによる再感染がない。細胞質内では、初回に感染が成立したSeV/ΔM-GFPベクター由来ゲノムが転写・複製をくり返し、細胞質に蓄積する。これらの蓄積にも影響されず、生存可能な細胞が得られれば、それは、細胞側にSeV耐性となる機構が備わった、もしくはSeV側に持続的な転写・複製に有利な何らかの変異が挿入されたと予想される。この現象のどちらかにより、SeVの持続感染が成立すると考えた。そこで、本実施例ではSeV/ΔMベクターを用いた。

SeV/ΔM-GFP感染6日後、感染細胞は細胞傷害性を示し90%以上の細胞が死滅した。残った細胞を培養し、5継代目にそれらのクローニングをおこなった。感染に使用したベクターにはGFPを搭載してあるため、GFP蛍光をクローニングマーカーとして、GFP蛍光ポジティブ細胞の場合はSeV感染ポジティブとし、74クローンの感染細胞クローンを取得した。74クローン中、その細胞からウイルスを分離できたのは60クローンだった。分離したウイルスを再度、M蛋白質発現パッケージング細胞 (M発現細胞LLC-MK2/M62)へ感染させ、32℃および37℃で培養後、子ウイルスベクター放出量の差を親株SeV/ΔM-GFPの場合と比較した。結果、60クローン中59クローンは親株SeV/ΔM-GFPと同様の傾向を示した。しかし、1クローン（clone#37）は全く別の性質を示し、37℃ではHAアッセイ検出限界以下の粒子数であったが、32℃では親株SeV/ΔM-GFPと同等の粒子数を確認した。

パッケージング細胞への感染と同時に、LLC-MK2細胞へ分離した60クローンを感染し、それらが示す細胞融合能を目視で観察した。しかしほとんどのクローンでは、その差は明瞭ではなく判断の指標とはならなかった。ベクター由来のGFP蛍光強度においても、両温度で親株SeV/ΔM-GFPとの差は観察されなかった。しかし、やはりここでも1クローン（clone#37）は全く別の性質を示し、37℃ではGFP蛍光強度が非常に弱く、32℃では親株SeV/ΔM-GFP同等の蛍光強度を示した (図1, 3)。また、SeV感染に感受性が強いとされるCV-1細胞への感染においても同様の傾向を示し、さらにはSeV感染による細胞傷害性が大幅に減弱されていた。(図2)。

以上の観察から、
1) 温度によりGFP発現パターンに差が観察される → clone#37は温度感受性に関与する変異を有している、
2) 親株と同量の感染であっても、細胞傷害性が観察されない → 細胞傷害性減弱に関与する変異を有している、
という推測ができる。

分離したウイルスのうち、変異 + と予想した59クローンについて、GFP蛍光強度は親株と同等であるにも関わらず5代までは継代可能だったことから、感染細胞表面に表出するF、HN蛋白質に変異が生じたと予想し、それらについてはF、HN遺伝子の塩基配列を確認した。一方、1クローン（clone#37）は全く別の性質を示すことから、ベクター駆動に必須であるNP、P、L蛋白質に変異挿入があったと予想された。そこで、clone#37についてはSeV全塩基配列の確認を行った。その結果、変異+と予想された59クローンのうち、15クローンでF、HN遺伝子内に17箇所の変異を確認した。17箇所変異の内、12箇所はアミノ酸変異を伴うものだった。clone#37では、F、HN遺伝子に変異は確認されなかったが、L遺伝子内に2箇所アミノ酸変異を伴う変異が挿入されていた(図4)。

HN遺伝子内で確認された126番目のアミノ酸変異は、3クローンで見つかった変異であるため、何らかの表現型変化があると推測しその解析を進めたが、ウイルス生産性、シアル酸への結合能、細胞傷害性、いずれも親株であるSeV/ΔM-GFPとの差が観察されなかった。

［実施例14］変異同定
14-1. 変異挿入型F遺伝子欠失型ベクターの回収
本試験で得られたSeV/ΔM-GFP clone#37が有するL遺伝子内の2変異Y1214F、M1602L、このどちらが表現型変化に関与しているのかを調べるために、それぞれの変異をF遺伝子欠失型SeVベクター (SeV/ΔF)へ挿入した。SeV/ΔFは、F遺伝子をゲノムから欠失させることで、非伝播型となり安全性を確保したベクターである。また、細胞傷害性も第一世代と呼ばれるSeVベクター（遺伝子欠失なし）に比べ減弱している。これらの理由から、SeV/ΔFをバックボーンにもつ研究が多く行われており、その有用性が示されている。本発明は、SeVベクターによる遺伝子導入後のさらなる細胞傷害性減弱、搭載遺伝子発現の延長を目的とした変異同定である。そこで、現在エンベロープ遺伝子欠失型SeVベクターの中で最も研究が進んでいるSeV/ΔFへ取得した2変異（Y1214F、M1602L)を挿入し、
1) さらなる細胞傷害性の減弱効果
2) 搭載遺伝子発現能の維持
を検証した。変異を挿入したSeV/ΔF-GFP-1214、SeV/ΔF-GFP-1602、双方の変異を挿入したSeV/ΔF-GFP-1214-1602を、F発現細胞 (LLC-MK2/F7)とプラスミドベースリバースジェネティック法を用いて作製した。全てのベクターにおいて1x10⁸ CIU/ml以上での回収が可能であった。

14-1. 細胞傷害性定量
CV-1細胞へMOI 0.1から10で各変異挿入型SeV/ΔF-GFP (SeV/ΔF-GFP-1214、SeV/ΔF-GFP-1602、双方の変異を挿入したSeV/ΔF-GFP-1214-1602)を感染し、32℃および37℃での細胞傷害性をSeV/ΔF-GFPと比較した（図5）。その結果、32℃ではSeV/ΔF-GFPとSeV/ΔF-GFP-1602は同等の傷害性を示した。また37℃においても、その傷害性は20%の低下にとどまった。一方、SeV/ΔF-GFP-1214、SeV/ΔF-GFP-1214-1602は両温度で細胞傷害性がSeV/ΔF-GFPと比較した場合に80%低下した。

MOI 30での感染において、SeV/ΔF-GFP、SeV/ΔF-GFP-1602では大半の細胞で剥離が観察されたが、SeV/ΔF-GFP-1214、SeV/ΔF-GFP-1214-1602では剥離は観察されず、感染3日目でもGFP観察が可能であった（図6）。なお、感染5日目でも同様にGFP観察が可能であった。
この結果から、細胞傷害性減弱に関与しているのはY1214F変異であることが示唆された。

14-2. 変異挿入型F遺伝子欠失型ベクターの生産性
パッケージング細胞LLC-MK2/F7にMOI 3で各変異挿入型SeV/ΔF-GFPを感染し、32℃および37℃におけるベクター生産能をSeV/ΔF-GFPと比較した（図7）。その結果、両温度でSeV/ΔF-GFPとSeV/ΔF-GFP-1602は同等の生産能をしめした。一方、SeV/ΔF-GFP-1214、SeV/ΔF-GFP-1214-1602は、32℃でその遅れがみられたが、3日目にはSeV/ΔF-GFPと同等となった。しかし、37℃での生産では、3日目までSeV/ΔF-GFPの1/10000の生産性であった。この結果から、温度感受性に関与しているのはY1214F変異であることが示唆された。

［実施例15］マウス骨髄由来間葉系細胞への遺伝子導入
LLC-MK2細胞、CV-1細胞ではSeV/ΔF-GFP-1214のGFP発現能が観察可能であった。そこで、初代培養したC57BL/6マウス骨髄由来間葉系細胞への感染を行い、細胞株で示された表現型を維持しているのかを検討した。その結果、これまで検討した細胞株と同様Y1214F変異をL遺伝子内に持つSeV/ΔF-GFP-1214は温度感受性を示し、32℃では変異のないSeV/ΔF-GFPと同等もしくはそれ以上の発現が確認された。また、これまでの結果同様SeV/ΔF-GFP-1214は細胞傷害性減弱効果をもつため、その感染細胞は感染後14日までGFP蛍光の観察が可能であった（図8,9）。

［実施例16］リアルタイムPCRによる細胞質内SeV RNAの検出
これまでの結果から、温度感受性、細胞傷害性減弱に起因する変異はY1214F単独によるものと判断できる。そこで、この表現型変化に関与する変異Y1214FをもつSeV/ΔF- GFP-1214と表現型変化は認められなかったが変異株として取得したclone#37内に同時に挿入されていたM1602LをもつSeV/ΔF-GFP-1602の細胞質内での転写・複製コピー数を変異のないSeV/ΔF-GFPと比較した（図10）。各SeVベクターをLLC-MK2細胞へMOI 3で感染し、その20時間後に細胞質に存在するSeV RNA量を測定した。SeVは-鎖のRNAをゲノムとしてもつ。よって、RNAからcDNAへ合成する際、プライマーを使い分けることにより-鎖RNA(SeVゲノム)、+ 鎖RNA(SeVアンチゲノム)、mRNAを区別できた。

結果、mRNA量はSeV/ΔF-GFPと比較した場合、SeV/ΔF-GFP-1214, SeV/ΔF-GFP-1602ともに減少がみられた。SeV/ΔF-GFP-1602では温度差によらず、30%減少していた。SeV/ΔF-GFP-1214ではSeV/ΔF-GFPと比較して、32℃では86%、37℃では98%の減少が確認された。

また、SeVアンチゲノム(+鎖RNA)量においても同様の傾向がみられた。特に37℃におけるSeV/ΔF-GFP-1214のゲノムコピー数とアンチゲノムコピー数は少なく、その値は1細胞あたり7コピーであった。MOI 3で感染したため、理論上は感染時には1細胞あたり3本のゲノムが細胞質に存在する。この理論数をもとに計算した場合、Y1214FをもつSeVベクターは感染後20時間において、1ないし2回の複製しか行われていないことになる。

SeV/ΔF-GFP-1602感染においては、細胞質に存在するmRNAコピー数、アンチゲノムコピー数の温度による量的変化はみられなかったが、ゲノムコピー数は37℃で減少傾向を示した。この結果から、M1602Lは、アンチゲノムからゲノムへの複製段階で、温度による複製阻害に作用する変異であると推測した。しかし、その阻害性はわずかで表現型変化には至らないと推測される。

これらの結果から、Y1214Fが細胞傷害性減弱、持続感染能といった表現型変化をもつようになったのは、感染後のmRNA合成量の減少とそれに伴いおこるゲノム複製量の減少であることが判明した。

［実施例17］持続感染能、発現能の安定性
細胞傷害性減弱効果があるY1214F変異を持つSeV/ΔF-GFP-1214および変異を持たないSeV/ΔF-GFPをLLC-MK2細胞、CV-1細胞へMOI 100で感染させ、SeV感染による宿主細胞増殖への影響を検証した(図11)。

SeV感染に対する感受性の強いCV-1細胞の場合、SeV/ΔF-GFPにより細胞は大きなダメージを受け、増殖することなく剥離し細胞死を示した。一方、SeV/ΔF-GFP-1214感染では、感染後3日目、4日目で細胞増殖は一時減速したが、その後5日目には非感染細胞と同程度の細胞数に回復した。

LLC-MK2細胞では、SeV/ΔF-GFP感染において、感染後2日目から増殖の遅れを確認し、3日目以降はその細胞数を保つ程度で増殖はみられなかった。しかし、SeV/ΔF-GFP-1214感染後は、非感染細胞と同速度で増殖し、GFP発現レベルも一定に保たれていた (図12)。そこで、SeV/ΔF-GFP-1214感染後のLLC-MK2細胞を5代まで継代し、そのGFP発現レベルの観察を行った。結果、感染後5日目また5継代後5日目のGFP発現レベルは同等であった(図13)。これらの結果から、Y1214F単独で持続感染能をもつことが判明した。

［実施例18］搭載遺伝子発現量
LacZ遺伝子をベクターへ搭載し、温度感受性、細胞傷害性減弱、持続感染能を担うY1214F変異を持つSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214、および変異を持たないSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF、またLacZ遺伝子搭載アデノウイルスベクター(AdenoCALacZ)を用いて搭載遺伝子発現量の動態定量と発現能の比較を行った(図14)。結果、32℃においてSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214のLacZ遺伝子発現は感染24時間以降に上昇し、感染32時間後にその値は、SeV¹⁸⁺LacZ/ΔFがもつLacZ遺伝子発現能の70%を示した。これをアデノウイルスベクターと比較した場合は10倍の値であった。37℃においてはアデノウイルスベクターとほぼ同等の発現能を有していた。

［実施例19］搭載遺伝子mRNA、Genomeの定量
LacZ遺伝子発現量定量と同時に、それらを感染させた細胞質に存在するLacZ遺伝子のmRNAコピー数、SeVゲノムコピー数をリアルタイムPCRで定量し、その動態をみた。
37℃において、SeV¹⁸⁺LacZ/ΔFと比較した場合、SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214感染細胞内のLacZ mRNA蓄積は有意に遅れた。SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF感染細胞内では、LacZ mRNAの蓄積が感染後10時間までは比例関数的であり、その後22時間までは指数関数的に増加する。この増加は、感染10時間以降、新たなゲノムが複製され、それらを鋳型としてmRNAの合成が行われると推測される。実際、野生型L遺伝子をもつSeVゲノムは感染後10時間から複製が行われていた。SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214の場合、感染10時間以降にようやくLacZ mRNAが蓄積しはじめるが、それは微量であった。感染22時間後、SeV¹⁸⁺LacZ/ΔFではLacZ mRNA蓄積がピークを迎えるにも関わらず、SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214では比例関数的にmRNA量を蓄積し続けた。SeV¹⁸⁺LacZ/ΔFでは22時間までに蓄積されたLacZ mRNAはその後減少するが、LacZ発現能は維持していた (図15)。

32℃においても、SeV¹⁸⁺LacZ/ΔFと比較した場合、SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214感染細胞内ではLacZ mRNAの蓄積が有意に遅れた。しかし、感染10時間後からLacZ mRNA、SeV Genomeの蓄積が観察され、感染32時間後でもピークに達することはなかった (図16)。

本発明者らは、例えばY1214FをもつSeV/ΔFベクターを細胞に感染させた場合、
1) 感染初期には転写の抑制が起こり、その後は転写抑制よりも複製速度が有意に低下（1/10に低下）していることを明らかとした。このLの転写活性・自立複製能の低下により、感染細胞は細胞傷害性を全く示さなくなった。搭載遺伝子の発現能は野生型LをもつSeV/ΔFベクターに比べて劣るが、アデノウイルスベクターの遺伝子発現能と同等またはそれ以上であり、長期間その発現は持続した。さらに、感染細胞を複数回継代しても、搭載遺伝子の発現は維持され、かつSeVゲノムの変異挿入部分である1214番目のフェニルアラニンは野生型のチロシンに戻らないことを確認した。つまりLの変異によって、搭載遺伝子の発現能を実用レベルで保ちながら、ウイルス成分をバランスよく低下することが可能である。
2) ワクチン投与部位の鼻腔で想定される32℃において、変異LをもつSeV/ΔFベクターは、変異のないLを有するSeV/ΔFと同様に複製することを示した。一方、37℃では、ほとんどウイルス粒子を産生しない温度感受性を示した。マウス骨髄由来間葉系細胞への感染では、32℃の培養条件において、野生型LをもつSeV/ΔFベクターよりも遺伝子発現が安定し、長期間持続した。

以上のことから、LのY1214F変異を遺伝子導入ベクターとして利用可能なSeV/ΔFベクターに応用すれば、細胞傷害性をほとんど示すことなく遺伝子を長期間安定に発現し、染色体とは独立に存在できるセンダイウイルスの利点を十分に生かした遺伝子発現系を開発できると考えられる。

また、近縁ウイルスのRdRpのアミノ酸配列の類似性は高く、SeVのLの1214番目のチロシンは各ウイルスのRNAポリメラーセで、進化上よく保存されていることが判明した。この事実は、Y1214Fの変異によるRNAポリメラーゼの活性を低下させるという表現型に普遍性を与えるものである。すなわち、センダイウイルスLにおけるY1214F変異は、他のウイルスあるいはウイルスベクターに導入すれば、それらが弱毒化することが期待できる。例えば、パラインフルエンザウイルスなどのワクチン開発にも応用できる普遍性・安定性がある。

加えて、L蛋白質はパラミクソウイルス間では非常によく保存されているため、Y1214Fをワクチン開発が進行しているヒト呼吸器系ウイルスなど他のウイルスの弱毒化にも応用することが期待される。

Claims

配列番号：１に記載のアミノ酸配列における1214番目に相当する位置のアミノ酸が野生型から置換されている変異L蛋白質をコードする遺伝子を有するマイナス鎖RNAウイルスであって、弱毒化しているマイナス鎖RNAウイルス。
弱毒化がゲノム複製活性および／または転写活性の低下である、請求項１に記載のマイナス鎖RNAウイルス。
置換が、チロシンからフェニルアラニンへの置換である、請求項１または２に記載のマイナス鎖RNAウイルス。
エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子のうち少なくとも１つ以上の遺伝子が欠失または不活化している、請求項１から３のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルス。
該欠失または不活化している遺伝子が、F、HN、およびM蛋白質をコードする遺伝子のうちいずれか１つ、または２つ以上の組み合わせである、請求項４に記載のマイナス鎖RNAウイルス。
マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルス科ウイルスである、請求項１から５のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルス。
パラミクソウイルス科ウイルスがセンダイウイルスである、請求項６に記載のマイナス鎖RNAウイルス。
請求項１から７のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルスからなるウイルスベクター。
外来遺伝子を発現可能に保持する、請求項８に記載のウイルスベクター。