KR20090114431A

KR20090114431A - 약독화 마이너스 가닥 ｒｎａ 바이러스

Info

Publication number: KR20090114431A
Application number: KR1020097018335A
Authority: KR
Inventors: 마리코 요시자키; 마코토 이노우에; 마모루 하세가와
Original assignee: 디나벡크 가부시키가이샤
Priority date: 2007-02-07
Filing date: 2008-02-07
Publication date: 2009-11-03
Also published as: US20100323428A1; CA2677659A1; JPWO2008096811A1; WO2008096811A1; CN101646768A; EP2123755A1

Abstract

본 발명은 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자 등은, 센다이 바이러스의 L 단백질의 아미노산서열에 있어서의 1214번째의 아미노산의 변이(Y1214F)가, 바이러스의 게놈 복제활성 및/또는 전사활성을 억제하는 것을 발견하였다. 또한 바이러스 게놈으로부터의 어느 특정 유전자를 결실시킴으로써, 종래에 비해 추가적으로 세포상해성이나 면역반응의 경감을 도모할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.

Description

약독화 마이너스 가닥 ＲＮＡ 바이러스{Attenuated minus-stranded RNA virus}

본 발명은 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 관한 것이다.

1994년에 리버스 제네틱스법(reverse genetics method)이 개발된 후, 마이너스 가닥 RNA 게놈을 갖는 바이러스의 cDNA를 토대로, 인 비트로(in vitro)에서 감염성 입자로서 바이러스 분자를 생성할 수 있게 되었다. 이 기술에 의해, 바이러스 cDNA를 임의로 개변하는 것이 가능해져, 현재는 몇개의 유전자 도입용 벡터로서 마이너스 가닥 비분절형 RNA 바이러스 벡터가 개발되어 있다(비특허문헌 1 참조).

바이러스 벡터를 인간으로 응용하는 경우, 약독화(attenuation)는 중요한 조건이다. 바이러스 약독화의 방법은 크게 나눠, 2가지다. 제1은 바이러스 게놈으로부터 유전자를 결실하는 방법이다. 예를 들면, 호흡기병 유아(乳兒) 환자의 병인 바이러스(causative virus)로서 인간·메타뉴모바이러스(HMPV), 호흡기 합포체 바이러스(RSV)가 있다. 2세 이하의 아동의 경우, 그 바이러스에 감염될 리스크가 매우 높고, 감염 후, 심각한 세기관지염이나 폐렴을 일으킨다(비특허문헌 2, 3 참조). 이 때문에, 소아용 백신의 개발이 필요하였다. 이에, HMPV의 경우에는 엔벨로프 유전자인 SH·G 유전자를 결실시킨 HMPV 벡터가 개발되었다(비특허문헌 4 참조). 또한, 구성 유전자가 유사한 RSV의 경우에도 마찬가지로 SH 유전자를 결실시킨 생백신이 개발되었다(비특허문헌 5 참조). 양쪽 모두 약독화되어, 백신 벡터 투여 후의 기관 상부, 하부에서는 감염성 입자의 증식이 억제되어 있었다. 또한, 이들 벡터의 목적은 바이러스 그 자체에 대한 면역유도이기 때문에, 백신 벡터 투여 후에는 그들에 대한 중화항체가 생산되어, 야생형 바이러스로부터의 보호작용이 확인되었다. 센다이 바이러스(SeV)의 경우는, F 유전자의 결실(비특허문헌 6 참조), M/F 유전자의 결실(비특허문헌 7), M/F/HN 유전자의 결실(비특허문헌 8 참조)에 관한 보고가 있다. 엔벨로프 관련 유전자 결실에 의해 비전파성이 된다는 장점이 있다. 또한, 인 비보(in vivo)에서 감염성 SeV 입자를 억제하여, 면역반응의 야기를 약하게 하는 효과가 있었다. 그러나, 유전자를 결실해도, 생산세포로부터 트랜스로 벡터 입자로 결실한 단백질은 공급되고 있다. 게놈 상에, 그 유전자가 있어 전사될 때보다도 대폭적인 분자수의 감소는 있지만, 세포상해성이나 면역반응의 경감을 도모하기에는 한계가 있는 방법이었다.

2번째 방법은 바이러스의 세포상해성을 경감하는 표현형을 갖는 돌연변이의 동정(同定)이다. 예를 들면, 파라인플루엔자 바이러스도 인간 호흡기질환을 일으키는 바이러스이나, 약독 백신의 개발을 목표로, 모든 바이러스 성분을 균형적으로 감소시키는 것을 목적으로 RNA 의존성 RNA 폴리머라아제(RdRp)의 활성을 저하시키는 점돌연변이(point mutation)의 해석이 매우 잘 진행되어 있다(비특허문헌 9~11 참조). 파라인플루엔자 바이러스 벡터도 앞서 기술한 RSV와 구성 유전자가 유사하기 때문에, 백신개발에는 「점변이는 근연(近緣) 바이러스로 이행할 수 있다」는 이점을 살린 개량형이 많이 보고되어 있다(비특허문헌 12, 13 참조).

RNA 바이러스는, 그 게놈이 1회 복제하는 동안의 염기치환율은 10^-5~10^-3의 높은 돌연변이율이다. 인 비트로의 배양세포계 등에서의 바이러스의 계대과정에서, 종종 약독 바이러스의 자연발생을 관찰할 수 있다. 예를 들면, human immunodeficiency virus(비특허문헌 14, 15 참조), hepatitis A virus(비특허문헌 16 참조), Japanese encephalitis virus(비특허문헌 17 참조)로, 이러한 약독화 바이러스를 동정하여 백신주로서의 응용이 제창되는 보고가 있다. 센다이 바이러스에 있어서도, 지금까지 다수의 지속 감염 바이러스주가 동정되어, 돌연변이된 부위의 결정, 및 그의 성상 해석이 행해져 왔다(비특허문헌 18~24 참조)(http://br.expasy.org/uniprot/P06447).

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비특허문헌 24 : Nishio, M., Nagata, A., Tsurudome, M., Ito, M., Kawano, M., Komada, H., and Ito, Y. (2004) Recombinant Sendai viruses with L1618V mutation in their L polymerase protein establish persistent infection, but not temperature sensitivity. Virology 329, p289-301.

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행하였다.

본 발명자 등은 가장 유효한 약독화 벡터의 개발로서, 바이러스의 특정 성분의 생산을 억제하여 비전파성으로 하는 유전자 결실의 방법에 더하여, L(Large; 라지) 단백질의 활성을 유의하게 저하시키는 돌연변이를 이용하는 것을 생각하였다.

이에 본 발명에서는, 인 비트로(in vitro)에서의 배양세포계를 사용하여, 지속 감염성을 지표로 센다이 바이러스(Sendai virus; SeV)의 전사·복제활성이 현저히 저하된 변이 SeV 바이러스주를 클로닝하여, 유의하게 세포상해성을 감소시킨 L 유전자의 변이에 대해서 구명(究明)하였다.

M(Matrix; 매트릭스) 유전자 결실 SeV 벡터(SeV/△M)는, 그 게놈으로부터 M 유전자를 제거하였기 때문에, 감염세포로부터의 VLP(Virus like particle; 2차 입자)의 방출이 거의 없다. 따라서 SeV/△M 벡터를 사용함으로써, 감염세포로부터 방출된 자벡터(daughter vector) 입자가 재감염되는 경우는 없다. 또한, 세포질 내에 SeV RNA가 축적되기 때문에, SeV측, 세포측은 그것을 회피하고자 하여 어떠한 변이가 삽입될 가능성이 높은 것으로 예상하였다. 이에, 이 벡터의 성질을 이용하여, LLC-MK2 세포로 EGFP(증강 녹색형광단백질) 유전자 탑재 SeV/△M 벡터(SeV/△M-GFP)를 MOI 3으로 감염시켜, 지속 감염되어 있는 74클론의 세포주를 취득하였다. 이 중 60클론에 대해서는 감염세포질로부터 자벡터가 회수 가능하여, 그들의 HA 활성을 친벡터(parental vector)(SeV/△M-GFP)와 비교하였다. 그 결과, 59클론은 친벡터와 동등한 HA 활성을 나타내었다. 그러나, 1클론(clone#37)은, 37℃ 배양에 있어서 HA 활성이 검출되지 않았다. 32℃ 배양에서는 친벡터와 거의 동등한 HA 활성을 나타내었다. 지금까지 동정된 약독 바이러스(attenuated virus)는 온도감수성의 보고가 많은 것으로부터, 이 클론도 온도감수성일 가능성이 있다. 이에, 이 clone#37에 대해서, 추가적으로 그의 성상 해석을 행한바, EGFP 유전자의 발현량은 감소하고 있었으나, 세포상해성도 현저히 감약(減弱)되어 있었다. 이 사실로부터, clone#37은 온도감수성과 동시에 전사·복제속도가 느려진 돌연변이주인 것이 시사되었다.

동정한 SeV/△M-GFP-clone#37의 게놈 전장을, 디데옥시뉴클레오티드를 사용한 생거법(Sanger method)의 변법으로 염기서열을 결정하였다. 센다이 바이러스의 각 유전자에 대해서 Z주의 NP, P, F, HN, L과 비교한바, L 유전자(6687염기, 2228아미노산)의 1214번째의 아미노산이 티로신에서 페닐알라닌으로, 1602번째의 아미노산이 메티오닌에서 류신으로 치환되어 있었다.

L 유전자는 RdRp로서 기능하는 다기능 효소를 코드하고 있다. L의 활성은, 캡 효소활성, 전사, 복제가 있고, SeV의 RNP와 결합한 상태에서 세포질에 국재한다. L은 6684 bp, 200 kDa의 거대 단백질로, 6개의 도메인이 보고되어 있다(Chandrika, R.et al. (1995) Virology 213, p352-363., Cortese, C. K.et al. (2000) Virology 277, p387-396., Feller, J. A.et al. (2000) Virology 269, p426-439., Horikami, S. M., and Moyer, S. A. (1995) Virology 211, p577-582., Smallwood, S.et al. (1999) Virology 262, p375-383., Smallwood, S.et al. (2002) Virology 304, p135-145., Smallwood, S. et al. (2002) Virology 304, p235-245.). 이 중 L 유전자의 1214번째의 아미노산의 변이(티로신에서 페닐알라닌:Y1214F)는 도메인 V에 위치하고 있다.

돌연변이의 종류는 (1) 점돌연변이(point mutation), (2) 역위(inversion), (3) 전좌(translocation)로 분류할 수 있다. 가장 많은 것은 점돌연변이로, 치환, 결실, 삽입이 있다. 결실, 삽입에서는 프레임 시프트가 일어나, 그 유전자 산물은 기능부전으로 귀결된다. 치환에 의해 아미노산이 교체되는 것을 미스센스 변이, 또한 치환의 경우에서도, 3번째의 코돈 변이로, 3종류의 종지 코돈(TAA, TAG, TGA) 중 어느 하나로 변이된 것을 넌센스 변이라고 한다. 변이되어 있던 것은, Y1214F, M1602L의 2잔기 뿐으로, 그 밖에 염기의 결실이나 추가의 점돌연변이는 검출되지 않았다.

Y1214F의 염기 치환 코돈은, 티로신(TaT)에서 페닐알라닌(TtT)으로 바뀌어 있었다. 일반적으로 transversion(피리미딘 염기가 푸린 염기 또는 그 반대의 치환을 일으키는 변화)은, transition(피리미딘 염기가 다른 피리미딘 염기로, 또는 푸린 염기가 다른 푸린 염기로 변화)보다도 일어나기 어렵다. 요시타케 등(Yoshitake, J. et al. (2004) J Virol 78, p8709-8719.)은, EGFP 유전자를 탑재한 센다이 바이러스(SeV-GFP)를 CV-1 세포로 감염하고, 계대 후의 돌연변이 출현율을 조사하였다. 그 결과, GFP 유전자 내의 돌연변이는, A에서 G의 transition은, 계대하고 있는 동안에 자연발생하고 있었다. 실제로, 본 발명에서 동정한 60클론 중 17클론의 표현형은 친벡터와 동등하였으나, F 또는 HN 유전자에 점돌연변이가 발견되고, 그 중 대부분이 코돈의 1번째 염기, 또는 2번째 염기의 A에서 G 또는 G에서 A로의 transition이었다.

한편, L 유전자 내에 Y1214F, M1602L의 2 변이를 갖는 clone#37이 나타내는 탑재 유전자의 발현량 감소, 세포상해성의 감약, 온도감수성이라는 표현형 변화는, 어느 변이에 기인하고 있는지를 명확하게 하기 위해, 비전파형 벡터로, 실제로 유전자치료·유전자 백신으로의 응용이 검토되고 있는 F 유전자 결실 SeV 벡터(SeV/△F)의 L 유전자에 부위 특이적 염기서열 변이법으로 각각의 변이를 도입한 SeV/△F-GFP-1214, SeV/△F-GFP-1602, 또한 양쪽을 동시 도입한 SeV/△F-GFP-1214-1602의 3종류의 SeV 벡터를 제작하였다. 최근의 지견(知見)으로부터 추찰하여, 동정한 돌연변이 중 M1602L의 기여가 큰 것을 예상하였다. 니시오 등(Nishio, M. et al. (2004) Virology 329, p289-301.)은, 센다이 바이러스의 변이로서 L 유전자 내의 1618번째의 아미노산인 류신을 발린으로 치환한 경우에 지속 감염이 성립되고, 세포상해성이 감약되는 것을 보고하고 있다. 그 1618번째의 점변이에 더하여, 1169번째의 아미노산이 트레오닌인 경우, 온도감수성을 나타내는 것을 보고하고 있다.

그러나, M1602L을 갖는 벡터(SeV/△F-GFP-1602)는, 야생형 L 유전자를 갖는 벡터와 다름 없는 세포상해성을 나타내고, mRNA의 전사량은 30% 감소한 것에 그쳤다. 게놈 복제활성에서는 온도간 차가 확인되었으나, 표현형 변화에는 이르지 못하였다. 이 결과로부터, 표현형 변화를 초래하기에 필요한 점변이는 Y1214F인 것이 시사되었다.

한편, Y1214F를 갖는 벡터(SeV/△F-GFP-1214, SeV/△F-GFP-1214-1602)는, 벡터 감염에 의한 세포상해성이 거의 확인되지 않고, 지속 감염성이 관찰되었다(도 12, 13). 이 사실은, 벡터 감염세포로부터 세포질 RNA를 정제하여, cDNA로 변환한 후에 측정한 실시간 PCR의 결과(도 10)로부터도 증명되었다. SeV/△F-GFP-1214 mRNA의 전사활성은, 32℃에서는 SeV/△F-GFP의 13%, 37℃에서는 1.5%까지 감소되어 있었다. 이로부터, 게놈 복제도 감염 후 20시간이 경과해도, 1세포당 7개의 게놈밖에 존재하지 않았다. 또한, 동정한 SeV/△M-GFP clone#37의 돌연변이는, 다른 결실형 센다이 바이러스 벡터(SeV/△F)에 도입해도 기능하여, 그 표현형은 Y1214F에 의한 것을 알 수 있었다.

유전학에 있어서의 돌연변이의 동정에서는 Y→F의 치환은 많다. 티로신과 페닐알라닌은 수산기만 다를뿐 구조적으로 유사하다. 시그날 전달의 분야에서는, 티로신 키나아제의 기질인 티로신을 페닐알라닌으로 치환하여 조사하는 방법이 있다(Yurchak, L. K. et al. (1996) J Biol Chem 271, p12549-12554.). 이 Y→F에 의해, 1214번째의 티로신 잔기의 수산기가 다른 아미노산 또는 펩티드와 상호작용할 가능성이 있다고 가정한다. 그 경우, 상호작용에 관여한 수산기가 페닐알라닌으로 치환되어 소실되면, 바이러스 RdRp의 3차구조에 영향을 주어, 결과적으로 L의 전사·복제를 행하는 폴리머라아제 활성이 감소된 것이 이유의 하나로서 생각된다. 온도감수성을 나타낸 것은, 32℃에서는 티로신의 수산기 없는 상태(=페닐알라닌)에서도 3차구조는 유지할 수 있기 때문인 것으로 추측하였다. 또한, 티로신 키나아제에 의한 L의 활성을 상승시키는 제어 메커니즘이 존재하는 경우는, Y→F에 의해 커다란 영향이 있는 것을 예상할 수 있으나, 그러한 보고는 지금까지 없다.

약독화 바이러스의 변이로서, McAuliffe 등(McAuliffe, J. M. et al. (2004) J Virol 78, p2029-2036.)은 리콤비넌트 인간 파라인플루엔자 1형(rHPIV 1)을 사용하여, L 유전자가 코드하는 아미노산에 있어서의 942번째의 티로신→히스티딘 변이의 세포계대에 있어서의 돌연변이 안정성을 해석하고 있다. 그 결과, 6계대 후, cAC에서 tAC로 원래의 염기로 용이하게 되돌아가는 것이 시사되었다. 이 보고로부터, HPIV나 RSV 바이러스의 약독화에 점변이를 사용하는 경우에는, 둘 이상의 염기 치환에 의한 미스센스 변이를 사용하는 것을 추천·장려하고 있다(Murphy, B. R., and Collins, P. L. (2002) J Clin Invest 100, p21-27.). 그러나, 본 발명에서 얻어진 Y1214F는 1 염기 치환임에도 불구하고, 그 변이는 12계대 후에서도 안정하였다.

RNA 의존성 RNA 폴리머라아제(RNA-dependent RNA polymerase; RdRp)는, 다기능 단백질이다. RdRp의 효소활성을 제어하는 인자로서, 바이러스의 증식을 제어하고 있다. Sue A. Moyer 등(Chandrika, R. et al. (1995) Virology 213, p352-363., Cortese, C. K. et al. (2000) Virology 277, p387-396., Feller, J. A. et al. (2000) Virology 269, p426-439., Horikami, S. M., and Moyer, S. A. (1995) Virology 211, p577-582., Smallwood, S. et al. (1999) Virology 262, p375-383., Smallwood, S. et al. (2002) Virology 304, p135-145., Smallwood, S. et al. (2002) Virology 304, p235-245.)은, L 단백질의 기능에 대해서 6개의 도메인의 구분을 제창하고 있다. 각 도메인의 특징, 및 지금까지 보고된 추측은, 도메인 I-소수성 잔기로 구성되어 있다(Smallwood, S. et al. (1999) Virology 262, p375-383.). 도메인 II-추정 상의 RNA 결합 모티브가 있다(Malur, A. G. et al. (2002) Gene Expr 10, p93-100., Schnell, M. J., and Conzelmann, K. K. (1995) Virology 214, p522-530.). 도메인 III-VQGDNQ라는 매우 잘 보존된 아미노산서열이 있어, RNA 폴리머라아제 활성부분, RNA 결합 모티브로 예측되고 있다. 도메인 VI-6개의 불변적인 프롤린 잔기를 갖는 동시에, RNIGDP라는 보존된 아미노산서열이 있다. 이 아미노산서열이 푸린 결합 도메인이다. 도메인 V-히스티딘과 시스테인 잔기가 보존되어 있고, 그들은 금속결합에 관여한다. 도메인 VI-푸린 염기 결합에 관여하고, 메틸화 효소활성을 가지고 있다(Ferron, F. et al. (2002) Trends Biochem Sci 27, p222-224.). 이 중 Y1214F는 도메인 V(1129aa-1378aa)에 위치하고 있다. 현재, 도메인 V의 기능은 불명확한(Cortese, C. K. et al. (2000) Virology 277, p387-396.) 점이 아직 많다. 이에, 지금까지 유전자은행(GenBank)에 등록되어 있는 정보를 토대로 레스피로바이러스(respirovirus), 모빌리바이러스(morbillivirus), 루불라바이러스(rubulavirus)의 RdRp의 염기서열, 아미노산서열을 비교·검토하였다(표 1).

GenBank Accession No.

YP_138518 SeV(Sendai virus), AAL89409 HPIV 1(Human parainfluenza virus 1), P12577 HPIV 3(Human parainfluenza virus 3), P12576 MeV(Measles virus), BAA12219 BPIV 3(Bovine parainfluenza virus 3), AAK54670 CDV(Canine distemper virus), NP_054714 MuV(Mumps virus), P11205 NDV(Newcastle disease virus), YP_138518 SV5(Simian parainfluenza virus 5)

표 1로부터, Y1214, M1602 중 어느 아미노산서열도, 10종류의 바이러스에서 잘 보존되어 있었다. 특히 Y1214에 있어서의 보존성이 높은 것을 알 수 있었다. 이들 정보로부터, Y1214를 페닐알라닌으로 변이하는 돌연변이의 표현형에는 보편성·일반성이 있는 것이 시사되었다. 즉, 센다이 바이러스의 L과 마찬가지로, 다른 바이러스의 RdRp에 Y1214F 또는 그에 대응하는 변이를 도입함으로써, 약독화, 또는 RdRp의 활성을 감소할 수 있는 가능성이 있는 것을 강하게 시사하고 있다.

임상적으로 중요한 인플루엔자나 파라인플루엔자의 경우에는, 약독화 바이러스를 이용하여, 생백신의 개발이 진행되고 있다. 센다이 바이러스의 Y1214F 변이 동정과 동일하게, RdRp의 활성을 저감하는 돌연변이의 보고가 있다(Skiadopoulos, M. H. et al. (1999) J Virol 73, p1374-1381., Haller, A. A. et al. (2001) Virology 288, p342-350., McAuliffe, J. M. et al. (2004) J Virol 78, p2029-2036.). 센다이 바이러스를 사용하여 금번 동정한 Y1214F 변이는, RdRp의 활성을 약 1/10로 억제하고, 또한 계대 수를 거듭하여도 안정하였다. 이 Y1214F를 파라인플루엔자 등 다른 백신개발용 바이러스에 도입하면, 효과적인 약독화를 기대할 수 있음이 추찰 가능하다.

탑재 유전자로서 LacZ 유전자를 사용하면, β-gal 염색과 함께 β-gal 발현 단백질량의 정량이 가능하다. 이에, LLC-MK2 세포로 SeV 벡터를 감염시켜, 시간 경과에 따른 SeV 벡터의 동태를 LacZ의 mRNA량과 LacZ 단백질량으로 측정하였다(도 14, 15, 16). 감염 후의 시간 경과를 감염 초기(0-10시간), 감염 중기(10-22시간), 감염 후기(22-32시간)로 나누었다. 야생형의 L 유전자를 갖는 SeV 벡터로서, LacZ 유전자를 탑재하는 F 유전자 결실형 벡터인 SeV¹⁸⁺LacZ/△F를 사용하였다.

37℃에 있어서의 센다이 바이러스의 야생형 L의 감염 초기의 mRNA 합성속도를 계산한바, 1.5 뉴클레오티드/초였다. 이 수치는, 구베이 등(Gubbay, O. et al. (2001) J Gen Virol 82, p2895-2903.)이 측정한 감염 초기의 L의 mRNA 신장속도 1.7 뉴클레오티드/초와 동일하였다. 감염 중기(10-22시간)에는 L의 전사활성이 급격히 상승하는 시기로, 그에 수반하여 LacZ 단백질의 세포질 내로의 축적이 일어나고 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 이 시기에 게놈의 복제가 개시되고 있었다. 도 15에 나타내는 바와 같이 세포상해성이 나타나기 시작하는 감염 후기(22-32시간)에는 mRNA의 감소가 보였다. 이는 SeV에 의한 강한 세포독성에 의해 세포가 용해된 것에 기인한다. 감염 초기(감염 후, 0-10시간)의 Y1214F 변이를 갖는 SeV¹⁸⁺LacZ/△F-1214에 있어서의 L의 전사신장속도는 0.3 뉴클레오티드/초로, SeV¹⁸⁺LacZ/△F의 1/5의 속도였다. 또한, 그 게놈의 복제개시는 감염 후 22시간 후였다. 복제에 의해 게놈 분자수가 증가하면, 전사합성되는 mRNA 분자수가 증가하여, 결과적으로 L, P의 전사인자의 분자수도 증가한다. 따라서, 이러한 상태에 있는 감염 중기에서는 LacZ mRNA 분자수는 직선적으로 증가하고 있었다.

탑재 유전자의 발현 레벨의 수준을 비교 검토하기 위해, 5형 아데노바이러스 벡터(Ad5)의 유전자 발현량을 대조로서 사용하였다. 그 결과, Y1214F-L의 활성은 아데노바이러스 벡터 유래 β-갈락토시다아제 발현량과 동등 이상이었다. 즉, 이 사실은 L의 돌연변이에 의해 유의하게 바이러스의 항원성이 감소했음에도 불구하고, 유전자치료에 있어서 중요한 인자인 탑재 유전자의 발현량은 충분히 유지되고 있는 것을 의미한다.

32℃에 있어서의 세포 내에 축적되는 LacZ mRNA의 정량결과에서는, LacZ mRNA의 축적은 감염 후 10시간에 검출할 수 있었다. SeV¹⁸⁺LacZ/△F-1214의 전사속도는, SeV¹⁸⁺LacZ/△F의 40%의 활성을 나타내었다. 그러나, Y1214F-L의 전사속도는 감염 후 22시간-32시간의 감염 후기에 있어서도, 그 축적속도의 직선성은 잘 유지되고 있었다. 이에 대해, 야생형의 L의 경우는 감염 후기에서의 mRNA의 축적은 37℃의 경우와 마찬가지로, 감소 경향이 있었다. 이 사실은 역시 세포상해성의 영향에 의한 것으로 생각되었다. 탑재 유전자의 발현량은 감염 초기에서는 거의 검출 불가능하였으나, 감염 중기가 되자 세포 내에 축적이 관찰되었다. 또한 감염 후기에는, LacZ mRNA, 단백질량은 야생형 L을 갖는 벡터의 80%까지 되었다. 이는, 32℃에서도 세포상해성이 억제되어, 세포의 용해가 일어나고 있지 않은 것에 의한 것으로 생각되었다. LacZ 염색에 있어서도, 변이의 허용온도 32℃에 있어서의 LacZ 단백질의 발현은 야생형 L을 갖는 벡터와 손색 없을 정도인 것을 알 수 있었다(도 16). 전체 엔벨로프 유전자 결실형 센다이 바이러스 벡터에 의한 유전자 도입에서는, 세포상해성 및 강한 면역야기반응에 의해, 인 비보에 있어서의 탑재 유전자의 발현기간은 수일로, 그 후, 그 발현은 신속하게 소실되었다(Yoshizaki, M., Hironaka, T., Iwasaki, H., Ban, H., Tokusumi, Y., Iida, A., Nagai, Y., Hasegawa, M., and Inoue, M. (2006) Naked Sendai virus vector lacking all of the envelope-related genes: reduced cytopathogenicity and immunogenicity. J Gene Med 8, p1151-1159.). 이 사실은 게놈으로부터의 유전자 결실에 의한 개량에는 한계가 있는 것을 나타내고 있다. 유전자 결실에 의한 SeV 개량은 어느 정도의 효과는 기대할 수 있다. 또한, L의 활성 제어와 유전자의 결실을 조합한 약독화(Attenuation)가 유망하다. 인 비보에 있어서도, 센다이 바이러스의 강한 독성이 감약되어, 탑재 유전자의 발현, 면역반응으로부터의 회피에 있어서 현저한 우위성을 발휘하는 것을 기대할 수 있다.

LacZ의 단백질은 재조합형 β-갈락토시다아제를 사용하였다. 대조의 β-갈락토시다아제의 분자수는, 분자량과 질량으로부터 산출하고, 이 검량선으로부터 SeV 벡터, 및 Ad5 벡터에 의한 LacZ 유전자의 발현량을 LacZ 단백질량으로부터 측정하였다. 세포당 LacZ량은, 야생형 L-SeV 벡터(SeV¹⁸⁺LacZ/△F)에서 6 pg/세포, Y1214F 변이를 갖는 L-SeV 벡터(SeV¹⁸⁺LacZ/△F-1214)에서는 1.5~4 pg/세포였다. Ad 벡터에서는 0.3 pg/세포의 발현량이었다. 예를 들면, 다중클론항체 또는 단일클론항체를 제작할 때의 마우스로의 면역을 모델계로서 생각해본다. 마우스에서는, 다중클론항체 또는 단일클론항체를 제작할 때의 필요 항원량은 5~50 ㎍이다(Harlow, E., 1998, Antibodies, chapter6, p152). SeV¹⁸⁺LacZ/△F-1214의 항원 발현량은 1.5~4 pg/세포인 것으로부터, 3×10⁶개의 세포에 유전자 도입 가능하다면, 필요량의 항원을 면역 마우스 체내에 공급할 수 있는 계산이 된다. 또한, 변성된 항원을 포함하는 재조합 정제 항원과는 달리, SeV는 세포 내에서 본래의 단백질의 고차구조로 생산된 항원으로 면역할 수 있다. 또한, 치료 유전자 산물을 공급하는 경우에도, 본래의 고차구조를 갖는 단백질을 효율적으로 생산시킬 수 있다. 이 숫자는 인간으로의 적용에 있어서, 벡터 발현능의 목표값을 설정하기 위한 기준으로도 된다. L의 활성을 저하시키는 점돌연변이, Y1214F의 도입은, 적어도 마우스를 사용한 백신 등의 응용을 고려한 전(前)임상시험에 있어서 유망한 것을 시사하고 있다.

센다이 바이러스 벡터는 높은 유전자 발현능을 갖는 것이 특징이다(Tokusumi, T. et al. (2002) Virus Res 86, p33-38.). 따라서, 약독화 바이러스(Attenuated virus) 벡터의 개발에서는, 바이러스 게놈의 개변에 의해, 세포상해성이 감약되는 동시에 탑재 유전자 발현량이 감소되어 버릴 우려가 있다. 실용성을 생각하면, 최저한의 유전자 발현량을 유지하면서, 최대한으로 SeV 항원량을 감소시키는 것, 세포의 자연면역반응의 대상이 되는 바이러스 RNA량을 감소시키는 것이 필요하다. 이 점을 고려하면, Y1214F는 RdRp의 활성을 저하시키나, 아데노바이러스와 동등 이상의 탑재 유전자 발현을 나타내는 동시에, L의 활성을 감소시켜 SeV 항원량 및 바이러스 RNA량의 감소를 실현하였다. 유전자치료, 백신개발 뿐 아니라, 기초연구에 있어서의 발현 벡터를 개발하는데 있어서도, SeV 벡터의 구조단백질 유전자의 결실(예를 들면, F 유전자 결실, M/F 유전자 결실, M/F/HN 유전자 결실)과 조합하여, L 유전자에 Y1214F 변이를 도입하는 것은 유효한 바이러스 벡터가 되는 것을 명확하게 하였다. 또한, RdRp의 아미노산서열에는 높은 유사성이 있어, 금번 성상 해석한 센다이 바이러스의 L에 있어서의 점돌연변이; Y1214F는, 파라인플루엔자 바이러스 등의 백신개발에도 이용할 수 있는 보편성·안정성이 있다.

즉 본 발명은 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 관한 것으로, 상세하게는

[1] 서열번호:1(SeV 야생형 L 단백질)에 기재된 아미노산서열에 있어서의 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산이 야생형으로부터 치환되어 있는 변이 L 단백질을 코드하는 유전자를 갖는 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서, 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스,

[2] 약독화가 게놈 복제활성 및/또는 전사활성의 저하인, [1]에 기재된 마이너스 가닥 RNA 바이러스,

[3] 치환이 티로신에서 페닐알라닌으로의 치환인, [1] 또는 [2]에 기재된 마이너스 가닥 RNA 바이러스,

[4] 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자 중 적어도 하나 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화(inactivation)되어 있는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 마이너스 가닥 RNA 바이러스,

[5] 상기 결실 또는 불활성화되어 있는 유전자가, F, HN, 및 M 단백질을 코드하는 유전자 중 어느 하나, 또는 둘 이상의 조합인, [4]에 기재된 마이너스 가닥 RNA 바이러스,

[6] 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 마이너스 가닥 RNA 바이러스,

[7] 파라믹소바이러스과 바이러스가 센다이 바이러스인, [6]에 기재된 마이너스 가닥 RNA 바이러스,

[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 마이너스 가닥 RNA 바이러스로 되는 바이러스 벡터,

[9] 외래 유전자를 발현 가능하게 보유하는, [8]에 기재된 바이러스 벡터,

[10] 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코드하는 유전자에 있어서, 서열번호:1에 기재된 아미노산서열에 있어서의 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산을 치환하는 변이를 도입함으로써, 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 약독화하는 방법,

[11] 약독화가 게놈 복제활성 및/또는 전사활성의 저하인, [10]에 기재된 방법,

[12] 도입되는 세포의 세포상해성을 저하시키기 위해 실시하는, [10] 또는 [11]에 기재된 방법,

[13] 외래 유전자의 발현의 지속성을 향상시키기 위해 실시하는, [10] 또는 [11]에 기재된 방법,

[14] 면역반응을 경감시키기 위해 실시하는, [10] 또는 [11]에 기재된 방법,

[15] 치환이 티로신에서 페닐알라닌으로의 치환인, [10] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[16] 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 있어서의 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자 중 적어도 하나 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있거나, 또는 결실 또는 불활성화되는 공정을 추가적으로 포함하는, [10] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[17] 상기 결실 또는 불활성화되어 있거나, 또는 결실 또는 불활성화되는 유전자가, F, HN, 및 M 단백질을 코드하는 유전자 중 어느 하나, 또는 둘 이상의 조합인, [16]에 기재된 방법,

[18] 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인, [10] 내지 [17] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[19] 파라믹소바이러스과 바이러스가 센다이 바이러스인, [18]에 기재된 방법,

에 관한 것이다.

더욱이 본 발명은,

[20] 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코드하는 유전자에 있어서, 서열번호:1에 기재된 아미노산서열에 있어서의 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산을 치환하는 변이를 도입하는 공정을 포함하는, 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 제조방법,

[21] 약독화가 게놈 복제활성 및/또는 전사활성의 저하인, [20]에 기재된 제조방법,

[22] 치환이 티로신에서 페닐알라닌으로의 치환인, [20] 또는 [21]에 기재된 제조방법,

[23] 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 있어서의 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자 중 적어도 하나 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있거나, 또는 결실 또는 불활성화되는 공정을 추가적으로 포함하는, [20] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 제조방법,

[24] 상기 결실 또는 불활성화되어 있거나, 또는 결실 또는 불활성화되는 유전자가, F, HN, 및 M 단백질을 코드하는 유전자 중 어느 하나, 또는 둘 이상의 조합인, [23]에 기재된 제조방법,

[25] 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인, [20] 내지 [24] 중 어느 하나에 기재된 제조방법,

[26] 파라믹소바이러스과 바이러스가 센다이 바이러스인, [25]에 기재된 제조방법,

에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 SeV/△M-GFP 벡터 감염 후의 LLC-MK2 세포에 있어서의 GFP 발현을 나타내는 사진이다(MOI 3).

도 2는 SeV/△M-GFP 벡터 감염 후의 CV-1 세포에 있어서의 GFP 발현을 나타내는 사진이다(MOI 3).

도 3은 SeV/△M-GFP 벡터 감염 후의 LLC-MK2 세포에 있어서의 GFP 발현강도를 나타내는 도면이다(MOI 1).

도 4는 SeV/△M-GFP 벡터 지속 감염 세포가 가지고 있던 변이 삽입부분을 나타내는 도면이다.

도 5는 SeV/△F-GFP, SeV/△F-GFP-1602, SeV/△F-GFP-1214, 또는 SeV/△F-GFP-1214-1602 벡터 감염 후의 CV-1 세포에 있어서의 세포상해성을 나타내는 도면이다.

도 6은 SeV/△F-GFP, SeV/△F-GFP-1602, SeV/△F-GFP-1214, 또는 SeV/△F-GFP-1214-1602 벡터 감염 후의 CV-1 세포에 있어서의 세포형태를 나타내는 사진이다.

도 7은 SeV/△F-GFP, SeV/△F-GFP-1602, SeV/△F-GFP-1214, 또는 SeV/△F-GFP-1214-1602 벡터 감염 후의 LLC-MK2/F7 세포에 있어서의 벡터 생산능을 나타내는 도면이다.

도 8은 SeV/△F-GFP, 또는 SeV/△F-GFP-1214 벡터 감염 후의 C57BL/6 마우스 골수 유래 간엽계 세포에 있어서의 GFP 발현을 나타내는 사진이다(감염 후 7일째, MOI 100).

도 9는 SeV/△F-GFP, 또는 SeV/△F-GFP-1214 벡터 감염 후의 C57BL/6 마우스 골수 유래 간엽계 세포에 있어서의 GFP 발현을 나타내는 사진이다(감염 후 14일째, MOI 100).

도 10은 SeV/△F-GFP(Y1214F), SeV/△F-GFP(M1602), 및 SeV/△F-GFP 벡터 감염 후의 LLC-MK2 세포에 있어서의 게놈 RNA, 안티게놈 RNA, 및 mRNA 발현량을 나타내는 도면이다.

도 11은 SeV/△F-GFP, 또는 SeV/△F-GFP-1214 벡터 감염 후의 CV-1 세포에 있어서의 세포증식속도를 나타내는 도면이다.

도 12는 SeV/△F-GFP, 또는 SeV/△F-GFP-1214 벡터 감염 후의 LLC-MK2 세포에 있어서의 세포증식속도를 나타내는 도면이다.

도 13은 SeV/△F-GFP-1214 벡터 감염 후 5계대 후의 LLC-MK2 세포에 있어서의 GFP 발현레벨을 나타내는 사진이다.

도 14는 SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF, SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214, 또는 Adeno-LacZ 벡터 감염 후의 LLC-MK2 세포에 있어서의 탑재 유전자(LacZ)의 발현동태를 나타내는 도면이다.

도 15(A)는 SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF, 또는 SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214 벡터 감염 후의 LLC-MK2 세포에 있어서의 LacZ mRNA 카피 수, 및 SeV 게놈 카피 수를 나타내는 도면이다(37℃ 배양). 감염 후 0-10시간에 있어서의 mRNA 카피 수에 대해서, 보다 상세하게 나타내기 위해 확대한 그래프를, 도면 왼쪽 하단에 나타낸다. 도 15(B)는 벡터 감염 후의 LLC-MK2 세포에 있어서의 LacZ 염색을 나타내는 사진이다(37℃ 배양).

도 16(A)는 SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF, 또는 SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214 벡터 감염 후의 LLC-MK2 세포에 있어서의 LacZ mRNA 카피 수, 및 SeV 게놈 카피 수를 나타내는 도면이다(32℃ 배양). 감염 후 0-10시간에 있어서의 mRNA 카피 수에 대해서, 보다 상세하게 나타내기 위해 확대한 그래프를, 도면 왼쪽 하단에 나타낸다. 도 15(B)는 벡터 감염 후의 LLC-MK2 세포에 있어서의 LacZ 염색을 나타내는 사진이다(32℃ 배양).

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 제공한다. 구체적으로는, 센다이 바이러스의 야생형 L 단백질의 아미노산서열에 있어서의 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산이 야생형으로부터 치환되어 있는 변이 L 단백질을 코드하는 유전자를 갖는 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서, 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 관한 것이다(이하, 본 발명에서는 「약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스」로 기재하는 경우가 있다).

본 발명자 등은, 센다이 바이러스의 야생형 L 단백질의 아미노산서열에 있어서의 1214번째의 아미노산이, 야생형과 비교하여 치환되어 있는 경우에, 센다이 바이러스가 약독화되는 것을 처음 발견하였다. 예를 들면, 본 실시예에 있어서 나타내어지는 바와 같이, Y1214F를 갖는 센다이 바이러스(SeV/△F-GFP-1214) mRNA의 전사활성은, 아미노산 치환이 없는 센다이 바이러스와 비교하여 감소가 확인되고, 게놈 복제도 감염 후 20시간이 경과해도 1세포당 7개의 게놈밖에 존재하지 않는 것이 확인되었다. 게놈 복제의 저하에 의해 게놈 분자수가 저하되면, 전사합성되는 mRNA의 분자수도 감소한다. 즉, 본 발명에 있어서 「약독화」란, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 복제활성 및/또는 전사활성이 저하되어 있는 것을 가리킨다.

센다이 바이러스의 야생형 L 단백질의 아미노산서열을 서열번호:1에, 또한 당해 아미노산서열을 코드하는 염기서열을 서열번호:2에 기재한다.

본 발명에 있어서 「상당하는 위치」란, L 단백질에 있어서의 상동한 위치를 말하고, 구체적으로는, 서열번호:1의 아미노산서열과 정렬시킨 경우에, 동일한 위치가 되는 아미노산서열의 위치를 말한다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질은 고도로 보존되어 있어, 서열번호:1의 1214번째에 상당하는 위치는, 각 아미노산서열을 공지의 수법으로 정렬시킴으로써 동정하는 것이 가능하다. 아미노산서열의 정렬은, 예를 들면 BLAST(Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990; Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993; Altschul SF, et al., J. Mol. Biol., 215: 403, 1990)나, CLUSTAL W(Thompson JD, et al., Nucleic Acids Res 22:4673-4680, 1994) 등을 이용함으로써 용이하게 행할 수 있다. 서열번호:1의 1214번째에 상당하는 위치에 대해서, GenBank에 있어서의 액세션번호와 함께 이하에 구체예를 나타낸다.

·YP_138518 SeV(센다이 바이러스)의 아미노산서열에 있어서의 1214번째

·AAL89409 HPIV 1(인간 파라인플루엔자 바이러스 1)의 아미노산서열에 있어서의 1214번째

·P12577 HPIV 3(인간 파라인플루엔자 바이러스 3)의 아미노산서열에 있어서의 1214번째

·P12576 MeV(밍크 장염 바이러스)의 아미노산서열에 있어서의 1212번째

·BAA12219 BPIV 3(소 파라인플루엔자 바이러스 3)의 아미노산서열에 있어서의 1214번째

·AAK54670 CDV(개 디스템퍼 바이러스)의 아미노산서열에 있어서의 1212번째

·NP_054714 MuV(유행성 이하선염 바이러스)의 아미노산서열에 있어서의 1222번째

·P11205 NDV(뉴캐슬병 바이러스)의 아미노산서열에 있어서의 1192번째

·YP_138518 SV5(원숭이 파라인플루엔자 바이러스 5)의 아미노산서열에 있어서의 1216번째

본 발명에 있어서의 「마이너스 가닥 RNA 바이러스」란, 마이너스 가닥(바이러스 단백질을 코드하는 센스 가닥에 대한 안티센스 가닥)의 RNA를 게놈으로서 포함하는 바이러스이다. 마이너스 가닥 RNA는 네거티브 가닥 RNA로도 불린다. 본 발명에 있어서 사용되는 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서는, 특히 단일 가닥 마이너스 가닥 RNA 바이러스(비분절형(non-segmented) 마이너스 가닥 RNA 바이러스라고도 한다)를 들 수 있다. 「단일 가닥 네거티브 가닥 RNA 바이러스」란, 단일 가닥 네거티브 가닥[즉 마이너스 가닥] RNA를 게놈에 갖는 바이러스를 말한다.

상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서는, 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, 및 Pneumovirus속 등을 포함한다), 라브도바이러스(Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, 및 Ephemerovirus속 등을 포함한다), 에볼라 출혈열 바이러스를 포함하는 필로바이러스(Filoviridae), 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae; Influenza virus A, B, C, 및 Thogoto-like viruses 등을 포함한다), 분야바이러스(Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, 및 Phlebovirus속 등을 포함한다), 아레나바이러스(Arenaviridae) 등의 과에 속하는 바이러스가 포함된다.

본 발명에 있어서 사용되는 마이너스 가닥 바이러스를 구체적으로 예를 들자면, 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 바이러스의 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 유행성 이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measles virus), RS 바이러스(Respiratory syncytial virus), 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(simian parainfluenza virus)(SV5), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 2, 3형(human parainfluenza virus 1, 2 and 3), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)의 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 라브도바이러스과(Rhabdoviridae)의 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 광견병 바이러스(Rabies virus), 필로바이러스과의 에볼라 출혈열 바이러스(Ebola virus) 등을 예시할 수 있다. DI 입자(J. Virol. 68, 8413-8417(1994)) 등의 불완전 바이러스나, 합성한 올리고뉴클레오티드 등도 사용할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서의 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서는, 바람직하게는 파라믹소바이러스과의 바이러스이고, 보다 바람직하게는 파라믹소바이러스아과(Paramyxovirinae)의 바이러스, 가장 바람직하게는 레스피로바이러스속(파라믹소바이러스속이라고도 한다)의 바이러스이다.

또한 본 발명에 있어서의 서열번호:1에 기재된 아미노산서열에 있어서의 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산의 치환은, 바람직하게는 티로신에서 페닐알라닌으로의 치환(점돌연변이)이다. 서열번호:1에 기재된 아미노산서열에 있어서의 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산이 티로신인 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서는, 예를 들면, 레스피로바이러스속에 속하는 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV), 소 파라인플루엔자 바이러스(BPIV), 모빌리바이러스속에 속하는 밍크 장염 바이러스(MeV), 개 디스템퍼 바이러스(CDV), 루불라바이러스속에 속하는 유행성 이하선염 바이러스(MuV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(SV5) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서는, 티로신에서 페닐알라닌으로의 아미노산의 치환이라면, 상기 아미노산을 코드하는 염기의 치환부위나 치환수에 대해서는 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 하나 이상의 transversion 변이(피리미딘 염기가 푸린 염기 또는 그 반대의 치환을 일으키는 변화)를 포함한다. 또한, 2 염기 이상의 변이를 포함하는 것도 바람직하다. 이 경우, 적어도 하나는 transversion 변이인 것이 바람직하다. 치환의 일태양으로서, 티로신(TaT)에서 페닐알라닌(TtT)이라는 염기의 치환을 예시할 수 있다. 또한, 상기 아미노산이 야생형으로부터 치환되어 있는 변이 L 단백질을 코드하는 유전자란, 다른 위치의 아미노산에도 변이를 갖는 것을 포함한다. 예를 들면, 1214번째에 상당하는 위치에 더하여, 1602번째에 상당하는 위치에 추가적으로 변이를 가지고 있어도 된다. 또한, 당해 변이 L 단백질을 코드하는 유전자를 갖는 마이너스 가닥 RNA 바이러스는, 다른 유전자에 변이 및/또는 결손이 있어도 되고, 또한, 다른 유전자가 부가되어 있어도 된다.

변이는 주지의 부위특이적 변이도입법에 의해 도입할 수 있고, 예를 들면, PCR법이나 카세트 변이법 등을 사용할 수 있다(Deng, W. P. & Nickoloff, J. A., Anal. Biochem. 200:81, 1992; Haught, C., et al., BioTechniques 16(1):47-48, 1994; Zhu, L. & Holtz, A., Methods Mol. Biol. 57:119-137, 1996; Zhu, L., Methods Mol. Biol. 57:13-29, 1995; GeneEditor^TM System, Altered Sites(R) II System, Promega Co. WI, USA; KOD-Plus-Mutagenesis Kit, Toyobo Co., Ltd. Osaka, Japan; Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit, Takara Bio Inc., Otsu, Japan). 예를 들면, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 cDNA를 조제하고, L 유전자를 서브클로닝한다. 얻어진 L 유전자에 대해, 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산을 코드하는 코돈에 변이를 도입함으로써, 서열번호:1에 기재된 아미노산서열에 있어서의 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산이 야생형으로부터 치환되어 있는 변이 L 단백질을 코드하는 핵산 및 이 핵산을 포함하는 벡터를 얻을 수 있다. 이 핵산을 발현시킴으로써, 서열번호:1에 기재된 아미노산서열에 있어서의 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산이 야생형으로부터 치환되어 있는 변이 L 단백질을 생산할 수 있다. 얻어진 변이 L 단백질을 코드하는 핵산을 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 cDNA의 L 유전자부분과 교환함으로써, L 단백질을 코드하는 유전자에 변이를 갖는 바이러스 게놈 cDNA가 얻어진다. 이것을 토대로 바이러스를 제조함으로써, 본 발명의 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 조제할 수 있다.

본 발명에 있어서의 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스에는, 천연의 바이러스에 있어서, L 유전자에만 상기 변이를 도입한 것이 포함된다. 병원성 바이러스의 L 유전자의 1214번째의 아미노산 코드영역에 변이를 도입함으로써, 바이러스를 약독화하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 있어서의 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스는, 엔벨로프를 구성하는 바이러스 단백질(엔벨로프 구성 단백질)을 코드하는 유전자 중, 적어도 하나 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있는 것도 바람직하다. 유전자치료 등에 있어서 사용하는 벡터를 제작하는 경우에는, 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자를 결손시킴으로써, 감염 입자를 복제하는 능력이 결여된 벡터를 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서의 「엔벨로프 구성 단백질」에는, 바이러스의 엔벨로프를 구성하는 스파이크 단백질 및 엔벨로프의 라이닝 단백질(lining protein)이 포함된다. 구체적으로는, 바이러스의 종류에 따라서도 상이하나, F(Fusion; 퓨전), H(Hemagglutinin; 헤마글루티닌), HA(동), HN(Hemagglutinin-Neuraminidase; 헤마글루티닌-뉴라미니다아제), G(Glycoprotein; 글리코프로테인), M(Matrix; 매트릭스), M1(Matrix 1; 매트릭스 1) 등의 단백질을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 엔벨로프 구성 단백질은, 상기 F, H, HN, G, M, M1 등의 단백질 뿐 아니라, 예를 들면 다른 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 있어서, 상기 엔벨로프 구성 단백질에 상당하는 단백질이라면, 설령 명칭이 상이하더라도 본 발명에 포함된다.

예를 들면 파라믹소바이러스에 있어서의 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자로서는, M(매트릭스), F(퓨전), 및 HN(헤마글루티닌-뉴라미니다아제) 유전자(또는 H(헤마글루티닌) 유전자)가 알려져 있다. 파라믹소바이러스아과에 속하는 각 바이러스에 있어서의 각 유전자는, 일반적으로 다음과 같이 표기된다.

레스피로바이러스속 M F HN

루불라바이러스속 M F HN

모빌리바이러스속 M F H

예를 들면 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)의 레스피로바이러스속(genus Respirovirus)(파라믹소바이러스속(genus Paramyxovirus)이라고도 한다)으로 분류되는 센다이 바이러스의 각 유전자의 염기서열의 데이터 베이스의 액세션 번호는, M 유전자에 대해서는 D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F 유전자에 대해서는 D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN 유전자에 대해서는 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131을 참조할 것.

또한, 기타 바이러스가 코드하는 바이러스 유전자를 예시하자면, M 유전자에 대해서는 CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; 및 SV5, M32248, F 유전자에 대해서는 CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; 및 SV5, AB021962, HN(H 또는 G) 유전자에 대해서는 CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; 및 SV-5, S76876, L 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV, AJ608288; HPIV-1, AF117818; HPIV-2, X57559; HPIV-3, AB012132; Mumps, AB040874; MV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV, Z30698; 및 SV-5, D13868을 예시할 수 있다.

단, 각 바이러스는 복수의 주(株)가 알려져 있어, 주의 차이에 의해 상기에 예시한 것 이외의 서열로 되는 유전자도 존재한다.

본 발명의 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스는, 상기 F, HN, 및 M 단백질을 코드하는 유전자 중 어느 하나, 또는 둘 이상 조합한 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있는 것이 바람직하다.

예를 들면 M 단백질을 코드하는 유전자가 결실 또는 불활성화된 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스는, 본 발명에 있어서의 약독화라는 특장에 더하여, 추가적으로 바이러스 감염 후의 입자 형성에 필수인 M 단백질이 생산되지 않기 때문에 바이러스 입자가 방출되지 않아, 결국 자바이러스(daughter virus)에 의한 재감염이 없어진다는 특장을 가질 수 있다.

또한 F 단백질을 코드하는 유전자가 결실 또는 불활성화된 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스는, 본 발명에 있어서의 약독화라는 특장에 더하여, 추가적으로 비전파형 바이러스가 되어, 안전성이 확보된 바이러스가 될 수 있다.

또한 HN 단백질을 코드하는 유전자가 결실 또는 불활성화된 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스는, 본 발명에 있어서의 약독화라는 특장에 더하여, 추가적으로 세포 표면의 당사슬을 시알산 잔기의 부분에서 절단하는 활성이 저해되기 때문에, 새롭게 제작된 바이러스 입자가 감염된 세포로부터 유리되지 않게 되는 특장을 가질 수 있다.

본 발명에 있어서는, F, HN, 및 M 단백질을 코드하는 유전자의 조합에 대해서는 특별히 제한되지 않는다.

또한 본 발명은 본 발명의 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스로 되는 벡터(이하, 「본 발명의 벡터」로 기재하는 경우가 있다)를 제공한다.

본 발명의 벡터는 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 유래하는 바이러스 게놈을 포함하고, 자기복제능을 결여하며, 숙주 내에 핵산분자를 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자이다. 즉, 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 이용한 운반담당을 말하고, 세포 또는 숙주에 핵산을 도입하기 위해 사용되는 담체를 가리키며, 벡터가 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 백본을 갖는 것을 가리킨다. 「약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 백본을 갖는」다는 것은, 상기 벡터를 구성하는 바이러스 입자에 포함되는 핵산분자가 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈을 토대로 하는 것을 말한다. 예를 들면, 바이러스 입자에 포함되는 핵산분자가 약독화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스 게놈 유래의 팩키징 시그날 서열을 갖는 벡터는, 본 발명의 벡터에 포함된다. 또한 본 발명의 벡터에는, 유전자 재조합 기술에 의해 구축된 바이러스 벡터도 포함된다. 바이러스 게놈을 코드하는 DNA와 팩키징 세포를 사용하여 구축한 바이러스 벡터는, 재조합 바이러스 벡터로서 본 발명의 벡터에 포함된다.

본 발명의 벡터로서는, 예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 센다이 바이러스인, 센다이 바이러스 벡터를 들 수 있다. 센다이 바이러스 벡터는, 높은 유전자 발현능을 갖는 것이 특징으로, 이 점에서 Y1214F는 RdRp의 활성을 저하시키나, 아데노바이러스와 동등 이상의 외래 유전자(본 발명에 있어서는 「탑재 유전자」라 기재하는 경우도 있다)의 발현을 나타내는 동시에, L 단백질의 활성을 감소시켜 센다이 바이러스의 항원량 및 바이러스 RNA량의 감소를 실현하였다. 유전자치료, 백신개발 뿐 아니라, 기초연구에 있어서의 발현 벡터를 개발하는데 있어서도, 센다이 바이러스 벡터의 구조단백질 유전자의 결실(예를 들면, F 유전자 결실, M/F 유전자 결실, M/F/HN 유전자 결실)과 조합하여, L 유전자에 Y1214F 변이를 도입하는 것은 유효한 바이러스 벡터가 되는 것을 명확히 하였다.

따라서 결실에 의한 센다이 바이러스 개량은 어느 정도의 효과는 기대할 수 있다. 또한, L의 활성 제어와 유전자의 결실을 조합한 약독화가 유망하다. 인 비보에 있어서도, 센다이 바이러스의 강한 독성이 감약되어, 외래 유전자의 발현, 면역반응으로부터의 회피에 있어서 현저한 우위성을 발휘하는 것을 기대할 수 있다.

또한 본 발명의 벡터는, 외래 유전자를 발현 가능하게 보유하고 있어도 된다. 본 발명의 벡터가 보유하는 외래 유전자로서는 특별히 제한은 없고, 표적세포 중에서 발현시키고자 하는 목적하는 유전자를 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 단백질을 코드하는 핵산이어도 되고, 또한, 예를 들면, 안티센스 또는 리보자임 등의 단백질을 코드하지 않는 핵산이어도 된다. 유전자는 천연 유래 또는 인위적으로 설계된 서열이어도 된다. 인공적인 단백질로서는, 예를 들면, 다른 단백질과의 융합단백질, 도미넌트 네거티브 단백질(수용체의 가용성 분자 또는 막결합형 도미넌트 네거티브 수용체를 포함한다), 결실형 세포 접착 분자 및 가용형 세포 표면 분자 등이어도 된다.

또한, 본 발명에 있어서의 외래 유전자로서는, 유전자의 도입효율이나 발현 안정성 등을 평가하기 위한 마커 유전자여도 된다. 마커 유전자로서는, 예를 들면, 녹색형광단백질(이하, GFP라고도 한다), 베타-갈락토시다아제, 루시페라아제 등을 코드하는 유전자를 들 수 있다.

또는, 본 발명의 외래 유전자로서는, 예를 들면, 유전자치료 등을 목적으로 하는 경우에는, 본 발명의 벡터에 대상이 되는 질환의 치료용 유전자를 삽입한다. 외래 유전자를 도입하는 경우는, 예를 들면, 센다이 바이러스 벡터에 있어서는, 전사개시(S)서열과 전사종결(E)소열 사이 등에, 게놈의 총 염기수가 6의 배수가 되도록 고려하여 서열을 삽입하는 것이 필요하다(Journal of Virology, Vol.67, No.8, 1993, p.4822-4830). 전후 유전자의 발현을 방해하지 않도록 하기 위해, 외래 유전자의 앞 또는 뒤에 적절히 E-I-S서열(전사개시서열-개재서열-전사종결서열) 또는 그의 부분을 삽입해도 된다. 삽입한 외래 유전자의 발현량은, 외래 유전자의 상류에 부가하는 전사개시서열의 종류에 따라 조절할 수 있다(WO01/18223). 또한, 유전자 삽입 위치, 또한 유전자 전후의 염기서열에 의해 조절할 수 있다. 예를 들면, 센다이 바이러스에 있어서는, 삽입 위치가 (-) 가닥 RNA의 3'말단에 가까울수록(야생형 바이러스 게놈 상의 유전자 배치에 있어서는, NP 유전자에 가까울수록), 삽입된 유전자의 발현량이 높다. 외래 유전자의 높은 발현을 얻기 위해서는, 외래 유전자를 네거티브 가닥 게놈에 있어서 상류영역(마이너스 가닥에 있어서는 3'측)에 삽입하는 것이 바람직하다. 반대로, 삽입 위치가 네거티브 가닥 RNA의 5'말단에 가까울수록(야생형 바이러스 게놈 상의 유전자 배치에 있어서는, L 유전자에 가까울수록), 삽입된 유전자의 발현량이 낮아진다. 외래 유전자의 발현을 낮게 억제하기 위해서는, 예를 들면 네거티브 가닥의 가장 5'측, 즉 야생형 바이러스 게놈에 있어서는 L 유전자의 하류(네거티브 가닥에 있어서는 L 유전자의 5'인접부위), 또는 L 유전자의 상류(네거티브 가닥에 있어서는 L 유전자의 3'인접부위)에 외래 유전자를 삽입한다. 외래 유전자를 용이하게 삽입할 수 있도록 하기 위해, 삽입부위에 클로닝 사이트를 설계할 수 있다. 클로닝 사이트는, 예를 들면 제한효소의 인식서열로 할 수 있다. 게놈을 코드하는 벡터 DNA 중의 당해 제한효소부위에 외래 유전자 단편을 삽입할 수 있다. 클로닝 사이트는, 복수의 제한효소 인식서열을 갖는, 소위 멀티클로닝 사이트로 해도 된다. 본 발명의 벡터는 이와 같이 다른 외래 유전자를 보유하고 있어도 된다.

재조합 마이너스 RNA 바이러스의 재구성은 공지의 방법을 이용해서 행하면 된다. 구체적으로는, (a) 포유동물세포에 있어서, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 구성하는 바이러스 단백질의 존재하, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA 또는 그의 상보가닥(안티게놈 RNA. 플러스 가닥)을 코드하는 DNA를 전사시키는 공정, (b) 생성된 마이너스 가닥 RNA 바이러스 또는 상기 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 회수하는 공정에 의해 제조할 수 있다. 상기의 RNP를 구성하는 바이러스 단백질(viral proteins)이란, 바이러스 게놈 RNA와 함께 RNP를 형성하고, 뉴클레오캡시드를 구성하는 단백질을 말한다. 이들은 게놈의 복제 및 유전자 발현에 필요한 단백질군으로, 전형적으로는, N(뉴클레오캡시드(또는 뉴클레오프로테인(NP)이라고도 한다)), P(포스포), 및 L(라지) 단백질이다. 바이러스종에 따라서는, 표기는 상이한 경우도 있으나, 대응하는 단백질군은 당업자에게는 알려져 있다(Anjeanette Robert et al., Virology 247:1-6 (1998)). 예를 들면, N은 NP로 표기되는 경우도 있다.

바이러스 재구성시에는, 상기와 같이, 마이너스 가닥 RNA 게놈(즉 바이러스 게놈과 동일한 안티센스 가닥)을 생성시켜도 되고, 플러스 가닥 RNA(안티게놈. 게놈 RNA의 상보 가닥)를 생성시켜도 되나, 바이러스의 재구성효율을 높이기 위해서는, 바람직하게는 플러스 가닥을 생성시킨다. 바이러스 게놈 RNA로서는, RNP의 재구성에 필요한 바이러스 단백질을 코드하고 있으면, 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자를 결실하고 있어도 감염세포에 있어서 게놈 RNA를 복제할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, N, P, 및 L 단백질을 코드하고 있으면, F, HN, M 등의 바이러스 단백질은 코드하지 않도록 구축한다. 이러한 결손형 바이러스는, 세포 내에서 게놈 RNA를 증폭할 수 있으나, 감염성 바이러스 입자를 방출하지 않기 때문에, 안전성이 높은 유전자 도입 벡터로서 유용하다(WO00/70055, WO00/70070, 및 WO03/025570; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)). 재조합 바이러스를 제조하는 경우는, 이들 엔벨로프 구성 단백질을, 바이러스 생산세포 내에서 별도 발현시켜, 입자 형성을 상보한다. 바이러스 단백질이나 RNA 게놈을 세포 내에서 발현시키기 위해서는, 적당한 프로모터의 하류에 상기 단백질 또는 게놈을 코드하는 DNA가 연결된 발현 벡터를, 숙주세포에 도입한다. 프로모터로서는, 예를 들면 CMV 프로모터나 CAG 프로모터 등이 사용된다(Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199, 일본국 특허공개 평3-168087).

RNA 말단은 천연의 바이러스 게놈과 마찬가지로 3'리더서열과 5'트레일러서열의 말단을 가능한 한 정확하게 반영시키는 것이 바람직하다. 이를 위해서는, 예를 들면 전사산물의 5'말단에 자기절단형 리보자임을 부가해두고, 리보자임에 의해 마이너스 가닥 RNA 바이러스 게놈의 말단을 정확하게 잘라낸다(Inoue, K. et al. J. Virol. Methods 107, 2003, 229-236). 또는, 전사산물의 5'말단을 정확하게 제어하기 위해, 전사개시부위에 박테리오파지의 RNA 폴리머라아제 인식서열을 이용하여, 상기 RNA 폴리머라아제를 세포 내에서 발현시켜 전사를 유도한다. 박테리오파지의 RNA 폴리머라아제로서는, 예를 들면 대장균 T3 파지 및 T7 파지, 및 살모넬라 SP6 파지 등이 사용된다(Krieg, P.A. and Melton, D.A. 1987, Methods Enzymol. 155: 397-15; Milligan, J.F. et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 8783-798; Pokrovskaya, I.D. and Gurevich, V.V., 1994, Anal. Biochem. 220: 420-23). 박테리오파지의 RNA 폴리머라아제는, 예를 들면 이를 발현하는 백시니아 바이러스(Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986))를 사용하여 공급할 수 있고, 또는 플라스미드 등의 발현 벡터로부터 공급하는 것도 가능하다. 전사산물의 3'말단을 제어하기 위해서는, 예를 들면 전사산물의 3'말단에 자기절단형 리보자임을 코드시켜두고, 이 리보자임에 의해 정확하게 3'말단이 잘려지게 하는 방법도 알려져 있다(Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 1997: 78; 2813-2820, Kato, A. et al., EMBO J. 1997,: 16; 578-587 및 Yu, D. et al., Genes Cells. 1997: 2; 457-466). 리보자임으로서는, 델타 간염 바이러스의 안티게놈 가닥(antigenomic strand) 유래의 자기개열 리보자임을 사용할 수 있다.

엔벨로프 구성 단백질의 유전자를 결실시킨 바이러스의 재구성에 있어서는, 결실시킨 엔벨로프 구성 단백질로 바이러스의 감염성을 상보해도 되나, 예를 들면, 결실시킨 단백질과는 별도의 엔벨로프 단백질로 슈도타입화하는 것도 가능하다. 이러한 엔벨로프 단백질로서는, 예를 들면 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV)의 G 단백질(VSV-G)(J. Virology 39: 519-528 (1981))을 사용할 수 있다(Hirata, T. et al., 2002, J. Virol. Methods, 104:125-133; Inoue, M. et al., 2003, J. Virol. 77:6419-6429; Inoue M. et al., J Gene Med. 2004;6:1069-1081). 또한, 바이러스의 엔벨로프 단백질 이외에도, 예를 들면, 특정 세포에 접착할 수 있는, 접착인자, 리간드, 수용체 등 유래의 폴리펩티드로 수식하거나, 또는, 그들을 세포 외 영역에 가져, 바이러스 엔벨로프 유래의 폴리펩티드를 세포 내 영역에 갖는 키메라 단백질 등을 사용하는 것이 가능하다. 이것에 의해, 특정 조직을 표적으로 하는 벡터를 제작하는 것도 가능하다. 게놈으로부터 결손시키는 유전자로서는, 예를 들면 F, HN, H, G 등의 스파이크 단백질 유전자, M 등의 엔벨로프 라이닝 단백질 유전자, 또는 그들의 임의의 조합을 들 수 있다. 스파이크 단백질 유전자의 결실은, 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 비전파성으로 하는데 유효하며, 또한, M 단백질 등의 엔벨로프 라이닝 단백질 유전자의 결실은, 감염세포로부터의 입자 형성을 불능으로 하는데 유효하다. 예를 들면, F 유전자 결실형 마이너스 가닥 RNA 바이러스(Li, H.-O. et al., J.Virol. 74, 6564-6569 (2000)), M 유전자 결실형 마이너스 가닥 RNA 바이러스(Inoue, M. et al., J.Virol. 77, 6419-6429 (2003)) 등은 적합하게 사용된다. 또한, F, HN(또는 H), 및 M 중 적어도 둘의 유전자의 임의의 조합을 결손하는 바이러스는, 보다 안전성이 보장된다. 예를 들면, M 및 F 유전자 양쪽 결실형 바이러스는, 높은 레벨의 감염성 및 유전자 발현능을 보유한채, 비전파성이며 또한 입자 형성이 결여된 바이러스가 된다. 이들 바이러스는 바이러스 벡터로서 사용하는 경우에 높은 안전성을 확보할 수 있기 때문에 특히 유용하다.

F 유전자 결실형 재조합 바이러스의 제조를 구체적으로 예시하자면, 예를 들면 F 유전자가 결손된 마이너스 가닥 RNA 바이러스 게놈 또는 그의 상보 가닥을 발현하는 플라스미드를, F 단백질을 발현하는 발현 벡터, 및 N, P, 및 L 단백질의 발현 벡터와 함께 숙주세포에 트랜스펙션한다. 또는, F 유전자가 염색체에 삽입된 숙주세포를 사용하면, 보다 효율적으로 바이러스를 제조할 수 있다(WO00/70070). 이 경우는, F 유전자를 유도 발현할 수 있도록, Cre/loxP나 FLP/FRT 등의 서열 특이적 재조합 효소와 그의 표적서열을 사용하여, 발현을 유도할 수 있도록 해두는 것이 바람직하다(WO00/70055 및 WO00/70070;Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820 참조). 구체적으로는, 예를 들면 Cre/loxP 유도형 발현 플라스미드 pCALNdlw(Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, p1115-1121) 등의 재조합 효소 표적서열을 갖는 벡터에 엔벨로프 단백질 유전자를 삽입한다. 발현의 유도는, 예를 들면 아데노바이러스 AxCANCre를 moi=3~5로 감염시켜서 행한다(Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T.et al., J. Virol 72,1115-1121 (1998)).

본 발명에 있어서 사용하는 마이너스 가닥 RNA 바이러스는, 액세서리 유전자가 결손된 것이어도 된다. 예를 들면 센다이 바이러스(SeV)의 액세서리 유전자 중 하나인 V 유전자를 녹아웃함으로써, 배양세포에 있어서의 유전자 발현 및 복제는 장애를 받지 않고, 마우스 등의 숙주에 대한 SeV의 병원성이 현저히 감약된다(Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71:7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16:578-587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179).

또한 마이너스 가닥 RNA 바이러스는, 감염의 지속성을 높이기 위해, 상기 L 유전자의 변이부위에 더하여, P 유전자 또는 L 유전자에 추가적으로 변이를 갖는 것을 사용해도 된다. 이러한 변이로서는, 구체적으로는, SeV P 단백질의 86번째의 Glu(E86)의 변이, SeV P 단백질의 511번째의 Leu(L511)의 다른 아미노산으로의 치환, 또는 다른 마이너스 가닥 RNA 바이러스 P 단백질의 상동부위의 치환을 들 수 있다. 구체적으로는, 86번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 511번째의 아미노산의 Phe로의 치환 등을 예시할 수 있다. 또한 L 단백질에 있어서는, SeV L 단백질의 1197번째의 Asn(N1197) 및/또는 1795번째의 Lys(K1795)의 다른 아미노산으로의 치환, 또는 다른 마이너스 가닥 RNA 바이러스 L 단백질의 상동부위의 치환을 들 수 있고, 구체적으로는, 1197번째의 아미노산의 Ser로의 치환, 1795번째의 아미노산의 Glu로의 치환 등을 예시할 수 있다. P 유전자 및 L 유전자의 변이는, 지속 감염성, 2차입자 방출의 억제, 또는 세포상해성의 억제 효과를 현저히 높이는 것을 기대할 수 있다.

보다 구체적인 재조합 바이러스의 재구성은, 예를 들면 이하의 문헌을 참조할 수 있다(WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570; WO2005/071092; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587; Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38, Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569). 이들 방법에 의해, 파라인플루엔자, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 우역 바이러스, 센다이 바이러스 등을 포함하는 마이너스 가닥 RNA 바이러스를, DNA로부터 재구성시킬 수 있다.

본 발명에 있어서 마이너스 가닥 RNA 바이러스에는, 감염성 바이러스 입자, 비감염성 바이러스 입자(바이러스 유사 입자; VLP라고도 한다) 및 바이러스의 코어(게놈 및 게놈 결합 바이러스 단백질을 포함하는 RNP 복합체)를 포함한다. 즉 본 발명의 마이너스 가닥 RNA 바이러스는, 마이너스 가닥 RNA 바이러스 유래의 게놈 RNA 및 이 RNA의 복제 및 탑재 유전자의 발현에 필요한 바이러스 단백질을 갖는 리보뉴클레오프로테인(RNP) 복합체를 포함하는 복합체를 말한다. 상기 RNP는, 예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA 또는 그의 상보 가닥(안티게놈 RNA)과, N, L, P 단백질을 포함하는 복합체이다. 바이러스 입자로부터 엔벨로프를 제거한 RNP(바이러스 코어)이더라도, 세포에 도입되면 세포 내에 있어서 바이러스 게놈 RNA를 복제할 수 있다(WO97/16538; WO00/70055). RNP 또는 VLP는, 예를 들면 트랜스펙션 시약 등과 함께 숙주에 투여하면 된다(WO00/70055; WO00/70070).

바이러스 생산에는 목적하는 포유동물세포 등을 사용할 수 있는데, 구체적으로는, 예를 들면, 원숭이 신장 유래의 LLC-MK2 세포(ATCC CCL-7) 및 CV-1 세포(예를 들면 ATCC CCL-70), 햄스터 신장 유래의 BHK 세포(예를 들면 ATCC CCL-10) 등의 배양세포, 인간 유래 세포 등을 들 수 있다. 또한, 대량으로 바이러스를 얻기 위해, 상기 숙주로부터 얻어진 바이러스를 발육 계란에 감염시켜, 바이러스를 증폭시킬 수 있다. 계란을 사용한 바이러스의 제조방법은 이미 개발되어 있다(나카니시 등 편, (1993), 「신경과학연구의 첨단기술 프로토콜 III, 분자신경세포생리학」, 고세이샤, 오사카, pp.153-172). 구체적으로는, 예를 들면, 수정란을 배양기에 넣고 9~12일간 37~38℃에서 배양하여, 배(embryo)를 성장시킨다. 바이러스를 요막강(allantoic cavity)으로 접종하고, 수일간(예를 들면 3일간) 알을 배양하여 바이러스를 증식시킨다. 배양기간 등의 조건은, 사용하는 재조합 센다이 바이러스에 따라 바뀔 수 있다. 그 후, 바이러스를 포함한 요액(allantoic fluid)을 회수한다. 요액으로부터의 센다이 바이러스의 분리·정제는 통상적인 방법에 따라 행할 수 있다(다시로 마비토, 「바이러스 실험 프로토콜」, 나가이, 이시하마 감수, 메디컬뷰사, pp.68-73, (1995)).

회수한 바이러스는 실질적으로 순수해지도록 정제할 수 있다. 정제방법은 여과(filtration), 원심분리, 흡착, 및 칼럼정제 등을 포함하는 공지의 정제·분리방법 또는 그의 임의의 조합에 의해 행할 수 있다. 「실질적으로 순수」란, 바이러스를 포함하는 용액 중에서 상기 바이러스의 성분이 주요한 비율을 차지하는 것을 말한다. 예를 들면 실질적으로 순수한 바이러스 조성물은, 용액 중에 포함되는 전체 단백질(단 캐리어나 안정제로서 첨가한 단백질은 제외) 중, 바이러스의 성분으로서 포함되는 단백질의 비율이 10%(중량/중량) 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상을 차지함으로써 확인할 수 있다. 예를 들면 파라믹소바이러스인 경우, 구체적인 정제방법으로서는, 셀룰로오스 황산 에스테르 또는 가교 폴리사카라이드 황산 에스테르르 사용하는 방법(일본국 특허공고 소62-30752호 공보, 일본국 특허공고 소62-33879호 공보, 및 일본국 특허공고 소62-30753호 공보), 및 푸코오스 황산 함유 다당 및/또는 그의 분해물에 흡착시키는 방법(WO97/32010) 등을 예시할 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다.

본 발명의 마이너스 가닥 RNA 바이러스는 목적에 따른 조성물로서 조제할 수 있다. 상기 바이러스를 포함하는 조성물의 제조에 있어서는, 바이러스는 필요에 따라 약리학적으로 허용되는 목적하는 담체 또는 매체와 조합시킬 수 있다. 「약학적으로 허용되는 담체 또는 매체」는, 예를 들면 바이러스 또는 그 처리물의 투여대상에 사용할 수 있는 목적하는 용액 등을 들 수 있고, 본 발명의 바이러스를 벡터로서 사용하는 경우에는, 벡터와 함께 투여하는 것이 가능하여, 벡터에 의한 유전자 도입을 유의하게 저해하지 않는 재료이다. 예를 들면 본 발명의 바이러스를 생리식염수 또는 인산완충 생리식염수(PBS) 등으로 적절히 희석하여 조성물로 할 수 있다. 또한 상기 바이러스를 포함하는 조성물은, 탈이온수, 5% 덱스트로오스 수용액 등의 담체 또는 매체를 포함하고 있어도 된다. 또한, 그 밖에도, 식물유, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 살생물제 등이 함유되어 있어도 된다. 또한 보존제 또는 기타 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 바이오폴리머 등의 유기물, 히드록시 아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리젖산 폴리머 또는 코폴리머, 폴리에틸렌글리콜 폴리머 또는 코폴리머 및 그의 화학적 유도체 등을 담체로서 조합시키는 것도 가능하다. 본 발명의 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 포함하는 조성물을 시약으로서, 및 의약으로서 유용하다.

외래 유전자로서 질환의 치료용 유전자를 사용하여 벡터를 조제하면, 이 벡터를 투여하여 유전자치료를 행하는 것이 가능해진다. 본 발명의 바이러스 벡터의 유전자치료로의 응용으로서는, 직접 투여에 의한 유전자 발현, 간접(ex vivo) 투여에 의한 유전자 발현 중 어느 방법으로도, 치료효과를 기대할 수 있는 외래 유전자 또는 환자의 체내에서 공급이 부족한 내재유전자 등을 발현시키는 것이 가능하다. 예를 들면, 외래 유전자로서, 감염증에 관한 세균 또는 바이러스의 항원을 코드하는 유전자를 사용하면, 이를 동물에게 투여함으로써, 상기 동물에 있어서 면역을 유도할 수 있다. 즉, 백신으로서 이용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 벡터는 유전자치료 등의 임상에 응용할 수 있는 가능성이 있다.

벡터의 투여량이나 투여횟수는, 질환, 환자의 체중, 연령, 성별, 증상, 투여목적, 투여조성물의 형태, 투여방법, 도입유전자 등에 따라 다르나, 당업자라면 적절히 결정하는 것이 가능하다. 투여경로는 적절히 선택할 수 있으나, 예를 들면 경피적, 비강내적, 경기관지적, 근내적, 복강내, 정맥내, 관절내, 척수강내, 또는 피하 등에 행해질 수 있으나 그들에 한정되지 않는다. 또한 국소 또는 전신에 투여 가능하다. 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물의 투여대상으로서는, 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 양, 소, 개 등 모든 포유동물이 포함된다.

또한 본 발명은, 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 약독화하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코드하는 유전자에 있어서, 서열번호:1에 기재된 아미노산서열에 있어서의 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산을 치환하는 변이를 도입함으로써, 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 약독화할 수 있다.

상기 본 발명의 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 약독화하는 방법에 있어서의 아미노산의 치환은, 전술한 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 있어서의 경우와 마찬가지로, 바람직하게는 티로신에서 페닐알라닌으로의 치환(점돌연 치환)이다.

상기 본 발명의 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 약독화하는 방법에 있어서는, 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 있어서의 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자 중 적어도 하나 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있거나, 또는 결실 또는 불활성화되는 공정을 추가적으로 포함하고 있는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서의 「결실 또는 불활성화되어 있거나, 또는 결실 또는 불활성화되는」 유전자로서는, F, HN, 및 M 단백질을 코드하는 유전자 중 어느 하나, 또는 둘 이상의 조합인 유전자를 들 수 있다.

본 발명자 등은, 본 발명의 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 약독화하는 방법을 사용함으로써, 실제로 Y1214F를 갖는 센다이 바이러스 벡터가, 벡터 감염에 의한 세포상해성이 거의 확인되지 않아, 유의하게 세포상해성을 감소시키는 것을 발견하였다. 또한, Y1214F 변이에 의해, 유의하게 바이러스의 항원성이 감소했음에도 불구하고, 아데노바이러스와 동등 이상의 외래 유전자 발현능을 나타내, 외래 유전자의 발현량이 충분히 유지되어 있음을 발견하였다. 또한, Y1214F 변이에 의해, L 단백질의 활성을 감소시켜 SeV 항원량 및 바이러스 RNA량의 감소를 실현하여, 면역반응을 경감시킬 수 있는 것을 발견하였다. 즉, 본 발명의 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 약독화하는 방법은, 도입되는 세포의 세포상해성을 저하시키기 위해, 외래 유전자의 발현 지속성을 향상시키기 위해, 또는 면역반응을 경감시키기 위해 실시할 수 있다.

본 발명의 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 약독화하는 방법으로 약독화되는 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서는, 바람직하게는 파라믹소바이러스과 바이러스를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 센다이 바이러스를 들 수 있다.

또한 본 발명은, 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 제조방법을 제공한다. 구체적으로는, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코드하는 유전자에 있어서, 서열번호:1에 기재된 아미노산서열에 있어서의 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산을 치환하는 변이를 도입하는 공정을 포함하는, 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 제조방법이다.

상기 본 발명의 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 제조방법에 있어서의 아미노산의 치환은, 전술한 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스 또는 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 약독화하는 방법에 있어서의 경우와 마찬가지로, 바람직하게는 티로신에서 페닐알라닌으로의 치환(점돌연 치환)이다.

상기 본 발명의 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 제조방법에 있어서는, 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 있어서의 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자 중 적어도 하나 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있거나, 또는 결실 또는 불활성화되는 공정을 추가적으로 포함하고 있는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서의 「결실 또는 불활성화되어 있거나, 또는 결실 또는 불활성화되는」 유전자로서는, F, HN, 및 M 단백질을 코드하는 유전자 중 어느 하나, 또는 둘 이상의 조합인 유전자를 들 수 있다.

본 발명의 약독화 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 제조방법에 있어서의 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서는, 바람직하게는 파라믹소바이러스과 바이러스를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 센다이 바이러스를 들 수 있다.

또한, 본 명세서에 인용된 문헌은 모두 명세서의 일부로서 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

재료 및 방법

[실시예 1] 유전자

1-1. 센다이 바이러스

센다이 바이러스는 Z주 15 kb를 사용하여, 각 유전자의 결실, 아미노산 변이의 삽입을 행하였다.

1-2. 리포터 유전자

EGFP 발광 에쿼리아 빅토리아 해파리(Aequorea victoria) 유래의 염기서열을 개변한 녹색형광단백질, 720 b(Accession No.U57606)를 센다이 바이러스 게놈으로 탑재하였다.

LacZ β갈락토시다아제, 3.1 kb(Accession No.U13184)를 센다이 바이러스 게놈으로 탑재하였다.

[실시예 2] 세포배양

2-1. 세포주

LLC-MK2 붉은털 원숭이 신장 유래 세포주

CV-1 아프리카 녹색원숭이 신장 유래 세포주

HEK 293 인간 태아 유래 신장 세포주

마우스 골수 유래 간엽계 세포 C57BL/6 마우스 대퇴로부터 채취

2-2. 세포배양

원숭이 신장 유래 세포주인 LLC-MK2 세포(ATCC CCL-7), CV-1(ATCC CCL-70)은, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, GIBCO-BRL,Cat.No.10099-141), 100 ㎍/㎖ 페닐실린/100 units/㎖ 스트렙토마이신(Nakarai Tesque, Cat.No.26253-84)을 포함하는 최소 필수 배지(Minimal essential medium; MEM)(Invitrogen-GIBCO, Cat.No.11095-080)배지에 현탁하고, 5% 이산화탄소 존재하, 37℃에서 배양하였다. HEK 293 세포주(ATCC CRL-1573)는, 10% FBS, 100 ㎍/㎖ 페니실린/100 units/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM)(Invitrogen-GIBCO, Cat.No.11995-065)배지에 현탁하고, 동조건으로 배양하였다. 마우스 골수세포는 C57BL/6 마우스 대퇴로부터 채취하였다. 채취 후, 10% FBS를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen-GIBCO, Cat.No.11875-093)배지에 현탁하고, 동조건으로 배양하였다.

[실시예 3] 바이러스 조제

3-1. 센다이 바이러스 벡터 조제

F 유전자 결실형 벡터(SeV/△F), M 유전자 결실형 벡터(SeV/△M)는 각각 결실시킨 유전자가 코드하는 단백질을 안정하게 공급하는 팩키징 세포주 LLC-MK2/F7(F 단백질 발현 세포)(Li, H. O., Zhu, Y. F., Asakawa, M., Kuma, H., Hirata, T., Ueda, Y., Lee, Y. S., Fukumura, M., Iida, A., Kato, A., et al. (2000), J Virol 74, p6564-6569.), LLC-MK2/F7/M62(M 단백질 발현 세포)(Inoue, M., Tokusumi, Y., Ban, H., Kanaya, T., Shirakura, M., Tokusumi, T., Hirata, T., Nagai, Y., Iida, A., and Hasegawa, M. (2003), J Virol 77, p6419-6429.)를 사용해서 회수하였다.

3-2. 아데노바이러스 벡터 조제

Cre 리콤비나아제를 발현하는 아데노바이러스 벡터(AxCANCre)(나카노, 2003, P147)를 사용하여, 각각의 결실된 유전자가 코드하는 단백질의 유도에 사용하였다. LacZ를 발현하는 5형 아데노바이러스 벡터(AdenoCALacZ)는 HEK 293 세포를 사용하여 회수하고, Adeno-X^TM Rapid Titer Kit(BD Bioscience, Cat.No.K1653-1)를 사용하 여 그 역가를 측정하였다.

[실시예 4] 변이 SeV주의 취득

4-1. SeV/△M-GFP 지속 감염 세포의 수립

6웰 플레이트에 포화상태에서 준비해 둔 LLC-MK2 세포(1×10⁶cells/well)에 GFP 유전자 탑재 M 유전자 결실형 SeV 벡터(SeV/△M-GFP)를 MOI 3으로 감염하여 37℃, 무혈청 MEM 배지에서 세포를 배양하였다. 그 2일 후, 2×10⁵cells를 새롭게 준비해 둔 혈청을 포함하는 MEM 배지로 계대하였다. 계대는 5회 반복하였다. 5회째에 계대한 세포가 컨플루언트 상태가 된 시점에서, 감염세포는 한계희석법을 사용하여 96웰 플레이트로 1 cell/well이 되도록 파종하였다. 파종 2주 후, 생존세포는 증식되어, 콜로니를 형성하였다. GFP 포지티브 세포 클론만을 선택하여, SeV/△M-GFP 지속 감염 세포로 하였다.

4-2. 지속 감염 세포로부터의 바이러스 분리

SeV/△M-GFP 지속 감염 세포로부터 이하의 순서로 바이러스를 분리하였다. 12웰 플레이트로 확대배양한 SeV/△M-GFP 지속 감염 세포 클론이 포화상태가 된 시점에서, 그 세포와 배양상청을 에펜도르프 튜브에 모두 회수하고, 동결 융해를 3회 반복하였다. 이에 세포질 내에 포함되는 RNPs(ribonucleoproteins)와 초생 바이러스(primary virus)를 얻었다. 얻어진 초생 바이러스를 재차 새롭게 준비해 둔 M 단백질 유도 후의 LLC-MK2/F7/M62로 감염시키고, 5일간 트립신을 포함하는 MEM 배지를 첨가하여 32℃에서 배양하고, 배양상청 중의 자바이러스 벡터(daughter viral vector)를 회수하였다. 회수한 배양상청 중의 자바이러스 벡터 입자는 HA 어세이법에 의해 확인하였다.

4-2-1. HA 어세이

자 바이러스를 포함하는 배양상청을 둥근 바닥 96웰 플레이트(Iwaki, Cat.No.3870-096) 상에서 PBS를 사용해서 단계희석하여, 50 ㎕/well로 하였다. 닭 적혈구는 PBS로 5회 세정하고, 8×10⁷/㎖가 되도록 조정하였다. 단계희석 후의 플레이트로 50 ㎕의 닭 적혈구를 첨가하고, 4℃에서 1시간 방치하여, 그 응집반응을 보았다.

4-3. 분리 바이러스의 선택

분리된 자바이러스 벡터를, 재차 12웰 플레이트에 포화상태에서 준비해 둔 M 단백질 유도 후의 LLC-MK2/F7/M62로 일정량 감염하고, 5일간 트립신을 포함하는 MEM 배지를 첨가하여 32℃ 및 37℃에서 5일간 배양하고, 배양상청을 회수하였다. 양쪽 온도에서 회수한 배양상청의 HA 어세이를 행하여, 친주 SeV/△M-GFP와 동일한 경향을 나타내는 것을 변이 -로 하고, 차가 있는 것을 변이 +로 하였다.

분리된 자바이러스 벡터를, 12웰 플레이트에 포화상태에서 준비해 둔 LLC-MK2 세포(5×10⁶cells/well)로 일정량 감염하고, 32℃ 및 37℃에서 트립신을 포함하는 MEM 배지를 첨가하여 32℃ 및 37℃에서 5일간 배양하고, 그 세포의 형태변화를 관찰하였다. 세포상해성, 세포융합이 친주 SeV/△M-GFP와 동일하게 관찰된 경우는 변이 -로 하고, 그 형태변화가 적은 것은 정도에 따라 변이 ±~+, 전혀 관찰되 지 않는 것은 변이 ++로 하였다.

4-3-1. 플로우 사이토메트리(flow cytometry)

변이 ++로 판정한 것에 관하여, LLC-MK2로 분리 바이러스를 MOI 1로 감염 후, FACS Calibur^TM플로우 사이토미터(Becton Dickinson)로 GFP의 발현을 측정하였다. 음성 대조(negative control)는 비감염세포를 사용하였다.

[실시예 5] 변이주 동정

변이 ++, +, ±로 예상된 바이러스의 변이유무 특정은, 바이러스 게놈의 염기서열 해독에 의해 판정하였다. 회수한 바이러스 벡터로부터 QIAamp viral RNA minikit(QIAGEN, Cat.No.52906)를 사용하여 RNA 추출을 행하였다. RT(Reverse Transcription) PCR은, Superscript^TM RT-PCR system(Invitrogen, Cat.No.10928-042)과 random 헥사머, SeV 특이적 프라이머를 사용해서 행하였다. 그 후, ABI PRISM^TM 377(Applied Biosystem Japan)로 염기서열 해독을 행하였다. 변이 ++로 예상된 클론은 전체 바이러스 게놈을 해독하여, 변이 +, ±로 예상된 클론은 세포융합에 관여하는 F, HN 유전자의 해독을 행하였다.

[실시예 6] EGFP 탑재 변이 삽입형 F 유전자 결실형 SeV 플라스미드의 구축

6-1. EGFP 탑재 2 변이 삽입형 F 유전자 결실형 SeV 플라스미드(pSeV/△F-GFP-1214-1602)의 구축

L 유전자 내에 확인된 2 변이(Y1214F, M1602L)를 갖는 SeV/△M-GFP clone#37로부터 이하의 순서로 EGFP 탑재 2 변이 삽입형 F 유전자 결실형 SeV 플라스미 드(pSeV/△F-GFP-1214-1602)를 구축하였다. SeV/△M-GFP clone#37로부터 SeV RNA 게놈을 추출·정제 후, Superscript^TMII(Invitrogen, Cat.No.18064-041)와 random 헥사머를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여, 이하의 SeV 특이적 프라이머를 사용해서 2 변이를 포함하는 PCR 단편의 증폭을 행하였다.

5'-ATCACTGCTAGATCTGTGCTGC-3'(sense)(서열번호:3)

5'-GGACTCCTATACCTCTTGTCCT-3'(anti sense)(서열번호:4)

증폭된 L 유전자 내부의 2 kb 단편에는 SeV 유니크 사이트인 Nhe I, Xho I를 포함한다. 따라서, 이 PCR 단편을 제한효소 Nhe I, Xho I로 소화하고, pSeV/△F-GFP의 L 유전자 내부 동사이트로 삽입하였다. 구축된 pSeV/△F-GFP-1214-1602는 변이 삽입부분의 염기서열 확인을 행하였다.

6-2. EGFP 탑재 1 변이 삽입형 F 유전자 결실형 SeV 플라스미드(pSeV/△F-GFP-1214, pSeV/△F-GFP-1602)의 구축

L 유전자 내에 확인된 2 변이(Y1214F, M1602L)를 각각에 갖는 EGFP 탑재 F 유전자 결실형 SeV 플라스미드(pSeV/ΔF-GFP-1214, pSeV/ΔF-GFP-1602)를 이하의 순서로 구축하였다. 먼저, 야생형 SeV-L 유전자를 주형으로 하여, 6-1.에서 사용한 프라이머 세트를 사용하여, 야생형 L 유전자의 일부를 증폭하였다. 그 후, 증폭 단편은 pGEM-T 벡터(Promega, Cat.No.A1360) 내에 삽입하고, SeV-L의 일부(2 kb)를 갖는 pGEM-L(2 kb)을 구축하였다. 이것을 주형으로 하고, 이하의 프라이머를 사용해서 PCR을 행하여, pGEM-L-1214, pGEM-L-1602를 구축하였다.

Y1214F

5'-gctataagcctcccctTttttggatcagccactgatg-3'(sense)(서열번호:5)

5'-catcagtggctgatccaaaaAaggggattcttatagc-3'(anti sense)(서열번호:6)

M1602L

5'-cagatgtggccgacTtgaggaggtcctctttcttg-3'(sense)(서열번호:7)

5'-caagaaagaggacctcctcaAgtcggccacatctg- 3'(anti sense)(서열번호:8)

구축된 pGEM-L-1214, pGEM-L-1602는 염기서열 확인을 행하였다.

다음으로 pGEM-L-1214, pGEM-L-1602를 제한효소 Nhe I, Xho I로 소화하여 얻어진 단편 1.5 kb를, pSeV/ΔF-GFP의 동일한 사이트로 각각 삽입하였다. 구축된 pSeV/ΔF-GFP-1214, pSeV/ΔF-GFP-1602는 변이 삽입부분의 염기서열 확인을 행하였다.

6-3. LacZ 유전자의 삽입

SeV 게놈으로 탑재한 외래 유전자 발현량을 정량하기 위해, LacZ 유전자를 NP 유전자의 번역영역 상류로 이하의 순서로 삽입하였다. pSeV¹⁸⁺LacZ/ΔMΔF(Inoue, M., Tokusumi, Y., Ban, H., Shirakura, M., Kanaya, T., Yoshizaki, M., Hironaka, T., Nagai, Y., Iida, A., and Hasegawa, M. (2004), J Gene Med 6, p1069-1081.)를 제한효소 Not I를 사용하여 소화하고, 전사종결-개재-전사개시(transcription end-intervening-transcription start; EIS) 엘리먼트 부착 LacZ 유전자 Not I 프래그먼트를 취출(取出)하여, 그 프래그먼트를 NP 유전자와 스타트 시그날 사이에 존재하는 Not I 사이트로 삽입함으로써 pSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF, pSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214를 구축하였다.

[실시예 7] 변이 삽입형 F 유전자 결실형 SeV 벡터의 제작

약 1×10⁷ cells/10 ㎝ 디쉬로 파종된 LLC-MK2 세포로 EGFP 유전자 탑재 변이 삽입형 F 유전자 결실형 SeV 플라스미드(pSeV/ΔF-GFP-1214, pSeV/ΔF-GFP-1602, pSeV/ΔF-GFP-1214-1602) 및 LacZ 유전자 탑재 변이 삽입형 F 유전자 결실형 SeV 플라스미드(pSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214, pSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214-1602)와 각 SeV 유전자 NP, P, F, HN, L이 탑재된 pCAGGS 플라스미드(WO2005/71085)를 동시에 트랜스펙션하였다. LLC-MK2 세포는 7.5 ㎍/㎖의 트립신을 포함하는 MEM 배지에서 24시간 배양하였다. 그 후, AxCANCre를 MOI 5로 감염시켜 F 단백질을 유도시켜 둔 LLC-MK2/F7을 중층하여 배양하였다. 중층 48시간 후, 공배양한 세포를 모두 회수하고, 동결 융해를 3회 Opti-MEM 배지 중에서 반복함으로써 세포질 내에 포함되는 RNPs(ribonucleoproteins)와 초생 바이러스를 얻었다. 얻어진 초생 바이러스를 재차, 새롭게 준비해 둔 F 단백질 유도 후의 LLC-MK2/F7으로 감염시키고, 5일부터 10일간 트립신을 포함하는 MEM 배지를 첨가하여 32℃에서 배양하였다. F 유전자 결실형 SeV 벡터로 GFP 유전자를 탑재하고 있기 때문에, 인접하는 세포로 GFP 발현이 전파되는 상(像)이 관찰되면, 바이러스 벡터는 배양상청으로 방출되고 있다. 바이러스 벡터를 포함하는 배양상청을 회수하고, 재차 새로운 팩키징 세포로 감염시키는 작업을 반복하여, 증폭시켰다. 본 실험에서는, 2회의 증폭을 반복하여 얻어진 바이러스 벡터에 최종 농도 1%가 되는 BSA를 첨가하고 -80℃에서 보관한 것을 사용하였다.

회수한 바이러스 벡터의 역가는 1 ㎖당 GFP 발현세포 및 LacZ 염색 포지티브 세포의 비율을 산출해서 구하였다.

[실시예 8] 세포상해성 정량

약 4×10⁴ cells/well(96웰 플레이트 포화상태)의 CV-1 세포로, SeV/ΔF-GFP, SeV/ΔF-GFP-1214, SeV/ΔF-GFP-1602, 및 SeV/ΔF-GFP-1214-1602를 MOI 0.1, 0.3, 1, 3, 10으로 6시간 감염시켜 32℃ 및 37℃, 무혈청 MEM 배지에서 세포를 배양하였다. 그 배양상청을 감염 3일째에 회수하고, 상청 중의 LDH(lactase dehydrogenase)를 Cytotoxicity Detection Kit(Roche Cat. No. 1664793)를 사용하여 측정하였다(Decker, T., and Lohmann-Matthes, M. L. (1988), J Immunol Methods 115, p61-69.).

[실시예 9] 지속 감염능 평가

6웰 플레이트에 준비해 둔 LLC-MK2 세포(5×10⁴cells/well), CV-1 세포(1×10⁵cells/well)로 SeV/ΔF-GFP 및 SeV/ΔF-GFP-1214를 MOI 100으로 감염시켜, 37℃, 10% FBS를 포함하는 MEM 배지 중에서 배양하였다. 감염세포는 매일 회수하여, GFP 포지티브 생존 세포 수를 계수하였다.

감염 후 5일째 형광현미경하에서 촬영하여, 2×10⁵cells의 각 벡터 감염 LLC-MK2 세포를 계대하였다. 계대는 5회 반복하고, 5계대째 세포를 동조건으로 형광현미경하 촬영하였다.

[실시예 10] 초대 배양세포에서의 유전자 발현능

C57BL/6 마우스 대퇴로부터 채취한 골수 유래 간엽계 세포를 1×10⁵cells/well로 폴리 L 리신 코트 6웰 플레이트(SUMILON, Cat.No.MS-0006L)에 파종하였다. 1주간의 배양 후, SeV/ΔF-GFP 및 SeV/ΔF-GFP-1214를 MOI 100으로 24시간 감염시키고, 50 μM 2-메르캅토에탄올, 100 μM MEM NEAA(Non-Essencial Amino Acid solution; GIBCO, Cat.No.11140-050), 1 mM Sodium pyruvate(SIGMA, Cat.No.S8636), 2 mM L-Glutamine solution(GIBCO, Cat.No.25030-081), 10% FBS를 포함하는 PPMI1640 배지 중에서 배양하였다. 감염 후 7일째, 14일째의 GFP 발현을 형광현미경하에서 관찰하였다.

[실시예 11] 실시간 PCR에 의한 세포질 내 SeV RNA의 정량

11-1. 감염세포의 조제

12웰 플레이트에 포화상태에서 준비해 둔 LLC-MK2 세포(5×10⁶cells/well)로, SeV/ΔF-GFP, SeV/ΔF-GFP-1214, SeV/ΔF-GFP-1602, 및 SeV/ΔF-GFP-1214-1602를 MOI 3으로 감염하고, 32℃ 및 37℃, 무혈청 MEM 배지에서 세포를 배양하였다. 감염 후, 2시간에서 32시간까지 그 세포를 회수하였다. 회수시에 생존 세포 수를 계수하여, 1웰당 세포 수를 산출하였다. LacZ 유전자 탑재 변이 삽입형 F 유전자 결실형 SeV에 대해서도, 동일한 작업을 행하였다.

11-2. 세포질 RNA 조제

회수한 감염세포로부터 세포질 RNA를 Gough의 방법(Gough, N. M. (1988), Anal Biochem 173, p93-95.)에 따라 조제하였다. 100 ㎕의 가용화 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.65%(w/v) NP-40)에 회수한 세포 펠릿을 현탁, 원심함으로써 세포핵을 제거하였다. 얻어진 세포질액에 추출 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 350 mM NaCl, 10 mM EDTA, 7 M Urea, 1%(w/v) SDS)를 등량 첨가한 후, 페놀/클로로포름 정제를 행하여, 세포 단백질을 제거하였다. 세포질 RNA를 포함하는 수층을 취출하고, 3배량의 에탄올을 사용하여 에탄올 침전한 펠릿을 풍건하고, 세포질 RNA 1 ㎍/㎕가 되도록 멸균수에 용해하였다.

정제 세포질 RNA 1 ㎍에 유래하는 세포 수=

세포질 RNA 조제에 사용한 세포 수(cells)/전체 세포질 RNA량(㎍)

으로서 계산하였다.

11-3. 정제 세포질 RNA로부터의 SeV cDNA 합성

정제 후의 세포질 RNA 1 ㎍을 주형으로 하여, RT(Reverse Transcription)를 Superscript^TM II(Invitrogen, Cat.No.18064-041)와 oligo dT 프라이머(12-18)(SeV mRNA용 프라이머), random 헥사머(SeV 전체 RNA용 프라이머), 또는 이하의 프라이머를 사용하여 SeV cDNA 합성을 행하였다. 합성 후의 SeV cDNA는 20 ㎕로 하였다.

5'-caagagaaaaaacatgtatgg-3'(SeV 게놈용 프라이머)(서열번호:9)

5'-agagtttaagagatatgtagcc-3'(SeV 안티게놈용 프라이머)(서열번호:10)

합성 SeV cDNA 20 ㎕를 제작하기 위해 사용한 세포 수=정제 세포질 RNA 1 ㎍의 세포 수

로 하였다.

11-4. 합성 SeV cDNA를 사용한 RNA 정량

합성된 일정량의 각 SeV cDNA를 주형으로 하여, 실시간 PCR을 이하의 프라이머와 QuantiTect^TM SYBR Green Kit(QIAGEN Cat.No.204143), ABI PRISM^TM 7700(Applied Biosystem Japan)을 사용해서 행하였다. 반응량은 50 ㎕로 하였다.

SeV-L 유전자 내

5'-cctccactaatctatctcatagg-3'(sense)(서열번호:11)

5'-ataacaatacttggctgaacgtg-3'(anti sense)(서열번호:12)

LacZ 유전자 내

5'-cggattggcctgaactgc-3'(sense)(서열번호:13)

5'-aacaggcggcagtaaggc- 3'(anti sense)(서열번호:14)

실시간 PCR 1 튜브당 상당하는 세포 수=

정제 세포질 RNA 1 ㎍의 세포 수×(실시간 PCR에 사용한 SeV cDNA(㎕)/전체 SeV cDNA 20 ㎕)

1 세포당 존재하는 SeV RNA 카피 수=

실시간 PCR 검출값(mean)/실시간 PCR 1 튜브당 상당하는 세포 수 플라스미드 pSeV¹⁸⁺LacZ/ΔF를 검량선을 위한 표준으로 하였다.

[실시예 12] LacZ 단백질 발현의 검출 및 정량

12-1. LacZ 염색

6웰 플레이트에 준비해 둔 포화상태의 LLC-MK2 세포(1×10⁶cells/well)로 SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF, SeV⁸⁺LacZ/ΔF-1214를 MOI 3으로 감염시키고, 32℃ 및 37℃, 무혈청 MEM 배지에서 세포를 배양하였다. 22시간 후, 감염세포의 LacZ 염색을 이하의 순서로 행하였다. 감염세포를 PBS로 세정하고, 고정액(0.05% 글루타르알데히드, 2% 포름아미드)을 사용하여 4℃에서 10분 고정하였다. 그 후, X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase) 염색액(1 ㎎/㎖ X-gal, 5 mM K₃Fe(CN)₆, 5 mM K₄Fe(CN)₆, 2 mM MgCl₂)을 사용하여 37℃에서 12시간 반응시켰다.

12-2. LacZ 활성 측정

LacZ 염색시와 마찬가지로, 감염 후 22시간의 감염세포를 준비하였다. 감염세포를 회수 후, 세포 수를 계수하여 1웰당 세포 수를 산출하였다. 250 mM Tris-HCl, pH 8.0 버퍼에 세포를 현탁 후, 소니케이션(sonication)에 의해 세포를 파쇄하였다. 세포 단백질은 Bradford 시약(BIOLAD, Cat.No.500-0006)을 사용하여, OD 595 nm에서 단백질량을 측정하였다. 일정량의 세포 단백질 분획으로 solution A(1 mM MgCl₂, 45 mM 2-mercaptoethanol)와 88 ㎍ o-nitrophenyl-β-D-galactosidase를 첨가하고, 37℃에서 30분 반응시켰다. 반응은 정지액(100 mM sodium phosphate pH 7.5, 1 M Na₂Co₃)을 반응액과 등량 첨가하여 정지시키고, OD 420 nm에서 측정하였 다. 검량선은 기지의 농도를 나타내는 LacZ(Sigma, Cat.No.G4155)를 단계희석한 것을 사용하였다.

결과

[실시예 13] SeV 변이주(SeV/ΔM-GFP clone#37)의 취득

세포상해성이 감약된 SeV 변이주를 얻기 위해서는, 지속 감염 세포를 수립하는 것이 하나의 수단이다. 이에, SeV/ΔM-GFP 벡터를 LLC-MK2 세포에 감염시키는 방법을 사용하여, 지속 감염 세포를 선택하였다. 지속 감염 세포 취득은 통상 야생형을 사용해서 행해진다. 이 경우, 감염 후에 완전 엔벨로프를 갖는 자바이러스, 손바이러스 입자(third-generation viral particle)가 배양상청 중으로 방출되고, 세포는 재감염을 반복해 간다. 그러나, 유전자 도입 벡터를 상정한 경우, 처음에 도입한 세포에서의 목적 유전자의 지속적 발현을 목적으로 하기 때문에, 감염 후에 방출된 입자를 매개로 한 지속 감염이 성립하는 계(系)에서는 본래의 목적에 합치하고 있다고는 하기 어렵다. 한편, M 유전자 결실형 벡터(SeV/△M)는, M 유전자를 게놈으로부터 결실하고 있기 때문에, 감염 후에는 입자 형성에 필수인 M 단백질이 생산되지 않아, 배양상청 중에 바이러스 입자는 방출되지 않는다. 즉, 자바이러스에 의한 재감염이 없다. 세포질 내에서는, 초회에 감염이 성립된 SeV/△M-GFP 벡터 유래 게놈이 전사·복제를 반복하여, 세포질에 축적된다. 이들 축적에도 영향을 받지 않고, 생존 가능한 세포가 얻어지면, 그것은, 세포측에 SeV 내성이 되는 메커니즘이 구비되었거나, 또는 SeV측에 지속적인 전사·복제에 유리한 어떠한 변이가 삽입된 것으로 예상된다. 이 현상 중 어느 하나에 의해, SeV의 지속 감염이 성립되는 것으로 생각하였다. 이에, 본 실시예에서는 SeV/△M 벡터를 사용하였다.

SeV/△M-GFP 감염 6일 후, 감염세포는 세포상해성을 나타내 90% 이상의 세포가 사멸되었다. 남은 세포를 배양하고, 5계대째에 그들의 클로닝을 행하였다. 감염에 사용한 벡터에는 GFP를 탑재하였기 때문에, GFP 형광을 클로닝 마커로 하고, GFP 형광 포지티브 세포의 경우는 SeV 감염 포지티브로 하여, 74클론의 감염세포 클론을 취득하였다. 74클론 중, 그 세포로부터 바이러스를 분리할 수 있었던 것은 60클론이었다. 분리된 바이러스를 재차, M 단백질 발현 팩키징 세포(M 발현세포 LLC-MK2/M62)로 감염시키고, 32℃ 및 37℃에서 배양 후, 자바이러스 벡터 방출량의 차를 친주 SeV/△M-GFP의 경우와 비교하였다. 결과, 60클론 중 59클론은 친주 SeV/△M-GFP와 동일한 경향을 나타내었다. 그러나, 1클론(clone#37)은 전혀 다른 성질을 나타내, 37℃에서는 HA 어세이 검출한계 이하의 입자 수였으나, 32℃에서는 친주 SeV/△M-GFP와 동등한 입자 수를 확인하였다.

팩키징 세포로의 감염과 동시에, LLC-MK2 세포로 분리된 60클론을 감염하고, 그들이 나타내는 세포 융합능을 육안으로 관찰하였다. 그러나 대부분의 클론에서는, 그 차는 명료하지 않아 판단의 지표로는 되지 않았다. 벡터 유래의 GFP 형광강도에 있어서도, 양쪽 온도에서 친주 SeV/△M-GFP와의 차는 관찰되지 않았다. 그러나, 역시 여기에서도 1클론(clone#37)은 전혀 다른 성질을 나타내, 37℃에서는 GFP 형광강도가 매우 약하고, 32℃에서는 친주 SeV/△M-GFP와 동등한 형광강도를 나타내었다(도 1, 3). 또한, SeV 감염에 감수성이 강한 것으로 알려지는 CV-1 세포로의 감염에 있어서도 동일한 경향을 나타내고, 더 나아가서는 SeV 감염에 의한 세포상 해성이 대폭 감약되어 있었다(도 2).

이상의 관찰로부터,

1) 온도에 따라 GFP 발현 패턴에 차가 관찰된다 → clone#37은 온도감수성에 관여하는 변이를 가지고 있다,

2) 친주와 동량의 감염이더라도, 세포상해성이 관찰되지 않는다 → 세포상해성 감약에 관여하는 변이를 가지고 있다,

고 하는 추측이 가능하다.

분리된 바이러스 중, 변이 +로 예상한 59클론에 대해서, GFP 형광강도는 친주와 동등함에도 불구하고 5대까지는 계대 가능하였던 것으로부터, 감염세포 표면에 표출되는 F, HN 단백질에 변이가 생긴 것으로 예상하고, 그들에 대해서는 F, HN 유전자의 염기서열을 확인하였다. 한편, 1클론(clone#37)은 전혀 다른 성질을 나타내는 것으로부터, 벡터 구동에 필수인 NP, P, L 단백질에 변이 삽입이 있었던 것으로 예상되었다. 이에, clone#37에 대해서는 SeV 전체 염기서열의 확인을 행하였다. 그 결과, 변이 +로 예상되었던 59클론 중, 15클론에서 F, HN 유전자 내에 17개소의 변이를 확인하였다. 17개소 변이 중, 12개소는 아미노산 변이를 수반하는 것이었다. clone#37에서는, F, HN 유전자에 변이는 확인되지 않았으나, L 유전자 내에 2개소 아미노산 변이를 수반하는 변이가 삽입되어 있었다(도 4).

HN 유전자 내에서 확인된 126번째의 아미노산 변이는 3클론에서 발견된 변이이기 때문에, 어떠한 표현형 변화가 있다고 추측하고 그 해석을 진행시켰으나, 바이러스 생산성, 시알산으로의 결합능, 세포상해성, 모두 친주인 SeV/△M-GFP와의 차가 관찰되지 않았다.

[실시예 14] 변이 동정

14-1. 변이 삽입형 F 유전자 결실형 벡터의 회수

본 시험에서 얻어진 SeV/△M-GFP clone#37이 갖는 L 유전자 내의 2 변이 Y1214F, M1602L, 이 중 어느 쪽이 표현형 변화에 관여하고 있는 것인지 조사하기 위해, 각각의 변이를 F 유전자 결실형 SeV 벡터(SeV/△F)에 삽입하였다. SeV/△F는 F 유전자를 게놈으로부터 결실시킴으로써, 비전파형으로 되어 안전성을 확보한 벡터이다. 또한, 세포상해성도 제1 세대로 불리는 SeV 벡터(유전자 결실 없음)에 비해 감약되어 있다. 이들 이유로부터, SeV/△F를 백본에 갖는 연구가 다수 행해지고 있어, 그 유용성이 나타내어지고 있다. 본 발명은 SeV 벡터에 의한 유전자 도입 후의 추가적인 세포상해성 감약, 탑재 유전자 발현의 연장을 목적으로 한 변이 동정이다. 이에, 현재 엔벨로프 유전자 결실형 SeV 벡터 중에서 가장 연구가 진행되고 있는 SeV/△F로 취득한 2 변이(Y1214F, M1602L)를 삽입하고,

1) 추가적인 세포상해성의 감약효과

2) 탑재 유전자 발현능의 유지

를 검증하였다. 변이를 삽입한 SeV/ΔF-GFP-1214, SeV/ΔF-GFP-1602, 양쪽 변이를 삽입한 SeV/ΔF-GFP-1214-1602를, F 발현세포(LLC-MK2/F7)와 플라스미드 베이스 리버스 제네틱법을 사용하여 제작하였다. 모든 벡터에 있어서 1×10⁸ CIU/㎖ 이상으로의 회수가 가능하였다.

14-1. 세포상해성 정량

CV-1 세포로 MOI 0.1에서 10으로 각 변이 삽입형 SeV/ΔF-GFP(SeV/ΔF-GFP-1214, SeV/ΔF-GFP-1602, 양쪽의 변이를 삽입한 SeV/ΔF-GFP-1214-1602)를 감염하고, 32℃ 및 37℃에서의 세포상해성을 SeV/ΔF-GFP와 비교하였다(도 5). 그 결과, 32℃에서는 SeV/ΔF-GFP와 SeV/ΔF-GFP-1602는 동등한 상해성을 나타내었다. 또한 37℃에 있어서도, 그 상해성은 20%의 저하에 그쳤다. 한편, SeV/ΔF-GFP-1214, SeV/ΔF-GFP-1214-1602는 양쪽 온도에서 세포상해성이 SeV/ΔF-GFP와 비교한 경우에 80% 저하되었다.

MOI 30으로의 감염에 있어서, SeV/ΔF-GFP, SeV/ΔF-GFP-1602에서는 대부분의 세포에서 박리가 관찰되었으나, SeV/ΔF-GFP-1214, SeV/ΔF-GFP-1214-1602에서는 박리는 관찰되지 않고, 감염 3일째에서도 GFP 관찰이 가능하였다(도 6). 또한, 감염 5일째에서도 마찬가지로 GFP 관찰이 가능하였다.

이 결과로부터, 세포상해성 감약에 관여하고 있는 것은 Y1214F 변이인 것이 시사되었다.

14-2. 변이 삽입형 F 유전자 결실형 벡터의 생산성

팩키징 세포 LLC-MK2/F7에 MOI 3으로 각 변이 삽입형 SeV/ΔF-GFP를 감염하고, 32℃ 및 37℃에 있어서의 벡터 생산능을 SeV/ΔF-GFP와 비교하였다(도 7). 그 결과, 양쪽 온도에서 SeV/ΔF-GFP와 SeV/ΔF-GFP-1602는 동등한 생산능을 나타내었다. 한편, SeV/ΔF-GFP-1214, SeV/ΔF-GFP-1214-1602는 32℃에서 그 늦음이 보였으나, 3일째에는 SeV/ΔF-GFP와 동등해졌다. 이 결과로부터, 온도감수성에 관여하고 있는 것은 Y1214F 변이인 것이 시사되었다.

[실시예 15] 마우스 골수 유래 간엽계 세포로의 유전자 도입

LLC-MK2 세포, CV-1 세포에서는 SeV/ΔF-GFP-1214의 GFP 발현능이 관찰 가능하였다. 이에, 초대 배양한 C57BL/6 마우스 골수 유래 간엽계 세포로의 감염을 행하여, 세포주에서 나타내어진 표현형을 유지하고 있는지를 검토하였다. 그 결과, 지금까지 검토한 세포주와 마찬가지로 Y1214F 변이를 L 유전자 내에 갖는 SeV/ΔF-GFP-1214는 온도감수성을 나타내, 32℃에서는 변이가 없는 SeV/ΔF-GFP와 동등 또는 그 이상의 발현이 확인되었다. 또한, 지금까지의 결과와 마찬가지로 SeV/ΔF-GFP-1214는 세포상해성 감약효과를 갖기 때문에, 그 감염세포는 감염 후 14일까지 GFP 형광의 관찰이 가능하였다(도 8, 9).

[실시예 16] 실시간 PCR에 의한 세포질 내 SeV RNA의 검출

지금까지의 결과로부터, 온도감수성, 세포상해성 감약에 기인하는 변이는 Y1214F 단독에 의한 것으로 판단할 수 있다. 이에, 이 표현형 변화에 관여하는 변이 Y1214F를 갖는 SeV/ΔF-GFP-1214와 표현형 변화는 확인되지 않았으나 변이주로서 취득한 clone#37 내에 동시에 삽입되어 있었던 M1602L을 갖는 SeV/ΔF-GFP-1602의 세포질 내에서의 전사·복제 카피 수를 변이가 없는 SeV/ΔF-GFP와 비교하였다(도 10). 각 SeV 벡터를 LLC-MK2 세포로 MOI 3으로 감염하고, 그 20시간 후에 세포질에 존재하는 SeV RNA량을 측정하였다. SeV는 마이너스 가닥의 RNA를 게놈으로서 갖는다. 따라서, RNA로부터 cDNA로 합성할 때, 프라이머를 구분해서 사용함으로써 마이너스 가닥 RNA(SeV 게놈), 플러스 가닥 RNA(SeV 안티게놈), mRNA를 구별할 수 있었다.

결과, mRNA량은 SeV/ΔF-GFP와 비교한 경우, SeV/ΔF-GFP-1214, SeV/ΔF-GFP-1602 모두 감소가 보였다. SeV/ΔF-GFP-1602에서는 온도차에 상관 없이, 30% 감소하고 있었다. SeV/ΔF-GFP-1214에서는 SeV/ΔF-GFP와 비교하여, 32℃에서는 86%, 37℃에서는 98%의 감소가 확인되었다.

또한, SeV 안티게놈(플러스 가닥 RNA)량에 있어서도 동일한 경향이 보였다. 특히 37℃에 있어서의 SeV/ΔF-GFP-1214의 게놈 카피 수와 안티게놈 카피 수는 적고, 그 값은 1 세포당 7 카피였다. MOI 3으로 감염하였기 때문에, 이론상으로는 감염시에는 1 세포당 3개의 게놈이 세포질에 존재한다. 이 이론 수를 토대로 계산한 경우, Y1214F를 갖는 SeV 벡터는 감염 후 20시간에 있어서, 1~2회의 복제만이 행해지고 있는 것이 된다.

SeV/ΔF-GFP-1602 감염에 있어서는, 세포질에 존재하는 mRNA 카피 수, 안티게놈 카피 수의 온도에 따른 양적 변화는 보이지 않았으나, 게놈 카피 수는 37℃에서 감소 경향을 나타내었다. 이 결과로부터, M1602L은 안티게놈으로부터 게놈으로의 복제 단계에서, 온도에 따른 복제 저해에 작용하는 변이라고 추측하였다. 그러나, 그 저해성은 미약하여 표현형 변화에는 이르지 않을 것으로 추측된다.

이들 결과로부터, Y1214F가 세포상해성 감약, 지속 감염능이라는 표현형 변화를 갖게 된 것은, 감염 후의 mRNA 합성량의 감소와 그에 수반되어 일어나는 게놈 복제량의 감소인 것이 판명되었다.

[실시예 17] 지속 감염능, 발현능의 안정성

세포상해성 감약효과가 있는 Y1214F 변이를 갖는 SeV/ΔF-GFP-1214 및 변이를 갖지 않는 SeV/ΔF-GFP를 LLC-MK2 세포, CV-1 세포로 MOI 100으로 감염시켜, SeV 감염에 의한 숙주세포 증식으로의 영향을 검증하였다(도 11).

SeV 감염에 대한 감수성이 강한 CV-1 세포의 경우, SeV/ΔF-GFP에 의해 세포는 커다란 손상을 입어, 증식하지 않고 박리되어 세포사를 나타내었다. 한편, SeV/ΔF-GFP-1214 감염에서는, 감염 후 3일째, 4일째에서 세포증식은 일시 감속되었으나, 그 후 5일째에는 비감염 세포와 동정도의 세포 수로 회복하였다.

LLC-MK2 세포에서는, SeV/ΔF-GFP 감염에 있어서, 감염 후 2일째부터 증식의 늦음을 확인하고, 3일째 이후는 그 세포 수를 유지하는 정도이고 증식은 보이지 않았다. 그러나, SeV/ΔF-GFP-1214 감염 후에는, 비감염세포와 동정도로 증식하고, GFP 발현레벨도 일정하게 유지되고 있었다(도 12). 이에, SeV/ΔF-GFP-1214 감염 후의 LLC-MK2 세포를 5대까지 계대하고, 그 GFP 발현레벨을 관찰하였다. 결과, 감염 후 5일째 또한 5계대 후 5일째의 GFP 발현레벨은 동등하였다(도 13). 이들 결과로부터, Y1214F 단독으로 지속 감염능을 갖는 것이 판명되었다.

[실시예 18] 탑재 유전자 발현량

LacZ 유전자를 벡터로 탑재하고, 온도감수성, 세포상해성 감약, 지속 감염능을 담당하는 Y1214F 변이를 갖는 SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214, 및 변이를 갖지 않는 SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF, 또한 LacZ 유전자 탑재 아데노바이러스 벡터(AdenoCALacZ)를 사용하여 탑재 유전자 발현량의 동태 정량과 발현능의 비교를 행하였다(도 14). 결과, 32℃에 있어서 SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214의 LacZ 유전자 발현은 감염 24시간 이후에 상승하고, 감염 32시간 후에 그 값은 SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF가 갖는 LacZ 유전자 발현능의 70%를 나타내었다. 이를 아데노바이러스 벡터와 비교한 경우는 10배의 값이었다. 37℃에 있어서는 아데노바이러스 벡터와 거의 동등한 발현능을 가지고 있었다.

[실시예 19] 탑재 유전자 mRNA, Genome의 정량

LacZ 유전자 발현량 정량과 동시에, 그들을 감염시킨 세포질에 존재하는 LacZ 유전자의 mRNA 카피 수, SeV 게놈 카피 수를 실시간 PCR로 정량하여, 그 동태를 보았다.

37℃에 있어서, SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF와 비교한 경우, SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214 감염세포 내의 LacZ mRNA 축적은 유의하게 늦었다. SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF 감염세포 내에서는, LacZ mRNA의 축적이 감염 후 10시간까지는 비례함수적으로, 그 후 22시간까지는 지수함수적으로 증가한다. 이 증가는 감염 10시간 이후, 새로운 게놈이 복제되어, 그들을 주형으로 하여 mRNA의 합성이 행해지는 것으로 추측된다. 실제로, 야생형 L 유전자를 갖는 SeV 게놈은 감염 후 10시간부터 복제가 행해지고 있었다. SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214의 경우, 감염 10시간 이후에 겨우 LacZ mRNA가 축적되기 시작하나, 그것은 미량이었다. 감염 22시간 후, SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF에서는 LacZ mRNA 축적이 피크를 맞이함에도 불구하고, SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214에서는 비례함수적으로 계속해서 mRNA량을 축적 하였다. SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF에서는 22시간까지 축적된 LacZ mRNA는 그 후 감소하나, LacZ 발현능은 유지되고 있었다(도 15).

32℃에 있어서도, SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF와 비교한 경우, SeV¹⁸⁺LacZ/ΔF-1214 감염세포 내에서는 LacZ mRNA의 축적이 유의하게 늦었다. 그러나, 감염 10시간 후부터 LacZ mRNA, SeV Genome의 축적이 관찰되고, 감염 32시간 후에서도 피크에 도달하는 경우는 없었다(도 16).

본 발명자 등은, 예를 들면 Y1214F를 갖는 SeV/ΔF 벡터를 세포에 감염시킨 경우,

1) 감염 초기에는 전사의 억제가 발생하고, 그 후는 전사 억제 보다도 복제속도가 유의하게 저하(1/10로 저하)되고 있는 것을 명확하게 하였다. 이 L의 전사활성·자립복제능의 저하에 의해, 감염세포는 세포상해성을 전혀 나타내지 않았다. 탑재 유전자의 발현능은 야생형 L을 갖는 SeV/ΔF 벡터에 비해 떨어지나, 아데노바이러스 벡터의 유전자 발현능과 동등 또는 그 이상으로, 장시간 그 발현은 지속되었다. 또한, 감염세포를 복수회 계대해도, 탑재 유전자의 발현은 유지되며, 또한 SeV 게놈의 변이 삽입부분인 1214번째의 페닐알라닌은 야생형의 티로신으로 돌아가지 않는 것을 확인하였다. 즉 L의 변이에 의해, 탑재 유전자의 발현능을 실용 레벨로 유지하면서, 바이러스 성분을 균형있게 저하시키는 것이 가능하다.

2) 백신 투여부위인 비강에서 상정되는 32℃에 있어서, 변이 L을 갖는 SeV/ΔF 벡 터는, 변이가 없는 L을 갖는 SeV/ΔF와 동일하게 복제하는 것을 나타내었다. 한편, 37℃에서는, 대부분 바이러스 입자를 생산하지 않는 온도감수성을 나타내었다. 마우스 골수 유래 간엽계 세포로의 감염에서는, 32℃의 배양조건에 있어서, 야생형 L을 갖는 SeV/ΔF 벡터 보다도 유전자 발현이 안정되어, 장시간 지속되었다.

이상의 사실로부터, L의 Y1214F 변이를 유전자 도입 벡터로서 이용 가능한 SeV/ΔF 벡터에 응용하면, 세포상해성을 거의 나타내지 않고 유전자를 장기간 안정하게 발현하여, 염색체와는 독립적으로 존재할 수 있는 센다이 바이러스의 이점을 충분히 살린 유전자 발현계를 개발할 수 있을 것으로 생각된다.

또한, 근연 바이러스(related virus)의 RdRp의 아미노산서열의 유사성은 높고, SeV의 1214번째의 티로신은 각 바이러스의 RNA 폴리머라아제로, 진화상 잘 보존되어 있는 것이 판명되었다. 이 사실은 Y1214F의 변이에 의한 RNA 폴리머라아제의 활성을 저하시킨다고 하는 표현형에 보편성을 부여하는 것이다. 즉, 센다이 바이러스 L에 있어서의 Y1214F 변이는, 다른 바이러스 또는 바이러스 벡터에 도입하면, 그들이 약독화되는 것을 기대할 수 있다. 예를 들면, 파라인플루엔자 바이러스 등의 백신개발에도 응용할 수 있는 보편성·안정성이 있다.

이에 더하여, L 단백질은 파라믹소바이러스 사이에서는 매우 잘 보존되어 있기 때문에, Y1214F를 백신개발이 진행되고 있는 인간 호흡기계 바이러스 등 다른 바이러스의 약독화에도 응용하는 것이 기대된다.

SEQUENCE LISTING <110> DNAVEC CORPORATION <120> Attenuated negative strand RNA virus <130> D4-A0701P <150> JP 2007-027520 <151> 2007-02-07 <160> 14 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2228 <212> PRT <213> Sendai virus <400> 1 Met Asp Gly Gln Glu Ser Ser Gln Asn Pro Ser Asp Ile Leu Tyr Pro 1 5 10 15 Glu Cys His Leu Asn Ser Pro Ile Val Arg Gly Lys Ile Ala Gln Leu 20 25 30 His Val Leu Leu Asp Val Asn Gln Pro Tyr Arg Leu Lys Asp Asp Ser 35 40 45 Ile Ile Asn Ile Thr Lys His Lys Ile Arg Asn Gly Gly Leu Ser Pro 50 55 60 Arg Gln Ile Lys Ile Arg Ser Leu Gly Lys Ala Leu Gln Arg Thr Ile 65 70 75 80 Lys Asp Leu Asp Arg Tyr Thr Phe Glu Pro Tyr Pro Thr Tyr Ser Gln 85 90 95 Glu Leu Leu Arg Leu Asp Ile Pro Glu Ile Cys Asp Lys Ile Arg Ser 100 105 110 Val Phe Ala Val Ser Asp Arg Leu Thr Arg Glu Leu Ser Ser Gly Phe 115 120 125 Gln Asp Leu Trp Leu Asn Ile Phe Lys Gln Leu Gly Asn Ile Glu Gly 130 135 140 Arg Glu Gly Tyr Asp Pro Leu Gln Asp Ile Gly Thr Ile Pro Glu Ile 145 150 155 160 Thr Asp Lys Tyr Ser 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Ala Asp Lys Val Arg Ala His Met Tyr Ala 370 375 380 Gln Lys Ala Ile Lys Leu Lys Thr Leu Tyr Glu Cys His Ala Val Phe 385 390 395 400 Cys Thr Ile Ile Ile Asn Gly Tyr Arg Glu Arg His Gly Gly Gln Trp 405 410 415 Pro Pro Cys Asp Phe Pro Asp His Val Cys Leu Glu Leu Arg Asn Ala 420 425 430 Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ile Ser Tyr Glu Cys Ala Val Asp Asn Tyr 435 440 445 Thr Ser Phe Ile Gly Phe Lys Phe Arg Lys Phe Ile Glu Pro Gln Leu 450 455 460 Asp Glu Asp Leu Thr Ile Tyr Met Lys Asp Lys Ala Leu Ser Pro Arg 465 470 475 480 Lys Glu Ala Trp Asp Ser Val Tyr Pro Asp Ser Asn Leu Tyr Tyr Lys 485 490 495 Ala Pro Glu Ser Glu Glu Thr Arg Arg Leu Ile Glu Val Phe Ile Asn 500 505 510 Asp Glu Asn Phe Asn Pro Glu Glu Ile Ile Asn Tyr Val Glu Ser Gly 515 520 525 Asp Trp Leu Lys Asp Glu Glu Phe Asn Ile Ser Tyr Ser Leu Lys Glu 530 535 540 Lys Glu Ile Lys Gln Glu Gly Arg Leu Phe Ala Lys Met Thr Tyr Lys 545 550 555 560 Met Arg Ala Val Gln Val Leu Ala Glu Thr Leu Leu Ala Lys Gly Ile 565 570 575 Gly Glu Leu Phe Ser Glu 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gacttacaag cagaagaaaa atcatgtcta tgaggagatc 2400 accaaatatt tcggtgctct aagacacgtc atgtttgatg tagggcacga gctaaaattg 2460 aacgagacca tcattagtag caagatgttt gtctatagta aaaggatata ctatgatggg 2520 aagattttac cacagtgcct gaaagccttg accaagtgtg tattctggtc cgagacactg 2580 gtagatgaaa acagatctgc ttgttcgaac atctcaacat ccatagcaaa agctatcgaa 2640 aatgggtatt ctcctatact aggctactgc attgcgttgt ataagacctg tcagcaggtg 2700 tgcatatcac tagggatgac tataaatcca actatcagcc cgaccgtaag agatcaatac 2760 tttaagggta agaattggct gagatgtgca gtgttgattc cagcaaatgt tggaggattc 2820 aactacatgt ctacatctag atgctttgtt agaaatattg gagaccccgc agtagcagcc 2880 ctagctgatc tcaaaagatt catcagagcg gatctgttag acaagcaggt attatacagg 2940 gtcatgaatc aagaacccgg tgactctagt tttctagatt gggcttcaga cccttattcg 3000 tgtaacctcc cgcattctca gagtataact acgattataa agaatatcac tgctagatct 3060 gtgctgcagg aatccccgaa tcctctactg tctggtctct tcaccgagac tagtggagaa 3120 gaggatctca acctggcctc gttccttatg gaccggaaag tcatcctgcc gagagtggct 3180 catgagatcc tgggtaattc 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taaggatgat caagttgtac tgcatgagca ttacagtgta 5760 atccggatcg cgtatctggt gggggatcga gacgttgtgc ttataagcaa gattgctccc 5820 aggctgggca cggattggac caggcagctc agcctatatc tgagatactg ggacgaggtt 5880 aacctaatag tgcttaaaac atctaaccct gcttccacag agatgtatct cctatcgagg 5940 caccccaaat ctgacattat agaggacagc aagacagtgt tagctagtct cctccctttg 6000 tcaaaagaag atagcatcaa gatagaaaag tggatcttaa tagagaaggc aaaggctcac 6060 gaatgggtta ctcgggaatt gagagaagga agctcttcat cagggatgct tagaccttac 6120 catcaagcac tgcagacgtt tggctttgaa ccaaacttgt ataaattgag cagagatttc 6180 ttgtccacca tgaacatagc tgatacacac aactgcatga tagctttcaa cagggttttg 6240 aaggatacaa tcttcgaatg ggctagaata actgagtcag ataaaaggct taaactaact 6300 ggtaagtatg acctgtatcc tgtgagagat tcaggcaagt tgaagacaat ttctagaaga 6360 cttgtgctat cttggatatc tttatctatg tccacaagat tggtaactgg gtcattccct 6420 gaccagaagt ttgaagcaag acttcaattg ggaatagttt cattatcatc ccgtgaaatc 6480 aggaacctga gggttatcac aaaaacttta ttagacaggt ttgaggatat tatacatagt 6540 ataacgtata gattcctcac caaagaaata aagattttga tgaagatttt aggggcagtc 6600 aagatgttcg gggccaggca aaatgaatac acgaccgtga ttgatgatgg atcactaggt 6660 gatatcgagc catatgacag ctcgtaa 6687 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 3 atcactgcta gatctgtgct gc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 4 ggactcctat acctcttgtc ct 22 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 5 gctataagcc tccccttttt tggatcagcc actgatg 37 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 6 catcagtggc tgatccaaaa aaggggattc ttatagc 37 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 7 cagatgtggc cgacttgagg aggtcctctt tcttg 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 8 caagaaagag gacctcctca agtcggccac atctg 35 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 9 caagagaaaa aacatgtatg g 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 10 agagtttaag agatatgtag cc 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 11 cctccactaa tctatctcat agg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 12 ataacaatac ttggctgaac gtg 23 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 13 cggattggcc tgaactgc 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 14 aacaggcggc agtaaggc 18

Claims

서열번호:1에 기재된 아미노산서열에 있어서의 1214번째에 상당하는 위치의 아미노산이 야생형으로부터 치환되어 있는 변이 L 단백질을 코드하는 유전자를 갖는 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서, 약독화(弱毒化)되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스.
제1항에 있어서,

약독화가 게놈 복제활성 및/또는 전사활성의 저하인 마이너스 가닥 RNA 바이러스.
제1항 또는 제2항에 있어서,

치환이 티로신에서 페닐알라닌으로의 치환인 마이너스 가닥 RNA 바이러스.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자 중 적어도 하나 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스.
제4항에 있어서,

상기 결실 또는 불활성화되어 있는 유전자가, F, HN, 및 M 단백질을 코드하 는 유전자 중 어느 하나, 또는 둘 이상의 조합인 마이너스 가닥 RNA 바이러스.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인 마이너스 가닥 RNA 바이러스.
제6항에 있어서,

파라믹소바이러스과 바이러스가 센다이 바이러스인 마이너스 가닥 RNA 바이러스.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 마이너스 가닥 RNA 바이러스로 되는 바이러스 벡터.
제8항에 있어서,

외래 유전자를 발현 가능하게 보유하는 바이러스 벡터.