KR20110063863A - 생 약독화 호흡기 세포융합 바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염 및/또는 중증 RSV-연관 병의 발달에 대해 백신으로서 유용한 생 약독화 RSV를 특징으로 한다. 개시된 바이러스는 대상체에게 투여될 때 비병원성인 정도로 약독화되지만, 야생형 RSV의 항원성 및 면역원성 특성을 실질적으로 보유한다.

Description

생 약독화 호흡기 세포융합 바이러스{LIVE, ATTENUATED RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS}
<관련 출원에 대한 교차 참조>
본원은 2008년 11월 5일에 출원된 미국 가출원 61/198,327호를 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)는 음성-극성 (negative-sense)의 단일 가닥 RNA 바이러스이고, 뉴모바이러스 (Pneumovirus)속, 파라믹소바이러스 (Paramyxoviradae)과의 구성원이다. RSV는 1세 미만의 유아에서 바이러스성 폐렴 및 세기관지염의 주도하는 원인이고, 이들 유아에서 입원 및 치명적인 호흡기도 질병의 주요 원인이다. 특정 근원 병 (예를 들어, 면역결핍, 선천성 심장병 및 기관지폐 형성이상)이 있는 아동에 심각한 질병이 또한 발병할 수 있다. 실질적으로 모든 아동은 2세에 감염되고, 보다 나이 든 아동 및 성인에서 재감염이 일반적이다 (Chanock et al., in Viral Infections of Humans, 3rd ed, A. S. Evans, ed., Plenum Press, N.Y. (1989)). 건강한 성인에서, 대부분은 감염은 무증상이고, 일반적으로 가벼운 상부 호흡기도 질병으로 한정되지만; 노인 환자 및 면역손상 개체는 아마도 중증의 가능하게는 생명을 위협하는 감염에 걸리기 쉽다.
RSV의 2개의 주요 항원성 하위군 (A 및 B), 및 각각의 하위군 내에서 몇몇 상이한 유전자형이 확인되었다 ([Anderson et al., 1985, J Infect. Dis. 151:626-633]; [Mufson et al., 1985, J. Gen, Virol. 66:2111-2124]). 2개의 항원성 하위군들은 상호 교차-중화 분석에 의해 약 25%가 항원상 관련된다. 각각의 하위군의 다중의 변이체가 온대 기후에서 늦가을, 겨울 및 봄 달 동안 매년 발생하는 유행병에서 동시-유행하는 것으로 밝혀졌다 (Anderson et al., 1991, J. Infect. Dis. 163:687-692). 2개의 주요 RSV 하위군 중 하나로 감염된 아동은 상동성 하위군에 의한 재감염에 대해 보호될 수 있다는 증거가 존재한다 (Mufson et al., 1987, J. Clin. Microbiol 26:1595-1597). 이것은 보호 면역성이 반복 감염 후에 축적될 것이라는 증거와 함께, 심각한 질병 및 사망에 대해 보호하기 위해 충분한 면역성을 제공할, 유아 및 어린 아동을 위한 RSV 예방접종 요법을 개발하는 것이 실현가능하다는 것을 제안한다.
실질적으로 문헌 ([Mink et al., 1991, Virology 185:615-624]; [Stec et al., 1991, Virology 183:273-287]; 및 [Connors et al., 1995, Virology. 208:478-484])에 기재된 바와 같이, 천연 RSV 게놈은 일반적으로 상보성 바이러스 mRNA를 통해, 바이러스 단백질의 11개의 물질종, 즉, 비구조적 물질종 NS1 및 NS2, N, P, 매트릭스 (M), 작은 소수성 (SH), 당단백질 (G), 융합 (F), M2(ORF1), M2(ORF2), 및 L을 코딩하는 음성-극성의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.
면역 예방제 시나지스 (Synagis)®가 조산, 고위험 유아에서 RSV-연관 질병의 예방을 위해 현재 시판되고 있지만, 수십 년의 연구에도 불구하고, RSV 감염 및 연관된 임상 질병을 방지하는 안전하고 효과적인 백신이 없는 실정이다. 분비형 항체는 상부 호흡기도를 보호하는데 가장 중요한 것으로 보이는 한편, 고수준의 혈청 항체는 하부 호흡기도에서 RSV 감염에 대한 저항에서 주요 역할을 하는 것으로 생각된다. 그러나, 정제된 인간 면역글로불린 (Ig) 제제는 전염성 혈액 매개 바이러스의 가능성 때문에 불리한 한편, 재조합 Ig 제제는 제조하기 비싸다.
어린 아동을 예방접종하기 위해 초기 시도 (1966)는 비경구로 투여된 포르말린-불활성화된 RSV 백신을 사용하였다. 불행히도, 몇몇 분야 시험에서 상기 백신의 투여는 RSV로의 후속적인 자연 감염 후에 유의하게 악화된 병의 발병과 구체적으로 연관된 것으로 나타났다 ([Kapikian et al., 1968, Am. J Epidemiol. 89:405-421]; [Kim et al., 1969, Am. J Epidemiol. 89:422-434]; [Fulginiti et al., 1969, Am. J Epidemiol. 89:435-448]; [Chin et al., 1969, Am, J Epidemiol 89:449-463]). 상기 백신이 RSV 질병을 강화시키는 이유는 분명하지 않다. RSV 항원에 대한 상기 노출이 비정상적인 또는 균형을 잃은 면역 반응을 일으키고, 이는 자연 질병의 면역병리학적 강화를 일으킨다고 제안되었다 ([Kim et al., 1976, Pediatr. Res. 10:75-78]; [Prince et al., 1986, J. Virol. 57:721-728]).
생 약독화 또는 생-벡터형 (live-vectored) 바이러스 백신의 사용은 하위단위 (subunit) 또는 불활성화 바이러스 백신에 비해 몇 가지 잇점이 있다. 생 약독화 바이러스 백신은 천연 바이러스 감염을 모방할 수 있어서 숙주 면역계를 효율적으로 촉발시킬 수 있고, 아마도 하위단위 또는 불활성화 백신보다, 체액성 및 세포성 성분을 모두 포함하는 강건한 면역성을 제공하는 것 같다.
<발명의 개요>
본원은 야생형 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염에 대한, 인간을 포함한 대상체의 면역화에 적합한 RSV의 생 균주 (strain)를 개시한다. 제공된 균주는 그를 사용한 면역화 시에 호흡기 질병을 유발하지 않으면서 RSV 감염과 연관된 심각한 호흡기 병에 대해 보호하는, 예방접종된 대상체에서 면역 반응의 생산을 효과적으로 유도하기 위해 적절하게 약독화된다. 약독화 균주는 하위군 A의 표현형적으로 야생형인 인간 RSV 균주를 Vero 세포 내에서 고정된 다중도로 계대배양함으로써 개발되었다. 서열 분석에서는 돌연변이가 계대배양 과정을 통해 유도되어, 유전적으로 안정하고 면역원성 및 보호성이고 무독성 (avirulent)인 RSV 균주를 생성시킴을 보여준다.
본 발명의 상이한 측면은 (1) 본원에서 확인된 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 돌연변이; (2) 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하고/하거나 본원에 개시된 약독화 RSV에서 확인된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 코딩하는 바이러스 게놈; 및/또는 (3) 본원에서 설명되는 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이를 갖거나 본원에서 설명되는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 생 약독화 RSV에 관한 것이다.
"돌연변이"에 대한 언급은 각각 단백질 서열 또는 유전자 및/또는 게놈 서열 내에서 명시된 아미노산 또는 뉴클레오티드 위치에서, 참조 또는 야생형 서열에 제공된 것과 상이한 아미노산 또는 뉴클레오티드의 존재를 나타낸다. 최종 결과가 지시된 돌연변이를 제공한다면, 생성되는 돌연변이는 참조 또는 야생형 서열 내로 직접 도입될 수 있거나, 참조 또는 야생형 서열과 다른 서열에 의해 제공될 수 있다.
본 발명의 생 약독화 RSV는 면역원성이고, RSV 감염 또는 RSV 감염과 연관된 중증 호흡기 병의 발병에 대해 보호성이다. 바람직한 실시양태에서, 생 약독화 RSV는 하위군 A 및/또는 B의 야생형 RSV 감염에 대한 면역화를 위해 적합한 인간 RSV이다. 상기 생 약독화 RSV를 포함하는 제약 조성물, 및 상기 조성물을 투여함으로써 RSV 감염에 대해 대상체, 바람직하게는 인간을 치료하는 방법을 또한 본원에서 개시한다.
본원에서 설명되는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 코딩하거나 본원에서 설명되는 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이를 갖는 서열을 포함하는 핵산의 예는 (1) 특정 전장 RSV 참조 서열에 기초한 전장 RSV 게놈 서열; (2) 본원에서 설명되는 특정 RSV 핵산 서열에 기초한 상이한 RSV 핵산 구역; (3) 본원에서 설명되는 하나 이상의 특정 RSV 핵산 서열을 포함하는 부분 게놈 서열; 및 (4) 본원에서 설명되는 하나 이상의 특정 RSV 핵산 서열을 함유하는 전장 게놈 서열을 포함한다. 특정 RSV 핵산 서열에 대한 언급은 명시된 서열 및/또는 명시된 서열에 대한 지시된 동일성을 포함한다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 감염 또는 재감염의 예방 또는 감소, 또는 RSV 감염의 증상, 질병 또는 병태의 감소 또는 제거를 포함한, 치료 및/또는 예방 처치를 모두 나타낸다. 치료를 필요로 하는 환자는 일반적인 집단 및/또는 RSV로 감염된 환자를 포함한다. 그를 필요로 하는 환자의 예는 RSV-연관 질환(들)이 이미 있는 환자, 그러한 질환을 발병할 경향이 있는 환자, 및/또는 그러한 질환을 예방해야 하는 환자를 포함한다.
"질환"은 폐렴 및 세기관지염을 포함하고 이로 제한되지 않는, 전적으로 또는 부분적으로 RSV 감염으로부터 생성되는 임의의 상태이다. 용어 "질환"에는 포유동물을 문제의 질환에 쉽게 걸리게 하는 병리 상태를 포함한 만성 및 급성 질환 또는 질병이 포함된다.
용어 "보호하다" 또는 "보호"는 본 발명의 약독화 바이러스 또는 치료 방법의 문맥에서 사용될 때 RSV 감염, 재감염, RSV 감염으로부터 생성되는 질환(들)의 가능성을 감소시키고, 또한 감염, 재감염 및/또는 그러한 감염으로부터 생성되는 질환(들)의 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
용어 "유효량"은 척추동물 숙주, 바람직하게는 인간 숙주에 도입될 때, 보호 면역 반응을 생성시키는 충분한 양을 의미한다. 당업자는 상기 수준이 변할 수 있음을 알 것이다.
본원에서 설명되는 생 약독화 RSV는 임의의 RSV 하위군 (A 또는 B) 또는 균주 (예를 들어, 인간, 소, 쥐), 바람직하게는 인간으로부터 유래될 수 있다. 보호 면역 반응을 유도하기 위해, RSV 균주는 면역화시킬 대상체에 내인성인 것일 수 있고, 예를 들어 인간을 면역화시키기 위해 인간 RSV가 사용된다.
RSV 균주에 대해 용어 "야생형" 또는 "wt"은 약독화를 위한 공지의 마커 (marker)에서 야생형인 게놈 서열을 가진 바이러스 및/또는 약독화의 생체내 (예를 들어, 인간 또는 다른 적합한 동물 모델에서) 또는 시험관내 모델에서 보여질 때 표현형적으로 야생형인 (즉, 약독화되지 않은) 바이러스를 모두 나타낸다. RSV 단백질 또는 핵산 (예를 들어, 유전자, 게놈) 서열에 관하여 용어 "야생형"은 약독화된 표현형에 기여하는 것으로 공지된 마커를 함유하지 않는 서열을 나타낸다.
본원에 개시된 RSV에 관하여 "생 약독화 바이러스"는 야생형 RSV와 유전자형이 상이하고 (즉, 게놈 서열 내에 차이를 갖고) 상기 야생형 바이러스와 표현형이 상이한 (즉, 약독화된 표현형에 의해 입증되는 바와 같이) 바이러스를 의미한다. 약독화된 바이러스는 여전히 생존가능하면서 (또는 "살아있으면서") 감소된 바이러스 독성 (virulence)을 나타냄으로써 표현형이 상이하고; 따라서, 바이러스는 상이한 정도의 약독화를 보일 수 있다. 본 발명의 생 약독화 RSV는 대상체 숙주 내에서 비병원성이도록 약독화된다. 불완전하게 약독화된 바이러스는 발병기전의 감소를 보이지만, 여전히 대상체 숙주에서 질병 반응을 생성할 수 있다. 본 발명의 생 약독화 RSV는 자연 유래되거나 (예를 들어, 야생형 또는 불완전하게 약독화된 균주를 계대배양하여), 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 재조합 방식으로 생산될 경우, 재조합 RSV는 재조합 발현 시스템으로부터 직접 또는 간접적으로 유래하거나 그로부터 생성된 바이러스 입자 또는 부바이러스 (subviral) 입자로부터 전파되는 RSV 또는 RSV-유사 바이러스 입자 또는 부바이러스 입자를 포함한다. 본원에 개시된 생 약독화 RSV는 단리되고 대개 정제된 형태이다.
"실질적으로 유사한"은 문서 문맥에 의해 지시될 때 주어진 핵산 또는 아미노산 서열이 참조 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 참조 서열에 대한 서열 동일성은 서열을 참조 서열과 정렬하고 상응하는 구역 내의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수를 결정함으로써 결정한다. 상기 수를 참조 서열 내의 아미노산의 총수로 나누고 100을 곱한 후, 가장 가까운 정수로 어림한다. 서열 동일성은 많은 당업계에 알려진 서열 비교 알고리즘에 의해 또는 시각 검사에 의해 결정할 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Ausubel, F. M, et al., Current Protocols in Molecular Biology, 4, John Wiley & Sons, Inc., Brooklyn, N.Y., A.1E.1-A.1F.11, 1996-2004] 참조). 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 또는 아미노산 서열은 NS2, G, L 또는 F 단백질을 코딩하거나 그로 이루어진다면, 아래에서 상세하게 설명되는 p17 내에서 확인된 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 돌연변이를 유지할 것이다.
"단리된"에 대한 언급은 자연에서 또는 감염된 개체의 비인두와 같은 야생형 바이러스의 천연 환경 외에서 발견되는 상이한 형태를 나타낸다. 따라서, 단리된 바이러스는 세포 배양액 또는 다른 시스템의 이종성 성분일 수 있다. 상이한 형태는 예를 들어, 자연에서 발견되는 것과 상이한 순도 및/또는 자연에서 발견되지 않는 구조일 수 있다.
"포함하다"와 같은 개방형 (open-ended) 용어에 대한 언급은 추가의 요소 또는 단계를 허용한다. 때때로, "하나 이상"과 같은 어구가 추가의 요소 또는 단계의 가능성을 강조하기 위해 개방형 용어와 함께 또는 그 없이 사용된다.
명백하게 진술하지 않으면, 예를 들어 단수형 ("a," "an" 및 "the")와 같은 용어에 대한 언급은 하나에 제한되지 않고, 문맥이 명백하게 다르게 지시하지 않으면 복수 언급을 포함한다. 예를 들어, "하나의 세포"는 "세포들"을 제외하지 않는다. 때때로, 하나 이상과 같은 어구가 복수의 가능한 존재를 강조하도록 사용된다.
용어 "포유동물"은 인간을 포함한 임의의 포유동물을 나타낸다.
약어 "Kb"는 킬로염기를 의미한다.
약어 "pfu"는 플라크 (plaque) 형성 단위를 의미한다.
약어 "ORF"는 유전자의 개방 해독 프레임을 의미한다.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 상이한 실시예를 포함한 본원에서 제공되는 추가의 설명으로부터 명백하다. 제공되는 실시예는 본 발명을 실시하는데 유용한 상이한 성분 및 방법론을 예시한다. 실시예는 청구된 발명을 제한하지 않는다. 본 명세서에 기초하여, 당업자는 본 발명을 실시하기 위해 유용한 다른 성분 및 방법론을 확인하고 이용할 수 있다.
도 1은 야생형 RSV 균주, hRSV S2 (서열 2; NCBI Genbank 등록 번호 U39662; [Tolley et al., 1996, Vaccine 14:1637-1646] 참조), Merck 균주 287 (서열 4) 및 p17 (서열 6)로부터 NS2 단백질의 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. 단일 밑줄로 표시된 아미노산은 hRSV S2 균주와 두 Merck 287 및 p17 균주 사이에서 NS2 단백질의 차이를 나타낸다. Merck 균주 p17_pp의 NS1 아미노산 서열은 p17 (서열 6)에 대한 것과 동일하다.
도 2는 hRSV S2 (서열 8), Merck 균주 287 (서열 10) 및 p17 (서열 12)로부터 G 단백질의 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. 단일 밑줄로 표시된 아미노산은 hRSV S2 균주와 두 Merck 287 및 p17 균주 사이에서 G 단백질의 차이를 나타낸다. 이중 밑줄로 표시된 아미노산은 p17 균주와 두 hRSV S2 및 Merck 287 균주 사이에서 차이를 나타낸다. Merck 균주 p17_pp의 G 아미노산 서열은 p17 (서열 12)에 대한 것과 동일하다.
도 3a 및 b는 hRSV S2 (서열 14), Merck 균주 287 (서열 16) 및 p17 (서열 18)로부터 F 단백질의 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. 단일 밑줄로 표시된 아미노산은 hRSV S2 균주와 두 Merck 287 및 p17 균주 사이에서 F 단백질의 차이를 나타낸다. 이중 밑줄로 표시된 아미노산은 p17 균주와 두 hRSV S2 및 Merck 287 균주 사이에서 차이를 나타낸다. 서열 18의 아미노산 위치 294는 "X"로서 지정되고, 이는 Glu 또는 Lys 잔기를 나타낸다. 서열 18의 아미노산 위치 486도 또한 "X"로서 지정되고, 이는 Asp 또는 Gly 잔기를 나타낸다.
도 4a-g는 hRSV S2 (서열 20), Merck 균주 287 (서열 22) 및 p17 (서열 24)로부터 L 단백질의 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. 단일 밑줄로 표시된 아미노산은 hRSV S2 균주와 두 Merck 287 및 p17 균주 사이에서 L 단백질의 차이를 나타낸다. 이중 밑줄로 표시된 아미노산은 p17 균주와 두 hRSV S2 및 Merck 287 균주 사이에서 차이를 나타낸다. 서열 24의 아미노산 위치 148은 "X"로서 지정되고, 이는 Asp 또는 Ala 잔기를 나타낸다. 아미노산 위치 2054도 또한 "X"로서 지정되고, 이는 Leu 또는 Phe 잔기를 나타낸다.
도 5는 바이러스를 코 안에 접종한 코튼 래트 (cotton rat)로부터 코 및 폐 샘플 모두에서 야생형 hRSV A2 균주 (Huang and Wetz, 1982, J. Virol. 43:150), Merck 균주 287의 계대배양 3 ("p3"), 및 Merck 균주 287의 계대배양 17 ("p17")의 바이러스 역가 (pfu/g 조직)를 비교한 것이다.
도 6은 조합된 코 안 또는 기관내 경로에 의해 바이러스를 접종한 아프리카 녹색 (African green) 원숭이로부터 코 및 폐 샘플 모두에서 야생형 hRSV A2 균주, Merck 균주 287의 계대배양 3 ("p3"), 및 Merck 균주 287의 계대배양 17 ("p17")의 바이러스 역가 (pfu/g 조직)를 비교한 것이다.
도 7은 바이러스를 코 안에 접종한 코튼 래트로부터 코 및 폐 샘플 모두에서 Merck 균주 287의 계대배양 3 ("p3"), 5 ("p5"), 10 ("p10") 및 15 ("p15")의 바이러스 역가 (pfu/g 조직)를 비교한 것이다.
도 8은 코튼 래트에서 면역화 후 제14일, 제28일 및 제56일에 wt hRSV A2, Merck 균주 287의 계대배양 3 ("p3") 또는 Merck 균주 287의 계대배양 17 ("p17")로 면역화시킨 후 야생형 hRSV A2에 대한 혈청중화 (SN) 항체 역가를 비교한 것이다. 래트를 바이러스로 근육내로 면역화시켰다.
도 9는 먼저 야생형 hRSV A2, Merck 균주 287 p3 또는 Merck 균주 287 p17로 또는 바이러스 없이 근육내로 면역화시킨 후, 105.5 pfu의 wt A2 바이러스를 코 안에 챌린징한 코튼 래트의 코 및 폐 샘플에서 바이러스 역가 (pfu/g 조직)를 비교한 것이다.
도 10은 코 및 폐에서 Merck 균주 287의 계대배양 17 ("p17")로 또는 바이러스 없이 ("none") 면역화시킨 28일 후에 아프리카 녹색 원숭이에서 야생형 hRSV A2에 대한 혈청중화 (SN) 항체 역가를 비교한 것이다. 원숭이를 근육내로 면역화시켰다.
도 11은 먼저 Merck 균주 287 p17로 또는 바이러스 없이 근육내로 면역화시킨 후, 105.5 pfu의 wt A2 바이러스를 코 안 및 기관내 접종에 의해 챌린징한 아프리카 녹색 원숭이의 코 및 폐 샘플에서 평균 바이러스 역가 (pfu/ml)를 비교한 것이다.
본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염 및/또는 RSV-연관 병의 발병에 대한 백신으로서 사용하기 위한 생 약독화 RSV에 관한 것이다. 본원에 개시된 바이러스는 대상체, 바람직하게는 인간에게 투여될 때 비병원성이도록 약독화되지만, 야생형 RSV의 항원성 및 면역원성 특성을 실질적으로 보유한다. 따라서, 본원에 개시된 약독화된 바이러스는 야생형 바이러스에 의해 유발된 호흡기 증상을 생성시키지 않으면서 접종된 포유동물에서 보호 면역 반응을 자극하기 위해 유용하다.
I. 생 약독화 RSV
본원에서 설명되는 생 약독화 RSV 바이러스는 이하에서 "Merck 균주 287", "균주 287" 또는 "p0"로 불리는, hRSV A형 균주의 연속 계대배양에 의해 확인되었다. Merck 균주 287은 초기에 GMK 세포 내에서 2배 증폭시킨 RSV 균주로부터 유래하였다. 상기 초기 증폭 후에, 바이러스를 인간 이배체 세포주 WI-38 내에서 5회 추가 계대배양시켰다. 상기 계대배양 5 물질 (Merck 균주 287로 개명함)은 서열 결정되었고, 약독화에 대해 공지된 유전자 마커에서 유전적으로 야생형이고 또한 표현형적으로 야생형인 것으로 나타났다 (하기 실시예 참조).
Merck 균주 287을 VERO CCL-81 원숭이 신장 세포 내에서 고정된 다중도로 계대배양하였다. 바이러스 역가는 계대배양에 걸쳐 변함없이 유지되고, 배양액 내에서 바이러스의 세포병변 효과도 일관적이었다. 계대배양된 바이러스의 약독화는, 생체내 설치류 및 영장류 모델에서 바이러스 흘림 (shedding)의 감소를 측정함으로써 모니터링하였다. 코튼 래트 모델 및 아프리카 녹색 원숭이 모두에서 계대배양 3 (p3) 및 계대배양 17 (p17) 사이에서 현저한 약독화가 보였고, 바이러스 부하 (load)의 2-4 로그 감소를 보여준다. p17 바이러스 집단으로부터 단리된 게놈 DNA를 원래의 Merck 균주 287과 서열 비교하여, p17 게놈 내에서 뉴클레오티드 돌연변이를 확인하였고, 그 대부분은 G, F 및 L 단백질을 코딩하는 유전자 (이하에서 각각 G, F 및 L 유전자로 언급됨) 내에 위치한다. p17은 Merck 균주 287과 비교할 때 총 21개 뉴클레오티드 차이 및 11개 아미노산 차이를 함유한다. p17로부터 유래된 플라크-정제된 바이러스 (p17_pp)는 Merck 균주 287과 비교할 때 추가의 뉴클레오티드 돌연변이를 함유한다. 추가의 서열 분석을 계대배양 과정에 걸쳐 유전적 변화를 모니터링하기 위해 계대배양 5 (p5), 계대배양 10 (p10) 및 계대배양 15 (p15)에 대해, 및 유도된 돌연변이의 유전적 안정성을 측정하기 위해 계대배양 18 (p18) 및 계대배양 22 (p22)에 대해 수행하였다. 면역원성 및 보호 연구를 또한 수행하였다. 이들 연구는 본원에 개시된 p17 균주가 유전적으로 안정하고, 면역원성 및 보호성이고, 무독성임을 보여준다. 따라서, 본 발명의 생 약독화 RSV는 RSV의 감염에 의해 유발되는 질병에 대해 보호하기 위해 백신으로서 사용될 수 있다.
Merck 균주 287 (계대배양 0 또는 "p0") 및 그의 다양한 계대배양된 균주 사이에서 서열 비교의 상세한 요약은 하기 실시예 2 및 4에서 찾을 수 있다. 간단히 설명하면, p0, p17, 및 p17_pp (p17로부터 유래된 플라크 정제된 바이러스)에 대한 전장 바이러스 게놈을 서열 결정하고 비교하고, 또한 계대배양 5, 10, 15, 및 18의 서열을 표적화하였다. Merck 균주 287의 게놈 서열을 본원에서 서열 25로서 기재한다. p17 및 p17_pp 균주의 게놈 서열을 본원에서 각각 서열 26 및 서열 91로서 기재한다. Merck 균주 287 및 p17의 바이러스 게놈 사이에서 21개의 뉴클레오티드 차이, 및 특정한 뉴클레오티드 돌연변이의 위치를 하기 표 5에 나열한다 (예를 들어, 위치 5295에서 알라닌 (A)에서 구아닌 (G)로의 돌연변이). p17_pp 균주의 게놈 서열을 본원에서 서열 91로서 기재한다. p17_pp의 게놈 서열은 NS1 단백질을 코딩하는 유전자 내에서 (NS1 유전자의 뉴클레오티드 위치 162에서) 추가의 침묵 뉴클레오티드 돌연변이를 제외하고는 p17의 것과 동일하다. 하기 표 8은 Merck 균주 287, p17 및 p17_pp 사이에서 뉴클레오티드 차이를 비교한 것이다. 하기 표 6 및/또는 9에서는 또한 p17 및 p17_pp 게놈 서열 내에서 뉴클레오티드 돌연변이의 위치, 및 RSV 유전자 개방 해독 프레임 (ORF) 내에서 각각의 돌연변이의 상응하는 위치를 나열한다. 예를 들어, p17 바이러스 게놈의 위치 5295에서 돌연변이는 G 유전자 ORF의 뉴클레오티드 위치 610에서 돌연변이에 상응한다. 표 6 및 9에서는 특정 점 돌연변이 또는 점 돌연변이들의 조합이 아미노 치환을 생성하는지 여부, 및 상기 치환의 아미노산 위치를 추가로 나열한다. 예를 들어, p17 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 위치 5295에서 돌연변이는 G 단백질의 아미노산 잔기 위치 204에서 리신 (LYS)에서 글루탐산 (GLU)으로의 아미노산 치환을 일으킨다. p17 및 Merck 균주 287 사이에서 21개의 뉴클레오티드 차이 (및 p17_pp 및 Merck 균주 287 사이에서 22개의 뉴클레오티드 차이) 중에서, 1개의 뉴클레오티드 차이는 바이러스 게놈의 비번역 구역 내에 (즉, 5' 비번역 구역 내에서 뉴클레오티드 15046) 위치한다.
모 p0 균주 (Merck 균주 287)에 비해 p17 바이러스 게놈 내에서 확인된 21개의 뉴클레오티드 차이 중에서, 4개의 뉴클레오티드 차이는 계대배양 17 내에 포함된 바이러스 집단 내에서 다형성 (polymorphism)을 나타낼 수 있고, RSV 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 위치 6538, 7115, 8937 및 14656에 위치한다 (하기 실시예 2 참조). 이들 위치는 서열 26에서 "n"으로 지정된다. 위치 6538에서 "n"은 G 또는 A일 수 있고; 위치 7115에서 "n"은 A 또는 G일 수 있고; 위치 8937에서 "n"은 A 또는 C일 수 있고; 위치 14656에서 "n"은 G 또는 T일 수 있다. 이들 뉴클레오티드 다형성은 F 및 L 유전자에 상응하는 유전자 서열 (각각 서열 17 및 23)에서 "n"으로 및 F 및 L 단백질에 상응하는 단백질 서열 (각각 서열 18 및 24)에서 "x"로 또한 표지된다. 다형성은 집단 내에서 2개 (이상)의 형태의 유전자의 존재를 나타내고, 여기서 각각의 형태는 단지 새로운 근소한 돌연변이 때문이라고 하기에는 너무 흔한 것이다. 이들 잠재적인 다형성 중 2개는 F 단백질에 대한 코딩 구역 내에 위치하고, 2개는 L 단백질 코딩 구역 내에 위치한다. 이들 다형성은 적어도 2개의 뉴클레오티드에 상응하는 이중 피크에 의해 나타내어지는, 서열결정 크로마토그램 상에서 명백하다. 다형성은 서열 분석을 위해 그로부터 DNA가 추출된 바이러스의 p17 풀 (pool) 내의 바이러스의 집단이 바이러스의 균질한 집단이 아님을 나타낸다. 이들 4개의 뉴클레오티드 다형성은 각각 아미노산 치환을 유도한다 (하기 실시예 2 참조).
p17 RSV 균주를 플라크 정제하여 클로날 (clonal) 집단 (p17_pp) 바이러스를 얻고, 서열 결정하였다 (하기 실시예 4 참조). p17_pp 게놈 내에서 NS1 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 162에서 침묵 돌연변이를 확인하는 것에 추가로, p17의 L 및 F 단백질을 코딩하는 유전자 내에서 확인된 다형성은 해명되었다 (하기 표 8 및 9 참조). 따라서, p17_pp 바이러스의 F 및 L 단백질을 코딩하는 유전자를 본원에서 각각 서열 92 및 서열 94로서 기재하고, 코딩된 단백질은 서열 93 및 서열 95로서 기재한다.
표 7 (하기 실시예 2)은 본원에서 설명되는 Merck 균주 287의 계대배양에 걸쳐 유도된 돌연변이의 진행을 보여준다. 예를 들어, 단지 하나의 뉴클레오티드 돌연변이가 계대배양 5 (p5)에서 보이고, 이는 RSV 게놈의 뉴클레오티드 위치 954에 위치한다. 뉴클레오티드 돌연변이의 수는 계대배양 과정에 걸쳐 증가하고, p15에서는 p17 내의 21개의 뉴클레오티드 돌연변이 중 적어도 20개가 존재한다. 5' 비번역 구역 내에서 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 15046에 위치하는, p17에서 보이는 제21번째 뉴클레오티드 차이는 p15 내에 존재할 수 있지만, p15 바이러스 게놈의 그 부분을 함유하는 유전자 세그먼트는 서열 결정되지 않았다.
도 7의 결과는 p3, p5, p10 및 p15의 생체내 복제를 포함하는, 바이러스 계대배양 및 약독화 정도 사이의 관계를 강조한다 (또한, 하기 실시예 3 참조). 계대배양 5 (p5)는 이미 p3에 비해 감소된 복제를 보이기 시작한다. 계대배양 10 (p10) 및 15 (p15)는 복제의 감소가 더욱 커지고, p10 및 p15 사이에서 복제가 현저하게 감소한다. p15 바이러스는 상기 설명되는 p17 바이러스만큼 약독화된 것으로 보인다 (도 5 참조). p10 및 p15 내에 존재하는 돌연변이의 어레이를 비교할 때, p15는 단지 2개의 추가의 뉴클레오티드 차이를 갖고, 이는 F 및 L 단백질 코딩 구역 내에 위치한다. 따라서, 특정 이론에 매이지 않으면서, F 및/또는 L 단백질 코딩 구역 내의 돌연변이가 RSV를 약독화하기 위해 특히 중요하다는 것이 가능하다. p17의 플라크 정제된 유도체인 p17_pp의 약독화 연구는 바이러스가 모 p17 균주만큼 약독화됨을 보여준다 (하기 실시예 4 참조).
표 1은 Merck 균주 287 (MRK287), p17, p17_pp 및 공개된 야생형 균주 hRSV S2 (NCBI Genbank 등록 번호 U39662에 개시됨; [Tolley et al., 1996, Vaccine 14:1637-1646])에 대한 NS1, NS2, G, F 및 L 유전자 개방 해독 프레임 및 코딩된 단백질에 대한 서열 확인 번호 (서열 번호)의 요약을 제공한다.
Figure pct00001
RSV는 음성-극성의 비-세그먼팅된 단일 가닥 RNA 게놈이다. 따라서, 게놈 세그먼트의 재편성은 일어나지 않는다. 그러나, RNA 교정 및 편집 능력이 없는 RNA 중합효소에 대한 의존성 때문에, RSV 게놈은 돌연변이가 발생할 가능성이 높다. 다양한 RSV 유전자의 서열 연구에 의해 2개의 주요 군 (A 및 B)으로 인간 RSV의 분할을 확인한 한편, 각각의 군 내에서 많은 변이체 또는 계열을 또한 확인하였다 (예를 들어, 문헌 [Peret et al., 1998, J Gen. Virol. 79:2221-2229] 참조). 인간 RSV의 2개의 항원성 하위군 사이에서, 아미노산 서열 동일성은 96% (N 단백질에 대해) 내지 53% (G 단백질에 대해) 범위이다 (Johnson et al., 1987, Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:5625-5629). 군 A 및 군 B 균주 내에서, G 단백질은 각각 20% 및 9%까지의 아미노산 다양성을 보여준다 ([Cane et al. 1991, J. Gen. Virol 72:649-357]; [Sullender et al., 1991, J. Virol 65:5425-5434]).
상기 유전적 비균질성의 예로서, Merck 균주 287, p17, 및 hRSV S2로부터 NS2, G, F 및 L 단백질의 정렬을 각각 도 1, 2, 3 및 4에서 찾을 수 있다. 도 1의 NS2 단백질의 정렬에 도시된 바와 같이, Merck 균주 287 및 본원에서 설명되는 p17 계대배양된 균주 사이에 아미노산 차이가 존재하지 않지만, 야생형 hRSV S2 균주와 두 Merck 균주 287 및 p17 사이에서 2개의 아미노산 차이가 존재한다 (도 1에서 밑줄침). 그러나, 두 Merck 균주 287 및 hRSV S2는 표현형적으로 야생형이고; 따라서, hRSV S2와 두 Merck 균주 287 및 p17 사이에서 이들 아미노산 차이는 p17 또는 p17_pp의 약독화를 유도하지도 않고 그에 기여하지도 않는 것을 아는 것이 중요하다.
이와 유사하게, G, F 및 L 단백질 서열에서 야생형 hRSV S2 균주 및 두 Merck 균주 287 및 p17 사이에 아미노산 차이가 존재한다 (각각 도 2, 3 및 4에서 단일 밑줄로 표시된 아미노산을 참조한다). 그러나, Merck 균주 287 및 p17의 G, F 및 L 단백질 서열 사이에 또한 아미노산 차이가 존재한다 (각각 도 2, 3, 및 4에서 이중 밑줄로 표시된 아미노산을 참조한다). 하나 이상의 이들 이중 밑줄로 표시된 아미노산 차이는 p17 및 p17_pp에 대해 입증된 약독화된 표현형에 기여하는 것 같다.
따라서, 본 발명은 Merck 균주 287에 비해 p17 및/또는 p17_pp에 기재된 바와 같이 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하고/하거나 본원에서 p17에 기재된 바와 같이 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 코딩하는 변형된 바이러스 게놈을 갖는 생 약독화 RSV에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 약독화된 RSV의 바이러스 게놈은 예를 들어, 서열 25에 제시된 Merck 균주 287 게놈 서열 또는 다른 표현형적으로 야생형인 RSV 균주 (예를 들어, hRSV S2)에 비해 추가의 뉴클레오티드 차이를 함유하고/하거나 추가의 아미노산 차이를 코딩할 수 있고, 여기서 상기 추가의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 돌연변이는 약독화 표현형에 실질적으로 기여하지 않는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 생 약독화 RSV는 약독화를 위해 공지된 유전자 마커에서 추가의 돌연변이에 추가로 p17 및/또는 p17_pp에 기재된 바와 같은 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Conners et al., 1995, Virology, 208:478-484]; [Crowe et al., 1996, Virus Genes 13:269-273]; [Firestone et al., 1996, Virology 225:419-422]; [Whitehead et al., 1998, J Virol. 72:4467-4471]) 참조).
II . 상이한 실시양태의 예
제1 실시양태에서, 본 발명은 바이러스 게놈을 포함하는 생 약독화 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)에 관한 것이고, 여기서 바이러스 게놈은 G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 204의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 205의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 211의 알라닌; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 213의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 221의 글리신; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 223의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 232의 글리신; F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 294의 리신; F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 486의 글리신; L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 148의 알라닌; 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 2054의 페닐알라닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 단백질을 코딩한다. 따라서, 상기 실시양태에서, 본 발명의 생 약독화 RSV는 상기 단락에서 언급된 아미노산 잔기의 하나, 전부 또는 하위세트를 포함한다. 언급된 아미노산 잔기의 위치는 바이러스 게놈 내의 유전자에 의해 코딩되는 특정 아미노산 서열 내의 그들의 위치에 따라 언급된다. G, F 및 L 단백질은 각각 G, F 및 L 유전자에 의해 코딩된다,
추가의 실시양태에서, 본 발명의 생 약독화 RSV는 NS1 유전자의 뉴클레오티드 위치 162의 아데닌; NS2 유전자의 뉴클레오티드 위치 327의 아데닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 610의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 613의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 630의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 631의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 637의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 639의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 654의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 661의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 662의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 666의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 667의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 668의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 675의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 695의 구아닌; G 유전자의 뉴클레오티드 위치 696의 구아닌; F 유전자의 뉴클레오티드 위치 880의 아데닌; F 유전자의 뉴클레오티드 위치 1457의 구아닌; L 유전자의 뉴클레오티드 위치 443의 시토신; 및 L 유전자의 뉴클레오티드 위치 6162의 티민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 게놈을 포함한다. 바이러스 게놈은 명시된 뉴클레오티드의 하나, 전부 또는 하위세트를 포함할 수 있다.
명시된 아미노산 잔기 및/또는 뉴클레오티드의 하나, 전부 또는 하위세트는 본 발명의 생 약독화 RSV를 구성할 수 있다. 상기 언급된 아미노산 잔기 및 뉴클레오티드는 본원에서 설명되는 p17 및 p17_pp 내에 존재하는 특정한 아미노산 잔기 및 뉴클레오티드의 위치에 상응한다 (하기 표 5, 6, 8 및 9 참조). 예를 들어, 상기 실시양태 내의 생 약독화 RSV는 F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 294에 리신, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 486에 글리신, L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 148에 알라닌, 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 2054에 페닐알라닌을 포함할 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, 본원에 제시된 결과는 F 및 L 단백질 내의 언급된 아미노산 잔기가 p17 및 p17_pp의 약독화된 표현형에 실질적으로 기여함을 제안한다.
제2 실시양태에서, 본 발명은 약독화되지 않은 RSV 바이러스 게놈에 비해 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하는 바이러스 게놈을 포함하는 생 약독화 RSV에 관한 것이고, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 야기하고, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 각각 G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 204, 205, 211, 213, 221, 223, 및 232; 각각 F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 294 및 486; 및 각각 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 148 및 2054로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에 위치한다. 약독화되지 않은 RSV 균주는 유전적으로 및/또는 표현형적으로 야생형인 RSV이고, 참조 서열을 제공한다. 아미노산 돌연변이의 위치는 바이러스 게놈 내의 유전자에 의해 코딩되는 특정 아미노산 서열 내의 그들의 위치에 따라 언급된다. G, F 및 L 단백질은 각각 G, F 및 L 유전자에 의해 코딩된다. 상기 언급된 아미노산 돌연변이는 유전적으로 야생형 (RSV S2 균주) 및 표현형적으로 야생형인 (Merck 균주 287) RSV 균주에 비해 본원에서 설명되는 p17 및 p17_pp 내에 존재하는 아미노산 치환의 위치에 상응한다 (표 6 및 9 참조).
추가의 실시양태에서, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 204의 아미노산 돌연변이는 글루탐산으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 205의 아미노산 돌연변이는 글루탐산으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 211의 아미노산 돌연변이는 알라닌으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 213의 아미노산 돌연변이는 글루탐산으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 221의 아미노산 돌연변이는 글리신으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 223의 아미노산 돌연변이는 글루탐산으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 232의 아미노산 돌연변이는 글리신으로의 돌연변이이고, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 294의 아미노산 돌연변이는 리신으로의 돌연변이이고, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 486의 아미노산 돌연변이는 글리신으로의 돌연변이이고, L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 148의 아미노산 돌연변이는 알라닌으로의 돌연변이이고, L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 2054의 아미노산 돌연변이는 페닐알라닌으로의 돌연변이이다.
또 다른 추가의 실시양태에서, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 204의 아미노산 돌연변이는 Lys204Glu이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 205의 아미노산 돌연변이는 Lys205Glu이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 211의 아미노산 돌연변이는 Thr211Ala이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 213의 아미노산 돌연변이는 Lys213Glu이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 221의 아미노산 돌연변이는 Lys221Gly이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 223의 아미노산 돌연변이는 Lys223Glu이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 232의 아미노산 돌연변이는 Glu232Gly이고, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 294의 아미노산 돌연변이는 Glu294Lys이고, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 486의 아미노산 돌연변이는 Asp486Gly이고, L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 148의 아미노산 돌연변이는 Asp148Ala이고, L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 2054의 아미노산 돌연변이는 Leu2054Phe이다. 일례로서, G 단백질에 대해 사용되는 용어 "Lys204Glu"는 G 단백질의 아미노산 위치 204의 리신 (Lys) 아미노산 잔기가 글루탐산 (Glu) 아미노산 잔기로 치환됨을 나타낸다. 아미노산 잔기 약어는 아래에서 언급된다. 상기 언급된 아미노산 돌연변이는 본원에서 설명되는 p17 및 p17_pp 내에 존재하는 아미노산 치환에 상응한다 (표 6 및 표 9 참조).
다른 실시양태에서, 바이러스 게놈은 언급된 아미노산 돌연변이의 전부 또는 하위세트를 야기하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 상기 실시양태의 약독화된 RSV의 바이러스 게놈은 F 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질 내에서 언급된 아미노산 위치 중 하나 또는 전부에서 아미노산 돌연변이를 야기하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 설명된 바와 같이, 본원에 제시되는 결과는 F 및 L 단백질 내의 돌연변이가 p17 및 p17_pp의 약독화된 표현형에 실질적으로 기여함을 제안한다.
추가의 실시양태에서, 상기 언급된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 야기하는 약독화된 RSV의 바이러스 게놈 내의 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이는 G 유전자의 위치 610, 613, 631, 637, 639, 661, 662, 667, 668, 695 및 696; F 유전자의 위치 880 및 1457; 및 L 유전자의 위치 443 및 6162로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 위치에 위치한다. 상기 실시양태에서, 아미노산 치환을 생성하기 위해 2개의 뉴클레오티드 위치가 돌연변이될 필요가 있을 수 있다. 뉴클레오티드 돌연변이의 위치는 바이러스 게놈 내에 함유된 특정 ORF 내의 그들의 위치에 따라 언급된다. 별법으로, 뉴클레오티드 돌연변이의 위치는 바이러스 게놈 자체 내의 그들의 위치에 따라 언급될 수 있다. 예를 들어, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 610은 RSV 게놈의 뉴클레오티드 위치 5295에 상응한다. 본원에서 설명되는 ORF 내의 특정한 위치의 돌연변이 및 RSV 게놈 내의 그의 상응하는 위치 사이의 관계는 하기 표 6 및 표 9에서 찾을 수 있다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 바이러스 게놈은 NS2 유전자의 위치 327, G 유전자의 위치 630, G 유전자의 위치 654, G 유전자의 위치 666, 및 G 유전자의 위치 675로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 위치에 존재하는 하나 이상의 침묵 뉴클레오티드 돌연변이를 추가로 포함한다. 바이러스 게놈은 NS1 유전자의 뉴클레오티드 위치 162에 침묵 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 바이러스 게놈은 이들 침묵 뉴클레오티드 돌연변이의 전부 또는 하위세트를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 바이러스 게놈은 상기 언급한 모든 뉴클레오티드 돌연변이 (침묵 및 비-침묵)를 포함한다.
다른 실시양태에서, 바이러스 게놈은 약독화되지 않은 또는 불완전하게 약독화된 RSV 균주의 바이러스 게놈에 비해 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 돌연변이는 NS1 유전자의 위치 162, NS2 유전자의 위치 327, G 유전자의 위치 610, 613, 630, 631, 637, 639, 654, 661, 662, 666, 667, 668, 675, 695 및 696, F 유전자의 위치 880 및 1457, 및 L 유전자의 위치 443 및 6162로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 위치에 위치한다. 상기 약독화되지 않은 바이러스 주는 유전적으로 및/또는 표현형적으로 야생형인 RSV일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 바이러스 게놈은 언급된 뉴클레오티드 위치의 전부에 돌연변이를 포함한다.
추가의 실시양태에서, NS1 유전자의 뉴클레오티드 위치 162의 뉴클레오티드 돌연변이는 T260A이고, NS2 유전자의 뉴클레오티드 위치 327의 뉴클레오티드 돌연변이는 G327A이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 610의 뉴클레오티드 돌연변이는 A610G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 613의 뉴클레오티드 돌연변이는 A613G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 630의 뉴클레오티드 돌연변이는 A630G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 631의 뉴클레오티드 돌연변이는 A631G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 637의 뉴클레오티드 돌연변이는 A637G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 639의 뉴클레오티드 돌연변이는 A639G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 654의 뉴클레오티드 돌연변이는 A654G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 661의 뉴클레오티드 돌연변이는 A661G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 662의 뉴클레오티드 돌연변이는 A662G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 666의 뉴클레오티드 돌연변이는 A666G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 667의 뉴클레오티드 돌연변이는 A667G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 668의 뉴클레오티드 돌연변이는 A668G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 675의 뉴클레오티드 돌연변이는 A675G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 695의 뉴클레오티드 돌연변이는 A695G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 696의 뉴클레오티드 돌연변이는 A696G이고, F 유전자의 뉴클레오티드 위치 880의 뉴클레오티드 돌연변이는 G880A이고, F 유전자의 뉴클레오티드 위치 1457의 뉴클레오티드 돌연변이는 A1457G이고, L 유전자의 뉴클레오티드 위치 443의 뉴클레오티드 돌연변이는 A443C이고, L 유전자의 뉴클레오티드 위치 6162의 뉴클레오티드 돌연변이는 G6162T이다. 일례로서, 상기 실시양태의 약독화된 RSV의 NS2 유전자에 대해 사용된 용어 "G327A"는 상기 위치에서 구아닌 뉴클레오티드가 아데닌 (A) 뉴클레오티드로 돌연변이됨을 나타낸다. 티민 및 시토신에 대한 뉴클레오티드 약어는 각각 "T" 및 "C"이다. 바이러스 게놈은 언급된 뉴클레오티드 위치의 전부 또는 하위세트에 뉴클레오티드 돌연변이를 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 또한 약독화되지 않은 또는 불완전하게 약독화된 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 균주의 바이러스 게놈에 비해 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하는 바이러스 게놈을 포함하는 생 약독화 RSV에 관한 것이고, 여기서 상기 하나 이상의 돌연변이는 RSV 게놈의 위치 260, 954, 5295, 5298, 5315, 5316, 5322, 5324, 5339, 5346, 5347, 5351, 5352, 5353, 5360, 5380, 5381, 6538, 7115, 8937 및 14656으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 위치에 위치한다. 상기 언급된 각각의 뉴클레오티드 돌연변이는 본원에서 설명되는 RSV p17 및/또는 p17_pp 균주 내에 존재한다. 추가의 실시양태에서, 상기 변형된 바이러스 게놈은 돌연변이를 언급된 뉴클레오티드 위치 전부에 포함한다.
RSV 단백질을 코딩하는 개방 해독 프레임, 전체 RSV 게놈 서열, 또는 RSV 단백질의 아미노산 서열 내의 특정 위치를 언급할 때, 정확한 위치는 RSV 균주들 사이에서 항원성 하위군 (A 대 B) 및 바이러스 종 (예를 들어, 인간 대 소) 내에서 및/또는 사이에서 근소하게 변할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에서 설명되는 구체적으로 언급된 위치에 상응하는 정확한 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 위치를 확인하기 위해, 그에 의해 다수의 참조 서열이 정렬되는 비교 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 분석을 이용할 수 있다. 따라서, 구체적인 아미노산 또는 뉴클레오티드 위치를 언급하는 선행 실시양태 및 이하의 실시양태 내에, 참조 서열의 서열 정렬 및 분석에 의해 결정할 때 상기 구체적으로 언급된 위치에 상응하는 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 잔기 및/또는 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이 및/또는 아미노산 돌연변이를 포함하는 바이러스 게놈을 포함하는 생 약독화 RSV가 포함된다.
제3 실시양태에서, 본 발명의 생 약독화 RSV의 바이러스 게놈은 야생형 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 단백질에 관련되는 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 각각 서열 88, 2, 8, 14 및 20, 이는 RSV S2 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 단백질 서열에 상응한다)을 포함하고, 여기서 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 단백질 서열은 특정한 바이러스 단백질의 p17 및/또는 p17_pp와 야생형 아미노산 서열 사이를 상이하게 하는 것으로 본원에서 확인된 아미노산 또는 아미노산 돌연변이 중 하나 또는 조합을 함유하고, 상기 관련 서열은 상이하게 하는 아미노산 또는 아미노산 돌연변이 중 하나 또는 조합의 외부의 구역에서 상기 야생형 RSV 단백질 서열과 적어도 95%, 바람직하게는 99% 서열 동일성을 갖는다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 생 약독화 RSV의 바이러스 게놈은 야생형 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 유전자 서열에 관련되는 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 유전자의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 각각 서열 87, 1, 7, 13 및 19, 이는 RSV S2 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 유전자 서열에 상응한다)을 포함하고, 여기서 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 유전자 서열은 특정한 유전자의 p17 및/또는 p17_pp와 야생형 뉴클레오티드 서열 사이를 상이하게 하는 것으로 본원에서 확인된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 돌연변이 중 하나 또는 조합을 함유하고, 상기 관련 서열은 상이하게 하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 돌연변이 중 하나 또는 조합의 외부의 구역에서 상기 야생형 RSV 유전자 서열과 적어도 95%, 바람직하게는 99% 서열 동일성을 갖는다.
제4 실시양태에서, 본 발명에 포함되는 생 약독화 RSV의 바이러스 게놈은 G, F 및/또는 L 단백질을 코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하고, 여기서 상기 단백질(들)은 각각 서열 12, 서열 18 또는 서열 93, 및 서열 24 또는 서열 95에 제시된 아미노산 서열로 구성된다. 서열 12, 18 및 24는 본원에서 설명되는 p17 내의 G, F 및 L 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다 (또한 각각 도 2, 3 및 4 참조). F 및 L 단백질 내의 다형성은 상응하는 언급된 서열 (서열 18 및 24)에 표시된다. 따라서, 추가의 실시양태에서, p17의 F 단백질 (서열 18)의 위치 294는 Lys 잔기이고/이거나 p17의 F 단백질의 위치 486은 Gly 잔기이다. 또 다른 추가의 실시양태에서, p17의 L 단백질 (서열 24)의 위치 148은 Ala 잔기이고/이거나 p17의 L 단백질의 위치 2054는 Phe 잔기이다. 서열 93 및 서열 95는 p17의 플라크 정제된 유도체인 p17_pp 내의 F 및 L 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 이들 서열 내의 다형성은 플라크 정제된 바이러스에서 해명되었고, 서열 93 및 95에 반영된다.
추가의 실시양태에서, 생 약독화 RSV의 바이러스 게놈은 G, F 및/또는 L 단백질을 코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하고, 여기서 단백질(들)은 각각 서열 12, 서열 18 또는 서열 93, 및 서열 24 또는 서열 95에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열로 구성되고, 특정한 바이러스 단백질의 p17 및/또는 p17_pp와 야생형 아미노산 서열 사이를 상이하게 하는 것으로 본원에서 확인된 상기 G, F 및/또는 L 단백질 내의 특정한 아미노산 중 하나 및 조합이 존재한다.
제5 실시양태에서, 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV의 바이러스 게놈은 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 단백질을 코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하고, 여기서 하나 이상의 상기 개방 해독 프레임은 각각 서열 89 또는 서열 90, 서열 5, 서열 11, 서열 17 또는 서열 92, 및/또는 서열 23 또는 서열 94에 제시된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 서열 89, 5, 11, 17 및 23은 각각 본원에서 설명되는 p17 내의 NS1, NS2, G, F 및 L 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. p17의 F 및 L 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 설명된 뉴클레오티드 다형성을 포함한다. 따라서, 추가의 실시양태에서, p17의 F 유전자 (서열 17)의 위치 880은 아데닌 뉴클레오티드이고/이거나 p17의 F 유전자의 위치 1457은 구아닌 뉴클레오티드이다. 또 다른 추가의 실시양태에서, p17의 L 유전자 (서열 23)의 위치 443은 시토신 뉴클레오티드이고/이거나 p17의 L 유전자의 위치 6162는 티민 뉴클레오티드이다. 서열 90, 5, 11, 92 및 94는 p17_pp 내의 NS1, NS2, G, F 및 L 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. p17의 F 및 L 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내의 다형성은 플라크 정제된 바이러스에서 해명되었고, 서열 92 및 94에 반영된다.
추가의 실시양태에서, 생 약독화 RSV의 바이러스 게놈은 각각 서열 90, 서열 5, 서열 11, 서열 17 또는 서열 92, 및/또는 서열 23 또는 서열 94에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 유전자에 상응하는 개방 해독 프레임을 포함하고, 여기서 특정한 바이러스 유전자의 p17 및/또는 p17_pp와 야생형 뉴클레오티드 서열 사이를 상이하게 하는 것으로 본원에서 확인된 상기 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 유전자 내의 특정한 뉴클레오티드 중 하나 또는 조합이 존재한다.
제6 실시양태에서, 선행 실시양태에서 설명된 생 약독화 RSV의 바이러스 게놈은 바이러스 게놈 내에 위치 15046에 시토신, 위치 15046에 돌연변이, 위치 15046에서 시토신으로의 돌연변이, 또는 A15046C의 돌연변이를 추가로 포함한다. 뉴클레오티드 위치 15046은 RSV 게놈의 5' 비번역 구역 내에 위치한다.
제7 실시양태에서, 선행 실시양태에서 설명된 생 약독화 RSV의 바이러스 게놈은 RSV의 약독화를 위해 공지된 유전자 마커에서 추가의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 돌연변이, 또는 RSV, 바람직하게는 인간 RSV에 약독화된 표현형을 부여하는 것으로 공지된 추가의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산을 포함한다. 상기 실시양태는 예를 들어, 화학적 돌연변이 유발, 저온 (cold) 적응, 또는 유전자 재조합 (예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발)에 의해 추가로 약독화된 것으로부터 유래한 균주를 비롯하여, 선행 실시양태에서 설명된 생 약독화 RSV를 전부 포함한다. 따라서, 당업계에 공지된 불완전하게 약독화된 RSV 돌연변이체는 p17 및/또는 p17_pp의 약독화에 기여하는 것으로 본원에서 설명되는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산의 도입에 의해 추가로 약독화될 (예를 들어, 보다 완전하게 약독화될) 수 있다.
제8 실시양태에서, 선행 실시양태에서 설명된 생 약독화 RSV는 RSV의 항원성 하위군 A 또는 B에 속한다. 추가의 실시양태에서, 생 약독화 RSV는 인간 RSV이다.
제9 실시양태에서, 본 발명의 생 약독화 RSV의 바이러스 게놈은 서열 26 또는 서열 91에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 서열 26은 본원에서 설명되는 p17의 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열 26의 뉴클레오티드 위치 6538, 7115, 8937 및 14656은 가능한 다형성을 함유한다. 따라서, 서열 26 내의 위치의 뉴클레오티드는 G 또는 A (위치 6538에 대해), A 또는 G (위치 7115에 대해), A 또는 C (위치 8937에 대해), 및 G 또는 T (위치 14656에 대해)이다. 추가의 실시양태에서, 위치 6538은 아데닌 뉴클레오티드이고/이거나; 위치 7115는 구아닌 뉴클레오티드이고/이거나; 위치 8937은 시토신 뉴클레오티드이고/이거나; 위치 14656은 티민 뉴클레오티드이다. 서열 91은 본원에서 설명되는 p17_pp의 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 추가의 실시양태에서, 생 약독화 RSV는 게놈 전체에 걸쳐, 서열 26 또는 서열 91에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 특정한 바이러스 유전자의 p17 및/또는 p17_pp와 야생형 뉴클레오티드 서열 사이를 상이하게 하는 것으로 본원에서 확인된 특정한 뉴클레오티드 중 하나 또는 조합이 존재한다.
제10 실시양태에서, 본 발명의 생 약독화 RSV는 실질적으로 동일한 물리적/구조적 및 기능적 특성을 모두 갖는 상기 약독화된 RSV에 상응하는, 선행 실시양태에서 설명된 약독화된 RSV 내에 포함된 서열에 실질적으로 유사한 변이체 단백질 및/또는 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 생 약독화 RSV는 엄격한 조건 하에 p17 또는 p17_pp 바이러스 내의 하나 이상의 변형된 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 상보체에 혼성화하는 핵산 분자에 의해 코딩되는 실질적으로 유사한 단백질을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 생 약독화 RSV는 엄격한 조건 하에 p17 또는 p17_pp 바이러스 내의 하나 이상의 변형된 핵산 분자 또는 그의 구역 (코딩 또는 비-코딩)에 혼성화하는 핵산 분자를 포함한다.
제11 실시양태에서, 선행 실시양태에서 설명된 생 약독화 RSV는 생 약독화 RSV의 집단 내에 구성된다. 약독화된 RSV의 집단은 상기 바이러스 집단이 단일 바이러스에 대해 반드시 균질하지는 않음을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 설명되는 바와 같이, 다형성은 본원에 개시된 RSV 균주의 보다 후기의 계대배양에서 발견되었다. 본원에서 설명되는 p17 게놈 내에 4개의 다형성 부위가 존재한다. 따라서, p17로 나타내어 지는 바이러스의 집단은 본원에서 설명되는 고정된 뉴클레오티드 돌연변이 (즉, 비-다형성)뿐만 아니라 4개의 다형성 위치 6538, 7115, 8937 및 14656에서 2개의 가능한 뉴클레오티드 중 하나를 포함하는 게놈을 갖는 상이한 약독화된 바이러스로 구성될 수 있다. RSV 집단은 약독화되지 않은 또는 불완전하게 약독화된 RSV 균주를 본원에서 설명되는 세포 배양액 (하기 실시예 1 참조) 내에서 연속 계대배양함으로써, 비제한적인 예로서 서열 25에 제시된 바이러스 게놈을 갖는 Merck 균주 287을 연속 계대배양함으로써 생성할 수 있다. 바이러스 집단은 적합한 세포 종류 상에서 계대배양함으로써 또는 일련의 하나 이상의 클로닝 단계를 수행함으로써 균질도 또는 실질적인 균질도로 정제할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태는 선행 실시양태에서 설명된 바와 같은 생 약독화 RSV 또는 그의 집단을 포함하고, 여기서 상기 바이러스는 특정한 바이러스 단백질 또는 유전자 (위에서 및 아래에서 상세하게 설명되는)의 p17 또는 p17_pp와 야생형 서열 사이를 상이하게 하는 것으로 본원에서 확인된 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산을 재조합 방법에 의해 약독화되지 않은 또는 불완전하게 약독화된 RSV 균주 내로 포함시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 선행 실시양태에서 설명된 바와 같은 생 약독화 RSV 또는 그의 집단은 하기 실시예 1에 기재되는 방법에 따라 Merck 균주 287 (서열 25에 제시된 게놈 서열을 갖는)을 연속 계대배양하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된다. 따라서, 상기 실시양태는 서열 25에 제시된 바이러스 게놈을 포함하는 약독화되지 않은 RSV 균주를 세포주 (비제한적인 예로서 아프리카 녹색 원숭이 세포주인 Vero CCL-81) 내에서 고정된 감염 다중도 (MOI) (예를 들어, 1:100 내지 1:1000)로 계대배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태는 특정한 바이러스 유전자 또는 단백질 (위에서 및 아래에서 상세하게 설명되는)의 p17 또는 p17_pp와 야생형 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이를 상이하게 하는 것으로 본원에서 확인된 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산을 재조합 방법에 의해 약독화되지 않은 또는 불완전하게 약독화된 RSV 균주 내로 포함시키는 것을 포함하는, RSV를 약독화시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 추가 실시양태는 하기 실시예 1에 기재되는 방법에 따라 Merck 균주 287 (서열 25에 제시된 게놈 서열을 갖는)을 연속 계대배양하는 것을 포함하는, RSV를 약독화시키는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 치료 (예를 들어, 인간 신체의); (b) 의약; (c) RSV 복제의 억제; (d) RSV에 의한 감염의 치료 또는 예방; 또는 (e) RSV-연관 질병(들)의 발병 또는 진행의 치료, 예방 또는 지연을 위해 (i) 사용하기 위해, (ii) 의약품으로서 사용하기 위해, 또는 (iii) 의약품의 제조에서 사용하기 위해 선행 실시양태에서 설명된 하나 이상의 생 약독화 RSV, 그의 집단, 또는 상기 약독화된 바이러스를 포함하는 백신을 포함한다. 이들 용도에서, 약독화된 바이러스 및/또는 백신은 임의로 하나 이상의 항바이러스제와 조합으로 사용될 수 있다.
III . 제약 조성물
본원에서 설명되는 생 약독화 RSV, 또는 상기 생 약독화 RSV를 포함하는 바이러스 집단 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 본 발명에서 제공한다.
따라서, 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV는 또한 허용되는 온도 범위 내에서 저장하는 동안 증가된 안정성을 촉진하면서 생물학적 활성을 유지하도록 돕기 위해 제약상 허용되는 담체와 함께 제형화될 수 있다. 본원에서 사용될 때 용어 "제약상 허용되는 담체"는 당업계에 잘 공지되고 다양한 문헌, 예를 들어 [Remington's Pharmaceutical Sciences]에 설명되어 있는 임의의 적합한 제약상 담체를 포함한다. 가능한 담체는 생리학적 균형 배양 배지, 인산염 완충 염수 용액, 물, 에멀젼 (예를 들어, 수중유 또는 유중수 에멀젼), 다양한 종류의 습윤제, 냉동보호 첨가제 또는 안정화제, 예를 들어 단백질, 펩티드 또는 가수분해물 (예를 들어, 알부민, 젤라틴), 당 (예를 들어, 수크로스, 락토스, 소르비톨), 아미노산 (예를 들어, 글루탐산나트륨) 또는 다른 보호제를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 생성되는 수용액은 그대로 포장될 수 있거나 동결건조된다. 동결건조된 제제는 단일 또는 다수 투여를 위해 투여 전에 멸균 용액과 조합한다. 제형화된 조성물, 특히 액체 제형은 저장하는 동안 분해를 방지 또는 최소화하기 위해 정균제, 예를 들어 비제한적으로 유효 농도 (대체로 ≤1% w/v)의 벤질 알콜, 페놀, m-크레솔, 클로로부탄올, 메틸파라벤, 및/또는 프로필파라벤을 함유할 수 있다. 정균제는 일부 환자에 금기일 수 있고; 따라서, 동결건조된 제형은 그러한 성분을 함유하거나 함유하지 않는 용액 내에 재구성될 수 있다.
제약 조성물은 임의로 숙주의 면역 반응을 향상시키기 위해 어쥬번트 (adjuvant)를 포함할 수 있다. 적합한 어쥬번트는 예를 들어, toll-유사 수용체 효현제, 백반, AlPO4, 알히드로겔, 지질-A 및 그의 유도체 또는 변이체, 오일-에멀젼, 사포닌, 중성 리포좀, 백신과 시토킨을 함유하는 리포좀, 비-이온성 블록 공중합체, 및 케모킨이다. 폴리옥시에틸렌 (POE) 및 폴리옥시프로필렌 (POP)를 함유하는 비-이온성 블록 공중합체, 예를 들어 POE-POP-POE 블록 공중합체가 어쥬번트로서 사용될 수 있다 (Newman et al., 1998, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15:89-142). 이들 어쥬번트는 비-특이적 방식으로 면역계를 자극하는 것을 돕고, 따라서 약품에 대한 면역 반응을 향상시키는 점에서 유리하다.
하나의 특정 RSV 하위군 또는 균주로부터 유래된, 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV는 상이한 하위군 또는 균주로부터 유래된 다른 약독화된 RSV와 조합될 수 있다. 상이한 바이러스는 혼합물로 존재하고 동시에 투여되거나, 따로 투여될 수 있다. RSV의 특정 균주들 사이의 교차-보호 현상 때문에, 하나의 균주를 사용한 면역화는 동일하거나 상이한 하위군의 몇몇 상이한 균주에 대해 보호할 수 있다. 따라서, 본원에서 설명되는 단리된 약독화된 RSV는 다른 비-천연 발생 RSV와 조합되거나, 약독화된 RSV의 집단 내에 존재할 수 있다.
몇몇 경우에, 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV 또는 그의 조성물을 다른 감염물질, 특히 다른 아동기 병을 유발하는 것에 대한 보호 반응을 유도하는 다른 약품 (예를 들어, 백신)과 조합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 설명되는 약독화된 RSV 조성물은 표적 연령군 (예를 들어, 생후 약 1 내지 6개월의 유아)에 대해 ACIP (Advisory Committee on Immunization Practices; http://www.cdc.gov/vaccines/recs/ACIP/default.htm)에서 권장되는 다른 백신과 동시에 (일반적으로 별개로) 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 이들 추가의 백신은 다른 비경구 투여되는 백신을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 따라서, 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV 조성물은 예를 들어, B형 간염 (HepB), 디프테리아, 파상풍 및 백일해 (DTaP), 폐렴구균 (PCV), 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 타입 b (Hib), 소아마비, 인플루엔자 및 로타바이러스에 대한 백신과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
IV . 사용 방법
생 약독화 RSV, 또는 상기 생 약독화 RSV를 포함하는 바이러스 집단을 포함하는 제약 조성물은 RSV 감염 및 그와 연관된 병을 치료하기 위해 대상체를 예방접종하기 위해 유용하다. 본 발명의 범위는 모체 면역화를 포함하는 의미이다.
따라서, 본 발명은 대상체에게 상기 본원에서 설명된 제약 조성물 유효량을 투여함으로써, RSV 감염에 대해 대상체를 예방접종하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 대상체는 동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어 침팬지 또는 인간일 수 있다. 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV를 함유하는 제약 조성물은 RSV 감염 또는 RSV 감염과 연관된 중증 병 (재감염 포함)의 발병에 감수성이거나 달리 위험이 있는 대상체에게 투여되어, 대상체 자신의 면역 반응 능력을 향상시킨다. 특히, 신생아, 혈청음성 및 혈청양성 유아 및 어린 아동, 및 노인에서 RSV 감염의 잠재적으로 심각한 결과 때문에, 이들 개체는 개시된 생 약독화 RSV 조성물로 면역화시키는 것이 유익할 것이다. 따라서, 설명된 약품을 사용한 면역화를 위해 특히 적합한 후보는 유아, 아동, 노인, 및 면역억제 요법을 위한 성인 후보이다. 혈청음성 개체는 하위군 A 또는 B RSV의 이전의 감염의 면역학적 증거를 보이지 않는 개체이다. 혈청양성 개체는 모체로부터 수동적으로 또는 과거의 RSV 감염의 결과로서 검출가능한 RSV 항체를 획득한 개체이다.
본원에서 설명되는 생 약독화 RSV를 포함하는 제약 조성물은 대상체가 야생형 RSV로 후속적으로 감염 또는 재감염될 때 심각한 하부 호흡기도 질병, 예를 들어 폐렴 및 세기관지염에 대해 보호성인 면역 반응의 생산을 도출한다. 자연 순환하는 바이러스는 특히 상부 호흡기도에서 여전히 감염을 유발할 수 있지만, 예방접종 및 야생형 바이러스에 의한 후속 감염에 의한 저항성의 가능한 부양의 결과로서 비염 가능성은 훨씬 감소한다. 예방접종 후에, 시험관 내에서 및 생체 내에서 상동성 (동일한 하위군의) 야생형 바이러스를 중화시킬 수 있는 검출가능한 수준의 숙주 생성 혈청 및 분비형 항체가 존재한다. 많은 경우에, 숙주 항체는 또한 상이한 비-백신 하위군의 야생형 바이러스를 중화시킨다. 예를 들어, 다른 하위군의 이종성 균주에 대한 보다 높은 수준의 교차-보호를 달성하기 위해, 대상체를 두 하위군 A 및 B 모두의 적어도 하나의 우세한 균주로부터의 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV로 예방접종할 수 있다. 따라서, 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV는 항원성 하위군 A 또는 B에 속할 수 있고, 두 하위군으로부터의 바이러스들은 유행하는 RSV 감염에 대해 보다 포괄적인 적용 (comprehensive coverage)를 위한 백신 제형에 조합될 수 있다.
본원에서 설명되는 생 약독화 RSV 및 그의 제약 조성물은 대상체, 바람직하게는 인간에서 RSV에 대한 효과적인 면역 반응을 유도 또는 향상시키기 위해 유효량으로 제공된다. 유효량은 목적하는 면역 반응을 생성하기 위해 바이러스의 일부 성장 및 증식을 허용할 것이지만, RSV-연관 증상 또는 병을 생성하지 않을 것이다. 본원에 제공되는 지침에 기초하여, 당업자는 생 백신에서 사용하기 위해 바이러스의 적합한 양을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 정확한 양은 몇몇 인자, 예를 들어, 대상체의 건강 상태 및 체중, 투여 방식, 바이러스의 약독화 정도, 제형의 성질, 및 대상체의 면역계가 손상되었는지 여부에 따라 결정될 것이다. 한 실시양태에서, 바이러스 투여의 일반적인 범위는 인간 대상체 당 약 103 내지 약 107 플라크 형성 단위 (PFU) 이상의 바이러스, 예를 들어 인간 대상체 당 약 104 내지 약 105 PFU 바이러스이다.
투여는 보호 면역 반응을 자극하는데 효과적인 것으로 밝혀진 형태일 수 있고, 그의 선택은 비경구로, 정맥내로, 경구로, 또는 점막 표면에 국소 도포를 포함할 수 있다. 대부분의 경우에, 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV는 비경구로 투여된다.
본원에서 설명되는 생 약독화 RSV 및 그의 제약 조성물의 단일 또는 다수 투여를 수행할 수 있다. 신생아 및 유아에서, 충분한 수준의 면역성을 도출하기 위해 다수 투여가 요구될 수 있다. 투여는 생애의 제1 개월 내에 시작하고 천연 (야생형) RSV 감염에 대한 충분한 수준의 보호를 유지하기 위해 필요한 대로 아동기 내내 일정 간격으로 지속될 수 있다. 예를 들어, 하나의 가능한 백신 스케줄은 1개월에 최초 투여, 및 2개월, 6개월, 1년 및/또는 2년에 후속 투여로 이루어질 수 있다. 예방접종 빈도는 다른 동시 사용 백신에 대한 현재의 지침과 일치하도록 변형될 수 있다. 유도된 면역성 수준은 중화 분비형 및 혈청 항체의 양을 측정함으로써 모니터링할 수 있고, 목적하는 수준의 보호를 유지하기 위해 필요한 대로 투여량을 조정하거나 예방접종을 반복할 수 있다.
어떠한 경우에도, 백신 제형, 그의 투여 유효량 및 구체적인 투여 방식은 예를 들어 (예를 들어, 상부 및 하부 호흡기 병의 징후 및 증상으로부터 보호에 대해 대상체를 모니터링하면서 반응들을 상호관련시키는) 다른 방법들 중에서 보체 고정, 플라크 중화 및/또는 효소-결합 면역흡착 분석에 의해 결정할 수 있는 바와 같이 항-RSV 면역 반응을 효과적으로 자극, 유도 또는 부양하기 위해 충분한 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV의 양을 제공해야 한다.
V. 생 약독화 RSV 의 생성
본원에서 설명되는 생 약독화 RSV는 생물학적으로 유도되거나 재조합 방식으로 생성될 수 있다. "생물학적으로 유도된 RSV"는 재조합 수단에 의해 생산되지 않은 임의의 RSV를 의미한다 (예를 들어, 계대배양을 통해). "재조합 방식으로 생산된 RSV"는 바이러스 클로닝 기술 (예를 들어, 역유전학 (reverse genetics))를 통해 생성된 임의의 RSV를 의미한다. 생 약독화 RSV는 참조 RSV 서열에 비해 게놈 변이를 포함하고, 여기서 상기 참조 RSV 서열은 야생형 또는 불완전하게 약독화된 RSV로부터 유도될 수 있다.
따라서, 본원에서 설명되는 특정한 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 잔기가 도입되는 RSV 게놈은 유전적으로 및/또는 표현형적으로 야생형인 바이러스 또는 야생형 바이러스의 유도체, 예를 들어 이미 부분적으로 약독화된 바이러스로부터의 것일 수 있고, 이 경우에 새로 혼입된 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 잔기는 균주를 (예를 들어, 예방접종된 대상체에 보호를 부여하기 위해 충분한 면역원성을 보유하면서 포유동물 숙주에서 목적하는 수준의 제한된 복제로) 추가로 약독화시키는 역할을 한다. 생물학적으로 유도된 또는 재조합 방식으로 생성된 하위군 A 또는 B RSV는 예를 들어, 저온-계대배양, 화학적 돌연변이 유발, 또는 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 부분적으로 약독화될 수 있다. 저온-계대배양에 의해 바이러스를 약독화하는 것은 바이러스를 점진적으로 보다 낮은 온도에서 세포 배양액 내에서 계대배양시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 야생형 바이러스는 대개 약 34-37℃에서 배양되는 반면, 부분적으로 약독화된 바이러스는 최적 미만의 온도, 예를 들어, 20-26℃에서 세포 배양액 (예를 들어, 일차 소 신장 세포) 내에서 계대배양함으로써 생산될 수 있다. 화학적 돌연변이 유발에 의해 바이러스를 약독화하는 것은 예를 들어, 문헌 ([Gharpure et al., 1969, J. Virol. 3:414-421] 및 [Richardson et al., 1978, J. Med. Virol. 3:91-100])에 기재된 일반적인 절차에 따라, 예를 들어, 약 10-3 내지 10-5 M, 바람직하게는 약 10-4 M의 농도에서 5-플루오로우리딘 또는 5-플루오로우라실과 같은 돌연변이원의 존재 하에 바이러스의 복제, 또는 약 100 ㎍/ml의 농도에서 니트로소구아니딘에 바이러스의 노출을 포함한다. 다른 화학적 돌연변이원이 또한 사용될 수 있다. 부분적으로 약독화된 RSV는 또한 약독화 돌연변이 (불완전한 약독화 돌연변이임에도 불구하고)를 야생형 RSV의 게놈 내로 혼입시킴으로써 재조합 방식으로 생성될 수 있다. 본원에서 설명되는 바와 같은 추가의 유도체화를 위해 유용한 약독화되지 않은 하위군 A 또는 B 균주로부터 부분적으로 약독화된 돌연변이체를 생산하기 위해 다양한 선택 기술이 조합될 수 있다.
본원에서 설명되는 생 약독화 RSV는 재조합 방법에 의해, 예를 들어, cDNA로부터 생산될 수 있다. 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 변화는 단독으로 또는 조합으로 야생형 또는 부분적으로 약독화된 RSV의 게놈 내로 혼입될 수 있다. 이들 변화는 하기 실시예에 설명되는 생물학적으로 유도된 약독화된 RSV의 목적하는 표현형 특징을 명시할 것이다. 감염성 RSV는 회합된 단백질 및 게놈 RNA를 함유하는 전사하는 복제하는 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid)를 생성하기 위해 필요한 바이러스 단백질과 함께, 생 약독화 RSV의 게놈 또는 항게놈 RNA를 코딩하는 cDNA의 포유동물 세포 내에서 세포내 동시-발현에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Palese, 1995, Trends in Microbiology, 3:123-125]; [Lawson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4477-4481]; [Schnell et al., 1994, EMBO J. 13:4195-4203]) 참조). RSV 항게놈은 자손체 음성-극성 RSV 게놈의 합성을 위한 주형으로서 역할을 하는, 단리된 양성-극성 (positive-sense) 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 따라서, 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 하나 이상의 cDNA로부터 본원에서 설명되는 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산을 갖는 생 약독화 RSV를 생산하는 방법이 또한 본 발명에 포함된다.
상기한 규정된 뉴클레오티드/아미노산 잔기 (단독으로 또는 조합으로)를 감염성 RSV 클론 내로 도입하는 것은 다양한 잘 공지된 방법에 의해 달성할 수 있다. "감염성 클론"은 감염성 바이러스 입자 또는 부바이러스 입자의 게놈을 생산하기 위해 주형으로서 역할을 할 수 있는 게놈 또는 항게놈 RNA 내로 전사될 수 있는 cDNA 또는 그의 생성물 (합성 또는 달리)을 의미한다. 규정된 돌연변이는 통상적인 기술 (예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발)에 의해 RSV 게놈 또는 항게놈의 cDNA 카피 내로 도입될 수 있다. 완전한 항게놈 또는 게놈 cDNA를 조립하기 위한 항게놈 또는 게놈 cDNA 하위단편 (subfragment)의 사용은 각각의 구역이 따로 조작되고 (보다 작은 cDNA는 큰 것보다 조작하기 더 쉽다), 이어서 완전한 cDNA로 쉽게 조립될 수 있는 점에서 유리하다. 이어서, 예를 들어, 돌연변이된 하위단편은 야생형 또는 불완전하게 약독화된 RSV로부터 게놈 또는 항게놈 서열로부터의 그의 상대물 하위단편에 대해 치환될 수 있다. 상대물 하위단편은 선택된 돌연변이된 하위단편과 실질적인 서열 동일성을 공유한다. 따라서, 완전한 항게놈 또는 게놈 cDNA 또는 그의 임의의 하위단편은 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발을 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 이것은 바이오-라드 래보래토리스 (Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 리치몬드)의 뮤타-진(Muta-gene)® 키트를 사용하는 것과 같은 단일 가닥 파지미드 형태의 중간체를 통해, 스트라타젠 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라)의 카멜레온 (Chameleon) 돌연변이 유발 키트와 같은 이중 가닥 플라스미드를 직접 주형으로서 사용하는 방법, 또는 관심있는 돌연변이(들)을 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 주형을 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의해 일어날 수 있다. RSV 게놈 또는 항게놈은 또한 예를 들어, RSV mRNA 또는 게놈 RNA의 역전사된 카피의 중합효소 연쇄 반응 (본원에 참조로 포함되는 문헌 [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego (1990)])에 의해 완전한 항게놈을 응집시키는 것을 나타내는, 클로닝된 cDNA 세그먼트를 조립함으로써 구성될 수 있다. 별법으로, 항게놈 또는 게놈 RNA는 시험관 내에서 합성될 수 있다.
cDNA-발현된 게놈 또는 항게놈으로부터 감염성 RSV를 생산하기 위해, 게놈 또는 항게놈은 (i) RNA 복제를 할 수 있는 뉴클레오캡시드를 생산하고, (ii) 자손체 뉴클레오캡시드가 RNA 복제 및 전사에 적격이 되도록 하기 위해 필요한 RSV 부속 (accessory) 단백질과 동시-발현된다. 게놈 뉴클레오캡시드에 의한 전사는 다른 RSV 단백질을 제공하고, 생산적 감염을 개시한다. 별법으로, 생산적 감염을 위해 필요한 추가의 RSV 단백질은 동시-발현에 의해 공급될 수 있다.
예를 들어, 본원에서 설명되는 생 약독화 바이러스 게놈의 감염성 RSV 클론은 먼저 플라스미드 벡터 내로 혼입될 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서의 후속적인 형질감염 및 발현에 적합한 플라스미드 벡터는 상업적으로 이용가능하다. 이어서, cDNA 카피를 함유하는 플라스미드 벡터는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소를 발현하는 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있다. RSV 주요 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰 (L) 중합효소 단백질, 및 임의로 전사 연장 인자 M2 ORF1 단백질을 발현하는 추가의 플라스미드 벡터가 숙주 세포 내로 동시-형질감염될 수 있다. cDNA는 전사되어 정장 음성-극성 (게놈) RNA를 생산한다. N, L 및 P 단백질, 및 임의로 M2(ORF1) 단백질의 발현은 자손체 바이러스의 합성을 용이하게 한다. 이어서, 비리온이 단리된다. 상기 방법에서, 전사하고 복제하는 뉴클레오캡시드 생성에 필요한 단백질을 코딩하는 보완 서열 (예를 들어, N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질을 코딩하는 서열)의 양성-극성 전사체와 혼성화할 가능성을 최소화하기 위해, 복제성 중간 RNA 또는 항게놈에 상응하는 RSV 게놈의 양성-극성 버전인 cDNA가 제작되는 것이 바람직하다. RSV 미니게놈 시스템을 사용할 때, 게놈 및 항게놈은 RSV에 의해 또는 플라스미드에 의해 보완되든지 구제 (rescue)에서 동등하게 활성이고, 이는 방법론 또는 다른 배경에 따라 게놈 또는 항게놈이 사용될 수 있음을 나타낸다.
N, P, L 및 임의로 M2(ORF1) 단백질은 게놈 또는 항게놈을 코딩하는 것과 동일하거나 별개의 것일 수 있는 하나 이상의 발현 벡터 및 그의 다양한 조합에 의해 코딩될 수 있다. 별개의 벡터에 의해 또는 N, P, L 또는 M2(ORF1) 단백질을 코딩하는 벡터 또는 완전한 게놈 또는 항게놈에 의해 코딩되는 추가의 단백질이 원하는 경우에 포함될 수 있다. 형질감염된 플라스미드로부터 게놈 또는 항게놈 및 단백질의 발현은 예를 들어, T7 RNA 중합효소에 대한 프로모터의 제어 하에 있는 각각의 cDNA에 의해 달성될 수 있고, 이는 다시 T7 RNA 중합효소에 대한 발현 시스템, 예를 들어, T7 RNA 중합효소를 발현하는 우두 바이러스 MVA 균주 재조합체를 사용한 감염, 형질감염 또는 형질도입에 의해 공급된다 (Wyatt et al., 1995, Virology, 210:202-205).
게놈 또는 항게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, cDNA) 및 별개로 N, P, L 및 임의로 M2(ORF1) 단백질은 형질감염, 전기천공, 기계적 삽입, 형질도입 등에 의해 생산적 RSV 감염을 지지할 수 있는 세포, 예를 들어, HEp-2, FRhL-DBS2, MRC, 및 Vero 세포 내로 삽입될 수 있다. 단리된 폴리뉴클레오티드 서열의 형질감염은 예를 들어 인산칼슘-매개 형질감염 ([Wigler et al., 1978, Cell 14:725]; [Corsaro & Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7:603]; [Graham & Van der Eb, 1973, Virology 52:456]), 전기천공 (Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841-845), DEAE-덱스트란 매개 형질감염 (Ausubel et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY (1987)), 양이온성 지질-매개 형질감염 (Hawley-Nelson et al., 1993, Focus 15:73-79) 또는 상업적으로 이용가능한 형질감염 시약, 예를 들어, LipofectACE® (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies))에 의해 배양된 세포 내로 도입될 수 있다. 바이러스 단백질 및/또는 T7 RNA 중합효소는 또한 형질전환된 포유동물 세포로부터, 또는 사전형성된 mRNA 또는 단백질의 형질감염에 의해 제공될 수 있다.
일단 본 발명의 생 약독화 RSV가 생성되면 (예를 들어, 상기한 클로닝 및 구제 실험에 따라), 약독화된 바이러스는 RSV 성장을 허용하는 많은 세포주 내에 전파될 수 있다. RSV는 다양한 인간 및 동물 세포에서 성장한다. 생 약독화 RSV의 전파를 위한 세포주의 예는 DBS-FRhL-2, MRC-5, 및 Vero 세포를 포함한다. 최고 바이러스 수율은 대체로 상피세포주, 예를 들어 Vero 세포에 의해 달성된다. 세포는 대개 약 0.001 내지 약 1.0 이상의 감염 다중도에서 바이러스로 접종되고, 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에, 예를 들어, 약 30-37℃에서 약 3-5일 동안 또는 바이러스가 충분한 역가에 도달하기 위해 필요한 만큼 배양된다. 바이러스는 세포 배양액으로부터 제거되고, 대개 잘 공지된 청정화 절차, 예를 들어, 원심분리에 의해 세포성 성분으로부터 분리되고, 원하는 경우에 당업자에게 잘 공지된 절차를 이용하여 추가로 정제될 수 있다.
본원에서 설명되는 바와 같이 약독화된 RSV는 충분한 약독화, 유전적 안정성 및 면역원성을 확인하기 위해 생체내 및/또는 시험관내 모델에서 시험할 수 있다. 유전적으로 변형된 RSV의 약독화 수준은 예를 들어, 감염된 대상체의 호흡기도에 존재하는 바이러스의 양을 정량하고, 이 양을 표현형적으로 야생형인 RSV (예를 들어, RSV A2, Merck 균주 287)에 의해 생산된 양과 비교함으로써 결정할 수 있다. 약독화된 바이러스는 RSV 감염의 다양한 동물 모델에서 시험할 수 있고, 이는 문헌 [Meignier et al., eds., Amimal Models of Respiratory Syncytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, (1991)]에 요약되어 있다. 예를 들어, RSV 감염의 코튼 래트 모델은 인간에서 약독화 및 효능을 예측하는 것으로서 오랫동안 유지되었다 (미국 특허 4,800,078; [Prince et al., 1985, Virus Res. 3:193-206]; [Prince et al., 1987, J. Virol. 61: 1851-1854]). 마우스를 비롯한 다른 설치류도 또한 유사하게 유용할 수 있고, 이것은 이들 동물이 RSV 복제를 허용하고 인간과 유사한 심부 온도를 갖기 때문이다 ([Wight et al., 1970, J. Infect. Dis. 122:501-512]; [Byrd and Prince, 1997, Clin. Infect. Dis. 25:1363-1368]). 특히, 영장류 모델은 RSV 감염을 연구하기 위한 유전학상 및 면역학상 관련 숙주 시스템이다 (McArthur-Vaughan and Gershwin, 2002, J. Med. Primatol 31:61-73). 예를 들어, 침팬지를 사용한 RSV 감염의 영장류 모델은 인간에서 약독화 및 효능을 예측한다 (예를 들어, 문헌 ([Richardson et al., 1978, J Med. Virol. 3:91-100]; [Wright et al.,1982, Infect. Immun. 37:397-400]; [Crowe et al., 1993, Vaccine 11:1395-1404]) 참조). 또한, 아프리카 녹색 원숭이가 RSV 감염 모델로서 사용되었다 ([Cheng et al., 2001, Virology 283:59-68]; [Kakuk et al., 1993, J. Infect Dis. 167:553-61]; [Weiss et al., 2003, J. Med. Primatol. 32:82-88]). 추가로, 약독화의 시험관내 분석은 인간 기도 상피세포에서 바이러스 성장의 평가를 포함할 수 있다 (Wright et al., 2005, J Virol. 79:8651-8654).
본원에서 설명되는 생 약독화 RSV는 야생형 바이러스의 복제 수준에 비해 고도의 감수성 숙주, 예를 들어 원숭이 및 코튼 래트의 상부 및 하부 호흡기도 모두에서 더 큰 정도의 제한된 복제, 예를 들어 1000배 초과로 더 적은 복제를 가질 것이다. 감염된 숙주의 비인두 내의 RSV 수준을 결정하는 방법은 문헌에 잘 기재되어 있다. 간단히 설명하면, 시료를 비인두 분비물의 흡인 또는 세척에 의해 얻고, 바이러스를 조직 배양액에서 또는 다른 실험 절차에 의해 정량할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Belshe et al., 1977, J. Med. Virology 1:157-162]; [Friedewald et al., 1968, J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694]; [Gharpure et al., 1969, J. Virol 3:414-421]; 및 [Wright et al., 1973, Arch. Ges. Virusforsch. 41:238-247] 참조).
생활력, 약독화 및 면역원성의 기준에 추가로, 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV의 특성은 또한 목적하는 속성이 유지되도록 가능한 안정해야 한다. 이상적으로는, 약품 (예를 들어, 백신)의 일부로서 유용한 바이러스는 그의 생활력, 그의 약독화 특성, 면역화된 숙주에서 복제하는 그의 능력 (보다 낮은 수준이지만), 및 야생형 바이러스에 의한 후속적인 감염에 의해 유발된 심각한 질병에 대해 보호를 부여하기 위해 충분한, 예방접종된 대상체에서 면역 반응의 생산을 효과적으로 도출하는 그의 능력을 유지해야 한다.
VI . 재조합 핵산
본원에서 설명되는 전장 또는 부분적으로 약독화된 RSV 게놈 또는 항게놈을 포함하는 핵산 분자, 본원에서 설명되는 변형된 바이러스 단백질 또는 그의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 본원에서 설명되는 변형된 바이러스 유전자 또는 그의 일부의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 상기 섹션 II 내에서 본 발명의 생 약독화 RSV를 포함한 핵산의 설명을 참조한다)이 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이들 핵산은 데옥시리보핵산 (DNA) 분자, 상보성 DNA 분자 (cDNA), 또는 리보핵산 (RNA) 분자일 수 있다.
4개의 가능한 뉴클레오티드 염기의 "삼중자 (triplet)" 코돈은 60개를 초과하는 변이체 형태로 존재할 수 있다. 이들 코돈은 단지 20개의 상이한 아미노산 (및 전사 개시 및 종료)에 대한 메세지를 제공하기 때문에, 일부 아미노산은 하나 초과의 코돈에 의해 코딩될 수 있다 (코돈 중복 (redundancy)으로 알려진 현상). 따라서, 유전자 코드의 이러한 축퇴 (degeneracy)로 인해, 특정 단백질을 코딩하기 위해 매우 많은 상이한 코딩 핵산 서열이 사용될 수 있다. 아미노산은 다음 RNA 코돈에 의해 코딩된다:
A=Ala=알라닌: 코돈 GCA, GCC, GCG, GCU
C=Cys=시스테인: 코돈 UGC, UGU
D=Asp=아스파르트산: 코돈 GAC, GAU
E=Glu=글루탐산: 코돈 GAA, GAG
F=Phe=페닐알라닌: 코돈 UUC, UUU
G=Gly=글리신: 코돈 GGA, GGC, GGG, GGU
H=His=히스티딘: 코돈 CAC, CAU
I=Ile=이소류신: 코돈 AUA, AUC, AUU
K=Lys=리신: 코돈 AAA, AAG
L=Leu==류신: 코돈 UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M=Met=메티오닌: 코돈 AUG
N=Asn=아스파라긴: 코돈 AAC, AAU
P=Pro=프롤린: 코돈 CCA, CCC, CCG, CCU
Q=Gln=글루타민: 코돈 CAA, CAG
R=Arg=아르기닌: 코돈 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S=Ser=세린: 코돈 AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T=Thr=트레오닌: 코돈 ACA, ACC, ACG, ACU
V=Val=발린: 코돈 GUA, GUC, GUG, GUU
W=Trp=트립토판: 코돈 UGG
Y=Tyr=티로신: 코돈 UAC, UAU
따라서, 본 발명은 개시된 핵산 분자와 상이하지만 동일한 단백질 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다.
본 발명의 RSV의 비-코딩 서열 (즉, 비번역된 서열)을 포함하는 핵산 분자도 또한 본 발명에 포함된다. 이들 비-코딩 구역은 바이러스 게놈의 5' 비-코딩 구역, 3' 비-코딩 구역, 유전자간 서열, 및 전사, 번역, 및 다른 조절 구역을 포함하고 이로 제한되지 않는 다른 비-코딩 구역을 포함한다. 이들 핵산 분자는 또한 DNA 분자, cDNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.
본 발명은 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV의 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 유전자를 포함하고 이로 제한되지 않는, 본 발명의 생 약독화 RSV의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 실질적으로 유사한 핵산 분자를 추가로 포함한다. RSV 바이러스 게놈 내로 혼입될 때, 상기 NS1, NS2, G, F 및/또는 L 유전자는 동일한 약독화된 표현형 효과를 생성할 것이다. 본 발명은 또한 그로부터 생산된 생성되는 바이러스의 표현형을 변경시키지 않는, 비-코딩 구역의 변화를 특징으로 하는 실질적으로 유사한 핵산 분자를 포함한다.
따라서, 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV 내에 포함된 단백질의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV 내에 포함된 비-코딩 뉴클레오티드 서열의 변이체를 포함하는 핵산 분자는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
엄격한 조건 하에 본 발명의 핵산 분자의 상보체에 혼성화하는 하나 이상의 지시된 뉴클레오티드를 함유하는 핵산 분자가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 비제한적인 예로서, 고엄격성의 조건을 이용하는 절차를 설명한다. DNA를 함유하는 필터 (filter)의 예비혼성화는 6x SSC, 5x 덴하르트 (Denhardt) 용액 및 100 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA로 이루어진 버퍼 내에서 약 65℃에서 약 2시간 내지 철야로 수행한다. 필터를 100 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA 및 5-20 x 106 cpm의 32P-표지된 프로브를 함유하는 예비혼성화 혼합물 내에서 65℃에서 약 12 내지 48시간 동안 혼성화시킨다. 필터의 세척은 2x SSC, 0.1% SDS를 함유하는 용액 내에서 37℃에서 약 1시간 동안 수행한다. 이어서, 0.1x SSC, 0.1% SDS 내에서 50℃에서 45분 동안 세척한 후 자가방사선촬영을 수행한다. 고엄격성의 조건을 이용하는 다른 절차는 5x SSC, 5x 덴하르트 용액, 50% 포름아미드 내에서 약 42℃에서 약 12 내지 48시간 동안 수행된 혼성화 단계, 또는 0.2x SSPE, 0.2% SDS 내에서 약 65℃에서 약 30 내지 60분 동안 수행된 세척 단계를 포함할 것이다. 고엄격성 혼성화를 수행하기 위한 상기한 절차에서 언급된 시약은 당업계에 잘 공지되어 있다. 이들 시약의 조성에 대한 상세한 내용은 문헌 ([Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989)] 또는 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (2001)]에서 찾을 수 있다. 상기한 것에 추가로, 사용될 수 있는 고엄격성의 다른 조건은 또한 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 핵산 분자는 RNA 전사의 프로모터 및 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본원에서 사용될 때 용어 "작동가능하게 연결된"은 프로모터가 핵산 분자에서 RNA의 전사를 유도할 방식으로 배치됨을 의미한다. 프로모터의 한 예는 T7 프로모터이다. 그에 대해 삽입된 조각의 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결되는 프로모터 및 클로닝 부위를 모두 함유하는 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있다. 이들 벡터는 시험관 내에서 및 생체 내에서 핵산을 전사할 수 있다. 그러한 벡터의 예는 본원에서 설명되는 생 약독화 RSV의 폴리펩티드 및/또는 비-코딩 구역을 코딩하는 핵산 구역을 다른 RSV 종류의 핵산을 위해 치환함으로써 변형된, 다른 RSV 종류 (다른 약독화된 하위형 및 야생형 균주를 모두 포함)의 바이러스 게놈으로부터 유래한 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자에 의해 코딩되는 재조합 바이러스가 추가로 제공된다.
본 발명의 상이한 특징을 추가로 설명하는 실시예를 아래에 제공한다. 실시예는 또한 본 발명을 실시하기 위해 유용한 방법론을 예시한다. 이들 실시예는 청구된 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
MRK RSV 균주 287의 계대배양
세포 및 바이러스 - 바이러스 배출량 (output)을 모니터링하기 위해 바이러스 성장 연구 및 플라크 분석 모두를 위해 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 Vero CCL-81을 사용하였다. 사용된 모 바이러스는 -20℃에서 동결건조 저장된 Merck 287 균주 hRSV이었다. 모 Merck 287 바이러스를 GMK 세포 내에서 2회 계대배양한 후, WI-38 세포 내에서 5회 추가 계대배양하였다 ([Bunyak et al., 1978, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 157:636-642]; [Bunyak et al., 1979, Proc. Soc. Exp. Biol. Med 160:272-277]; [Belshe et al., 1982, J. Infect. Dis. 145:311-319]). 서열 분석에 의해, 이는 약독화와 연관된 모든 공지된 위치에서 야생형 유전자형을 보유하는 것으로 확인되었다.
바이러스 계대배양 및 바이러스 원액 제조 - 모 바이러스를 사용하여 주령 융합 (confluent) Vero 단층을 1:100 또는 1:1000 MOI에서, 32℃에서 1 hr 부착; 부착 후에 WM's 배지 E (깁코 ( Gibco)), 1.6% 재조합 인간 알부민 (델타 바이오테크놀로지스 (Delta biotechnologies)), 2 mM L-글루타민 (깁코) 및 50 ㎍/ml 네오마이신 (시그마 (Sigma))으로 이루어진 유지 배지를 사용한 오버레이 (overlay)로 감염시켰다. 배양액을 최대 세포병변 효과 (CPE) >90%에 대해 관찰하고, 수거하고, CPE가 최적 바이러스 배출량을 위해 너무 진행될 때까지 24 hr 간격으로 추가의 수거를 위해 재-공급하였다.
플라크 분석 - 수거된 바이러스 샘플을 플라크 분석을 통해 연속 10배 희석에서 적정하고, 연속 10배 희석의 희석 당 삼중으로, 총 플레이트당 4개 희석으로 12-웰 분석 포맷 (코스타 (Costar))에서 100 ㎕/웰로 융합 (48-72 hr) VERO 단층을 접종하기 위해 사용하였다. 플레이트를 35℃±1℃ + 5.0% CO2에서 1시간 동안 인큐베이팅하고, WM's 배지 E (깁코), 1.6% 재조합 인간 알부민 (델타 바이오테크놀로지스), 2 mM L-글루타민 (깁코) 및 50 ㎍/ml 네오마이신 (시그마), 및 0.5% 최종 농도의 SeaPlaque® 아가로스로 이루어진 유지 배지로 오버레이하였다. 플라크를 6-8일 동안 35℃±1℃ + 5.0% CO2에서 발생시켰다. 플라크는 250 ㎕/웰의 PBS 중 5 mg/mL MTT (티알졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드; 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)®)을 첨가하고 세포가 염료를 대사하도록 2-6시간 동안 대기함으로써 가시화하였다. 바이러스 수율을 모니터링하기 위해서뿐만 아니라, 바이러스의 후속적인 계대배양을 위한 MOI에 대한 적절한 희석을 계산하기 위한 역가를 정확하게 측정하기 위해서 계대배양 사이에 모든 수거물에 대해 역가를 얻었다.
결과 - Merck HRSV 균주 287은 먼저 GMK 세포 내에서 2회 증폭시킨, 단리된 hRSV 균주로부터 유도된다. 초기 증폭 후에, 바이러스를 인간 이배체 세포주 WI-38 내에서 5회 추가의 계대배양시켰다. 상기 계대배양 5 물질을 비경구 투여 경로를 통한 백신 사용에 대한 인간 임상 시험에서 사용하였다. Merck 균주 287, hRSV A형은 서열 분석에서 및 생체내 동물 흘림 실험 (하기 참조)에서 모두 야생형 (WT) 표현형을 보였다. Merck 균주 287을 VERO-CCL-81 단층에서 고정된 다중도에서 22회 (계대배양 1 (p1) - 계대배양 22 (p22)) 연속 계대배양하였다. 바이러스 역가는 계대배양에 걸쳐 변함없이 유지되고, 배양액 내에서 바이러스의 세포병변 효과는 또한 일관되게 유지되었다. 바이러스 수율은 106-107 pfu/ml 범위 내에 있었다.
실시예 2
MRK RSV 균주 287의 서열결정 및 계대배양된 바이러스 원액
RSV 샘플 - 물질을 감염된 VERO 세포로부터 수거된 바이러스 상등액의 500-1000 ㎕ 분취액 내에 공급하였다. 1) MRK RSV 균주 287; 2) MRK RSV 균주 287, 계대배양 17 ("p17"); 및 3) MRK RSV 균주 287, 계대배양 22 ("p22")에 대한 전장 서열을 생성하였다. 1) MRK RSV 균주 287, 계대배양 5 ("p5"); 2) MRK RSV 균주 287, 계대배양 10 ("p10"); 3) MRK RSV 균주 287, 계대배양 15 ("p15"); 및 4) MRK RSV 균주 287, 계대배양 18 ("p18")에 대한 부분 (표적화된) 서열을 생성하였다.
RNA 추출 - 제조자의 프로토콜에 따라 QiaAMP 바이러스 RNA 추출 키트 (퀴아젠 (Qiagen), cat. no. 52904)를 사용하여 바이러스 배양 상등액으로부터 RNA를 추출하였다. 간단히 설명하면, 140 ㎕의 바이러스 배양 상등액을 용해 버퍼에 첨가하고, 결합 필터 상에 로딩하고, 세척하고 60 ㎕의 RNase가 없는 물 내에서 용출시켰다. 추출된 RNA 샘플을 -20℃에서 저장하였다. 추출된 RNA 샘플을 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 이중 가닥 DNA 단편으로 게놈의 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. RT-PCR 증폭을 위한 충분한 물질을 얻기 위해 각각의 샘플의 다수 추출을 수행하였다.
RT - PCR 에 의한 RSV 게놈의 증폭 - 퀴아젠 OneStep RT-PCR 키트 (퀴아젠, cat. no. 210212)를 사용하여 샘플의 RSV 게놈을 이중 가닥 DNA로 증폭시켰다. 전장 서열결정 (MRK RSV 287 및 계대배양 P17 및 P22)을 위해, 1000 염기쌍 (bp) 단편의 30회 증폭을 수행하였고, 여기서 각각의 단편은 인접한 단편과 약 500 bp 겹친다. 증폭 반응은 1 내지 30 (프라이머쌍에 대해)으로 번호를 매기고, 아래 나열한 바와 같이 수행하였다. 부분 길이 서열 결정 (MRK RSV 287 계대배양 P5, P10, P15 및 P18)을 위해, 프라이머쌍 2, 10, 11, 13, 14, 18, 및 29를 사용하여 1000 염기쌍 (bp) 단편의 7회 증폭을 수행하였다. 증폭 반응은 그에 따라 (프라이머쌍에 대해) 번호를 매기고, 아래 나열한 바와 같이 수행하였다.
마스터 믹스 (Master Mix) (반응에 따라): 10 ㎕ 5X 퀴아젠 OneStep RT-PCR 버퍼; 2 ㎕ dNTP 믹스; 3 ㎕ 프라이머 A (정방향 프라이머) - 10 μM 원액, 600 nM 최종; 3 ㎕ 프라이머 B (역방향 프라이머) - 10 μM 원액, 600 nM 최종; 2 ㎕ 퀴아젠 OneStep RT-PCR 효소 믹스; 5 ㎕ RNA 주형; 25 ㎕ 분자 생물학 등급 물.
증폭 반응은 다음 조건으로 Biometra 써모사이클러 (thermocycler)에서 수행하였다: 30분, 50℃ - 역전사 단계; 15 min, 95℃ - 초기 PCR 활성화 단계 (DNA 중합효소 활성화) 3-단계 사이클링 (총 40 사이클로 반복함); 1 min, 94℃ - 변성; 1분, 55℃ - 어닐링 (annealing); 1분, 72℃ - 연장; 10 min, 72℃ - 최종 연장.
RT-PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머를 표 2 및 3에 나열한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
증폭된 RT-PCR 생성물은 제조자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 QIAquick PCR 정제 키트 (퀴아젠, cat. no. 28104)를 사용하여 정제하였다. 정제된 RT-PCR 생성물을 1 내지 30 (프라이머쌍에 기초하여)으로 번호를 매기고, -20℃에서 저장하고, 서열결정을 위해 젠위즈 (GeneWiz, 미국 뉴저지주 사우쓰 플레인필드)로 수송하였다.
증폭된 RT - PCR 생성물의 서열결정 - 정제된 RT-PCR 생성물은 염료-종결 서열결정을 위해 젠위즈 (미국 뉴저지주 사우쓰 플레인필드)에 제출하였다. 서열결정은 RT-PCR 생성물과 함께 제출된 RT-PCR 증폭 프라이머를 사용하여 수행하였다. 각각의 RT-PCR 생성물에 대해, 2개의 서열을 생성하였고, 하나는 정방향 프라이머를 사용하고, 다른 하나는 역방향 프라이머를 사용하였다.
RT - PCR 생성물 서열 분석 및 RSV 게놈 조립 - 생성된 RT- PCR 단편 서열을 Sequencher™ 서열 분석 소프트웨어 (GeneCodes, Ann Arbor, Michigan)로 임포팅 (importing)하고, "contig" 조립을 수행함으로써 서열을 조립하였다. 이것은 스캐폴드 (scaffold)로서 500 bp 오버랩 (overlap) 구역을 사용하여, 모든 60개 RT-PCR 생성물 서열 (30개 생성물 각각에 대해 2개 서열)의 임포팅 및 전장 서열의 조립으로 이루어진다. 서열을 일반적으로 인정되는 실무를 이용하여 관계없는 손실된 피크에 대해 편집하였다. 완결된 서열을 파스타-포맷팅 (fasta-formatted) 파일로서 엑스포팅 (exporting)하고, 비교 및 서열 분석을 위해 VectorNTI™으로 임포팅하였다. p5, p10, p15, 및 p18의 표적화된 서열결정을 위해, 전장 게놈 조립보다는 개별 단편 조립을 수행하였다 (즉, 단편 2, 10, 11 등). 최종 서열을 VectorNTI™으로 임포팅하고, 서열 비교 및 분석을 수행하였다.
결과 - 원래의 공급 물질 (MRK 287), 및 계대배양 17 (p17) 및 계대배양 22 (p22)에 대해 전장 게놈 서열을 생성하였다. 추가의 계대배양 수준의 표적화된 서열은 계대배양 5 (p5), 10 (p10), 15 (p15) 및 18 (p18)에 대해 수득하였다. 바이러스 RNA를 배양 상등액 샘플로부터 추출하고; 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 RNA로부터 게놈의 이중 가닥 DNA 단편을 생성하고; RT-PCR 생성물을 정제하고 서열 결정하고; 생성된 서열을 전장 바이러스 게놈으로 조립하였다.
다음 비교 및 분석을 수행하였다:
1) 다른 RSV 서열에 대해 MRK RSV 287의 서열-관련성을 결정하기 위해, MRK RSV 287 균주 서열의 상동성 "blast" 분석을 일반적인 데이타베이스 (Genbank, EMBL)에서 공지의 서열결정에 대해 수행하였다.
2) 원래의 MRK RSV 균주 287 및 p17 사이의 서열 차이를 결정하기 위해, MRK RSV p17에 대한 MRK RSV 287 균주의 서열 정렬.
3) 2개의 샘플 사이에서 핵산 서열 차이와 연관된 아미노산 서열 차이 (존재하는 경우에)를 결정하기 위해, 원래의 MRK RSV 균주 287 및 p17 사이에서 임의의 서열 차이의 아미노산 분석.
4) 추가의 점 돌연변이가 바이러스 게놈 내에 다른 곳에서 획득되는지 결정하기 위해, MRK RSV 균주 287 p17 및 p22 사이에서 서열 차이를 결정하기 위해 MRK RSV p22에 대한 MRK RSV 287 균주 p17의 서열 정렬.
5) 증가하는 계대배양 수준에 따라 점 돌연변이의 획득 및 약독화의 가능한 마커를 이해하기 위해서, 원래의 MRK RSV 균주 287 및 연관된 계대배양된 물질 사이에서 서열 차이를 결정하기 위해 MRK RSV 균주 287 및 p5, p10, p15, p17, p18 및 p22로부터 유전자 세그먼트 2, 10, 11, 13, 14, 18 및 29의 비교.
서열 분석의 결과를 아래에 요약한다:
1) MRK RSV 균주 287 서열 분석 - MRK RSV 균주 287과 RSV의 공지의 야생형 및 백신 균주의 비교 (표 4에 나열됨)는 MRK RSV 287이 약독화 마커로서 이전에 확인된 점 돌연변이를 함유하지 않음을 나타낸다 (데이타를 제시하지 않음). MRK RSV 균주 287은 15,205 뉴클레오티드의 서열을 생성하였다. 계대배양 17 및 22는 15,000 뉴클레오티드를 생성하였고, 여기서 극단 5' 단부가 손실된다. MRK RSV 균주 287은 공지의 RSV 하위군 A 균주와 유사하였고, 상동성 스코어가 95%를 초과하였다.
Figure pct00006
2) MRK RSV 균주 287 및 계대배양 17 서열의 비교 - MRK RSV 균주 287 및 p17로부터의 게놈 서열의 비교는 2개의 서열 사이에 21개의 서열 차이 (점 돌연변이)가 존재함을 나타낸다. 서열 차이의 요약을 표 5에 나열한다.
Figure pct00007
3) MRK RSV 균주 287 및 계대배양 17 아미노산 서열의 비교 - 원래의 MRK RSV 균주 287 서열에 비교한 p17 내의 각각의 확인된 점 돌연변이의 유전자 위치를 매핑하고 (mapping), 점 돌연변이를 함유하는 각각의 유전자에 대한 아미노산 서열을 생성하였다. 21개의 점 돌연변이 중에서, 1개는 5' 비번역 구역 (바이러스 L 유전자에 대해 3') 내에 있고, 20개는 개방 해독 프레임 (바이러스 유전자) 내에 있다. 20개의 개방 해독 프레임 (ORF) 돌연변이 중에서, 5개는 침묵이고, 나머지 15개는 3개의 유전자 내에 11개의 아미노산에 영향을 미친다. 3개의 영향을 받은 ORF는 G (당단백질), F (융합 단백질) 및 L (큰 단백질, RNA 의존성 RNA 중합효소) 단백질을 코딩한다. 1개의 침묵 돌연변이는 NS2 유전자 ORF5에서 발생하고, 4개의 침묵 돌연변이는 G 유전자 ORF에서 발생한다. 서열 차이의 요약을 표 6에 나열한다.
Figure pct00008
4) MRK RSV p22 에 대한 MRK RSV p17 의 서열 정렬 - p17 및 p22 사이의 서열 비교로 2개의 서열이 동일한 것을 밝혔다. 뉴클레오티드 위치 번호 14656에서 다형성 수준에서 가능한 차이가 존재하지만, 이것은 정량되지 않았다.
5) MRK RSV 균주 287 및 계대배양 5, 10, 15, 17, 18 및 22로부터 유전자 세그먼트 2, 10, 11, 13, 14, 18 및 29의 비교 - MRK RSV 균주 287 계대배양 p5, p10, p15 및 p18의 선택된 유전자 세그먼트로부터 서열을 생성하였다. 이들 서열을 MRK RSV 균주 287, 및 MRK RSV 균주 계대배양 17 및 계대배양 22에 비교하였다. 표 7은 RSV p17 점 돌연변이의 이전에 확인된 부위에서 서열의 비교이다. 제시된 데이타로부터, 침묵 NS2 돌연변이는 5번째 계대배양에 의해 획득된 한편, G 유전자 돌연변이는 10번째 계대배양에서 존재함이 명백하다. F 및 L 유전자에서 돌연변이는 계대배양 10에서 나타나기 시작하였고, 모든 점 돌연변이의 증거는 계대배양 17에서 존재한다. 위치 14656에서 다형성는 여전히 명백하지만, 다른 다형성의 존재는 논의 중이다. 표 7은 분석된 다양한 계대배양 수준의 비교를 요약한 것이다.
Figure pct00009
실시예 3
MRK RSV 287 계대배양된 균주의 약독화
아프리카 녹색 원숭이 챌린지 연구 - 모든 동물을 혈청중화 항체 역가에 대해 예비스크리닝하였다. 역가≤4인 동물만을 본 연구에서 사용하였다. 원숭이를 10 mg/kg 케타민으로 근육내로 사용하여 마취시키고, 2가지 용량의 각각의 105.5 pfu의 바이러스로 챌린징하였다. 바이러스는 조합된 코 안 및 기관내 접종에 의해 용량 당 각각의 부위에서 1 ml로 투여하였다. 챌린지 후에, 비인두 스왑 (swab)을 연속 12일 동안 각각의 원숭이로부터 매일 수집하고, 제4, 5, 7, 및 10일에 기관지폐포 세척액을 수집하였다. 비인두 샘플은 다르콘 (Darcon) 스왑을 사용하여 구인두 구역의 2-3개 영역을 부드럽게 문지르고, 끝 (tip)을 0.2 M 수크로스, 3.8 mM KH2PO4, 7.2 mM K2PO4 및 4.4 mM 글루탐산일나트륨 (SPG)을 포함하는 행크스 (Hanks) 균형 염 용액 (HBSS) 및 0.1% 젤라틴을 함유하는 용액 내에 넣어서 수집하였다. 기관지폐포 세척액에 대해, 약 5-7 ml HBSS를 폐에 직접 주입하고, 멸균 French 카테터 및 시린지 (syringe)를 통해 흡인하였다. 회수된 샘플에 1/10 부피의 10x SPG 및 1/10 부피의 1% 젤라틴을 보충하고, 분취하고, 즉시 -70℃에서 동결 저장하였다.
코튼 래트 챌린지 연구 - 4마리의 8주령 암컷 코튼 래트 (시그모돈 히스피두스 (Sigmodon hispidus))에게 제0일에 0.1 ml 부피에서 105.5 pfu의 바이러스를 코 안에 접종하였다. 접종 4일 후에 폐 (좌엽) 및 비갑개를 제거하고, 얼음 상에서 SPG를 함유하는 행크스 균형 염 용액 (미국 매릴랜드주 워커스빌) 10 부피 내에 균질화하였다. 샘플을 2000 rpm에서 10분 동안 원심분리에 의해 청정화하고, 분취하고, 즉시 -70℃에서 동결 저장하였다.
바이러스 적정 - 바이러스 역가는 Hep-2 세포 상에서 결정하였다. 간단히 설명하면, 연속 희석으로 시험 샘플을 제조하였다. 0.1 ml의 샘플을 융합 Hep-2 세포를 함유하는 24-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 웰 당 MEM 내의 1% 아가로스 0.5 ml로 덮고, 37℃에서 4일 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후에, 아가로스 오버레이를 제거하고, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 바이러스 플라크를 계수하였다. 바이러스 역가는 조직 1 g당 플라크 형성 단위 (pfu)로서 표현하였다.
바이러스 중화 분석 - 바이러스 중화 분석을 위해, 모든 혈청을 56℃에서 30분 동안 열-불활성화시켰다. 시험 혈청은 이글 (Eagle) 최소 필수 배지 (EMEM) 내에 연속 2배 희석액으로 제조하고, 인큐베이팅하였다. 야생형 A2 바이러스는 표적 바이러스로서 사용하고, EMEM 내에 103 pfu/ml의 최종 역가로 희석하였다. 동일 부피의 혈청 및 바이러스를 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후에, 0.1 ml의 바이러스를 24-웰 플레이트의 웰에 옮기고, 이어서, 상기한 바와 같이 바이러스 플라크 분석을 수행하였다. 중화 역가는 바이러스 플라크의 >50% 감소를 유도한 최고 희석으로서 정의된다.
결과 -
1) MRK 287 p17 은 코튼 래트 및 아프리카 녹색 원숭이에서 고도로 약독화된다 - 생체내 복제 특성을 평가하기 위해, 코튼 래트 및 아프리카 녹색 원숭이 챌린지 모델에서 p17 바이러스를 그의 모 p3 바이러스 및 wt A2 균주와 비교하였다. 코튼 래트 및 비-인간 영장류 연구로부터의 데이타는 종합적으로 p17 바이러스가 고도로 약독화됨을 제안한다.
코튼 래트 연구에서, 군당 6마리의 동물에게 105.5 pfu의 시험 바이러스를 코 안에 접종하고; 챌린지의 4일 후에, 코 및 폐 샘플을 수집하고 바이러스 적정에 사용하였다 (도 5). 모 p3 바이러스는 완전히 복제 적격인 것으로 밝혀졌고, 여기서 코 및 폐 조직 모두에서 약 5 로그의 바이러스를 수득하였다. 코 내의 역가는 wt A2 균주의 것에 대등하였지만, 폐에서는 약 1 로그 더 낮았다. 이와 반대로, p17 바이러스의 복제는 제한되었다. 분석 검출 하한 (조직 1 g당 40 pfu)에 기초하여 코에서는 바이러스가 회수되지 않았고, 폐 바이러스는 4마리의 동물 중 1마리에서만 검출되었다. 상기 동물의 바이러스 역가는 또한 낮았고, 즉, 조직 1 g당 200 pfu이었다. 모 p3 바이러스에 비해, p17은 코 및 폐에서 각각 적어도 4- 및 2.5-로그 더 낮은 역가를 가졌다.
아프리카 녹색 원숭이 연구에서, 군당 4마리의 동물에게 총 2 x 105.5 pfu의 바이러스를 접종하였고, 이 중 절반은 코 안 접종에 의해, 다른 절반은 기관내 접종에 의해 투여하였다. 챌린지 후 다양한 시점에, 비인두 스왑 및 폐 세척액을 수집하고, 바이러스 적정을 위해 사용하였다. 결과를 도 6에 제시한다. 코튼 래트에서와 일치하게, 모 p3 바이러스는 코 및 폐 모두에서 유의한 바이러스 복제를 보였고, 여기서 피크 역가는 코 및 폐에서 약 104 및 105 pfu/ml이었다. 추가로, 그의 총 바이러스 흘림 프로필은 wt A2 바이러스와 다소 유사하였고, 여기서 역가는 제4일 내지 제7일 피크에 도달하고 약 10일 지속하였다. 이와 반대로, p17 바이러스는 단지 산발적으로 낮은 역가로 검출되었다. 예를 들어, 코 바이러스는 제2일에 2마리의 원숭이에서 및 제8일에 1마리의 원숭이에서만 검출되었고, 폐 바이러스는 제2, 3 및 7일에 각각 1마리, 3마리 및 1마리의 원숭이에서 검출되었다. 모든 양성 샘플 사이에서, 제2일 코 샘플 중 하나의 것인 최고 역가는 조직 1 g당 400 pfu이었다.
바이러스 계대배양 및 생체내 복제 사이의 관계를 보다 잘 이해하기 위해, 코튼 래트 모델에서 MRK 287 바이러스를 p17 이전의 계대배양에서 또한 시험하였다. 군당 6마리의 동물에게 105 pfu의 바이러스를 챌린징하고, 샘플을 챌린지 후 제4일에 수거하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, 계대배양 5 (p5)의 바이러스는 이미 감소된 복제를 보이기 시작하고, 계대배양 10 (p10) 및 15 (p15)의 바이러스는 복제의 추가 감소를 보였다. p15 바이러스는 상기 설명되는 p17 바이러스만큼 약독화된 것으로 보인다 (도 5).
p17 바이러스는 폐에서 회수되지 않았고, 코 샘플에서 검출되기는 하였지만 모 p3 바이러스보다 역가가 > 3 로그 더 낮았다.
2) MRK287 p17 백신 바이러스를 사용한 단일 근육내 면역화는 코튼 래트 및 아프리카 녹색 원숭이에서 강한 혈청중화 ( SN ) 항체 반응을 유도하고, wt 바이러스 챌린지에 대해 유의한 보호를 부여한다 - 코튼 래트 및 아프리카 녹색 원숭이 모두에서 면역원성 및 보호 연구를 수행하였다. 데이타는 약독화된 백신 균주 MRK287 p17을 사용한 단일 전신 면역화가 동물 모델에서 유의한 SN 역가를 유도하고 wt 바이러스 챌린지에 대해 보호를 부여할 수 있음을 입증한다.
코튼 래트 연구를 위해, 군당 4마리의 동물을 104.5 pfu의 wt A2, MRK287 p3, 또는 MRK287 p17 바이러스로 근육내 면역화시켰다. 혈액 샘플을 제14, 28, 및 56일에 수집하고, wt A2 바이러스에 대한 혈청중화 (SN) 항체 결정을 위해 사용하였다. 제56일에, 면역화된 동물 및 나이브 (naive) 동물의 군 모두에 105.5 pfu의 wt A2 바이러스를 코 안에 챌린징하고, 챌린지 후 제4일에 코 및 폐 조직을 수집하였다. 3개의 모든 바이러스를 사용한 단일 근육내 면역화는 유의한 SN 역가를 유도하였고, 이는 약 제28일에 피크 수준에 도달하고 동물에게 챌린징하는 제56일까지 지속하였다 (도 8). A2 바이러스를 투여한 동물은 MRK 287 바이러스를 투여받은 동물보다 더 높은 SN 역가를 보였다. 이것은 SN이 A2 균주에 대해 결정되었다는 사실로 인한 것일 수 있다. 모 MRK287 p3 바이러스를 투여한 동물 및 p17 바이러스를 투여한 동물의 SN 역가는 대등하였지만, 후자가 제28일 및 제56일에 보다 높은 SN 역가를 유도한 경향이 있었다. 챌린지 후에, 3개의 모든 면역화된 군의 폐 조직으로부터 검출가능한 바이러스가 존재하지 않았고 (도 9), 이것은 예방접종이 하부 호흡기도에서 완전한 보호를 제공하였음을 나타낸다. 코 샘플에 관하여, wt A2를 투여한 동물은 검출가능한 바이러스를 갖지 않았고, MRK287 p3 또는 p17을 투여한 동물은 나이브 동물보다 약 3 로그 더 낮은, 매우 낮은 역가를 가졌다.
아프리카 녹색 원숭이 연구는 2개의 군을 포함하였고, 여기서 하나는 실험군이고 다른 하나는 나이브 대조군이고, 각각 4마리의 동물을 포함한다. 실험군에 대해, 동물을 제0일에 105.5 pfu의 MRK287 p17 바이러스로 근육내 면역화시켰다. 두 군에 제28일에 2 x 105.5 pfu의 wt A2 바이러스를 코 안 및 기관내 접종에 의해 챌린징하였다. 코 스왑 및 폐 세척액을 바이러스 적정을 위해 챌린지 후 제7일에 수집하였다. 도 10은 제28일에 SN 역가를 보여준다. 백신을 투여한 동물은 약 1:128 (7 로그2)의 평균 SN 역가를 나타냈다. 챌린지 후에, 천연 동물은 제7일에 코 및 폐 샘플에서 각각 약 3.5- 및 5-로그 pfu/ml 바이러스를 가졌다 (도 11). 백신을 투여한 동물은 나이브 동물보다 코에서 약 1 로그 더 낮은 바이러스 역가 및 폐에서 3 로그 더 낮은 역가를 가졌다.
실시예 4
플라크 정제된 p17
플라크 정제 - 계대배양 17 바이러스의 단일 (클로날) 유전자 집단을 확인할 의도로 개별 플라크를 단리하고 수거하기 위한 목적을 위해 p17 바이러스 계대배양을 적정하였다. 바이러스를 웰당 ≤10 플라크를 표적화하도록 적정하였다. 바이러스 원액의 출발 역가는 1.7x106 pfu/mL이고, 분석을 위해 수행된 최종 희석의 범위는 1:10,000, 1:20,000, 및 1:40,000이었다. 접종 후 제7일에, 플레이트를 단층 상에 단수의 플라크에 대해 거시적으로 및 미시적으로 모두 시각화하였다. 계대배양 17 바이러스는 큰 (직경 약 2 mM) 및 작은 (직경 ≤1 mM) 2가지 구분되는 플라크 형태를 생성하였다. 초기 단리를 위해, 10개의 작은 형태 (#1-10) 및 10개의 큰 형태 플라크 (#11-20)를 단리하였다. 단리는 1 mL 멸균 혈청학적 피펫을 아가로스를 통해 넣고 단리할 플라크의 둘레를 원을 그림으로써 수행하였다. 이어서, 그 영역을 흡인함으로써, 물질을 1 mL의 RSV 유지 배지로 옮기고, 분산시키고, 5x200 ㎕로 분취하였다. 플라크 #1 및 #11을 적정 및 Vero 조직 배양 플레이트에서 즉시 증폭을 위해 선택하였다. 나머지 분취액은 액체 질소를 통해 동결시키고 -70℃에서 저장하였다. 2차 증폭은 플라크를 Vero 플레이트에서 1:20, 1:200, 및 1:2000에서 적정하는 것을 포함한다. 일부 플레이트에는 모 플라크로부터 플라크의 2차 집단을 생성하기 위해 아가로스 오버레이를 넣은 한편, 다른 것에는 후속적인 서열 분석을 위해 모 플라크 #1 및 #11의 원액을 생성하기 위해 액체 RSV 유지 배지 오버레이를 넣었다. 플라크 #1 및 #11의 2차 플라크 분석 중에서, 2개의 플라크를 단리하였다. 이들 플라크는 플레이트 상에서 다른 플라크로부터 그들의 분리 (따라서, 혼합 집단을 얻을 가능성이 감소한다) 및 모체에 유사한 그들의 플라크 형태 때문에 선택되었다. 2개의 플라크를 각각 모 플라크로부터 단리하고, #1-1 및 #1-2로 표지하였다 (예를 들어, 플라크 #11로부터 단리된 플라크는 #11-1 및 #11-2로 명명하였다). 플라크 #1-2는 제3 라운드의 플라크 정제에서 적정하고 증폭시키기 위해 선택하였고: 1x200 ㎕의 플라크 #1-2를 플라크 정제 및 증폭을 위해 동시에 적정하여, #1-2 모체의 추가의 원액을 생성하였다. #1-2로부터 단리된 플라크를 #1-2.1, #1-2.2, #1-2.3, #1-2.4, #1-2.5, 및 #1-2.6으로 표지하였다. 단리물에 대해 수행된 서열 분석은 #1-2.1의 분석이 클로날 집단을 보여준 후에 중지하였다.
바이러스 원액을 위한 플라크 #1-2.1의 증폭 - 바이러스 원액의 성장은 이전에 개략한 표준 절차를 따랐다. 200 ㎕의 원래의 플라크를 Vero 세포에서 12-웰 배양으로 증폭시켰다. 제1 증폭으로부터의 원액 (pp1)을 사용하여 Vero T150 배양액에 접종하고; 수거된 물질 (pp2)를 1회 추가로 증폭하여, 실험 용도를 위한 대량 부피 (약 1 L)의 물질을 생성하였다. 각각의 증대물 (scale up)로부터 취한 #1-2.1의 분취액을 서열 분석을 위해 제공하였다. PP3 물질을 이용하여 코튼 래트 연구에서 사용하였다.
코튼 래트 챌린지 연구 - 4마리의 4-8주령 암컷 코튼 래트 (시그모돈 히스피두스)에게 제0일에 0.1 ml 부피에서 105 pfu의 바이러스를 이소플루란 마취 하에 코 안에 접종하였다. 접종 4일 후에 폐 (좌엽) 및 비갑개를 제거하고, 얼음 상에서 SPG를 함유하는 행크스 균형 염 용액 (미국 매릴랜드주 워커스빌) 10 부피 내에 균질화하였다. 샘플을 2000 rpm에서 10분 동안 원심분리에 의해 청정화하고, 분취하고, 즉시 -70℃에서 동결 저장하였다. 바이러스는 (1) MRK287 p22, (2) MRK287 p17, (3) 플라크 정제된 MRK287 p17, (4) MRK287 p15, (5) MRK287 p10, (6) MRK287 p5, (7) MRK287 p3, 및 (8) RSV A2 야생형을 포함한다. 코 및 폐 균등물을 Vero 세포 내에서 적정하고, 조직 1 g당 플라크 형성 단위 (pfu)로서 포현한다.
결과 - MRK287 계대배양 17 (p17)을 플라크 정제하여 클로날 집단 ("p17_pp")을 얻고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 서열 결정하였다. 하나의 추가의 뉴클레오티드 돌연변이가 플라크 정제된 바이러스에서 보이고, 이는 NS1 단백질을 코딩하는 유전자 내의 뉴클레오티드 위치 162에 상응하는, RSV 게놈 내의 뉴클레오티드 위치 260에 위치한다. 이것은 침묵 돌연변이이다 (즉, 아미노산 돌연변이를 일으키지 않는다). 서열 87은 NS1을 코딩하는 야생형 유전자 서열에 상응한다 (예를 들어, S2 균주). 서열 89는 MRK287 및 p17 내의 NS1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 서열 90은 p17_pp 내의 NS1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 표 8 및 9는 MRK287 p17 및 플라크 정제된 버전 (p17_pp) 내의 돌연변이를 비교한다. 서열 88은 NS1의 아미노산 서열 (wt S2 바이러스, MRK287, MRK287 p17 및 MRK287 p17_pp에 대해 동일함)에 상응한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
(1) MRK287 p22, (2) MRK287 p17, (3) 플라크 정제된 MRK287 p17, (4) MRK287 p15, (5) MRK287 p10, (6) MRK287 p5, (7) MRK287 p3, 또는 (8) RSV A2 야생형을 접종한 각각의 동물에 대한 코튼 래트 챌린지 연구에서 4마리의 개별 동물의 평균 역가, 및 하부 및 상부 신뢰 간격 (CI)을 표 10에 제시한다. RSV A2 야생형 및 MRK287 p3의 바이러스 역가는 4 로그 pfu/g 조직을 초과한다. MRK287 p5 폐 샘플은 여전히 약 4 로그 바이러스 pfu/g를 갖는다. 이와 반대로, 플라크 정제된 MRK287 p17을 비롯한 계대배양 10 이후의 바이러스는 폐 및 코 샘플 모두에서 야생형 균주로부터 2 로그 초과의 감소를 보여준다. 추가로, 이들 데이타는 플라크 정제된 MRK287 p17이 MRK287 p17만큼 약독화됨을 확인한다.
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> Merck & Co., Inc. <120> LIVE, ATTENUATED RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS <130> MRL-IFD-22569 <150> 61/198,327 <151> 2008-11-05 <160> 95 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 375 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, S2 <400> 1 atggacacaa cacacaatga caccacacca caaagactga tgatcacaga catgagacca 60 ttgtcacttg agactataat aatatcacta accagagaca tcataacaca cagatttata 120 tacttgataa atcatgaatg tatagtgaga aaacttgatg aaagacaggc cacatttaca 180 ttcctggtca actatgaaat gaaactattg cacaaagtgg gaagcactaa atacaaaaaa 240 tatactgaat acaacacaaa atatggcact tttcctatgc caatatttat caatcatgat 300 gggttcttag aatgcattgg cattaagcct acaaagcaca ctcccataat atacaagtat 360 gatctcaatc catga 375 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus, S2 strain <400> 2 Met Asp Thr Thr His Asn Asp Thr Thr Pro Gln Arg Leu Met Ile Thr 1 5 10 15 Asp Met Arg Pro Leu Ser Leu Glu Thr Ile Ile Ile Ser Leu Thr Arg 20 25 30 Asp Ile Ile Thr His Arg Phe Ile Tyr Leu Ile Asn His Glu Cys Ile 35 40 45 Val Arg Lys Leu Asp Glu Arg Gln Ala Thr Phe Thr Phe Leu Val Asn 50 55 60 Tyr Glu Met Lys Leu Leu His Lys Val Gly Ser Thr Lys Tyr Lys Lys 65 70 75 80 Tyr Thr Glu Tyr Asn Thr Lys Tyr Gly Thr Phe Pro Met Pro Ile Phe 85 90 95 Ile Asn His Asp Gly Phe Leu Glu Cys Ile Gly Ile Lys Pro Thr Lys 100 105 110 His Thr Pro Ile Ile Tyr Lys Tyr Asp Leu Asn Pro 115 120 <210> 3 <211> 375 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain 287 <400> 3 atggacacga ctcacaatga taccacacca caaagactga tgatcacaga tatgagacca 60 ttgtcacttg agaccataat aacatcacta accagagaca tcataacaca caaatttata 120 tacttgataa atcatgaatg catagtgaga aaacttgatg aaagacaagc cacatttaca 180 ttcctggtca actatgaaat gaaactattg cacaaagtag gaagcactaa atataaaaaa 240 tatactgaat acaacacaaa atatggcact ttccctatgc cgatattcat caatcatgat 300 gggttcttag aatgcattgg cattaagcct acaaagcata ctcccataat atacaagtat 360 gatctcaatc cataa 375 <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain 287 <400> 4 Met Asp Thr Thr His Asn Asp Thr Thr Pro Gln Arg Leu Met Ile Thr 1 5 10 15 Asp Met Arg Pro Leu Ser Leu Glu Thr Ile Ile Thr Ser Leu Thr Arg 20 25 30 Asp Ile Ile Thr His Lys Phe Ile Tyr Leu Ile Asn His Glu Cys Ile 35 40 45 Val Arg Lys Leu Asp Glu Arg Gln Ala Thr Phe Thr Phe Leu Val Asn 50 55 60 Tyr Glu Met Lys Leu Leu His Lys Val Gly Ser Thr Lys Tyr Lys Lys 65 70 75 80 Tyr Thr Glu Tyr Asn Thr Lys Tyr Gly Thr Phe Pro Met Pro Ile Phe 85 90 95 Ile Asn His Asp Gly Phe Leu Glu Cys Ile Gly Ile Lys Pro Thr Lys 100 105 110 His Thr Pro Ile Ile Tyr Lys Tyr Asp Leu Asn Pro 115 120 <210> 5 <211> 375 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain p17 <400> 5 atggacacga ctcacaatga taccacacca caaagactga tgatcacaga tatgagacca 60 ttgtcacttg agaccataat aacatcacta accagagaca tcataacaca caaatttata 120 tacttgataa atcatgaatg catagtgaga aaacttgatg aaagacaagc cacatttaca 180 ttcctggtca actatgaaat gaaactattg cacaaagtag gaagcactaa atataaaaaa 240 tatactgaat acaacacaaa atatggcact ttccctatgc cgatattcat caatcatgat 300 gggttcttag aatgcattgg cattaaacct acaaagcata ctcccataat atacaagtat 360 gatctcaatc cataa 375 <210> 6 <211> 124 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain p17 <400> 6 Met Asp Thr Thr His Asn Asp Thr Thr Pro Gln Arg Leu Met Ile Thr 1 5 10 15 Asp Met Arg Pro Leu Ser Leu Glu Thr Ile Ile Thr Ser Leu Thr Arg 20 25 30 Asp Ile Ile Thr His Lys Phe Ile Tyr Leu Ile Asn His Glu Cys Ile 35 40 45 Val Arg Lys Leu Asp Glu Arg Gln Ala Thr Phe Thr Phe Leu Val Asn 50 55 60 Tyr Glu Met Lys Leu Leu His Lys Val Gly Ser Thr Lys Tyr Lys Lys 65 70 75 80 Tyr Thr Glu Tyr Asn Thr Lys Tyr Gly Thr Phe Pro Met Pro Ile Phe 85 90 95 Ile Asn His Asp Gly Phe Leu Glu Cys Ile Gly Ile Lys Pro Thr Lys 100 105 110 His Thr Pro Ile Ile Tyr Lys Tyr Asp Leu Asn Pro 115 120 <210> 7 <211> 897 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, S2 <400> 7 atgtccaaaa acaaggacca acgcaccgcc aagacactag aaaagacctg ggacactctc 60 aatcatctat tattcatatc atcgtgctta tacaagttaa atcttaaatc tatagcacaa 120 atcacattat ccattctggc aatgataatc tcaacttcac ttataattgc agccatcata 180 ttcatagcct cggcaaacca caaagtcaca ctaacaactg caatcataca agatgcaaca 240 agccagatca agaacacaac cccaacatac ctcacccaga atccccagct tggaatcagc 300 ttctccaatc tgtctgaaac tacatcacaa accaccacca tactagcttc aacaacacca 360 agtgtcaagt caaccctgca atccacaaca gtcaagacca aaaacacaac aacaaccaaa 420 atacaaccca gcaagcccac cacaaaacaa cgccaaaaca aaccaccaaa caaacccaat 480 aatgattttc actttgaagt gttcaacttt gtaccttgca gcatatgcag caacaatcca 540 acctgctggg ctatctgtaa aagaatacca aacaaaaaac ctggaaagaa aaccaccacc 600 aagcccacaa aaaaaccaac catcaagaca accaaaaaag atctcaaacc tcaaaccaca 660 aaaccaaagg aagtacctac caccaagccc acagaaaagc caaccatcaa caccaccaaa 720 acaaacatca gaactacact gctcaccaac aataccacag gaaatccaga acacacaagt 780 caaaagggaa ccctccactc aacctcctcc gatggcaatc caagcccttc acaagtctat 840 acaacatccg agtacctatc acaacctcca tctccatcca acacaacaaa ccagtag 897 <210> 8 <211> 298 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus, S2 <400> 8 Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Lys Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln 85 90 95 Leu Gly Ile Ser Phe Ser Asn Leu Ser Glu Thr Thr Ser Gln Thr Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Ser Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser 115 120 125 Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Lys Ile Gln Pro Ser 130 135 140 Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn 145 150 155 160 Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys 180 185 190 Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Ile 195 200 205 Lys Thr Thr Lys Lys Asp Leu Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu 210 215 220 Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Lys Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys 225 230 235 240 Thr Asn Ile Arg Thr Thr Leu Leu Thr Asn Asn Thr Thr Gly Asn Pro 245 250 255 Glu His Thr Ser Gln Lys Gly Thr Leu His Ser Thr Ser Ser Asp Gly 260 265 270 Asn Pro Ser Pro Ser Gln Val Tyr Thr Thr Ser Glu Tyr Leu Ser Gln 275 280 285 Pro Pro Ser Pro Ser Asn Thr Thr Asn Gln 290 295 <210> 9 <211> 900 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain 287 <400> 9 atgtccaaaa acaaagacca acgcactgct aagacactag aaaggacctg ggacactctc 60 aatcatttat tattcatatc atcgtgctta tataagttaa atcttaaatc tgtagcacaa 120 atcacattat ccattttggc aatgataatc tcaacttcac ttataattgc agccatcata 180 ttcattgcct cggcaaacca caaagtcaca tcaacaacta caatcataca agatgcaaca 240 agccagatca agaacacaac cccaacatac ctcacccaga gtcctcagct tggaatcagt 300 ccctctaatc cgtctgaaat tacatcacaa atcaccacca tactagcttc aacaacacca 360 ggagtcaagt caaccctgca atccacaaca gtcgggacca agaatacaac aacaactcaa 420 gcacaaccca gcaagcccac cacaaaacaa cgccaaaaca aaccaccaag caaacccaac 480 aatgattttc actttgaagt gttcaacttt gtaccctgca gcatatgcag caacaatcca 540 acctgctggg ccatctgcaa aagaataccc aacaaaaaac caggaaagaa aaccaccacc 600 aagcccacaa aaaaaccaac cttcaagaca accaaaaaag atcccaaacc tcaaaccact 660 aaatcaaagg aggtacccac caccaagccc acagaagagc caactatcaa caccaccaaa 720 acaaacatca caactacact actcacctcc aacaccacga gaaatccaga actcacaagt 780 caaatggaaa ccttccactc aacttcctcc gaaggtaatc caagcccttc tcaagtctcc 840 ataacatccg agtacctatc acaaccttca tctccaccca acacaccacg ctagtagtta 900 <210> 10 <211> 297 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain 287 <400> 10 Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Arg Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Ser Thr Thr Thr Ile Ile Gln Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Ser Pro Gln 85 90 95 Leu Gly Ile Ser Pro Ser Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gln Ile Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser 115 120 125 Thr Thr Val Gly Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Ala Gln Pro Ser 130 135 140 Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn 145 150 155 160 Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys 180 185 190 Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe 195 200 205 Lys Thr Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Ser Lys Glu 210 215 220 Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys 225 230 235 240 Thr Asn Ile Thr Thr Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Arg Asn Pro 245 250 255 Glu Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly 260 265 270 Asn Pro Ser Pro Ser Gln Val Ser Ile Thr Ser Glu Tyr Leu Ser Gln 275 280 285 Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Pro Arg 290 295 <210> 11 <211> 900 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain p17 <400> 11 atgtccaaaa acaaagacca acgcactgct aagacactag aaaggacctg ggacactctc 60 aatcatttat tattcatatc atcgtgctta tataagttaa atcttaaatc tgtagcacaa 120 atcacattat ccattttggc aatgataatc tcaacttcac ttataattgc agccatcata 180 ttcattgcct cggcaaacca caaagtcaca tcaacaacta caatcataca agatgcaaca 240 agccagatca agaacacaac cccaacatac ctcacccaga gtcctcagct tggaatcagt 300 ccctctaatc cgtctgaaat tacatcacaa atcaccacca tactagcttc aacaacacca 360 ggagtcaagt caaccctgca atccacaaca gtcgggacca agaatacaac aacaactcaa 420 gcacaaccca gcaagcccac cacaaaacaa cgccaaaaca aaccaccaag caaacccaac 480 aatgattttc actttgaagt gttcaacttt gtaccctgca gcatatgcag caacaatcca 540 acctgctggg ccatctgcaa aagaataccc aacaaaaaac caggaaagaa aaccaccacc 600 aagcccacag aagaaccaac cttcaagacg gccaaagagg atcccaaacc tcagaccact 660 ggatcggggg aggtgcccac caccaagccc acaggggagc caactatcaa caccaccaaa 720 acaaacatca caactacact actcacctcc aacaccacga gaaatccaga actcacaagt 780 caaatggaaa ccttccactc aacttcctcc gaaggtaatc caagcccttc tcaagtctcc 840 ataacatccg agtacctatc acaaccttca tctccaccca acacaccacg ctagtagtta 900 <210> 12 <211> 297 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain p17 <400> 12 Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Arg Thr 1 5 10 15 Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys 20 25 30 Leu Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met 35 40 45 Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser 50 55 60 Ala Asn His Lys Val Thr Ser Thr Thr Thr Ile Ile Gln Asp Ala Thr 65 70 75 80 Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Ser Pro Gln 85 90 95 Leu Gly Ile Ser Pro Ser Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gln Ile Thr 100 105 110 Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gln Ser 115 120 125 Thr Thr Val Gly Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Ala Gln Pro Ser 130 135 140 Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn 145 150 155 160 Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys 165 170 175 Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys 180 185 190 Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Phe 195 200 205 Lys Thr Ala Lys Glu Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Gly Ser Gly Glu 210 215 220 Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Gly Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys 225 230 235 240 Thr Asn Ile Thr Thr Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Arg Asn Pro 245 250 255 Glu Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly 260 265 270 Asn Pro Ser Pro Ser Gln Val Ser Ile Thr Ser Glu Tyr Leu Ser Gln 275 280 285 Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Pro Arg 290 295 <210> 13 <211> 1725 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, S2 <400> 13 atggagttgc caatcctcaa aacaaatgca attaccgcaa tccttgctgc agtcacactc 60 tgttttgctt ccagtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtc 120 agcaaaggct atcttagtgc tctaagaact ggttggtata ctagtgttat aactatagaa 180 ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa 240 caagaattag ataaatataa aagtgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca 300 ccggcaacca acaatcgagc cagaagagaa ctaccaaggt ttatgaatta tacactcaac 360 aataccaaaa ataccaatgt aacattaagc aagaaaagga aaagaagatt tcttggcttt 420 ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt ggcattgctg tatctaaggt cctgcaccta 480 gaaggggaag tgaacaagat caaaagtgct ctactatcca caaacaaggc tgtagtcagc 540 ttatcaaatg gagttagtgt cttaaccagc aaagtgttag acctcaaaaa ctatatagat 600 aaacagttgt tacctattgt gaacaagcaa agctgtagca tatcaaacat tgaaactgtg 660 atagagttcc aacaaaagaa caacagacta ctagagatta ccagggaatt tagtgttaat 720 gcaggtgtaa ctacacctgt aagcacttat atgttaacaa atagtgaatt attatcatta 780 atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaagttaa tgtccaacaa tgttcaaata 840 gttagacagc aaagttactc tatcatgtcc ataataaagg aggaagtctt agcatatgta 900 gtacaattac cactatatgg tgtaatagat acaccttgtt ggaaactaca cacatcccct 960 ctatgtacaa ccaacacaaa ggaagggtcc aacatctgtt taacaagaac cgacagagga 1020 tggtactgtg acaatgcagg atcagtatct ttcttcccac tagctgaaac atgtaaagtt 1080 caatcgaatc gagtattttg tgacacaatg aacagtttaa cattaccaag tgaagtaaat 1140 ctctgcaaca ttgacatatt caaccccaaa tatgattgca aaattatgac ttcaaaaaca 1200 gatgtaagca gctccgttat cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaact 1260 aaatgtacag catccaataa aaatcgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgcgat 1320 tatgtatcaa ataagggggt ggacactgtg tctgtaggta atacattata ttatgtaaat 1380 aagcaagaag gcaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa taataaattt ctatgaccca 1440 ttagtgttcc cctctgatga atttgatgca tcaatatctc aagtcaatga gaagattaac 1500 cagagcctag catttattcg taaatccgat gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa 1560 tccaccacaa atatcatgat aactactata attatagtga ttatagtaat attgttatca 1620 ttaattgccg ttggactgct cctatactgc aaggccagaa gcacaccagt cacactaagc 1680 aaggatcaac tgagtggtat aaataatatt gcatttagta actaa 1725 <210> 14 <211> 574 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus, S2 <400> 14 Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Thr Asn Ala Ile Thr Ala Ile Leu Ala 1 5 10 15 Ala Val Thr Leu Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser 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ttgacatatt caatcccaaa tatgattgta aaattatgac ttcaaaaaca 1200 gatgtaagca gctctgttat cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaact 1260 aaatgtacag catccaataa aaatcgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgcgat 1320 tatgtatcaa ataaaggggt ggacactgtg tctgtaggca acacattata ttatgtaaat 1380 aagcaagaag gcaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa taataaattt ctatgaccca 1440 ttagtattcc cctctgatga atttgatgca tcaatatctc aagtcaacga gaagattaac 1500 cagagcctgg catttattcg taaatccgat gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa 1560 tccaccacaa acatcatgat aactgctata attatagtga ttgtagtaat attattatca 1620 ttaattgctg taggactgct cctatactgt aaggccagaa gcacaccagt cacactaagc 1680 aaagatcaac tgagtggtat aaataatatt gcatttagta actaa 1725 <210> 16 <211> 574 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain 287 <400> 16 Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr 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taaaagggaa atattgagta tggaaaacct aagtattact 3600 gaattaagca aatatgttag ggaaagatct tggtctttat ccaatatagt tggtgttaca 3660 tcacctagta tcatgtatac aatggacatc aaatatacaa caagcactat agctagtggc 3720 ataatcatag agaaatataa tgttaacagt ttaacacgtg gtgagagagg acccactaaa 3780 ccatgggttg gttcatctac acaagagaaa aaaacaatgc cagtttataa tagacaagtt 3840 ttaaccaaaa aacagagaga tcaaatagat ctattagcaa aattggattg ggtgtatgca 3900 tctatagata acaaggatga attcatggaa gaacttagca taggaactct tgggttaaca 3960 tatgagaaag ccaaaaaatt atttccacaa tatttaagtg ttaactattt gcatcgcctt 4020 acagtcagta gtagaccatg tgaattccct gcatcaatac cagcttatag aactacaaat 4080 tatcactttg atactagccc tattaatcgc atattaacag aaaagtatgg tgatgaagat 4140 attgatatag tattccaaaa ctgtataagc tttggcctta gcttaatgtc agtagtagaa 4200 caatttacta atgtatgtcc taacagaatt attcttatac ctaagcttaa tgagatacat 4260 ttaatgaaac ctcccatatt cacaggtgat gttgatattc acaagttaaa acaagtgata 4320 caaaaacagc atatgttttt accagacaaa ataagtttga ctcaatatgt ggaattattc 4380 ttaagtaata aaacactcaa atctggatct catgttaatt ctaatttaat attggcgcat 4440 aagatatctg actattttca taatacttac attttaagta ctaatttagc tggacattgg 4500 attctgatta tacaacttat gaaagattct aagggtattt ttgaaaaaga ttggggagag 4560 ggatatataa ctgatcatat gttcattaat ttgaaagttt tcttcaatgc ttataagacc 4620 tatctcttgt gttttcataa aggttacggc agagcaaagc tggagtgtga tatgaatact 4680 tcagatctcc tatgtgtatt ggaattaata gacagtagtt attggaagtc tatgtctaag 4740 gtatttttag aacaaaaagt tatcaaatac attcttagcc aggatgcaag tttacataga 4800 gtaaaaggat gtcatagctt caaactatgg tttcttaaac gtcttaatgt agcagaattc 4860 acagtttgcc cttgggttgt taacatagat tatcatccaa cacatatgaa agcaatatta 4920 acttatatag atcttgttag aatgggattg ataaatatag ataaaatata cattaaaaat 4980 aaacacaaat tcaatgatga attttatact tctaatctct tttacattaa ttataacttc 5040 tcagataata ctcatctatt aactaaacat ataaggattg ctaattctga attagaaaat 5100 aattacaaca aattatatca tcctacacca gaaaccctag aaaatatact aaccaatccg 5160 gttaaatgta atgacaaaaa gacactgaat gactattgta taggtaaaaa tgttgactca 5220 ataatgttac cattgttatc taataagaag cttattaaat cgtctacaat gattagaacc 5280 aattacagca aacaagattt gtataattta tttcctacgg ttgtgattga taaaattata 5340 gatcattcag gtaatacagc caaatctaac caactttaca ctactacttc tcatcaaata 5400 cctttagtgc acaatagcac atcactttat tgcatgcttc cttggcatca tattaataga 5460 ttcaattttg tatttagttc tacaggttgt aaaattagta tagagtatat tttaaaagac 5520 cttaaaatta aagatcctaa ttgtatagca ttcataggtg aaggagcagg gaatttatta 5580 ttgcgtacag tagtggaact tcatcctgat ataagatata tttacagaag tctgaaagat 5640 tgcaatgatc atagtttacc tattgagttt ttaaggctgt acaatggaca tatcaacatt 5700 gattatggtg aaaatttgac cattcctgct acagatgcaa ccaacaacat tcattggtct 5760 tatttacata taaagtttgc tgaacctatc agtctttttg tctgtgatgc tgaattgcct 5820 gtaacagtca actggagtaa aattataata gagtggagca agcatgtaag aaaatgcaag 5880 tactgttcct cagttaataa atgtacgtta atagtaaaat atcatgctca agatgatatc 5940 gatttcaaat tagacaatat aactatatta aaaacttatg tatgcttagg cagtaagtta 6000 aaggggtctg aagtttactt agtccttaca ataggtcctg caaatgtgtt cccagtattt 6060 aatgtagtac aaaatgctaa 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gtttaactta tacacaaaat taaacaacat attaacacag 660 tatcgatcaa atgaggtaaa aaaccatggg tttacattga tagataatca aactcttagt 720 ggatttcaat ttattttgaa ccaatatggt tgtatagttt ataataagga actcaaaaga 780 attactgtga caacctataa tcaattcttg acatggaaag atattagcct tagtagatta 840 aatgtttgtt taattacatg gattagtaac tgcttgaaca cattaaataa aagcttaggc 900 ttaagatgcg gattcaataa tgttatctta acacaactat tcctttatgg agattgtata 960 ctaaaactat ttcacaatga ggggttctac ataataaaag aggtagaggg atttattatg 1020 tctctaattt taaatataac agaagaagat caattcagaa aacgatttta taatagtatg 1080 ctcaacaaca tcacagatgc tgctaataaa gctcagaaaa atctgctatc aagagtatgt 1140 catacattat tagataagac agtatccgat aatataataa atggcagatg gataattcta 1200 ttaagtaagt tccttaaatt aattaagctt gcgggtgaca ataaccttaa caatctgagt 1260 gaactatatt ttttgttcag aatatttgga cacccaatgg tagatgaaag acaagccatg 1320 gatgctgtta aaattaattg caatgagacc aaattttact tgctaagcag tctaagtatg 1380 ttaagaggtg cctttatata tagaattata aaagggtttg taaataatta caacagatgg 1440 cctactttaa gaaatgctat tgttttaccc 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agatatcaca tgggtggcat cgaagggtgg 2340 tgtcaaaaac tatggaccat agaagctata tcactattgg atctaatatc tctcaaaggg 2400 aaattctcaa ttactgcttt aattaatggt gacaatcaat caatagatat aagcaaacca 2460 attagactca tggaaggtca aactcatgct caagcagatt atttgctagc attaaatagc 2520 cttaaattac tgtataaaga gtatgcaggc ataggccaca aattaaaagg aactgagact 2580 tatatatcac gagatatgca atttatgagt aaaacaattc aacataacgg tgtgtattac 2640 ccagctagta taaagaaagt cctaagagtg ggaccgtgga taaacactat acttgatgat 2700 ttcaaagtga gtttagaatc tataggtagt ttgacacaag aattagaata tagaggtgaa 2760 agtctattat gcagtttaat atttagaaat gtatggttat ataatcagat tgctctacaa 2820 ttaaaaaatc atgcattatg taacaataaa ctatatttgg acatattaaa ggttctgaaa 2880 cacttaaaaa ccttttttaa tcttgataat attgatacag cattaacatt gtatatgaat 2940 ttacctatgt tatttggtgg tggtgatccc aacttgttat atcgaagttt ctatagaaga 3000 acccccgact tcctcacaga ggctatagtt cactctgtgt tcatacttag ttattataca 3060 aaccatgact taaaagataa acttcaagat ctgtcagatg atagattgaa taagttctta 3120 acatgcataa tcacgtttga caaaaaccct aacgctgaat tcgtaacatt gatgagagat 3180 cctcaagctt tagggtctga gagacaagct aaaattacta gcgaaatcaa taggctggca 3240 gttacagagg ttttgagtac agctccaaac aaaatattct ccaaaagtgc acaacattat 3300 accactacag agatagatct aaatgatatt atgcaaaata tagaacctac atatcctcat 3360 gggctaagag ttgtttatga aagtttaccc ttttataaag cagagaaaat agtaaatctt 3420 atatcaggta caaaatctat aactaacata ctggaaaaaa cttctgccat agacttaaca 3480 gatattgata gagccactga gatgatgagg aaaaacataa ctttgcttat aaggatactt 3540 ccattggatt gtaacagaga taaaagagag atattgagta tggaaaacct aagtattact 3600 gaattaagca aatatgttag ggaaagatct tggtctttat tcaatatagt tggtgttaca 3660 tcacccagta tcatgtatac aatggacatc aaatatacta caagcactat agctagtggc 3720 ataattatag agaaatataa tgttaacagt ttaacacgtg gtgagagagg acccactaaa 3780 ccatgggttg gttcatctac acaagagaaa aaaacaatgc cagtttataa tagacaagtc 3840 ttaaccaaaa aacagagaga tcaaatagat ctattagcaa aattggattg ggtgtatgca 3900 tctatagata acaaggatga attcatggaa gaactcagca taggaaccct tgggttaaca 3960 tatgaaaaag ccaagaaatt atttccacaa 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tatatcacta ttggatctaa tatctctcaa agggaaattc tcaattactg ctttaattaa 10920 tggtgacaat caatcaatag atataagcaa accaattaga ctcatggaag gtcaaactca 10980 tgctcaagca gattatttgc tagcattaaa tagccttaaa ttactgtata aagagtatgc 11040 aggcataggc cacaaattaa aaggaactga gacttatata tcacgagata tgcaatttat 11100 gagtaaaaca attcaacata acggtgtgta ttacccagct agtataaaga aagtcctaag 11160 agtgggaccg tggataaaca ctatacttga tgatttcaaa gtgagtttag aatctatagg 11220 tagtttgaca caagaattag aatatagagg tgaaagtcta ttatgcagtt taatatttag 11280 aaatgtatgg ttatataatc agattgctct acaattaaaa aatcatgcat tatgtaacaa 11340 taaactatat ttggacatat taaaggttct gaaacactta aaaacctttt ttaatcttga 11400 taatattgat acagcattaa cattgtatat gaatttacct atgttatttg gtggtggtga 11460 tcccaacttg ttatatcgaa gtttctatag aagaaccccc gacttcctca cagaggctat 11520 agttcactct gtgttcatac ttagttatta tacaaaccat gacttaaaag ataaacttca 11580 agatctgtca gatgatagat tgaataagtt cttaacatgc ataatcacgt ttgacaaaaa 11640 ccctaacgct gaattcgtaa cattgatgag agatcctcaa gctttagggt ctgagagaca 11700 agctaaaatt actagcgaaa tcaataggct ggcagttaca gaggttttga gtacagctcc 11760 aaacaaaata ttctccaaaa gtgcacaaca ttataccact acagagatag atctaaatga 11820 tattatgcaa aatatagaac ctacatatcc tcatgggcta agagttgttt atgaaagttt 11880 acccttttat aaagcagaga aaatagtaaa tcttatatca ggtacaaaat ctataactaa 11940 catactggaa aaaacttctg ccatagactt aacagatatt gatagagcca ctgagatgat 12000 gaggaaaaac ataactttgc ttataaggat acttccattg gattgtaaca gagataaaag 12060 agagatattg agtatggaaa acctaagtat tactgaatta agcaaatatg ttagggaaag 12120 atcttggtct ttattcaata tagttggtgt tacatcaccc agtatcatgt atacaatgga 12180 catcaaatat actacaagca ctatagctag tggcataatt atagagaaat ataatgttaa 12240 cagtttaaca cgtggtgaga gaggacccac taaaccatgg gttggttcat ctacacaaga 12300 gaaaaaaaca atgccagttt ataatagaca agtcttaacc aaaaaacaga gagatcaaat 12360 agatctatta gcaaaattgg attgggtgta tgcatctata gataacaagg atgaattcat 12420 ggaagaactc agcataggaa cccttgggtt aacatatgaa aaagccaaga aattatttcc 12480 acaatattta agtgtcaact atttgcatcg acttacagtc agtagtagac catgtgaatt 12540 ccctgcatca ataccagctt atagaacaac aaattatcac tttgacacta gccctattaa 12600 tcgcatatta acagaaaagt atggtgatga agatattgac atagtattcc aaaactgtat 12660 aagctttggc cttagcttaa tgtcagtagt agaacaattt actaatgtat gtcctaacag 12720 aattattctc atacctaagc ttaatgagat acatttgatg aaacctccca tattcacagg 12780 tgatgttgat attcacaagt taaaacaagt gatacaaaaa cagcatatgt ttttaccaga 12840 caaaataagt ttgactcaat atgtagaatt attcttaagt aataaaacac tcaaatctgg 12900 atctcatgtt aattctaatt taatattggc acataaaata tctgactatt ttcataatac 12960 ttacatttta agtactaatt tagctggaca ttggattctg attatacaac ttatgaaaga 13020 ttctaagggt atttttgaaa aagattgggg agagggatat ataactgatc atatgtttat 13080 taatttgaaa gttttcttca atgcctataa gacctatctc ttgtgttttc ataaaggtta 13140 tggcaaagca aagctggagt gtgatatgaa cacctcagat ctcctatgtg tattggaatt 13200 aatagacagt agttattgga aatctatgtc taaggtattt ttagaacaaa aagttatcaa 13260 atacattctt agccaagatg caagtttaca tagagtaaaa ggatgtcata gcttcaaatt 13320 atggtttctt aaacgtctta atgtagcaga attcacagtt tgcccttggg ttgttaacat 13380 agattatcat ccaacacata tgaaagcaat attaacttat atagatcttg ttagaatggg 13440 attgataaat atagatagaa tacacattaa aaataaacac aaattcaatg atgaatttta 13500 tacttctaat ctcttctaca ttaattataa cttctcagat aatactcatc tattaactaa 13560 acatataagg attgctaatt ctgaattaga aaataattac aacaaattat atcatcctac 13620 accagaaacc ctagagaata tactagccaa tccgattaaa agtaatgaca aaaagacact 13680 gaatgaatat tgtataggta aaaatgttga ctcaataatg ttaccattgt tatctaataa 13740 gaagcttatt aaatcgtctg caatgattag aaccaattac agcaaacaag atttgtataa 13800 tttattccct atggttgtga ttgatagaat tatagatcat tcaggcaata cagccaaatc 13860 caaccaactt tacactacta cttcccacca aatatcttta gtgcacaata gcacatcact 13920 ttactgcatg cttccttggc atcatattaa tagattcaat tttgtattta gttctacagg 13980 ttgtaaaatt agtatagagt atattttaaa agatcttaaa attaaagatc ccaattgtat 14040 agcattcata ggtgaaggag cagggaattt attattgcgt acagtagtgg aacttcatcc 14100 tgacataaga tatatttaca gaagtctgaa agattgcaat gatcatagtt tacctattga 14160 gtttttaagg ctgtacaatg gacatatcaa cattgattat ggtgaaaatt tgaccattcc 14220 tgctacagat gcaaccaaca acattcattg gtcttattta catataaagt ttgctgaacc 14280 tatcagtctt tttgtctgtg atgctgaatt gcctgtaaca gtcaattgga gtaaaattat 14340 aatagaatgg agcaagcatg taagaaagtg caagtactgt tcctcagtta ataaatgtat 14400 gttaatagta aaatatcatg ctcaagatga tattgatttc aaattagaca atataactat 14460 attaaaaact tatgtatgct taggcagtaa gttaaaggga tcggaggttt acttagtcat 14520 cacaataggt cctgcaaata tattcccagc atttaatgta gtacaaaatg ctaaattgat 14580 actatcaaga accaaaaatt tcatcatgcc taagaaagct gataaagagt ctattgatgc 14640 aaatattaaa agtttnatac cctttctttg ttaccctata acaaaaaaag gaattaatac 14700 tgcattgtca aaactaaaga gtgttgttag tggagatata ctatcatatt ctatagctgg 14760 acgtaatgaa gttttcagca ataaacttat aaatcataaa catatgaaca tcttaaaatg 14820 gttcaatcat gttttaaatt tcagatcaac agaattaaac tataaccatt tatatatggt 14880 agaatctaca tatccttacc taagtgaatt gttaaacagc ttgacaacca atgaacttaa 14940 aaaactgatt aaaatcacag gtagtctgtt atacaacttt cataatgaat aatgaataaa 15000 gatcttataa taaagattcc catagctata cactaccatt gtattcaatt atagttatta 15060 aaaattaaaa atcatataat tttttaaata acttttagtg aactaatcct aaagttatca 15120 ttttgatcta ggaggaataa atttaaatcc taatctaatt ggtttatatg tgtattaact 15180 aaactacgag atattagttt ttgac 15205 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 27 acgggaaaaa atgcgtacaa caaac 25 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 28 gtgtagtcat gcatagagtt gttgttttag attgtgtgaa 40 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 29 tatcaactag ctaatcaatg tcactaacac c 31 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 30 cctctcccat ttcttttagc atttt 25 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 31 ttcacacaat ctaaaacaac aactctatgc atgactacac 40 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 77 atttgcatcg acttacagtc agtag 25 <210> 78 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 78 gggtttctgg tgtaggatga tataatt 27 <210> 79 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 79 gaaagattct aagggtattt ttgaaaaaga ttggggagag 40 <210> 80 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 80 ccttcaccta tgaatgcata acaattggga tcttta 36 <210> 81 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 81 ttacaacaaa ttatatcatc ctacaccaga aaccctagag 40 <210> 82 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 82 cagctttctt aggcatgatg aaatttttgg ttcttgatag 40 <210> 83 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 83 attaaagatc ccaattgtat agcattcata ggtgaaggag 40 <210> 84 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 84 ggttgtcaag ctgtttaaca attca 25 <210> 85 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 85 tcggaggttt acttagtcat cacaa 25 <210> 86 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 86 ggtagtgtat agctatggga atctttat 28 <210> 87 <211> 420 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, S2 <400> 87 atgggcagca attcattgag tatgataaaa gttagattac aaaatttgtt tgacaatgat 60 gaagtagcat tgttaaaaat aacatgctat actgacaaat taatacattt aactaatgct 120 ttggctaagg cagtgataca tacaatcaaa ttgaatggca ttgtgtttgt gcatgttatt 180 acaagtagtg atatttgccc taacaataat attgtagtaa aatccaattt cacaacaatg 240 ccagtactac aaaatggagg ttatatatgg gaaatgatgg aattaacaca ttgctctcaa 300 cctaatggtc tactagatga caattgtgaa attaaattct ccaaaaaact aagtgattca 360 acaatgacca attatatgaa tcaattatct gaattacttg gatttgatct taatccataa 420 <210> 88 <211> 139 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus <400> 88 Met Gly Ser Asn Ser Leu Ser Met Ile Lys Val Arg Leu Gln Asn Leu 1 5 10 15 Phe Asp Asn Asp Glu Val Ala Leu Leu Lys Ile Thr Cys Tyr Thr Asp 20 25 30 Lys Leu Ile His Leu Thr Asn Ala Leu Ala Lys Ala Val Ile His Thr 35 40 45 Ile Lys Leu Asn Gly Ile Val Phe Val His Val Ile Thr Ser Ser Asp 50 55 60 Ile Cys Pro Asn Asn Asn Ile Val Val Lys Ser Asn Phe Thr Thr Met 65 70 75 80 Pro Val Leu Gln Asn Gly Gly Tyr Ile Trp Glu Met Met Glu Leu Thr 85 90 95 His Cys Ser Gln Pro Asn Gly Leu Leu Asp Asp Asn Cys Glu Ile Lys 100 105 110 Phe Ser Lys Lys Leu Ser Asp Ser Thr Met Thr Asn Tyr Met Asn Gln 115 120 125 Leu Ser Glu Leu Leu Gly Phe Asp Leu Asn Pro 130 135 <210> 89 <211> 420 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, strain 287 and p17 <400> 89 atgggcagca attcattgag tatgataaaa gttagattac aaaatttgtt tgacaatgat 60 gaagtagcat tgttaaaaat aacatgctat actgataaat taatacattt aactaatgct 120 ttggctaagg cagtgataca tacaataaaa ttgaatggca ttgtgtttgt gcatgttatt 180 acaagtagtg atatttgccc taataataat attgtagtaa aatccaattt cacaacaatg 240 ccagtactac aaaatggagg ctatatatgg gaaatgatgg aattaacaca ttgctctcaa 300 cctaatggtc tactagatga caattgtgaa attaaattct ccaaaaaact aagtgattca 360 acaatgacca attatatgaa tcaattatct gaattgcttg gatttgatct taatccataa 420 <210> 90 <211> 420 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain p17_pp <400> 90 atgggcagca attcattgag tatgataaaa gttagattac aaaatttgtt tgacaatgat 60 gaagtagcat tgttaaaaat aacatgctat actgataaat taatacattt aactaatgct 120 ttggctaagg cagtgataca tacaataaaa ttgaatggca tagtgtttgt gcatgttatt 180 acaagtagtg atatttgccc taataataat attgtagtaa aatccaattt cacaacaatg 240 ccagtactac aaaatggagg ctatatatgg gaaatgatgg aattaacaca ttgctctcaa 300 cctaatggtc tactagatga caattgtgaa attaaattct ccaaaaaact aagtgattca 360 acaatgacca attatatgaa tcaattatct gaattgcttg gatttgatct taatccataa 420 <210> 91 <211> 15205 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain p17_pp <400> 91 acgggaaaaa atgcgtacaa caaacttgcg taaaccaaaa aaatggggca aataagagtt 60 tgataagtac cacttaaatt taactccctt agttagagat gggcagcaat tcattgagta 120 tgataaaagt tagattacaa aatttgtttg acaatgatga agtagcattg ttaaaaataa 180 catgctatac tgataaatta atacatttaa ctaatgcttt ggctaaggca gtgatacata 240 caataaaatt gaatggcata gtgtttgtgc atgttattac aagtagtgat atttgcccta 300 ataataatat tgtagtaaaa tccaatttca caacaatgcc agtactacaa aatggaggct 360 atatatggga aatgatggaa ttaacacatt gctctcaacc taatggtcta ctagatgaca 420 attgtgaaat taaattctcc aaaaaactaa gtgattcaac aatgaccaat tatatgaatc 480 aattatctga attgcttgga tttgatctta atccataaat tataattaat atcaactagc 540 taatcaatgt cactaacacc attagttaat ataaaactta acagaagaca aaaatggggc 600 aaataaatca attcagccaa cccaaccatg gacacgactc acaatgatac cacaccacaa 660 agactgatga tcacagatat gagaccattg tcacttgaga ccataataac atcactaacc 720 agagacatca taacacacaa atttatatac ttgataaatc atgaatgcat agtgagaaaa 780 cttgatgaaa gacaagccac atttacattc ctggtcaact atgaaatgaa actattgcac 840 aaagtaggaa gcactaaata taaaaaatat actgaataca acacaaaata tggcactttc 900 cctatgccga tattcatcaa tcatgatggg ttcttagaat gcattggcat taaacctaca 960 aagcatactc ccataatata caagtatgat ctcaatccat aaacttcaac acaatattca 1020 cacaatctaa aacaacaact ctatgcatga ctacactcca tagtccaaat ggagcctgaa 1080 aattatagta atttaaaatt aaggagagat ataagataga agatggggca aatacaaaga 1140 tggctcttag caaagtcaag ttgaatgata cactcaacaa agatcaactt ctgtcatcta 1200 gcaaatacac catccaacgg agcacaggag atagtattga tactcctaat tatgatgtgc 1260 agaaacacat caataagtta tgtggcatgt tattaatcac agaagatgct aatcataaat 1320 tcactgggtt aataggtatg ttatatgcga tgtctaggtt aggaagagaa gacaccataa 1380 aaatactcag agatgcggga tatcatgtaa aagcaaatgg agtagatgta acaacacatc 1440 gtcaagacat taatgggaaa gaaatgaaat ttgaagtgtt aacattggca agcttaacaa 1500 ctgaaattca aatcaacatt gaaatagaat ctagaaaatc ctacaaaaaa atgctaaaag 1560 aaatgggaga ggtagctcca gaatacaggc atgactctcc tgattgtggg atgataatat 1620 tatgtatagc agcattagta ataaccaaat tggcagcagg ggatagatct ggtcttacag 1680 ctgtgattag gagagctaat aatgtcttaa aaaatgaaat gaaacgttat aaaggcttac 1740 tacccaagga catagccaac agcttctatg aggtgtttga aaaacatccc cactttatag 1800 atgtttttgt tcattttggt atagcacaat cttctaccag aggtggcagt agagtcgaag 1860 ggatttttgc aggattgttt atgaatgcct atggtgcagg gcaagtgatg ttacggtggg 1920 gagtcttagc aaaatcagtt aaaaatatta tgttaggaca tgctagtgtg caagcagaaa 1980 tggaacaagt tgttgaggtt tatgaatatg cccaaaaatt gggtggtgaa gcaggattct 2040 accatatatt gaacaaccca aaagcttcat tattatcctt gactcaattt cctcacttct 2100 ccagtgtagt attaggcaat gctgctggcc taggcataat gggagagtac agaggtacac 2160 cgaggaatca agatctatat gatgcagcaa aggcatatgc tgaacaactc aaagaaaatg 2220 gtgtgattaa ctacagtgta ctagacttga cagcagaaga actagaggct atcaaacatc 2280 agcttaatcc aaaagataat gatgtagagc tttgagttaa taaaaaaatg gggcaaataa 2340 atcatcatgg aaaagtttgc tcctgaattc catggagaag atgcaaacaa cagggctact 2400 aaatttctag agtcaataaa gggcaaattc gcatcaccta aagatcccaa gaaaaaagat 2460 agtatcatat ctgtcaactc aatagatata gaagtaacca aagaaagccc tataacatca 2520 aattcaacta ttatcaaccc aacaaatgag acagatgata ctgcagggaa caagcccaat 2580 tatcaaagaa aacctctagt aagtttcaaa gaagacccca caccaagtga taatcccttt 2640 tctaaactat acaaagaaac catagaaaca tttgataaca atgaagaaga atccagctat 2700 tcatatgagg aaataaatga tcagacaaac gacaatataa cggcaagatt agataggatt 2760 gatgaaaagt taagtgaaat actaggaatg cttcacacat tagtggtggc aagtgcagga 2820 cctacatctg ctcgggatgg tataagagat gccatggttg gtttaagaga agaaatgata 2880 gaaaaaatca gaactgaagc attaatgacc aatgacagat tagaagctat ggcaagactc 2940 aggaatgagg aaagtgaaaa gatggcaaaa gacacatcag atgaagtatc tctaaatcca 3000 acatcagaga aattgaacaa cctgttggaa gggaatgata gtgacaatga tctatcactt 3060 gaagatttct gattagttac caatcttaac atcaaaacac aacaccaaca gaagaccaac 3120 aaactaacca acccaatcat ccaaccaaac atccatctgc caatcagcta agcagccaac 3180 aaaacaacca gccaatccaa aactagccac ccggaaaaaa tcgacaatat agttacaaaa 3240 aaagaaaggg tggggcaaat atggaaacat acgtgaacaa gcttcacgaa ggctccacat 3300 acacagctgc tgttcaatac aatgtcctag aaaaagacga tgaccctgca tcacttacaa 3360 tatgggtgcc catgttccaa tcatctatgc cagcagattt actcataaaa gaactagcta 3420 atgtcaacat actagtgaaa caaatatcca cacccaaggg accttcacta agagtcatga 3480 taaactcaag aagtgcagtg ctagcacaaa tgcccagcaa atttaccata agcgctaatg 3540 tgtccttaga tgaaagaagc aaactagcat atgatgtaac cacaccctgt gaaatcaagg 3600 catgcagtct aacatgccta aaatcaaaaa atatgttaac tacagttaaa gatctcacta 3660 tgaagacact caaccctaca catgatatta ttgctttatg tgaatttgaa aacatagtaa 3720 catcaaaaaa agtcataata ccaacatacc taagatccat cagtgtcaga aataaggatc 3780 tgaacacact tgaaaatata acaaccactg aattcaaaaa tgctatcaca aatgcaaaaa 3840 tcatccctta ctcaggatta ctattagtca tcacagtgac tgacaacaaa ggagcattca 3900 aatacataaa gccacaaagt caattcatag tagatcttgg agcttaccta gaaaaagaaa 3960 gtatatatta tgtcaccaca aattggaagc acacagctac aagatttgca atcaaaccta 4020 tggaagatta accttcttca actacatcag tgtgttaatt catacaaact ttctacctac 4080 attcttcact tcaccatcac aatcacaaac acttcgtggt tcaaccaatc aaacaaaact 4140 tatctaaagt cccagatcat cccaagtcat tgtttatcag atctagtact caaataagtt 4200 aataaaaaca tacacatggg gcaaataatc atcggagaaa atccaactaa tcacaatatc 4260 tgttaacata gacaagtcaa cacaccatac agaatcaacc gatggaaaat acatccataa 4320 caatagaatt ctcaagcaaa ttctggccct actttacact aatacacatg atcacaacaa 4380 taatctcttt actaatcata atctccatca tgattgcaat actaaacaaa ctttgtgaat 4440 ataacgtatt ccataacaaa acctttgagt taccaagagc tcgagtcaac acatagcatt 4500 catcaatcca acagctcaaa acagtaacct tgtatttaaa agtgaacaac ccctgcctct 4560 ttacaacacc ttatcaacgt cccaccatgc aaaccaccat ccatactata tagtagttaa 4620 ttaaaatagt cataacaatg aactaggata tcaagactaa caataacatt ggggcaaatg 4680 caaacatgtc caaaaacaaa gaccaacgca ctgctaagac actagaaagg acctgggaca 4740 ctctcaatca tttattattc atatcatcgt gcttatataa gttaaatctt aaatctgtag 4800 cacaaatcac attatccatt ttggcaatga taatctcaac ttcacttata attgcagcca 4860 tcatattcat tgcctcggca aaccacaaag tcacatcaac aactacaatc atacaagatg 4920 caacaagcca gatcaagaac acaaccccaa catacctcac ccagagtcct cagcttggaa 4980 tcagtccctc taatccgtct gaaattacat cacaaatcac caccatacta gcttcaacaa 5040 caccaggagt caagtcaacc ctgcaatcca caacagtcgg gaccaagaat acaacaacaa 5100 ctcaagcaca acccagcaag cccaccacaa aacaacgcca aaacaaacca ccaagcaaac 5160 ccaacaatga ttttcacttt gaagtgttca actttgtacc ctgcagcata tgcagcaaca 5220 atccaacctg ctgggccatc tgcaaaagaa tacccaacaa aaaaccagga aagaaaacca 5280 ccaccaagcc cacagaagaa ccaaccttca agacggccaa agaggatccc aaacctcaga 5340 ccactggatc gggggaggtg cccaccacca agcccacagg ggagccaact atcaacacca 5400 ccaaaacaaa catcacaact acactactca cctccaacac cacgagaaat ccagaactca 5460 caagtcaaat ggaaaccttc cactcaactt cctccgaagg taatccaagc ccttctcaag 5520 tctccataac atccgagtac ctatcacaac cttcatctcc acccaacaca ccacgctagt 5580 agttattaaa aaacatatta tcacagaaag ccatgaccaa ctcaaacaga atcaaaataa 5640 actctggggc aaataacaat ggagttgcca atcctcaaag cgaatgcaat taccacaatc 5700 ctcactgcag tcacattttg ttttgcttct agtcaaaaca tcactgaaga attttatcaa 5760 tcaacatgca gtgcagttag caaaggctat cttagtgctc taagaactgg ttggtatacc 5820 agtgttataa ctatagaatt aagtaatatc aaggaaaata agtgtaatgg aacagatgct 5880 aaggtaaaat tgataaaaca agaattagat aaatataaaa atgctgtaac agaattgcag 5940 ttgctaatgc aaagcacacc agcagcaaac aatcgagcca gaagagaact accaaggttt 6000 atgaattata cactcaacaa tgccaaaaaa accaatgtaa cattaagcaa aaaaaggaaa 6060 agaagatttc ttggtttttt gttaggagtt ggatctgcaa tcgccagtgg cattgctgta 6120 tctaaggtcc tacacctaga aggggaagtg aacaagatca aaagtgctct actatccaca 6180 aacaaggctg tagtcagctt atcaaatgga gttagtgtct taaccagcaa agtgttagac 6240 ctcaaaaatt atatagataa acaattgtta cctattgtga acaagcaaag ctgcagcata 6300 tcaaatatag aaactgtgat agagttccaa caaaagaaca acagactact agagattacc 6360 agggaattta gtgttaatgc aggtgtaact acacctgtaa gcacttacat gttgactaat 6420 agtgaattat tgtcattaat caatgatatg cctataacaa atgatcagaa gaagttaatg 6480 tccaacaatg ttcaaatagt tagacagcaa agttactcta tcatgtccat aataaaaaag 6540 gaagtcttag catatgtagt acaattacca ctatatggtg ttatagatac accttgttgg 6600 aaattacaca catcccctct atgtacaacc aacacaaaag aagggtccaa catctgttta 6660 acaagaactg acagaggatg gtactgtgac aatgcaggat cagtctcttt cttcccacaa 6720 gctgaaacat gtaaagttca atcgaatcga gtattttgtg acacaatgaa cagtttaaca 6780 ttaccaagtg aagtaaatct ctgcaatgtt gacatattca atcccaaata tgattgtaaa 6840 attatgactt caaaaacaga tgtaagcagc tctgttatca catctctagg agccattgtg 6900 tcatgctatg gcaaaactaa atgtacagca tccaataaaa atcgtggaat cataaagaca 6960 ttttctaacg ggtgcgatta tgtatcaaat aaaggggtgg acactgtgtc tgtaggcaac 7020 acattatatt atgtaaataa gcaagaaggc aaaagtctct atgtaaaagg tgaaccaata 7080 ataaatttct atgacccatt agtattcccc tctggtgaat ttgatgcatc aatatctcaa 7140 gtcaacgaga agattaacca gagcctggca tttattcgta aatccgatga attattacat 7200 aatgtaaatg ctggtaaatc caccacaaac atcatgataa ctgctataat tatagtgatt 7260 gtagtaatat tattatcatt aattgctgta ggactgctcc tatactgtaa ggccagaagc 7320 acaccagtca cactaagcaa agatcaactg agtggtataa ataatattgc atttagtaac 7380 taaataaaat agcatctaat catgttctta cgatggttta ctatctactc atagacagcc 7440 catctgtcat tggattttcc taaaatctga acttcatcga aactctcatc tataaaccat 7500 ctcacttaca ctatttaagt agattcctag ttcatagtta tataaaacat aattgaatgc 7560 cagattaact tactatctga aaaaatgaaa actggggcaa atatgtcacg aaggaatcct 7620 tgcaaatttg aaattcgagg tcattgctta aatggtaaga ggtgtcattt tagtcataat 7680 tattttgaat ggccacccca tgcactgctt gtaagacaaa actttatgtt aaacagaata 7740 cttaagtcta tggataaaag tatagatacc ttatcagaaa taagtggagc tgcagagttg 7800 gacagaacag aagagtatgc tcttggtgta gttggagtgc tagagagtta tataggatca 7860 ataaacaata taactaaaca atcagcatgt gttgccatga gcaaactcct cactgaactc 7920 aatagtgatg atatcaaaaa gctgagggac aatgaagagc taaattcacc caagataaga 7980 gtgtacaata ctgtcatatc atatattgaa agcaacagga aaaacaataa acaaactatc 8040 catctgttaa aaagattgcc agcagacgtg ttgaagaaaa ccatcaaaaa cacattggat 8100 atccataaga gcataaccat caacaaccca aaagaattaa ctgttagtga tacaaatgac 8160 catgccaaaa ataatgatac tacctgacaa atatccttgt agtataactt ccatactaat 8220 tacaagtaga tgtagagtta ctatgtataa tcaaaagaac acactatatt tcaatcaaaa 8280 caatccaaat aaccatatgt actcactaaa tcaaacattc aatgaaatcc attggacctc 8340 tcaagatttg attgacacaa ttcaaaattt tctacaacat ctaggtatta ctgaggatat 8400 atatacaata tatatattag tgtcataaca ctcaattcta acacttacaa catcgttaca 8460 ttattaaatc aaacaattca agttgtggga caaaatggat cccattatta atggaaattc 8520 tgctaatgtt tatctaaccg atagttattt aaaaggtgtt atctctttct cagagtgtaa 8580 tgctttagga agctacatat tcaatggtcc ttatctcaaa aatgattata ccaacttaat 8640 tagtagacaa aatccattaa tagaacacat gaatctaaag aaactaaata taacacagtc 8700 cttaatatct aagtatcata aaggtgaaat aaaattagaa gaaccgactt attttcagtc 8760 attacttatg acatacaaga gtatgacctc gtcagaacag attgctacca ctaatttact 8820 taaaaagata ataagaagag ctatagaaat aagtgatgtc aaagtctatg ctatattgaa 8880 taaactaggg cttaaagaaa aggacaagat taaatccaac aatggacaag atgaagccaa 8940 ttcagttatt acgaccataa tcaaagatga tatactttca gctgttaaag ataatcaatc 9000 tcatcttaaa gcaggcaaaa atcactctac aaaacaaaaa gacacaatca aaacaacact 9060 cctgaagaaa ttgatgtgtt caatgcaaca tcctccatca tggttaatac attggtttaa 9120 cttatacaca aaattaaaca acatattaac acagtatcga tcaaatgagg taaaaaacca 9180 tgggtttaca ttgatagata atcaaactct tagtggattt caatttattt tgaaccaata 9240 tggttgtata gtttataata aggaactcaa aagaattact gtgacaacct ataatcaatt 9300 cttgacatgg aaagatatta gccttagtag 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atcacacata caaaactata tagaacatga 10200 aaaattaaaa ttttccgaga gtgataaatc aagaagagta ttagagtatt atttaagaga 10260 taacaagttc aatgaatgtg atttatacaa ctgtgtagtt gatcaaagtt atctaaacaa 10320 ccctaatcat gtggtatcat tgacaggcaa agaaagagaa ctcagtgtag gtagaatgtt 10380 tgcaatgcaa ccgggaatgt tcagacaggt tcaaatatta gcagagaaaa tgatagctga 10440 aaacatttta caattctttc ctgaaagtct tacaagatat ggtgatctag aactacaaaa 10500 aatattagaa ttgaaagcag gaataagtaa caaatcaaat cgctacaatg acaattacaa 10560 caattacatt agtaagtgct ctatcatcac agatctcagc aaattcaatc aagcatttcg 10620 atatgaaacg tcatgtattt gtagtgatgt gcttgatgaa ctgcatggtg tacaatctct 10680 attttcctgg ttacatttaa ctattcctca tgttacaata atatgtacat ataggcatgc 10740 acccccctat ataggagatc atattgtaga tcttaacaat gtagatgaac aaagtggatt 10800 atatagatat cacatgggtg gcatcgaagg gtggtgtcaa aaactatgga ccatagaagc 10860 tatatcacta ttggatctaa tatctctcaa agggaaattc tcaattactg ctttaattaa 10920 tggtgacaat caatcaatag atataagcaa accaattaga ctcatggaag gtcaaactca 10980 tgctcaagca gattatttgc tagcattaaa tagccttaaa ttactgtata aagagtatgc 11040 aggcataggc cacaaattaa aaggaactga gacttatata tcacgagata tgcaatttat 11100 gagtaaaaca attcaacata acggtgtgta ttacccagct agtataaaga aagtcctaag 11160 agtgggaccg tggataaaca ctatacttga tgatttcaaa gtgagtttag aatctatagg 11220 tagtttgaca caagaattag aatatagagg tgaaagtcta ttatgcagtt taatatttag 11280 aaatgtatgg ttatataatc agattgctct acaattaaaa aatcatgcat tatgtaacaa 11340 taaactatat ttggacatat taaaggttct gaaacactta aaaacctttt ttaatcttga 11400 taatattgat acagcattaa cattgtatat gaatttacct atgttatttg gtggtggtga 11460 tcccaacttg ttatatcgaa gtttctatag aagaaccccc gacttcctca cagaggctat 11520 agttcactct gtgttcatac ttagttatta tacaaaccat gacttaaaag ataaacttca 11580 agatctgtca gatgatagat tgaataagtt cttaacatgc ataatcacgt ttgacaaaaa 11640 ccctaacgct gaattcgtaa cattgatgag agatcctcaa gctttagggt ctgagagaca 11700 agctaaaatt actagcgaaa tcaataggct ggcagttaca gaggttttga gtacagctcc 11760 aaacaaaata ttctccaaaa gtgcacaaca ttataccact acagagatag atctaaatga 11820 tattatgcaa 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atgaatttta 13500 tacttctaat ctcttctaca ttaattataa cttctcagat aatactcatc tattaactaa 13560 acatataagg attgctaatt ctgaattaga aaataattac aacaaattat atcatcctac 13620 accagaaacc ctagagaata tactagccaa tccgattaaa agtaatgaca aaaagacact 13680 gaatgaatat tgtataggta aaaatgttga ctcaataatg ttaccattgt tatctaataa 13740 gaagcttatt aaatcgtctg caatgattag aaccaattac agcaaacaag atttgtataa 13800 tttattccct atggttgtga ttgatagaat tatagatcat tcaggcaata cagccaaatc 13860 caaccaactt tacactacta cttcccacca aatatcttta gtgcacaata gcacatcact 13920 ttactgcatg cttccttggc atcatattaa tagattcaat tttgtattta gttctacagg 13980 ttgtaaaatt agtatagagt atattttaaa agatcttaaa attaaagatc ccaattgtat 14040 agcattcata ggtgaaggag cagggaattt attattgcgt acagtagtgg aacttcatcc 14100 tgacataaga tatatttaca gaagtctgaa agattgcaat gatcatagtt tacctattga 14160 gtttttaagg ctgtacaatg gacatatcaa cattgattat ggtgaaaatt tgaccattcc 14220 tgctacagat gcaaccaaca acattcattg gtcttattta catataaagt ttgctgaacc 14280 tatcagtctt tttgtctgtg atgctgaatt gcctgtaaca 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taatctaatt ggtttatatg tgtattaact 15180 aaactacgag atattagttt ttgac 15205 <210> 92 <211> 1725 <212> DNA <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain p17_pp <400> 92 atggagttgc caatcctcaa agcgaatgca attaccacaa tcctcactgc agtcacattt 60 tgttttgctt ctagtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt 120 agcaaaggct atcttagtgc tctaagaact ggttggtata ccagtgttat aactatagaa 180 ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa 240 caagaattag ataaatataa aaatgctgta acagaattgc agttgctaat gcaaagcaca 300 ccagcagcaa acaatcgagc cagaagagaa ctaccaaggt ttatgaatta tacactcaac 360 aatgccaaaa aaaccaatgt aacattaagc aaaaaaagga aaagaagatt tcttggtttt 420 ttgttaggag ttggatctgc aatcgccagt ggcattgctg tatctaaggt cctacaccta 480 gaaggggaag tgaacaagat caaaagtgct ctactatcca caaacaaggc tgtagtcagc 540 ttatcaaatg gagttagtgt cttaaccagc aaagtgttag acctcaaaaa ttatatagat 600 aaacaattgt tacctattgt gaacaagcaa agctgcagca tatcaaatat agaaactgtg 660 atagagttcc aacaaaagaa caacagacta ctagagatta ccagggaatt tagtgttaat 720 gcaggtgtaa ctacacctgt aagcacttac atgttgacta atagtgaatt attgtcatta 780 atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aagaagttaa tgtccaacaa tgttcaaata 840 gttagacagc aaagttactc tatcatgtcc ataataaaaa aggaagtctt agcatatgta 900 gtacaattac cactatatgg tgttatagat acaccttgtt ggaaattaca cacatcccct 960 ctatgtacaa ccaacacaaa agaagggtcc aacatctgtt taacaagaac tgacagagga 1020 tggtactgtg acaatgcagg atcagtctct ttcttcccac aagctgaaac atgtaaagtt 1080 caatcgaatc gagtattttg tgacacaatg aacagtttaa cattaccaag tgaagtaaat 1140 ctctgcaatg ttgacatatt caatcccaaa tatgattgta aaattatgac ttcaaaaaca 1200 gatgtaagca gctctgttat cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaact 1260 aaatgtacag catccaataa aaatcgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgcgat 1320 tatgtatcaa ataaaggggt ggacactgtg tctgtaggca acacattata ttatgtaaat 1380 aagcaagaag gcaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa taataaattt ctatgaccca 1440 ttagtattcc cctctggtga atttgatgca tcaatatctc aagtcaacga gaagattaac 1500 cagagcctgg catttattcg taaatccgat gaattattac ataatgtaaa tgctggtaaa 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tctgtgatgc tgaattgcct 5820 gtaacagtca attggagtaa aattataata gaatggagca agcatgtaag aaagtgcaag 5880 tactgttcct cagttaataa atgtatgtta atagtaaaat atcatgctca agatgatatt 5940 gatttcaaat tagacaatat aactatatta aaaacttatg tatgcttagg cagtaagtta 6000 aagggatcgg aggtttactt agtcatcaca ataggtcctg caaatatatt cccagcattt 6060 aatgtagtac aaaatgctaa attgatacta tcaagaacca aaaatttcat catgcctaag 6120 aaagctgata aagagtctat tgatgcaaat attaaaagtt ttataccctt tctttgttac 6180 cctataacaa aaaaaggaat taatactgca ttgtcaaaac taaagagtgt tgttagtgga 6240 gatatactat catattctat agctggacgt aatgaagttt tcagcaataa acttataaat 6300 cataaacata tgaacatctt aaaatggttc aatcatgttt taaatttcag atcaacagaa 6360 ttaaactata accatttata tatggtagaa tctacatatc cttacctaag tgaattgtta 6420 aacagcttga caaccaatga acttaaaaaa ctgattaaaa tcacaggtag tctgttatac 6480 aactttcata atgaataatg aataa 6505 <210> 95 <211> 2166 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus, Merck strain p17_pp <400> 95 Met Asp Pro Ile Ile Asn Gly Asn Ser Ala Asn Val Tyr Leu Thr Asp 1 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Glu Arg Gln Ala Met Asp Ala Val Lys Ile Asn Cys Asn 435 440 445 Glu Thr Lys Phe Tyr Leu Leu Ser Ser Leu Ser Met Leu Arg Gly Ala 450 455 460 Phe Ile Tyr Arg Ile Ile Lys Gly Phe Val Asn Asn Tyr Asn Arg Trp 465 470 475 480 Pro Thr Leu Arg Asn Ala Ile Val Leu Pro Leu Arg Trp Leu Thr Tyr 485 490 495 Tyr Lys Leu Asn Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Leu Thr Glu Arg Asp 500 505 510 Leu Ile Val Leu Ser Gly Leu Arg Phe Tyr Arg Glu Phe Arg Leu Pro 515 520 525 Lys Lys Val Asp Leu Glu Met Ile Ile Asn Asp Lys Ala Ile Ser Pro 530 535 540 Pro Lys Asn Leu Ile Trp Thr Ser Phe Pro Arg Asn Tyr Met Pro Ser 545 550 555 560 His Ile Gln Asn Tyr Ile Glu His Glu Lys Leu Lys Phe Ser Glu Ser 565 570 575 Asp Lys Ser Arg Arg Val Leu Glu Tyr Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Phe 580 585 590 Asn Glu Cys Asp Leu Tyr Asn Cys Val Val Asp Gln Ser Tyr Leu Asn 595 600 605 Asn Pro Asn His Val Val Ser Leu Thr Gly Lys Glu Arg Glu Leu Ser 610 615 620 Val Gly Arg Met Phe Ala Met Gln Pro Gly Met Phe Arg Gln Val Gln 625 630 635 640 Ile Leu Ala Glu Lys Met Ile Ala Glu Asn Ile Leu Gln Phe Phe Pro 645 650 655 Glu Ser Leu Thr Arg Tyr Gly Asp Leu Glu Leu Gln Lys Ile Leu Glu 660 665 670 Leu Lys Ala Gly Ile Ser Asn Lys Ser Asn Arg Tyr Asn Asp Asn Tyr 675 680 685 Asn Asn Tyr Ile Ser Lys Cys Ser Ile Ile Thr Asp Leu Ser Lys Phe 690 695 700 Asn Gln Ala Phe Arg Tyr Glu Thr Ser Cys Ile Cys Ser Asp Val Leu 705 710 715 720 Asp Glu Leu His Gly Val Gln Ser Leu Phe Ser Trp Leu His Leu Thr 725 730 735 Ile Pro His Val Thr Ile Ile Cys Thr Tyr Arg His Ala Pro Pro Tyr 740 745 750 Ile Gly Asp His Ile Val Asp Leu Asn Asn Val Asp Glu Gln Ser Gly 755 760 765 Leu Tyr Arg Tyr His Met Gly Gly Ile Glu Gly Trp Cys Gln Lys Leu 770 775 780 Trp Thr Ile Glu Ala Ile Ser Leu Leu Asp Leu Ile Ser Leu Lys Gly 785 790 795 800 Lys Phe Ser Ile Thr Ala Leu Ile Asn Gly Asp Asn Gln Ser Ile Asp 805 810 815 Ile Ser Lys Pro Ile Arg Leu Met Glu Gly Gln Thr His Ala Gln Ala 820 825 830 Asp Tyr Leu Leu Ala Leu Asn Ser Leu Lys Leu Leu Tyr Lys Glu Tyr 835 840 845 Ala Gly Ile Gly 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Lys Pro Trp Val Gly 1250 1255 1260 Ser Ser Thr Gln Glu Lys Lys Thr Met Pro Val Tyr Asn Arg Gln Val 1265 1270 1275 1280 Leu Thr Lys Lys Gln Arg Asp Gln Ile Asp Leu Leu Ala Lys Leu Asp 1285 1290 1295 Trp Val Tyr Ala Ser Ile Asp Asn Lys Asp Glu Phe Met Glu Glu Leu 1300 1305 1310 Ser Ile Gly Thr Leu Gly Leu Thr Tyr Glu Lys Ala Lys Lys Leu Phe 1315 1320 1325 Pro Gln Tyr Leu Ser Val Asn Tyr Leu His Arg Leu Thr Val Ser Ser 1330 1335 1340 Arg Pro Cys Glu Phe Pro Ala Ser Ile Pro Ala Tyr Arg Thr Thr Asn 1345 1350 1355 1360 Tyr His Phe Asp Thr Ser Pro Ile Asn Arg Ile Leu Thr Glu Lys Tyr 1365 1370 1375 Gly Asp Glu Asp Ile Asp Ile Val Phe Gln Asn Cys Ile Ser Phe Gly 1380 1385 1390 Leu Ser Leu Met Ser Val Val Glu Gln Phe Thr Asn Val Cys Pro Asn 1395 1400 1405 Arg Ile Ile Leu Ile Pro Lys Leu Asn Glu Ile His Leu Met Lys Pro 1410 1415 1420 Pro Ile Phe Thr Gly Asp Val Asp Ile His Lys Leu Lys Gln Val Ile 1425 1430 1435 1440 Gln Lys Gln His Met Phe Leu Pro Asp Lys Ile Ser Leu Thr Gln Tyr 1445 1450 1455 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1855 Gly Asn Leu Leu Leu Arg Thr Val Val Glu Leu His Pro Asp Ile Arg 1860 1865 1870 Tyr Ile Tyr Arg Ser Leu Lys Asp Cys Asn Asp His Ser Leu Pro Ile 1875 1880 1885 Glu Phe Leu Arg Leu Tyr Asn Gly His Ile Asn Ile Asp Tyr Gly Glu 1890 1895 1900 Asn Leu Thr Ile Pro Ala Thr Asp Ala Thr Asn Asn Ile His Trp Ser 1905 1910 1915 1920 Tyr Leu His Ile Lys Phe Ala Glu Pro Ile Ser Leu Phe Val Cys Asp 1925 1930 1935 Ala Glu Leu Pro Val Thr Val Asn Trp Ser Lys Ile Ile Ile Glu Trp 1940 1945 1950 Ser Lys His Val Arg Lys Cys Lys Tyr Cys Ser Ser Val Asn Lys Cys 1955 1960 1965 Met Leu Ile Val Lys Tyr His Ala Gln Asp Asp Ile Asp Phe Lys Leu 1970 1975 1980 Asp Asn Ile Thr Ile Leu Lys Thr Tyr Val Cys Leu Gly Ser Lys Leu 1985 1990 1995 2000 Lys Gly Ser Glu Val Tyr Leu Val Ile Thr Ile Gly Pro Ala Asn Ile 2005 2010 2015 Phe Pro Ala Phe Asn Val Val Gln Asn Ala Lys Leu Ile Leu Ser Arg 2020 2025 2030 Thr Lys Asn Phe Ile Met Pro Lys Lys Ala Asp Lys Glu Ser Ile Asp 2035 2040 2045 Ala Asn Ile Lys Ser Phe Ile Pro Phe Leu Cys Tyr Pro Ile Thr Lys 2050 2055 2060 Lys Gly Ile Asn Thr Ala Leu Ser Lys Leu Lys Ser Val Val Ser Gly 2065 2070 2075 2080 Asp Ile Leu Ser Tyr Ser Ile Ala Gly Arg Asn Glu Val Phe Ser Asn 2085 2090 2095 Lys Leu Ile Asn His Lys His Met Asn Ile Leu Lys Trp Phe Asn His 2100 2105 2110 Val Leu Asn Phe Arg Ser Thr Glu Leu Asn Tyr Asn His Leu Tyr Met 2115 2120 2125 Val Glu Ser Thr Tyr Pro Tyr Leu Ser Glu Leu Leu Asn Ser Leu Thr 2130 2135 2140 Thr Asn Glu Leu Lys Lys Leu Ile Lys Ile Thr Gly Ser Leu Leu Tyr 2145 2150 2155 2160 Asn Phe His Asn Glu Ile 2165

Claims (33)

  1. G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 204의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 205의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 211의 알라닌; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 213의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 221의 글리신; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 223의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 232의 글리신; F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 294의 리신; F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 486의 글리신; L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 148의 알라닌; 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 2054의 페닐알라닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈을 포함하는 생 약독화 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV).
  2. 제1항에 있어서, 바이러스 게놈이 F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 294의 리신; F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 486의 글리신; L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 148의 알라닌; 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 2054의 페닐알라닌을 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 약독화 RSV.
  3. 제2항에 있어서, F 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 각각 서열 18 및 서열 24에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 약독화 RSV.
  4. 제3항에 있어서, F 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 각각 서열 18 및 서열 24에 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것인 약독화 RSV.
  5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 게놈이 각각 서열 17 및 서열 23에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 F 및 L 유전자를 포함하는 것인 약독화 RSV.
  6. 제5항에 있어서, 바이러스 게놈이 각각 서열 17 및 서열 23에 제시된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 F 및 L 유전자를 포함하는 것인 약독화 RSV.
  7. 제1항에 있어서, 바이러스 게놈이 G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 204의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 205의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 211의 알라닌; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 213의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 221의 글리신; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 223의 글루탐산; G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 232의 글리신; F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 294의 리신; F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 486의 글리신; L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 148의 알라닌; 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 2054의 페닐알라닌을 포함하는 단백질을 코딩하는 것인 약독화 RSV.
  8. 제7항에 있어서, G, F 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 각각 서열 12, 서열 18 및 서열 24에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 약독화 RSV.
  9. 제8항에 있어서, G, F, 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 각각 서열 12, 서열 18 및 서열 24에 제시된 아미노산 서열로 구성되는 것인 약독화 RSV.
  10. 제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 게놈이 NS1 유전자의 뉴클레오티드 위치 162의 아데닌, NS2 유전자의 뉴클레오티드 위치 327의 아데닌, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 630의 구아닌, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 654의 구아닌, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 666의 구아닌, 및 G 유전자의 뉴클레오티드 위치 675의 구아닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 약독화 RSV.
  11. 제10항에 있어서, 바이러스 게놈이 NS1 유전자의 뉴클레오티드 위치 162의 아데닌, NS2 유전자의 뉴클레오티드 위치 327의 아데닌, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 630의 구아닌, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 654의 구아닌, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 666의 구아닌, 및 G 유전자의 뉴클레오티드 위치 675의 구아닌을 포함하는 것인 약독화 RSV.
  12. 제11항에 있어서, 바이러스 게놈이 각각 서열 90, 서열 5, 서열 11, 서열 17, 및 서열 23에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 NS1, NS2, G, F 및 L 유전자를 포함하는 것인 약독화 RSV.
  13. 제12항에 있어서, 바이러스 게놈이 각각 서열 90, 서열 5, 서열 11, 서열 17, 및 서열 23에 제시된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 NS1, NS2, G, F 및 L 유전자를 포함하는 것인 약독화 RSV.
  14. 약독화되지 않은 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 바이러스 게놈에 비해 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하는 바이러스 게놈을 포함하고, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 야기하고, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 각각 G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 204, 205, 211, 213, 221, 223, 및 232; 각각 F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 294 및 486; 및 각각 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 148 및 2054로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에 위치하는 것인, 생 약독화 RSV.
  15. 제14항에 있어서, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 204의 아미노산 돌연변이가 글루탐산으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 205의 아미노산 돌연변이가 글루탐산으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 211의 아미노산 돌연변이가 알라닌으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 213의 아미노산 돌연변이가 글루탐산으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 221의 아미노산 돌연변이가 글리신으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 223의 아미노산 돌연변이가 글루탐산으로의 돌연변이이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 232의 아미노산 돌연변이가 글리신으로의 돌연변이이고, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 294의 아미노산 돌연변이가 리신으로의 돌연변이이고, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 486의 아미노산 돌연변이가 글리신으로의 돌연변이이고, L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 148의 아미노산 돌연변이가 알라닌으로의 돌연변이이고, L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 2054의 아미노산 돌연변이가 페닐알라닌으로의 돌연변이인 약독화 RSV.
  16. 제15항에 있어서, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 204의 아미노산 돌연변이가 Lys204Glu이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 205의 아미노산 돌연변이가 Lys205Glu이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 211의 아미노산 돌연변이가 Thr211Ala이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 213의 아미노산 돌연변이가 Lys213Glu이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 221의 아미노산 돌연변이가 Lys221Gly이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 223의 아미노산 돌연변이가 Lys223Glu이고, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 232의 아미노산 돌연변이가 Glu232Gly이고, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 294의 아미노산 돌연변이가 Glu294Lys이고, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 486의 아미노산 돌연변이가 Asp486Gly이고, L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 148의 아미노산 돌연변이가 Asp148Ala이고, L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 위치 2054의 아미노산 돌연변이가 Leu2054Phe인 약독화 RSV.
  17. 제16항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Glu294Lys, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Asp486Gly, L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Asp148Ala, 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Leu2054Phe을 포함하는 것인 약독화 RSV.
  18. 제17항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Lys204Glu, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Lys205Glu, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Thr211Ala, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Lys213Glu, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Lys221Gly, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Lys223Glu, G 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Glu232Gly, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Glu294Lys, F 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Asp486Gly, L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Asp148Ala, 및 L 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 Leu2054Phe을 포함하는 것인 약독화 RSV.
  19. 제14항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 야기하는 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이가 G 유전자의 위치 610, 613, 631, 637, 639, 661, 662, 667, 668, 695 및 696; F 유전자의 위치 880 및 1457; 및 L 유전자의 위치 443 및 6162로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 위치에 위치하는 것인 약독화 RSV.
  20. 제19항에 있어서, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 610의 뉴클레오티드 돌연변이가 A610G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 613의 뉴클레오티드 돌연변이가 A613G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 631의 뉴클레오티드 돌연변이가 A631G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 637의 뉴클레오티드 돌연변이가 A637G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 639의 뉴클레오티드 돌연변이가 A639G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 661의 뉴클레오티드 돌연변이가 A661G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 662의 뉴클레오티드 돌연변이가 A662G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 667의 뉴클레오티드 돌연변이가 A667G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 668의 뉴클레오티드 돌연변이가 A668G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 695의 뉴클레오티드 돌연변이가 A695G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 696의 뉴클레오티드 돌연변이가 A696G이고, F 유전자의 뉴클레오티드 위치 880의 뉴클레오티드 돌연변이가 G880A이고, F 유전자의 뉴클레오티드 위치 1457의 뉴클레오티드 돌연변이가 A1457G이고, L 유전자의 뉴클레오티드 위치 443의 뉴클레오티드 돌연변이가 A443C이고, L 유전자의 뉴클레오티드 위치 6162의 뉴클레오티드 돌연변이가 G6162T인 약독화 RSV.
  21. 제20항에 있어서, 바이러스 게놈이 NS1 유전자의 위치 162, NS2 유전자의 위치 327, G 유전자의 위치 630, G 유전자의 위치 654, G 유전자의 위치 666, 및 G 유전자의 위치 675로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 위치에 존재하는 하나 이상의 침묵 뉴클레오티드 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 약독화 RSV.
  22. 제21항에 있어서, NS1 유전자의 뉴클레오티드 위치 162의 뉴클레오티드 돌연변이가 T162A이고, NS2 유전자의 뉴클레오티드 위치 327의 뉴클레오티드 돌연변이가 G327A이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 630의 뉴클레오티드 돌연변이가 A630G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 654의 뉴클레오티드 돌연변이가 A654G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 666의 뉴클레오티드 돌연변이가 A666G이고, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 675의 뉴클레오티드 돌연변이가 A675G인 약독화 RSV.
  23. 제22항에 있어서, 바이러스 게놈이 NS1 유전자의 뉴클레오티드 위치 162에서의 T162A, NS2 유전자의 뉴클레오티드 위치 327에서의 G327A, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 610에서의 A610G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 613에서의 A613G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 630에서의 A630G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 631에서의 A631G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 637에서의 A637G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 639에서의 A639G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 654에서의 A654G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 661에서의 A661G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 662에서의 A662G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 666에서의 A666G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 667에서의 A667G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 668에서의 A668G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 675에서의 A675G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 695에서의 A695G, G 유전자의 뉴클레오티드 위치 696에서의 A696G, F 유전자의 뉴클레오티드 위치 880에서의 G880A, F 유전자의 뉴클레오티드 위치 1457에서의 A1457G, L 유전자의 뉴클레오티드 위치 443에서의 A443C, 및 L 유전자의 뉴클레오티드 위치 6162에서의 G6162T의 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하는 것인 약독화 RSV.
  24. 제1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 생 약독화 RSV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
  25. 제1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 생 약독화 RSV를 코딩하는 게놈 또는 항게놈 서열을 포함하는 핵산 분자.
  26. 제25항에 있어서, 상기 핵산 분자가 발현 벡터인 핵산 분자.
  27. 제26항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  28. 제1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 약독화 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)를 포함하는 생 약독화 RSV 집단.
  29. 제28항의 생 약독화 RSV 집단 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
  30. (a) 제1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 약독화된 RSV;
    (b) 제28항에 따른 약독화된 RSV 집단;
    (c) 제24항에 따른 면역원성 조성물; 또는
    (d) 제29항에 따른 면역원성 조성물
    중 하나 이상의 면역학상 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 RSV 감염에 대한 보호 면역 반응을 생성시키는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
  32. 면역학상 유효량의,
    (a) 제1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 약독화된 RSV;
    (b) 제28항에 따른 약독화된 RSV 집단;
    (c) 제24항에 따른 면역원성 조성물; 또는
    (d) 제29항에 따른 면역원성 조성물
    중 하나 이상의 환자에서 RSV 감염에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 의약 제조에서의 용도.
  33. 제32항에 있어서, 환자가 인간인 용도.
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