MX2011004719A - Virus sincitial respiratorio vivo atenuado. - Google Patents

Abstract

La presente invención divulga virus sincitiales respiratorios (VSR) vivos atenuados útiles como vacunas contra infecciones por VSR y/o el desarrollo de severas enfermedades asociadas con el VSR. Los virus divulgados están atenuados hasta el punto que no son patógenos al administrarse en un sujeto pero retienen de manera sustancial las propiedades antigénicas e inmunogénicas del VSR silvestre.

Description

VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO VIVO ATENUADO REFERENCIA RECÍPROCA CON SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional estadounidense No. 61/198.327, presentada el 5 de noviembre de 2008, la cual se incorpora en la presente como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus sincitial respiratorio humano (VSR) es un virus ARN monocatenario negativo y un miembro del género Pneumoviras, familia Paramyxoviradae. VSR es la causa principal de neumonía viral y bronquiolitis en niños menores de 1 año y es una causa principal de hospitalización y enfermedad fatal del tracto respiratorio en estos niños. También puede desarrollarse enfermedad seria en niños con ciertas enfermedades precedentes (ej., inmunodeficiencias, enfermedad cardiaca congénita, y displasia broncopulmonar). Virtualmente todos los niños están infectados a la edad de 2 años, y la reinfección es común en niños mayores y adultos. (Chanock, en Viral Infections of Humans, 3ra edición, A. S. Evans, ed., Plenum Press, N.Y. (1989)) En adultos saludables, la mayoría de infecciones son asintomáticas y generalmente están confinadas a enfermedad leve del tracto respiratorio superior; sin embargo, los pacientes mayores e individuos inmunocomprometidos tienen mayor probabilidad de tener infecciones severas y posiblemente que ponen la vida en peligro.

Se han identificado dos subgrupos antigénicos principales de VSR, A y B, así como también varios genotipos diferentes dentro de cada subgrupo (Anderson, 1985, J. Infect. Dis. 151 :626-633; Mufson, 1985, J. Gen, Virol. 66:2111-2124). Los dos subgrupos antigénicos son aproximadamente 25% antigénicamente relacionados mediante análisis de neutralización cruzada recíproca. Se han encontrado múltiples variantes que co-circulan en epidemias que suceden anualmente en meses hacia el final de otoño, invierno y primavera en climas templados (Anderson, 1991 , J. Infect. Dis. 163:687-692). Existe evidencia que niños infectados con uno de los subgrupos VSR principales pueden ser protegidos contra re-infección por el subgrupo homólogo (Mufson, 1987, J. Clin. Microbiol 26:1595-1597). Esto, junto con evidencia que inmunidad protectora se acumulará después de infecciones repetidas, indica que es factible desarrollar un régimen de vacunación VSR para infantes y niños pequeños el cual suministraría suficiente inmunidad para proteger contra enfermedad grave y muerte.

Un genoma VSR nativo típicamente comprende una molécula polinucleótida negativa la cual, a través de ARNms virales complementarios, codifica once especies de proteínas virales, es decir, las especies no estructurales NS1 y NS2, N, P, matriz (M), hidrofóbicas pequeñas (SH), glicoproteina (G), fusión (F), M2(ORFI), M2(ORF2), y L, sustancialmente como se describe en Mink et al, 1991 , Virology 185:615-624; Stec, 1991 , Virology 183:273-287; y Connors, 1995, Virology. 208:478-484.

Mientras una profilaxis inmune, Synagis®, es actualmente comercializado para la prevención de enfermedades asociadas con VSR en niños prematuros, de alto riesgo, a pesar de décadas de investigación, no existe una vacuna segura y efectiva para combatir infección por VSR y las enfermedades clínicas asociadas. Los anticuerpos secretorios parecen ser más importantes para proteger el tracto respiratorio superior, mientras altos niveles de anticuerpos séricos se consideran tienen un papel principal en resistencia a infección por VSR en el tracto respiratorio inferior. Sin embargo, las preparaciones de inmunoglobulina humana purificada (Ig) sufren de la posibilidad de transmitir virus de transmisión sanguínea, mientras las preparaciones Ig recombinantes son costosas de fabricar.

Los primeros intentos (1966) para vacunar niños pequeños utilizaron una vacuna VSR inactivada por formalina, administrada parenteralmente. Desafortunadamente, la administración de esta vacuna en varios ensayos de campo se mostró específicamente asociada con el desarrollo de una enfermedad significativamente exacerbada después de infección natural subsiguiente con VSR (Kapikian, 1968, Am. J Epidemiol. 89:405-421 ; Kim, 1969, Am. J Epidemiol. 89:422-434; Fulginiti, 1969, Am. J Epidemiol. 89:435-448; Chin ; 1969, Am. J Epidemiol. 89:449-463). Las razones del porque esta vacuna aumentó la enfermedad de VSR no son claras. Se ha indicado que esta inoculación a antígenos VSR produjo una respuesta inmune anormal o no balanceada la cual conllevó a una potenciación inmunopatológica de enfermedad natural (Kim, 1976, Pediatr. Res. 10:75-78; Prince, 1986, Virol. 57:721-728).

El uso de una vacuna de virus atenuado vivo o con vector vivo tiene varias ventajas sobre vacunas de virus inactivos o de subunidades virales. Las vacunas de virus atenuado vivo pueden imitar la infección viral natural, activando eficientemente el sistema inmune del huésped, y tienen mayor probabilidad que una vacuna de subunidad o inactivada de proporcionar inmunidad robusta comprende componentes tanto humorales como celulares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente solicitud divulga cepas vivas de virus sincitial respiratorio (VSR) apropiadas para inmunización de un sujeto, incluyendo humanos, contra infección tipo silvestre por VSR. Las cepas suministradas son apropiadamente atenuadas para producir una respuesta inmune en un sujeto vacunado que proteja contra enfermedades respiratorias graves asociadas con infección por VSR sin causar enfermedad respiratoria por inmunización con la misma. Las cepas atenuadas fueron desarrolladas al pasar una cepa del VSR humano tipo silvestre de manera fenotipica del subgrupo A en células Vero a una multiplicidad fija. El análisis de secuencias muestra que se indujeron mutaciones a través del proceso de pasaje, resultando en una cepa del VSR genéticamente estable, inmunogénica, protectora, y avirulenta.

Diferentes aspectos de la presente invención están dirigidos a un VSR atenuado vivo que comprende: (1) una o más mutaciones nucleótidas y/o aminoácidas identificadas en la presente; (2) un genoma viral el cual comprende una o más de las mutaciones nucleótidas y/o codifica una o más de las mutaciones aminoácidas identificadas en el VSR atenuado divulgado en la presente; y/o (3) un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida bien sea que tiene una o más de las mutaciones nucleótidas descritas en la presente o que codifica una o más mutaciones aminoácidas descritas en la presente.

La referencia a "mutación" se refiere a la presencia de un aminoácido o nucleótido diferente en una posición aminoácida o nucleótida especificada dentro de una secuencia proteica o una secuencia génica y/o genómica, respectivamente, a la proporcionada en una secuencia de referencia o tipo silvestre. La mutación resultante puede directamente introducirse en la secuencia de referencia o tipo silvestre o puede proporcionarse por una secuencia diferente de la secuencia de referencia o tipo silvestre, siempre y cuando el resultado final suministre la mutación indicada.

Un VSR atenuado vivo de la presente invención es inmunogénico y protector contra bien sea infección por VSR o el desarrollo de enfermedad respiratoria severa asociada con infección por VSR. En una realización preferida, un VSR atenuado vivo es un VSR humano apropiado para inmunización contra infección tipo silvestre por VSR del subgrupo A y/o B. También se divulgan en la presente composiciones farmacéuticas que comprenden dicho VSR atenuado vivo y métodos de tratar un sujeto, preferiblemente un humano, contra infección por VSR al administrar dichas composiciones.

Ejemplos de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia bien sea que codifica una o más mutaciones aminoácidas como se describe en la presente o que tiene una o más mutaciones nucleótidas como se describe en la presente incluyen: (1) secuencias genómicas del VSR de longitud completa basadas en una secuencia de referencia del VSR de longitud completa particular; (2) diferentes regiones de ácidos nucleicos del VSR basadas en secuencias de ácidos nucleicos de VSR en particular descritas en la presente; (3) secuencias genómicas parciales que comprenden una o más secuencias de ácidos nucleicos del VSR en particular descritas en la presente; y, (4) secuencias genómicas de longitud completa que contienen una o más secuencias de ácidos nucleicos del VSR en particular descritas en la presente. La referencia a una secuencia de ácidos nucleicos del VSR en particular incluye una secuencia específica y/o la identidad indicada a una secuencia específica.

El término "tratar" o "tratamiento" se refiere a ambos tratamiento terapéutico y/o profiláctico, incluyendo prevención o reducción de infección o reinfección, o la reducción o eliminación de síntomas, enfermedades, o condiciones asociadas con infección por VSR. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen la población general y/o pacientes infectados con VSR. Ejemplos de aquellos en necesidad incluyen aquellos ya tienen un trastorno o trastornos asociados con VSR, aquellos propensos a desarrollar tal trastorno, y/o aquellos en los cuales tal trastorno se pretende evitar.

Un "trastorno" es cualquier condición que resulta completamente o en parte a partir de infección por VSR, incluyendo pero sin limitar a neumonía y bronquiolitis. Abarcados por el término "trastorno" están los trastornos o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen el mamífero al trastorno en cuestión.

El término "proteger" o "protección," cuando se utiliza en el contexto de un virus atenuado o método de tratamiento de la presente invención, significa reducir la probabilidad de infección por VSR, reinfección, un trastorno o trastornos que resultan a partir de infección por VSR, así como también reducir la severidad de la infección, reinfección y/o un trastorno o trastornos que resultan a partir de tal infección.

El término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad suficiente que, cuando se introduce en un huésped vertebrado, preferiblemente un huésped humano, resulta en una respuesta inmune protectora. Alguien experto en el estado de la técnica reconoce que este nivel puede variar.

El VSR atenuado vivo descrito en la presente puede variarse a partir de cualquier subgrupo VSR (A o B) o cepa (ej., humana, bovina, murina), preferiblemente derivado a partir de humano. Para crear una respuesta inmune protectora, la cepa del VSR puede ser una la cual es endógena al sujeto inmunizado, tal como VSR humano utilizado para inmunizar humanos.

El término "tipo silvestre" o "wt," en referencia a una cepa del VSR, se refiere tanto a virus que tienen una secuencia genómica que es tipo silvestre en marcadores conocidos para atenuación y/o virus que son fenotípicamente tipo silvestre (es decir, no atenuados), como se muestra en cualquiera un modelo in vivo (ej., en un humano u otro modelo animal apropiado) o modelo in vitro de atenuación. El término "tipo silvestre," en referencia a una proteína del VSR o secuencia de ácido nucleico (ej., génica, genómica) se refiere a una secuencia que no contiene marcadores conocidos por contribuir a un fenotipo atenuado.

"Virus atenuado, vivo" en referencia a un VSR divulgado en la presente, se refiere a un virus que es tanto genotípicamente diferente a partir de un VSR tipo silvestre (es decir, que comprende diferencias en la secuencia genómica) como fenotípicamente diferente a partir de dicho virus tipo silvestre (es decir, como se evidenció por un fenotipo atenuado). Un virus atenuado es fenotípicamente diferente al presentar virulencia reducida mientras permanece viable (o "vivo"); así, el virus puede presentar diferentes grados de atenuación. Aquellos VSRs atenuados vivos de la presente invención son atenuados, haciéndolos no patogénicos en un huésped. Un virus incompletamente atenuado presenta una reducción en patogénesis pero aún es capaz de generar una respuesta patológica en un huésped. Un VSR atenuado vivo de la presente invención puede derivarse naturalmente (ej., vía el paso de una cepa tipo silvestre o incompletamente atenuada) o producirse de manera recombinante. Si se produce de manera recombinante, el VSR recombinante incluye un VSR o partícula viral o subviral tipo VSR derivada directa o indirectamente a partir de un sistema de expresión recombinante o propagada a partir de virus o partículas subvirales producidas a partir del mismo. El VSR atenuado vivo divulgado en la presente está en una forma aislada y típicamente purificada.

"Sustancialmente similar" significa que una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos dada comparte al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, y aún más preferiblemente al menos 95% o al menos 99% de identidad con una secuencia de referencia, según se indica por el contexto del texto. La identidad de secuencia con una secuencia de referencia se determina al alinear una secuencia con la secuencia de referencia y determinar el número de nucleótidos o aminoácidos idénticos en las regiones correspondientes. Este número es dividido por el número total de aminoácidos en la secuencia de referencia, multiplicado por 100, y luego redondeado al número entero más cercano. La identidad de secuencia puede determinarse por un número de algoritmos de comparación de secuencias reconocidos en el estado de la técnica o mediante inspección visual (ver generalmente Ausubel, F M, Current Protocols in Molecular Biology, 4, John Wiley & Sons, Inc., Brooklyn, N.Y., A.1 E.1-A.1 F.11 , 1996-2004). Una secuencia aminoácido o de ácidos nucleicos sustancialmente similar de la presente invención, si ésta codifica o consta de la proteína NS2, G, L o F, mantendrá una o más de las mutaciones nucleótidas o aminoácidas identificadas dentro de p17, descritas en detalle más adelante.

La referencia a "aislado" indica una forma diferente de la encontrada en la naturaleza o en otro diferente del ambiente nativo del virus tipo silvestre, tal como la nasofaringe de un individuo infectado. Así, un virus aislado puede ser un componente heterólogo de un cultivo celular u otro sistema. La forma diferente puede ser, por ejemplo, una pureza diferente de la encontrada en la naturaleza y/o una estructura que no es encontrada en naturaleza.

La referencia a términos abiertos tales como "comprende" tiene en cuenta elementos o pasos adicionales. Ocasionalmente, frases tales como "uno o más" se utilizan con o sin términos abiertos para resaltar la posibilidad de elementos o pasos adicionales.

A menos que explícitamente se afirme, la referencia a términos tales como "un," "una," y "el" no se limita a uno e incluye la referencia plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Por ejemplo, "una célula" no excluye "células." Ocasionalmente, frases tales como "uno o más" se utilizan para resaltar la posible presencia de una pluralidad.

El término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo un humano.

La abreviatura "Kb" se refiere a kilobases.

La abreviatura "pfu" se refiere a unidades formadoras de placas.

La abreviatura "ORF" se refiere al marco de lectura abierta de un gen.

Otras características y ventajas de la presente invención son manifiestas a partir de las descripciones adicionales proporcionadas en la presente incluyendo los diferentes ejemplos. Los ejemplos proporcionados ilustran diferentes componentes y metodologías útiles para practicar la presente invención. Los ejemplos no limitan la invención reivindicada. Con base en la presente divulgación el experto puede identificar y emplear otros componentes y metodología útiles para realizar la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra una alineación de las secuencias aminoácidas de la proteína NS2 a partir de una cepa tipo silvestre de VSR, VSRh S2 (SEQ ID NO: 2; ver Número de Acceso en Genbank NCBI U39662; Tolley, 1996, Vaccine 14:1637-1646), cepa Merck 287 (SEQ ID NO: 4) y p17 (SEQ ID NO: 6). Los aminoácidos con subrayado sencillo indican diferencias en la proteína NS2 entre la cepa VSRh S2 y ambas las cepas Merck 287 y p17. La secuencia aminoácida NS1 de Merck cepa p17_pp es la misma que para p17 (SEQ ID NO: 6).

La figura 2 muestra una alineación de las secuencias aminoácidas de la proteína G a partir de VSRh S2 (SEQ ID NO: 8), cepa Merck 287 (SEQ ID NO: 10) y p17 (SEQ ID NO: 12). Los aminoácidos con subrayado sencillo indican diferencias en la proteína G entre la cepa VSRh S2 y ambas las cepas Merck 287 y p17. Los aminoácidos con subrayado doble indican diferencias entre la cepa p17 y ambas la cepas hV S2 y Merck 287. La secuencia aminoácida G de la cepa Merck p17_pp es la misma que para p17 (SEQ ID NO: 12).

Las figuras 3A y 3B muestran una alineación de las secuencias aminoácidas de la proteína F a partir de VSRh S2 (SEQ ID NO: 14), cepa Merck 287 (SEQ ID NO: 16) y p17 (SEQ ID NO: 18). Los aminoácidos con subrayado sencillo indican diferencias en la proteina F entre la cepa VSRh S2 y ambas las cepas Merck 287 y p17. Los aminoácidos con subrayado doble indican diferencias entre la cepa p17 y ambas las cepas VSRh S2 y Merck 287. La posición aminoácida 294 de SEQ ID NO: 18 se designa como una "X," que representa bien sea un residuo Glu o Lys. La posición aminoácida 486 de SEQ ID NO: 18 también se designa como una "X," que representa bien sea un residuo Asp o Gly.

Las figuras 4A-4G muestran una alineación de las secuencias aminoácidas de la proteína L a partir de VSRh S2 (SEQ ID NO: 20), cepa Merck 287 (SEQ ID NO: 22) y pl7 (SEQ ID NO: 24). Los aminoácidos con subrayado sencillo indican diferencias en la proteína L entre la cepa VSRh S2 y ambas las cepas Merck 287 y p17. Los aminoácidos con subrayado doble indican diferencias entre la cepa p17 y ambas las cepas VSRh S2 y Merck 287. La posición aminoácida 148 de SEQ ID NO: 24 se designa como una "X," que representa bien sea un residuo Asp o Ala. La posición aminoácida 2054 también se designa como una "X," que representa bien sea un residuo Leu o Phe.

La figura 5 compara títulos virales (pfu/gramo de tejido) de la cepa VSRh A2 tipo silvestre (Huang y Wetz, 1982, J. Virol 43:150), pasaje 3 de cepa Merck 287 ("p3"), y pasaje 17 de cepa Merck 287 ("pl7") en muestras tanto de nariz como de pulmón a partir de ratones de algodón inoculadas de manera intranasal con dicho virus.

La figura 6 compara los títulos virales (pfu/gramo de tejido) de la cepa VSRh A2 tipo silvestre, pasaje 3 de la cepa Merck 287 ("p3"), y pasaje 17 de la cepa Merck 287 ("pl7") en ambas muestras de nariz y de pulmón a partir de monos verdes africanos inoculados con dicho virus mediante rutas intranasales o intratraqueales combinadas.

La figura 7 compara títulos virales (pfu/gramo de tejido) de pasajes 3 ("p3"), 5 ("p5"), 10 ("plO") y 15 ("pl5") de la cepa Merck 287 en muestras tanto de nariz como de pulmón a partir de ratones de algodón inoculadas de manera intranasal con dicho virus.

La figura 8 compara los títulos de anticuerpos seroneutralizantes (SN) contra VSRh A2 tipo silvestre después de inmunización con wt VSRh A2, pasaje 3 de cepa Merck 287 ("p3") o pasaje 17 de la cepa Merck 287 ("pl7") en los días 14, 28 y 56 después de inmunización en ratones de algodón. Los ratones se inmunizaron intramuscularmente con el virus.

La figura 9 compara los títulos virales (pfu/gramo de tejido) en muestras de nariz y de pulmón de ratones de algodón primero inmunizados intramuscularmente con bien sea VSRh A2 tipo silvestre, cepa Merck 287 p3 o cepa Merck 287 p17, o no virus, y luego inoculados intranasalmente con 1055 pfu de wt A2 virus.

La figura 10 compara los títulos de anticuerpos seroneutralizantes (SN) contra VSRh A2 tipo silvestre en monos verdes africanos veintiocho días después de inmunización con el pasaje 17 de la cepa Merck 287 ("p17") o no virus ("ninguno") en la nariz y pulmón. Los monos fueron inmunizados intramuscularmente.

La figura 11 compara los títulos virales medios (pfu/ml) en muestras de nariz y de pulmón de monos verdes africanos primero inmunizados intramuscularmente con cualquiera la cepa Merck 287 p17 o no virus, y luego expuestos mediante inoculación intranasal e intratraqueal con 105 5 pfu de wt A2 virus.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un virus sincitial respiratorio vivo atenuado (VSR) para utilizar como una vacuna contra infección por VSR y/o el desarrollo de enfermedades asociadas con VSR. El virus divulgado en la presente es atenuado tal que no sea patogénico cuando se administra a un sujeto, preferiblemente un humano, pero sustancialmente retiene las propiedades antigénicas e inmunogénícas de VSR tipo silvestre. Como tal, los virus atenuados divulgados en la presente son útiles para estimular una respuesta inmune protectora en un mamífero inoculado sin producir los síntomas respiratorios causados por virus tipo silvestre.

I. VSR Atenuado Vivo Los virus VSR atenuados vivos descritos en la presente fueron identificados mediante el pasaje serial de una cepa tipo VSRh A, de aquí en adelante llamada "cepa Merck 287," "cepa 287," o "pO." La cepa Merck 287 fue derivada a partir de una cepa del VSR que inicialmente se amplificó dos veces en células GMK. Después de esta amplificación inicial, el virus fue sometido a cinco pasajes adicionales en la línea celular diploide humana, Wl-38. Este material del pasaje 5, renombrado cepa Merck 287, fue secuenciado y mostrado ser tanto genéticamente tipo silvestre en marcadores genéticos conocidos para atenuación como fenotípicamente tipo silvestre (ver Ejemplos, más adelante).

La cepa Merck 287 fue pasada en células renales de mono VERO CCL-81 a una multiplicidad fija. Los títulos de virus permanecieron constantes al pasar, y el efecto citopático del virus en el cultivo también fue consistente. La atenuación de los virus pasados se monitoreó al medir una reducción en eliminación viral en modelos roedores y primates in vivo. Se observó una atenuación marcada entre el pasaje 3 (p3) y pasaje 17 (p17) en ambos el modelo de ratones de algodón y monos verdes Africanos, mostrando una reducción 2-4 log en carga viral. La comparación de secuencias del ADN genómico aislado a partir de la población viral p17 con la cepa Merck original 287 identificó mutaciones nucleótidas dentro del genoma p17, la mayoría de las cuales están localizadas dentro de los genes que codifican las proteínas G, F, y L (de aquí en adelante conocidos como los genes G, F y L, respectivamente). P17 contiene un total de 21 diferencias nucleótidas y 11 diferencias aminoácidas cuando se compara con la cepa Merck 287. Un virus purificado por placa derivado a partir de p17 (pl7_pp) contiene una mutación nucleótida adicional cuando se compara con la cepa Merck 287. El análisis de secuencia adicional se realizó sobre el pasaje 5 (p5), pasaje 10 (plO) y pasaje 15 (p15) para monitorear los cambios genéticos sobre el proceso de pasaje, así como también sobre el pasaje 18 (p18) y pasaje 22 (p22) para medir la estabilidad genética de las mutaciones inducidas. También se realizaron estudios de inmunogenicidad y protección. Estos estudios muestran que la cepa p17 divulgada en la presente es genéticamente estable, inmunogénica y protectora, y avirulenta. Así, un VSR atenuado vivo de la presente invención puede utilizarse como una vacuna para proteger contra enfermedad causada por infección con VSR.

Un resumen detallado de la comparación de secuencias entre la cepa Merck 287 (pasaje 0 o "pO") y varias cepas pasadas de las mismas puede encontrarse en los Ejemplos 2 y 4, más adelante. Brevemente, el genoma viral de longitud completa para pO, pl7, y pl7_pp (un virus purificado por placa derivado a partir de p17) fueron secuenciados y comparados, así como también las secuencias diana de los pasajes 5,10,15, y 18. La secuencia genómica de la cepa Merck 287 es divulgada en la presente como SEQ ID NO: 25. Las secuencias genómicas de p17 y la cepa p17_pp son divulgadas en la presente como SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 91 , respectivamente. La ubicación del 21 diferencias nucleótidas entre los genomas virales de la cepa Merck 287 y p17, así como también las mutaciones nucleótidas específicas, son listadas en la Tabla 5 (más adelante) (ej., una mutación alanina (A) a guanina (G) en la posición 5295). La secuencia genómica de la cepa P17_pp es divulgada en la presente como SEQ ID NO: 91. La secuencia genómica de p17_pp es la misma que para p17 con la excepción de una mutación nucleótida silenciosa adicional dentro del gen que codifica la proteína NS1 (en la posición nucleótida 162 del gen NS1). La Tabla 8 (más adelante) compara las diferencias nucleótidas entre la cepa Merck 287, p17 y pl7_pp. Las Tablas 6 y/o 9 (más adelante) también listan la ubicación de las mutaciones nucleótidas dentro de las secuencias genómicas p17 y p17_pp, así como también la ubicación correspondiente de cada mutación dentro de un marco de lectura abierta de un gen del VSR (ORE). Por ejemplo, la mutación en la posición 5295 del genoma viral p17 corresponde a una mutación en la posición nucleótida 610 del marco de lectura abierta del gen G. Las Tablas 6 y 9 adicionalmente listan si o no una mutación puntual particular, o combinación de mutaciones puntuales, genera una amino sustitución, así como también la posición aminoácida de dicha sustitución. Por ejemplo, la mutación en la posición nucleótida 5295 del genoma viral p17 conlleva a una sustitución aminoácida desde lisina (LYS) a ácido glutámico (GLU) en la posición del residuo aminoácido 204 de la proteina G. De las 21 diferencias nucleótidas entre p17 y la cepa Merck 287 (y las 22 diferencias nucleótidas entre las cepas pl7_pp y Merck 287), una diferencia nucleótida es localizada dentro de una región no traducida del genoma viral (es decir, nucleótido 15046 dentro de la región 5' no traducida).

De las 21 diferencias nucleótidas identificadas en el genoma viral p17, comparadas por la cepa precursora pO (cepa Merck 287), cuatro de las diferencias nucleótidas pueden representar polimorfismos dentro de la población viral que se encuentra dentro del pasaje 17, localizados en las posiciones nucleótidas 6538, 7115, 8937 y 14656 del genoma viral VSR (ver Ejemplo 2, más adelante). Estas posiciones son designadas con una "n" en SEQ ID NO: 26. La "n" en la posición 6538 puede ser cualquiera una G o A; la "n" en la posición 7115 puede cualquiera una A o G; la "n" en la posición 8937 puede cualquiera una A o C; y, la "n" en la posición 14656 puede cualquiera una G o T. Estos polimorfismos nucleótidos también son marcados con una "n" en las secuencias génicas que corresponden a los genes F y L (SEQ ID NOs: 17 y 23, respectivamente) y con una "x" en las secuencias proteicas que corresponden a las proteínas F y L (SEQ ID NOs: 18 y 24, respectivamente). Los polimorfismos representan la existencia de dos (o más) formas de un gen dentro de una población, en donde cada forma es demasiado común para deberse meramente a una mutación menor nueva. Dos de estos polimorfismos potenciales están localizados dentro de la región codificadora para la proteína F, y dos están localizados dentro de la región codificadora de la proteína L. Estos polimorfismos son evidentes en cromatogramas de secuencia, representados por picos dobles que corresponden a al menos dos nucleótidos. Los polimorfismos indican que la población de virus dentro del pool p17 de virus desde el cual el ADN se extrajo para análisis de secuencia no es una población homogénea de virus. Cada uno de estos cuatro polimorfismos nucleótidos induce una sustitución aminoácida (ver Ejemplo 2, más adelante,).

La cepa del VSR p17 fue purificada por placa a una población clonal, virus p17_pp, y secuenciada (ver Ejemplo 4, más adelantej. Además de identificar una mutación silenciosa en el nucleótido 162 del gen que codifica la proteína NS1 dentro del genoma p17_pp, los polimorfismos identificados dentro de los genes que codifican las proteínas L y F de p17 fueron resueltos (ver Tablas 8 y 9, más adelante Así, los genes que codifican las proteínas F y L del virus p17_pp virus son divulgadas en la presente como SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 94, respectivamente, y las proteínas codificadas son SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 95.

La Tabla 7 (dentro del Ejemplo 2, más adelante) muestra la progresión de mutaciones inducidas sobre el pasaje de la cepa Merck 287 descrita en la presente. Por ejemplo, solamente se observa una mutación nucleótida en el pasaje 5 (p5), localizada en la posición nucleótida 954 del genoma VSR. El número de mutaciones nucleótidas aumenta sobre el proceso de pasaje, y por p15, al menos 20 de las 21 mutaciones nucleótidas dentro de p17 están presentes. Mientras las veintiún diferencias nucleótidas observadas en pl7, localizadas en el nucleótido 15046 del genoma viral dentro de la región 5' no traducida, pueden estar presentes en p 5, el segmento génico que contiene esa porción del genoma viral p15 no fue secuenciada.

Los resultados en la Figura 7 resaltan la relación entre el pasaje viral y el grado de atenuación, comparando la replicación in vivo de p3, p5, p10, y p15 (ver también Ejemplo 3, más adelante). El Pasaje 5 (p5) ya comienza a mostrar la replicación reducida comparada con p3. Los pasajes 10 (p10) y 15 (p15) presentan una reducción aún adicional en replicación, con una reducción marcada en replicación entre p10 y p15. El virus p15 parece ser tan atenuado como el virus p17 descrito anteriormente (ver Figura 5). Cuando se compara con el arreglo de mutaciones presentes dentro de p10 y p15, p15 tiene solamente dos diferencias nucleótidas adicionales, localizadas dentro de las regiones codificadoras de proteínas F y L. Por lo tanto, y sin ser limitados por cualquier teoría particular, es posible que las mutaciones dentro de las regiones codificadoras de proteínas F y/o L son particularmente importantes para atenuar VSR. Un estudio de la atenuación del derivado purificado por placa de p17, p17_pp, muestra que el virus es tan atenuado como la cepa p17 precursora (ver Ejemplo 4, más adelante).

La Tabla 1 proporciona un resumen de los Números de Identificación de Secuencias (SEQ ID NOs) para los marcos de lectura abierta de los genes NS1 , NS2, G, F, y L y las proteínas codificadas para la cepa Merck 287 (MRK287), pl7, p17_pp, y una cepa tipo silvestre publicada, VSRh S2 (divulgada en Número de Acceso en Genbank NCBI. U39662; Tolley, 996, Vaccine 14:1637-1646).

TABLA 1 VSR es un genoma de ARN de hebra sencilla no segmentado de sentido negativo. Como tal, no ocurre reagrupación de segmentos genómicos. Sin embargo, una dependencia de polimerasa de ARN verificando habilidad del ARN en revisar y editar resulta en el genoma del VSR siendo bastante mutable. Estudios de secuencia de varios genes VSR han confirmado la división de VSR humano en dos grupos principales (A y B), mientras también identifican muchas variantes o linajes dentro de cada grupo (ver, ej., Peret, 1998, J. Gen. Virol 79:2221-2229). Entre los dos subgrupos antigénicos de VSR humano, identidad de secuencia aminoácida está en el rango desde 96% (para la proteina N) a 53% (para la proteina G) (Johnson, 1987, Proc. Nati Acad Sci. USA 84:5625-5629). Dentro de cepas del grupo A y grupo B, la proteína G muestra hasta 20% y 9% de diversidad aminoácida, respectivamente (Cañe., 1991 , J. Gen. Virol. 72:649-357; Sullender, 1991 , J.

Virol. 65:5425-5434).

Como ejemplos de esta heterogeneidad genética, las alineaciones de las proteínas NS2, G, F y L a partir de las cepas Merck 287, p17, y VSRh S2 puede encontrarse en las Figuras 1 , 2, 3A-3B y 4A-4G, respectivamente. Como se muestra en la alineación de las proteínas NS2s en Figura 1 , mientras no haya diferencias aminoácidas entre cepa Merck 287 y la cepa pasaje p17 descrita en la presente, existen dos diferencias aminoácidas entre la cepa VSRh S2 tipo silvestre y ambas la cepa Merck 287 y p17 (subrayadas en la Figura 1 ). Es importante notar, sin embargo, que ambas la cepa Merck 287 y VSRh S2 son fenotípicamente tipo silvestre; y, por lo tanto, estas diferencias aminoácidas entre VSRh S2 y ambas la cepa Merck 287 y p17 ni inducen ni contribuyen a la atenuación de p17 o p17_pp.

De manera similar, existen diferencias aminoácidas entre la cepa VSRh S2 tipo silvestre y ambas la cepa Merck 287 y p17 en las secuencias proteicas G, F, y L (ver los aminoácidos con subrayado sencillo en las Figuras 2, 3A-3B, y 4A-4G, respectivamente). Sin embargo, también existen diferencias aminoácidas entre las secuencias proteicas G, F, y L de la cepa Merck 287 y pl7 (ver los aminoácidos con subrayado doble en las Figuras 2, 3A-3B y 4A-4G, respectivamente). Es probable que una o más de estas diferencias aminoácidas con subrayado doble contribuyan al fenotipo atenuado demostrado para p17 y pl7 pp.

Como tal, la presente invención se relaciona con VSR atenuado vivo que tiene un genoma viral modificado que comprende una o más de las mutaciones nucleótidas descritas en p17 y/o pl7_pp y/o que codifica una o más de las mutaciones aminoácidas como se describen en p17 en la presente, comparadas con la cepa Merck 287. En una realización, el genoma viral de dicho VSR atenuado puede contener, por ejemplo, diferencias nucleótidas adicionales y/o codificar diferencias aminoácidas adicionales, en comparación con la secuencia genómica de la cepa Merck 287 como se divulga en SEQ ID NO: 25 u otra cepa fenotípicamente tipo silvestre de VSR (ej., VSRh S2), en donde dichas mutaciones adicionales nucleótidas y/o aminoácidas no contribuyen sustancialmente al fenotipo de atenuación.

En otra realización, un VSR atenuado vivo de la presente invención puede comprender una o más de las mutaciones nucleótidas y/o aminoácidas descritas en p17 y/o p17_pp además de mutaciones adicionales en marcadores genéticos conocidos para atenuación (ver, ej., Conners, 1995, Virology, 208:478-484; Crowe, 1996, Virus Genes 13:269-273; Firestone, 1996, Virology 225:419-422; Whitehead, 1998,/. Viro! 72:4467-4471).

II. Ejemplos de Diferentes Realizaciones En una primera realización, la presente invención se relaciona con un virus sincitial respiratorio vivo atenuado (VSR) que comprende un genoma viral, en donde el genoma viral codifica proteínas que comprenden uno o más aminoácidos seleccionados desde el grupo que consta de: un ácido glutámico en la posición 204 de la proteína codificada por el gen G; un ácido glutámico en la posición 205 de la proteína codificada por el gen G, una alanina en la posición 211 de la proteína codificada por el gen G; un ácido glutámico en la posición 213 de la proteína codificada por el gen G; una glicina en la posición 221 de la proteina codificada por el gen G; un ácido glutámico en la posición 223 de la proteína codificada por el gen G; una glicina en la posición 232 de la proteina codificada por el gen G; una lisina en la posición 294 de la proteína codificada por el gen F; una glicina en l posición 486 de la proteína codificada por el gen F; una alanina en la posición 148 de la proteína codificada por el gen L; y, una fenilalanina en la posición 2054 de la proteína codificada por el gen L. Así, en esta realización, un VSR atenuado vivo de la presente invención comprende uno, todos o un subgrupo de los residuos aminoácidos citados en este párrafo. La ubicación de los residuos de aminoácidos citados están referenciados con respecto a su posición dentro de una secuencia aminoácida particular codificada por un gen dentro del genoma viral. Las proteínas G, F y L son codificadas por los genes G, F y L, respectivamente.

En una realización adicional, un VSR atenuado vivo de la presente invención comprende un genoma viral que comprende uno o más nucleótidos seleccionados desde el grupo que consta de: una adenina en la posición nucleótida 162 del gen NS1; una adenina en la posición nucleótida 327 del gen NS2; una guanina en la posición nucleótida 610 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 613 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 630 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 631 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 637 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 639 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 654 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 661 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 662 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 666 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 667 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 668 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 675 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 695 del gen G; una guanina en la posición nucleótida 696 del gen G; una adenina en la posición nucleótida 880 del gen F; una guanina en la posición nucleótida 1457 del gen F; una citosina en la posición nucleótida 443 del gel L; y, una timina en la posición nucleótida 6162 del gel L. El genoma viral puede comprender uno, todos o un subgrupo de los nucleótidos específicos.

Uno, todos o un subgrupo de los residuos aminoácidos específicos y/o nucleótidos pueden comprender un VSR atenuado vivo de la presente invención. Los residuos aminoácidos y nucleótidos citados anteriormente corresponden a la ubicación de residuos aminoácidos específicos y nucleótidos presentes en pl7 y pl7_pp descritos en la presente (ver Tablas 5, 6, 8 y 9, más adelante). Por ejemplo, un VSR atenuado vivo dentro de esta realización puede comprender una lisina en la posición 294 de la proteína codificada por el gen F, una glicina en la posición 486 de la proteína codificada por el gen F, una alanina en la posición 148 de la proteina codificada por el gen L, y una fenilalanina en la posición 2054 de la proteína codificada por el gen L Como se describió anteriormente, los resultados presentados en la presente indican que los residuos aminoácidos citados dentro de las proteínas F y L sustancialmente contribuyen al fenotipo atenuado de p17 y p17_pp.

En una segunda realización, la presente invención se relaciona con un VSR atenuado vivo que comprende un genoma viral el cual comprende una o más mutaciones nucleótidas en comparación con un genoma viral del VSR no atenuado, en donde una o más de las mutaciones nucleótidas resultan en una o más mutaciones aminoácidas, y en donde la una o más mutaciones aminoácidas están localizadas en las posiciones aminoácidas seleccionadas desde el grupo que consta de: posiciones 204, 205, 21 1 ,213, 221 , 223, y 232, cada proteína codificada por el gen G; posiciones 294 y 486, cada proteína codificada por el gen F; y, posiciones 148 y 2054, cada proteína codificada por el gen L. La cepa del VSR no atenuada puede ser un VSR genéticamente y/o fenotipicamente tipo silvestre y proporciona secuencias de referencia. La ubicación de las mutaciones aminoácidas está referenciada con respecto a su posición dentro de una secuencia aminoácida particular codificada por un gen dentro del genoma viral. Las proteínas G, F y L son codificadas por los genes G, F y L, respectivamente. Las mutaciones aminoácidas citadas anteriormente corresponden a la ubicación de sustituciones aminoácidas presentes en pl7 y p17_pp descritas en la presente al comparar con una cepa del VSR genéticamente tipo silvestre (cepa del VSR S2) y fenotipicamente tipo silvestre (cepa Merck 287) (ver Tablas 6 y 9, más adelante).

En una realización adicional, una mutación aminoácida en la posición 204 de la proteína codificada por el gen G es a un ácido glutámico, una mutación aminoácida en la posición 205 de la proteina codificada por el gen G es a un ácido glutámico, una mutación aminoácida en la posición 211 de la proteina codificada por el gen G es a una alanina, una mutación aminoácida en la posición 213 de la proteina codificada por el gen G es a un ácido glutámico, una mutación aminoácida en la posición 221 de la proteína codificada por el gen G es a una glicina, una mutación aminoácida en la posición 223 de la proteína codificada por el gen G, es a un ácido glutámico, una mutación aminoácida en la posición 232 de la proteína codificada por el gen G, es a una glicina, una mutación aminoácida en la posición 294 de la proteína codificada por el gen F es a una lisina, una mutación aminoácida en la posición 486 de la proteína codificada por el gen F es a una glicina, una mutación aminoácida en la posición 148 de la proteína codificada por el gen L es a una alanina, y una mutación aminoácida en la posición 2054 de la proteína codificada por el gen L es a una fenilalanina.

En una realización aún adicional, una amino mutación en la posición 204 de la proteina codificada por el gen G es Lys204Glu, una mutación aminoácida en la posición 205 de la proteína codificada por el gen G es Lys205Glu, una mutación aminoácida en la posición 211 de la proteína codificada por el gen G es Thr211 Ala, una mutación aminoácida en la posición 213 de la proteína codificada por el gen G es Lys213Glu, una mutación aminoácida en la posición 221 de la proteína codificada por el gen G es Lys221Gly, una mutación aminoácida en la posición 223 de la proteína codificada por el gen G es Lys223Glu, una mutación aminoácida en la posición 232 de la proteína codificada por el gen G es Glu232Gly, una mutación aminoácida en la posición 294 de la proteína codificada por el gen F es Glu294Lys, una mutación aminoácida en la posición 486 de la proteína codificada por el gen F es Asp486Gly, una mutación aminoácida en la posición 148 de la proteina codificada por el gen L es Aspl48Ala, y una mutación aminoácida en la posición 2054 de la proteína codificada por el gen L es Leu2054Phe. Como un Ejemplo, el término "Lys204Glu," utilizado en referencia a la proteina G, indica que el residuo aminoácido de lisina (Lys) en la posición aminoácida 204 de la proteína G es sustituido por un residuo aminoácido de ácido glutámico (Glu). Las abreviaturas de residuos aminoácidos son citadas más adelante. Las mutaciones aminoácidas citadas anteriormente corresponden a las sustituciones aminoácidas presentes en p17 y pl7_pp descritas en la presente (ver Tabla 6 y Tabla 9, más adelante).

En otra realización, el genoma viral comprende mutaciones nucleótidas que resultan en bien sea todas o un subgrupo de las mutaciones aminoácidas citadas. Por ejemplo, el genoma viral de un VSR atenuado dentro de esta realización puede comprender mutaciones nucleótidas que resultan en mutaciones aminoácidas en una o todas las posiciones aminoácidas citadas dentro de las proteínas codificadas por los genes F y L. Como se describió anteriormente, los resultados presentados en la presente indican que las mutaciones dentro de las proteínas F y L sustancialmente contribuyen al fenotipo atenuado de p17 y p17_pp.

En una realización adicional, la una o más mutaciones nucleótidas dentro del genoma viral del VSR atenuado que resultan en la una o más mutaciones aminoácidas citadas anteriormente están localizadas en una posición nucleótida seleccionada del grupo que consta de: posiciones 610, 613, 631 ,637, 639, 661 , 662, 667, 668,695 y 696 del gen G; posiciones 880 y 1457 del gen F; y, posiciones 443 y 6162 del gel L En esta realización, dos posiciones nucleótidas pueden necesitar ser mutadas para generar una substitución aminoácida. La ubicación de las mutaciones nucleótidas es referenciada con respecto a su posición dentro de un marco de lectura abierta particular contenido dentro del genoma viral. En una alternativa, la ubicación de las mutaciones nucleótidas puede ser conocida por su posición dentro del genoma viral mismo. Por ejemplo, la posición nucleótida 610 del gen G corresponde a la posición nucleótida 5295 del genoma VSR. La relación entre una mutación en una posición específica dentro de un ORF descrito en la presente y su correspondiente posición dentro del genoma VSR puede encontrarse en la Tabla 6 y Tabla 9, más adelante.

En una realización aún adicional, el genoma viral además comprende una o más mutaciones nucleótidas silenciosas localizadas en la , posiciones nucleótidas seleccionadas desde el grupo que consta de la posición 327 del gen NS2, posición 630 del gen G, posición 654 del gen G, posición 666 del gen G, y posición 675 del gen G. El genoma viral puede además comprender una mutación silenciosa en la posición nucleótida 162 del gen NS1. El genoma viral puede comprender todas o un subgrupo de estas mutaciones nucleótidas silenciosas. En otra realización, el genoma viral comprende todas de las mutaciones nucleótidas (silenciosas y no silenciosas) citadas anteriormente.

En otra realización, el genoma viral comprende una o más mutaciones nucleótidas como comparada con el genoma viral de cualquiera una cepa de VSR no atenuada o incompletamente atenuada, en donde dicha una o más mutaciones están localizadas en las posiciones nucleótidas seleccionadas desde el grupo que consta de la posición 162 del gen NS1, posición 327 del gen NS2, posiciones 610, 613, 630, 631 , 637, 639, 654, 661 ,662, 666, 667, 668,675, 695, y 696 del gen G, posiciones 880 y 1457 del gen F, y, posiciones 443 y 6162 del gel L. Dicha cepa no atenuada puede ser un VSR genéticamente y/o fenotipicamente tipo silvestre. En una realización adicional, dicho genoma viral comprende mutaciones en todas las posiciones nucleótidas citadas.

En una realización adicional, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 162 del gen NS1 es T260A, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 327 del gen NS2 es G327A, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 610 del gen G es A610G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 613 del gen G es A613G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 630 del gen G es A630G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 631 del gen G es A631G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 637 del gen G es A637G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 639 del gen G es A639G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 654 del gen G es A654G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 661 del gen G es A661G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 662 del gen G es A662G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 666 del gen G es A666G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 667 del gen G es A667G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 668 del gen G es A668G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 675 del gen G es A675G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 695 del gen G es A695G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 696 del gen G es A696G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 880 del gen F es G880A, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 1457 del gen F es A1457G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 443 del gel L es A443C, y una mutación nucleótida en la posición nucleótida 6162 del gel L es G6162T. Como un Ejemplo el término "G327A," cuando se utiliza en referencia al gen NS2 de un VSR atenuado de esta realización, indica que el nucleótido de guanina en esta posición es mutado a un nucleótido de adenina (A). Las abreviaturas nucleótidas para timina y citosina son "T" y "C," respectivamente. El genoma viral puede comprender mutaciones nucleótidas en todas o un subgrupo de las posiciones nucleótidas citadas.

En una realización adicional, la presente invención también se relaciona con un virus sincitial respiratorio vivo atenuado (VSR) que comprende un genoma viral el cual comprende una o más mutaciones nucleótidas como comparada con el genoma viral de cualquiera una cepa del VSR no atenuada o incompletamente atenuada, en donde dicha una o más mutaciones están localizadas en la posiciones nucleótidas seleccionadas desde el grupo que consta de la posición 260, 954, 5295, 5298, 5315, 5316, 5322, 5324, 5339, 5346, 5347, 5351 , 5352, 5353, 5360, 5380, 5381 , 6538, 7115, 8937 y 14656 del genoma de VSR. Cada una de las mutaciones nucleótidas citadas anteriormente está presente dentro de la cepa del VSR p17 y/o pl7_pp descrita en la presente. En una realización adicional, dicho genoma viral modificado comprende mutaciones en todas de las posiciones nucleótidas citadas.

Cuando se hace referencia a una ubicación particular dentro de cualquiera un marco de lectura abierta que codifica una proteina de VSR, la secuencia genómica entera de VSR, o una secuencia aminoácida de una proteína del VSR, se aprecia que las ubicaciones precisas pueden variar levemente entre cepas del VSR dentro de y/o entre grupos antigénicos (A versus B) y especies virales (ej., humana versus bovina). Como tal, el análisis nucleótido y/o aminoácido comparativo, mediante el cual múltiples secuencias de referencia son alineadas, puede utilizarse para identificar la posición nucleótida y/o aminoácida que corresponde a una posición específicamente citada descrita en la presente. Así, incluidos dentro de las realizaciones anteriores, y aquellas realizaciones de aquí en adelante que citan posiciones nucleótidas y/o aminoácidas, son los VSRs atenuados vivos que comprenden un genoma viral que comprende uno o más de los residuos nucleótidos y/o aminoácidos y/o una o más de las mutaciones nucleótidas y/o mutaciones aminoácidas en las posiciones que corresponden a aquellas posiciones específicamente citadas como se determinó mediante alineación y análisis de secuencias de y con secuencias de referencia.

En una tercera realización el genoma viral de un VSR atenuado vivo de la presente invención comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteina NS1 , NS2, G, F y/o L que está relacionada con una proteína tipo silvestre de NS1 , NS2, G, F y/o L (ej., SEQ ID NO: 88, 2, 8, 14 y 20, respectivamente, las cuales corresponden a las secuencias proteicas VSR S2 NS1 , NS2, G, F y/o L), en donde la secuencia proteica de NS1 , NS2, G, F y/o L contiene uno o una combinación de los aminoácidos, o mutaciones aminoácidas, identificadas en la presente por diferir entre p17 y/o pl7_pp y secuencias aminoácidas tipo silvestre de la proteina viral especifica, y en donde dicha secuencia relacionada tiene al menos 95%, preferiblemente 99% de identidad de secuencia con dicha secuencia proteica de VSR tipo silvestre en la región exterior de uno o combinación de diferentes aminoácidos o mutaciones aminoácidas.

En una realización adicional el genoma viral de un VSR atenuado vivo de la presente invención comprende una secuencia nucleótida de un gen NS1 , NS2, G, F y/o L que está relacionada con una secuencia génica tipo silvestre de NS1 , NS2, G, F y/o L (ej., SEQ ID NO: 87, 1 ,7, 13 y 19, respectivamente, la cual corresponde a las secuencias génicas del VSR S2 NS1 , NS2, G, F y/o L), en donde la secuencia génica de NS1 , NS2, G, F y/o L contiene uno o una combinación de los nucleótidos, o mutaciones nucleótidas, identificados en la presente por diferir entre p17 y/o pl7_pp y secuencias nucleótidas tipo silvestre de los genes específicos, y en donde dicha secuencia relacionada tiene al menos 95%, preferiblemente 99% de identidad de secuencia con dicha secuencia genética de VSR tipo silvestre en la en la región por fuera de aquel o combinación de nucleótidos diferentes o mutaciones nucleótidas.

En una cuarta realización, el genoma viral de un VSR atenuado vivo contemplado por la presente invención comprende un marco de lectura abierta que codifica una proteína G, F y/o L, en donde dicha proteína consta de las secuencias aminoácidas como se divulgan en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 93, y SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 95, respectivamente. SEQ ID NOs: 12, 18 y 24 representan las secuencias aminoácidas de las proteínas G, F y L dentro de p17 descritas en la presente (ver también las Figuras 2, 3A-3B y 4A-4G, respectivamente). Los polimorfismos dentro de las proteínas F y L son indicados en las secuencias citadas correspondientes (SEQ ID NOs: 18 y 24). Así, en una realización adicional, la posición 294 de la proteína F de p17 (SEQ ID NO: 18) es un residuo Lys, y/o la posición 486 de la proteína F de p17 es un residuo Gly. En una realización aún adicional, la posición 148 de la proteína L de p17 (SEQ ID NO: 24) es un residuo Ala, y/o la posición 2054 de la proteína L de p17 es un residuo Phe. SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 95 representan las secuencias aminoácidas de las proteínas F y L dentro del derivado purificado por placa de p17, pl7_pp. Los polimorfismos dentro de estas secuencias han sido resueltos en el virus purificado por placa y se reflejan en SEQ ID NOs: 93 y 95.

En una realización adicional, el genoma viral de un VSR atenuado vivo comprende un marco de lectura abierta que codifica una proteína G, F y/o L, en donde la proteína consta de una secuencia aminoácida que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% idéntica a las secuencias aminoácidas divulgas en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 93, y SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 95, respectivamente, y en donde uno o una combinación de los aminoácidos específicos dentro de dichas proteínas G, F y/o L proteínas identificadas en la presente difieren entre p17 y/o p17 pp y secuencias aminoácidas tipo silvestre de las proteínas virales específicas están presentes.

En una quinta realización, el genoma viral de un VSR atenuado vivo descrito en la presente comprende un marco de lectura abierta que codifica una proteína NS1 , NS2, G, F y/o L, en donde uno o más de dichos marcos de lectura abierta constan de las secuencias nucleótidas como se divulgan en SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 92, y/o SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 94, respectivamente. SEQ ID NOs: 89, 5, 11 , 17 y 23 representan las secuencias nucleótidas que codifican las proteínas NS1 , NS2, G, F y L, respectivamente, dentro de p17 descrito en la presente. Las secuencias nucleótidas que codifican las proteínas F y L de p17 contienen el polimorfismo nucleótido descrito anteriormente. Así, en una realización adicional, la posición 880 del gen F de p17 (SEQ ID NO: 17) es un nucleótido de adenina, y/o posición 1457 del gen F de p17 es un nucleótido de guanina. En una realización aún adicional, la posición 443 del gel L de p17 (SEQ ID NO: 23) es un nucleótido de citosina, y/o la posición 6162 del gen L de p17 es un nucleótido de timina. SEQ ID NOs: 90, 5, 11 , 92 y 94 representan las secuencias nucleótidas que codifican las proteínas NS1 , NS2, G, F y L, respectivamente dentro de p17 pp. Los polimorfismos dentro de las secuencias nucleótidas que codifica las proteínas F y L de p17 han sido resueltos en el virus purificado por placa y se reflejan en SEQ ID NOs: 92 y 94.

En una realización adicional, el genoma viral de un VSR atenuado vivo comprende el marco de lectura abierta que corresponde a un gen NS1 , NS2, G, F y/o L que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% idéntico a una secuencia nucleótida divulgada en SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 92, y/o SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 94, respectivamente, en donde uno o una combinación de los nucleótidos específicos dentro de dichos genes de NS1 , NS2, G, F y/o L identificados en la presente por difieren entre p17 y/o p17_pp y las secuencias nucleótidas tipo silvestre de los genes virales específicos están presentes.

En una sexta realización, el genoma viral de un VSR atenuado vivo descrito en las realizaciones anteriores además contiene cualquiera una citosina en la posición 15046, una mutación en la posición 15046, una mutación en la posición 15046 a una citosina, o una mutación de A15046C, dentro del genoma viral. La posición nucleótida 15046 está localizada dentro de la región 5' no traducida del genoma VSR.

En una séptima realización, el genoma viral de un VSR atenuado vivo descrito en las realizaciones anteriores contiene cualquiera mutaciones nucleótidas y/o aminoácidas adicionales en marcadores genéticos conocidos para atenuación de VSR o nucleótidos y/o aminoácidos adicionales conocidos por conferir un fenotipo atenuado a VSR, preferiblemente VSR humano. Esta realización contempla todos los VSR vivos y atenuados descritos en las realizaciones anteriores, incluyendo cepas derivadas del mismo que son atenuadas adicionalmente por, por ejemplo, mutagénesis química, adaptación al frío, o recombinación genética (ej., mutagénesis dirigida a sitio). Por lo tanto, los mutantes de VSR atenuados de manera incompleta conocidos en el estado de la técnica pueden atenuarse adicionalmente (ej., más completamente atenuados) mediante la introducción de los nucleótidos y/o aminoácidos descritos en la presente por contribuir a la atenuación de p17 y/o p17_pp.

En una octava realización, un VSR atenuado vivo descrito en las realizaciones anteriores pertenece a cualquiera el subgrupo antigénico A o B de VSR. En una realización adicional, el VSR atenuado vivo es in VSR humano.

En una novena realización, el genoma viral de un VSR atenuado vivo de la presente invención comprende la secuencia nucleótida como se divulga en SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 91. SEQ ID NO: 26 representa la secuencia nucleótida del genoma viral de p17 descrito en la presente.

Las posiciones nucleótidas 6538,7115, 8937 y 14656 de SEQ ID NO: 26 contienen posibles polimorfismos. Así, los nucleótidos en aquellas posiciones dentro de SEQ ID NO: 26 representan bien sea G o A (para la posición 6538), A o G (para la posición 7115), A o C (para la posición 8937), y G o T (para la posición 14656). En una realización adicional, la posición 6538 es un nucleótido de adenina; la posición 7115 es un nucleótido de guanina; la posición 8937 es un nucleótido de citosina; y/o la posición 14656 es un nucleótido de timina. SEQ ID NO: 91 representa la secuencia nucleótida del genoma viral de p17_pp descrito en la presente. En una realización adicional, un VSR atenuado vivo comprende una secuencia nucleótida que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% idéntica, a través del genoma, a la secuencia nucleótida divulgada en SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 91 , en donde uno o una combinación de los nucleótidos específicos identificados en la presente por diferir entre p17 y/o p17_pp y secuencias nucleótidas tipo silvestre del genes virales específicos están presentes.

En una decima realización, un VSR atenuado vivo de la presente invención comprende una proteína variante y/o secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente similar a aquellas secuencias que se encuentran dentro del VSR atenuado descrito en la realizaciones anteriores que corresponden a dicho VSR atenuado, que tiene propiedades tanto físicas/estructurales como funcionales que son sustancialmente iguales. En una realización, dicho VSR atenuado vivo comprende un proteína sustancialmente similar codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones severas al complemento de una molécula de ácido nucleico que codifica una o más de las proteínas modificadas dentro del virus p17 o p17_pp. En una realización adicional, dicho VSR atenuado vivo comprende moléculas de ácido nucleico que hibridizan a una o más de las moléculas de ácido nucleico modificado, o regiones de las mismas (bien sea codificadoras o no codificadoras), dentro del virus p17 o p17_pp bajo condiciones severas.

En una onceava realización, un VSR atenuado vivo descrito en las realizaciones anteriores está comprendido dentro de una población de VSR atenuado vivo. Una población de VSR atenuado significa que dicha población viral no es necesariamente homogénea para un único virus. Por ejemplo, como se describe en la presente, se han encontrado polimorfismos en los posteriores pasajes de las cepas del VSR divulgadas en la presente. Existen cuatro sitios polimórficos dentro del genoma p17 descrito en la presente. Como tal, una población viral, como se representa por p17, puede constar de diferentes virus atenuados que tienen un genoma que comprende mutaciones nucleótidas fijas (es decir, no-polimórficas) descritas en la presente, asi como también uno de dos posibles nucleótidos en las cuatro posiciones polimórficas, 6538, 7115, 8937 y 14656. Una población VSR puede generarse al pasar serialmente cualquiera una cepa del VSR no atenuada o incompletamente atenuada en cultivo celular como se describió en la presente (ver Ejemplo 1 , más adelante), incluyendo pero sin limitar a pasar de manera serial la cepa Merck 287 que tiene un genoma viral como se divulga en SEQ ID NO: 25. Las poblaciones de virus pueden purificarse a homogeneidad u homogeneidad sustancial al someter a un proceso de pasaje tipos celulares adecuados o al ejecutar una serie de uno o más pasos de clonación.

Una realización adicional de la presente invención contempla un VSR atenuado vivo, o población del mismo, como se describe en las realizaciones anteriores, en donde dicho virus es producido mediante un proceso que comprende incorporar, por métodos recombinantes, uno o más de los nucleótidos y/o aminoácidos identificados en la presente por diferir entre p17 o p17_pp y secuencias tipo silvestre de las proteínas virales específicas o genes (descritos en detalle supra y más adelante) en cualquiera una cepa del VSR no atenuada o incompletamente atenuada. En una realización adicional de la presente invención, un VSR atenuado vivo, o población del mismo, como se describió en las realizaciones anteriores es producido mediante un proceso que comprende pasar de manera serial la cepa Merck 287 (que tiene la secuencia genómica como se divulga en SEQ ID NO: 25) mediante el método descrito en el Ejemplo 1 , más adelante. Así, dicha realización contempla pasar una cepa del VSR no atenuado que comprende un genoma viral como se divulga en SEQ ID NO: 25 en una línea celular (incluyendo, pero sin limitar a línea celular de Riñon de Mono Verde Africano, Vero CCL-81 ) a una multiplicidad fija de infección (MOI) (ej., entre 1 :100 y 1 :1000).

Una realización adicional de la presente invención contempla un método de atenuar un VSR que comprende incorporar, por métodos recombinantes, uno o más de los nucleótidos y/o aminoácidos identificados en la presente por diferir entre p17 o p17_pp y secuencias nucleótidas o aminoácidas tipo silvestre de los genes virales específicos o proteínas (descritas en detalle supra y más adelante) en cualquiera una cepa del VSR no atenuada o incompletamente atenuada. Una realización adicional de la presente invención contempla un método de atenuar un VSR que comprende pasar de manera serial una cepa Merck 287 (que tiene la secuencia genómica como se divulga en SEQ ID NO: 25) mediante por ejemplo el método descrito en el Ejemplo 1 , más adelante.

La presente invención incluye también uno o más de los VSRs atenuados vivos descritos en la realizaciones anteriores, una población de los mismos, o una vacuna que comprende dichos virus atenuados (i) para utilizar en, (ii) para utilizar como un medicamento para, o (iii) para utilizar en la preparación de un medicamento para: (a) terapia (ej., del cuerpo humano); (b) medicina; (c) inhibición de replicación de VSR; (d) tratamiento o profilaxis de infección por VSR; o, (e) tratamiento, profilaxis de, o retardo del comienzo o progresión de enfermedad(es) asociada(s) con VSR. En estos usos, el virus atenuado y/o vacuna puede opcionalmente emplearse en combinación con uno o más agentes anti-virales.

III. Composiciones farmacéuticas Una composición farmacéutica que comprende un VSR atenuado vivo, o una población viral que comprende dicho VSR atenuado vivo, como se describe en la presente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable también se proporciona por esta invención.

Asi, un VSR atenuado vivo descrito en la presente puede formularse con vehículo farmacéuticamente aceptable para ayudar a retener actividad biológica mientras promueve también estabilidad aumentada durante almacenamiento dentro de un rango de temperatura aceptable. Como se utiliza en la presente, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" contempla cualquiera de los vehículos farmacéuticos apropiados bien conocidos en el estado de la técnica y descritos en una variedad de textos, tal como Remington's Pharmaceutical Sciences. Vehículos potenciales incluyen, pero no se limitan a, medio de cultivo fisiológicamente balanceado, solución salina buffer de fosfato, agua, emulsiones (ej., emulsiones de aceite/agua o agua/aceite), varios tipos de agentes humectantes, aditivos crioprotectores o estabilizantes tales como proteínas, péptidos o hidrolisatos (ej., albúmina, gelatina), azucares (ej., sacarosa, lactosa, sorbitol), aminoácidos (ej., glutamato de sodio), u otros agentes protectores. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para utilizar como tal o pueden liofilizarse. Las preparaciones liofilizadas son combinadas con una solución estéril antes de administración para dosificación única o múltiple. Las composiciones formuladas, especialmente las formulaciones líquidas, pueden contener un bacteriostato para prevenir o minimizar degradación durante almacenamiento, incluyendo pero sin limitar a concentraciones efectivas (usualmente <1 % w/v) de alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol, metilparabeno, y/o propilparabeno. Un bacteriostato puede ser contraindicado en algunos pacientes; por lo tanto, una formulación liofilizada puede reconstituirse en una solución bien sea que contenga o no tal componente.

La composición farmacéutica puede opcionalmente incluir un adyuvante para mejorar la respuesta inmune del huésped. Adyuvantes apropiados son, por ejemplo, agonistas receptores tipo peaje, A1 P04, alhidrogel, Lípido-A y derivados o variantes de los mismos, emulsiones de aceite, saponinas, liposomas neutrales, liposomas que contienen la vacuna y citoquinas, copolímeros en bloque no-iónicos, y quimioquinas. Polímeros en bloque no-iónicos que contienen polioxietileno (POE) y polixilpropileno (POP), tales como copolímeros en bloque POE-POP-POE pueden utilizarse como un adyuvante (Newman, 1998, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carríer Systems 15:89-142). Estos adyuvantes tienen la ventaja de ayudar a estimular el sistema inmune en una forma no específica, aumentado así la respuesta inmune al producto farmacéutico.

Un VSR atenuado vivo descrito en la presente, derivado a partir de un subgrupo o cepa del VSR particular, puede combinarse con otro VSR atenuado derivado a partir de un subgrupo o cepa diferente. Los diferentes virus pueden ser en una mezcla y administrarse simultáneamente, o administrarse de manera separada. Debido al fenómeno de protección cruzada entre ciertas cepas del VSR, la inmunización con una cepa puede proteger contra varias cepas diferentes del mismo o diferente subgrupo. Así, un VSR atenuado aislado descrito en la presente puede combinarse con otro VSR no natural o existir dentro de una población de VSR atenuado.

En algunas instancias puede ser deseable combinar un VSR atenuado vivo descrito en la presente, o una composición del mismo, con otros productos farmacéuticos (ej., vacunas) los cuales inducen respuestas protectoras a otros agentes, particularmente aquellos que producen otras enfermedades infantiles. Por ejemplo, una composición de VSR atenuado descrito en la presente puede administrarse simultáneamente (típicamente de manera separada) o secuencialmente con otras vacunas recomendadas por el Comité de Asesoramiento sobre Prácticas de Inmunización (ACIP; http://www.cdc.gov/vacunas/recs/ACIP/default.htm) para el grupo de edad señalado (ej., niños desde aproximadamente uno a seis meses de edad). Estas vacunas adicionales incluyen, pero no se limitan a, otras vacunas administradas de manera parenteral. Como tal, una composición de VSR atenuado vivo descrito en la presente puede administrarse de manera simultanea o secuencial con vacunas contra, por ejemplo, hepatitis B (HepB), difteria, tétanos y tos ferina (DTaP), bacteria neumocóccica (PCV), Haemophilus influenzae tipo b (Hib), polio, influenza y rotavirus.

IV. Métodos de Uso Las composiciones farmacéuticas que comprenden un VSR atenuado vivo, o una población viral que comprende dicho VSR atenuado vivo, son útiles para vacunar un sujeto para tratar infección por VSR y enfermedades asociadas con el mismo. El alcance de esta invención incluye inmunización maternal.

Así, la presente invención proporciona además un método de vacunar un sujeto contra infección por VSR al administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición farmacéutica descrita en la presente antes. Este sujeto puede ser un animal, por ejemplo, un mamífero, tal como un chimpancé o un humano. Las composiciones farmacéuticas que contienen un VSR atenuado vivo descrito en la presente se administran a un sujeto susceptible a o de otra manera en riesgo de infección por VSR o el desarrollo de enfermedades severas asociadas con infección por VSR (incluyendo re-infección), aumentado las propias capacidades de respuesta inmune del sujeto. En particular, debido a las consecuencias potencialmente serias de infección por VSR en infantes y niños pequeños seronegativos y seropositivos, y la tercera edad, estas individuos se beneficiarán a partir de inmunización con las composiciones divulgadas de VSR atenuado vivo. Por lo tanto, candidatos particularmente apropiados para inmunización con los productos farmacéuticos descritos son infantes, niños, adultos mayores, y candidatos adultos para terapias inmunosupresivas. Los individuos seronegativos son aquellos que no exhiben evidencia inmunológica de previa infección con un subgrupo A o B VSR. Los individuos seropositivos son aquellos que han adquirido anticuerpos VSR detectables, bien sea de manera pasiva desde la madre o como resultado de infección anterior por VSR.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden el VSR atenuado vivo descrito en la presente causan la producción de una respuesta inmune que es protectora contra enfermedad grave del tracto respiratorio inferior, tal como neumonía y bronquiolitis, cuando el sujeto es subsiguientemente infectado o re-infectado con un VSR tipo silvestre. Mientras el virus que circula naturalmente es aún capaz de causar infección, particularmente en el tracto respiratorio superior, existe la posibilidad reducida de rinitis como resultado de la vacunación y un posible refuerzo de resistencia por infección subsiguiente por virus tipo silvestre. Después de vacunación, existen niveles detectables de suero producido por el huésped y anticuerpos secretores los cuales son capaces de neutralizar virus homólogo (del mismo subgrupo) tipo silvestre in vitro y in vivo. En muchas instancias los anticuerpos hospederos también neutralizarán virus tipo silvestre de un diferente subgrupo que no es vacuna. Para lograr niveles mayores de protección cruzada, por ejemplo, contra cepas heterólogas de otro subgrupo, los sujetos pueden vacunarse con un VSR atenuado vivo descrito en la presente a partir de al menos una cepa predominante de ambos subgrupos A y B. Como tal, un VSR atenuado vivo descrito en la presente puede pertenecer a cualquier subgrupo antigénico A o B, y virus a partir de ambos subgrupos puede combinarse en formulaciones de vacuna para cubrimiento más completo contra infecciones por VSR más prevalentes.

El VSR atenuado vivo descrito en la presente, y composiciones farmacéuticas del mismo, se proporcionan en una cantidad efectiva para inducir o aumentar una respuesta inmune efectiva contra VSR en un sujeto, preferiblemente un humano. Una cantidad efectiva permitirá algún crecimiento y proliferación del virus, con el propósito de producir la respuesta inmune deseada, pero no producirá síntomas o enfermedades asociadas con VSR. Con base en instrucciones proporcionadas en la presente, los expertos en el estado de la técnica podrán determinar la cantidad apropiada de virus para utilizar en la vacuna viva. Las cantidades exactas dependerán de varios factores, por ejemplo, la condición de salud y peso del sujeto, el modo de administración, el grado de atenuación del virus, la naturaleza de la formulación, y el hecho de si el sistema inmune del sujeto está comprometido. En una realización, un rango general de administración de virus está entre 103 y 107 aproximadamente unidades formadoras de placas (PFU) o más de virus por sujeto humano, incluyendo entre 104 y 105 PFU de virus por sujeto humano.

La administración puede estar en una forma encontrada como efectiva para estimular una respuesta inmune protectora, se puede elegir entre administración parenteral, intravenosa, oral, o tópica aplicada a una superficie mucosa. En la mayoría de instancias, el VSR atenuado vivo descrito en la presente se administra de manera parenteral.

Se pueden realizar administraciones únicas o múltiples del VSR atenuado vivo descrito en la presente, y composiciones farmacéuticas del mismo. En neonatos y niños, puede requerirse administración múltiple para producir niveles suficientes de inmunidad. La administración puede comenzar dentro de los primeros meses de vida y continuar a intervalos durante la niñez, según sea necesario para mantener niveles suficientes de protección contra infección nativa (tipo silvestre) por VSR. Por ejemplo, un posible esquema de vacunas puede constar de una administración inicial en el mes uno, y administraciones subsiguientes a dos meses, seis meses, un año y/o dos años. La frecuencia de vacunación puede modificarse para ser consistente con pautas actuales para otras vacunas de uso concomitante. Los niveles de inmunidad inducida pueden monitorearse al medir cantidades de anticuerpos secretorios y séricos neutralizantes, y dosificaciones ajustadas o vacunaciones repetidas según sea necesario para mantener niveles deseados de protección.

En cualquier evento, las formulaciones de vacuna, cantidades efectivas de las mismas para administración, y modo específico de administración deben proporcionar una cantidad de un VSR atenuado vivo descrito en la presente suficiente para estimular de manera efectiva, inducir o reforzar una respuesta inmune anti-VSR, ej., como puede determinarse por fijación de complemento, neutralización de placas, y/o ensayo inmunosorbente ligado a enzima, entre otros métodos (ej., correlacionando respuestas con sujetos bajo monitoreo para una protección contra signos y síntomas de enfermedad respiratoria superior e inferior).

V. Generación de VSR Atenuado Vivo El VSR atenuado vivo descrito en la presente puede derivarse de manera biológica o generarse de manera recombinante. Un "VSR derivado de manera biológica" se refiere a cualquier VSR no producido por medios recombinantes (ej., por medio de pasaje). Un "VSR generado de manera recombinante" se refiere a cualquier VSR generado vía técnicas de clonación viral (ej., genética inversa). El VSR atenuado vivo comprende variaciones genómicas en comparación con una secuencia VSR de referencia, en donde dicha secuencia VSR de referencia puede derivarse a partir de un VSR tipo silvestre o incompletamente atenuado.

Por consiguiente, el genoma VSR en el cual los residuos nucleótidos y/o aminoácidos específicos descritos en la presente son introducidos puede ser a partir de un virus genéticamente y/o fenotípicamente tipo silvestre o un derivado de virus tipo silvestre, tal como un virus parcialmente ya atenuado, en cuyo los residuos nucleótidos y/o aminoácidos recién incorporados actúan para atenuar adicionalmente la cepa (ej., a un nivel deseado de replicación restringida en un mamífero huésped mientras retiene suficiente inmunogenicidad para conferir protección en un sujeto vacunado). Cualquiera un subgrupo A o B VSR biológicamente-derivado o recombinantemente generado puede ser parcialmente atenuado por, por ejemplo, pasaje en frío, mutagénesis química, o mutagénesis dirigida a sitio.

Atenuar un virus al pasar en frío involucra someter el virus a pasaje en cultivo celular a temperaturas progresivamente inferiores. Por ejemplo, mientras el virus tipo silvestre es típicamente cultivado a aproximadamente 34-37°C, un virus parcialmente atenuado puede producirse por pasaje en cultivos celulares (ej., células renales bovinas primarias) a temperaturas subóptimas, ej., 20~26°C. Atenuar un virus por mutagénesis química involucra, por ejemplo, replicación del virus en la presencia de un mutágeno tal como 5-fluorouridina o 5-fluorouracilo a una concentración entre 10"3 y 10"5 M, preferiblemente 10" M, o inoculación del virus a nitrosoguanidina a una concentración de 100 ug/ml, según procedimientos generales descritos en, ej., Gharpure, 1969, J. Virol. 3:414-421 y Richardson, 1978, J. Med. Virol 3:91-100. Otros múgatenos químicos también pueden utilizarse. El VSR parcialmente atenuado también puede generarse recombinantemente al incorporar mutaciones atenuantes (aunque sean mutaciones atenuantes incompletas) en el genoma del VSR tipo silvestre. Varias técnicas de selección pueden combinarse para producir mutantes parcialmente atenuados a partir de cepas subgrupo A o B no atenuadas las cuales son útiles para derivatización adicional como se describe en la presente.

El VSR atenuado vivo descrito en la presente puede producirse mediante métodos recombinantes, ej., a partir de ADNc. Los cambios nucleótidos y/o aminoácidos, bien sea solos o en combinación, pueden incorporarse en el genoma de un VSR parcialmente atenuado o tipo silvestre. Estos cambios especificarán las características fenotípicas deseadas del VSR atenuado biológicamente derivado descrito en los Ejemplos, más adelante. VSR infeccioso puede producirse mediante la co-expresión intracelular en células mamiferas de un cDNA que codifica el genoma o ARN antigenoma del VSR atenuado vivo, junto con aquellas proteínas virales necesarias para generar un nucleocápside que se transcriba y se replique que contiene proteínas asociadas y ARN genómico (ver, ej., Palese, 1995, Trends ¡n Microbiology, 3:123-125; Lawson, 1995, Proc. Nati. Acad. Set USA 92:4477-4481 ; Schnell, 1994, EMBOJ. 13:4195-4203). Un antigenoma de VSR se refiere a una molécula polinucleótída aislada de sentido positivo la cual sirve como la plantilla para la síntesis de una progenie, genoma del VSR negativo. Así, la presente invención también contempla los métodos para producir un VSR atenuado vivo que tiene uno o más nucleótidos y/o aminoácidos descritos en la presente a partir de uno o más polinucleótidos aislados, ej., uno o más ADNc.

La introducción de los anteriores residuos nucleótidos/aminoácidos (solos o en combinación) en un clon VSR infeccioso puede lograrse mediante una variedad de métodos bien conocidos. "Clon infeccioso" se refiere a ADNc o su producto, sintético o de otra manera, el cual puede transcribirse en ARN genómico o anti-genómico capaz de servir como modelo para producir el genoma de un virus infeccioso o partícula subviral. Las mutaciones definidas pueden introducirse mediante técnicas convencionales (ej., mutagénesis dirigida a sitio) en una copia de ADNc de un genoma o antigenoma de VSR. El uso de subfragmentos de ADNc antigenómicos o genómicos para ensamblar un ADNc completo antigenómico o genómico tiene la ventaja que cada región puede manipularse de manera separada (ADNcs más pequeños son más fáciles para manipular) y luego ensamblarse de manera fácil en un ADNc completo. Por ejemplo, luego un subfragmento mutado, puede sustituirse por su subfragmento contraparte a partir de una secuencia genómica o anti-genómica a partir de cualquiera un VSR incompletamente atenuado o tipo silvestre. Los subfragmentos contrapartes comparten identidad de secuencia sustancial con el subfragmento mutado seleccionado. Asi, el ADNc completo antigenómico o genómico, o cualquier subfragmento del mismo, puede utilizarse como modelo para mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. Esto puede ser a través del intermedio de una forma fásmida moncatenaria, tal como el uso del kit Muta-gene® de Bio-Rad Laboratories (Richmond, Calif), un método que utiliza el plásmido de hebra doble directamente como plantilla tal como el kit de mutagénesis Chameleon de Stratagene (La Jolla, Calif), o mediante reacción de cadena de polimerasa que emplea cualquiera un plantilla o cebador oligonucleótido el cual contiene la mutación de interés. El genoma o antigenoma de VSR también puede construirse, ej., al ensamblar los segmentos de ADNc clonados, representando en conjunto un antigenoma completo, mediante reacción en cadena de polimerasa (Protocolos PCR: Una Guía para Métodos y Aplicaciones, Innis, eds., Academic Press, San Diego (1990), incorporados en la presente como referencia) de copias inversamente transcritas de ARNm de VSR o ARN genómico. Alternativamente, ARN antigenómico o genómico puede sintetizarse in vitro.

Para producir VSR infeccioso a partir de un genoma o antigenoma expresado por ADNc, el genoma o antigenoma es co-expresado con aquellas proteínas VSR auxiliares necesarias para (i) producir un nucleocápside capaz de replicación de ARN, y (ii) hacer competentes los nucleocápsides de progenie tanto para replicación como transcripción de ARN. La transcripción por el nucleocápside de genoma proporciona las otras proteínas VSR e inicia una infección productiva. Alternativamente, las proteínas VSR adicionales necesarias para una infección productiva pueden proporcionarse mediante co-expresión.

Por ejemplo, el clon VSR infeccioso del genoma de virus atenuado vivo descrito en la presente puede primero incorporarse en un vector plásmido. Vectores plásmidos apropiados para transfecciones subsiguientes y expresión en una célula hospedera mamífera son comercialmente disponibles. El vector plásmido que contiene una copia de ADNc luego puede transfectarse en una célula hospedera que expresa ARN polimerasa del bacteriófago T7. Los vectores plásmidos adicionales que expresan la proteina nucleocápside (N) principal de VSR, fosfoproteína nucleocápside (P), proteína de polimerasa grande (L), y, opcionalmente, la proteína M2 (ORF1 - factor de elongación de transcripción), puede ser co-transfectada en la célula hospedera. El ADNc se transcribe para producir ARN de sentido negativo de longitud completa (genómico). La expresión de las proteínas N, L y P, y opcionalmente la proteína M2(ORF1 ), facilita la síntesis de virus de progenie. Luego los viriones son aislados. Para este método, es preferible que un ADNc sea construido el cual es una versión de sentido positivo del genoma VSR, que corresponde al ARN intermedio replicativo, o antigenoma, para minimizar la posibilidad de hibridizar con transcriptos de sentido positivo de las secuencias complementarias que codifican las proteínas necesarias para generar un nucleocápside que se transcriba y se replique (ej., secuencias que codifican las proteínas N, P, L y M2(ORF1)). Cuando se utiliza un sistema de minigenoma de VSR, el genoma y antigenoma son igualmente activos en rescate, bien sea complementado por VSR o por plásmidos, indicando que cualquiera el genoma o antigenoma puede utilizarse dependiendo de los fundamentos metodológicos y otros.

Las proteínas N, P, L y, opcionalmente, las proteínas M2(ORF1) pueden codificarse por uno o más vectores de expresión los cuales pueden ser iguales o separados desde aquel que codifica el genoma o antigenoma, y varias combinaciones del mismo. Las proteínas adicionales pueden incluirse como se desee, codificadas por vectores separados o por un vector que codifica una proteína N, P, L, o M2(ORF1 ) o el genoma o antigenoma completo. La expresión del genoma o antigenoma y proteínas desde plásmidos transfectados puede lograrse, por ejemplo, mediante cada ADNc bajo el control de un promotor para T7 polimerasa de ARN, el cual a su vez es proporcionado por infección, transfección o transducción con un sistema de expresión para la polimerasa de ARN 17, ej., una cepa MVA del vaccinia virus recombinante el cual expresa la T7 polimerasa de ARN (Wyatt, 1995, Virology, 210:202-205).

Polinucleótidos aislados (ej., ADNc) que codifican el genoma o antigenoma y, de manera separada, las proteínas N, P, L y, opcionalmente, M2(ORF1), pueden insertarse por transfección, electroporación, inserción mecánica, transducctón o similares, en células las cuales son capaces de soportar una infección productiva por VSR, ej., HEp-2, FRhl_-DBS2, MRC, y células Vero. La transfección de secuencias polinucleótidas aisladas puede introducirse en células cultivadas mediante, por ejemplo, transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler, 1978, Célula 14:725; Corsaro & Pearson, 1981 , Somatic Cell Genetics 7:603; Graham & Van der Eb, 1973, Virology 52:456), electroporación (Neumann, 1982, EMBO J. 1 :841-845), transfección mediada por DEAE-dextrana (Ausubel, (ed.) Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley y Sons, Inc., NY (1987)), transfección mediada por lipidos catiónicos (Hawley-Nelson, 1993, Focus 15:7379) o un reactivo de transfección comercialmente disponible, ej., LipofectACE® (Life Technologies). Las proteínas virales, y/o polimerasa de ARN T7, también pueden proporcionarse a partir de células mamiferas transfectadas, o por transfección de ARNm preformado o proteína.

Una vez generado un VSR atenuado vivo de la presente invención (ej., mediante por ejemplo los experimentos de clonación y rescate descritos anteriormente), el virus atenuado puede propagarse en un número de líneas celulares que permiten el crecimiento de VSR. El VSR crece en una variedad de células humanas y animales. Ejemplos de líneas celulares para propagación del VSR atenuado vivo incluyen células DBS-FRhL-2, MRC-5, y Vero. Los mayores rendimientos de virus usualmente se logran con líneas celulares epiteliales tales como células Vero. Las células típicamente se inoculan con virus a una multiplicidad de infección en el rango entre 0.001 y 1.0 o más aproximadamente, y se cultivan bajo condiciones permisivas para replicación del virus, ej., a 30-37° C aproximadamente, y durante 3-5 días aproximadamente, o tanto como sea necesario para que el virus alcance un título adecuado. El virus es retirado desde el cultivo celular y separado de los componentes celulares, típicamente mediante procedimientos de clarificación bien conocidos, ej., centrifugación, y pueden purificarse adicionalmente como se desee utilizando procedimientos bien conocidos por expertos en el estado de la técnica. ° El VSR que ha sido atenuado como se describe en la presente puede probarse en modelos in vivo y/o in vitro para confirmar atenuación adecuada, estabilidad genética, e inmunogenicidad. El nivel de atenuación de un VSR genéticamente modificado puede determinarse, por ejemplo, al cuantificar la cantidad de virus presente en el tracto respiratorio de un sujeto infectado y comparando la cantidad con aquella producida por un VSR fenotípícamente tipo silvestre (ej., VSR A2, cepa Merck 287). Los virus atenuados pueden probarse en una variedad de modelos animales de infección por VSR, descritos y resumidos en Meignier, eds., Modelos animales de Infección por Virus Sincitial Respiratorio, Merieux Foundation Publication, (1991 ). Por ejemplo, el modelo de ratón de algodón de infección por VSR ha sido mantenido como predictivo para atenuación y eficacia en humanos (Pat. US. No. 4,800,078; Prince, 1985, Virus Res. 3:193-206; Prince, 1987, J. Virol. 61 :1851 -1854). Otros roedores, incluyendo ratones, también podrían ser útiles de manera similar puesto que estos animales son permisivos para replicación de VSR y tienen una temperatura corporal más como la de los humanos (Wight, 1970, J. Infect. Dis. 122:501-512; Byrd y Prince, 1997, Clin, infecí Dis. 25:1363-1368). En particular, los modelos primates son genéticamente e inmunológicamente sistemas hospederos relevantes en los cuales se puede estudiar la infección por VSR (McArthur-Vaughan y Gershwin, 2002, J. Med. Prímatol. 31:61-73). Por ejemplo, un modelo primate de infección por VSR que utiliza los chimpancés es predictivo de atenuación y eficacia en humanos (ver, ej., Richardson, 1978, J. Med. Virol. 3:91-100; Wright,1982, Infect. Immun. 37:397-400; Crowe, 1993, Vacuna 1 1 :1395-1404. También se han utilizado monos verdes africanos como un modelo de infección por VSR (Cheng, 2001 , Virology 283:5968; Kakuk, 1993, J. Infect Dis. 167:553-61 ; Weiss, 2003, J. Med. Prímatol. 32:8288). Adicionalmente, el análisis de atenuación in vitro puede incluir evaluar el crecimiento del virus en células epiteliales aéreas humanas (Wright, 2005, Virol. 79:8651-8654).

El VSR atenuado vivo descrito en la presente tendrá un grado mayor de replicación restringida en ambos los tractos respiratorios superior e inferior de huéspedes altamente susceptibles, tales como monos y el ratón de algodón, comparado con los niveles de replicación de virus tipo silvestre, ej., más de 1000 veces menos. Los métodos para determinar niveles de VSR en la nasofaringe de un huésped infectado son bien conocidos en la literatura. Brevemente, los especímenes pueden obtenerse por aspiración o lavado de secreciones nasofaríngeas y virus cuantificado en cultivo tisular o mediante procedimiento de laboratorio. Ver, por ejemplo, Beishe, 1977, J. Med. Virology 1 :157-162; Friedewald, 1968, J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694; Gharpure, 1969, J. Virol. 3:414-421 ; y, Wright, 1973, Arch. Ges. Virusforsch. 41 :238-247.

Además de los criterios de viabilidad, atenuación e inmunogenicidad, las propiedades del VSR atenuado vivo descrito en la presente también deben ser tan estables como sea posible de manera que los atributos deseados sean mantenidos. Idealmente, un virus el cual es útil como parte de un producto farmacéutico (ej., vacuna) debe mantener su viabilidad, su propiedad de atenuación, su capacidad para replicarse en el huésped inmunizado (aunque a niveles inferiores), y su capacidad para causar de manera efectiva la producción de una respuesta inmune en un sujeto vacunado que es suficiente para conferir protección contra enfermedad grave causada por infección subsiguiente por virus tipo silvestre.

VI. Ácidos Nucleicos Recombinantes Las moléculas de ácido nucleico que comprenden bien sea un genoma o antigenoma de VSR atenuado de longitud completa o parcial descrito en la presente, una secuencia nucleótida que codifica una proteína viral modificada descrita en la presente o una porción del mismo, o una secuencia nucleótida de un gen viral modificado descrito en la presente o una porción del mismo (ver, ej., la descripción de ácido nucleico que se encuentra dentro del VSR atenuado vivo de la presente invención dentro de la Sección II, supra), también están dentro del alcance de la presente invención. Estos ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN), moléculas de ADN complementarias (ADNc), o moléculas de ácido ribonucleico (ARN).

Un codón "tripleta" de cuatro bases nucleótidas posibles puede existir en más de 60 formas variantes. Puesto que estos codones proporcionan el mensaje para solamente 20 aminoácidos diferentes (así como también iniciación y terminación de transcripción), algunos aminoácidos pueden codificarse por más de un codón, un fenómeno conocido como redundancia de codones. Así, debido a esta degeneración del código genético, un gran número de secuencias codificadoras diferentes de ácidos nucleicos pueden utilizarse para codificar una proteína particular. Los aminoácidos se codifican mediante los siguientes codones de ARN: A-Ala-Alanina: codones GCA, GCC, GCG, GCU C=Cys=Cisteina: codones UGC, UGU D=Asp=Ácido aspártico: codones GAC, GAU E=Glu=Ácido glutámico: codones GAA, GAG F=Phe=Fenilalanina: codones UUC, UUU G=Gly-Glicina: codones GGA, GGC, GGG, GGU H=His-Histidina: codones CAC, CAU l=Ue=lsoleucina: codones AUA, AUC, AUU K=l_ys=Lisina: codones AAA, AAG L=Leu=Leucina: codones UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU = et= etionina: codón AUG N=Asn=Asparagina: codones AAC, AAU P=Pro=Prolina: codones CCA, CCC, CCG, CCU Q=Gln=Glutamina: codones CAA, CAG R=Arg=Arg¡nina: codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU S-Ser-Sehna: codones AGC AGU, UCA, UCC, UCG, UCU T-Thr-Treonina: codones ACA, ACC, ACG, ACU V-Val=Valina: codones GUA, GUC, GUG, GUU W=Trp=Triptofano: codón UGG Y=Tyr=Tirosina: codones UAC, UAU Asi, ia presente invención incluye ácidos nucleicos que difieren de las moléculas de ácido nucleico pero los cuales codifican la misma secuencia proteica.

También contempladas por la presente invención están las moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias no codificadoras (es decir, secuencias no traducidas) del VSR de la presente invención. Estas regiones no codificadoras incluyen regiones no codificadoras 5", regiones no codificadoras 3', secuencias intergénicas, y otras regiones no codificadoras del genoma viral, incluyendo pero sin limitar a, regiones de transcripción, de traducción, y otras regiones reguladoras. Estas moléculas de ácido nucleico también pueden ser moléculas de ADN, moléculas de ADNc o moléculas de ARN.

La presente invención incluye además moléculas de ácido nucleico sustancialmente similares a aquellas moléculas de ácido nucleico que codifican una o más proteínas del VSR atenuado vivo de la presente invención, incluyendo pero sin limitar a los genes NS1, NS2, G, F y/o L del VSR atenuado vivo descrito en la presente. Cuando se incorporan en un genoma viral del VSR, dichos genes NS1 , NS2, G, F y/o L producirán el mismo efecto fenotípico atenuado. La presente invención también contempla moléculas sustancialmente similares de ácido nucleico caracterizadas por cambios en regiones no codificadoras que no alteran el fenotipo del virus resultante producido a partir del mismo.

Por consiguiente, incluidas dentro del alcance de esta invención están las moléculas de ácido nucleico que comprende bien sea secuencias nucleótidas que codifican variantes de las proteínas que se encuentran dentro del VSR atenuado vivo descrito en la presente, o moléculas de ácido nucleico que comprenden variantes de las secuencias no codificadoras nucleótidas que se encuentran dentro del VSR atenuado vivo descrito en la presente.

Incluidas dentro del alcance de la presente invención están moléculas de ácido nucleico que contienen uno o más de los nucleótidos indicados que hibridizan al complemento de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención bajo condiciones severas. A manera de ejemplo, y no de limitación, se utiliza un procedimiento que utiliza condiciones de alta severidad. La prehibridización de filtros que contienen ADN es realizada durante entre 2 horas y toda la noche 65°C aproximadamente en buffer compuesto de 6x SSC, 5x solución Denhardt, y 100 ug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Filtros son hibridizados durante 12 y 48 hrs aproximadamente a 65°C en mezcla de prehibridización que contiene 100 ug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 x 106 cpm de sonda rotulada con 32p. El lavado de los filtros se realiza a 37°C durante 1 hora aproximadamente en una solución que contiene 2x SSC, 0.1% SDS, Esto es seguido por un lavado en O.lx SSC, 0.1% SDS a 50°C durante 45 minutos antes de autoradiografía. Otros procedimientos que utilizan condiciones de alta severidad incluirían bien sea un paso de hibridización realizado en 5x SSC, 5x Solución Denhardt, 50% formamida a 42°C aproximadamente durante 12 y 48 horas o un paso de lavado realizado en 0.2x SSPE, 0.2% SDS a 65°C aproximadamente durante 30 y 60 minutos. Los reactivos mencionados en los procedimientos anteriores para realizar hibridización de alta severidad son bien conocidos en el estado de la técnica. Detalles de la composición de estos reactivos pueden encontrarse en Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, ( 989) o Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (2001). Además de lo anterior, otras condiciones de alta severidad que pueden utilizarse también son bien conocidas en el estado de la técnica.

Las moléculas de ácido nucleico de esta invención pueden estar operativamente ligadas a un promotor de transcripción de ARN, asi como también a otras secuencias reguladoras. Como se utiliza en la presente, el término "operativamente ligado" significa posicionado en tal manera que el promotor dirigirá la transcripción de ARN fuera de la molécula de ácido nucleico. Un ejemplo de un promotor es el promotor 17. Los vectores que contienen ambos un promotor y un sitio de clonación al cual se inserta una pieza de ácido nucleico es operativamente ligada al promotor, son bien conocidos en el estado de la técnica. Estos vectores pueden ser capaces de transcribir ácido nucleico in vitro y in vivo. Ejemplos de tales vectores incluyen aquellos que comprenden ácidos nucleicos derivados a partir de genomas virales de otros tipos de VSR (incluyendo ambos otros subtipos atenuados y cepas tipo silvestre) que han sido modificados al sustituir las regiones de ácido nucleico que codifican los polipéptidos y/o las regiones no codificadoras del VSR atenuado vivo descrito en la presente para los ácido nucleicos de dichos tipos de VSR. Adicionalmente proporcionados son los virus recombinantes codificados por las moléculas de ácido nucleico de esta invención.

Se proporcionan ejemplos a continuación que ilustran adicionalmente diferentes características de la presenté invención. Los ejemplos también ilustran metodología útil para practicar la invención. Estos ejemplos no limitan la invención reivindicada.

EJEMPLO 1 Pasaje de MRK cepa del VSR 287 Células y virus -La linea celular de riñon de Mono Verde Africano Vero CCL-81 se utilizó tanto para estudios de crecimiento de virus como ensayo de placas para monitorear salida viral. El virus precursor utilizado fue la cepa VSRh Merck 287 la cual fue liofilizada almacenada a -20C. El virus precursor Merck 287 experimentó dos pasajes en células GMK, luego cinco pasajes adicionales en células WI-38 (Bunyak, 1978, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 157:636-642; Bunyak, 1979, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 160:272-277; Belshe, 1982, J. Infecí Dis. 145:311-319). Mediante análisis de secuencias, se confirmó retener un genotipo tipo silvestre en todas las posiciones conocidas asociadas con atenuación.

Pasajes de virus y preparación de concentrados virales - Se utilizó virus precursor para infectar monocapas cofluentes Vero de una semana a un MOI 1:100 o 1 :1000 con una fijación de 1 hora a 32°C; sobreposición pos fijación con medio de mantenimiento comprendido de medio E de WM's (Gibco), albúmina humana recombinante al 1.6% (Delta biotechnologies), 2 mM L-glutamina (Gibco), y 50 ug/ml Neomicina (Sigma). Se observaron cultivos para efecto citopático máximo (CPE) >90%, y se cosecharon y re-alimentaron para cosechas adicionales a intervalos de 24 horas hasta que CPE estuvo demasiado avanzado para salida viral óptima.

Ensayo de placas - Muestras de virus cosechadas fueron tituladas a diluciones seriales 10x vía ensayo de placas y utilizadas para inocular monocapas confluentes VERO (48-72 horas) en formato de ensayo de 12 pozos (Costar), 100 ul/pozo, en triplicado por dilución de diluciones seriales 10x, cuatro diluciones por total de placas. Las placas se incubaron a 35°C ±1 °C más 5.0% CO2 durante una hora, sobreposición con medio de mantenimiento comprendido de Medio E de WM (Gibco), albúmina humana recombinante ah .6% (Delta biotechnologies), 2 mM L-glutamina (Gibco), y 50 ug/ml Neomicina (Sigma), y concentración final al 0.5% de agarosa SeaPlaque®. Las placas se desarrollan durante 6-8 días a 35°C ±1°C más 5.0% CO2. Las placas se visualizaron al agregar 250 ul/pozo de 5 mg/mL MTT; Bromuro de Tetrazolio de Azul de Tialzolilo (Sigma-Aldrich®) en PBS y esperando 2-6 horas para que las células metabolicen la cepa. Los títulos se obtuvieron sobre todas las cosechas entre pasajes no solo para monitorear el rendimiento viral, sino para medir con exactitud los títulos para calcular la dilución apropiada para el MOI para el pasaje subsiguiente de virus.

Resultados - La cepa Merck HVSR 287 es derivada desde una cepa de VSRh que primero fue amplificada dos veces en células GMK. Después de la amplificación inicial, el virus experimentó cinco pasajes adicionales en la línea celular diploide humana WI-38. Este material de 5 pasajes se utilizó en ensayos clínicos humanos para uso en vacunas vía una ruta de administración parenteral. La cepa Merck 287, VSRh tipo A, mostró un fenotipo (WT) tipo silvestre tanto en análisis de secuencias como in vivo en experimentos de presencia viral en animales (ver más adelanté). La cepa Merck 287 fue pasada serialmente 22 veces (pasaje 1 (p1) - pasaje 22 (p22)) a una multiplicidad fija en monocapas VERO-CCL-81. Los títulos de virus permanecieron constantes ante pasaje y el efecto citopático del virus en cultivo también permaneció consistente. Los rendimientos de virus estuvieron en el rango 106-107 pfu/ml.

EJEMPLO 2 Secuenciación de la MRK VSR cepa 287 y Concentrados virales sometidos a proceso de pasaje Muestras VSR - Los materiales fueron proporcionados en 500-1000 ul alícuotas de sobrenadantes virales cosechados desde células VERO infectadas. Secuencias de longitud completa fueron generadas para: 1 ) MRK VSR cepa 287; 2) MRK VSR cepa 287, pasaje 17 ("p17"); y, 3) MRK VSR cepa 287, pasaje 22 ("p22"). Secuencias Parciales (dirigidas) fueron generadas para: 1 ) Cepa MRK VSR 287, pasaje 5 ("p5"); 2) MRK VSR cepa 287, pasaje 10 ("p10"); 3) MRK VSR cepa 287, pasaje 15 ("p15"); y, 4) MRK VSR cepa 287, pasaje 18 ("p18").

Extracción de ARN - El ARN se extrajo a partir de sobrenadantes de cultivos celulares utilizando el Kit de Extracción Viral de ARN QiaAMP (Qiagen, cat. no. 52904) mediante por ejemplo el protocolo del fabricante. En resumen, 140 ul de sobrenadantes de virus se agregaron al buffer de lisis, se cargaron sobre un filtro de fijación, se lavaron y eluyeron en 60 ul de agua libre de RNasa. Las muestras de ARN fueron almacenadas a -20°C. Las muestras de ARN extraídas se utilizaron como modelos para amplificación de genoma en fragmentos de ADN de hebra doble mediante reacción de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR). Extracciones múltiples de cada muestra se realizaron para obtener materiales suficientes para las amplificaciones RT-PCR.

Amplificación de genoma VSR por RT-PCR - El genoma VSR de muestras fue amplificado en ADN de hebra doble utilizando el kit Qiagen OneStep RT-PCR (Qiagen, cat. no. 210212). Para secuenciación de longitud completa (MRK VSR 287 y pasajes P17 y P22), treinta (30) amplificaciones de 000 fragmentos de pares de base (bp) fueron realizadas, con cada fragmento traslapando fragmentos adyacentes en aproximadamente 500 bp. Las reacciones de amplificación fueron enumeradas 1 a 30 (para el par del cebador) y realizadas como se lista a continuación. Para secuenciación de longitud parcial (MRK VSR 287 pasajes P5, P10, P15 y Pl 8) siete (7) amplificaciones de 1000 fragmentos pares base fueron realizadas, utilizando pares cebadores 2, 10, 1 1 , 13, 14, 18, y 29. Las reacciones de amplificación fueron enumeradas (para el par cebador) y realizadas como se lista a continuación.

Master Mix (por reacción): 10 ul de buffer 5X QIEDADN OneStep RT-PCR; 2 ul de mezcla dNTP; 3 ul de cebador A (cebador guía) - 10 uM de concentrado, 600nM final; 3 ul cebador B (cebador inverso) - 10 uM concentrado, 600nM final; 2 ul QIEDADN OneStep RT-PCR Enzyme Mix; 5 ul de modelo de ARN; 25 ul agua de calidad para biología molecular.

Las reacciones de amplificación se realizaron en un termociclador Biometra con las siguientes condiciones: 30 minutos, 50°C -paso de transcripción inversa; 15 min 95°C - paso de activación PCR inicial (activación de polimerasa de ADN) ciclos en tres etapas (repetición por 40 ciclos totales); 1 min, 94°C - desnaturalización; 1 minuto, 55°C -apareamiento; 1 minuto, 72°C - extensión; 10 min 72°C - extensión final.

Los cebadores utilizados para las amplificaciones RT-PCR son listados en las Tablas 2 y 3.

TABLA 2 Cebadores de amplificación RT-PCR (secuenciacion), pares 1-15 Par Cebador Secuencia de Cebadores (5' 3') SEO ID NO Posición 5 de Longitud cebador fijación de Producto 1 1056 FWD ACGGGAAAAAATGCGTACAACAAAC 27 1 REV GTGTAGTCATGCATAGAGTTGTTGTT 28 1056 TTAGATTGTGTGAA FWD TATCAACTAGCTAATCAATGTCACTA 29 530 ACACC 1043 REV CCTCTCCCATT I C I I I I AGCA I 1 1 1 30 1572 FWD TTCACACAATCTAAAACAACAACTCT 31 1017 ATGCATGACTACAC 3 1000 REV TTTGGGCATATTCATAAACCTCAAC 32 2016 FWD AATCC C AC A A AAAA ATGCT A A A AG A 33 1537 1018 AATGGGAGAGGTAGC REV CTGTCTCATTTGTTGGGTTGATAATA 34 2554 GTTGA FWD TATGAATATGCCCAAAAATTGGGTGG 35 2001 TGAAGCA 5 1194 REV TGGCTGGTTGTTTTGTTGGCTGCTT 36 3194 FWD GCCCTATAACATCAAATTCAACTATT 37 2507 ATCAACCC 6 1028 REV CGCTTATGGTAAATTTGCTGGGCAT 38 3534 7 1002 FWD ACATCAGAGAAATTGAACAACCTGT 39 3001 REV TTGTAGCTGTGTGCTTCCAATTTGT 40 4002 FWD CTAGCACAAATGCCCAGCAAATTTAC 41 3501 CATAAGCG 8 1097 REV GTGGTTTGCATGGTGGGACGTTGAT 42 4597 9 1002 FWD AGATTTGCAATCAAACCTATGGAAG 43 4002 REV TTCAGACGGATTAGAGGGACTGATT 44 5003 10 1002 FWD CATCAATCCAACAGCTCAAAACAGT 45 4501 REV TACCTTCGGAGGAAGTTGAGTGGAA 46 5502 FWD GAAATTACATCAACAAATCACCACC A 47 5001 11 1000 AAACCTTGGTAGTTCTCTTCTGGCT 48 6000 12 1114 FWD TAATCCAAGCCCTTCTCAAGTCTCC 49 5501 REV GATGTGTGTAATTTCCAACAAGGTG 50 6614 FWD C ACTC A AC AATGCC A AA A A A AC C A 51 6011 A TGTAAC 13 1 117 REV GCATCAAATTCACCAGAGGGGAATA 52 7127 14 1001 FWD TAGACAGCAAAGTTACTCTATCATG 53 6501 REV GATGGTTTATAGATGAGAGTTTCGA 54 7501 FWD ACACTGTGTCTGTAGGCAACACATTA 55 7001 TATTATG 15 1067 REV I I ÜC I GGCAA I C I I I I I AACAGA I 56 8067 GGATAGTTTGTTTA TABLA 3 Cebadores de amplificación RT-PCR (secuenciación). pares 16-30 Par Longitud Posición 5' de Cebador Secuencia de Cebadores (5'-> 3') SEQ ID NO cebador de fijación Producto FWD TGCCAGATTAACTTACTATCTGAAAA 57 7558 ATGAAAACTGGGG 6 1020 REV CACTCTGAGAAAGAGATAACACCTTT 58 8577 TAAATAACTATCGG FWD TAAACAAACTATCCATCTGTTAAAAA 59 8028 7 GATTGCCAGCAGAC 1000 REV GAGTGATTTTTGCCTGCTTTAAGAT 60 9027 FWD GGAAATTCTGCTAATGTTTATCTAAC CG 61 8513 1046 REV Cül I I ICIÜAAI IUAICI ICI ICIG 62 9558 FWD TCATCTTAAAGCAGGCAAAAATCACT 63 9001 CTACA 1053 REV CGTAGTCCTGATAACACAATCAAATC 64 10053 TCTTTCTGTAAGTT 1010 FWD CAGAAGAAGATCAATTCAGAAAACG 65 9534 REV GCGATTTGATTTGTTACTTATTCCTGC 66 10543 1000 FWD CCTTCTTTGTTGGAACTTACAGAAA 67 10001 REV GCAAATAATCTGCTTGAGCATGAGT 68 11000 FWD GAAAGCAGGAATAAGTAACAAATCA 69 10513 AATCGC 1136 REV CGI IAGGGI I I I I G I CAAACG TGAT1 70 11648 ATGCATGTTAAGAA FWD ATAGCCTTAAATTACTGTATAAAGAG 71 11010 TATGCAGGCATAGG 1000 REV I I I I ICCICAICAICICAGIGGCIC 72 12009 1016 FWD GACTTCCTCACAGAGGCTATAGTTC 73 11501 REV GTAAGTCGATGCAAATAGTTGACAC 74 12516 FWD ACTTTGCTTATAAGGATACTTCCATT GG 75 12014 1041 REV CTCTCCCCAATCTTTTTCAAAAATAC 76 13054 CCTTAGAATCTTTC 1131 FWD ATTTGCATCGACTTACAGTCAGTAG 77 12501 REV GGGTTTCTGGTGTAGGATGATATAAT T 78 13631 FWD GAAAGATTCTAAGGGTATTTTTGAAA 79 13015 AAGATTGGGGAGAG 1044 REV CCTTCACCTATGAATGCATAACAATT 80 14058 GGGATCTTTA FWD TTACAACAAATTATATCATCCTACAC 81 13597 CAGAAACCCTAGAG 28 1025 REV CAGCTTTCTTAGGCATGATGAAATTT 82 14621 TTGGTTCTTGATAG FWD ATTAAAGATCCCAATTGTATAGCATT 83 14021 CATAGGTGAAGGAG 29 909 REV GGTTGTCAAGCTGTTTAACAATTCA 84 14929 30 537 FWD TCGGAGGTTTACTTAGTCATCACAA 85 14501 GGTAGTGTATAGCTATGGGAATCTTT AT 86 15037 Los productos RT-PCR amplificados se purificaron utilizando el kit de purificación QIAGEN QIAquick PCR (QIEDADN, cat. no. 28104), mediante por ejemplo el protocolo del fabricante. Los productos RT-PCR fueron enumerados 1 a 30 (con base en el par cebador), almacenados -20°C y enviados para secuenciación a GeneWiz (South Plainfield, NJ).

Secuenciación de productos RT-PCR amplificados - Los productos RT-PCR purificados enviados a GeneWiz (South Plainfield, NJ) para secuenciación de extremos con tinte. La secuenciación se realizó utilizando los cebadores de amplificación RT-PCR, los cuales fueron enviados junto con los productos RT-PCR. Para cada uno de los productos RT-PCR, se generaron (2) secuencias, una utilizando el cebador guía y una utilizando el cebador inverso.

Análisis de secuencia de productos RT-PCR y ensamble de penoma del VSR - Las secuencias de fragmentos RT-PCR generadas fueron importadas en el software de análisis de secuencias Sequencher™ (GeneCodes, Ann Arbor, Michigan) y las secuencias fueron ensambladas al realizar ensambles "contig". Esto consta de la importación de todas las 60 secuencias de producto RT-PCR (2 secuencias para cada uno de los 30 productos) y el ensamble de una secuencia de longitud completa que utiliza las regiones de traslapo de 500 bp como andamios. Las secuencias fueron editadas para picos extraños y faltantes utilizando prácticas comúnmente aceptadas. Las secuencias finalizadas fueron exportadas como archivos con formato FASTA e importadas en el VectorNTI™ para comparaciones y análisis de secuencias. Para secuenciación dirigida de p5, p10, p15, y p18, se hicieron ensambles de fragmentos individuales (es decir, fragmentos 2, 10, 11 , etc.) más que un ensamble de genoma de longitud completa. Las secuencias finales fueron importadas en el VectorNTI™ y se realizaron comparaciones y análisis de secuencias.

Resultados - Se generaron las secuencias genómicas de longitud completa para el material de fuente original (MRK 287), así como también pasaje 17 (p17) y pasaje 22 (p22). Se obtuvieron secuencias diana de niveles de pasaje adicionales para pasajes 5 (p5), 10 (p10), 15 (p15) y 18 (p 8). Se extrajo ARN viral a partir de muestras de sobrenadante de cultivo; se generaron fragmentos de ADN de hebra doble a partir del ARN mediante reacción de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR); los productos RT-PCR se purificaron y secuenciaron; y, las secuencias generadas se ensamblaron en un genoma viral de longitud completa.

Se realizaron las siguientes comparaciones y análisis 1) Se realizó análisis "BLAST" de homología de la secuencia de la MRK VSR cepa 287 contra secuenciación conocida en bases de datos comunes (Genbank, EMBL) para determinar relación de secuencias de MRK VSR 287 contra otras de secuencias de VSR. 2) Alineación de secuencias de la MRK VSR cepa 287 contra MRK VSR p17 para determinar diferencias de secuencia entre la cepa original MRK VSR 287 y p17. 3) Análisis aminoácidos de cualquiera de las diferencias de secuencias entre la MRK VSR cepa 287 original y p 7 para determinar diferencias de secuencias aminoácidas, si existen, asociadas con diferencias de secuencias de ácido nucleico entre las 2 muestras. 4) Alineación de secuencias de la MRK VSR cepa 287 p17 contra MRK VSR p22 para determinar diferencias de secuencia entre la MRK VSR cepa 287 p17 y p22, con el objeto de determinar si las mutaciones puntuales adicionales son adquiridas en otra parte en el genoma viral. 5) Comparación de segmentos génicos 2, 10, 1 1 , 13, 14, 18 y 29 a partir de la MRK VSR cepa 287 y p5, p10, p15, p17, p18, y p22 para determinar diferencias de secuencia entre la MRK VSR cepa 287 original y materiales subcultivados (pasaje) asociados, para entender la adquisición de mutaciones puntuales con nivel de pasaje creciente y los posibles marcadores de atenuación.

Los resultados de análisis de secuencias se resumen a continuación 1) Análisis de secuencias de la MRK VSR cepa 287 -Comparaciones de la MRK VSR cepa 287 con cepas de vacuna y tipo silvestre conocidas del VSR (listadas en Tabla 4) indican que MRK VSR 287 no contiene mutaciones puntuales previamente identificadas como marcadores de atenuación (no se muestran datos). La MRK VSR cepa 287 rindió una secuencia de 15.205 nucleótidos. Los pasajes 17 y 22 proporcionaron 15,000 nucleótidos, con el extremo 5 faltante. La MRK VSR cepa 287 fue similar a las cepas del VSR conocidas del subgrupo A, con puntajes de homología mayores de 95%.

TABLA 4 Información de Acceso en Genbank sobre secuencias seleccionadas de 2) Comparación de secuencias de MRK VSR cepa 287 y Pasaje 17 - Las comparaciones de secuencias genómicas a partir de la MRK VSR cepa 287 y p17 indica que existen 21 diferencias de secuencia (mutaciones puntuales) entre las 2 secuencias. Un resumen de diferencias de secuencias es listado en la Tabla 5.

TABLA 5 Diferencias de secuencia entre la MRK VSR Cepa 287 y p17 * posibles polimorfismos; R, M y K representan códigos IUPAC para polimorfismos: R=A G; K=G o T; M=A o C 3) Comparación de secuencias aminoácidas de MRK VSR Cepa 287 y Pasaje 17 -La ubicación génica de cada mutación puntual identificada en p17 comparada con la secuencia original de cepas MRK VSR 287 fue mapeada y se generó una secuencia aminoácida para cada gen que contiene mutaciones puntuales. De las 21 mutaciones puntuales, 1 está en la región no traducida 5'(3' al gen viral L) y 20 están dentro de los marcos de lectura abierta (genes virales). De las 20 mutaciones de marco de lectura abierta (ORF), cinco (5) son silenciosas y las restantes quince (15) afectan once (11) aminoácidos en tres (3) genes. Los 3 marcos de lectura abierta afectados codifican G (Glicoproteina), F (proteína de fusión) y proteínas L (proteína grande, polimerasa de ARN dependiente de ARN). Una mutación silenciosa ocurre con el gen NS2 ORF, y cuatro (4) mutaciones silenciosas con el marco de lectura abierta del gen G. Un resumen de diferencias de secuencia es listado en Tabla 6.

TABLA 6 Comparación de secuencias aminoácidas entre MRK VSR 287 y Pasaje * posibles polimorfismos: 1=GLU/LYS, 2=ASP/GLY, 3=ASP/ALA, 4=LEU/PHE 4) Alineación de secuencias de MRK VSR p17 contra MRK VSR p22 - Las comparaciones de secuencias entre p17 y p22 encontraron que las dos secuencias eran idénticas. Hubo una posible diferencia en el nivel de polimorfismo en la posición nucleótida número 14656, pero esto no ha sido cuantificado. 5) Comparación de los segmentos pénicos 2, 10, 11, 13, 14, 18, y 29 desde la MRK VSR cepa 287 y pasajes 5, 10, 15, 17, 18 y 22 - Las secuencias se generaron a partir de segmentos génicos seleccionados de la MRK VSR cepa 287 pasajes p5, p10, p15 y p18. Estas secuencias se compararon con la MRK VSR cepa 287, asi como también la cepa MRK VSR pasaje 17 y pasaje 22. La Tabla 7 es una comparación de las secuencias en los sitios previamente identificados de las mutaciones puntuales VSR p17. Es evidente a partir de los datos presentados que la mutación silenciosa NS2 fue adquirida por el quinto pasaje, mientras las mutaciones del gen G estuvieron presentes por el décimo pasaje. Las mutaciones en los genes F y L comenzaron a aparecer por el pasaje 10, y evidencia de todas las mutaciones puntuales está presente en el pasaje 17. El polimorfismo en la posición 14656 es aún evidente, mientras la presencia de otros polimorfismos está en cuestión. La Tabla 7 resume las comparaciones de los diferentes niveles de pasaje analizados.

TABLA 7 * posibles polimorfismos; R, M y K representan códigos IUPAC para polimorfismos: R=A o G; K=G o T; M=A o C EJEMPLO 3 Atenuación de Cepas Pasadas MRK VSR 287 Estudio de Inoculación en Monos Verdes Africanos - Todos los animales se pre-clasificaron para títulos de anticuerpos seroneutralizantes. Solamente aquellos con títulos < 4 se utilizaron en los estudios actuales. Los monos se anestesiaron utilizando 10 mg/kg de cetamina, intramuscularmente, y se inocularon con dos dosis cada una de 105 5 pfu de virus. El virus se administró mediante inoculación intranasal e intratraqueal combinada, 1 mi en cada sitio por dosis. Después de la inoculación, se recolectaron hisopos nasofaríngeos diariamente desde cada mono durante 12 días consecutivos, y se recolectaron lavados broncoalveolares en los días 4, 5, 7, y 10. Se recolectaron muestras nasofaríngeas al frotar suavemente 2-3 áreas de la región orofaríngea utilizando un hisopo Darcon y colocando las puntas en una solución que contiene Solución Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) que contiene 0.2 M Sacarosa, 3.8 mM KH2P04, 7.2 m K2P04 y 4.4 mM monoglutamato de sodio (SPG), y gelatina al 0.1 %. Para lavado broncoalveolar, aproximadamente 5-7 mi HBSS fue infundido directamente en el pulmón y aspirado vía un catéter francés y jeringa estéril. Las muestras recuperadas se suplementaron con 1/10 volumen de lOx SPG y 1/10 volumen de gelatina al 1 %, alicuotadas e inmediatamente almacenadas congeladas a -70°C.

Estudio de inoculación de ratones de algodón - Ratones hembra de algodón de 4 a 8-semanas de edad (Sigmodon hispidus) se inocularon intranasalmente con 105 5 pfu de virus en 0.1 mi de volumen el día 0. Los cornetes pulmonares (lóbulos izquierdos) y nasales se retiraron cuatro días pos inoculación, se homogenizaron en 10 volúmenes de Solución Salina Equilibrada de Hanks (Wálkersville, MD) conteniendo SPG sobre hielo. Las muestras se clarificaron mediante centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos, se alicuotaron e inmediatamente se congelaron almacenadas a -70°C.

Titulación Viral - Se determinaron los títulos virales sobre células Hep-2. Brevemente, se realizaron muestras de prueba con diluciones seriales. 0.1 mi de la muestra se agregó a un pozo de placas de 24 pozos conteniendo células Hep-2 confluentes. Las células se incubaron a 37°C durante 1 hora. Después de incubación, las células fueron lavadas una vez con PBS y superpuestas con 0.5 mi de agarosa al 1% en MEM por pozo e incubaron a 37°C durante 4 días. Después de incubación, las sobreposiciones de agarosa se retiraron y las células se tiñeron con cristal violeta y las placas virales fueron contadas. Los títulos virales se expresaron como unidades formadoras de placas (pfu) por gramo de tejido.

Ensayo de neutralización viral - Para ensayo de neutralización viral, todos los sueros se inactivaron por calor a 56°C durante 30 minutos. Los sueros de prueba se prepararon en diluciones seriales dobles en Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) y se incubaron. El virus A2 tipo silvestre era el virus diana y se diluyó en EMEM al título final de 103 pfu/ml. Volumen igual de suero y el virus se mezclaron e incubaron a 37°C durante 1 hora. Después de incubación, 0.1 mi del virus se transfirió a un pozo de placas de 24 pozos, lo cual fue seguido por el ensayo viral de placas como se describió anteriormente. Los títulos neutralizantes se definieron como la mayor dilución que indujo reducción de > 50% de las placas virales.

Resultados 1) MRK 287p 17 es altamente atenuado en ratones de algodón y Monos verdes africanos - Para evaluar propiedades de replicación in vivo, se comparó virus p17 con su virus p3 precursor y cepa wt A2 en modelos de inoculación en ratones de algodón y monos verde Africano. Los datos a partir de ratones de algodón y los estudios de primates no humanos colectivamente indican que el virus p17 es altamente atenuado.

En el estudio de ratones de algodón, 6 animales por grupo se inocularon intranasalmente con 10 pfu de un virus de prueba; 4 días después de inoculación, se recolectaron muestras de nariz y de pulmón y se utilizaron para titulación de virus (Figura 5). El virus p3 precursor fue encontrado como completamente competente por replicación, lo cual proporcionó aproximadamente 5 registros del virus en ambos los tejidos de nariz y pulmón. Los títulos en la nariz fueron comparables con aquel en la cepa wt A2, mientras que en los pulmones fueron aproximadamente 1 log menos. En contraste, la replicación de virus p17 fue restringida. No se recuperó virus en la nariz con base en el menor límite de detección del ensayo, 40 pfu por gramo de tejido, y se detectó virus pulmonar solamente en uno de cuatro animales. El título viral de este animal también fue bajo, es decir, 200 pfu por gramo de tejido. En comparación con el virus p3 precursor, el p17 tuvo al menos títulos de 4- y 2.5- log menos en la nariz y pulmones, respectivamente.

En el estudio de Monos Verdes Africanos, se inocularon cuatro animales por grupo con un total de 2 x 1055 pfu de virus, del cual la mitad se administró por inoculación intranasal y la otra mitad por inoculación intratraqueal. En varios puntos de tiempo pos inoculación, hisopos nasofaríngeos y lavados pulmonares se recolectaron y utilizaron para titulación de virus. Los resultados se muestran en la Figura 6. Consistente con aquella en ratones de algodón, el virus p3 precursor mostró replicación viral significativa tanto en la nariz como en pulmones, donde los títulos pico estuvieron alrededor de 104 y 105 pfu/ml en nariz y pulmones, respectivamente. Además, sus perfiles de presencia viral en general fueron más similares a aquel de wt A2 virus, en cuanto a que los títulos tuvieron picos entre los días 4 y 7 y duraron alrededor de 10 días. En contraste, el virus p17 fue detectado solo esporádicamente y con títulos bajos. Por ejemplo, el virus de nariz se detectó solamente en dos monos el día 2 y en uno mono el día 8, y el virus pulmonar se detectó en 1 , 3 y 1 monos los días 2, 3 y 7, respectivamente. Entre todas las muestras positivas, el título mayor, el cual fue a partir de las muestras de nariz del día 2, fue 400 pfu por gramo de tejido.

Para entender mejor la relación entre pasaje viral y replicación in vivo, también se probó el virus RK 287 en los pasajes antes de p17 en el modelo de ratón de algodón. Seis animales por grupo fueron inoculados con 105 pfu de virus y se cosecharon muestras el día 4 pos inoculación. Como se muestra en la Figura 7, el virus en el pasaje 5 (p5) ya comienza a mostrar replicación reducida, y aquellos en los pasajes 10 (p10) y 15 (p15) muestran reducción adicional en replicación. El virus p15 parece ser tan atenuado como el virus p17 descrito anteriormente (Figura 5). No se recuperó p 7 en los pulmones y mientras que se detectó en las muestras nasales, los títulos fueron más 3 logs menos que los del virus precursor p3. 2) Inmunización intramuscular única con virus de vacuna MRK287p17 induce fuertes respuestas de anticuerpos seroneutralizantes (SN) y confiere protección significativa contra inoculación del virus wt en ratones de algodón y Monos verdes africanos - Se realizaron estudios de inmunogenicidad y protección tanto en ratones de algodón como en monos verdes africanos. La datos demuestran que inmunización sistémica única con la cepa de vacuna atenuada MRK287 p17 puede inducir títulos SN significativos y conferir protección contra inoculación del wt virus en los modelos animales.

Para el estudio de ratones de algodón, se inmunizaron 4 animales por grupo intramuscularmente con 104 5 pfu de wt A2 virus, MRK287 p3, o MRK287 p17. Se recolectaron muestras sanguíneas los días 14, 28, y 56 y se utilizaron para determinación de anticuerpos seroneutralizantes (SN) contra wt A2 virus. El día 56, ambos los animales inmunizados y un grupo de animales nunca antes sometidos a tratamiento fueron inoculados intranasalmente con 105 5 pfu de wt A2 virus, y los tejidos de nariz y pulmón se recolectaron 4 días pos inoculación. Inmunización intramuscular única con todos los tres virus indujo títulos SN significativos, los cuales alcanzaron el nivel máximo alrededor del día 28 y persistieron hasta el día 56 cuando la animales fueron inoculados (Figura 8). Los animales que recibieron el virus A2 exhibieron títulos SN más altos que aquellos que recibieron virus MRK 287. Esto puede deberse al hecho de que la seroneutralización (SN) se determinó contra la cepa A2. Los títulos SN de los animales que recibieron el virus MRK 287 p3 precursor y aquellos que recibieron el virus p17 fueron comparables, aunque hubo una tendencia que el último indujo títulos SN más altos los días 28 y 56. Después de inoculación, no hubo virus detectable desde tejidos pulmonares de todos los tres grupos inmunizados (Figura 9), indicando que la vacunación proporcionó una protección completa en el tracto respiratorio inferior. Con respecto a las muestras nasales, los animales que recibieron wt A2 no tuvieron virus detectable, y los animales que recibieron cualquiera MRK287 p3 o p17 tuvieron títulos muy bajos, aproximadamente 3 logs menos que que de los animales nunca antes sometidos a tratamiento.

El estudio de Monos Verdes Africanos involucró dos grupos, un grupo experimental y un grupo de control nunca sometido a tratamiento, con 4 animales cada uno. Para el grupo experimental, los animales fueron inmunizados intramuscularmente con 105 5 pfu de virus MRK287 p17 el día 0. Ambos grupos fueron inoculados con 2 x 105 5 pfu de wt A2 virus mediante inoculación intranasal e intratraqueal el día 28. Se recolectaron hisopos de nariz y lavados pulmón el día 7 pos inoculación para titulación de virus. La Figura 10 muestra los títulos SN títulos el día 28. Los animales que recibieron la vacuna desarrollaron títulos SN promedio de 1 :128 aproximadamente (7 log 2). Después de inoculación, los animales nativos tuvieron aproximadamente 3.5- y 5-log pfu/ml de virus el día 7 en las muestras de nariz y de pulmón, respectivamente (Figura 11). Los animales que recibieron la vacuna tenían títulos virales de aproximadamente 1 log menos en la nariz y títulos virales 3 logs menos en los pulmones que aquellos en los animales nunca antes sometidos a tratamiento.

EJEMPLO 4 P17 Purificado mediante Placa Purificación por placa - El pasaje de virus p17 fue titulado para el propósito de aislar y cosechar placas individuales con la intención de identificar poblaciones genéticas únicas (clónales) del virus p17. El virus fue titulado para dirigirse a menos de 10 placas por pozo. El título de inicio del concentrado de virus fue 1.7xl06 pfu/mL, y el rango de diluciones finales corridas para el ensayo fueron 1 :10,000, 1 :20,000, y 1 :40,000. El día 7 pos inoculación, las placas se visualizaron tanto macroscópicamente como microscópicamente para placas singulares sobre la monocapa. El virus pasaje 17 virus produjo dos morfologías de placa diferentes, grande (aproximadamente 2mM de diámetro) y pequeña (< 1mM de diámetro). Para el aislamiento inicial, se aislaron diez placas de morfología pequeña (#1-10), y placas de morfología grande (#11-20). El aislamiento se realizó al colocar una pipeta serológica estéril de 1ml_ a través de la agarosa y encerrando el perímetro de la placa a aislar. Levantando el área con succión, el material luego se transfirió a 1mL de medio de mantenimiento de VSR, se dispersó y alicuotó 5x200uL La Placa #1 y #11 se eligieron para titulación y amplificación inmediata en placas de cultivo tisular Vero. El resto de las alícuotas se congelaron vía nitrógeno líquido y se almacenaron a -70°C. La amplificación secundaria constó de titular placas a 1 :20, 1 :200, y 1 :2000 en placas Vero. Algunas placas recibieron recubrimiento de agarosa para crear una población secundaria de placas a partir de la placa precursora, mientras otras recibieron recubrimiento de medio de mantenimiento de VSR líquido para crear concentrados de placas precursoras #1 y #1 1 para análisis de secuencia subsiguiente. Del ensayo de placa secundario a partir de las placas #1 y #1 1 , dos placas fueron aisladas. Estas placas fueron elegidas debido a su segregación a partir de otras placas sobre el plato (reduciendo así la probabilidad de obtener a población mixta) y su morfología de placas siendo similar a la precursora. Dos placas cada una fueron aisladas a partir de placa precursora y rotuladas #1-1 y #1-2 (ej., las placas aisladas a partir de la placa #11 recibieron la nomenclatura de #11-1 y #11-2). Placa #1-2 fue elegida para titular y amplificar en una tercera ronda de purificación de placas: Ix200ul de la placa #1-2 fue titulado simultáneamente para la purificación y amplificación para crear concentrados adicionales del pariente #1-2. Las placas aisladas a partir de #1-2 fueron rotuladas #1-2.1 , #1-2.2, #1-2.3, #1-2.4, #1.2-5, y #1-2.6. El análisis de secuencias realizado sobre aislados detenidos después de análisis de #12.1 mostró una población clonal.

Amplificación de placa #1-2.1 para concentraciones de virus - El crecimiento de concentraciones de virus siguió procedimiento estándar, descrito previamente. 200ul de la placa original se amplificaron en cultivos de 12 pozos de células Vero. Concentrados de la primera amplificación (ppl) se utilizaron para inocular cultivos Vero T150; material cosechado (pp2) se amplificó una vez más para crear un gran volumen (1 L aproximadamente) de material para uso experimental. Las alícuotas de #1-2.1 tomadas a partir de cada escala se suministraron para análisis de secuencia. El material PP3 se utilizó para uso en estudios en ratones de algodón.

Estudio de inoculación en ratones de algodón - Cuatro ratones de algodón hembra de 4-8 semanas de edad {Sigmodon hispidus) se inocularon intranasalmente, bajo anestesia de isoflurano con 105 pfu de virus en 0.1 mi volumen el día 0. Se retiraron cornetes pulmonares (lóbulos izquierdos) y nasales cuatro días pos inoculación, se homogenizaron en 10 volúmenes de Solución Salina Equilibrada de Hanks (Walkersville, MD) conteniendo SPG sobre hielo. Las muestras se clarificaron por centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos, alicuotadas e inmediatamente almacenadas congeladas a -70°C. Los virus incluyen: (1) MRK287 p22, (2) MRK 287 p17, (3) MRK287 p17 purificado por placa, (4) MRK287 p15, (5) MPvK287 p10, (6) MRK287 p5, (7) MRK287 p3, y (8) VSR A2 tipo silvestre. Los homogenados nasales y pulmonares fueron titulados en células Vero y se expresaron como unidades formadoras de placas (pfu) por gramo de tejido.

Resultados - El MRK287 pasaje 17 (p17) fue purificado por placas a una población clonal ("p17_pp") y secuenciado como se describió en el Ejemplo 2. Una mutación nucleótida adicional fue observada en el virus purificado por placas, localizada en la posición nucleótida 260 dentro del genoma de VSR, que corresponde a la posición nucleótida 162 dentro del gene que codifica la proteína NS1. Esta es una mutación silenciosa (es decir, no resulta en una mutación aminoácida). SEQ ID NO: 87 corresponde a la secuencia génica silvestre que codifica NS1 (ej., cepa S2). SEQ ID NO: 89 corresponde a la secuencia nucleótida que codifica NS1 dentro de MRK287 y p17. SEQ ID NO: 90 corresponde a la secuencia nucleótida que codifica NS1 dentro de p17_pp. Las Tablas 8 y 9 comparan las mutaciones en MRK287 p17 y la versión purificada por placas (p17_pp). SEQ ID NO: 88 corresponde a la secuencia aminoácida de NS1 (la cual es igual para el wt S2 virus, MRK287, MRK287 p17 y MRK287 p17_pp).

TABLA 8 Diferencias de secuencia entre MRK VSR Cepa 287. p17 y p17 pp Posición MRK VSR 287 p17 P17 PP nucleótida 260 T T A 954 G A A 5295 A G G 5298 A G G 5315 A* G G 5316 A G G 5322 A G G 5324 A G G 5339 A G G 5346 A G G 5347 A G G 5351 A G G 5352 A G G 5353 A G G 5360 A. G G 5380 A G G 5381 A G G 6538 G A (R?) * 7115 A G (R?) * G 8937 A C (M?) * C 14656 G T (K?) * T 15046 C TBD * posibles polimorfismos; R, M y K representan códigos IUPAC para polimorfismos: R=A o G; K=G o T; M=A o C TABLA 9 Comparación de secuencias aminoácidas entre MRK VSR 287. p17 y P17 pp Posición Posición Posición Nota Aminoácido Aminoácido Aminoácido Nucleó ida nucleótidel MRK VSR p17 p17_pp da - gen Aminoácid 287 VSR o del Gen 260 NS1-162 54 ILE ILE ILE Mutación silenciosa 954 NS2-327 109 LYS LYS LYS Mutación silenciosa 5295 G-610 204 LYS GLU GLU 5298 G-613 205 LYS GLU GLU 5315 G-630 210 THR THR THR Mutación silenciosa 5316 G-631 211 THR AILAI ALA 5322 G-637 213 L/VS GLU GLU 5324 G-639 5339 G-654 219 GLN GLN GLN Mutación silenciosa 5346 G-661 221 LYS GLY GLY 5347 G-662 5351 G-666 222 SER SER Mutación silenciosa 5352 G-667 223 LYS GLU GLU 5353 G-668 5360 G-675 226 VAL VAL VAL Mutación silenciosa 5380 G-695 232 GLU GLY GLY 5381 G-696 6538 F-880 294 GLU LYS*1 LYS 7115 F-1457 486 ASP GLY*2 GLY 8937 L-443 148 ASP AkLiAt ALA 14656 L-6162 2054 LEU PHE*4 PHE 15046 NTR NA región sin NA NA NA traducir 5' * posibles polimorfismos: 1=GLU7LYS, 2-ASP/GLY, 3=ASP/ALA, 4=LEU/PHE Los títulos medios de los 4 animales individuales en el estudio de inoculación en ratones de algodón, y los intervalos de confianza inferior y superior (Cl), para cada animal inoculado con (1 ) MRK287 p22, (2) MRK287 p17, (3) MRK287 p17 purificado por placas, (4) MRK287 p15, (5) MRK287 p10, (6) RK287 p5, (7) MRK287 p3, o (8) VSR A2 tipo silvestre se muestran en Tabla 10. Los títulos de virus de VSR A2 tipo silvestre y MRK287 p3 tienen por encima de 4 logs pfu/g tejido. Las muestras pulmonares MRK287 p5 tienen aún aproximadamente 4 logs de virus pfu/g. En contraste, el virus en y después del pasaje 10, incluyendo el MRK287 p17 purificado por placas, muestra una reducción de más de 2 logs desde las cepas tipo silvestre, en ambas las muestras de nariz y pulmón. Además, estos datos confirman que el MRK287 p 7 purificado por placas es tan atenuado como MRK287 p17.

TABLA 10 Títulos virales (log pfu/qramo de tejido) * El Limite de delección fue 1.6 pfu/g para muestras nasales y 2.0 pfu/g para muestras pulmonares

Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un virus sincitial respiratorio vivo atenuado (VSR) que comprende un genoma viral, en donde el genoma viral codifica proteínas que comprenden uno o más aminoácidos seleccionados a partir del grupo que consta de: un ácido glutámico en la posición 204 de la proteína codificada por el gen G; un ácido glutámico en la posición 205 de la proteina codificada por el gen G; una alanina en la posición 211 de la proteína codificada por el gen G; un ácido glutámico en la posición 213 de la proteína codificada por el gen G; una glicina en la posición 221 de la proteína codificada por el gen G; un ácido glutámico en la posición 223 de la proteína codificada por el gen G; una glicina en la posición 232 de la proteína codificada por el gen G; una lisina en la posición 294 de la proteína codificada por el gen F; una glicina en la posición 486 de la proteína codificada por el gen F; una alanina en la posición 148 de la proteína codificada por el gen L; y, una fenilalanina en la posición 2054 de la proteína codificada por el gen L.

2.- El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el genoma viral codifica proteínas que comprenden una lisina en la posición 294 de la proteína codificada por el gen F, una glicina en la posición 486 de la proteína codificada por el gen F, una alanina en la posición 148 de la proteína codificada por el gen L, y una fenilalanina en la posición 2054 de la proteína codificada por el gen L

3. - El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque las proteínas codificadas por los genes F y L comprenden secuencias aminoácidas que son al menos 95% idénticas a las secuencias aminoácidas como se divulga en SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO. 24, respectivamente.

4. - El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque las proteínas codificada por los genes F y L constan de las secuencias aminoácidas como se divulga en SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 24, respectivamente.

5. - El VSR atenuado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el genoma viral comprende los genes F y L que son al menos 95% idénticos a las secuencias nucleótidas como se divulga en SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 23, respectivamente.

6.- El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el genoma viral comprende los genes F y L que constan de las secuencias nucleótidas como se divulga en SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 23, respectivamente.

7.- El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el genoma viral codifica proteínas que comprenden un ácido glutámico en la posición 204 de la proteína codificada por el gen G, un ácido glutámico en la posición 205 de la proteina codificada por el gen G, una alanina en la posición 211 de la proteína codificada por el gen G, un ácido glutámico en la posición 213 de la proteína codificada por el gen G, una glicina en la posición 221 de la proteina codificada por el gen G, un ácido glutámico en la posición 223 de la proteína codificada por el gen G, una glicina en la posición 232 de la proteína codificada por el gen G, una Usina en la posición 294 de la proteina codificada por el gen F, una glicina en la posición 486 de la proteina codificada por el gen F, una alanina en la posición 148 de la proteína codificada por el gen L, y una fenilalanina en la posición 2054 de la proteina codificada por el gen L.

8. - El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque las proteínas codificadas por los genes G, F y L comprenden secuencias aminoácidas que son al menos 95% idéntica a las secuencias aminoácidas como se divulga en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 24, respectivamente.

9. - El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque las proteínas codificadas por los genes G, F, y L constan de las secuencias aminoácidas como se divulga en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 24, respectivamente.

10. - El VSR atenuado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el genoma viral además comprende uno o más nucleótidos seleccionados a partir del grupo que consta una adenina en la posición nucleótida 162 del gen NS1 , una adenina en la posición nucleótida 327 del gen NS2, una guanina en la posición nucleótida 630 del gen G, una guanina en la posición nucleótida 654 del gen G, una guanina en la posición nucleótida 666 del gen G, y una guanina en la posición nucleótida 675 del gen G.

11. - El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el genoma viral comprende una adenina en la posición nucleótida 162 del gen NS1 , una adenina en la posición nucleótida 327 del gen NS2, una guanina en la posición nucleótida 630 del gen G, una guanina en la posición nucleótida 654 del gen G, una guanina en la posición nucleótida 666 del gen G, y una guanina en la posición nucleótida 675 del gen G.

12. - El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el genoma viral comprende los genes NS1 , NS2, G, F y L que son al menos 95% idénticos a las secuencias nucleótidas como se divulga en SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 23, respectivamente.

13. - El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el genoma viral comprende los genes NS1 , NS2, G, F, y L que constan de las secuencias nucleótidas como se divulga en SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 23, respectivamente.

14 - Un virus sincitial respiratorio vivo atenuado (VSR) que comprende un genoma viral que comprende una o más mutaciones nucleótidas en comparación con un genoma viral del VSR no atenuado, en donde una o más de las mutaciones nucleótidas resultan en una o más mutaciones aminoácidas, y en donde la una o más mutaciones aminoácidas están localizadas en las posiciones aminoácidas seleccionadas a partir del grupo que consta de las posiciones 204, 205, 211 , 213, 221 , 223, y 232, cada proteina codificada por el gen G; las posiciones 294 y 486, cada proteína codificada por el gen F; y, las posiciones 148 y 2054, cada proteina codificada por el gen L.

15.- El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque una mutación aminoácida en la posición 204 de la proteína codificada por el gen G es un ácido glutámico, una mutación aminoácida en la posición 205 de la proteina codificada por el gen G es un ácido glutámico, una mutación aminoácida en la posición 211 de la proteina codificada por el gen G es una alanina, una mutación aminoácida en la posición 2 3 de la proteina codificada por el gen G es un ácido glutámico, una mutación aminoácida en la posición 221 de la proteína codificada por el gen G es una glicina, una mutación aminoácida en la posición 223 de la proteína codificada por el gen G es un ácido glutámico, una mutación aminoácida en la posición 232 de la proteina codificada por el gen G es una glicina, una mutación aminoácida en la posición 294 de la proteína codificada por el gen F es una lisina, una mutación aminoácida en la posición 486 de la proteína codificada por el gen F es una glicina, una mutación aminoácida en la posición 148 de la proteína codificada por el gen L es una alanina, y una mutación aminoácida en la posición 2054 de la proteína codificada por el gen L es una fenilalanina.

16. - El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque una mutación aminoácida en la posición 204 de la proteina codificada por el gen G es Lys204Glu, una mutación aminoácida en la posición 205 de la proteína codificada por el gen G es Lys205Glu, una mutación aminoácida en la posición 211 de la proteína codificada por el gen G es Thr21 lAla, una mutación aminoácida en la posición 213 de la proteína codificada por el gen G es Lys213Glu, una mutación aminoácida en la posición 221 de la proteína codificada por el gen G es Lys221 Gly, una mutación aminoácida en la posición 223 de la proteína codificada por el gen G es Lys223Glu, una mutación aminoácida en la posición 232 de la proteína codificada por el gen G es Glu232Gly, una mutación aminoácida en la posición 294 de la proteína codificada por el gen F es Glu294Lys, una mutación aminoácida en la posición 486 de la proteína codificada por el gen F es Asp486Gly, una mutación aminoácida en la posición 148 de la proteína codificada por el gen L es Asp 148 Ala, y una mutación aminoácida en la posición 2054 de la proteína codificada por el gen L es Leu2054Phe.

17. - El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la una o más mutaciones aminoácidas comprende Glu294Lys de la proteina codificada por el gen F, Asp486Gly de la proteína codificada por el gen F, Aspl48Ala de la proteína codificada por el gen L, y Leu2054Phe de la proteína codificada por el gen L.

18. - El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la una o más mutaciones aminoácidas comprende Lys204Glu de la proteina codificada por el gen G, Lys205Glu de la proteína codificada por el gen G, Thr211 Ala de la proteína codificada por el gen G, Lys213Glu de la proteína codificada por el gen G, Lys221Gly de la proteína codificada por el gen G, Lys223Glu de la proteína codificada por el gen G, Glu232Gly de la proteína codificada por el gen G, Glu294Lys de la proteína codificada por el gen F, Asp486Gly de la proteína codificada por el gen F, Aspl48Ala de la proteína codificada por el gen L, y Leu2054Phe de la proteína codificada por el gen L.

19.- El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la una o más mutaciones nucleótidas que resultan en la una o más mutaciones aminoácidas están localizadas en la posiciones nucleótidas seleccionados desde el grupo que consta de: posiciones 610, 613, 631 , 637, 639, 661 , 662, 667, 668, 695, y 696 del gen G; posiciones 880 y 1457 del gen F; y, posiciones 443 y 6162 del gen L.

20.- El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque a mutación nucleótida en la posición nucleótida 610 del gen G es A610G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 613 del gen G es A613G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 631 del gen G es A631G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 637 del gen G es A637G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 639 del gen G es A639G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 661 del gen G es A661G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 662 del gen G es A662G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 667 del gen G es A667G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 668 del gen G es A668G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 695 del gen G es A695G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 696 del gen G es A696G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 880 del gen F es G880A, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 1457 del gen F es A1457G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 443 del gen L es A443C, y una mutación nucleótida en la posición nucleótida 6162 del gel L es G6162T.

21 - El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el genoma viral además comprende una o más mutaciones nucleótidas silenciosas localizadas en las posiciones nucleótidas seleccionadas desde el grupo que consta de la posición 162 del gen NS1 , posición 327 del gen NS2, posición 630 del gen G, posición 654 del gen G, posición 666 del gen G, y posición 675 del gen G.

22.- El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque una mutación nucleótida en la posición nucleótida 162 del gen NS1 es T162A, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 327 del gen NS2 es G327A, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 630 del gen G es A630G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 654 del gen G es A654G, una mutación nucleótida en la posición nucleótida 666 del gen G es A666G, y una mutación nucleótida en la posición nucleótida 675 del gen G es A675G.

23.- El VSR atenuado de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el genoma viral comprende las mutaciones nucleótidas de: T162A en la posición nucleótida 162 del gen NS1 , G327A en la posición nucleótida 327 del gen NS2, A610G en la posición nucleótida 610 del gen G, A613G en la posición nucleótida 613 del gen G, A630G en la posición nucleótida 630 del gen G, A631G en la posición nucleótida 631 del gen G, A637G en la posición nucleótida 637 del gen G, A639G en la posición nucleótida 639 del gen G, A654G en la posición nucleótida 654 del gen G, A661G en la posición nucleótida 661 del gen G, A662G en la posición nucleótida 662 del gen G, A666G en la posición nucleótida 666 del gen G, A667G en la posición nucleótida 667 del gen G, A668G en la posición nucleótida 668 del gen G, A675G en la posición nucleótida 675 del gen G, A695G en la posición nucleótida 695 del gen G, A696G en la posición nucleótida 696 del gen G, G880A en la posición nucleótida 880 del gen F, A1457G en la posición nucleótida 1457 del gen F, A443C en la posición nucleótida 443 del gen L, y G6162T en la posición nucleótida 6162 del gel L.

24. - Una composición inmunogénica que comprende el VSR atenuado vivo de cualquiera de las reivindicaciones 1-23 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

25. - Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia genómica o anti-genómica que codifica el VSR atenuado vivo de cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

26. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque dicha molécula de ácido nucleico es un vector de expresión.

27. - Una célula recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 26.

28. - Una población de virus sincitial respiratorio vivo atenuado (VSR) que comprende el VSR atenuado de cualquiera de las reivindicaciones 1-23.

29 - Una composición inmunogénica que comprende la población de VSR atenuado vivo de la reivindicación 28 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

30.- El uso de una cantidad inmunológicamente efectiva de uno o más de los siguientes: (a) el VSR atenuado de cualquiera de las reivindicaciones 1-23; (b) la población de VSR atenuado de la reivindicación 28; (c) la composición inmunogénica de la reivindicación 24; o, (d) la composición inmunogénica de la reivindicación 29; en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune protectora en un paciente contra una infección por VSR.

31.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 30, en donde el paciente es un humano.