CN102159710B - 使用染色体非整合型病毒载体制造经初始化的细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供用于简便且有效地制造染色体上未整合外源基因的ES样细胞的载体。发现了使用染色体非整合型病毒载体从体细胞制作ES样细胞的方法。上述制作的ES样细胞的染色体上未整合外源基因，因而不仅适合用于利用本细胞进行的试验、研究，还可以在疾病的治疗中避免免疫排斥问题和伦理层面的问题。

Description

使用染色体非整合型病毒载体制造经初始化的细胞的方法
技术领域
本发明涉及经初始化的细胞的制造方法、通过该方法制造的细胞、以及该方法中使用的组合物等。特别是，本发明涉及由分化的体细胞制造多能干细胞的方法、以及通过该方法制备的多能干细胞。
背景技术
胚胎干细胞(ES细胞)是从哺乳动物胚泡的内部细胞团建立的干细胞，其在保持了分化成所有细胞的能力(分化多能性)的同时，还能够无限增殖。由于该特性，将从ES细胞大量诱导、制备的心肌细胞、神经细胞移植给心肌梗塞、帕金森病患者来进行治疗的干细胞疗法备受期待。此外，其作为病理、药理基础研究或药物研发的开发工具的应用也令人期待。但是，该ES细胞存在利用和牺牲人受精卵这样的伦理问题。此外，还存在有限的供体受精卵的组织相容性抗原与患者不一致这样的免疫排斥问题。另一方面，生物体的各组织中存在神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等组织干细胞。组织干细胞不使用受精卵，因此少有或者没有伦理问题；此外，由于可以使用患者自身的细胞，因而可以避免免疫排斥反应。但是，组织干细胞的性质并不一定清楚，因而分离困难，且数量极少。而且，组织干细胞的增殖能力、分化能力有限，远不能与ES细胞相比。如果能够采取某种手段将组织干细胞、分化细胞等体细胞转变为与具有高增殖能力和分化多能性的ES细胞类似的细胞(称为ES样细胞)，对临床应用等而言，这种ES样细胞将成为理想的干细胞。
具体地，采集哺乳动物的细胞、特别是患者的体细胞(皮肤、胃、肺等组织、血液细胞等)，用核初始化因子(nuclear reprogramming factors)(诱导核初始化(nuclear reprogramming)的因子)刺激培养的这些细胞，制作ES样细胞(也称“人工多能干细胞”、“诱导多能干细胞(iPS细胞)”或“胚胎干细胞样细胞”)。可以期待将该制作的ES样细胞直接或以细胞库的形式储备而作为于细胞应用于临床、或者用于包括药理、病理在内的基础研究(专利文献1)。此外，还可以使用从患者建立的人工多能干细胞进行药效确认实验。
核初始化因子(nuclear reprogramming factors)包括例如Oct基因、Klf基因、Myc基因、Sox基因、Nanog基因、Lin28基因、TERT基因以及SV40LargeT基因等(专利文献2、非专利文献1～7)。
例如，已知可以使用下述4种重组病毒载体，从上述体细胞制作上述ES样细胞(非专利文献1～7)。当临床应用上述制作的ES样细胞时，有可能能够避免免疫排斥问题、伦理层面问题。
(1)包含Oct3/4基因的γ逆转录病毒载体或慢病毒载体(以下将其合称“逆转录病毒载体”)
(2)包含Klf4基因的逆转录病毒载体
(3)包含c-Myc基因的逆转录病毒载体
(4)包含Sox2基因的逆转录病毒载体
上述专利文献、非专利文献如下。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2005/080598
专利文献2：国际公开WO2007/069666
非专利文献
非专利文献1：Cell.2007 Nov 30；131(5)：861-872
非专利文献2：Science.2007Dec 21；318(5858)：1917-1920
非专利文献3：Nat Biotechnol.2008Jan；26(1)：101-106
非专利文献4：Science.2007Dec 21；318(5858)：1920-1923
非专利文献5：Nature.2008Jan 10；451(7175)：141-146
非专利文献6：PNAS.2008Feb 26；105(8)：2883-2888
非专利文献7：Cell.2008Apr 18；133(2)：250-264
发明内容
发明所要解决的问题
但是，就使用上述逆转录病毒载体制作的ES样细胞而言，必须注意因载体对宿主染色体的整合而引起染色体的结构性改变。存在导致无法预料的染色体功能异常的可能性，特别是存在癌细胞化的隐患。其原因是逆转录病毒载体的使用。因为在使用逆转录病毒载体的情况下，由于载体对导入细胞的染色体随机整合，有使染色体内的癌抑制基因失活、或者使与插入位点相邻的参与癌化的基因活化的危险性(《实验医学》Vol.26No.5(增刊)：pp.35-40，2008)。此外，当其整合至其它基因或对该基因的表达进行修饰的基因时，同样存在转变为性质无法预期的细胞的可能性。而且，最近认为染色体的所谓非编码区域也担负着一定的染色体功能，因此还必须要考虑逆转录病毒载体整合到非编码区域所带来的不期望的结果。再者，在载体插入参与多能干细胞的分化的基因的情况下，对于使用通过分化干细胞而得到的细胞进行的治疗或研究，也存在因不能进行分化而无法获得细胞、因而无法实施的可能性。这样，在基于传统方法的细胞初始化中，除了使用所得ES样细胞进行治疗存在安全性问题之外，在使用由患者建立的ES样细胞的药效、病理学分析中，还必须考虑因染色体内外源基因的插入而引起的、原本在细胞中发挥功能的基因的失活或活化所造成的影响，而这样的分析成为极其困难的操作。此外，在使用逆转录病毒载体的情况下，即使是同一研究者，也会由于批次不同，而存在无法保证人工多能干细胞的均一性的问题；或者，不同制作者即使按相同规程进行制作，所建立的ES样细胞中逆转录病毒载体会插入到染色体内的不同位置，这也会存在无法保证人工多能干细胞的均一性的问题。
本发明旨在从根本上解决诸如上述的问题，提供简便且有效地制造染色体上未整合外源基因的ES样细胞、即非染色体重组ES细胞的方法。此外，本发明提供用于在该方法中对诱导初始化有用的基因导入组合物。此外，本发明提供通过本发明的方法获得的多能干细胞。
解决问题的方法
本发明人发现：通过使用染色体非整合型载体，能够制造染色体上未整合外源基因的多能干细胞。
即，本发明涉及使用染色体非整合型载体的多能干细胞的制造方法、以及采用本发明的方法制作的ES样细胞等，更具体地，涉及各项权利要求中记载的发明。而且，引用同一权利要求的权利要求所记载的发明中的两者或更多的任意组合所构成的发明，也是本说明书中所意图的发明。即，本发明涉及：
〔1〕一种用于在细胞的初始化中导入基因的方法，该方法包括：使用染色体非整合型病毒载体将该基因导入细胞；
〔2〕〔1〕所述的方法，其中，所述初始化是诱导多能干细胞；
〔3〕〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述染色体非整合型病毒载体是RNA病毒载体；
〔4〕〔3〕所述的方法，其中，所述RNA病毒载体是负链RNA病毒载体；
〔5〕〔4〕所述的方法，其中，所述负链RNA病毒载体是副粘病毒载体；
〔6〕〔5〕所述的方法，其中，所述副粘病毒载体是仙台病毒载体；
〔7〕〔1〕～〔6〕中任一项所述的方法，其中，该基因选自下述的(1)～(8)：
(1)Oct基因
(2)Klf基因
(3)Myc基因
(4)Sox基因
(5)Nanog基因
(6)Lin28基因
(7)SV40LargeT抗原基因
(8)TERT基因；
〔8〕用于细胞的初始化中的基因导入的组合物，其包含染色体非整合型病毒载体；
〔9〕〔8〕所述的组合物，其中，所述初始化是诱导多能干细胞；
〔10〕〔8〕或〔9〕所述的组合物，其中，所述染色体非整合型病毒载体是RNA病毒载体；
〔11〕〔10〕所述的组合物，其中，所述RNA病毒载体是负链RNA病毒载体；
〔12〕〔11〕所述的组合物，其中，所述负链RNA病毒载体是副粘病毒载体；
〔13〕〔12〕所述的组合物，其中，所述副粘病毒载体是仙台病毒载体；
〔14〕〔8〕～〔13〕中任一项所述的组合物，其中，该基因选自下述的(1)～(8)：
(1)Oct基因
(2)Klf基因
(3)Myc基因
(4)Sox基因
(5)Nanog基因
(6)Lin28基因
(7)SV40LargeT抗原基因
(8)TERT基因。
此外，本发明涉及：
〔1〕制造经初始化的细胞的方法，该方法包括：使至少一种染色体非整合型病毒载体与经分化的细胞接触的步骤；
〔2〕〔1〕所述的方法，其中，经初始化的细胞是人工多能干细胞；
〔3〕〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，该载体是携带至少一种编码核初始化因子的基因的至少一种染色体非整合型病毒载体；
〔4〕〔3〕所述的方法，其中，该基因选自下述的(1)～(8)：
(1)Oct基因
(2)Klf基因
(3)Myc基因
(4)Sox基因
(5)Nanog基因
(6)Lin28基因
(7)SV40LargeT抗原基因
(8)TERT基因；
〔5〕〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，组合载体，使得细胞内内源性或外源性表达至少Oct基因、Klf基因和Sox基因这3种基因、或者至少Oct基因、Sox基因、Nanog基因、Lin28基因这4种基因。
〔6〕〔5〕所述的方法，其中，组合载体，使得细胞内内源性或外源性表达至少Oct基因、Klf基因、Sox基因和Myc基因这4种基因；
〔7〕〔1〕～〔6〕中任一项所述的方法，其中，所述染色体非整合型病毒载体是RNA病毒载体；
〔8〕〔7〕所述的方法，其中，所述RNA病毒载体是负链RNA病毒载体；
〔9〕〔8〕所述的方法，其中，所述负链RNA病毒载体是副粘病毒载体；
〔10〕〔9〕所述的方法，其中，所述副粘病毒载体是仙台病毒载体；
〔11〕制造经分化的细胞的方法，该方法包括使通过〔1〕～〔10〕中任一项所述的方法制造的细胞分化的步骤；
〔12〕通过〔1〕～〔11〕中任一项所述的方法制造的细胞；
〔13〕〔12〕所述的细胞，其中，载体未通过初始化步骤整合至染色体中；
〔14〕用于在细胞的初始化中使用的组合物，其包含染色体非整合型病毒载体作为表达载体；
〔15〕〔14〕所述的组合物，其中，初始化是从经分化的细胞诱导多能干细胞；
〔16〕〔14〕或〔15〕所述的组合物，其中，所述染色体非整合型病毒载体是RNA病毒载体；
〔17〕〔16〕所述的组合物，其中，所述RNA病毒载体是负链RNA病毒载体；
〔18〕〔17〕所述的组合物，其中，所述负链RNA病毒载体是副粘病毒载体；
〔19〕〔18〕所述的组合物，其中，所述副粘病毒载体是仙台病毒载体；
〔20〕〔14〕～〔19〕中任一项所述的组合物，其中，载体至少携带编码选自下述的(1)～(8)的初始化因子的基因：
(1)Oct基因
(2)Klf基因
(3)Myc基因
(4)Sox基因
(5)Nanog基因
(6)Lin28基因
(7)SV40LargeT抗原基因
(8)TERT基因；
〔21〕染色体非整合型病毒载体在制造用于经分化的细胞的初始化的药物中的用途；
〔22〕〔21〕所述的用途，其中，所述初始化是经分化的细胞诱导多能干细胞；
〔23〕〔21〕或〔22〕所述的用途，其中，所述染色体非整合型病毒载体是RNA病毒载体；
〔24〕〔23〕所述的用途，其中，所述RNA病毒载体是负链RNA病毒载体；
〔25〕〔24〕所述的用途，其中，所述负链RNA病毒载体是副粘病毒载体；
〔26〕〔25〕所述的用途，其中，所述副粘病毒载体是仙台病毒载体；
〔27〕〔21〕～〔26〕中任一项所述的用途，其中，所述载体至少携带编码选自下述的(1)～(8)的初始化因子的基因：
(1)Oct基因
(2)Klf基因
(3)Myc基因
(4)Sox基因
(5)Nanog基因
(6)Lin28基因
(7)SV40LargeT抗原基因
(8)TERT基因。
此外，本发明涉及：
〔1〕携带选自下述的(1)～(8)的基因的染色体非整合型病毒载体：
(1)Oct基因
(2)Klf基因
(3)Myc基因
(4)Sox基因
(5)Nanog基因
(6)Lin28基因
(7)SV40LargeT抗原基因
(8)TERT基因；
〔2〕〔1〕所述的载体，其中，所述染色体非整合型病毒载体是RNA病毒载体；
〔3〕〔2〕所述的载体，其中，所述RNA病毒载体是负链RNA病毒载体；
〔4〕〔3〕所述的载体，其中，所述负链RNA病毒载体是副粘病毒载体；
〔5〕〔4〕所述的载体，其中，所述副粘病毒载体是仙台病毒载体。
而且，本说明书中记载的任意发明要素及其任意组合，均是本说明书所意图的。此外，在这些发明，除本说明书所述的任意要素或其任意组合以外的发明，也是本说明书所意图的。此外，对于本发明，说明书中中记载的某特定实施方式不仅公开其本身，还公开包含该实施方式的更上位的本说明书中公开的发明中的除该实施方式以外的发明。
发明的效果
如以上说明的，通过本发明的方法制作的细胞的染色体上未整合外源基因，因而，不仅适合于利用该细胞的试验、研究，而且在疾病的治疗中也可以期待能够避免免疫排斥问题、伦理层面问题，进而避免基于遗传毒性的癌化的危险性、染色体功能变化引起的不可预期的副作用、以及细胞性质的变化。而且，根据本发明的方法，能够从包括成人皮肤细胞在内的希望的细胞种类以显著高于使用逆转录病毒的传统方法的效率(例如约10倍)诱导多能干细胞。而且，就使用逆转录病毒的传统方法而言，即使采用完全相同的规程来制作细胞，所建立的ES样细胞中逆转录病毒载体仍会插入到染色体内的不同位置，因而无法保证人工多能干细胞的均一性；与此相对，采用本发明的方法，载体不插入到染色体上，因而能够稳定地制作遗传上更均一的细胞。此外，逆转录病毒通常具有强的向性，例如，对于目前的常规初始化方法中使用的同向性(ecotropic)逆转录病毒载体而言，存在或外部导入有逆转录病毒受体是初始化的先决条件，在没有表达逆转录病毒受体的动物物种中建立人工多能干细胞是困难的。与此相对，本发明的方法可以应用于广泛的动物物种(全体哺乳动物)，例如应用于猴、猪等作为疾病模型动物需求大的生物物种。
附图说明
[图1]显示通过本发明的方法获得的细胞的形态的照片。上图的中间和右边的图显示载体导入后23日的集落。下图显示传代后的集落。
[图2]通过本发明的方法获得的细胞的碱性磷酸酶染色结果。
[图3]显示通过本发明的方法获得的细胞的细胞内特定基因的表达量的结果。显示出了使用从碱性磷酸酶阳性集落群(ALP(+))制备的mRNA(图(a))和从单一集落制备的mRNA(图(b))的RT-PCR的结果。在这些细胞中，不仅确认了Oct3/4、Sox2、Klf4、和c-Myc的表达，而且还观察到了ES细胞标志物Nanog的表达(图(a)和(b))。此外，在从单一克隆传代的细胞中，确认了hTERT的表达，这是显示无限增殖能力的端粒末端转移酶活化的指标(图(b))。BJ：未导入载体的细胞。NCCIT：胚胎癌细胞(阳性对照)。对照是无模板DNA的阴性对照。
[图4]显示通过本发明的方法获得的细胞的ES标识物的表达的结果。BJ：未导入载体的细胞。NCCIT：胚胎性癌细胞(阳性对照)。对照是无模板DNA的阴性对照。
[图5]对通过本发明的方法获得的细胞的端粒末端转移酶活性进行检测的结果。
[图6]显示通过本发明的方法获得的细胞的多分化能力的结果。示出了胚状体形成实验的结果。
[图7]显示通过本发明的方法获得的细胞的多分化能力(体外)的结果。显示利用本发明的载体从人BJ细胞诱导的无病毒的诱导多能性干(iPS)细胞在体外向中胚层(心肌、血细胞)、外胚层(TH阳性多巴胺能神经元)、内胚层(Sox17阳性细胞和PDX1阳性胰β细胞)来源的有用细胞的分化。
[图8]显示通过本发明的方法获得的细胞的多分化能力(体内)的结果。将利用本发明的载体从人BJ细胞诱导得到的无病毒的iPS细胞HNLs、HNL1施用于免疫缺陷小鼠的皮下而制作的胚胎瘤。a：各种分化组织。b：软骨和分泌细胞(黑箭头)。c：骨组织d：从分泌组织(黑箭头)和神经上皮分化而得的视网膜样组织(白箭头)。e：变移上皮组织(中)。f：硬骨和骨髓样组织(白箭头)。g：胃肠道样组织。h：球形组织。i：心肌样组织。
[图9]显示通过本发明的方法获得的细胞的实验胚胎学的结果。a：分别针对Oct3/4和Nanog采用亚硫酸氢盐测序法分析了人ES细胞特异性启动子区域的活化状态。活化的去甲基化区域用白圈表示，甲基化区域用黑圈表示。针对亲本株人新生儿周皮细胞BJ来源的SeV-iPS克隆HNL1和HNLs、人成人皮肤细胞HDF来源的SeV-iPS克隆7H5进行了分析。所有SeV-iPS细胞在两个区域中均确认了相应启动子的活化。b：对于利用SeV从人BJ细胞诱导得到的无病毒iPS细胞HNL1用微阵列进行了基因表达分析，与作为亲本株的BJ细胞和人ES细胞H9株进行了比较。以r表示相关系数。其结果是，与已经报导的通过逆转录病毒诱导的人iPS细胞HDF-iPS相比，无外源基因的SeV-iPS显示出更接近人ES细胞H9株的表达谱(profile)(相关系数r＝0.9789)。
[图10]通过细胞增殖除去导入的外源基因和仙台病毒(SeV)载体。这是显示导入的外源基因和仙台病毒(SeV)载体随着细胞增殖被稀释/除去的图。(A)对于来源于新生儿细胞(BJ)或成人细胞(HDF)的SeV-iPS细胞(使用18+c-Myc的BJ来源克隆：4BJ1，B1；HDF来源克隆：使用7H5、HNL-c-Myc的BJ来源克隆：HNLs，HNL1～6，HNLp)，通过使用识别载体部分的序列的引物进行RT-PCR随时间测定了其中导入的外源基因的表达减少(P表示传代数)。随着传代的进行，确认了4个导入初始化因子减少为3个、2个的现象。观察到这样的倾向：当在18+位导入外源基因时，c-Myc最先被除去；而当在HNL位导入c-Myc时，c-Myc保留到最后。这提示，通过4个载体之间的组合，具有一定的复制优势。此外，用HNL-c-Myc诱导的克隆HNLs和HNL1中完全不存在外源基因。(B)iPS细胞内的SeV基因组的随时间性减少。像A中那样，采用定量RT-PCR测定了各iPS细胞克隆中SeV基因组的随时间性减少。其结果，通过定量PCR也确认了SeV基因组随传代而减少的事实，且明确了在HNL1和HNLs克隆中SeV基因组的消失。(C)iPS细胞内的SeV蛋白质的消失。利用抗SeV抗体进行Western印迹同样确认了A、B中已确认的SeV来源基因在HNL1和HNLs中的消失，而且可以确认不仅基因组消失，SeV来源蛋白质也消失了。
[图11]利用抗病毒蛋白质抗体回收病毒载体阴性细胞集团。(上图)显示iPS集落内的病毒载体稀释。利用抗HN抗体进行的针对SeV-iPS细胞集落的染色提示：集落内SeV阳性细胞与阴性细胞混合存在，如左模式图所示那样，通过选择病毒粒子少的部分来回收阴性群体是可行的(P：传代数)。(下图)实际上，可以以SeV感染细胞表面展现的HN抗原为指标，利用抗HN抗体来除去SeV阳性细胞。使SeV-iPS细胞群体(残存c-Myc/SeV的株：HNLp4亲本(parent))与抗HN抗体反应，并使它们结合于IMag(BD)磁珠，回收其阴性级分，通过RT-PCR确认为SeV阴性(HNL4p-)。此外，对SeV阳性群体进行浓缩也是可行的(HNL4p+)。
[图12]新温度敏感株(TS)的特性。实施例1中使用的TS株在37℃的细胞毒性少，而即使从35℃变化到39℃，所加载的GFP蛋白的表达的变化也比较少(对照TS/ΔF)。但是，对于新构建的TS7(Y942H，L1361C，L1558I)，在38℃以上未观察到GFP的表达；TS13(P2，L1558I)中37℃的表达低于35℃；TS15(P2，L1361C，L1558I)中在37℃基本未见GFP的表达。
[图13]利用温度敏感株TS7，TS13，TS15/ΔF/SeV进行的人iPS细胞诱导及病毒的除去。A.使在TS7，TS13或TS15的HNL位(HN基因与L基因之间)上携带c-Myc而得的ΔF/TS/SeV、与在TS中携带Oct3/4，Sox2，Klf4而得的ΔF/TS/SeV同时感染新生儿周皮细胞BJ，诱导了人iPS细胞。分离得到的iPS细胞，A.RT-PCR的结果显示，其半数以上变成无外源基因；B.在对无外源基因的iPS细胞克隆中的SeV蛋白质进行确认时，显示即使在蛋白水平也完全无病毒。(4BJ1和B1：SeV表达iPS细胞；对照：SeV感染LLC-MK2细胞)。
[图14]利用温度敏感株TS7、TS13、TS15/ΔF/SeV诱导的人iPS细胞的ES标识物表达。针对在图13所示的实验中已确认无外源基因、无病毒的iPS细胞克隆，通过RT-PCR确认了ES标识物的表达。在全部的无病毒的iPS细胞中均确认了所考察的全部ES标识物的表达。
[图15]利用其它SeV载体、初始化因子诱导的SeV-iPS细胞。(A)在Lm(Y1214F)ΔF/SeV(与实施例1中所用的TS ΔF/SeV不同的载体骨架)中加载Oct3/4，Sox2，Oct4，Nanog，进行了iPS细胞诱导，得到了碱性磷酸酶(ALP)阳性的ES样细胞集落。(B)利用Thomson的4个因子(Oct3/4，Sox2，Nanog，Lin28ΔF/TS/SeV)进行iPS细胞诱导。除了Yamanaka的4个因子(Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc)(左图)以外，利用Thomson的4个因子(Oct3/4，Sox2，Nanog，Lin28ΔF/TS/SeV)(右图)也诱导出了iPS细胞。
发明的具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行具体说明。
本发明提供：使用染色体非整合型病毒载体诱导经分化的细胞的初始化的方法、特别是从体细胞制造多能干细胞的方法。该方法包括使例如携带编码希望导入的核初始化因子(nuclear reprogramming factor(s))的基因的染色体非整合型病毒载体与体细胞等经分化的细胞相接触的步骤。更具体地，本发明提供用于在细胞的初始化中导入基因的方法，该方法是使用染色体非整合型病毒载体将该基因导入有需要的细胞；本发明还提供用于该方法的包含染色体非整合型病毒载体的组合物。本发明中，多能干细胞是指：由动物的胚泡期的胚的内部细胞团产生的干细胞或具有与之相似的表现型的细胞。具体地，本发明中诱导的多能干细胞是表达作为ES样细胞的指标的碱性磷酸酶的细胞。此外优选地，多能干细胞通过培养形成由相对于细胞质的细胞核的比率高的细胞构成的扁平集落。培养可以是与适宜的饲养细胞(feeder)一起进行。此外，在数周内停止增殖的MEF等培养细胞相对，多能干细胞能够长期传代，这根据其经过传代例如每3日一次传代进行15次以上、优选20次以上、25次以上、30次以上、35次以上、或40次以上之后亦不失去增殖性的事实来加以确证。此外，多能干细胞优选表达内源性的Oct3/4或Nanog，更优选表达这两者。此外，多能干细胞优选表达TERT，显示端粒末端转移酶活性(合成端粒重复序列的活性)。此外，多能干细胞优选具有分化成三胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的能力(例如在畸胎瘤形成和/或胚状体形成中)。更优选地，多能干细胞通过移植至胚泡生成种系嵌合体。能够种系传递(Germline transmission)的多能干细胞是指：具有种系嵌合能力(germline-competent)的多能干细胞。这些表现型的确认可以通过公知的方法来实施(WO2007/69666；Ichisaka T等，Nature 448(7151)：313-7，2007)。
此外，本发明中“已分化”是指：例如，分化程度高于多能干细胞，包括尚保持着分化成多种细胞谱系的能力的状态(例如体性干细胞等)、以及终末分化的状态。经分化的细胞是指：来源于多能干细胞的(多能干细胞以外的)细胞。经分化的细胞可以是例如不具有分化成三胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的能力的细胞。这样的细胞如果不经过初始化(reprogramming)，就不具有形成三胚层的能力。此外，经分化的细胞可以是例如不能生成自身所属的胚层类型以外的细胞的细胞。经分化的细胞可以是体细胞，例如可以是生殖细胞以外的细胞。
本发明中初始化(reprogramming)是指：使某细胞的分化状态成为较之未分化的状态，包括例如经分化的细胞脱分化，例如从不具有分化多能性的细胞诱导具有分化多能性的细胞、例如多能干细胞。此外，本发明中脱分化是指：使某细胞成为更不成熟的(例如未分化的)状态。脱分化也可以是指：某细胞返回其分化的最初状态或中途状态。此外，脱分化也可以是指从不能生成自身所属的胚层类型以外的细胞的细胞变成能够分化成其它胚层的细胞的状态。脱分化包括例如，不具有三胚层分化能力的细胞获得三胚层分化能力。此外，脱分化包括多能干细胞的生成。
此外，本发明中，体细胞是指：例如多能干细胞以外的细胞。体细胞包括例如，构成多细胞生物的细胞中的多能干细胞以外的细胞、及其培养细胞。体细胞包括例如，体性干细胞和终末分化的细胞。
本发明中，病毒载体是具有相应的病毒来源的基因组核酸，并能够通过在该核酸中整合导入基因而表达该基因的载体。此外，本说明书中，用于制造多能干细胞的染色体非整合型病毒载体是指：来源于病毒的、能够将基因导入靶细胞的病毒载体，而且其是不存在导入的基因整合至宿主染色体(核来源染色体)的危险性的携带体(carrier)。通过构建携带外源基因的染色体非整合型病毒载体，能够得到本发明中使用的重组非整合型病毒载体。此外，本发明中，病毒载体除了包括感染病毒粒子之外，还包括病毒核心、病毒基因组与病毒蛋白质的复合体、或包含非感染性病毒粒子等的复合体，它们是具有导入细胞中而表达加载的基因的能力的复合体。例如，在RNA病毒中，由病毒基因组及与之结合的病毒蛋白质构成的核糖核蛋白(病毒的核心部分)能够在导入细胞后向细胞中导入表达基因(WO00/70055)。针对细胞的导入可以使用适当的转染试剂等来进行。本发明中的病毒载体也包括这样的核糖核蛋白(RNP)。
本发明中，“不存在整合至宿主染色体的危险性”，是指在导入病毒载体时，病毒载体向宿主染色体整合的频率充分地低。优选地，向宿主染色体整合的频率例如，在以10PFU/细胞感染人纤维肉瘤来源细胞株HT1080(ATCC CCL121)时为5×10-4以下、更优选10-4以下、更优选10-5以下、更优选10-6以下、更优选10-7以下。本发明中使用的非整合型病毒载体特别优选为RNA病毒。本发明中，RNA病毒是指：具有RNA基因组、且在生命周期中不具有DNA阶段的病毒。本发明中，RNA病毒不具有逆转录酶(即，不包括逆转录病毒)。即，在病毒增殖中，病毒基因组不经由DNA，而通过RNA依赖性RNA聚合酶被复制。RNA病毒不具有DNA阶段，因此，通过使用RNA病毒载体，能够将针对宿主染色体的整合风险抑制在最小限度。RNA病毒包括单链RNA病毒(包括正链RNA病毒和负链RNA病毒)和双链RNA病毒。此外，包括具有包膜的病毒(有包膜病毒；enveloped viruses)和不具有包膜的病毒(无包膜病毒；non-enveloped viruses)，优选使用有包膜病毒来源的载体。本发明中，RNA病毒具体包括属于以下的科的病毒。
沙粒病毒科(Arenaviridae)如拉沙病毒等
正粘病毒科(Orthomyxoviridae)如流感病毒等
冠状病毒科(Coronaviridae)如SARS病毒等
披膜病毒科(Togaviridae)如风疹病毒等
副粘病毒科(Paramyxoviridae)如流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙台病毒、如RS病毒等
微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)如脊髓灰质炎病毒、克沙奇病毒、艾可病毒等
纤维病毒科(Filoviridae)如马尔堡病毒、埃博拉出血热病毒等
黄病毒科(Flaviviridae)如黄热病病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒等
布尼亚病毒科(Bunyaviridae)；包括布尼亚病毒属、汉坦病毒属、内罗病毒属和白蛉病毒属等
弹状病毒科(Rhabdoviridae)如狂犬病病毒等，以及
呼肠孤病毒科(Reoviridae)
本发明中使用的染色体非整合型病毒载体是例如负链RNA病毒载体。负链RNA病毒载体是指由包含负链(相对于编码病毒蛋白质的有义链的反义链)的RNA作为基因组的病毒构成的载体。负链RNA也称作阴性链RNA。作为本发明中作为示例公开的负链RNA病毒，特别可以列举出单链负链RNA病毒(也称非分节型(non-segmented)负链RNA病毒)。“单链阴性链RNA病毒”是指基因组中具有单链阴性链[即负链]RNA的病毒。作为这样的病毒，包括属于副粘病毒(副粘病毒科；包括副粘病毒属(Paramyxovirus)，麻疹病毒属(Morbillivirus)，腮腺炎病毒属(Rubulavirus)和肺病毒属(Pneumovirus)等)、弹状病毒(弹状病毒科；包括水疱病毒属(Vesiculovirus)，狂犬病毒属(Lyssavirus)和短暂热病毒属(Ephemerovirus)等)、纤丝病毒(Filoviridae)等科的病毒，其在分类学上属于单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)(ウィルス第57卷第1期pp29-36、2007；Annu.Rev.Genet.32，123-162，1998；Fields virology fourth edition，Philadelphia，Lippincott-Raven，1305-1340，2001；Microbiol.Immunol.43，613-624，1999；Field Virology，Third editionpp1205-12411996)。
作为本发明中作为示例公开的负链RNA病毒载体，可以列举出副粘病毒载体。副粘病毒载体是来源于副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的病毒载体。可以列举出例如作为副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的仙台病毒(Sendai virus)。作为其它例子，可以列举出：新城疫病毒(Newcastle diseasevirus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻疹病毒(Measles virus)、RS病毒(Respiratory syncytial virus)、牛瘟病毒(rinderpest virus)、瘟热病毒(distempervirus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1，2，3型、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)等。
作为可在本发明中使用的病毒的进一步示例，包括例如仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟热病毒(PDV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)、尼帕病毒(Nipah)、人副流感病毒-2(HPIV-2)、猴副流感病毒5(SV5)、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒-4b(HPIV-4b)、流行性腮腺炎病毒(Mumps)、和新城疫病毒(NDV)等。更优选地，可以列举出选自仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟热病毒(PDV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒(Nipah)中的病毒。
本发明中使用的载体可以是例如属于副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属、腮腺炎病毒属和麻疹病毒属)的病毒或其衍生物，例如属于呼吸道病毒属(genus Respirovirus)(也称副粘病毒属(genus paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物中包括在不损害病毒的基因导入能力的同时病毒基因被修饰的病毒和化学修饰的病毒。作为可适用于本发明的呼吸道病毒属病毒，包括例如人副流感病毒1型(HPIV-1)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、仙台病毒(也称小鼠副流感病毒1型)和猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。
作为本发明中作为示例公开的负链RNA病毒，更具体地，可以列举出仙台病毒。野生型仙台病毒的基因组在3′的短前导区域之后，依次包含核壳(N)基因、磷(P)基因、基质(M)基因、融合(F)基因、血凝素-神经氨酸酶(HN)基因和大(L)基因、以及短的5′-后随序列(trailer)区域。与野生型病毒相当的重组载体以及各种突变型载体的制作均是已知的。而且还显示，仅使用除去该病毒的包膜而得到的RNP也能够实现基因导入(WO00/70055)。因此，基于RNP的初始化也包含在本发明中。对于其它病毒的RNP也是一样。
本发明中的染色体非整合型病毒可以来源于天然株、野生株、突变株、实验室传代株和人工构建的株等。总之，该病毒只要能够诱导目的初始化，可以是具有与从自然界分离的病毒相同的结构的病毒载体，也可以是通过基因重组进行人工修饰而得到的病毒。例如，可以是野生型病毒所具有的任何基因中存在突变、缺损的病毒。此外，还可以使用DI粒子(J.Virol.68：8413-8417，1994)等不完全病毒。例如，可以适宜使用编码病毒的包膜蛋白质或外壳蛋白质的至少1个基因中具有突变或缺损的病毒。这样的病毒载体可以是例如能够在感染细胞中复制基因组、但不能形成感染性病毒粒子的病毒载体。这样的复制能力缺损型病毒载体没有将感染扩大至周围的隐患，因而安全性高。例如可以使用不含有编码F、H、HN、或G等包膜蛋白质或刺突蛋白质的基因中的至少1个或者它们的组合的负链RNA病毒(WO00/70055和WO00/70070；Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。如果基因组RNA中编码基因组复制所必需的蛋白质(例如N、P、和L蛋白质)，则能够在感染细胞中扩增基因组。为了制造缺损型病毒，例如可以在病毒产生细胞中外源性地供给缺损的基因产物或能够补偿该基因产物的蛋白质(WO00/70055和WO00/70070；Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。此外，不需与缺损的病毒蛋白质完全互补、而以非感染性病毒粒子(VLP)的形式回收病毒载体的方法也是已知的(WO00/70070)。此外，在以RNP(例如由N、L、P蛋白质和基因组RNA构成的RNP)的形式回收病毒载体的情况下，能够制造载体，而无需补偿包膜蛋白质。
此外，还优选使用携带突变型病毒蛋白质基因的病毒载体。本发明特别提供初始化中的基因导入方法以及经初始化的细胞的制造方法，其中使用了病毒基因中具有突变和/或缺失的RNA病毒载体。例如，对于包膜蛋白质、外壳蛋白质，已知有包括弱毒化突变、温度敏感性突变在内的多种突变。本发明中可以适宜地使用具有这些突变蛋白质基因的RNA病毒。本发明中优选可以使用细胞毒性减弱的载体。细胞毒性例如可以通过对从细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)进行定量来测定。例如，可以使用细胞毒性与野生型相比显著弱化的载体。就细胞毒性弱化的程度而言，可以使用例如以MOI 3感染HeLa(ATCC CCL-2)或猴CV-1(ATCC CCL 70)并培养3天后的培养液中的LDH释放量，与野生型相比显著降低的、例如降低20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上或50％以上的载体。此外，降低细胞毒性的突变中包括温度敏感性突变。温度敏感性突变是指：与低温(例如30℃～32℃)相比，在病毒宿主的通常温度(例如37℃～38℃)下活性显著地降低的突变。这样的具有温度敏感性突变的蛋白质能够在容许温度(低温)下制作病毒，因而便于使用。本发明中有用的具有温度敏感性突变的病毒载体，例如与在培养细胞中于30℃进行感染时相比，于37℃进行感染时的增殖速度或基因表达水平为至少1/2以下、优选1/3以下、更优选1/5以下、更优选1/10以下、更优选1/20以下。
本发明中使用的染色体非整合型病毒载体只要不抑制初始化且能够诱导基于初始化因子的初始化，也可以是野生型，此外，优选至少1个、更优选至少2、3、4、5个或其以上的病毒基因中具有缺失或突变。缺失和突变还可以针对各基因任意地组合导入。此处所说的突变，可以是功能降低型突变或温度敏感性突变，而且是至少在37℃下可使病毒的增殖速度或携带的基因的表达水平与野生型相比降低至优选为1/2以下、更优选为1/3以下、更优选为1/5以下、更优选为1/10以下、更优选为1/20以下的突变。使用这样的修饰病毒载体，特别是对于多能干细胞的诱导而言可能是重要的。例如本发明中适用的负链RNA病毒载体中，至少2个病毒基因发生了缺失或突变。这样的病毒包括至少2个病毒基因缺失的病毒、至少2个病毒基因突变的病毒、至少1个病毒基因突变而至少1个病毒基因缺失的病毒。突变或缺失的至少2个病毒基因优选是编码包膜构成蛋白质的基因。例如F基因缺失、且M和/或HN(或H)基因缺失、或M和/或HN(或H)基因中有突变(例如温度敏感性突变)的载体，是本发明中优选使用的。此外，例如F基因缺失、且M或HN(或H)基因也缺失、而余下的M和/或HN(或H)基因中具有突变(例如温度敏感性突变)的载体，也是本发明中优选使用的。本发明中使用的载体，更优选至少3个病毒基因(优选编码包膜构成蛋白质的至少3个基因)缺失或突变。这样的病毒载体包括：至少3个基因缺失的载体、至少3个基因突变的载体、至少1个基因突变且至少2个基因缺失的载体、至少2个基因突变且至少1个基因缺失的载体。更优选的实施方式有，例如，缺失F基因、且M和HN(或H)基因也缺失、或M和HN(或H)基因具有突变(例如温度敏感性突变)的载体，这样的载体是本发明中优选使用的。此外，例如F基因缺失、且M或者HN(或H)基因也缺失、而余下的M或者HN(或H)基因有突变(例如温度敏感性突变)的载体，本发明中也是优选使用的。这样的突变型的病毒可以采用公知的方法来制作。
例如，作为负链RNA病毒的M基因的温度敏感性突变，可以列举出：选自仙台病毒的M蛋白质中的69位(G69)、116位(T116)和183位(A183)中的任意位点或其它负链RNA病毒M蛋白质的同源位点的氨基酸取代(Inoue，M.等，J.Virol.2003，77：3238-3246)。其它负链RNA病毒M蛋白质的同源位点的氨基酸是容易鉴定的，具体地例如，作为与SeV M蛋白质的G69相当的M蛋白质的同源位点，可以列举出：人副流感病毒-1(HPIV-1)(括号内为简称)的G69、人副流感病毒-3(HPIV-3)的G73、海豹瘟热病毒(PDV)和犬瘟热病毒(CDV)的G70、海豚麻疹病毒(DMV)的G71、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)的G70、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒(Nipah)的G81、人副流感病毒-2(HPIV-2)的G70、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)的E47、流行性腮腺炎病毒(Mumps)的E72(文字和编号表示氨基酸及其位置)。此外，作为与SeV M蛋白质的T116相当的各M蛋白质的同源位点，可以列举出：人副流感病毒-1(HPIV-1)的T116、人副流感病毒-3(HPIV-3)的T120、海豹瘟热病毒(PDV)和犬瘟热病毒(CDV)的T104、海豚麻疹病毒(DMV)的T105、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)的T104、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒(Nipah)的T120、人副流感病毒-2(HPIV-2)和猴副流感病毒5(SV5)的T117、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)的T121、流行性腮腺炎病毒(Mumps)的T119、新城疫病毒(NDV)的S120。作为与SeV M蛋白质的A183相当的各M蛋白质的同源位点，可以列举出：人副流感病毒-1(HPIV-1)的A183、人副流感病毒-3(HPIV-3)的F187、海豹瘟热病毒(PDV)和犬瘟热病毒(CDV)的Y171、海豚麻疹病毒(DMV)的Y172、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)的Y171、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒(Nipah)的Y187、人副流感病毒-2(HPIV-2)的Y184、猴副流感病毒5(SV5)的F184、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)和人副流感病毒-4b(HPIV-4b)的F188、流行性腮腺炎病毒(Mumps)的F186、新城疫病毒(NDV)的Y187。在以上所列举的病毒中，具有编码各自的M蛋白质中上述3个位点中的任一个、优选任意2个位点的组合、更优选全部3个位点上的氨基酸被其它氨基酸取代的突变M蛋白质的基因组的病毒，是本发明中优选使用的。
氨基酸突变优选取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸，例如取代成BLOSUM62矩阵(Henikoff，S.and Henikoff，J.G.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)的值为3以下、优选2以下、更优选1以下、更优选0以下的氨基酸。具体地，可以将仙台病毒M蛋白质的G69、T116和A183或者其它病毒M蛋白质的同源位点分别取代成Glu(E)、Ala(A)和Ser(S)。此外，还可以利用与麻疹病毒温度敏感株P253-505(Morikawa，Y.等，KitasatoArch.Exp.Med.1991：64；15-30)的M蛋白质的突变同源的突变。突变的导入例如可以使用寡核苷酸等、采用公知的突变导入方法来实施。
此外，作为HN(或H)基因的温度敏感性突变，例如可以列举出：任意选自仙台病毒的HN蛋白质的262位(A262)、264位(G264)和461位(K461)中的位点或其它负链RNA病毒M蛋白质的同源位点的氨基酸取代(Inoue，M.等，J.Virol.2003，77：3238-3246)。具有编码3个位点中的任何1个、优选任意2个位点的组合、更优选全部3个位点的氨基酸被取代成其它氨基酸的突变HN蛋白质的基因组的病毒，是本发明中优选使用的。同上述，氨基酸的取代优选取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。作为优选的一个例子，可以将仙台病毒HN蛋白质的A262、G264和K461或者其它病毒HN蛋白质的同源位点分别取代成Thr(T)、Arg(R)和Gly(G)。此外，例如还可以以流行性腮腺炎病毒的温度敏感性疫苗株Urabe AM9为参照，针对HN蛋白质的464以及468位的氨基酸导入突变(Wright，K.E.等，Virus Res.2000：67；49-57)。
此外，负链RNA病毒可以在P基因和/或L基因中具有突变。作为这样的突变，具体地可以列举出：SeV P蛋白质的86位的Glu(E86)的突变、SeVP蛋白质的511位的Leu(L511)到其它氨基酸的取代、或其它负链RNA病毒P蛋白质的同源位点的取代。同上述，氨基酸的取代优选取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地可以示例出：86位的氨基酸到Lys的取代、511位的氨基酸到Phe的取代等。此外，在L蛋白质中，可以列举出SeV L蛋白质的1197位的Asn(N1197)和/或1795位的Lys(K1795)到其它氨基酸的取代、或其它负链RNA病毒L蛋白质的同源位点的取代，同上述，氨基酸的取代优选取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地可以示例出：1197位的氨基酸到Ser的取代、1795位的氨基酸到Glu的取代等。P基因和L基因的突变能够显著提高持续感染性、2次粒子释放的抑制或细胞毒性的抑制的效果。而且，通过组合包膜蛋白质基因的突变和/或缺损，能够急剧地提升所述效果。此外，对于L基因，可以列举出SeV L蛋白质的1214位的Tyr(Y1214)和/或1602位的Met(M1602)到其它氨基酸的取代、或其它负链RNA病毒L蛋白质的同源位点的取代，同上述，氨基酸的取代优选取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地可以示例出：1214位的氨基酸到Phe的取代、1602位的氨基酸到Leu的取代等。以上示例的突变可以任意组合。
在本发明中，为了表达核初始化因子(nuclear reprogramming factors)，特别优选使用例如：SeV M蛋白质的至少69位的G、116位的T以及183位的A，SeV HN蛋白质的至少262位的A、264位的G以及461位的K，SeVP蛋白质的至少511位的L，SeV L蛋白质的至少1197位的N以及1795位的K分别被取代成其它氨基酸，且F基因缺损或缺失的仙台病毒载体；其它负链RNA病毒的各同源蛋白质中的同源位点上具有取代突变、且F基因缺损或缺失的F基因缺损或缺失载体；以及具有与之同样或更低的细胞毒性和/或具有与之同样或更高的温度敏感性的F基因缺损或缺失的负链RNA病毒载体。作为具体的取代实例，可以示例出例如：M蛋白质的G69E、T116A以及A183S取代，HN蛋白质的A262T、G264以及K461G的取代，P蛋白质的L511F取代，以及L蛋白质的N1197S和K1795E取代。编码核初始化因子(nuclear reprogramming factors)的基因可以配置在例如负链RNA基因组的最上游(3′侧)(例如N基因的3′侧)。但是，对于Myc基因，可以将其配置在其它位置，例如负链RNA基因组的后方，即更靠5′侧的位置。例如，可以插入到HN基因与L基因之间。
此外，作为L蛋白质的突变，还可以列举出：选自SeV L蛋白质的942位(Y942)、1361位(L1361)和1558位(L1558)中的任意位点的氨基酸到其它氨基酸的取代、或其它负链RNA病毒L蛋白质的同源位点的取代。同上述，氨基酸的取代优选取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地，可以示例出：942位的氨基酸到His的取代、1361位的氨基酸到Cys的取代、1558位的氨基酸到Ile的取代等。特别可以优选使用至少942位或1558位发生了取代的L蛋白质。例如，优选除了1558位以外、1361位也被取代成其它氨基酸的突变L蛋白质。此外，还优选除了942位以外、1558位和/或1361位也被取代成其它氨基酸的突变L蛋白质。通过这些突变，能够提高L蛋白质的温度敏感性。
此外，作为P蛋白质的突变，可以列举出选自SeV P蛋白质的433位(D433)、434位(R434)和437位(K437)中的任意位点的氨基酸到其它氨基酸的取代、或其它负链RNA病毒P蛋白质的同源位点的取代。同上述，氨基酸的取代优选取代成侧链的化学性质不同的其它氨基酸。具体地，可以示例出：433位的氨基酸到Ala(A)的取代、434位的氨基酸到Ala(A)的取代、437位的氨基酸到Ala(A)的取代等。特别可以优选使用上述3个位点全部发生取代的P蛋白质。通过这些突变，可以提高P蛋白质的温度敏感性。
下述病毒载体也是本发明中优选使用的：编码SeV P蛋白质的至少433位的D、434位的R和437位的K这3个位置被取代成其它氨基酸的突变P蛋白质、和SeV L蛋白质的至少1558位的L被取代的突变L蛋白质(优选至少1361位的L也被取代成其它氨基酸的突变L蛋白质)的、F基因缺损或缺失的仙台病毒载体；其它负链RNA病毒中同源位点发生突变的F基因缺损或缺失载体；以及具有与之同样或更低的细胞毒性和/或与之同样或更高的温度敏感性的F基因缺损或缺失的负链RNA病毒载体。各病毒蛋白质中，除了上述突变以外，其它氨基酸(例如10个以内、5个以内、4个以内、3个以内、2个以内或1个氨基酸)也可以具有突变。具有上述所示突变的载体显示高的温度敏感性，因此在初始化完成后，通过将细胞在稍微的高温(例如37.5～39℃、优选38～39℃或38.5～39℃)下进行培养，能够简便地将载体除去。核初始化因子(nuclear reprogramming factors)可以适宜插入到基因组的适当位置，例如插入基因组的最上游(3′侧)(例如NP基因的3′侧)。Myc基因可以插入到例如负链RNA病毒的基因组的中央的5′端侧(正中的基因的5′端侧)、例如L基因的5′侧或3′侧、特别是L基因的3’侧(例如HN-L间)。
载体的细胞毒性，例如可以通过对从细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)进行定量来测定。具体地例如，测定以MOI 3感染HeLa(ATCC CCL-2)或猴CV-1(ATCC CCL 70)并培养3天后的培养液中的LDH释放量。LDH释放量越少，细胞毒性越低。此外，温度敏感性可以通过测定病毒宿主在通常温度(例如37℃～38℃)下的病毒增殖速度或加载基因的表达水平来确定。与不具有突变的情况相比，病毒的增殖速度和/或携带的基因的表达水平越是降低，则判定温度敏感性越高。
此外，在使用有包膜病毒的情况下，可以使用包膜中包含与病毒本来具有的包膜蛋白质不同的蛋白质的病毒。例如，在制造病毒时，通过使病毒产生细胞表达希望的外源性包膜蛋白质，能够制造含该外源性包膜蛋白质的病毒。对于这样的蛋白质，没有特殊限制，可以使用对哺乳动物细胞赋予感染能力的希望的粘附因子、配体、受体等蛋白质。具体地，可以列举出例如水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的G蛋白质(VSV-G)。VSV-G蛋白质可以来源于任意的VSV株，例如可以使用Indiana血清型株(J.Virology 39：519-528(1981))来源的VSV-G蛋白，但不限于此。本发明中作为示例公开的负链RNA病毒可以任意组合包含其它病毒来源的包膜蛋白质。
具有核初始化因子(nuclear reprogramming factors)的重组RNA病毒的重构可以利用公知方法进行。就作为本发明的示例公开的负链RNA病毒而言，作为具体的规程，代表性地可以通过下述步骤来制造：(a)使编码负链RNA病毒基因组RNA(负链)或其互补链(正链)的cDNA在表达病毒粒子形成所必需的病毒蛋白质(N、P、和L)的细胞中进行转录的步骤，和(b)回收含有生成的病毒的培养上清的步骤。粒子形成所必需的病毒蛋白质可以由转录后的病毒基因组RNA表达，也可以从基因组RNA以外反式供给。例如，可以将编码N、P和L蛋白质的表达质粒导入细胞来供给。在基因组RNA中粒子形成所必需的病毒基因缺损的情况下，在病毒产生细胞中另行表达该病毒基因，以补全粒子的形成。为了在细胞内表达病毒蛋白质或RNA基因组，将下述载体导入宿主细胞，所述载体中，编码所述蛋白质或基因组RNA的DNA连接在能够在宿主细胞中发挥功能的适当启动子的下游。转录的基因组RNA在病毒蛋白质的存在下得以复制，并形成感染性病毒粒子。在制造包膜蛋白质等基因缺损的缺损型病毒时，在病毒产生细胞中表达能够补偿缺损的蛋白质或其功能的其它病毒蛋白质等。
例如，作为本发明的示例的负链RNA病毒的制造可以采用以下的公知方法来实施(WO97/16539；WO97/16538；WO00/70055；WO00/70070；WO01/18223；WO03/025570；WO2005/071092；WO2006/137517；WO2007/083644；WO2008/007581；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997、Kato，A.等，1997，EMBO J.16：578-587以及Yu，D.等，1997，Genes Cells 2：457-466；Durbin，A.P.等，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell.M.J.等，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.等，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.等，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.等，1996，Genes Cells 1：569-579；Baron，M.D.与Barrett，T.，1997，J.Virol.71：1265-1271；Bridgen，A.与Elliott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404；Tokusumi，T.等.Virus Res.2002：86；33-38、Li，H.-O.等，J.Virol.2000：74；6564-6569)。通过这些方法，可以从DNA重构包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒(Rinderpest virus)、仙台病毒等在内的负链RNA病毒。
正(+)链RNA病毒的制造方法，可以列举出以下的例子。
1)冠状病毒
Enjuanes L，Sola I，Alonso S，Escors D，Zuniga S.
Coronavirus reverse genetics and development of vectors for geneexpression.
Curr Top Microbiol Immunol.2005；287：161-97.Review.
2)披膜病毒
Yamanaka R，Zullo SA，Ramsey J，Onodera M，Tanaka R，Blaese M，Xanthopoulos KG.
Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoralinjection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.
Cancer Gene Ther.2001Oct；8(10)：796-802.
Datwyler DA，Eppenberger HM，Koller D，B ailey JE，Magyar JP.
Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbisvirus.
J Mol Med.1999Dec；77(12)：859-64.
3)微小核糖核酸病毒
Lee SG，Kim DY，Hyun BH，Bae YS.
Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus；themanipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the geneticstability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system.
J Virol.2002Feb；76(4)：1649-62.
Mueller S，Wimmer E.
Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion：analysis ofgenetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike openreading frames.
J Virol.1998Jan；72(1)：20-31.
4)黄病毒
Yun SI，Kim SY，Rice CM，Lee YM.
Development and application of a reverse genetics system for Japaneseencephalitis virus.
J Virol.2003Jun；77(11)：6450-65.
Arroyo J，Guirakhoo F，Fenner S，Zhang ZX，Monath TP，Chambers TJ.
Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow feverVirus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine(ChimeriVax-JE).
J Virol.2001Jan；75(2)：934-42.
5)呼肠孤病毒
Roner MR，Joklik WK.
Reovirus reverse genetics：Incorporation of the CAT gene into the reovirusgenome.
Proc Natl Acad Sci U S A.2001Jul 3；98(14)：8036-41.Epub 2001Jun 26.
关于其它的RNA病毒的增殖方法和重组病毒的制造方法，可以参照病毒实验学各论改订第二版(ウイルス実験学 各論、改訂二版)(国立预防卫生研究所学友会编，丸善，1982)。
上述的染色体非整合型病毒载体中，可以适宜地使其携带用于细胞的初始化的基因。携带的基因可以是参与从经分化的细胞诱导多能干细胞等各种干细胞等的希望的基因。例如，可以携带所述初始化所必需的基因、或提高初始化的效率的基因。即，本发明提供本发明的染色体非整合型病毒载体用于在细胞的初始化中导入基因的用途、以及用于在细胞中表达初始化因子以诱导该细胞的初始化的用途。此外，本发明提供包含本发明的染色体非整合型病毒载体的用于在细胞的初始化中导入基因的作用剂(导入剂、基因导入剂)、以及用于在细胞中表达初始化因子的作用剂。此外，本发明涉及包含本发明的染色体非整合型病毒载体，用于在细胞中表达初始化因子、诱导该细胞的初始化的作用剂。此外，本发明的载体可以用于在进行细胞的核初始化时在该细胞中表达希望的基因。携带1个或以上的编码核初始化因子(nuclear reprogramming factor)的基因的非整合型病毒载体，可以依照本发明用于细胞的初始化。本发明可以用于医学的用途和非医学的用途，在医学和非医学的实施方式中是有用的。例如，本发明可以用于治疗、手术和/或诊断目的，或者可以用于非治疗、非手术和/或非诊断目的。
本发明中，核初始化因子(a nuclear reprogramming factor)是指：能够单独或与多个因子共同用于将某细胞的分化状态诱导至相对未分化的状态的基因或其产物，例如包括能够用于诱导经分化的细胞脱分化的基因或其产物。本发明中，核初始化因子(a nuclear reprogramming factor)包括：核的初始化(reprogramming)所必需的因子、和提高核初始化的效率的辅助性因子(辅助因子)。本发明中，可以使载体携带用于核初始化(nuclear reprogramming)的希望的基因。例如，可以携带用于多能干细胞的制造的基因。作为用于诱导多能干细胞的核初始化因子(nuclear reprogramming factors)，具体地可以使用例如：在ES细胞、初期胚等中表达、但在分化的多种体细胞中不表达或表达降低的基因(ES细胞特异性基因等)。这样的基因优选是编码转录因子、核蛋白质等的基因。鉴定核初始化基因(nuclear reprogramming factors)的方法是已知的(WO2005/80598)，实际上，已证明采用该方法鉴定出的基因显示对于向多能干细胞的初始化(reprogramming)是有用的(WO2007/69666)。
作为这样的基因的例子，可以列举出：DPPA5(发育多能性相关5，ES细胞特异性基因1(ESG1)；登录号NM_001025290，NM_025274，XM_236761)、F-框蛋白15(Fbx15，NM_152676，NM_015798)、Nanog(NM_024865，AB093574)、ECAT1(ES细胞相关转录物1；AB211062，AB211060)、ERAS(ES细胞表达的Ras；NM_181532，NM_181548)、DNMT3L(DNA(包嘧啶-5-)-甲基转移酶3-样；NM_013369，NM_019448)、ECAT8(AB211063，AB211061)、GDF3(生长分化因子3；NM_020634，NM_008108)、SOX15(SRY(性别决定区Y)-box 15；NM_006942，NM_009235)、DPPA4(发育多能性相关4；NM_018189，NM_028610)、DPPA2(NM_138815，NM_028615)、FTHL17(运铁蛋白，重链多肽-样17；NM_031894，NM_031261)、SALL4(sal-样4；NM_020436，NM_175303)、Oct3/4(也称POU5F1；NM_002701，NM_203289，NM_013633，NM_001009178)、Sox2(NM_003106，NM_011443，XM_574919)、Rex-1(ZFP42(锌指蛋白42homolog)；NM_174900，NM_009556)、Utfl(未分化的胚胎细胞转录因子1；NM_003577，NM_009482)、TCLlA(T细胞白血病/淋巴瘤1A；NM_021966，NM_009337)、DPPA3(也称Stella，NM_199286，NM_139218，XM_216263)、KLF4(Kruppel-样因子4；NM_004235，NM_010637)、联蛋白β1(钙粘蛋白-相关蛋白β1；NM_001904，NM_007614；含S33Y突变体)、c-Myc(NM_002467，NM_010849；含T58A突变体)、STAT3(信号转导者和转录活化者3；NM_139276，NM_213659)、GRB2(结合于生长因子受体的蛋白2；NM_002086，NM_008163)，以及这些基因所属家族的其它成员的基因等。这些基因已被显示通过导入细胞能够诱导多能干细胞(WO2007/69666)。因此，携带这些基因中的任一个的染色体非整合型病毒载体、例如RNA病毒载体，在本发明中可以用于诱导细胞的脱分化，特别优选用于多能干细胞的诱导。可以将这些基因1个1个分别地整合在独立的载体中，也可以将多个基因一起整合在1个载体中。此外，可以将各基因整合在一种载体中，或者也可以将不同种类的载体(包括染色体整合型病毒载体和/或非病毒载体)与染色体非整合型病毒载体组合使用。此外，各病毒载体可以分别包装，而在使用时组合使用。或者，可以将携带不同基因的多个病毒载体预先组合做成试剂盒，或者混合起来作为组合物。此外，在细胞的初始化、特别是多能干细胞的制造中也优选使用包含这些基因的任意组合(或全部)的1个或其以上的非整合型病毒载体、以及包含该载体的试剂盒或组合物。对于组合物的情况，载体可以适宜混合在灭菌水、pH缓冲液、生理盐水、培养液等中。而且，这些体系中，还可以将核初始化基因的一部分或大部分替换成作为其表达产物的蛋白质。即，本发明的组合物和试剂盒只要包含至少一种染色体非整合型病毒载体，还可以包含表达初始化因子的其它载体(染色体整合型病毒载体和/或非病毒载体)和/或诱导初始化的化合物、蛋白质等。初始化的必要因子可以全部由染色体非整合型病毒载体表达，或者也可以仅一部分由染色体非整合型病毒载体表达而其它部分由其它载体和/或化合物(例如蛋白质或低分子化合物)供给。此外，本发明的经初始化的细胞的制造方法，并不限于全部的基因导入均使用染色体非整合型病毒载体来进行的方法。即，本发明的方法使用至少一种染色体非整合型病毒载体即可，还包括组合使用表达初始化因子的其它载体(染色体整合型病毒载体和/或非病毒载体)和/或诱导初始化的化合物等。
本发明涉及包含染色体非整合型病毒载体作为表达载体的用于细胞的初始化的组合物。此外，本发明涉及染色体非整合型病毒载体的用于经分化的细胞的初始化的用途。例如，本发明提供染色体非整合型病毒载体的用途，其用于在细胞的初始化中针对有必要的细胞导入基因。此外，本发明涉及：用于在细胞的初始化中导入基因的方法，该方法中使用染色体非整合型病毒载体，针对有必要的细胞导入该基因。此外，本发明还涉及包含染色体非整合型病毒载体的用于细胞的初始化中的基因导入的组合物、用于细胞的初始化中的基因导入的作用剂(用于细胞的初始化中的基因导入的导入剂、细胞的初始化中的基因导入剂)。此外，本发明还涉及染色体非整合型病毒载体用于制造用于在细胞的初始化中针对有必要的细胞导入基因的药物的用途。此外，本发明提供包含染色体非整合型病毒载体的用于在细胞的初始化中使用的基因导入剂(基因表达剂或表达载体)。此外，本发明提供包含染色体非整合型病毒载体的初始化基因导入剂(基因表达剂或表达载体)。此外，本发明提供包含染色体非整合型病毒载体的核初始化因子(nuclear reprogrammingfactor)表达剂(核初始化基因(a nuclear reprogramming gene)导入剂、核初始化基因(a nuclear reprogramming gene)表达载体)。此外，本发明提供包含编码核初始化因子(a nuclear reprogramming factor)的染色体非整合型病毒载体的多能干细胞诱导剂和多能干细胞诱导辅助剂。此外，本发明提供染色体非整合型病毒载体用于经分化的细胞的初始化的用途。此外，本发明提供染色体非整合型病毒载体用于制造用于经分化的细胞的初始化的药剂、试剂和/或医药的用途。此外，本发明还涉及染色体非整合型病毒载体用于制造经分化的细胞的核初始化因子(a nuclear reprogramming factor)导入剂的用途。
此处，初始化可以是例如从分化的细胞诱导多能干细胞。载体可以整合编码用于初始化的因子的基因来使用。作为编码初始化因子的基因，可以列举出编码例如上述或者以下示例的因子中的任何一个的基因。
而且，导入的因子可以根据希望初始化的细胞的来源适宜选择，可以是人来源的，也可以是其它哺乳动物来源例如小鼠、大鼠、兔、猪、或者猴等灵长类来源的。此外，基因和蛋白质的序列并不一定是野生型的序列，只要能够诱导初始化，可以具有任何突变。实际上，已知使用突变型基因制作多能干细胞的实例(WO2007/69666)。例如，编码添加、缺失、取代、和/或插入1个或少数(例如数个、3个以内、5个以内、10个以内、15个以内、20个以内、25个以内)氨基酸而成的氨基酸序列、且能够诱导初始化的基因，可以在本发明中使用。此外，只要保持生物学活性(初始化诱导能力)，例如N末端和/或C未端的1个～数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸发生缺失或添加而成的多肽、以及1个～数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸发生取代而成的多肽等，也是可以使用的。作为可以使用的变体，包括例如：天然蛋白质的片段、类似物、衍生物、以及与其它多肽的融合蛋白质(例如添加异种信号肽或抗体片段而成的等)。具体地，包括下述多肽，所述多肽包含在野生型氨基酸序列中取代、缺失、和/或添加1个或其以上的氨基酸而成的序列、且具有与野生型蛋白质等同的生物学活性(例如诱导初始化的活性)。在使用野生型蛋白质的片段的情况下，通常包含野生型多肽(对于分泌蛋白质为成熟型的形态)的70％以上、优选80％以上、85％以上、更优选90％以上、95％以上或98％以上的连续区域。
氨基酸序列的变体，例如可以通过在编码天然多肽的DNA中导入突变来制备(Walker and Gaastra，eds.Techniques in Molecular Biology(MacMillanPublishing Company，New York，1983)；Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492，1985；Kunkel等，Methods Enzymol.154：367-382，1987；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview，N.Y.)，1989；U.S.Pat.No.4,873,192)。关于如何进行氨基酸取代而不影响生物学活性，可以参考例如Dayhoff等(Dayhoff等，in Atlas ofProtein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)，1978)的指导。
对于进行修饰的氨基酸的数目没有特殊限制，例如是天然的成熟型多肽的全部氨基酸的30％以内、优选25％以内、更优选20％以内、更优选15％以内、更优选10％以内、5％以内或3％以内，例如15个氨基酸以内、优选10个氨基酸以内、更优选8个氨基酸以内、更优选5个氨基酸以内、更优选3个氨基酸以内。在对氨基酸氨基酸进行取代时，通过取代成侧链性质相似的氨基酸可以期待保持蛋白质的活性。这样的取代，在本发明中称作保守取代。保守取代可以列举出：例如碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等各组内的氨基酸之间的取代等。此外，可以列举出例如，BLOSUM62取代矩阵(S.Henikoff andJ.G.Henikoff，Proc.Acad.Natl.Sci.USA 89：10915-10919，1992)中处于正值关系的氨基酸之间的取代。
经修饰的蛋白质与野生型蛋白质的氨基酸序列之间显示高同源性。高同源性是指：具有例如70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、95％以上或96％以上的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可以使用例如BLASTP程序(Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)来确认。例如，可以在NCBI(National Center for BiothchnologyInformation)的BLAST的网页上，使用默认参数来进行检索(Altschul S.F.等，Nature Genet.3：266-272，1993；Madden，T.L.等，Meth.Enzymol.266：131-141，1996；Altschul S.F.等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Zhang J.&Madden T.L.，Genome Res.7：649-656，1997)。例如，通过进行2个序列的比较的blast2sequences程序(Tatiana A等，FEMS Microbiol Lett.174：247-250，1999)，制作2个序列的比对，可以确定序列的同一性。空位按错配对待，计算出例如相对于天然型细胞因子(分泌后的成熟型的形态)的氨基酸序列全体的同一性的值。具体地，计算出野生型蛋自质(若为分泌蛋白质则为成熟型)的全部氨基酸数中的一致的氨基酸数的比例。
此外，基因可以导入沉默突变，而不改变所编码的氨基酸序列。特别是，在富含AT的基因中，针对5个以上的连续的A或T碱基，将其取代成G或C，而不改变所编码的氨基酸序列，从而能够稳定地获得基因的高表达。
此外，作为修饰蛋白质或者用于初始化的蛋白质，可以列举出：与编码野生型蛋白质的基因的编码区域的一部分或全部在严格条件下杂交的核酸所编码的、具有与野生型蛋白质等同的活性(诱导初始化的活性)的蛋白质。在杂交中，例如，可以从包含野生型蛋白质基因的编码区域序列或其互补序列的核酸或作为杂交对象的核酸中的任何一方制备探针，通过检测其是否与另一方的核酸杂交来进行鉴定。严格杂交的条件例如是：在含5xSSC、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑鱼精DNA、5xDenhardt液(1xDenhardt溶液含0.2％聚乙烯基吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白以及0.2％Ficoll)的溶液中，于60℃、优选65℃、更优选68℃进行杂交，然后在与杂交相同的温度下，于2xSSC中、优选1xSSC中、更优选0.5xSSC中、更优选0.1xSSC中振荡洗涤2小时的条件。
为了诱导细胞的初始化，特别优选的基因可以列举出：F-框蛋白15(Fbx15，NM_152676，NM_015798)、Nanog(NM_024865，AB093574)、ERAS(ES细胞表达的Ras；NM_181532，NM_181548)、DPPA2(NM_138815，NM_028615)、Oct3/4(也称POU5F1；NM_002701，NM_203289，NM_013633，NM_001009178)、Sox2(NM_003106，NM_011443，XM_574919)、TCL1A(T细胞白血病/淋巴瘤1A；NM_021966，NM_009337)、KLF4(Kruppel-样因子4；NM_004235，NM_010637)、联蛋白β1(钙联蛋白相关蛋白beta 1；NM_001904，NM_007614；含S33Y突变体)和c-Myc(NM_002467，NM_010849；含T58A突变体)、以及这些基因所属家族的其它成员的基因等。有报导称，在导入这些基因的情况下，显示出诱导多能干细胞的形态的集落的比例甚至高于导入下文所述的4种基因(Oct3/4、Sox2、KLF4和c-Myc)时的比例(WO2007/69666)。因此，携带这些基因中的任何一个的染色体非整合型病毒载体在本发明中可以用于诱导细胞的初始化，特别是优选可以用于诱导多能干细胞。各个病毒载体可以在使用时进行组合来使用。此外，也可以预先做成试剂盒，或者混合起来作为组合物。此外，本发明还包括：包含这些基因的任意组合(或全部)的、1个或其以上的染色体非整合型病毒载体，以及包含该载体的试剂盒或组合物。
其中，对多能干细胞的诱导而言特别优选的基因的组合之一是至少包含Sox基因、KLF基因、Myc基因和Oct基因这4种基因的组合(Takahashi，K.and Yamanaka S.，Cell 126，663-676，2006；Lowry WE等，Proc Natl Acad Sci US A，105(8)：2883-8，2008；Masaki，H.等，Stem Cell Res.1：105-115，2008；WO2007/69666)。此处，Sox蛋白质、KLF蛋白质、Myc蛋白质和Oct蛋白质、以及它们的基因是指：分别属于Sox家族、KLF家族、Myc家族和Oct家族的成员的蛋白质和基因。有报告称，通过进行调整使得分别表达1个以上的这4个家族的成员，可以从分化的各种细胞诱导多能干细胞。例如，有报告称，对于Sox家族的基因，使用Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、Sox17中的任何一个基因，均可以诱导多能干细胞(WO2007/69666)。此外，对于KLF家族，使用KLF4或KLF2均能够诱导多能干细胞(WO2007/69666)。对于Myc家族，不仅是使用野生型c-Myc、使用T58A突变体或N-Myc、L-Myc也能够诱导多能干细胞(WO2007/69666；Blelloch R.等，Cell Stem Cell，1：245-247，2007)。这样，由于可以通过多种方式选择家族的基因并使用，可以适宜地选择上述的4种家族基因来诱导初始化。
例如，已经判明从仙台病毒载体等RNA病毒载体表达野生型c-Myc的表达量少。但是，通过在野生型c-Myc中导入选自a378g、t1122c、t1125c、a1191g和a1194g中的1个以上、优选2个以上、3个以上、4个以上、或全部5个突变，可使得稳定地从载体高表达基因成为可能。本发明中，可以优选使用例如SEQ ID NO：45所示的修饰型c-Myc基因。基因在载体中的插入位置，可以选择所希望的位点。
例如，Myc基因可以配置在负链RNA基因组的后方(5′侧)，即在基因组上配置的多个蛋白质编码序列中，从5′侧数起比从3′侧数起更先数到的位置(参照实施例)。Myc基因可以配置在例如，最5′侧(即5′侧起第1位)、或者5′侧起第2或第3位。Myc基因可以配置在例如基因组的5′侧起第2位，具体地，在基因组的最5′侧是L基因、然后是HN基因的情况下，Myc基因可以配置于它们之间。Myc基因中可以适宜导入沉默突变、取代连续的A或T的碱基序列，而不改变所编码的氨基酸序列。
将Myc基因配置在负链RNA基因组的后方(5′侧)而成的负链RNA病毒载体可以与编码其它核初始化因子的负链RNA病毒载体组合使用。这种情况下，在编码其它核初始化因子的负链RNA病毒载体中，这些核初始化因子可以配置在各载体的负链RNA基因组中的前方(3′侧)，即在基因组上配置的多个蛋白质编码序列中，从3′侧数起比从5′侧数起更先数到的位置。例如，可以配置在最3′侧(即3′侧起第1位)、或者3′侧起第2或第3位。例如，编码Myc以外的核初始化因子的基因(例如Oct基因、Klf基因和Sox基因)在各负链RNA病毒载体中可以配置在基因组的5′侧起第1位或第2位、更优选第1位。具体地，可以在位于基因组的NP基因的3′侧的最3′端侧配置编码核初始化因子的基因。
可以从初始化完后的细胞的集落适宜选择出除去了载体的细胞。例如可以选择自然除去载体的细胞。为此，例如可以使用病毒载体特异性的抗体(例如抗HN抗体)进行负选择。此外，在使用温度敏感性载体时，通过在高温(例如37.5～39℃、优选38～39℃或38.5～39℃)下进行培养，可以简便地除去载体。
具体地，作为KLF家族，包括Klf1(NM_006563，NM_010635)、Klf2(NM_016270，NM_008452)、Klf4(NM_004235，NM_010637)、Klf5(NM_001730，NM_009769)；作为Myc家族，包括c-Myc(NM_002467，NM_010849，含T58A突变体)、N-Myc(NM_005378，NM_008709)、L-Myc(NM_005376，NM_005806)；作为Oct家族，包括Oct1A(NM_002697，NM_198934)、Oct3/4(NM_002701，NM_203289，NM_013633，NM_001009178)、Oct6(NM_002699，NM_011141)；作为Sox家族，包括Sox1(NM_005986，NM_009233)、Sox2(NM_003106，NM_011443，XM_574919)、Sox3(NM_005634，NM_009237)、Sox7(NM_031439，NM_011446)、Sox15(NM_006942，NM_009235)、Sox17(NM_022454，NM_011441)、Sox18(NM_018419，NM_009236)。携带这些基因中的任何一个的染色体非整合型病毒载体，在本发明中可以用于诱导细胞的脱分化，特别优选用于诱导多能干细胞。
而且，Myc家族的基因对于多能干细胞的诱导并非必需，仅使用除Myc家族基因以外的3个家族的基因也能够诱导多能干细胞(Nakagawa M.等，Nat Biotechnol.26(1)：101-6，2008；Wering M.等，Cell Stem Cell 2(1)：10-2，2008；实施例5)。在不表达Myc基因的情况下，例如通过p53 siRNA和UTF1能够使多能干细胞的诱导效率显著地提高(Y.Zhao等，Cell Stem Cell，3(5)：475-479，2008；N.Maherali，and K.Hochedlinger，Cell Stem Cell，3(6)：595-605，2008)。此外，有报告称，仅使用除KLF家族的基因之外的3个家族的基因也能够诱导多能干细胞(Park IH等，Nature，451(7175)：141-6，2008)。此外，有报告称，通过结合使用G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂(BIX-01294；Kubicek，S.等，Mol.Cell 25，473-481，2007)，仅使用Klf基因、Sox基因和Myc基因这3个基因就可以从胚胎来源的NPC诱导多能干细胞(Shi Y等，Cell StemCell，2(6)：525-8，2008)。因此，携带Sox基因、KLF基因和Oct基因各基因中的任何一个，或者Sox基因、Myc基因和Oct基因各基因中的任何一个，或者Sox基因、Myc基因和Klf基因的组合的1个或多个染色体非整合型病毒载体，用于本发明中的细胞初始化的诱导是特别有用的，优选可以用于诱导多能干细胞。编码各基因的病毒载体可以分别单独准备。它们可以在使用时组合使用。此外，也可以将任意组合或全部组合在一起作为试剂盒，或者混合起来作为组合物。此外，本发明还涉及包含这些基因的任意组合(或全部)的1种或多种染色体非整合型病毒载体，以及包含该载体的用于初始化的试剂盒或组合物。而且，还可以将该试剂盒中所含的一部分重组载体替换成具有相当功能的蛋白质、合成化合物等。
而且，例如在原来的经分化的细胞中已经内源性表达了上述基因中的1个或几个的情况下，可以省略该基因的导入。例如，神经祖细胞(neuralprogenitor cells(NPCs))表达内源性的Sox家族基因，因而仅通过导入Oct3/4和Klf4就可以诱导多能干细胞(Shi Y等，Cell Stem Cell，2(6)：525-8，2008)。此外，有报告称，使用Oct4，Sox2，Esrrb(雌激素相关受体β，NM_004452.2，NP_004443.2，NM_011934.3，NP_036064.2)这3个基因可以从小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)诱导多能干细胞，这暗示Esrrb能够补偿Klf的功能(Feng，B.等，Nat Cell Biol.11(2)：197-203，2009)。此外，通过组合组蛋白甲基转移酶抑制剂(BIX-01294)和钙离子通道激动剂(BayK8644)，仅导入Oct3/4和Klf4就可以从胚成纤维细胞诱导多能干细胞(Shi Y等，Cell Stem Cell，3(5)：568-574，2008)。此外，有报告称，在使用成体小鼠脑来源的神经干细胞(neural stem cells；NSCs)进行的实验中，不仅是Oct3/4和Klf4的组合，仅导入Oct3/4和c-Myc这2个因子的基因，也能够诱导多能干细胞(Kim，J.B.等，Nature，doi：10.1038/nature07061；2008年6月29日网上发表；Nature.2008，454(7204)：646-50)。此外，通过调整培养时间，仅使用Oct4也能够诱导多能干细胞(Jeong Beom Kim等，Cell，136(3)：411-419，2009)。可以适宜地使用必要的编码初始化因子的染色体非整合型病毒载体。此外，内源性初始化因子的内源性表达如果是可以被其它基因的表达或化合物处理所诱导的，则可以只导入编码不能仅被这样的其它基因的表达或化合物处理所诱导的初始化因子的染色体非整合型病毒载体，同时结合表达所述其它基因的载体的导入或化合物处理。在本发明中，“组合载体，使得内源性或外源性表达至少Oct基因、Klf基因和Sox基因这3种、或者至少Oct基因、Klf基因、Sox基因和Myc基因这4种、或者至少Oct基因、Sox基因、Nanog基因、Lin28基因这4种”不但包括例如某初始化因子在自然状态下内源性表达的状态，还包括当通过导入表达其它基因的载体或用化合物、蛋白质进行处理等能够诱导内源性的初始化因子的表达时，组合染色体非整合型病毒载体以仅外源性表达不足的因子的情况。
此外，除了上述4种或3种的组合以外，包含Oct基因、Sox基因、NANOG基因(NM_024865，AB093574)和LIN28基因(NM_024674)这4种的各基因的组合对于诱导多能干细胞也是有用的(Yu J.等，Science，318(5858)：1917-20，2007)。此外，这其中优选再组合进Myc基因和KLF基因(Liao J等，Cell Res.18(5)：600-3，2008)。携带这些中的任意基因的染色体非整合型病毒载体，在本发明中特别优选用于诱导细胞的脱分化，优选用于诱导多能干细胞。包含这些基因的任意组合(或全部)的1个或其以上的染色体非整合型病毒载体，以及包含该载体的试剂盒或组合物，优选用于细胞的初始化，特别是多能干细胞的制造。而且，同上述，在作为对象的细胞已经表达这些基因中的一部分的情况下，也可以不导入表达该基因的载体。而且，该试剂盒中所包含的一部分重组载体也可以替换成具有相当的功能的蛋白质、合成化合物等。
在以上描述的基因的组合中，还可以进一步组合其它基因，来提高初始化的诱导效率。作为这样的基因，可以列举出TERT(NM_198253，NM_009354)和/或SV40大T抗原(NC_001669.1，Fiers，W.(05-11-1978)Nature273：(5658)113-120)(Park IH.等，Nature，451(7175)：141-6，2008)。此外，可以进一步组合选自HPV16E6、HPV16E7、Bmil(NM_005180，NM_007552)中的1个以上的基因。此外，可以表达选自Fbx15(Mol Cell Biol.23(8)：2699-708，2003)、Nanog(Cell 113：631-642，2003)、Eras(Nature 423，541-545，2003)、DPPA2(Development 130：1673-1680，2003)、TCL1A(Development 130：1673-1680，2003)、β-联蛋白(Nat Med 10(1)：55-63，2004)中的1个或任意组合。而且，可以组合选自ECAT1(AB211062，AB211060)、DPPA5(NM_001025290，NM_025274，XM_236761)、DNMT3L(NM_013369，NM_019448)、ECAT8(AB211063，AB211061)、GDF3(NM_020634，NM_008108)、SOX15(NM_006942，NM_009235)、DPPA4(NM_018189，NM_028610)、FTHL17(NM_031894，NM_031261)、SALL4(NM_020436，NM_175303)、Rex-1(NM_174900，NM_009556)、Utf1(NM_003577，NM_009482)、DPPA3(NM_199286，NM_139218，XM_216263)、STAT3(NM_139276，NM_213659)、和GRB2(NM_002086，NM_008163)中的1个以上的基因。通过额外表达这些基因，能够促进多能干细胞的诱导(WO2007/69666)。在以成熟B细胞作为对象的情况下，例如，可以异处表达髓细胞转录因子C/EBPα(CCAAT/增强子结合蛋白α)(NM_004364)，或者抑制B细胞转录因子Pax5(成对框5；NM_016734)的表达，来促进初始化(Hanna J，Cell.133(2)：250-64，2008)。这些因子也可以使用本发明中的染色体非整合型病毒载体进行表达。而且，该试剂盒中所包含的一部分重组载体可以替换成具有相当功能的蛋白质、合成化合物等。
此外，除了表达上述的因子以外，例如，通过结合添加化合物，也能够提高初始化的效率。例如，bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和/或SCF(干细胞因子)促进多能干细胞的诱导，而且能够在多能干细胞的诱导中代替c-Myc的功能(WO2007/69666)。此外，MAP激酶抑制剂(PD98056)可以用于建立更接近于ES细胞的多能干细胞等用途(WO2007/69666)。此外，有报告称，通过DNA甲基化酶(Dnmt)抑制剂和/或组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂，能够改善多能干细胞的诱导效率(Huangfu D等，Nat Biotechnol.(Published online：22 June 2008，doi：10.1038/nbt1418)；Nat.Biotechnol.26，795-797(2008))。例如，通过组合使用HDAC(VPA)，仅导入Oct4和Sox2这2个基因就能够诱导多能干细胞(Huangfu，D.等，Nat Biotechnol.200826(11)：1269-75)。本发明的载体作为用于表达这些基因或其部分基因的作用剂是有用的。作为Dnmt抑制剂，可以使用例如5-氮杂胞苷等；作为HDAC抑制剂，可以使用例如N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、曲古抑菌素A(TSA)、丙戊酸(VPA)等。此外，在使用5-氮杂胞苷的情况下，通过组合使用糖皮质素(地塞米松)，可以提高效率。
为了使细胞初始化，将上述组合的载体等导入细胞。在组合导入多个载体和/或化合物的情况下，导入优选同时进行，具体地，优选在添加最初的载体或化合物等后的48小时以内、优选36小时以内、更优选24小时以内、18小时以内、12小时以内、10小时以内、8小时以内、6小时以内、3小时以内、2小时以内或1小时以内，将编码初始化因子的全部载体和/或化合物添加完毕。载体的用量可以适宜制备，优选以MOI 0.3～100、更优选MOI0.5～50、更优选MOI 1～30、更优选MOI 1～10、更优选MOI 1～5、更优选MOI约3进行感染。诱导出的多能干细胞形成与ES细胞十分相似的扁平集落，并表达碱性磷酸酶。此外，诱导出的多能干细胞可以表达未分化细胞标志物Nanog、Oct4和/或Sox2等。此外，诱导出的多能干细胞优选表达TERT和/或显示端粒末端转移酶活性。本发明还涉及表达碱性磷酸酶、优选还表达未分化细胞标志物Nanog和/或TERT的细胞的制造方法，以及染色体非整合型病毒载体在制造该细胞和制造诱导该细胞的药物中的用途。
根据本发明，能够从含成人皮肤细胞和新生儿周皮细胞的希望的细胞以例如0.3×10-5以上、0.5×10-5以上、0.8×10-5以上、或1×10-5以上(例如1.7×10-5～2.4×10-3)的出现率，优选以1.5×10-5以上、1.7×10-5以上、2.0×10-5以上、2.5×10-5以上、3×10-5以上、4×10-5以上、5×10-5以上、8×10-5以上、1×10-4以上、2×10-4以上、3×10-4以上、5×10-4以上、8×10-4以上、1×10-3以上、1.5×10-3以上、2×10-3以上或2.3×10-3以上的出现率诱导出多能干细胞的集落。
对于作为诱导初始化的对象的经分化的细胞，没有特殊限制，可以使用希望的体细胞等。从体细胞生成多能干细胞，不仅可以从小鼠胚胎来源的细胞生成，从采集自成体小鼠尾部的经分化的细胞、或肝细胞和胃粘膜细胞生成也显示是可行的，这提示并非依赖于细胞类型或分化状态(WO2007/069666；Aoi T.等，Science[2008年2月14日网上发表]；Science.2008；321(5889)：699-702)。此外，对于人类，已经确认可以从成人的面部皮肤来源的成纤维细胞、成人滑膜细胞、新生儿周皮来源成纤维细胞、成人间充质干细胞、成人手掌的皮肤细胞、胚胎细胞等多种多样的细胞诱导多能干细胞(Takahashi K et al.(2007)Cell 131：861-872；Park IH等，Nature，451(7175)：141-6，2008)。此外，有报告称，从胰脏β细胞、B淋巴细胞这样的终末分化细胞同样可以诱导多能干细胞(Stadtfeld M等，Curr Biol.2008May 21.[PubMed，PMID：18501604]；Curr Biol.2008；18(12)：890-4；Hanna J.等，Cell.133(2)：250-64，2008)。这些认识提示，多能干细胞的诱导不依赖于作为基础的细胞。在这些从这些希望的体细胞诱导多能干细胞的过程中，可以适用本发明的方法。具体地，作为初始化的对象的经分化的细胞包括成纤维细胞、滑膜细胞、口腔或胃等的粘膜细胞、肝细胞、骨髓细胞、牙胚细胞、其它希望的细胞。此外，细胞可以是来源于例如胚、胚胎、新生儿、小孩、成人或老年人的细胞。此外，对动物的来源没有特殊限制，包括哺乳动物等，哺乳动物包括例如人和非人灵长类(猴等)、小鼠、大鼠等啮齿类和牛、猪、羊等非啮齿类。
采用本发明的方法制造的细胞可用于分化成各种组织或细胞，可用于希望的试验、研究、诊断、检查、治疗等。例如，预期诱导出的干细胞可用于干细胞疗法。例如，可以使用采集自患者的体细胞，诱导初始化(reprogramming)，然后，将分化诱导所得的体性干细胞或其它体细胞移植给患者。对于细胞分化诱导的方法没有特殊限制，例如，可以通过视黄酸处理、各种增殖因子-细胞因子处理、利用激素进行的处理来诱导分化。此外，所得细胞可以用于检测希望的药物、化合物的效果，由此可以实施药物、化合物的筛选。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明不受这些实施例的限制。此外，本说明书中引用的文献及其它参考资料，全部并入作为本说明书的一部分。
<本发明中使用的携带外源基因的仙台病毒载体的制作>
本发明中使用的携带外源基因的仙台病毒载体的制作方法如下所示。如无特别说明，外源基因的导入使用该载体来进行。此外，下述SeVl8+/TSΔF是M蛋白质中具有G69E、T116A和A183S的突变、HN蛋白质中具有A262T、G264和K461G的突变、P蛋白质中具有L511F突变、且L蛋白质中具有N1197S和K1795E突变的F基因缺失型仙台病毒载体(WO2003/025570)。该载体的NP基因的上游(基因组的3′侧；也称“18+位”)具有导入基因插入位点(NotI位点)。
(1)用于分离c-Myc基因、Sox2基因、KLF4基因以及Oct3/4基因的cDNA文库的制作
为了分离c-Myc基因、Sox2基因、KLF4基因以及Oct3/4基因，从Jurkat细胞抽提了总RNA。将1.0×106(个)细胞的Jurkat细胞(Schneider U et al(1977)Int J Cancer 19(5)：621-6)于8000rpm、室温离心1分钟，进行了收集。添加细胞溶解缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，1.5mM MgCl2，0.65％NP-40)200μl，吹吸后，利用涡旋振荡使之悬浮。6000rpm离心分离3分钟，将上清转移至另外的1.5ml Eppendorf管中，添加200μl的抽提缓冲液。利用涡旋振荡充分悬浮后，添加400μl的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，再利用涡旋振荡充分悬浮。15000rpm、4℃离心分离5分钟，将上清转移至另外的1.5ml Eppendorf管中，添加400μl的异丙醇，利用涡旋振荡充分悬浮后，于-20℃冷却30分钟。15000rpm、4℃离心分离15分钟，除去上清，在沉淀物中加入70％乙醇1ml，利用涡旋振荡悬浮后，15000rpm、4℃离心分离5分钟。除去上清并于室温进行干燥后，将其溶解于100μl的不含核酸酶的水中，得到了Jurkat细胞的总RNA溶液。
为了分离KLF4基因，采用与上述相同的方法从人胚胎肾细胞来源的293T/17细胞(人胚胎肾亚克隆17，ATCC CRL-11286，Pear，W.S.等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8392-8396)中回收了总RNA。
为了分离Oct3/4基因，采用与上述相同的方法从人胚胎瘤细胞NCCIT细胞(ATCC编号CRL-2073；Damjanov I，等，Lab.Invest.1993，68(2)：220-32)中回收了总RNA。
从回收的总RNA使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen目录号18080-044)合成了cDNA。将总RNA 1μg、随机六聚体100ng、10mM dNTP混合液1μl用不含核酸酶的水调整至13μl。65℃热处理5分钟，然后在冰上放置冷却1分钟。然后，添加5x第一链缓冲液4μl 0.1M DTT 1μl、RNaseOUT1μl，再添加Superscript III RT 1μl，通过吹吸进行混合后，旋转沉降，进行25℃5分钟、50℃60分钟、70℃15分钟的反应。添加TE(pH8.0)180μl，将此作为cDNA文库。
(2)人转录因子c-Myc的分离和携带有c-Myc的仙台病毒载体质粒的构建
从Jurkat的cDNA文库使用PrimeStar(商标)HS DNA聚合酶(TAKARA Bio株式会社目录号R010A)以c-Myc-21F(5’-AACCAGCAGCCTCCCGCGACG-3’(SEQ ID NO：1))和c-Myc 1930R(5’-AGGACATTTCTGTTAGAAGGAATCG-3’(SEQ ID NO：2))为引物，进行了PCR(94℃-3分钟→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分钟进行40个循环→72℃-7分钟)。将该PCR产物用TE稀释100倍后，对于其中的1μl，使用c-Myc-F(5’-GATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACC-3’(SEQ ID NO：3))和c-Myc-R(5’-GTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTG-3’(SEQ ID NO：4))引物进行PCR。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出约1.3kbp的条带，用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(QIAGEN，目录号28706)进行了纯化。克隆至pCAGGS-BSX(WO2005/071092)的SwaI位点，进行测序选择出正确的克隆，得到了pCAGGS-BSX-c-Myc。然后，以pCAGGS-BSX-c-Myc作为模板，使用NotI-c-Myc F(5’-ATTGCGGCCGCATGCCCCTCAACGTTAGCTTCAC-3’(SEQ ID NO：5))和NotI-c-Myc R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTCAAGTTTGTGTTTC-3’(SEQ ID NO：6))引物进行PCR。PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)进行纯化，然后进行Not I消化(37℃3小时)。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)进行纯化，克隆至Bluescript质粒载体的Not I位点，通过测序确认基因序列，选择出序列正确的克隆，得到了pBS-KS-c-Myc。将pBS-KS-c-Myc用Not I消化(37℃，3小时)，用1％琼脂糖凝胶电泳分离，切出约1.5k bp的条带，用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(GIAGEN，目录号28706)纯化。将该包含c-Myc基因的NotI片段克隆至编码仙台病毒载体(SeV18+/TSΔF)的反基因组的pSeV18+/TSΔF载体的Not I位点，通过测序选择出序列正确的克隆，从而得到了pSeV18+c-Myc/TSΔF。
(3)人转录因子SOX2基因的分离和携带SOX2基因的仙台病毒载体质粒的构建
从Jurkat的cDNA文库，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(TAKARA Bio株式会社目录号R010A)并利用SOX2-64F(5’-CAAAGTCCCGGCCGGGCCGAGGGTCGG-3’(SEQ ID NO：7))和SOX2-1404R(5’-CCCTCCAGTTCGCTGTCCGGCCC-3’(SEQ ID NO：8))引物，进行了PCR(94℃-3分钟→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分钟进行40个循环→72℃-7分钟)。将该PCR产物用TE稀释100倍后，对于其中的1μl，使用Sox2-F(5’-GATGTACAACATGATGGAGACGGAGC-3’(SEQ ID NO：9))和Sox2-R(5’-GTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTG-3’(SEQ ID NO：10))引物进行了PCR。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出约0.95k bp的条带，用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(QIAGEN，目录号28706)进行了纯化。克隆至pCAGGS-BSX的SwaI位点，进行测序选择出正确的克隆，从而得到了pCAGGS-BSX-SOX2。然后，以pCAGGS-BSX-SOX2作为模板，用Not I Sox-2F(5’-ATTGCGGCCGCATGTACAACATGATGGAGACG-3’(SEQ ID NO：11))和Not I Sox-2R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATGGCCGTG-3’(SEQ IDNO：12))引物进行PCR。将PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)进行纯化，然后进行Not I消化(37℃、3小时)。用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)进行纯化，克隆至Bluescript质粒载体的Not I位点，通过测序确认基因序列，选择出序列正确的克隆，从而得到了pBS-KS-Sox2。将pBS-KS-Sox2用Not I进行消化(37℃3小时)，用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出约1k bp的条带，用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(GIAGEN，目录号28706)进行了纯化。将该含Sox2基因的NotI片段克隆至pSeV18+/TSΔF载体的Not I位点，通过测序选择出序列正确的克隆，从而得到了pSeV18+Sox2/TSΔF。
(4)人转录因子KLF4基因的分离和携带有KLF4基因的仙台病毒载体质粒的构建
从Jurkat的cDNA文库，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(TAKARABio株式会社目录号R010A)并利用KIF-4-35F(5’-CCACATTAATGAGGCAGCCACCTGGC-3’(SEQ ID NO：13))和KIF-41772R(5’-GCAGTGTGGGTCATATCCACTGTCTG-3’(SEQ ID NO：14))引物，进行了PCR(94℃-3分钟→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分钟进行40个循环→72℃-7分钟)。将该PCR产物用TE稀释100倍后，对于其中的1μl，使用KIF4-F(5’-GATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCC-3’(SEQ ID NO：15))和KIF4-R(5’-GTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGAG-3’(SEQ ID NO：16))引物，进行了PCR。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出约1.4k bp的条带，用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(QIAGEN，目录号28706)进行了纯化。克隆至pCAGGS-BSX的SwaI位点，从而得到了pCAGGS-BSX-KLF4#19。测序结果可以确认pCAGGS-BSX-KLF4#19有1个位置发生了沉默突变(c19t)。因而，以pCAGGS-BSX-KLF4#19作为模板，使用NotI-KIF4-F(5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’(SEQ ID NO：17))和NotI-KIF4-R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGAGGTGGTC-3’(SEQ ID NO：18))引物进行了PCR。将PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)进行纯化，克隆pCAGGS-BSX的SwaI位点。通过测序进行确认，选择出序列正确的克隆，从而得到了pCAGGS-BSX-KLF4。然后，以pCAGGS-BSX-KLF4作为模板，使用NotI-KIF4-F(5’-ATTGCGGCCGCGACATGGCTGTCAGCGACGCGCTG-3’(SEQ ID NO：17))和NotI-KIF4-R(5’-ATTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGCGAGGTGGTC-3’(SEQ ID NO：18))引物进行了PCR。将PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)进行纯化，然后进行Not I消化(37℃3小时)。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)进行纯化，克隆至Bluescript质粒载体的Not I位点，通过测序确认基因序列，选择出序列正确的克隆，从而得到了pBS-KS-KLF4。将pBS-KS-KLF4用Not I进行消化(37℃3小时)，用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出约1.5k bp的条带，用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(GIAGEN，目录号28706)进行了纯化。将该包含KLF4基因的Not I片段克隆至pSeVl8+/TSΔF载体的Not I位点，通过测序选择出序列正确的克隆，从而得到了pSeVl8+KLF4/TSΔF。
(5)人转录因子Oct3/4基因的分离和携带了Oct3/4基因的仙台病毒载体质粒的构建
从NCCIT的cDNA文库，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(TAKARABio株式会社目录号R010A)并利用Oct-3-28F(5’-CACCATGCTTGGGGCGCCTTCCTTCC-3’(SEQ ID NO：19))和OCT3/4R301(5’-CATCGGAGTTGCTCTCCACCCCGAC-3’(SEQ ID NO：20))引物、OCT3/4F 192(5’-CCCGCCGTATGAGTTCTGTGG-3’(SEQ ID NO：21))和NotI-Oct-3/4R-DPN(5’-GCCGCGGCCGCGTTATCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAG-3’(SEQ IDNO：22))引物，进行了PCR (94℃-3分钟→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-1分钟进行35个循环→72℃-7分钟)，将Oct3/4分2个区域进行了扩增。将这2个PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)进行纯化，将其洗脱至试剂盒附带的洗脱液100μl中。洗脱液用TE稀释50倍。将这些PCR产物1μl进行混合，使用Not I-Oct-3/4F (5’-GCCGCGGCCGCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’(SEQ ID NO：23))和Not I-Oct-3/4R-DPN (5’-GCCGCGGCCGCGTTATCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAG-3’(SEQ ID NO：22))引物，进行了PCR(94℃-3分钟→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-1.5分钟进行35个循环→72℃-7分钟)。用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)纯化PCR产物，然后将其克隆至pCAGGS-BSX的SwaI位点，进行测序，选择出序列正确的克隆，从而得到了pCAGGS-BSX-Oct3/4。然后，以pCAGGS-BSX-Oct3/4作为模板，使用Not I-Oct-3/4F(5’-GCCGCGGCCGCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC-3’(SEQ IDNO：23))和Not I-Oct-3/4R(5’-GCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGCCCAGAGTGGTGAC-3’(SEQ ID NO：24))引物，进行了PCR(94℃-3分钟→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-2分钟进行25个循环→72℃-7分钟)。将PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)纯化，然后用Not I消化(37℃、2小时)。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)纯化，将该包含Oct3/4基因的Not I片段克隆至pSeV18+/TSΔF载体的Not I位点，通过测序选择出序列正确的克隆，从而得到了pSeV18+Oct3/4/TSΔF。
(6)携带人转录因子的仙台病毒载体的制作
转染的前一天，在6孔平板上播种106细胞/孔的293T/17细胞，在37℃的CO2培养箱(5％CO2条件下)中进行了培养。将该293T/17细胞与pCAGGS-NP、pCAGGS-P4C(-)、pCAGGS-L(TDK)、pCAGGS-T7、pCAGGS-F5R(WO2005/071085)以及上述所示的携带了人转录因子的仙台病毒载体质粒(pSeV18+c-Myc/TSΔF  或pSeV18+Sox2/TSΔF  或pSeV18+KLF4/TSΔF或pSeV18+Oct3/4/TSΔF)按照分别0.5μg，0.5μg，2μg，0.5μg，0.5μg和5.0μg的量进行混合，使用15μl的TransIT-LT1(Mirus)进行了转染。在37℃的CO2培养箱中培养2天。然后，将表达仙台病毒的融合蛋白质(F蛋白质)的细胞LLC-MK2/F/A(Li，H.-O.等，J.Virology 74.6564-6569(2000)，WO00/70070)按每孔106细胞的比例在转染后的293T/17细胞上叠层，在37℃的CO2培养箱中培养1天。第二天，弃去细胞的培养液，用添加有青链霉素的MEM培养基(以下称作PS/MEM)1ml洗涤细胞1次，每孔添加含2.5μg/ml胰蛋白酶的PS/MEM培养基(以下称作Try/PS/MEM)1ml，于32℃的CO2培养箱中培养2天。每3～4天更换培养基一次，并根据情况用LLC-MK2/F/A细胞进行传代来继续培养。对于一部分培养上清，通过血红细胞凝集分析确认有无载体回收，在获得充分的血红细胞凝集反应后，回收了培养上清。从回收的培养上清使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(GIAGEN，目录号52906)回收RNA，以携带的转录因子的区域为靶标进行了RT-PCR。通过测序确认所得RT-PCR产物是正确的碱基序列，制作了下述(a)～(d)的载体。
(a)携带Oct3/4基因的F基因缺失型仙台病毒载体(以下称作“SeV 18+Oct3/4/TSΔF载体”)
(b)携带Sox2基因的F基因缺失型仙台病毒载体(以下称作“SeV18+Sox2/TSΔF载体”)
(c)携带Klf4基因的F基因缺失型仙台病毒载体(以下称作“SeV18+Klf4/TSΔF载体”)
(d)携带c-Myc基因的F基因缺失型仙台病毒载体(以下称作“SeV18+c-Myc/TSΔF载体”)
<实施例1>利用携带外源基因的仙台病毒载体制作ES样细胞
首先，将8.0x105(个)的人新生儿周皮来源成纤维细胞(BJ)(ATCC(http://www.atcc.org)、CRL-2522)(人成人皮肤来源成纤维细胞HDF(Applications，Inc.106-05A-1388；36岁成人白人女性颊来源)和人胚胎肺细胞来源成纤维细胞(MRC5；ATCC，CCL-171)在DMEM(GIBCO-BRL，11995)，10％FBS(GIBCO-BRL)中于37℃、0.5％CO2培养箱中培养一天(DMEM(GIBCO-BRL，11995)，10％FB S(GIBCO-BRL))。
培养后，将MOI＝3的浓度的下述(a)～(d)的载体施用于上述培养的细胞。
(a)SeV18+Oct3/4/TSΔF载体
(b)SeV18+Sox2/TSΔF载体
(c)SeV18+Klf4/TSΔF载体
(d)SeV18+c-Myc/TSΔF载体
施用上述载体后，第二天更换培养基(DMEM(GIBCO-BRL，11995)，10％FBS(GIBCO-BRL))。
然后，在37℃、0.5％CO2培养箱中培养7～8天。然后，在于包被有明胶的10cm培养皿中制备的5.0×105(个)丝裂霉素处理过的饲养细胞(例如MEF)上培养用0.25％胰蛋白酶解离的上述导入细胞5.0×104(个)～1.0×106(个)。第二天，将DMEM、10％FBS更换为灵长类ES用培养基(ReproCell公司，RCHEMD001)(添加最浓度4ng/ml的bFGF)，在3％CO2培养箱中进行培养。培养基的更换每日或每二日进行一次。培养基可以是饲养细胞的条件化培养基。
集落在数日后出现，通过基本上培养20天左右，出现了人ES细胞样集落(图1；BJ来源)。
对图1的照片进行观察，可见与诱导前的成纤维细胞(BJ)明显不同的、与在人ES细胞中所见相同的扁平集落(实验医学Vol.26，No.5(增刊)：pp.35-40，2008)。挑取该集落，在新的饲养细胞上进行培养。这些细胞能够用ES细胞样解离液加以解离(胰蛋白酶与胶原酶混合物：ReproCell公司，RCHETP002)并进行传代和增殖。
为了明确上述初始化实验中获得的细胞是否表达ES细胞的特征性未分化标志物，进一步进行了下述实验。
<实施例2>通过上述初始化实验获得的细胞的碱性磷酸酶染色
用NBCT/BCIP(PIERCE，NBT/BCIP，1-Step，#34042)进行染色，考察ES细胞的未分化标志物碱性磷酸酶的活性，结果观察到了被染成蓝色的碱性磷酸酶阳性集落(图2)。
<实施例3>通过上述培养获得的细胞的细胞内特定基因表达量的检测
收集上述实施例2所示的碱性磷酸酶阳性的多个集落(ALP(+))，抽提了RNA(图3(a)的ALP(+))。用随机引物进行逆转录反应，并使用各自的引物进行了PCR(图3(a))。就引物序列而言，Oct3/4使用了Fw：5′-GATCCTCGGACCTGGCTAAGC-3′(SEQ    ID    NO：25)和Rv：5′-GCTCCAGCTTCTCCTTCTCCAGC-3′(SEQ ID NO：26)，Sox2使用了Fw：5′-AGCGCTGCACATGAAGGAGCACC-3′(SEQ    ID    NO：27)和Rv：5′-ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG-3′(SEQ ID NO：28)，KLF4使用了Fw：5′-GCTGCACACGACTTCCCCCTG-3′(SEQ  ID  NO：29)和Rv：5′-GGGGATGGAAGCCGGGAGGAAGCGG-3′(SEQ ID NO：30)，c-myc使用了Fw：5′-TCTCAACGACAGCAGCTCGC-3′(SEQ  ID  NO：31)和Rv：5′-CAGGAGCCTGCCTCTTTTCCACAGA-3′(SEQ ID NO：32)，Nanog使用了Fw：5′-TACCTCAGCCTCCAGCAGAT-3′(SEQ    ID    NO：33)和Rv：5′-TGCGTCACACCATTGCTATT-3′(SEQ ID NO：34)，β-肌动蛋白使用了Fw：5′-CAACCGCGAGAAGATGAC-3′(SEQ    ID    NO：35)和Rv：5′-AGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′(SEQ ID NO：36)。
此外，分离单一的ES样细胞集落，按照与上述相同的方法进行了RT-PCR(图3(b)的4BJ-1iPS)。同时，还使用引物Fw：5′-tgcccggacctccatcagagccag-3′(SEQ    ID    NO：37)和Rv：5′-tcagtccaggatggtcttgaagtctg-3’(SEQ ID NO：38)对hTERT的表达进行了检测。
检测到了在诱导前的成纤维细胞(BJ)中不能检出的导入基因的表达(Oct3/4，Sox2，Klf4)，c-Myc的表达也增加了。此外，还发现ES细胞标志物Nanog也如阳性对照胚胎性癌细胞(NCCIT)中那样被诱导表达(图3(a)的ALP(+))。Nanog是新鉴定出的同源结构域蛋白质(Cell，Vol.113，631-642，2003)，其在ES细胞、EG细胞等多能干细胞或初期胚中特异性表达，参与保持多能性与自复制能力的信号传导系统。此外，在单一集落来源的细胞中也观察到了未分化ES细胞的标志物基因表达，而且还观察到hTERT的表达，这是显示无限增殖能力的端粒末端转移酶的活化指标(图3(b)的4BJ-1iPS)。上述事实支持分离出的集落的细胞是多能干细胞。
<实施例4>使用突变型c-Myc制作诱导性多能干细胞
导入沉默突变的人转录因子c-Myc(以下称作c-rMyc)的制作
以pBS-KS-c-Myc作为模板，使用PrimeStar HS DNA聚合酶(TAKARA Bio株式会社目录号R010A)并加入突变导入用的6种引物(c-rMyc1-F(5′-CGGACGACGAGACCTTCATCAAGAACATCATCATCCAGGACTG-3′(SEQ ID NO：39))、c-rMyc1-R(5′-CAGTCCTGGATGATGATGTTCTTGATGAAGGTCTCGTCGTCCG-3′(SEQ ID NO：40))、c-rMyc2-F(5′-GAACGAGCTAAAACGGAGCTTCTTCGCCCTGCGTGACCAGATCC-3′(SEQ ID NO：41))、c-rMyc2-R(5′-GGATCTGGTCACGCAGGGCGAAGAAGCTCCGTTTTAGCTCGTTC-3′(SEQ ID NO：42))、c-rMyc3-F(5′-CCCAAGGTAGTTATCCTTAAGAAGGCCACAGCATACATCCTGTC-3′(SEQ ID NO：43))和c-rMyc3-R(5′-GACAGGATGTATGCTGTGGCCTTCTTAAGGATAACTACCTTGGG-3′(SEQ ID NO：44)))，进行了PCR(94℃-3分钟→98℃-30秒、55℃-30秒、72℃-6分钟进行25个循环→72℃-7分钟)。将PCR产物用Dpn I于37℃处理2小时。使用该反应液5μl转化大肠杆菌DH5α(ToYoBo Code No.DNA-903)。挑取16个大肠杆菌菌落，进行小量制备(minipre)，通过测序选择出序列正确的克隆，从而得到了pBS-KS-c-rMyc。将pBS-KS-c-rMyc用Not I进行消化(37℃3小时)，用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出约1.5k bp的条带，用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(GIAGEN，目录号28706)进行了纯化。将该包含c-rMyc基因的Not I片段克隆至pSeV(HNL)/TSΔF载体的Not I位点，通过测序选择出序列正确的克隆，从而得到了pSeV(HNL)-c-rMyc/TSΔF。c-rMyc的碱基序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：45和46所示。c-rMyc具有a378g、t1122c、t1125c、a1191g、和a1194g的突变。
pSeV(HNL)/TSΔF的构建如下进行。以Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNtsΔF-GFP(国际公开号：WO2003/025570)为基础，使用del GFP-Pac F(5’-GAGGTCGCGCGTTAATTAAGCTTTCACCTCAAACAAGCACAGATCATGG-3’(SEQ ID NO：47))和del GFP-Pac R(5’-GCATGTTTCCCAAGGGGAGAGTTAATTAACCAAGCACTCACAAGGGAC-3’(SEQ ID NO：48))进行了PCR(94℃-1分钟→94℃-30秒、55℃-1分、68℃-22分钟进行30个循环→68℃-7分钟)。对PCR产物连续进行Pac I处理和Dpn I处理，将其产物连接(自连接)，进行测序，选择出序列正确的除去了GFP基因的质粒，从而得到了Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNtsΔF-GFP delGFP。以该Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNtsΔF-GFP delGFP作为模板，使用HNLNOTI-F：5’-GGGTGAATGGGAAGCGGCCGCTAGGTCATGGATGG-3’(SEQ ID NO：49)和HNLNOTI-R：5’-CCATCCATGACCTAGCGGCCGCTTCCCATTCACCC-3’(SEQ ID NO：50)进行了PCR(94℃-3分钟→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-12分钟进行25个循环→72℃-7分钟)。将PCR产物用Dpn I处理后，使用该反应液20μl转化大肠杆菌DH5α(ToYoBo Code No.DNA-903)。挑取6个大肠杆菌菌落，进行小量制备，通过NotI消化选择出导入了NotI序列的质粒，然后通过测序选择出序列正确的克隆，从而得到了Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNts(HNL)-dF。然后，将该Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNts(HNL)-dF用Sal I和NheI消化，将回收的片段与将L基因中有两处突变的质粒pSeV/ΔSalINheIfrg Lmut(国际公开号：WO2003/025570)用SalI/NheI消化并回收的片段进行连接，从而得到了pSeV(HNL)/TSΔF。该载体编码与SeV18+/TSΔF相同的病毒蛋白质，且在HN基因和L基因之间具有导入基因插入位点(NotI位点)。
携带了c-rMyc的仙台病毒载体(SeV(HNL)-c-rMyc/TSΔF载体)的回收
在转染的前一天于6孔平板中播种每孔106细胞的293T/17细胞，在37℃的CO2培养箱(5％CO2条件下)中进行了培养。将该293T/17细胞分别与pCAGGS-NP，pCAGGS-P4C(-)，pCAGGS-L(TDK)，pCAGGS-T7，pCAGGS-F5R以及上述所示的携带了人转录因子c-rMyc的仙台病毒载体质粒pSeV(HNL)-c-rMyc/TSΔF各0.5μg，0.5μg，2μg，0.5μg，0.5μg和5.0μg混合，使用15μl的TransIT-LT1(Mirus)进行了转染。在37℃的CO2培养箱中培养2天。然后，将表达仙台病毒的融合蛋白质(F蛋白质)的细胞LLC-MK2/F/A按每孔106细胞的比例叠层在转染后的293T/17细胞上，在37℃的CO2培养箱中培养1天。第二天，弃去细胞的培养液，用添加有青链霉素的MEM培养基(以下称作PS/MEM)1ml洗涤细胞一次，每孔添加含2.5μg/ml胰蛋白酶的PS/MEM培养基(以下称作Try/PS/MEM)1ml，在32℃的CO2培养箱中培养2天。每3～4日更换培养基一次，根据情况用LLC-MK2/F/A细胞进行传代来继续培养。对于一部分培养上清，通过血红细胞凝集分析确认有无载体回收，在获得充分的血红细胞凝集反应后，回收了培养上清。从回收的培养上清中使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(GIAGEN，目录号52906)回收RNA，以携带的c-rMyc的区域为靶标进行RT-PCR。所得RT-PCR产物经测序确认是正确的碱基序列，从而得到了SeV(HNL)-c-rMyc/TSΔF载体。
<实施例5>携带有初始化因子的仙台病毒载体的iPS诱导效率
携带有初始化因子的仙台病毒载体的iPS诱导效率如表中所示。相对于饲养细胞上负载的仙台病毒感染细胞数，示出了形成的ES样集落数。实验像实施例1那样进行，只是载体还是用了上述的携带c-rMyc的载体。在初始化因子Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc之中，使用携带于载体的HNL位点的修饰型c-Myc(c-rMyc)时获得了最大的集落形成数。该效率是使用逆转录病毒载体的诱导效率的约10倍。此外，使用无Myc的3个因子也能够利用仙台病毒载体诱导iPS。而且，不仅是人新生儿周皮来源细胞(BJ)，利用仙台病毒载体也能够从人成人皮肤来源的细胞HDF诱导iPS，并且效率与BJ相似。该结果表明，本发明的方法是能够高效率地诱导iPS细胞的、比传统方法更为简便的方法。
[表1]
所示的结果中，“野生型”使用携带野生型c-Myc基因的SeV18+c-Myc/TSΔF载体，“HNL-rMyc”使用实施例4记载的在HN-L基因之间携带沉默突变型c-rMyc基因的pSeV(HNL)-c-rMyc/TSΔF载体。
<实施例6>iPS细胞的ES标志物表达
确认了利用携带有初始化因子的仙台病毒载体诱导的iPS细胞的ES标志物表达。iPS细胞的诱导像实施例1那样进行，只是载体还是使用了上述的携带了c-rMyc的载体。对于各ES细胞样集落，使用干细胞刀(日本医化器械)在显微镜下进行分离，并进行传代。从各株抽提RNA，像图3那样进行RT反应和PCR。利用RT-PCR确认了ES细胞标志物Oct3/4、Nanog和Tert，以及其它8个基因：GDF3、TDGF1、Zfp42、Sal4F、Dmmt3b、CABRB3、CYP26A1、FoxD3(Adewumi，O.等，Characterization of human embryonic stemcell lines bv the International Stem Cell Initiative.Nat.Biotechnol.25，803-816，2007)的表达以及初始化因子Sox2，Klf4，c-Myc的表达。方法如实施例3。在全部5个克隆中，确认了全部标志物的表达(图4)。
而且，所使用的各引物如下。对于TERT使用了TERT F2847(TGCCCGGACCTCCATCAGAGCCAG(SEQ ID NO：37))和TERT R3399(TCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCTG(SEQ ID NO：38))；对于GDF3，使用了GDF3F(GGCGTCCGCGGGAATGTACTTC(SEQ ID NO：51))和GDF3R(TGGCTTAGGGGTGGTCTGGCC(SEQ ID NO：52)；对于TDGF1，使用了TDGF1-F1(ATGGACTGCAGGAAGATGGCCCGC(SEQ ID NO：53))和TDGF 1-R567(TTAATAGTAGCTTTGTATAGAAAGGC(SEQ ID NO：54))；对于Zfp42，使用了Zfp42-F1(ATGAGCCAGCAACTGAAGAAACGGGCAAAG(SEQ ID NO：55))和Zfp42-R933(CTACTTTCCCTCTTGTTCATTCTTGTTCG(SEQ ID NO：56))；对于Sall4，使用了Sall4F(AAACCCCAGCACATCAACTC(SEQ ID NO：57))和Sall4R(GTCATTCCCTGGGTGGTTC(SEQ ID NO：58))；对于Dmmt3b，使用了Dnmt3b F(GCAGCGACCAGTCCTCCGACT(SEQ ID NO：59))和Dnmt3b R(AACGTGGGGAAGGCCTGTGC(SEQ ID NO：60))；对于GABRB3，使用了GABRB3F(CTTGACAATCGAGTGGCTGA(SEQ ID NO：61))和GABRB3R(TCATCCGTGGTGTAGCCATA(SEQ IDNO：62))；对于CYP26A1，使用了CYP26A1F(AACCTGCACGACTCCTCGCACA(SEQ ID NO：63))和CYP26A1R(AGGATGCGCATGGCGATTCG(SEQ ID NO：64))；对于FOXD3，使用了FoxD3-F418(GTGAAGCCGCCTTACTCGTAC(SEQ ID NO：65))和FoxD3-R770(CCGAAGCTCTGCATCATGAG(SEQ ID NO：66))；对于SeV-Oct3/4，使用了F6(ACAAGAGAAAAAACATGTATGG(SEQ ID NO：67))和OCT3/4R259(GAGAGGTCTCCAAGCCGCCTTGG(SEQ ID NO：68))；对于SeV-Sox2，使用了Sox2-F294(AGCGCTGCACATGAAGGAGCACC(SEQ ID NO：27))和R150(AATGTATCGAAGGTGCTCAA(SEQ ID NO：69))；对于SeV-Klf4，使用了F6(ACAAGAGAAAAAACATGTATGG(SEQ ID NO：67))和KIF4-R405(CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC(SEQ ID NO：70))；对于SeV-c-Myc，使用了F6(ACAAGAGAAAAAACATGTATGG(SEQ ID NO：67))和c-rMyc406(TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG(SEQ ID NO：71))；对于c-Myc/HNL，使用了F8424(TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG(SEQ ID NO：72))和c-rMyc406(TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG(SEQ ID NO：71))。
<实施例7>iPS细胞的端粒末端转移酶活性
为了确认利用携带有初始化因子的仙台病毒载体诱导的iPS细胞的无限增殖能力，进行了端粒末端转移酶活性的测定。iPS细胞的诱导如实施例1那样进行，只是载体还使用了上述的携带了c-rMyc的载体(记作HNL)。端粒末端转移酶活性的检测使用TRAPEZE(商标)端粒末端转移酶检测试剂盒(CHEMICON目录号S7700)进行。回收细胞，添加200μl的试剂盒附带的1X CAPS溶胞缓冲液，通过吹吸使其悬浮。在冰上培养30分钟，使用冷却微量离心机4℃、12000rpm离心20分钟。将上清160μl转移至另外的Eppendorf管中，测定了该细胞溶解液的蛋白质浓度。在进行测定之前，将相当于1μg蛋白质的量的细胞溶解液采集至Eppendorf管中，85℃热处理10分钟。将1μg进行过热处理的样品以及未进行热处理的样品用于TRAP测定。按每个测定10X TRAP反应缓冲液5.0μL，50X dNTP Mix 1.0μL，TS引物1.0μL，TRAP引物预混物1.0μL，H2O+细胞溶解液(1μg蛋白质)＝40.6μL，Taq聚合酶0.4μL的比例制备反应液，进行了PCR(30℃-30分钟、(94℃-30秒、59℃-30秒、72℃-60秒)30个循环)。在PCR反应液中添加6x上样染料，将20μL上样至10％或12.5％的聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，并使用溴化乙锭进行了染色。
在全部的iPS克隆中观察到了端粒末端转移酶活性，而在作为对照的亲本株BJ、HDF和热处理后的iPS细胞中未观察到活性(图5)。
<实施例8>iPS细胞的多分化能力
为了确认利用携带有初始化因子的仙台病毒载体诱导的iPS细胞的多分化能力，进行了体外(in vitro)的胚状体形成实验。iPS细胞的诱导如实施例1那样进行。将3个iPS克隆4BJ1、B1(BJ来源)以及7H5(HDF来源)集落用胶原酶IV(Invitrogen，17104-019)从平皿解离，将细胞团块转移至MPC包被的孔(Nunc，145383)中，在RPMI1640，10％FBS中悬浮培养数天，在显微镜下确认了胚状体的形成。仙台病毒载体诱导iPS保持了分化能力，所有的iPS均形成了胚状体，在第7天进一步分化，观察到多个囊胞状的胚状体(图6)。
为了进一步展示利用仙台病毒载体诱导的iPS细胞(SeV-iPS)的分化成三胚层的多分化能力，在体外(in vitro)确认了分化成心肌细胞(中胚层)、多巴胺能神经元(外胚层)、胰细胞(内胚层)的分化诱导。将除去了SeV载体的SeV-iPS克隆用1mg/ml胶原酶IV从饲养细胞上解离。对于心肌细胞诱导，在存在0.1mM维生素C的条件下，于包被有NPC的平板上使用DMEM、20％FBS悬浮培养6天，胚状体形成后，转移至0.1％明胶包被的平板上培养1周，获得了跳动的心肌(Takahashi，T.et.al.，Circulation 107，1912-1916，2003)。对于多巴胺能神经元诱导，同样地分离iPS细胞后，将其播种在0.1％明胶包被的平板上汇合的PA6饲养细胞(RIKEN BRC)上，用加有10％KSR、2mM L-谷氨酰胺和非必需氨基酸、以及终浓度1x 10-4M的2-巯基乙醇的GMEM培养基(Invitrogen)培养16天，用10％福尔马林溶液固定细胞后，通过抗βIII微管蛋白抗体(SantaCruz；2G10)染色和抗抗酪氨酸羟化酶抗体(Chemicon；P07101)染色，确认其为多巴胺能神经元(Kawasaki，H.等，Neuron 28，31-40(2000))。对于胰脏细胞诱导，将SeV-iPS细胞在MMC处理过的MEF饲养细胞上用补充有2％FBS和100ng/ml激活素A(activin A)的RPMIl640培养基(R&D Systems)中培养4天，再用添加有N2和B27补充剂(supplements)、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、1x10-4M 2-巯基乙醇、以及0.5mg/ml的BSA(Invitrogen)的DMEM/F12培养基培养8天。细胞用10％福尔马林溶液固定后，用抗PDX抗体(R&D Systems；AF2419)和抗SOX17抗体(R&D Systems；245013)染色，确认了其分别为胰β细胞和内胚层系细胞(D’Amour，K.A.等，Nat.Biotechnol.23，1534-1541(2005))。(图7)
此外，通过在免疫缺陷小鼠中形成畸胎瘤了确认体外(in vitro)的多分化能力。将SeV-iPS细胞接种于SCID小鼠皮下，约1个月后观察到了肿瘤形成，约2个月后采集样品，用10％福尔马林固定后进行石蜡包埋，对组织切片进行苏木精-伊红染色，确认了三胚层分化。(图8)
<实施例9>iPS细胞的启动子分析
为了评价在ES细胞中表达的Oct3/4和Nanog基因启动是否也在iPS细胞中活化，采用以下的亚硫酸氢盐测序法进行了甲基化分析。结果显示，在作为对照的亲本株BJ和HDF中观察到了Oct3/4启动子(-2330～-2110区域)和Nanog启动子(-685～-120区域)的高度甲基化，而在SeV-iPS细胞的各克隆中，这些启动子高度去甲基化。由此可以明确：与ES细胞相似，SeV-iPS细胞中Oct3/4和Nanog启动子也被活化(图9)。
(亚硫酸氢盐测序法)
使用QIAamp DNA迷你试剂盒(50)(GIAGEN，目录号：51304)，按试剂盒的规程从iPS细胞抽提了基因组DNA。然后，以1μg抽提的基因组DNA为基础，使用BisulFast甲基化DNA检测用DNA修饰试剂盒(东洋纺，目录号：MDD-101)按试剂盒的规程进行亚硫酸氢盐(bisulfite)修饰。以经亚硫酸氢盐修饰的基因组DNA作为模板，以Oct3/4基因及Nanog基因的启动子区域为靶标使用特异性引物进行了PCR。将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，将目的条带用QIAquick凝胶抽提试剂盒(GIAGEN，目录号：28704)进行纯化。对于纯化的PCR产物，使用pGEM-T Easy Vector System I(PROMEGA，目录号：A1360)按试剂盒的规程进行TA-克隆。然后，使用以Oct3/4基因和Nanog基因的启动子区域作为靶标的特异性引物进行菌落PCR。进行琼脂糖凝胶电泳，选择出约10个克隆的条带大小正确的克隆。从这些克隆通过小量制备抽提质粒DNA，并使用T7引物和SP6引物进行测序。与亚硫酸氢盐修饰后的靶标序列进行比较，评价启动子区域的甲基化状态。
Oct3/4基因启动子区域扩增用和菌落PCR用引物(J.Biol.Chem.，2005，Vol.280，6257-6260)
mOct4-5F：5’-AATAGATTTTGAAGGGGAGTTTAGG-3’(SEQ IDNO：73)
mOct4-5R：5’-TTCCTCCTTCCTCTAAAAAACTCA-3’(SEQ ID NO：74)
Nanog基因启动子区域扩增用和菌落PCR用引物(Stem cell Research，Vol.1，105-115；Cell，2007，Vol.131，861-72)
Nanog-z1-L：5’-GGAATTTAAGGTGTATGTATTTTTTATTTT-3’(SEQID NO：75)
mehNANOG-F1-AS：5’-AACCCACCCTTATAAATTCTCAATTA-3’(SEQID NO：76)
测序用引物
T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO：77)
SP6：5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’(SEQ ID NO：78)
使用的试剂盒
BisulFast甲基化DNA检测用DNA修饰试剂盒
(东洋纺，目录号：MDD-101)
<实施例10>iPS细胞的基因表达分析
将利用仙台病毒载体诱导的iPS细胞(SeV-iPS细胞)的基因表达谱与亲本株BJ细胞、人ES细胞和已经建立的人iPS细胞(GSM241846；Takahashi，K.等，Cell，131，1-12，2007)进行了比较。使用Rneasy迷你试剂盒(Qiagen)抽提SeV-iPS与BJ细胞的总RNA，使用Agilent公司的Quick Amp标记试剂盒，从cDNA合成花青(Cyanine)染料标记的cRNA，使用Agilent公司基因表达杂交试剂盒，在全人基因组寡核苷酸微阵(4x 44K)上进行17小时的杂交，洗涤后用Agilent微阵列扫描仪读取DNA微阵列的图像，使用特征提取软件(v.9.5.3.1)将各点的荧光信号数值化并进行了分析。对芯片上的总共41078个探针(除去重复的)进行了分析(BioMatrix研究所)。将SeV-iPS细胞的基因表达下列对照的基因表达进行了比较，这些对照的信息获自GEODetaSets：人ES细胞hES-H9(GSM194390；Teser P.J.，et al，Nature 448，196-199，2007)和人iPS细胞hiPS，其是从HDF诱导的(GSM241846；Takahashi，K.等，Cell，131，1-12，2007)。其结果是，SeV-iPS与BJ、人ES细胞、人iPS细胞分别具有r＝8732、r＝0.9658、r＝0.9580的相关性，ES细胞中表达的Nanog，Sox2，Oct3/4基因在SeV-iPS中也表达。虽然与BJ非相关，但SeV-iPS分别与人ES细胞或人iPS细胞处于相关线上，且它们完全一致(图9)。
<实施例11>导入了温度依赖失活突变的载体的制作
(载体的制作方法)
用于制作导入了温度依赖失活突变的仙台病毒载体的质粒的构建
以Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNtsΔF-GFP(WO2003/025570)为模板，使用L Y942H-F(5’-CAAATGTTGGAGGATTCAACCACATGTCTACATCTAGATG-3’(SEQ ID NO：79))、L Y942H-R(5’-CATCTAGATGTAGACATGTGGTTGAATCCTCCAACATTTG-3’(SEQ ID NO：80))的组合，以及L Y942H-F、L Y942H-R、P2-F(5′-CATCACAGCTGCAGGTGGCGCGACTGACAAC-3′(SEQ ID NO：81))、和P2-R(5’-GTTGTCAGTCGCGCCACCTGCAGCTGTGATG-3’(SEQ ID NO：82))的组合进行了PCR(94℃-3分钟→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-11分钟进行25个循环→72℃-7分钟)。将PCR产物用Dpn I于37℃消化1小时，用该反应液20μl转化大肠杆菌DH5α(ToYoBo Code No.DNA-903)。分离生长出的菌落，进行小量制备后，通过进行测序选择出正确的克隆，分别得到了Litmus38TSΔF-GFP-LY942H和Litmus38T SΔF-GFP-P2LY942H。
将Litmus38TSΔF-GFP-P2LY942H进行StuI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出1.9kbp的条带并进行纯化。将Litmus SalINheIfrgPmutMtsHNtsΔF-GFP进行StuI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出9.8kbp的条带并纯化。将该纯化后的2个片段连接，从而得到了Litmus38T SΔF-GFP-P2。
将Litmus38TSΔF-GFP-P2LY942H进行NcoI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出7.1kbp的条带并进行纯化。将Litmus SalINheIfrgPmutMtsHNtsΔF-GFP delGFP进行NcoI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出3.7kbp的条带并进行纯化。将纯化后的各DNA连接，通过菌落PCR和NcoI-PacI双重消化对结构进行确认，从而得到了Litmus38TSΔF-P2LY942HΔGFP。
将pSeV(HNL)/TSΔF进行NcoI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出3.7kbp  的条带并进行纯化。将该条带与上述的Litmus38TSΔF-GFP-P2LY942H的7.1kbp的NcoI片段进行连接，从而得到了Litmus38TSΔF-P2LY942H(HNL)ΔGFP。
将Litmus38TSΔF-GFP-P2进行NcoI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，切出7.1kbp的条带并进行纯化。将该条带与上述的Litmus SalINheIfrgPmutMtsHNtsΔF-GFP delGFP的NcoI消化纯化片段(3.7kbp)或pSeV(HNL)/TSΔF的NcoI消化纯化片段(3.7kbp)进行连接，分别得到了Litmus38TSΔF-P2ΔGFP和Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFP。
以pSeV/ΔSalINheIfrg Lmut(WO2003/025570)作为模板，使用L L1361C-F(5’-GGTTCCTTAGGGAAGCCATGTATATTGCACTTACATCTTA-3’(SEQ ID NO：83))和L L1361C-R(5’-TAAGATGTAAGTGCAATATACATGGCTTCCCTAAGGAACC-3’(SEQ ID NO：84))的组合、L L1558I-F(5’-CCTGTGTATGGGCCTAACATCTCAAATCAGGATAAGATAC-3’(SEQ ID NO：85))和L L 1558I-R(5’-GTATCTTATCCTGATTTGAGATGTTAGGCCCATACACAGG-3’(SEQ ID NO：86))的组合、以及L L1361C-F、L L1361C-R、LL1558I-F和L L1558I-R的组合进行了PCR (94℃-3分钟→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-9分钟进行25个循环→72℃-7分钟)。将PCR产物用Dpn I于37℃消化1小时，用该反应液20μl转化大肠杆菌DH5α(ToYoBo CodeNo.DNA-903)。分离生长出的集落，进行小量制备后，通过进行测序选择出正确的克隆，分别得到了pSeV/TSΔF-Linker L 1361C、pSeV/TSΔF-LinkerL1558I、pSeV/TSΔF-Linker L1361CL1558I。
将Litmus38TSΔF-P2LY942H(HNL)ΔGFP和pSeV/TSΔF-LinkerL1361CL1558I分别进行SalI-NheI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出8.0kbp、8.3kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV(HNL)/TS8ΔF。
pSeV(HNL)/TS8ΔF和pSeV(HNL)/TSΔF进行NotI-XhoI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出4.9kbp、11.4kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV(HNL)/TS7ΔF。在pSeV(HNL)/TS7ΔF载体的Not I位点中导入将pBS-KS-c-rMyc用NotI消化并切出和纯化而得到的含c-rMyc基因的Not I片段，从而得到了pSeV(HNL)-c-rMyc/TS7ΔF。
将Litmus38TSΔF-P2LY942HΔGFP和pSeV/TSΔF-Linker L1361CL1558I分别进行SalI-NheI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出8.0kbp、8.3kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段而得到了pSeV18+BSSHII/TS8ΔF。将该pSeV18+BSSHII/TS8ΔF和pSeV18+Oct3/4/TSΔF分别用AatII-SphI进行消化，切出15.2kbp和2.3kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV18+Oct3/4/TS8ΔF。将pSeV18+Oct3/4/TS8ΔF和pSeV18+/TSΔF分别进行PacI-SphI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出13.3kbp、4.2kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV18+Oct3/4/TS7ΔF。然后，将pSeV18+Oct3/4/TS7ΔF进行NotI消化，用琼脂糖凝胶电泳进行分离后，切出16.4kbp的条带并进行纯化。将该纯化物与将前述的pBS-KS-Sox2、pBS-KS-KLF4、pBS-KS-c-rMyc用NotI消化并进行切出和纯化而得到的含Sox2、KLF4、c-rMyc基因的Not I片段分别连接，从而得到了pSeV18+Sox2/TS7ΔF、pSeV18+KLF4/TS7ΔF、pSeV18+c-rMyc/TS7ΔF。
将Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFP和pSeV/TSΔF-Linker L1361C分别进行SalI-NheI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出8.0kbp、8.3kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV(HNL)/TS14ΔF。在该pSeV(HNL)/TS14ΔF的Not I位点导入将pBS-KS-c-rMyc进行NotI消化、并进行切出和纯化而得到的含c-rMyc基因的Not I片段，从而得到了pSeV(HNL)-c-rMyc/TS14ΔF。
将Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFP和pSeV/TSΔF-Linker L1558I分别进行SalI-NheI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出8.0kbp、8.3kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV(HNL)/TS13ΔF。将pBS-KS-c-rMyc进行NotI消化、并进行切出和纯化而得到的含c-rMyc基因的Not I片段导入该pSeV(HNL)/TS13ΔF的Not I位点，从而得到了pSeV(HNL)-c-rMyc/TS 13ΔF。
将Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFP和pSeV/TSΔF-Linker L1361CL1558I分别进行SalI-NheI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出8.0kbp、8.3kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV(HNL)/TS15ΔF。在该pSeV(HNL)/TS15ΔF的Not I位点导入将pBS-KS-c-rMyc进行NotI消化、并进行切出和纯化而得到的含c-rMyc基因的Not I片段，从而得到了pSeV(HNL)-c-rMyc/TS15ΔF。
将Litmus38TSΔF-P2ΔGFP和pSeV/TSΔF-Linker L1361C分别进行SalI-NheI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出8.0kbp、8.3kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV18+BSSHII/TS14ΔF。将该pSeV18+BSSHII/TS14ΔF AatII-SphI进行消化，切出15.2kbp的条带并进行纯化。将该纯化片段与前述的pSeV18+Oct3/4/TSΔF的AatII-SphI片段(2.3kbp)进行连接，从而得到了pSeV18+Oct3/4/TS14ΔF。然后，将pSeV18+Oct3/4/TS14ΔF进行NotI消化，用琼脂糖凝胶电泳进行分离后，切出16.4kbp的条带并进行纯化。将该纯化物与将前述的pBS-KS-Sox2、pBS-KS-KLF4、pBS-KS-c-rMyc用NotI消化、并进行切出和纯化而得到的含Sox2、KLF4、c-rMyc基因的Not I片段分别连接，从而得到了pSeV18+Sox2/TS14ΔF、pSeV18+KLF4/TS14ΔF、pSeV18+c-rMyc/TS14ΔF。
将Litmus38TSΔF-P2ΔGFP和pSeV/TSΔF-Linker L1558I分别进行SalI-NheI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出8.0kbp、8.3kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV18+BSSHII/TS13ΔF。将该pSeV18+BSSHII/TS13ΔF用AatII-SphI进行消化，切出15.2kbp的条带并进行纯化。将该纯化片段与前述的pSeV18+Oct3/4/TSΔF的AatII-SphI片段(2.3kbp)进行连接，从而得到了pSeV18+Oct3/4/TS13ΔF。然后，将pSeV18+Oct3/4/TS13ΔF进行NotI消化，用琼脂糖凝胶电泳进行分离后，切出16.4kbp的条带并进行纯化。将该纯化物与前述的含Sox2、KLF4、c-rMyc基因的Not I片段分别连接，从而得到了pSeV18+Sox2/TS13ΔF、pSeV18+KLF4/TS13ΔF、pSeV 18+c-rMyc/TS13ΔF。
将Litmus38TSΔF-P2ΔGFP和pSeV/TSΔF-Linker L1361CL1558I分别进行SalI-NheI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出8.0kbp、8.3kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV18+BSSHII/TS15ΔF。将该pSeV18+BSSHII/TS15ΔF用AatII-SphI进行消化，切出15.2kbp的条带并进行纯化。将该纯化片段与前述的pSeV18+Oct3/4/TSΔF的AatII-SphI片段(2.3kbp)进行连接，从而得到了pSeV18+Oct3/4/TS15ΔF。然后，将pSeV18+Oct3/4/TS15ΔF进行NotI消化，用琼脂糖凝胶电泳进行分离后，切出16.4kbp的条带并进行纯化。将该纯化物与前述的含Sox2、KLF4、c-rMyc基因的Not I片段分别进行连接，从而得到了pSeV18+Sox2/TS15ΔF、pSeV18+KLF4/TS15ΔF、pSeV18+c-rMyc/TS15ΔF。
将Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFP和pSeV/ΔSalINheIfrg Lmut分别进行SalI-NheI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出8.0kbp、8.3kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV(HNL)/TS12ΔF。在该pSeV(HNL)/TS12ΔF的Not I位点导入将pBS-KS-c-rMyc进行NotI消化、并进行切出和纯化而得到的含c-rMyc基因的Not I片段，从而得到了pSeV(HNL)-c-rMyc/TS12ΔF。
将Litmus38TSΔF-P2ΔGFP和pSeV/ΔSalINheIfrg Lmut分别进行于SalI-NheI消化后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，分别切出8.0kbp、8.3kbp的条带并进行纯化。连接这些纯化片段，从而得到了pSeV18+BSSHII/TS12ΔF。将该pSeV18+BSSHII/TS12ΔF用AatII-SphI进行消化，切出15.2kbp的条带并进行纯化。将该纯化片段与前述的pSeV18+Oct3/4/TSΔF的AatII-SphI片段(2.3kbp)进行连接，从而得到了pSeV18+Oct3/4/TS12ΔF。然后，将pSeV18+Oct3/4/TS12ΔF进行NotI消化，用琼脂糖凝胶电泳进行分离后，切出16.4kbp的条带并进行纯化。将该纯化物与前述的含Sox2、KLF4、c-rMyc基因的Not I片段分别进行连接，从而得到了pSeV18+Sox2/TS12ΔF、pSeV18+KLF4/TS12ΔF、pSeV18+c-rMyc/TS12ΔF。
(导入了温度依赖失活突变的F基因缺失型仙台病毒载体的回收)
转染的前一天，在6孔平板上播种每孔106细胞的293T/17细胞，在37℃的CO2培养箱(5％CO2条件下)中进行了培养。将该293T/17细胞与pCAGGS-NP，pCAGGS-P4C(-)，pCAGGS-L(TDK)，pCAGGS-T7，pCAGGS-F5R(WO2005/071085)以及上述所示的携带了人转录因子的导入了温度依赖失活突变的F基因缺失型仙台病毒载体质粒按分别0.5μg，0.5μg，2μg，0.5μg和5.0μg的量进行混合，使用15μl的TransIT-LT1(Mirus)进行了转染。在37℃的CO2培养箱中培养2～3天。然后，将表达仙台病毒的融合蛋白质(F蛋白质)的细胞LLC-MK2/F/A按每孔106细胞的比例层叠在转染后的293T/17细胞上，在37℃的CO2培养箱中培养1天。第二天，弃去细胞的培养液，用添加有青链霉素的MEM培养基(以下称作PS/MEM)1ml洗涤细胞1次，每孔添加含2.5μg/ml的胰蛋白酶的PS/MEM培养基(以下称作Try/PS/MEM)1ml，在32℃的CO2培养箱中进行培养。每3～4日更换培养基一次，在某些情况下使用LLC-MK2/F/A细胞进行传代，来继续培养。对于一部分培养上清，通过血红细胞凝集分析确认有无载体回收，在获得充分的血红细胞凝集反应后，回收了培养上清。从回收的培养上清使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(GIAGEN，目录号52906)回收RNA，以携带的基因的区域为靶标进行RT-PCR。通过测序确认所得RT-PCR产物是正确的碱基序列，从而得到了携带了各种人转录因子的导入了温度依赖失活突变的F基因缺失型仙台病毒载体。
<实施例12>载体的去除
从SeV-iPS细胞得到了SeV载体自然除去的集落。此外，使用温度敏感性载体于37℃诱导iPS，然后变温为39℃，从而得到了仙台病毒阴性克隆。而且，以通过SeV感染而在细胞表面表达的HN抗原作为指标，通过使用抗HN抗体进行阴性选择，得到了SeV阴性的克隆。
1.自然脱落
对SeV-iPS细胞进行传代培养，载体自然除去的细胞增多。从SeV-iPS细胞集落抽提RNA，进行RT-PCR，对SeV来源的外源基因表达进行确认，在18+的位置(作为基因组的最3′侧的NP基因的3′侧)插入SeV-Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc(c-rMyc和c-Myc)的情况下(分别为SeV18+Oct3/4/TSΔF、SeV18+Sox2/TSΔF、SeV18+Klf4/TSΔF、SeV18+c-Myc/TSΔF(或SeV18+c-rMyc/TSΔF))，外源基因随着细胞分裂而被稀释，往往减少到只有其中1种或2种被表达，而野生型c-Myc由于复制的劣势最先被除去。此外，在HNL的位置插入了c-rMyc的情况下(HNL-c-rMyc/TSΔF)，由于相对于18+的位置插入目的因子的载体的复制优势，多数情况下仅残留携带了Myc基因的载体，而且还获得了导入的外源性初始化因子完全被除去的克隆。除了RT-PCR，在蛋白水平上利用抗SeV-NP抗体的Western印迹也显示完全除去(图10)。RT-PCR的引物如实施例6所示。
2.利用抗HN抗体的去除
SeV载体会因基于细胞分裂的稀释和传代而自然减少，但积极地收集SeV载体阴性细胞也是可能的。以因SeV感染而在细胞表面表达的HN抗原作为指标，利用抗HN抗体获得除去了SeV载体的克隆是可能。对细胞经过胶原酶IV和胰蛋白酶处理、悬浮操作而形成小细胞群体，使之与抗HN单克隆抗体(IL4.1)在冰上反应30分钟，用培养基进行洗涤后，使之与第2抗体例如结合于磁珠的抗小鼠IgG1抗体(抗小鼠IgG1颗粒，BD)同样在冰上反应30分钟，将非结合级分收集到磁铁(Imagnet细胞分离磁铁，BD)上(阴性选择)。其结果是，获得了SeV载体的表达减弱的细胞群体，通过反复进行相同操作，获得了载体阴性的iPS细胞(图11)。此外，还可以利用FACS收集抗HN抗体阴性群体。
3.利用温度敏感性载体去除SeV的技术
TS 7：L(Y942H/L1361C/L1558I)
TS 13：P(D433A/R434A/K437A)，L(L1558I)
TS 14：P(D433A/R434A/K437A)，L(L1361C)
TS 15：P(D433A/R434A/K437A)，L(L1361C/L1558I)
将上述突变导入SeV18+/TSΔF载体。这些载体是温度敏感性，其复制受到变温(temperature shift)的抑制。具体地说，携带的基因在32℃表达最强，在35～36℃也能够表达，在37℃表达稍弱，而在38.5℃或39℃不表达。
在这些载体上同样地(如此前所述)携带初始化因子，于37℃诱导iPS，在制成iPS细胞后进行变温，能够容易地将SeV除去。
4.HNL-Myc的复制优势
如1所示，在使用SeV-18+Oct3/4，Klf4，Sox2与SeV-HNL-c-rMyc的组合进行iPS诱导的情况下，相对于携带插入至18+的位置(NP基因的上游)的其它因子的SeV载体，c-rMyc基因插入在HN和L之间的SeV-HNL-c-rMyc在复制上具有优势，且c-Myc对细胞增殖是有利的，由于该性质，携带于SeV的4个因子中，只有SeV-HNL-c-rMyc残留到最后。此外，利用SeV-HNL-c-rMyc诱导的SeV-iPS细胞的增殖能力良好，因而容易建立克隆；且最后残留的载体只有1个，因而其也容易自然除去。因此，为了使用温度敏感株利用变温进行去除，仅使HNL-c-rMyc成为温度敏感性即可，实际上，残留到最后的HNL-c-rMyc载体能够通过变温而除去(图12、13)。
5.利用温度敏感性SeV载体制作载体除去容易的iPS细胞
使用在上述TS7、TS13或TS15的HN-L之间插入有c-rMyc基因的载体(TS7ΔF、TS13ΔF、TS15ΔF)和在18+的位置上分别插入有Oct3/4，Klf4，Sox2的TS载体，从成纤维细胞(BJ细胞)进行iPS诱导，由于上述的SeV-HNL-Myc复制优势，仅有温度敏感性的SeV-HNL-Myc残留。此外，温度敏感株在37℃的表达弱，在仅有SeV-HNL-Myc的情况下，残留至最后的载体也很快地被除去。
这样进行iPS诱导，在诱导后1个月以内，使用TS/18+Oct3/4，Sox2，Klf4/TSΔF与TS13ΔF/HNL-c-rMyc的组合时有4/6的克隆；使用TS/18+Oct3/4，Sox2，Klf4/TSΔF与TS 15ΔF/HNL-c-rMyc的组合时有3/6的克隆、使用TS/18+Oct3/4，Sox2，Klf4/TSΔF与TS7ΔF/HNL-c-rMyc的组合时有2/12的克隆成为SeV载体阴性(图13)。所得SeV阴性克隆全部表达人ES细胞特异性标志物(图14)。
通过该方法，能够容易地获得SeV阴性的、无损的iPS细胞、而对染色体不造成损伤。
<实施例13>
除了上述TSΔF载体以外，在实施例12的5中于TS7ΔF、TS13ΔF、TS15ΔF中携带初始化因子(Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc)也能够进行iPS细胞的诱导，而且如下地确认了使用其它的ΔF载体骨架L突变体Y1214F(WO2008/096811)也能够同样地诱导iPS细胞。
(LmΔF/SeV的构建)
质粒构建
将pSeV18+LacZ/ΔF-1214(WO2008/096811)用NotI进行消化后，进行了纯化。然后进行连接，选择未加入LacZ基因的质粒，从而得到了pSeV18+/ΔF-1214(“Lm(Y1214F)ΔF/SeV”或简记作“LmΔF/SeV”)。然后，将pSeV18+/ΔF-1214用NotI消化后进行纯化，分别携带前述的初始化4因子Oct3/4，Klf4，Sox2和c-rMyc的NotI片段，从而构建了病毒载体制作用的质粒pSeV18+Oct3/4/ΔF-1214、pSeV18+Sox2/ΔF-1214、pSeV18+KLF4/ΔF-1214、pSeV18+c-rMyc/ΔF-1214。
LmΔF/SeV仙台病毒载体的回收
转染的前一天，在6孔平板上播种每孔106细胞的293T/17细胞，在37℃的CO2培养箱(5％CO2条件下)中进行了培养。将该293T/17细胞与pCAGGS-NP，pCAGGS-P4C(-)，pCAGGS-L(TDK)，pCAGGS-T7，pCAGGS-F5R(WO2005/071085)以及上述所示的携带了人转录因子的LmΔF/SeV仙台病毒载体质粒以分别0.5μg，0.5μg，2μg，0.5μg和5.0μg的量进行混合，使用15μl的TransIT-LT1(Mirus)进行了转染。在37℃的CO2培养箱中培养2～3天。然后，将表达仙台病毒的融合蛋白质(F蛋白质)的细胞LLC-MK2/F/A按每孔106细胞的比例叠层在转染后的293T/17细胞上，在37℃的CO2培养箱中培养1天。第二天，弃去细胞的培养液，用添加有青链霉素的MEM培养基(以下称作PS/MEM)1ml洗涤细胞1次，每孔添加含2.5μg/ml的胰蛋白酶的PS/MEM培养基(以下称作Try/PS/MEM)1ml，在32℃的CO2培养箱中进行培养。每3～4日更换培养基1次，根据情况用LLC-MK2/F/A细胞进行传代，来继续培养。对于一部分培养上清，通过血红细胞凝集分析确认有无载体回收，在获得充分的血红细胞凝集反应后，回收了培养上清。从回收的培养上清使用QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(GIAGEN，目录号52906)回收RNA，以携带的基因的区域为靶标进行RT-PCR。所得RT-PCR产物通过测序确认是正确的碱基序列，从而得到了携带有各种人转录因子的LmΔF/SeV仙台病毒载体。
对于LmΔF/SeV，同样地将4种初始化因子Oct3/4，Klf4，Sox2和c-rMyc(TSΔF)插入18+位置，制作了病毒载体。
使携带4种因子的LmΔF/SeV感染人成纤维细胞BJ，如TSΔF SeV载体那样地进行iPS诱导，结果是，与使用TSΔF/SeV时同样，出现了iPS样集落，并表达ES标志物ALP(图15A)。这表明，并不限于一种载体，使用仙台病毒载体的其它骨架也能够进行iPS诱导。
<实施例14>不使用饲养细胞(feeder)的iPS诱导方法
由于仙台病毒载体高表达初始化因子，因此不仅可以通过传统的在饲养细胞上诱导的方法，通过不使用饲养细胞(feeder)的方法也能够进行诱导。用携带了初始化因子的SeV感染细胞后，在塑料平皿上进行诱导15天，从出现iPS样集落时开始，将培养液从DMEM/10％FBS更换为ES细胞用的培养基，在集落变得充分大之后，用胶原酶(collagenase)IV将细胞从平皿上解离，重新播种在新的饲养细胞上，成功建立了iPS细胞。
<实施例15>利用Thomson的4种因子(Oct3/4，Sox2，Lin28，Nanog)进行iPS诱导
除了Yamanaka的4种因子(Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc)(Takahashi，K.和Yamanaka S.，Cell 126，663-676，2006)以外，将Thomson的4种因子(Oct3/4，Sox2，Lin28，Nanog)(Yu J等，Science.2007，318(5858)：1917-20)插入TSΔF/SeV，也能够从人成纤维细胞诱导iPS细胞(图15B)。以下给出Nanog和Lin28载体的构建实例。
(1)人转录因子Nanog的分离、携带有Nanog的仙台病毒载体质粒的构建以及携带有Nanog的仙台病毒载体的制作
从NCCIT细胞的cDNA文库，使用PrimeStar(商标)HS DNA聚合酶(TAKARA Bio株式会社目录号R010A)并利用NANOF-F(5’-CCACCATGAGTGTGGATCCAGCTTGTCC-3’(SEQ  ID  NO：87))和NANOF-R(5’-CTCACACGTCTTCAGGTTGCATGTTC-3’(SEQ ID NO：88))引物，进行了PCR。PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)进行了纯化。克隆至Bluescript质粒载体的EcoRV位点，通过测序确认基因序列，选择出序列正确的克隆，从而得到了pBS-KS-Nanog。
然后，以pBS-KS-Nanog为模板，使用NotI-Nanog-F(5’-GCGCGGCCGCACCACCATGAGTGTGGATCCAGCTTGTCC-3’(SEQ ID NO：89))和NotI-Nanog-R(5’-GCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCACACGTCTTCAGGTTGCATGTTCATGGAGTAGTTTAG-3’(SEQ ID NO：90))引物进行PCR。PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)纯化，然后用Not I消化。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)进行纯化，克隆至pSeVl8+/TSΔF载体的Not I位点，通过测序选择出序列正确的克隆，从而得到了pSeV18+Nanog/TSΔF。使用该质粒，采用前述的方法制备了携带Nanog基因的F基因缺失型仙台病毒载体(以下称作“SeV18+Nanog/TSΔF载体”)。
(2)人Lin 28的分离、携带有Nanog的仙台病毒载体质粒的构建以及携带有Lin 28的仙台病毒载体的制作
从NCCIT细胞的cDNA文库，使用PrimeStar(商标)HS DNA聚合酶(TAKARA Bio株式会社目录号R010A)并利用LIN28-F(5’-CCACCATGGGCTCCGTGTCCAACCAGC-3’(SEQ ID NO：91))和LIN28-R(5’-GTCAATTCTGTGCCTCCGGGAGC-3’(SEQ ID NO：92))引物进行PCR。PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)进行纯化，克隆至B1uescript质粒载体的EcoRV位点，通过测序确认基因序列，选择出序列正确的克隆，从而得到了pBS-KS-Lin28。然后，以pBS-KS-Lin 28为模板，使用NotI-Lin28-F(5’-GCGCGGCCGCACCACCATGGGCTCCGTGTCCAACCAGC-3’(SEQ ID NO：93))和NotI-Lin28-R(5’-GCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAATTCTGTGCCTCCGGGAGCAGGGTAGGGCTGTG-3’(SEQ ID NO：94))引物进行PCR。PCR产物用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)纯化，然后用Not I消化。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(GIAGEN，目录号28106)纯化，克隆至pSeV18+/TSΔF载体的Not I位点，通过测序选择出序列正确的克隆，从而得到了pSeV18+Lin 28/TSΔF。使用该质粒，采用前述的方法制备了携带Lin28基因的F基因缺失型仙台病毒载体(称作“SeV18+Lin 28/TSΔF载体”)。
工业实用性
根据本发明，能够在不在宿主细胞的染色体上整合基因的条件下制造ES样细胞(多能干细胞)。所得ES样细胞在染色体上未整合外源基因，因此，可以期待其不仅适用于利用本细胞的试验、研究，在疾病治疗方面也能够避免免疫排斥问题和伦理层面问题，进而能够避免基于遗传毒性的癌化危险性。

Claims (18)

1.一种用于在体细胞的初始化中向该细胞中导入基因的方法，其中使用一种或多种具有温度敏感性突变的仙台病毒载体将
至少下述三种基因：Oct3/4、Klf4和Sox2基因；
至少下述四种基因：Oct3/4、Klf4、Sox2和Myc基因；或
至少下述四种基因：Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28基因
导入所述细胞，其中所述仙台病毒载体缺少F基因，并且包含下述突变：(a)M蛋白中的G69E、T116A和A183S，HN蛋白中的A262T、G264R和K461G，P蛋白中的L511F，以及L蛋白中的N1197S和K1795E，且(1)所述方法还包括在初始化后通过在37.5℃-39℃培养所述细胞来除去所述载体，或(2)所述仙台病毒载体还具有下述突变：(i)L蛋白中的Y942H、L1361C和L1558I；(ii)P蛋白中的D433A、R434A和K437A，以及L蛋白中的L1558I；(iii)P蛋白中的D433A,R434A和K437A，以及L蛋白中的L1361C；或(iv)P蛋白中的D433A、R434A和K437A；以及L蛋白中的L1558I和L1361C；或(b)L蛋白中的Y1214F。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述初始化是诱导多能干细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述仙台病毒载体缺少F基因，并且包含下述突变：M蛋白中的G69E、T116A和A183S，HN蛋白中的A262T、G264R和K461G，P蛋白中的L511F，以及L蛋白中的N1197S和K1795E。
4.权利要求3的方法，其中所述仙台病毒载体还具有下述突变：
(i)L蛋白中的Y942H、L1361C和L1558I；
(ii)P蛋白中的D433A、R434A和K437A，以及L蛋白中的L1558I；
(iii)P蛋白中的D433A,R434A和K437A，以及L蛋白中的L1361C；或
(iv)P蛋白中的D433A、R434A和K437A；以及L蛋白中的L1558I和L1361C。
5.权利要求3的方法，其中所述方法还包括在初始化后通过在37.5℃-39℃培养所述细胞来除去所述载体。
6.一种或多种具有温度敏感性突变的仙台病毒载体在制造用于初始化体细胞的药物中的用途，其中所述药物用于导入
至少下述三种基因：Oct3/4、Klf4和Sox2基因；
至少下述四种基因：Oct3/4、Klf4、Sox2和Myc基因；或
至少下述四种基因：Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28基因，
其中所述仙台病毒载体缺少F基因，并且包含下述突变：(a)M蛋白中的G69E、T116A和A183S，HN蛋白中的A262T、G264R和K461G，P蛋白中的L511F，以及L蛋白中的N1197S和K1795E，且(1)所述药物用于在初始化后通过在37.5℃-39℃培养所述细胞进一步除去所述载体，或(2)所述仙台病毒载体还具有下述突变：(i)L蛋白中的Y942H、L1361C和L1558I；(ii)P蛋白中的D433A、R434A和K437A，以及L蛋白中的L1558I；(iii)P蛋白中的D433A,R434A和K437A，以及L蛋白中的L1361C；或(iv)P蛋白中的D433A、R434A和K437A；以及L蛋白中的L1558I和L1361C；或(b)L蛋白中的Y1214F。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述初始化体细胞是诱导多能干细胞。
8.权利要求6的用途，其中所述仙台病毒载体缺少F基因，并且包含下述突变：M蛋白中的G69E、T116A和A183S，HN蛋白中的A262T、G264R和K461G，P蛋白中的L511F，以及L蛋白中的N1197S和K1795E。
9.权利要求8的用途，其中所述仙台病毒载体还具有下述突变：
(i)L蛋白中的Y942H、L1361C和L1558I；
(ii)P蛋白中的D433A、R434A和K437A，以及L蛋白中的L1558I；
(iii)P蛋白中的D433A,R434A和K437A，以及L蛋白中的L1361C；或
(iv)P蛋白中的D433A、R434A和K437A；以及L蛋白中的L1558I和L1361C。
10.权利要求8的用途，其中所述药物用于在初始化后进一步通过在37.5℃-39℃培养所述细胞来除去所述载体。
11.一种制造经初始化的细胞的方法，该方法包括使一种或多种仙台病毒载体接触体细胞的步骤，所述仙台病毒载体具有温度敏感性突变且编码
至少下述三种基因：Oct3/4、Klf4和Sox2基因；
至少下述四种基因：Oct3/4、Klf4、Sox2和Myc基因；或
至少下述四种基因：Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28基因，
其中所述仙台病毒载体缺少F基因，并且包含下述突变：(a)M蛋白中的G69E、T116A和A183S，HN蛋白中的A262T、G264R和K461G，P蛋白中的L511F，以及L蛋白中的N1197S和K1795E，且(1)所述方法还包括在初始化后通过在37.5℃-39℃培养所述细胞来除去所述载体，或(2)所述仙台病毒载体还具有下述突变：(i)L蛋白中的Y942H、L1361C和L1558I；(ii)P蛋白中的D433A、R434A和K437A，以及L蛋白中的L1558I；(iii)P蛋白中的D433A,R434A和K437A，以及L蛋白中的L1361C；或(iv)P蛋白中的D433A、R434A和K437A；以及L蛋白中的L1558I和L1361C；或(b)L蛋白中的Y1214F。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述经初始化的细胞是人工多能干细胞。
13.权利要求11的方法，其中所述仙台病毒载体缺少F基因，并且包含下述突变：M蛋白中的G69E、T116A和A183S，HN蛋白中的A262T、G264R和K461G，P蛋白中的L511F，以及L蛋白中的N1197S和K1795E。
14.权利要求13的方法，其中所述仙台病毒载体还具有下述突变：
(i)L蛋白中的Y942H、L1361C和L1558I；
(ii)P蛋白中的D433A、R434A和K437A，以及L蛋白中的L1558I；
(iii)P蛋白中的D433A,R434A和K437A，以及L蛋白中的L1361C；或
(iv)P蛋白中的D433A、R434A和K437A；以及L蛋白中的L1558I和L1361C。
15.权利要求13的方法，其中所述方法还包括在初始化后通过在37.5℃-39℃培养所述细胞来除去所述载体。
16.根据权利要求11～15中任一项所述的方法，其中，组合使用载体，使得细胞内内源性或外源性地表达至少Oct3/4基因、Klf4基因和Sox2基因这3种基因、或者至少Oct3/4基因、Sox2基因、Nanog基因和Lin28基因这4种基因。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，组合使用载体，使得细胞内内源性或外源性地表达至少Oct3/4基因、Klf4基因、Sox2基因和Myc基因这4种基因。
18.一种制造体细胞的方法，其包括权利要求11～15中任一项所述的方法制造经初始化的细胞的步骤以及使所述经初始化的细胞分化的步骤。
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