JP2011250798A - 生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】hRSV A型株(Merck株287)を連続して継代することによって同定された生弱毒化RSVウイルス。対象に投与された場合に非病原性で、ある程度まで弱毒化されているが、野生型RSVの抗原性および免疫原性特性を実質的に維持している、前記弱毒化RSVウイルス、並びに、前記生弱毒化RSV個体群および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物のうちの1つまたは複数を投与する工程を含む、対象の体内においてRSV感染に対して防御免疫応答を誘導する方法。
【選択図】なし
Description
本出願は、2008年11月5日に出願された米国仮出願第61/198,327号の利益を主張するものであり、この出願は本明細書に参照により取り込まれる。
本明細書に記載される生弱毒化RSVウイルスはhRSV A型株(以後「Merck株287」、「株287」または「p0.」と称する)を連続して継代することによって同定された。Merck株287は、GMK細胞で最初に2回増幅されたRSV株に由来する。この最初の増幅の後、当該ウイルスはヒトニ倍体細胞株WI−38中において更に5回の継代を経ている。この5回継代材料は、Merck株287と命名され、配列が決定されて、弱毒化の既知遺伝子マーカーについて遺伝学的に野生型であり且つ表現型も野生型であることが示された(後段の実施例参照)。
第1の実施態様として、本発明は生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス(RSV)に関するものであり、当該ウイルスに含まれるウイルスゲノムは、G遺伝子にコードされるタンパク質の204位のグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の205位のグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の211位のアラニン、G遺伝子にコードされるタンパク質の213位のグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の221位のグリシン、G遺伝子にコードされるタンパク質の223位のグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の232位のグリシン、F遺伝子にコードされるタンパク質の294位のリシン、F遺伝子にコードされるタンパク質の486位のグリシン、L遺伝子にコードされるタンパク質の148位のアラニン、L遺伝子にコードされるタンパク質の2054位のフェニルアラニンからなる群より選択される1以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードする。したがって、この実施態様において、本発明の生弱毒化RSVはこの段落に記載されているアミノ酸残基の1つ、全てまたは部分集団を含む。列挙されたアミノ酸残基の位置は、ウイルスゲノム内の遺伝子にコードされる特定のアミノ酸配列内におけるそれらの位置により示される。G、FおよびLタンパク質はそれぞれG、FおよびL遺伝子によってコードされる。
第八の実施態様においては、上記各実施態様に記載された生弱毒化RSVはRSVの抗原性サブグループAまたはBのいずれかに属している。更なる実施態様においては、生弱毒化RSVはヒトRSVである。
本明細書に記載される生弱毒化RSVまたは当該生弱毒化RSVを含むウイルス個体群および医薬上許容される担体を含む医薬組成物も本発明によって提供される。
したがって、本明細書に記載される生弱毒化RSVは、生物学的活性の維持を補助し、また許容可能な温度範囲内での保存期間における安定性を向上させるために、医薬上許容可能な担体とともに製剤化することができる。本明細書で用いる場合、「医薬上許容可能な担体」との用語は、当業界で周知でありRemington’s Pharmaceutical Sciencesのような様々なテキストに記載されている適当な製剤用担体を含む。担体として使用可能なものには生理的平衡培養液、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション(例えば油/水または水/油エマルション)、タンパク質、ペプチドもしくは加水分解物(例えばアルブミン、ゼラチン)等の安定化剤もしくは凍結保護用添加剤、糖(例えばラクトース、ソルビトール)、アミノ酸(例えばグルタミン酸ナトリウム)またはその他利用可能な薬品が含まれるが、これらに限定されない。得られた水溶液はそのまま使用するように容器に入れられるか、または凍結乾燥される。凍結乾燥された配合剤は無菌液と組み合わされて単回投与または複数回投与のいずれかで投与される。製剤化された組成物、特に液剤は、保存時における分解を防止または軽減するために、有効濃度(通常は1% w/v以下)のベンシルアルコール、フェノール、m−クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベンおよび/またはプロピルパラベンを含む(但しこれらに限定はされない)静菌薬を含んでいても良い。静菌薬はある種の患者には禁忌であり、したがって凍結乾燥された製剤は、これらの成分を含む溶液か含まない溶液のいずれかに溶かすことができる。
生弱毒化RSVまたは当該生弱毒化ウイルスを含むウイルス個体群を含む医薬組成物は、RSV感染およびそれに関連する疾患を治療することを目的として対象者に接種するために有用である。本発明の範囲は、母子免疫を含むことを意図している。
本明細書に記載される生弱毒化RSVは、生物学的に誘導するか、遺伝子組み換えによって産生される。「生物学的に誘導されたRSV」とは、組み換え技術によって産生されたものではないRSV(例えば継代培養によるRSV)を意味している。「遺伝子組み換えによって産生されたRSV」とは、ウイルスクローニング技術(例えばリバースジェネティクス法)によって産生されたRSVを意味している。生弱毒化RSVは参照RSV配列と比較するとゲノム変動を含んでおり、ここで参照RSV配列とは野生型または不完全に弱毒化されたRSVである。
本明細書に記載される弱毒化RSVゲノムもしくはアンチゲノムの全長または一部のいずれかを含む核酸分子、本明細書に記載される改変されたウイルスタンパク質もしくはその一部をコードするヌクレオチド配列、または本明細書に記載される改変されたウイルスゲノムもしくはその一部のヌクレオチド配列(上記II節における本願発明の生弱毒化RSV内に含まれる核酸の記載参照)も、本願発明の範囲内に含まれる。これらの核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)分子、相補性DNA分子(cDNA)またはリボ核酸(RNA)分子であり得る。
C=Cys=システイン: コドン UGC、 UGU
D=Asp=アスパラギン酸: コドン GAC、 GAU
E=Glu=グルタミン酸: コドン GAA、 GAG
F=Phe=フェニルアラニン: コドン UUC、 UUU
G=Gly=グリシン: コドン GGA、 GGC、 GGG、 GGU
H=His=ヒスチジン: コドン CAC、 CAU
I=Ile=イソロイシン: コドン AUA、 AUC、 AUU
K=Lys=ロイシン: コドン AAA、 AAG
L=Leu=ロイシン: コドン UUA、 UUG、 CUA、 CUC、 CUG、 CUU
M=Met=メチオニン: コドン AUG
N=Asn=アスパラギン: コドン AAC、 AAU
P=Pro=プロリン: コドン CCA、 CCC、 CCG、 CCU
Q=Gln=グルタミン: コドン CAA、 CAG
R=Arg=アルギニン: コドン AGA、 AGG、 CGA、 CGC、 CGG、 CGU
S=Ser=セリン: コドン AGC、 AGU、 UCA、 UCC、 UCG、 UCU
T=Thr=トレオニン: コドン ACA、 ACC、 ACG、 ACU
V=Val=バリン: コドン GUA、 GUC、 GUG、 GUU
W=Trp=トリプトファン: コドン UGG
Y=Tyr=チロシン: コドン UAC、 UAU
したがって、本願発明は、開示された核酸分子とは異なるが同じタンパク質配列をコードしている核酸を含む。
MRK RSV株287の継代
細胞およびウイルス
アフリカミドリザルの腎臓細胞株Vero CCL−81をウイルス増殖試験およびプラークアッセイの両方に用いてウイルス生産をモニターした。使用した親ウイルスは‐20℃で保存、凍結乾燥されていたMerck287株hRSVを用いた。親Merck287ウイルスはGMK細胞中において2回継代され、その後WI−38細胞(Bunyakら、1978、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.157:636−642:Bunyakら、1979、Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 160:272−277;Belsheら、1982、J.Infect.Dis. 145:311−319)中において更に5回継代された。配列分析によって、弱毒化に関連する既知の全ての位置において野生型の遺伝子型が保持されていることが確認された。
親ウイルスを用いて、1週間目のコンフルエントなVero単層細胞に、32℃、1:100または1:1000MOIで1時間接触させて感染させ;ウィリアム培地E(Gibco)、1.6%組み換えヒトアルブミン(Delta biotechnologies)、2mM L−グルタミン(Gibco)および50μg/ml ネオマイシン(Sigma)からなる維持培地によって接触後に被覆した。90%以上の最大細胞変性効果(CPE)が認められまで培養を観察した後、回収し、CPEが上昇し過ぎて適切なウイルス産生ができなくなるまで栄養補給して24時間間隔で更に回収を行った。
回収したウイルスサンプルは、プラークアッセイによって連続10倍希釈における力価検定に供し、12穴アッセイフォーマット(Costar:100μl/well、連続10倍希釈の1希釈あたり3ウェル、1プレート当たり4希釈)中のコンフルエント(48〜78時間)VERO単層への接種に使用した。35℃±1℃、5.0%CO2の条件下で1時間プレートをインキュベートし、ウィリアム培地E(Gibco)、1.6%組み換えヒトアルブミン(Delta biotechnologies)、2mM L−グルタミン(Gibco)、50μg/ml ネオマイシン(Sigma)および最終濃度0.5% SeaPlaque(登録商標)アガロースからなる維持培地で被覆する。35℃±1℃、5.0%CO2の条件下、6〜8日でプラークが生じる。5mg/ml MTT(Thialzolyl Blue Tetrazolium Bromide(Sigma−Aldrich(登録商標))のPBS溶液)を1ウェル当たり250μl加え、細胞が染色剤を代謝するまで2〜6時間待ってプラークを可視化した。
Merck HRSV株287が、GMK細胞で最初に2回増幅した単離hRSV株から得られた。最初の増幅の後、このウイルスをヒトニ倍体細胞株WI−38中で更に5回継代した。この5回継代材料を、非経口投与経路によるワクチン用途のためのヒト臨床試験に使用した。Merck株287、hRSV A型、は配列分析およびin vivo動物排出実験(後記参照)のいずれにおいても野生型(WT)表現型を示した。Merck株287を一定の多重度でVERO−CCL−81単層中において連続して22回継代した(継代1(p1)〜継代22(p22))。継代の間において、ウイルス力価は一定に維持され、培養中のウイルスによる細胞変性効果も一定に維持されていた。ウイルス収量は106〜107 pfu/mlの範囲であった。
実施例2
MRK RSV株287および継代された保存ウイルスの配列決定
RSVサンプル
材料は、感染VERO細胞から回収されたウイルス上清液の500〜1000μlアリコットとして供された。1)MRK RSV株287、2)MRK RSV株287、継代17(p17)、および3)MRK RSV株287、継代22(p22)について、完全長の配列が作製された。1)MRK RSV株287、継代5(p5)、2)MRK RSV株287、継代10(p10)、3)MRK RSV株287、継代15(p15)および4)MRK RSV株287、継代18(p18)について、(標的の)部分配列を作製した。
QiaAMP ウイルスRNA抽出キット(Qiagen、カタログ番号52904)をメーカー手順書に基づいて使用し、ウイルス培養上清からRNAを抽出した。簡単に説明すると、ウイルス培養上清140μlを溶解バッファーに加え、結合フィルター上にのせた後、洗浄し、RNaseを含まない水60μlで溶出させた。抽出されたRNAサンプルを−20℃で保存した。抽出されたRNAサンプルを鋳型として用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によってゲノムを二本鎖DNA断片の形で増幅した。RT−PCR増幅のために十分な量の材料を得るために、各サンプルにおいて複数回の抽出を行った。
Qiagen OneStep RT−PCRキット(Qiagenカタログ番号210212)を用いて、サンプルのRSVゲノムを二本鎖DNAの形で増幅した。完全長の配列(MRK RSV 287および継代p17およびp22)を決定するために、それぞれ約500塩基対(bp)で隣接する断片とオーバーラップする断片を用いて、1000bp断片の増幅を30回実施した。増幅反応は(プライマー対について)1から30まで付番し、以下に示す表のように実施した。部分長配列決定(MRK RSV287継代p5、p10、p15およびp18)のために、プライマー対2、10、11、13、14、18および29を用いて1000塩基対(bp)断片の増幅を7回実施した。増幅反応は下記表に示すように(プライマー対について)付番し、実施した。
RT−PCR増幅に使用されたプライマーを表2および3に示す。
精製されたRT−PCR産物を、ダイ−ターミネーション配列決定(dye−termination sequencing)のために、GeneWiz(South Plainfield、NJ)に提出した。RT−PCR産物と共に提出したRT−PCR増幅プライマーを用いて配列決定が行われた。それぞれのRT−PCR産物についてフォワードプライマーを使用した配列とリバースプライマーを使用した配列の2つの配列が作製された。
得られたRT−PCR断片の配列をSequencher(商標)配列分析ソフトウェア(GeneCodes、Ann Arbor、Michigan)にインポートし、「コンティグ」構築を実施して配列を構築した。この工程は、60のRT−PCR産物配列(30産物のそれぞれについて2配列)すべてをインポートし、500bpのオーバーラップ領域をスキャフォールドとして使用して完全長の配列を構築することから構成されている。無関係なピークあるいは欠失したピークについて、通常許容されている慣行に基づいて、配列を編集した。p5、p10、p15およびp18の目標とする配列の決定のために、完全長のゲノム構築ではなくむしろ個々の断片構築(即ち断片2、10、11等)を行った。最終的な配列をVectorNTI(商標)にインポートし、配列比較および分析を行った。
起源材料(MRK287)ならびに継代17(p17)および継代22(p22)から完全長のゲノム配列を作製した。その他の継代レベルの標的配列を継代5(p5)、10(p10)、15(p15)および18(p18)から得た。ウイルスRNAを培養上清サンプルから抽出し、逆転者酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって、このRNAからゲノムの二本鎖DNA断片を作製した。RT−PCR産物を精製し、配列を決定した。作製した配列を完全長ウイルスゲノム内に構築した。
MRK RSV株287を既知のRSVの野生型および(表4に記載される)ワクチン株と比較した結果、MRK RSV287は既に弱毒化マーカーとして同定されている点突然変異を含まないことが示された(データ示さず)。MRK RSV株287から15205ヌクレオチドの配列が得られた。継代17および22から末端の5’終末が欠損した15000ヌクレオチドが得られた。MRK RSV株287は既知のRSVサブグループA株と類似し、95%以上の相同性スコアを有していた。
MRK RSV株287およびp17由来のゲノム配列を比較した結果、2つの配列の間において21の配列相違(点突然変異)が存在することが示された。配列相違の概要を表5に示す。
起源MRK RSV株287配列と比較してp17において同定された各点突然変異の遺伝子位置をマッピングし、点突然変異を含む各遺伝子についてアミノ酸配列を作成した。21の点突然変異のうち、1つは5’非翻訳領域(ウイルスL遺伝子に対して3’側)内にあり、20はオープンリーディングフレーム(ウイルス遺伝子)内にある。20のオープンリーディングフレーム(ORF)突然変異体のうち、5つは非表現突然変異であり、残りの15は3つの遺伝子内において11のアミノ酸に影響している。影響された3つのORFはGタンパク質(糖タンパク質)、Fタンパク質(融合タンパク質)およびLタンパク質(巨大タンパク質、RNA依存性RNAポリメラーゼ)をコードしている。1つの非表現突然変異はNS2遺伝子ORF内にあり、4つの非表現突然変異はG遺伝子ORF内にある。配列相違の概要を表6に示す。
p17とp22の配列を比較することによって、両者の配列が同一であることが確認された。ヌクレオチド第14656番において多型レベルで相違する可能性があるが、定量的に確認されていない。
MRK RSV株287継代p5、p10、p15およびp18の選択した遺伝子セグメントから配列を作成した。これらの配列をMRKRSV株287ならびにMRK
RSV株継代17および継代22と比較した。表7は、既に同定されているRSV p17点突然変異の位置においてこれら配列を比較した結果を示す。示されたデータから、非表現NS2突然変異は5回目の継代で生じ、一方G遺伝子突然変異は10回目の継代で生じたことが明らかである。FおよびL遺伝子中の突然変異は継代10から出現し始め、全点突然変異の証拠は継代17に存在する。14656位の多型は依然明白であるが、他の多型の存在には疑問がある。表7は分析した様々な継代レベルの比較の概要を示す。
MRK RSV287継代株の弱毒化
アフリカミドリザル暴露試験
全ての動物を、血清中和抗体価について予めスクリーニングした。抗体価が4以下の動物のみこの試験に使用した。10mg/kgのケタミン筋肉注射によってサルを麻酔し、それぞれ105.5pfuのウイルスに2回暴露させた。鼻内及び気道内接種を組合せてウイルスを投与し、1回の投与あたりそれぞれの部位に1ml投与した。暴露の後、12日間連日それぞれのサルから鼻咽頭スワッブを採取し、気管支肺胞洗浄液を4、5、7および10日目に採取した。鼻咽頭サンプルは、Darconスワッブを用いて中咽頭領域の2、3箇所を穏やかにこすり、0.2Mスクロース、3.8mMKH2PO4、7.2mM K2PO4および4.4mMグルタミン酸ナトリウム(SPG)および0.1%ゼラチンを含むハンクス平衡塩溶液(HBSS)に先端を入れて採取した。気管支肺胞洗浄には、約5〜7mlのHBSSを直接肺内に吸入させ滅菌したフレンチカテーテルおよびシリンジで吸引した。回収したサンプルに1/10量の10xSPGと1/10量の1%ゼラチンを加え、一定量に小分けして直ちに−70℃で凍結保存した。
Hep−2細胞を用いてウイルス力価を測定した。簡単に説明すると、試験サンプルを無菌的に希釈し、サンプルの0.1mlをコンフルエントなHep−2細胞を含む24穴プレートに加えた。37℃で1時間細胞をインキュベートした。インキュベーションの後、PBSで細胞を1度洗浄し、1ウェル当たり0.5mlの1%アガロース含有MEMで被覆し、37℃で4日間インキュベートした。インキュベーションの後、アガロース被覆を取り除き、クリスタルバイオレットで細胞を染色し、ウイルスプラークを計測した。ウイルス力価は組織1グラム当たりのプラーク形成単位(pfu)で表示した。
ウイルス中和アッセイのために、全ての血清を56℃で30分間非働化した。イーグル最小必須培地(EMEM)で試験血清を連続2倍希釈しインキュベートした。野生型A2ウイルスを標的ウイルスとして、103pfu/mlの最終力価までEMEM中に希釈した。同用量の血清とウイルスを混合し、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーションの後、0.1mlのウイルスを24穴プレートの1ウェルに移し、上記のウイルスプラークアッセイを行った。中和力価は、ウイルスプラークを50%以上抑制する最大希釈率で定義した。
1)MRK287 p17はコットンラットおよびアフリカミドリザルモデルにおいて高度に弱毒化されている。
プラーク精製されたp17
プラーク精製
継代17ウイルスの遺伝的に単一な(クローン)集団を得ることを目標として、それぞれのプラークを単離、回収することを目的に、p17ウイルス継代の力価を測定した。1ウェル当たり10個以下のプラークを目標に定めてウイルスの力価を測定した。ウイルスストックの出発力価は1.7x106pfu/mlであり、アッセイに用いるための最終希釈は1:10,000、1:20,000および1:40,000の範囲であった。接種後7日目に、単層上の単一のプラークについて、肉眼および顕微鏡下の両方でプレートを目視した。継代17ウイルスは2種類の異なったプラーク形態、即ち大形態(直径約2mm)と小形態(直径1mm以下)を形成した。最初の単離のために、10の小形態(#1−10)と10の大形態(#11−20)を単離した。滅菌した1mL血清ピペットをアガロースに差込み、単離するプラークの周辺に円を描くことで単離を行った。吸引しながら領域を引き上げて、試料を1mLのRSV維持培地に移し、分散させた後に5x200μLに分注した。プラーク#1と#11を選択して力価検定を行い、Vero組織培養プレート中で直ちに増幅した。分注試料の残りは液体窒素を用いて凍結し、−70℃で保存した。二回目の増幅では、Veroプレート中、1:20、1:200および1:2000でプラークの力価検定を行った。親プラークから第2集団のプラークを作製するために、何枚かのプレートにはアガロースを重層し、また、その後の配列分析のために親プラーク#1と#11のストックを作製するために他のプレートにはRSV維持液体培地を重層した。プラーク#1と#11の二回目のプラークアッセイの中から2つのプラークが単離された。これらのプラークは、プレート上で他のプラークから離れて位置していたこと(したがって、混合集団を得る可能性が減少する)、プラークの形態が親と類似していたことから選択された。プラーク#1−2を選択して力価検定を行い、3回目のプラーク精製において増幅し、1x200μlのプラーク#1−2をプラーク精製と増幅のために同時に力価検定して、親#1−2の追加のストックを作った。#1−2から単離されたプラークを#1−2.1、#1−2.2、#1−2.3、#1−2.4、#1−2.5および#1−2.6と標識した。#1−2.1の分析の後に休止させた単離体において配列分析を行った結果、クローン化された集団であることが示された。
ウイルスストックの培養は既に概要を記した標準手順にしたがった。200μlの初代プラークをVero細胞の12ウェル培養中に増幅した。最初の増幅で得られたストック(pp1)を使用してVeroT150培養に植え付け、回収した試料(pp2)を更に1回増幅して実験に使用するための大量(約1L)の材料を作製した。各スケールアップから得られた#1−2.1のアリコットを用いて配列分析を行った。pp3材料はコットンラット研究のために利用した。
4−8週齢の雌性コットンラット(Sigmodon hispidus)4匹に、イソフルラン麻酔下で、0.1ml容量のウイルス105pfuを0日目に鼻内接種した。肺(左肺)および鼻甲介を接種後4日に取り出し、氷上でSPG含有ハンクス平衡塩溶液(Walkersville、MD)の10倍量の中でホモジナイズした。サンプルを2000rpmで10分間遠心分離して浄化し、分注して直ちに−70℃で凍結保存した。上記ウイルスには(1)MRK287p22、(2)MRK287p17、(3)プラーク精製したMRK287p17、(4)MRK287p15、(5)MRK287p10、(6)MRK287p5、(7)MRK287p3、および(8)RSV
A2野生型が含まれる。鼻および肺ホモジネートをVero細胞中で力価検定し、組織1グラム当たりのプラーク形成単位(pfu)として示した。
MRK287継代17(p17)をクローン化集団("p17 pp")になるまでプラーク精製し、実施例2に記載したように配列決定した。プラーク精製されたウイルス中には、NS1タンパク質をコードする遺伝子内のヌクレオチド162位に該当するRSVゲノム内のヌクレオチド260位において、1つの新たなヌクレオチド突然変異が認められた。これは非表現突然変異(即ち、アミノ酸変異の原因とはならない変異)である。配列番号87は(例えばS2株の)NS1をコードする野生型遺伝子配列に該当する。配列番号89はMRK27とp17内のNS1をコードするヌクレオチド配列に該当する。配列番号90はp17 pp内のNS1をコードするヌクレオチド配列に該当する。表8および9は、MRK287p17およびプラーク精製したもの(p17 pp)における突然変異を比較した結果を示す。配列番号88は(wtS2ウイルス、MRK287、MRK287 p17およびMRK287 p17 ppにおいて同じである)NS1のアミノ酸配列に該当する。
A2野生型を接種されたそれぞれの動物について、コットンラット暴露研究における4匹の動物の平均力価ならびに下側および上側信頼区間(CI)を表10に示す。RSVA2野生型およびMRK287p3のウイルス力価は約4log pfu/g組織であった。MRK287 p5肺サンプルは依然約4logウイルスpfu/gであった。これに対して、継代10およびプラーク精製したMRK287 p17を含むそれ以降の継代ウイルスは、肺および鼻サンプルのいずれにおいても野生型株に比較して2logを超えた減少を示した。更に、これらのデータは、プラーク精製されたMRK287 p17がMRK287 p17と同様に弱毒化されていることを証明している。
Claims (33)
- ウイルスゲノムを含む生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス(RSV)であって、ウイルスゲノムが、G遺伝子にコードされるタンパク質の204位におけるグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の205位におけるグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の211位におけるアラニン、G遺伝子にコードされるタンパク質の213位におけるグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の221位におけるグリシン、G遺伝子にコードされるタンパク質の223位におけるグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の232位におけるグリシン、F遺伝子にコードされるタンパク質の294位におけるリシン、F遺伝子にコードされるタンパク質の486位におけるグリシン、L遺伝子にコードされるタンパク質の148位におけるアラニンおよびL遺伝子にコードされるタンパク質の2054位におけるフェニルアラニンから成る群より選択される1以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードしている前記生弱毒化呼吸器抱合体ウイルス。
- ウイルスゲノムが、F遺伝子にコードされるタンパク質の294位におけるリシン、F遺伝子にコードされるタンパク質の486位におけるグリシン、L遺伝子にコードされるタンパク質の148位におけるアラニンおよびL遺伝子にコードされるタンパク質の2054位におけるフェニルアラニンを含む請求項1に記載の弱毒化RSV。
- FおよびL遺伝子にコードされるタンパク質が、それぞれ配列番号18および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む請求項2に記載の弱毒化RSV。
- FおよびL遺伝子にコードされるタンパク質が、それぞれ配列番号18および配列番号24のアミノ酸配列から成る請求項3に記載の弱毒化RSV。
- ウイルスゲノムが、それぞれ配列番号17および配列番号23のヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるFおよびL遺伝子を含む、請求項1乃至4のいずれかに記載の弱毒化RSV。
- ウイルスゲノムが、それぞれ配列番号17および配列番号23のヌクレオチド配列から成るFおよびL遺伝子を含む請求項5に記載の弱毒化RSV。
- ウイルスゲノムが、G遺伝子にコードされるタンパク質の204位におけるグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の205位におけるグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の211位におけるアラニン、G遺伝子にコードされるタンパク質の213位におけるグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の221位におけるグリシン、G遺伝子にコードされるタンパク質の223位におけるグルタミン酸、G遺伝子にコードされるタンパク質の232位におけるグリシン、F遺伝子にコードされるタンパク質の294位におけるリシン、F遺伝子にコードされるタンパク質の486位におけるグリシン、L遺伝子にコードされるタンパク質の148位におけるアラニンおよびL遺伝子にコードされるタンパク質の2054位におけるフェニルアラニン含むタンパク質をコードしている請求項1に記載の弱毒化RSV。
- G、FおよびL遺伝子にコードされるタンパク質が、それぞれ配列番号12、配列番号18および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む請求項7に記載の弱毒化RSV。
- G、FおよびL遺伝子にコードされるタンパク質が、それぞれ配列番号12、配列番号18および配列番号24のアミノ酸配列から成る請求項8に記載の弱毒化RSV。
- ウイルスゲノムが、NS1遺伝子のヌクレオチド162位におけるアデニン、NS2遺伝子のヌクレオチド327位におけるアデニン、G遺伝子のヌクレオチド630位におけるグアニン、G遺伝子のヌクレオチド654位におけるグアニン、G遺伝子のヌクレオチド666位におけるグアニンおよびG遺伝子のヌクレオチド675位におけるグアニンから成る群より選択される1以上のヌクレオチドを更に含む請求項1乃至9のいずれかに記載の弱毒化RSV。
- ウイルスゲノムが、NS1遺伝子のヌクレオチド162位におけるアデニン、NS2遺伝子のヌクレオチド327位におけるアデニン、G遺伝子のヌクレオチド630位におけるグアニン、G遺伝子のヌクレオチド654位におけるグアニン、G遺伝子のヌクレオチド666位におけるグアニンおよびG遺伝子のヌクレオチド675位におけるグアニンを含む請求項10に記載の弱毒化RSV。
- ウイルスゲノムが、それぞれ配列番号90、配列番号5、配列番号11、配列番号17および配列番号23のヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるNS1、NS2、G、FおよびL遺伝子を含む請求項11に記載の弱毒化RSV。
- ウイルスゲノムが、それぞれ配列番号90、配列番号5、配列番号11、配列番号17および配列番号23のヌクレオチド配列から成るNS1、NS2、G、FおよびL遺伝子を含む請求項12に記載の弱毒化RSV。
- 非弱毒化RSVウイルスゲノムと比較して1以上のヌクレオチド突然変異を含むウイルスゲノムを含む生弱毒化呼吸器合胞体ウイルス(RSV)であって、当該1以上のヌクレオチド突然変異によって1以上のアミノ酸突然変異が起こり、当該1以上のアミノ酸突然変異がG遺伝子にコードされるタンパク質の204位、205位、211位、213位、221位、223位および232位、F遺伝子にコードされるタンパク質の294位および486位、およびL遺伝子にコードされるタンパク質の148位および2054位から成る群より選択されるアミノ酸位に位置している前記生弱毒化呼吸器抱合体ウイルス。
- G遺伝子にコードされるタンパク質の204位におけるアミノ酸突然変異がグルタミン酸への変異であり、G遺伝子にコードされるタンパク質の205位におけるアミノ酸突然変異がグルタミン酸への変異であり、G遺伝子にコードされるタンパク質の211位におけるアミノ酸突然変異がアラニンへの変異であり、G遺伝子にコードされるタンパク質の213位におけるアミノ酸突然変異がグルタミン酸への変異であり、G遺伝子にコードされるタンパク質の221位におけるアミノ酸突然変異がグリシンへの変異であり、G遺伝子にコードされるタンパク質の223位におけるアミノ酸突然変異がグルタミン酸への変異であり、G遺伝子にコードされるタンパク質の232位におけるアミノ酸突然変異がグリシンへの変異であり、F遺伝子にコードされるタンパク質の294位におけるアミノ酸突然変異がリシンへの変異であり、F遺伝子にコードされるタンパク質の486位におけるアミノ酸突然変異がグリシンへの変異であり、L遺伝子にコードされるタンパク質の148位におけるアミノ酸突然変異がアラニンへの変異であり、L遺伝子にコードされるタンパク質の2054位におけるアミノ酸突然変異がフェニルアラニンへの変異である請求項14に記載の弱毒化RSV。
- G遺伝子にコードされるタンパク質の204位におけるアミノ酸突然変異がLys204Gluであり、G遺伝子にコードされるタンパク質の205位におけるアミノ酸突然変異がLys205Gluであり、G遺伝子にコードされるタンパク質の211位におけるアミノ酸突然変異がThr211Alaであり、G遺伝子にコードされるタンパク質の213位におけるアミノ酸突然変異がLys213Gluであり、G遺伝子にコードされるタンパク質の221位におけるアミノ酸突然変異がLys221Glyであり、G遺伝子にコードされるタンパク質の223位におけるアミノ酸突然変異がLys223Gluであり、G遺伝子にコードされるタンパク質の232位におけるアミノ酸突然変異がGlu232Glyであり、F遺伝子にコードされるタンパク質の294位におけるアミノ酸突然変異がGlu294Lysであり、F遺伝子にコードされるタンパク質の486位におけるアミノ酸突然変異がAsp486Glyであり、L遺伝子にコードされるタンパク質の148位におけるアミノ酸突然変異がAsp148Alaであり、L遺伝子にコードされるタンパク質の2054位におけるアミノ酸突然変異がLeu2054Pheである請求項15に記載の弱毒化RSV。
- 前記1以上のアミノ酸突然変異が、F遺伝子にコードされるタンパク質のGlu294Lys、F遺伝子にコードされるタンパク質のAsp486Gly、L遺伝子にコードされるタンパク質のAsp148AlaおよびL遺伝子にコードされるタンパク質のLeu2054Pheを含む請求項16に記載の弱毒化RSV。
- 前記1以上のアミノ酸突然変異が、G遺伝子にコードされるタンパク質のLys204Glu、G遺伝子にコードされるタンパク質のLys205Glu、G遺伝子にコードされるタンパク質のThr211Ala、G遺伝子にコードされるタンパク質Lys213Glu、G遺伝子にコードされるタンパク質のLys221Gly、G遺伝子にコードされるタンパク質のLys223Glu、G遺伝子にコードされるタンパク質のGlu232Gly、F遺伝子にコードされるタンパク質のGlu294Lys、F遺伝子にコードされるタンパク質のAsp486Gly、L遺伝子にコードされるタンパク質のAsp148AlaおよびL遺伝子にコードされるタンパク質のLeu2054Pheを含む請求項17に記載の弱毒化RSV。
- 1以上のアミノ酸突然変異の原因となる前記1以上のヌクレオチド突然変異が、G遺伝子の610位、613位、631位、637位、639位、661位、662位、667位、668位、695位および696位、F遺伝子の880位および1457位およびL遺伝子の443位および6162位から成る群より選択されるヌクレオチド位に位置する請求項4に記載の弱毒化RSV。
- G遺伝子のヌクレオチド610位におけるヌクレオチド突然変異がA610Gであり、G遺伝子のヌクレオチド613位におけるヌクレオチド突然変異がA613Gであり、G遺伝子のヌクレオチド631位におけるヌクレオチド突然変異がA631Gであり、G遺伝子のヌクレオチド637位におけるヌクレオチド突然変異がA637Gであり、G遺伝子のヌクレオチド639位におけるヌクレオチド突然変異がA639Gであり、G遺伝子のヌクレオチド661位におけるヌクレオチド突然変異がA661Gであり、G遺伝子のヌクレオチド662位におけるヌクレオチド突然変異がA662Gであり、G遺伝子のヌクレオチド667位におけるヌクレオチド突然変異がA667Gであり、G遺伝子のヌクレオチド668位におけるヌクレオチド突然変異がA668Gであり、G遺伝子のヌクレオチド695位におけるヌクレオチド突然変異がA695Gであり、G遺伝子のヌクレオチド696位におけるヌクレオチド突然変異がA696Gであり、F遺伝子のヌクレオチド880位におけるヌクレオチド突然変異がG880Aであり、F遺伝子のヌクレオチド1457位におけるヌクレオチド突然変異がA1457Gであり、L遺伝子のヌクレオチド443位におけるヌクレオチド突然変異がA443Cであり、L遺伝子のヌクレオチド6162位におけるヌクレオチド突然変異がG6162Tである請求項19に記載の弱毒化RSV。
- ウイルスゲノムが、NS1遺伝子の162位、NS2遺伝子の327位、G遺伝子の630位、G遺伝子の654位、G遺伝子の666位およびG遺伝子の675位から成る群より選択されるヌクレオチド位における1以上の非表現ヌクレオチド突然変異を更に含む請求項20に記載の弱毒化RSV。
- NS1遺伝子のヌクレオチド162位におけるヌクレオチド突然変異がT162Aであり、NS2遺伝子のヌクレオチド327位におけるヌクレオチド突然変異がG327Aであり、G遺伝子のヌクレオチド630位におけるヌクレオチド突然変異がA630Gであり、G遺伝子のヌクレオチド654位におけるヌクレオチド突然変異がA654Gであり、G遺伝子のヌクレオチド666位におけるヌクレオチド突然変異がA666Gであり、G遺伝子のヌクレオチド675位におけるヌクレオチド突然変異がA675Gである請求項22に記載の弱毒化RSV。
- ウイルスゲノムが、NS1遺伝子のヌクレオチド162位におけるT167A、NS2遺伝子のヌクレオチド327位におけるG327A、G遺伝子のヌクレオチド610位におけるA610G、G遺伝子のヌクレオチド613位におけるA613G、G遺伝子のヌクレオチド630位におけるA630G、G遺伝子のヌクレオチド631位におけるA631G、G遺伝子のヌクレオチド637位におけるA637G、G遺伝子のヌクレオチド639位におけるA639G、G遺伝子のヌクレオチド654位におけるA654G、G遺伝子のヌクレオチド661位におけるA661G、G遺伝子のヌクレオチド662位におけるA662G、G遺伝子のヌクレオチド666位におけるA666G、G遺伝子のヌクレオチド667位におけるA667G、G遺伝子のヌクレオチド668位におけるA668G、G遺伝子のヌクレオチド675位におけるA675G、G遺伝子のヌクレオチド695位におけるA695G、G遺伝子のヌクレオチド696位におけるA696G、F遺伝子のヌクレオチド880位におけるG880A、F遺伝子のヌクレオチド1457位におけるA1457G、L遺伝子のヌクレオチド443位におけるA443CおよびL遺伝子のヌクレオチド6162位におけるG6162Tのヌクレオチド突然変異を含む請求項22に記載の弱毒化RSV。
- 請求項1乃至23のいずれかに記載の生弱毒化RSVおよび医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
- 請求項1乃至23のいずれかに記載の生弱毒化RSVをコードするゲノム配列またはアンチゲノム配列を含む核酸分子。
- 発現ベクターである請求項25に記載の核酸分子。
- 請求項26の発現ベクターを含む組み換え細胞。
- 請求項1乃至23のいずれかに記載の弱毒化RSVを含む弱毒化呼吸器合胞体ウイルス(RSV)個体群。
- 請求項28に記載の生弱毒化RSV個体群および医薬上許容される担体を含む免疫原性組成物。
- 対象の体内においてRSV感染に対して防御免疫応答を誘導する方法であって、当該対象に免疫学上有効な量の(a)請求項1乃至23のいずれかに記載の弱毒化RSV、(b)請求項28に記載の弱毒化RSV個体群、(c)請求項24の記載の免疫原性組成物または(d)請求項29に記載の免疫原性組成物のうちの1つまたは複数を投与する工程を含む前記方法。
- 対象がヒトである請求項30に記載の方法。
- 患者体内においてRSV感染に対する防御免疫応答を誘導するための医薬の製造における免疫学上有効な量の(a)請求項1乃至23のいずれかに記載の弱毒化RSV、(b)請求項28に記載の弱毒化RSV個体群、(c)請求項24の記載の免疫原性組成物または(d)請求項29に記載の免疫原性組成物のうちの1つまたは複数の使用。
- 患者がヒトである請求項32に記載の使用。
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