CN116018402A - iPS细胞的品质改善剂、iPS细胞的制备方法、iPS细胞、及iPS细胞制备用组合物 - Google Patents
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Abstract
iPS细胞的品质改善剂，其包含多核苷酸，前述多核苷酸具有：H1foo基因；和调控序列，其能在前述H1foo基因被导入至细胞的情况下对由前述H1foo基因表达的H1foo蛋白的在细胞内的存在量及存在时期中的至少一者进行调控。
Description
技术领域
本发明涉及iPS细胞的品质改善剂、iPS细胞的制备方法、iPS细胞、及iPS细胞制备用组合物。
本申请基于于2020年9月4日在日本提出申请的日本特愿2020-149447号主张优先权，并将其内容并入于此。
背景技术
iPS细胞(induced pluripotent stem cell；也称为“人工多潜能干细胞”或“诱导性多能干细胞”)可以通过导入Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc而自体细胞产生(非专利文献1、专利文献1)。这可以通过对亲代体细胞的转录网络及表观遗传标记(epigeneticsignature)进行重编程而实现。iPS细胞为基础研究、医药品的革新、及再生医疗带来各种利益。然而，所生成的iPS细胞的细胞群与胚胎干细胞(ES细胞)的细胞群相比为不均一的品质(heterogeneous quality)，这仍然是严重的问题。例如，ES细胞的情况下，各细胞的性质偏差小，大致能使任一个细胞分化为目标细胞。相对于此，iPS细胞各细胞的性质偏差大，常常会出现无法使其分化为目标细胞的细胞。获得各细胞没有偏差、任意的iPS细胞均显示出高品质的iPS细胞的细胞群对基础研究及临床目的而言是重要的。
为了解决iPS细胞的细胞群的品质不均一的问题，进行了大量尝试。例如，专利文献2中记载了将规定量的Oct3/4基因、Klf4基因、c-Myc基因及Sox2基因以规定次数导入至体细胞时可以提高iPS细胞的制备效率及稳定性。专利文献3中记载了，在Oct3/4基因或其基因产物、Sox2基因或其基因产物、Klf4基因或其基因产物、及c-Myc基因或其基因产物之外，还将Prdm14基因或其基因产物、Esrrb基因或其基因产物、及Sall4a基因或其基因产物导入至体细胞，从而可以高效且在短时间内制备品质方面优异的iPS细胞。专利文献4中记载了，在Oct3/4基因或其基因产物、Sox2基因或其基因产物、K1f4基因或其基因产物、及c-Myc基因或其基因产物之外，还将Jarid2突变体基因或其基因产物导入至体细胞，从而可以高效且在短时间内制备品质方面优异的iPS细胞。然而，iPS细胞的品质尚有改善的余地。因此，需要开发更高品质且品质偏差更小的iPS细胞的制备方法。
连接组蛋白H1家族与接头DNA结合而产生高阶染色质结构以对基因表达进行调控。连接组蛋白H1家族的成员包括组蛋白H1a、H1b、H1c、H1d、H1e、H1foo、H1x、H1.0、H1t、H1T2、HILS1。连接组蛋白家族的大部分成员由凝缩染色质的体细胞连接组蛋白组成。因此，该结构通常对全局性基因转录活性进行调控(非专利文献2、3)。本申请的发明人发现了，自体细胞诱导iPS细胞时，在上述基因之外，导入作为连接组蛋白H1家族成员的H1foo基因，从而可以制备高品质且品质偏差小的iPS细胞(专利文献5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4183742号公报
专利文献2：日本特开2011-004674号公报
专利文献3：日本特开2014-217344号公报
专利文献4：日本特开2014-217345号公报
专利文献5：国际公开第2017/010080号
非专利文献
非专利文献1：Takahashi，K.&Yamanaka，S.Induction of pluripotent stemcells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by definedfactors.Cell 126，663-676(2006)
非专利文献2：Steinbach，O.C.，Wolffe，A.P.&Rupp，R.A.Somatic linkerhistones cause loss of mesodermal competence in Xenopus.Nature 389，395-399(1997)
非专利文献3：Hebbar，P.B.&Archer，T.K.Altered histone H1 stoichiometryand an absence of nucleosome positioning on transfected DNA.The Journal ofbiological chemistry 283，4595-4601(2008)
发明内容
发明所要解决的课题
专利文献5中记载的iPS细胞的制备方法与现有方法相比，可以制备高品质且品质偏差小的iPS细胞。然而，iPS细胞诱导后得到的集落数量与现有方法为同等程度。
因此，本发明的课题在于提供能够增加iPS细胞诱导后得到的集落数量的、iPS细胞的品质改善剂、iPS细胞的制备方法、利用该制备方法制备的iPS细胞、及iPS细胞制备用组合物。
用于解决课题的手段
本申请的发明人为了解决上述课题而反复进行了认真研究，结果发现了，通过对由已导入至体细胞的H1foo基因表达的H1foo蛋白的在细胞内的存在时期及存在量中的任一者进行调控，iPS细胞诱导后的集落数量显著增加，从而完成了本发明。
本发明包括以下方式。
[1]iPS细胞的品质改善剂，其包含多核苷酸，前述多核苷酸具有：H1foo基因；和调控序列，其能在前述H1foo基因被导入至细胞的情况下对由前述H1foo基因表达的H1foo蛋白的在细胞内的存在量及存在时期中的至少一者进行调控。
[2]如[1]所述的iPS细胞的品质改善剂，其中，前述多核苷酸以在导入其的细胞内能表达前述H1foo基因的状态插入至表达载体。
[3]如[2]所述的iPS细胞的品质改善剂，其中，前述表达载体为仙台病毒载体。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的iPS细胞的品质改善剂，其中，
前述调控序列包含编码不稳定结构域的核苷酸序列，前述不稳定结构域是促进包含前述不稳定结构域的融合蛋白的基于蛋白酶体的降解的结构域，前述调控序列以能表达前述不稳定结构域与前述H1foo蛋白的融合蛋白的方式与前述H1foo基因连接。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的iPS细胞的品质改善剂，其中，前述调控序列包含对化学刺激做出响应而调控前述H1foo基因的转录的启动子序列。
[6]iPS细胞的品质改善剂，其包含H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白，其中，前述不稳定结构域是促进前述融合蛋白的基于蛋白酶体的降解的结构域。
[7]iPS细胞的制备方法，前述方法包括：将核重编程物质和[1]～[6]中任一项记载的iPS细胞的品质改善剂导入至体细胞的步骤。
[8]如[7]所述的iPS细胞的制备方法，其中，前述iPS细胞为始发态(prime-type)或原始态(naive-type)iPS细胞。
[9]如[7]或[8]所述的iPS细胞的制备方法，其中，前述核重编程物质包含选自由Oct基因家族的基因、Sox基因家族的基因、K1f基因家族的基因、Myc基因家族的基因、Lin基因家族的基因、及Nanog基因、以及它们的基因产物组成的组中的至少一者。
[10]如[7]～[9]中任一项所述的iPS细胞的制备方法，其中，前述核重编程物质为Oct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因、L-Myc或者c-Myc、及它们的基因产物。
[11]如[7]～[9]中任一项所述的iPS细胞的制备方法，其中，前述核重编程物质为选自由Oct基因家族的基因、Sox基因家族的基因、Klf基因家族的基因、Myc基因家族的基因、Lin基因家族的基因、及Nanog基因组成的组中的至少一个基因，前述至少一个基因以能在导入前述至少一个基因的细胞内表达前述至少一个基因的状态插入至表达载体。
[12]如[11]所述的iPS细胞的制备方法，其中，前述表达载体为仙台病毒载体。
[13]iPS细胞的制备方法，前述方法包括将核重编程物质和H1foo基因导入至体细胞的步骤，
其中，由已导入前述体细胞的前述H1foo基因表达的H1foo蛋白的在前述体细胞内的存在时期及存在量中的至少一者被调控。
[14]如[13]所述的iPS细胞的制备方法，其中，前述H1foo基因以能在导入前述H1foo基因的细胞内表达前述H1foo基因的状态插入至表达载体。
[15]如[13]或[14]所述的iPS细胞的制备方法，其中，前述核重编程物质为选自由Oct基因家族的基因、Sox基因家族的基因、Klf基因家族的基因、Myc基因家族的基因、Lin基因家族的基因、及Nanog基因组成的组中的至少一个基因，前述至少一个基因被编码在能表达前述至少一个基因的表达载体中。
[16]如[14]或[15]所述的iPS细胞的制备方法，其中，前述表达载体为仙台病毒载体。
[17]iPS细胞，其通过[7]～[16]中任一项记载的iPS细胞的制备方法而制备。
[18]iPS细胞制备用组合物，其包含核重编程物质和[1]～[6]中任一项记载的iPS细胞的品质改善剂。
[19]iPS细胞的制备方法，前述方法包括将核重编程物质、和在与前述核重编程物质一同被导入至体细胞起第2～15天中的任一天诱导前述体细胞的重编程、并且具有抑制固有免疫的功能的物质导入至前述体细胞的步骤。
发明效果
通过本发明，可提供iPS细胞的品质改善剂、iPS细胞的制备方法、利用该制备方法制备的iPS细胞、及iPS细胞制备用组合物。根据本发明，可以增加iPS细胞诱导后得到的集落数量，并且，如此制备的iPS细胞群之中包含大量的高分化多能性等作为iPS细胞的品质高的细胞。
附图说明
[图1]示出实施例中使用的包含H1FOO基因的三种仙台病毒载体(SeV18+H1FOO/TS15ΔF、SeV18+H1FOO-DD/TS15ΔF、SeV18+DD-H1FOO/TS15AF)的结构。
[图2]示出将图1所示的三种仙台病毒载体中的任一者导入至人皮肤成纤维细胞，用Western印迹法对(2)H1FOO、(3)H1FOO-DD融合蛋白、(4)DD-H1FOO融合蛋白的表达量进行比较而得的结果。图2中，“(1)对照”是使用了图1所示的“(a)SeV18+H1FOO/TS15ΔF”中代替H1FOO基因而包含Azami-Green基因的仙台病毒载体(以下相同)。
[图3]示出由人皮肤成纤维细胞制作的始发态iPS细胞中的碱性磷酸酶(A1kalinePhosphatase：ALP)阳性集落数量。始发态iPS细胞是通过与包含Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因及L-Myc基因的仙台病毒载体一同使用图1所示的(a)～(c)中的任一种仙台病毒载体而制作的。
[图4A]示出由人外周血单个核细胞制作的始发态iPS细胞中的ALP阳性集落数量。始发态iPS细胞是通过与包含Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因及L-Myc基因的仙台病毒载体一同使用SeV1 8+H1FOO-DD而制作的。
[图4B]示出由人皮肤成纤维细胞制作的原始态iPS细胞中的ALP阳性集落数量。原始态iPS细胞是通过与包含Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因及L-Myc基因的仙台病毒载体一同使用SeV18+H1FOO-DD而制作的。
[图4C]示出由人外周血单个核细胞制作的原始态iPS细胞中的ALP阳性集落数量。原始态iPS细胞是通过与包含Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因及L-Myc基因的仙台病毒载体一同使用SeV18+H1FOO-DD而制作的。
[图5A]示出由人皮肤成纤维细胞制作的始发态iPS细胞中，就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS对基因表达量的偏差进行比较评价而得的结果。
[图5B]示出由人皮肤成纤维细胞制作的原始态iPS细胞中，就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS对基因表达量的偏差进行比较评价而得的结果。
[图6A]示出由人皮肤成纤维细胞制作的始发态iPS细胞中，就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS对DNA甲基化的偏差进行比较评价而得的结果。
[图6B]示出由人皮肤成纤维细胞制作的原始态iPS细胞中，就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS对DNA甲基化的偏差进行比较评价而得的结果。
[图7A]示出在使用心肌分化诱导培养基由始发态iPS细胞分化诱导而成的细胞中，用流式细胞术测定TNNT2阳性细胞的比例的测定例。左图是(1)对照-iPS的测定例，右图是(3)H1FOO-DD-iPS的测定例。
[图7B]示出在使用心肌分化诱导培养基由始发态iPS细胞分化诱导而成的细胞中，就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS对TNNT2阳性细胞的比例进行比较评价而得的结果。
[图8]示出由始发态iPS细胞分化诱导为内胚层的细胞中，就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS用qPCR半穷举地(semi-exhaustively)对与内胚层相关的标志物的表达进行评价而得的结果。
[图9]示出由始发态iPS细胞分化诱导为肝细胞的细胞中，就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS用qPCR对ASGR1的表达进行比较评价而得的结果。
[图10]示出由始发态iPS细胞分化诱导为肝细胞的细胞中，就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS用ELISA对白蛋白的分泌进行评价而得的比较结果。
[图11A]示出使用原始内胚层分化诱导培养基由原始态iPS细胞分化诱导而成的细胞中，用流式细胞术测定PDGFRA及ANPEP这两者阳性的细胞的比例的测定例。左图是(1)对照-iPS的测定例，右图是(3)H1FOO-DD-iPS的测定例。
[图11B]示出使用原始内胚层分化诱导培养基由原始态iPS细胞分化诱导而成的细胞中，就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS对PDGFRA及ANPEP这两者阳性的细胞的比例进行比较评价而得的结果。
[图12A]示出原始态iPS细胞中就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS对备用呼吸能力(Spare respiratory capacity)进行比较评价而得的结果。
[图12B]示出原始态iPS细胞中就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS对耗氧速率(Oxygen comsumption rate：OCR)及细胞外酸化速率(Extracellular acidificationrate：ECAR)进行比较评价而得的结果。
[图13A]为原始态iPS细胞的、使用了UTX、HUWE1、及XIST探针的mRNA-FISH的荧光显微镜图像的一个例子。左图是HUWEI+/+XIST+/+的例子。右图是HUWEI+/-XIST-/-的例子。
[图13B]示出原始态iPS细胞中就(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS对HUWE1及XIST的表达模式进行比较评价而得的结果。
[图14]示出用qRT-PCR测定FKBP1A的表达量而得的结果。HDF：人皮肤成纤维细胞(TIG)120；H9 ESC：H9 ES细胞；H1FOO OE HDF：向人皮肤成纤维细胞中导入H1FOO-DD后第2天的细胞；OSKL day2：向人皮肤成纤维细胞中导入核重编程物质(OCT4/SOX2/KLF4/LMYC)后第2天的细胞；OSKLH day2：向人皮肤成纤维细胞中导入核重编程物质(OCT4/SOX2/KLF4/LMYC)及H1FOO-DD后第2天的细胞。
具体实施方式
“包含～”(comprise)这一术语意指可以包含除作为对象的构成要素以外的构成要素。“由～构成”(consist of)这一术语意指不含除作为对象的构成要素以外的构成要素。“基本上由～组成”(consist essentially of)这一术语意指不以发挥特别功能的方式(使发明效果完全丧失的方式等)包含除作为对象的构成要素以外的构成要素。本说明书中，记载为“包含～”(comprise)的情况包括“由～组成”(consist of)的方式、及“基本上由～组成”(essentially consist of)的方式。
蛋白质(多肽)、肽、多核苷酸(DNA、RNA)、载体、及细胞可以是经分离的。“经分离”意指从自然状态分离后的状态。本说明书中记载的蛋白质(多肽)、肽、多核苷酸(DNA、RNA)、载体、及细胞可以是经分离的蛋白质(经分离的多肽)、经分离的肽、经分离的多核苷酸(经分离的DNA、经分离的RNA)、经分离的载体、及经分离的细胞。
“基因”这一术语意指包含编码特定蛋白质的至少一个开放阅读框的多核苷酸。基因可以仅包含外显子，也可以包含外显子、以及内含子、5’UTR、及3’UTR中的任一者以上。
涉及多核苷酸时使用的“功能性地连接”这一术语意指，第一碱基序列被配置得充分接近第二碱基序列，第一碱基序列能对第二碱基序列或第二碱基序列的调控下的区域造成影响。例如，多核苷酸与启动子功能性地连接意指，该多核苷酸以在该启动子的调控下进行表达的方式连接。启动子配置于基因的上游的情况下，通常，前述基因与前述启动子功能性地连接。
“能表达的状态”是指，在导入多核苷酸的细胞内，该多核苷酸处于能被转录的状态。
“表达载体”是指，包含对象多核苷酸的载体，且具备使对象多核苷酸成为在导入该载体的细胞内能表达的状态的系统。
[iPS细胞的品质改善剂]
<第一实施方式>
一个实施方式中，本发明提供iPS细胞的品质改善剂。本实施方式的iPS细胞的品质改善剂包含多核苷酸，前述多核苷酸具有：H1foo基因；和核苷酸序列(以下也称为“调控序列”)，其能在前述H1foo基因被导入至细胞的情况下对由前述H1foo基因表达的H1foo蛋白的在细胞内的存在量及存在时期中的至少一者进行调控。
本实施方式的iPS细胞的品质改善剂通过与后述的核重编程物质一同导入至体细胞，从而能够改善由体细胞诱导的iPS细胞的品质。作为“iPS细胞的品质”，可举出iPS细胞中的未分化标志物(Nanog、Tra-1-60、ALP等)表达高、类胚体形成能力高、由iPS细胞形成的类胚体尺寸的均一性、异常甲基化低、小鼠iPS细胞的嵌合体形成能力高、向分化细胞(例如，心肌细胞)的分化能力高等各种性质、及iPS细胞间的如上所述的各种性质的均一性等。本实施方式的iPS细胞的品质改善剂通过与核重编程物质一同导入至体细胞，从而发挥下述效果：与仅导入核重编程物质的情况相比，如上所述的iPS细胞的各种性质提高，或提高iPS细胞间的各种性质的均一性提高等。尤其是本实施方式的iPS细胞的品质改善剂发挥提高表达ALP的始发态iPS细胞的生成能力、提高表达ALP的原始态iPS细胞的生成能力等效果。另外，本实施方式的iPS细胞的品质改善剂通过与核重编程物质一同导入至体细胞，从而发挥下述效果：在所生成的iPS细胞中，基因表达的均一性提高、DNA甲基化的均一性提高、向目标细胞的分化能力提高、及上述性质的均一性提高、分化为均一性高的分化细胞群的能力提高、及原始态表型(代谢功能、HUWE1/XIST表达模式等)的表达提高等。分化细胞的均一性例如可以通过研究分化细胞标志物的表达量的偏差来进行确认。作为分化细胞，没有特别限定，例如，可举出内胚层系细胞、中胚层系细胞、外胚层系细胞、心肌细胞、肝细胞、肾细胞、肌细胞、成纤维细胞、神经细胞、免疫细胞(淋巴细胞等)、血管细胞、眼细胞(视网膜色素上皮细胞等)、血细胞(巨核细胞、红细胞等)、其他各组织细胞、及它们的祖细胞等。
(H1foo基因)
本说明书中，“H1foo基因”意指编码H1foo蛋白的多核苷酸。作为H1foo基因所源自的生物种类，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如，可举出人、小鼠、大鼠、牛、绵羊、马、猴等任意的哺乳动物。上述H1foo基因的序列信息可以从已知的数据库获得。例如，可以在GenBank中以登录号BC047943(人)、或BC137916(小鼠)获取。将前述登录号的人的H1foo基因的核苷酸序列示于序列号1，将由该核苷酸序列编码的人的H1foo蛋白的氨基酸序列示于序列号2。将前述登录号的小鼠的H1foo基因的核苷酸序列示于序列号3，将小鼠的H1foo蛋白的氨基酸序列示于序列号4。本说明书中，字母均以大写记载为“H1FOO”的情况下，是指人的H1foo基因或H1foo蛋白。记载为“H1foo”的情况下，包含所有生物种类(包括人)的H1foo基因或H1foo蛋白。
H1foo基因并不限于野生型的H1foo基因，也可以为包含突变(缺失、取代、插入及添加中的任一者、或它们的组合)的基因。只要具有编码具有H1foo活性的蛋白质的核苷酸序列，则突变的数目并没有特别限定。需要说明的是，本说明书中，“H1foo活性”是指野生型的H1foo蛋白所具有的功能中的至少一种。作为H1foo活性，例如，可举出与将核小体间连接的接头DNA结合的活性。H1foo活性更优选为与将核小体间连接的接头DNA结合、且使该接头DNA区域维持松弛状态的活性。
作为H1foo基因，例如，可举出以下的(a)～(g)。
(a)野生型的H1foo基因(例如，由序列号1或3所表示的核苷酸序列构成的多核苷酸)
(b)由编码野生型的H1foo蛋白(例如，由序列号2或4所表示的氨基酸序列构成的蛋白质)的核苷酸序列构成的多核苷酸
(c)编码由野生型的H1foo蛋白的氨基酸序列(例如，序列号2或4所表示的氨基酸序列)中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、且具有H1foo活性的蛋白质的多核苷酸
(d)编码由与野生型的H1foo蛋白的氨基酸序列(例如，序列号2或4所表示的氨基酸序列)具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成且具有H1foo活性的蛋白质的多核苷酸
(e)编码由野生型的H1foo基因的核苷酸序列(例如，序列号1或序列号3所表示的核苷酸序列)中1个或多个核苷酸突变而得的核苷酸序列构成、且具有H1foo活性的蛋白质的多核苷酸
(f)由与野生型的H1foo基因的核苷酸序列(例如，序列号1或序列号3所表示的核苷酸序列)具有70％以上的序列同一性的核苷酸序列构成、且编码具有H1foo活性的蛋白质的多核苷酸
(g)与野生型的H1foo基因(例如，包含序列号1或序列号3所表示的核苷酸序列的多核苷酸)在严格性条件下杂交、且编码具有H1foo活性的蛋白质的多核苷酸
上述(c)及(e)中，“突变”可以是缺失、取代、添加及插入中的任一者，也可以是它们的组合。
上述(c)中，“多个”只要作为结果而产生的蛋白质具有H1foo活性就没有特别限定，例如，可例示出2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，进一步优选为2～5个，特别优选为2个或3个。
上述(e)中，“多个”只要作为结果而产生的多核苷酸编码具有H1foo活性的蛋白质就没有特别限定，例如，可例示出2～60个，优选为2～50个，更优选为2～40个或2～30个，进一步优选为2～20个或2～1O个，特别优选为2～5个或2个或者3个。
上述(d)及(f)中，序列同一性只要为70％以上就没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上。氨基酸序列彼此或核苷酸序列彼此的序列同一性如下求出：对两个氨基酸序列或核苷酸序列以相对应的氨基酸或核苷酸一致得最多的方式，一边在相当于插入及缺失的部分留下空位一边进行并列，求出相对于所得到的比对中不包括空位的氨基酸序列整体或核苷酸序列整体而言的、一致的氨基酸或核苷酸的比例。氨基酸序列彼此或核苷酸序列彼此的序列同一性可以使用该技术领域中已知的各种同源性检索软件而求出。例如，氨基酸序列或核苷酸序列的序列同一性的值可以通过以利用已知的同源性检索软件BLASTP或BLASTN得到的比对为基础的计算而获得。
上述(g)中，所谓“严格性条件”，例如可举出Molecular Cloning-A LABORATORYMANUAL THIRD EDITION(Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press)中记载的条件。例如，可例示出通过在由6×SSC(20×SSC的组成：3M氯化钠、0.3M柠檬酸溶液、pH7.0)、5×邓哈特溶液(Denhardt′s solution)(100×邓哈特溶液的组成：2质量％牛血清白蛋白、2质量％Ficoll、2质量％聚乙烯吡咯烷酮)、0.5质量％的SDS、0.1mg/mL鲑鱼精子DNA、及50容量％甲酰胺组成的杂交缓冲液中、于42～70℃进行数小时至一夜孵育从而使其杂交的条件。作为孵育后的洗涤时所使用的洗涤缓冲液，优选举出含0.1质量％SDS的1×SSC溶液，更优选举出含0.1质量％SDS的0.1×SSC溶液。
上述(b)～(e)中，对于简并密码子而言，优选使用在使用本实施方式的iPS细胞的品质改善剂的体细胞中密码子使用频率高的密码子。例如，用于人的体细胞的情况下，优选使用人细胞中使用频率高的密码子。即，优选按人密码子进行优化。另外，用于小鼠的体细胞的情况下，优选使用小鼠细胞中使用频率高的密码子。即，优选按小鼠密码子进行优化。
本说明书中，“H1foo蛋白”有时是指后述的不稳定结构域与H1foo蛋白的融合蛋白、或该融合蛋白中的H1foo蛋白区域。
(调控序列)
调控序列是能在H1foo基因被导入至细胞的情况下对由H1foo基因表达的H1foo蛋白的在细胞内的存在量及存在时期中的至少一者进行调控的核苷酸序列。只要调控序列能对H1foo蛋白的在细胞内的存在量及存在时期中的任一者进行调控，则调控方法没有特别限定。作为调控序列，例如，可举出编码不稳定结构域的核苷酸序列。或者，作为调控序列，例如，可举出对化学刺激做出响应而调控前述H1foo基因的转录的启动子序列。
本说明书中，“不稳定结构域”(Destabilized Domain：DD)是指，促进包含该结构域的融合蛋白的基于蛋白酶体的降解的结构域。即，将不稳定结构域连接于所期望的蛋白质的N末端或C末端，制成包含不稳定结构域的融合蛋白，从而促进包含所期望的蛋白质的融合蛋白的基于蛋白酶体的降解。
不稳定结构域只要促进包含该结构域的融合蛋白的降解，就没有特别限定，可以使用已知的不稳定结构域。作为不稳定结构域，例如，可举出源自FKBP12的不稳定结构域(Banaszynski等，Cell.2006 Sep 8；126(5)：995-1004.)、源自ecDHFR的不稳定结构域(Iwamoto等，Chem Biol.2010 Sep 24；17(9)：981-8.)等。作为源自FKBP12的不稳定结构域，例如，可例示出具有序列号14中记载的氨基酸序列的不稳定结构域，作为编码前述氨基酸序列的核苷酸序列，可例示出序列号13中记载的核苷酸序列。需要说明的是，所期望的蛋白质与不稳定结构域的融合蛋白可以在所期望的蛋白质与不稳定结构域之间包含多肽。
包含上述不稳定结构域的融合蛋白的降解可以利用被称为Shield1(源自FKBP12的不稳定结构域的情况)、或Guard(源自ecDHFR的不稳定结构域的情况)的膜透过性的低分子化合物(以下称为“稳定化化合物”)进行抑制。编码上述不稳定结构域的多核苷酸(以下称为“不稳定结构域基因”)及稳定化化合物可以通过PreteoTunerTM Shield System(Clontech)、PreteoTunerTM Guard System(Clontech)等进行利用。
不稳定结构域也可以称为降解决定子(degron)序列。作为降解决定子的例子，可举出mTOR降解决定子(美国专利申请公开第2009/0215169号)、二氢叶酸还原酶(DHFR)降解决定子(美国专利申请公开第2012/0178168号)、PEST(国际公开第99/54348)、TetR降解决定子(国际公开第2007/032555号)、及生长素诱导型降解决定子(auxin-inducibledegron，AID)(国际公开第2010/125620号)等，但并不限于此。
不稳定结构域基因可以以能表达不稳定结构域与H1foo蛋白的融合蛋白的方式与H1foo基因连接。由此，将本实施方式的iPS细胞的品质改善剂导入至细胞的情况下，H1foo蛋白作为与不稳定结构域的融合蛋白而表达。因此，H1foo蛋白在表达后迅速被蛋白酶体降解。即，通过以与不稳定结构域的融合蛋白的形式使H1foo蛋白表达，能够以H1foo蛋白在细胞内的存在量变少的方式进行调控。此外，作为前述融合蛋白的表达载体，使用不将基因整合至宿主染色体而是在细胞质内表达基因、基因表达后迅速从细胞中消失的载体，从而能够将H1foo蛋白的存在时期调控在该表达载体导入后的一定期间内。如此，通过以使H1foo蛋白在自导入核重编程物质起至重编程结束为止的一定期间表达、之后以比较低的水平存在的方式进行调控，从而能够以高效率制作品质高的iPS细胞。
另外，包含不稳定结构域的融合蛋白也可以通过添加稳定化化合物从而对在细胞内的存在量及存在时期进行调控。例如，也可以将本实施方式的iPS细胞的品质改善剂与后述的核重编程物质一同导入至体细胞后，在任意期间添加稳定化化合物，经过前述任意期间后除去稳定化化合物，从而对H1foo蛋白的存在量及存在时期进行调控。
另外，本实施方式的iPS细胞的品质改善剂中所含的多核苷酸也可以为H1foo基因以能在导入其的细胞内表达的状态插入至表达载体的形态。不稳定结构域基因可以以能表达不稳定结构域与该表达载体的复制所需的蛋白质(以下称为“复制相关蛋白”)的融合蛋白的方式与该复制相关蛋白基因连接。“复制相关蛋白基因”意指编码复制相关蛋白的多核苷酸。作为与不稳定结构域的融合蛋白而表达的复制相关蛋白在表达后迅速被蛋白酶体降解。因此，由于该复制相关蛋白质量的降低，表达载体的复制被抑制。由此，可以间接地对H1foo蛋白在细胞内的存在时期及存在量进行调控。
形成与不稳定结构域的融合蛋白的复制相关蛋白没有特别限定，根据表达载体的种类适当选择即可。例如，表达载体为仙台病毒载体的情况下，作为复制相关蛋白，可举出核壳蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、大蛋白(L)。上述之中，优选P蛋白。
表达载体包含多个复制相关蛋白基因的情况下，也可以将不稳定结构域基因连接于前述多个复制相关蛋白基因中的任意两者以上。
调控序列包含不稳定结构域基因序列的情况下，调控序列连接于H1foo基因或复制相关蛋白基因的5’末端及3’末端中的至少一者即可。调控序列可以连接于前述蛋白基因的5’末端及3’末端中的任一者，也可以连接于5’末端及3’末端这两者。调控序列与H1foo基因或复制相关蛋白基因的连接以在不稳定结构域基因及H1foo基因或者复制相关蛋白基因中不发生移码(即，在框内)的方式进行。作为一个例子，将使源自FKBP12的不稳定结构域基因连接于H1foo基因的3’末端的情况下的核苷酸序列示于序列号15。序列号15中记载的核苷酸序列编码在H1foo蛋白的C末端添加有源自FKBP12的不稳定结构域的融合蛋白(序列号16)。作为一个例子，将使源自FKBP12的不稳定结构域基因连接于H1foo基因的5’末端的情况下的核苷酸序列示于序列号17。序列号17中记载的核苷酸序列编码在H1foo蛋白的N末端添加有源自FKBP12的不稳定结构域的融合蛋白(序列号18)。
调控序列也可以连接于H1foo基因和复制相关蛋白基因这两者。
调控序列也可以包含对外部刺激做出响应而调控H1foo基因的转录的启动子序列。作为外部刺激，例如，可举出化学物质、热、光、pH、浸透压等。对外部刺激做出响应而调控H1foo基因的转录的启动子(以下称为“外部刺激应答性启动子”)配置于H1foo基因的上游以调控H1foo基因的转录。
外部刺激应答性启动子没有特别限定，可以使用已知的启动子。作为外部刺激应答性启动子，例如，可举出四环素应答性启动子(例如，四环素响应因子：TRE)。
(多核苷酸)
本实施方式的iPS细胞的品质改善剂包含具有上述H1foo基因和上述调控序列的多核苷酸。前述多核苷酸是H1foo基因以能在调控序列的调控下表达的状态插入至表达载体中的多核苷酸。
需要说明的是，“能表达H1foo基因的表达载体”可以是表达H1foo蛋白的表达载体，也可以是表达H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白的表达载体。
表达载体优选根据需要在H1foo基因及调控序列之外还包含对H1foo基因或H1foo基因及不稳定结构域基因(以下统称为“H1foo基因等”)的表达进行调控的启动子。表达载体中，该启动子配置于H1foo基因等的上游以调控H1foo基因等的表达。其中，前述调控序列为外部刺激应答性启动子的情况下，表达载体优选不包含调控H1foo基因的表达的其他启动子。
作为启动子，例如，可举出SRα启动子、SV40早期启动子、反转录病毒的LTR、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳氏肉瘤病毒)启动子、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、热激启动子等。另外，也可以与启动子一同使用人CMV的IE基因的增强子。作为一个例子，可以使用CAG启动子(包含巨细胞病毒增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和β-珠蛋白基因的polyA信号部位)。
另外，也可以使用上述“调控序列”一项中举出的刺激应答性启动子。
表达载体也可以在启动子之外根据期望包含增强子、polyA添加信号、标志物基因、复制起始点、编码与复制起始点结合并调控复制的蛋白质的基因等。标志物基因是指，能够通过将该标志物基因导入细胞从而进行细胞的筛选、选择的基因。作为标志物基因的具体例，可举出耐药基因、荧光蛋白基因、萤光素酶基因、显色酶基因等。它们可以单独使用一种，也可以同时使用两种以上。作为耐药基因的具体例，可举出新霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、博莱霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。作为荧光蛋白基因的具体例，可举出绿色荧光蛋白(GFP)基因、黄色荧光蛋白(YFP)基因、红色荧光蛋白(RFP)基因等。作为萤光素酶基因的具体例，可举出萤光素酶基因等。作为显色酶基因的具体例，可举出β半乳糖苷酶基因、β葡糖醛酸糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因等。
使用刺激应答性启动子作为启动子的情况下，表达载体也可以包含对该刺激做出响应而与启动子结合的增强子基因或阻遏物(repressor)基因。例如，四环素应答性启动子的情况下，表达载体也可以包含反向四环素调控性反式激活剂(reverse tetracycline-regulatable transactivator)(rtTA)或四环素调控性反式激活剂(tetracycline-regulatable transactivator)(rTA)等的基因。这些增强子基因或阻遏物基因也可以包含于与具有H1foo基因的表达载体分开的表达载体中。
表达载体的种类没有特别限定，可以使用已知的表达载体。作为表达载体，例如，可举出附加型载体(episomal vector)、人工染色体载体、质粒载体、病毒载体等。
附加型载体是能在染色体外自主复制的载体。使用附加型载体的具体的手段已在Yu等，Science，324，797-801(2009)中公开。例如，可以使用在附加型载体的复制所需的载体要素的5’侧及3’侧沿相同方向配置了loxP序列而成的附加型载体。附加型载体由于能在染色体外自主复制，因此即使不整合至基因组中也可提供在宿主细胞内的稳定表达，但期望一旦建立iPS细胞之后该载体被迅速地去除。用两个loxP序列夹着附加型载体的复制所需的载体要素，使Cre重组酶对其发挥作用而切出该载体要素，从而可以使附加型载体的自主复制能力丧失，可以使该载体在早期从iPS细胞脱落。
作为附加型载体，例如，可举出来源于EBV、SV40等的包含自主复制所需的序列作为载体要素的载体。作为自主复制所需的载体要素，具体而言，可举出复制起始点、及编码与复制起始点结合并调控复制的蛋白质的基因，例如，对于EBV可举出复制起始点oriP和EBNA-1基因，对于SV40可举出复制起始点ori和SV40LT基因。
作为人工染色体载体，可举出YAC(Yeast artificial chromosome，酵母人工染色体)载体、BAC(Bacterial artificial chromosome，细菌人工染色体)载体、PAC(P1-derived artificial chromosome，P1衍生的人工染色体)载体等。
作为质粒载体，只要是能在作为导入对象的体细胞内表达的质粒载体，就没有特别限定。作为导入对象的体细胞为哺乳动物的情况下，可以使用通常作为动物细胞表达用质粒载体使用的质粒载体。作为动物细胞表达用质粒载体，例如，可举出pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
作为病毒载体，可举出反转录病毒(包括慢病毒)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、仙台病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、痘病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、辛德毕斯病毒载体、弹状病毒载体、副粘病毒载体、正粘病毒载体等。
本说明书中，病毒载体意指，具有来源于该病毒的基因组核酸、能够通过将导入基因整合至该核酸从而使该基因表达的载体。
作为病毒载体，优选仙台病毒载体。仙台病毒属于单负病毒目(Mononegavirales)病毒之一的副粘病毒科(包含Paramyxoviridae；Paramyxovirus，Morbillivirus，Rubulavirus，及Pnemovirus等属)，包含一条负链(相对于编码病毒蛋白的有义链而言的反义链)的RNA作为基因组。负链RNA也称为negative strand RNA。仙台病毒载体为染色体非整合型病毒载体，载体在细胞质中表达。因此，不会有导入基因整合至宿主的染色体中的风险。因此安全性高，能够在达成目的后从导入细胞中除去载体。
仙台病毒载体中在感染性病毒粒子之外包含由病毒核心、病毒基因组与病毒蛋白的复合体、或非感染性病毒粒子等组成的复合体，前述复合体具有通过导入细胞而表达所搭载的基因的能力。例如，由仙台病毒基因组和与其结合的仙台病毒蛋白(NP、P、及L蛋白)组成的核糖核蛋白(病毒的核心部分)可以通过导入至细胞中从而在该细胞内表达导入基因(国际公开第00/70055号)。向细胞中的导入只要适当使用转染试剂等进行即可。因此，这样的核糖核蛋白(RNP)也包含在仙台病毒载体中。
仙台病毒的基因组从3’端朝向5’端依次包含NP(核壳)基因、P(磷酸化)基因、M(基质)基因、F(融合)基因、HN(血细胞凝集素/神经氨酸酶)基因、及L(大)基因。其中，仙台病毒只要有NP基因、P基因、及L基因就可以作为载体充分发挥功能，可以在细胞中复制基因组，使所搭载的基因表达。仙台病毒由于基因组中具有负链RNA，因此与通常相反，基因组的3’侧相当于上游，5’侧相当于下游。
就仙台病毒的上述各基因的碱基序列的数据库(GenBank)的登录号而言，例如关于NP基因，可以参见M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046，X17218来确定；关于P基因，可以参见M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007，X17008来确定；关于M基因，可以参见D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584，X53056来确定；关于F基因，可以参见D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152，X02131来确定；关于HN基因，可以参见D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808，X56131来确定；关于L基因，可以参见D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587，X58886来确定。
然而，仙台病毒已知有多个株，根据株的不同也存在由上述中例示的以外的序列构成的基因。具有来源于上述中任一个基因的病毒基因的仙台病毒载体作为仙台病毒载体也是有用的。例如，仙台病毒载体可包含与上述中任一个病毒基因的编码序列具有90％以上、优选95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的序列同一性的碱基序列。另外，仙台病毒载体可包含编码与例如上述中任一个病毒基因的编码序列所编码的氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的同一性的氨基酸序列的碱基序列。另外，仙台病毒载体可包含编码保持各基因产物的功能的多肽的碱基序列，前述多肽为例如上述中任一个病毒基因的编码序列所编码的氨基酸序列中取代、插入、缺失、及/或添加10个以内、优选9个以内、8个以内、7个以内、6个以内、5个以内、4个以内、3个以内、2个以内、或1个氨基酸而成的氨基酸序列。
本说明书中记载的碱基序列及氨基酸序列等的参考数据库登录号的序列是参考本申请申请日时的序列，确定为本申请申请日时间点的序列。各时间点的序列可以通过参考数据库的修订历史来确定。
本实施方式中使用的仙台病毒载体也可以是衍生物。仙台病毒载体的衍生物包括以不损害基于仙台病毒的基因导入能力的方式改变了病毒基因的病毒、及经化学修饰的病毒等。
仙台病毒可以来源于天然株、野生株、突变株、实验室传代株、及人工建立的株等。例如可举出Z株(Medical Journal of Osaka University Vol.6，No.1，March 1955 p1-15)。即，该病毒只要能实现目标功能即可，可以是具有与从自然分离的病毒同样的结构的病毒载体，也可以是通过基因重组人为地改变后的病毒。例如，也可以是野生型病毒所具有的任意基因存在突变、缺失的病毒。另外，也能够使用DI粒子(J.Virol.68：8413-8417，1994)等不完全病毒。例如，可以适当使用编码病毒的包膜蛋白或外壳蛋白的至少一个基因具有突变或缺失的病毒。这样的病毒载体是能够在例如感染细胞中复制基因组、但无法形成感染性病毒粒子的病毒载体。这样的传播能力缺陷型的病毒载体没有向周围扩大感染的顾虑，因此安全性高。例如，可以使用不包含F及/或HN等编码包膜蛋白或刺突蛋白的至少一个基因、或者它们的组合的病毒载体(国际公开第00/70055号、国际公开第00/70070号、Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。只要将基因组复制所需的蛋白(例如NP、P、及L蛋白)编码在基因组RNA中，就可以在感染细胞中扩增基因组。为了制备缺陷型病毒，例如，向病毒生产细胞外源性地供给缺失的基因产物或能够与之互补的蛋白质(国际公开第00/70055号、国际公开第00/70070号、Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。将病毒载体作为RNP(例如N、L、P蛋白、及由基因组RNA组成的RNP)回收的情况下，可以不与包膜蛋白互补地制备载体。
作为适宜的仙台病毒载体，例如，可以为M蛋白具有G69E，T116A及A183S的突变、HN蛋白具有A262T、G264及K461G的突变、P蛋白具有L511F突变、并且L蛋白具有N1197S及K1795E突变的F基因缺陷型仙台病毒载体(例如Zstrain)，也可以为在该载体中进一步导入了TS 7、TS 12、TS 13、TS 14、或TS 15的突变的载体。具体而言，可举出SeV18+/TSΔF(国际公开第2010/008054号、国际公开第2003/025570号)、SeV(PM)/TSΔF、及在其中进一步引入了TS 7、TS 12、TS 13、TS 14、或TS 15的突变的载体等，但并不限于此。
“TSΔF”是指M蛋白具有G69E、T116A及A183S的突变、HN蛋白具有A262T、G264R及K461G的突变、P蛋白具有L511F突变、并且L蛋白具有N1197S及K1795E突变，缺失F基因。
作为适宜的仙台病毒载体，例如，可举出向P蛋白中添加降解决定子序列以可以从感染细胞容易地除去的方式制成的载体(国际公开第2016/125364号)。作为降解决定子，可举出mTOR降解决定子(美国专利申请公开第2009/0215169号)、二氢叶酸还原酶(DHFR)降解决定子(美国专利申请公开第2012/0178168号)、PEST(国际公开第99/54348号)、TetR降解决定子(国际公开第2007/032555号)、及生长素诱导型降解决定子(auxin-inducibledegron：AID)(国际公开第2010/125620号)等，但并不限于此。例如，可适宜地使用在P蛋白的C末端添加有作为mTOR降解决定子的一种的DD-tag的载体。
具有导入对象的多核苷酸(H1foo基因、或者H1foo基因及调控序列)的重组仙台病毒载体的重建可以利用已知的方法进行。
具体而言，可以通过步骤(a)、(b)而制备：步骤(a)将编码仙台病毒基因组RNA(负链)或其互补链(正链)的cDNA在表达病毒粒子形成所需的病毒蛋白(N、P、及L)的细胞中转录；步骤(b)将包含所生成的病毒的培养上清液回收。粒子形成所需的病毒蛋白可以由转录的病毒基因组RNA表达，也可以以反式(trans)方式自基因组RNA以外供给。例如，可以将编码N、P、及L蛋白的表达质粒导入细胞而进行供给。基因组RNA中缺失粒子形成所需的病毒基因的情况下，也可以使该病毒基因在病毒生产细胞中另行表达，来补充粒子形成。为了使病毒蛋白、RNA基因组在细胞内表达，将在宿主细胞中发挥功能的适宜的启动子的下游连接有编码该蛋白质、基因组RNA的DNA的载体导入至宿主细胞。转录的基因组RNA在病毒蛋白的存在下复制，形成感染性病毒粒子。制备缺失包膜蛋白等的基因的缺陷型病毒的情况下，也可以使缺失的蛋白质或能够代偿其功能的其他病毒蛋白等在病毒生产细胞中表达。
另外，仙台病毒的制备可以利用以下的已知的方法实施(国际公开第97/16539号；国际公开第97/16538号；国际公开第00/70055号；国际公开第00/70070号；国际公开第01/18223号；国际公开第03/025570号；国际公开第2005/071092号；国际公开第2006/137517号；国际公开第2007/083644号；国际公开第2008/007581号；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997、Kato，A.等，1997，EMBO_J.16：578-587及Yu，D.等，1997，Genes Cells 2：457-466；Durbin，A.P.等，1997，Virology 235：323-332；Whelan，S.P.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：8388-8392；Schnell.M.J.等，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.等，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.等，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.等，1996，Genes Cells 1：569-579；Baron，M.D.and Barrett，T.，1997，J.Virol.71：1265-1271；Bridgen，A.andE1liott，R.M.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：15400-15404；Tokusumi，T.等，VirusRes.2002：86；33-38、Li，H.-O.等，J.Virol.2000：74；6564-6569)。
使用仙台病毒载体的情况下，H1foo基因等只要不破坏仙台病毒的各基因，可以位于仙台病毒基因组RNA(负链)中的任意位置。例如，H1foo基因等可以较之NP基因位于3’侧，可以位于NP基因与P基因之间，可以位于P基因与M基因之间，可以位于M基因与F基因之间，可以位于F基因与HN基因之间(不具有F基因的情况下，为M基因与HN基因之间)，可以位于HN基因与L基因之间，也可以较之L基因位于5’侧。为了增加H1foo基因等的表达量，优选将H1foo基因等配置于更靠3’侧。例如，在仙台病毒基因组RNA(负链)上，将H1foo基因等配置于最靠3’侧的情况下(例如，较之NP基因更靠3’侧)，H1foo基因等的表达量增加得最多。使用仙台病毒载体的情况下，优选将H1foo基因等配置于较之仙台病毒的全部基因更靠3’侧。即，优选将H1foo基因等配置于最靠3’侧。由此，容易适度地维持H1foo蛋白的表达量、与通过不稳定结构域促进的H1foo蛋白的降解量的平衡。因此，可以以高效率制作品质更高的iPS细胞。另外，通过使导入对象细胞感染仙台病毒，从而可以以高效率制作品质更高的iPS细胞。
使用病毒载体作为表达载体的情况下，可以使用利用包装细胞得到的病毒粒子。包装细胞是导入编码病毒的结构蛋白的基因的细胞，若在该细胞中导入组入有目的基因的重组病毒载体，则产生组入有该目的基因的重组病毒粒子。包装细胞没有特别限定，可以根据目的适当选择。例如，可举出以源自人肾脏的HEK293细胞或源自小鼠成纤维细胞的NIH3T3细胞为基础的包装细胞；以表达源自Ecotropic virus的包膜糖蛋白的方式设计的PLAT-E细胞；以表达源自Amphotropic virus的包膜糖蛋白的方式设计的PLAT-A细胞；及以表达源自水疱性口炎病毒的包膜糖蛋白的方式设计的PLAT-GP细胞等。病毒载体的导入对象为人体细胞的情况下，作为包装细胞，出于宿主靶向性这点，优选PLAT-A细胞、PLAT-GP细胞等。病毒载体向包装细胞导入的方法没有特别限定，可以根据目的适当选择。例如，可举出脂质体转染法、电穿孔法、磷酸钙法等。
表达载体也可以包含后述的核重编程物质。表达载体包含核重编程物质的情况下，该核重编程物质可以为一种，也可以为两种以上。表达载体具有H1 foo基因等和核重编程物质的情况下，也可以使编码2A肽等自切割肽的碱基序列、或IRES(Intemal RibozymeEntry Site，内部核糖体进入位点)序列等介于H1foo基因等与核重编程物质之间。通过介在上述序列，可以由一个启动子独立地表达多个蛋白质。
优选的方式中，本实施方式的品质改善剂是以能表达的形态搭载有编码H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白的多核苷酸的仙台病毒载体。进一步优选的方式中，本实施方式的品质改善剂是以能表达的形态搭载有编码H1foo蛋白与源自FKBP12的不稳定结构域的融合蛋白的多核苷酸的仙台病毒载体。作为包含H1FOO的前述融合蛋白的具体例，可举出包含序列号16或序列号18中记载的氨基酸序列的蛋白质。作为编码这些蛋白质的多核苷酸的具体例，可举出包含序列号15或序列号17中记载的核苷酸序列的多核苷酸。
<第二实施方式>
一个实施方式中，本发明提供包含H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白的、iPS细胞的品质改善剂。前述不稳定结构域是诱导前述融合蛋白的基于蛋白酶体的降解的结构域。
(H1foo蛋白)
H1foo蛋白是由上述“<第一实施方式>”中说明的H1foo基因转录及翻译而产生的蛋白质，具有H1foo活性。作为H1foo蛋白所源自的生物种类，没有特别限制，可以根据目的适当选择、例如，可举出人、小鼠、大鼠、牛、绵羊、马、猴等任意的哺乳动物。将人的H1foo蛋白的氨基酸序列示于序列号2。另外，将小鼠的H1foo蛋白的氨基酸序列示于序列号4。
H1foo蛋白并不限于野生型的H1foo蛋白，也可以为包含突变(缺失、取代、插入及添加中的任一者、或它们的组合)的H1foo蛋白。只要是具有H1foo活性的蛋白质，则突变的数目没有特别限定。
作为H1foo蛋白，例如，可举出以下的(a)～(c)。
(a)野生型的H1foo蛋白(例如，由序列号2或序列号4所表示的氨基酸序列构成的多肽)
(b)由野生型的H1foo蛋白的氨基酸序列(例如，序列号2或4所表示的氨基酸序列)中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、且具有H1foo活性的蛋白质
(c)由与野生型的H1foo蛋白的氨基酸序列(例如，序列号2或4所表示的氨基酸序列)具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成、且具有H1foo活性的蛋白质
上述(b)中，“突变”可以为缺失、取代、添加及插入中的任一者，也可以为它们的组合。
上述(b)中，“多个”只要作为结果而产生的蛋白质具有H1foo活性就没有特别限定，例如，可例示出2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，进一步优选为2～5个，特别优选为2个或3个。
上述(c)中，序列同一性只要为70％以上就没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上。
(不稳定结构域)
不稳定结构域与上述“<第一实施方式>”中说明的不稳定结构域同样，可例示出与上述“<第一实施方式>”中例示的不稳定结构域同样的不稳定结构域。
(融合蛋白)
H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白在H1foo蛋白的N末端及C末端中的至少一者连接有不稳定结构域。不稳定结构域可以连接于H1foo蛋白的N末端及C末端中的任一者，也可以连接于N末端及C末端这两者。
H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白可以使用包含在H1foo基因的5’末端或3’末端中的至少一者连接有不稳定结构域基因的多核苷酸的表达载体而制备。该融合蛋白可以通过下述方式而获得：将该表达载体导入适宜的细胞，对该细胞进行培养，从其培养上清液或培养菌体或者细胞中分离·纯化融合蛋白。
H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白可以还具有蛋白转导结构域(PTD)。作为PTD，开发了使用源自果蝇的AntP、源自HIV的TAT、源自HSV的VP22等蛋白质的细胞穿透结构域的PTD。通过具有PTD，可以在不使用蛋白质导入试剂的情况下将融合蛋白导入至细胞。
H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白导入至体细胞的情况下，由于具有不稳定结构域，因此迅速地被蛋白酶体降解。需要说明的是，包含不稳定结构域的融合蛋白可以通过添加稳定化化合物从而对在细胞内的存在量及存在时期进行调控。因此，可以对细胞内的H1foo蛋白的存在量及存在时期进行调控。将本实施方式的iPS细胞的品质改善剂与后述的核重编程物质一同导入至体细胞后，以H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白仅在例如刚导入后的任意时间存在于细胞内的方式进行调控，从而可以制备品质高的iPS细胞。
本发明的iPS细胞的品质改善剂、及iPS细胞的制备方法中，也可以使用在与核重编程物质一同导入至体细胞、具有在开始细胞的重编程之际同时抑制该细胞内的固有免疫应答的功能的物质来代替具有上述H1foo基因和调控序列的多核苷酸。所谓固有免疫应答的抑制，作为具体例，意指抑制IFIT1、IFNA等固有免疫应答标志物的表达，此外，具体而言，意指在该细胞内使FKBP1A的表达与仅导入核重编程物质的情况相比增加至2倍以上、优选2～20倍、进一步优选5～15倍。此处，所谓开始细胞的重编程之际，是指自导入核重编程物质起第2～15天、优选第3～6天。通过进行这样的重编程步骤，不仅iPS细胞的建立效率提高，而且可使得所制备的iPS细胞群之中包含大量的高分化多能性等作为iPS细胞的品质高的细胞，因此作为异体iPS细胞的制备方法也是有效的，在制备自体iPS细胞时不作为细胞株建立而是以大批量处理的情况下具有特别大的效果。
具有抑制固有免疫应答的功能的物质只要可抑制固有免疫应答标志物的表达，就没有特别限定。作为具有抑制固有免疫应答的功能的物质，例如，可举出针对固有免疫应答标志物基因的siRNA或者反义RNA、固有免疫应答标志物基因的转录抑制因子、FKBP1A、FKBP1A基因、FKBP1A的转录促进因子等，但并不限于此。
[iPS细胞的制备方法]
<第一实施方式>
一个实施方式中，本发明提供iPS细胞的制备方法。包括将核重编程物质和上述实施方式的iPS细胞的品质改善剂导入至体细胞的步骤。
《导入步骤》
本实施方式的iPS细胞的制备方法提供iPS细胞的制备方法。包括将核重编程物质和上述实施方式的iPS细胞的品质改善剂导入至体细胞的步骤。
(iPS细胞的品质改善剂)
iPS细胞的品质改善剂可以为上述“[iPS细胞的品质改善剂]”中说明的第一实施方式及第二实施方式中的任一者。另外，也可以同时使用第一实施方式及第二实施方式这两者的iPS细胞的品质改善剂。
(核重编程物质)
本说明书中，“核重编程物质”意指能够通过导入至体细胞从而将该体细胞诱导成iPS细胞的物质(组)。核重编程物质只要是能够自体细胞诱导成iPS细胞的物质(组)就没有特别限定。核重编程物质也可以是基因(包括插入至表达载体的形态)或者其基因产物、或低分子化合物等任意的物质。“基因产物”意指由基因转录的mRNA、及由该mRNA翻译的蛋白质。作为核重编程物质使用的基因产物可以是mRNA，可以是蛋白质，也可以是这两者。作为核重编程物质的基因意指编码作为核重编程物质的蛋白质的多核苷酸。
核重编程物质为基因或其基因产物的情况下，可举出选自由Oct基因家族的基因、Sox基因家族的基因、K1f基因家族的基因、Myc基因家族的基因、Lin基因家族的基因、及Nanog基因、以及它们的基因产物组成的组中的至少一者(国际公开第2007/69666号；日本专利第5696282号；Science，2007，318：1917-1920)。上述之中，可优选举出选自由Oct基因家族的基因、Sox基因家族的基因、Klf基因家族基因、及Myc基因家族的基因、及这些基因的基因产物组成的组中的至少一者。
以下列举出这些家族的基因及其组合的具体例。需要说明的是，以下仅记载了基因的名称，但也包括使用该基因产物的情况。
(a)由Oct基因家族的基因组成的一种核重编程物质；
(b)由Oct基因家族的基因及Sox基因家族的基因组成的两种核重编程物质的组合；
(c)由Oct基因家族的基因及Klf基因家族的基因组成的两种核重编程物质的组合；
(d)由Oct基因家族的基因及Nanog基因组成的两种核重编程物质的组合；
(e)由Oct基因家族的基因、Sox基因家族的基因、及Klf基因家族的基因组成的三种核重编程物质的组合；
(f)由Oct基因家族的基因、Klf基因家族的基因及Myc基因家族的基因组成的三种核重编程物质的组合。
(g)由Oct基因家族的基因、Sox基因家族的基因、Klf基因家族的基因及Myc基因家族的基因组成的四种核重编程物质的组合；以及
(h)由Oct基因家族的基因、Sox基因家族的基因、Lin基因家族的基因、及Nanog基因组成的四种核重编程物质的组合。
更具体而言，示例出以下的组合，但并不限于此。以下的组合中，Sox2基因可以用Sox1基因、Sox3基因、Sox15基因、Sox17基因、或Sox18基因替换。Klf4基因可以用Klf1基因、Klf2基因、或Klf5基因替换。c-Myc基因可以用T58A(活性型突变体)基因、N-Myc基因、或L-Myc基因替换。
(1)Oct3/4基因、K1f4基因、c-Myc基因
(2)Oct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因、c-Myc基因
(3)Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、c-Myc基因、Fbx15基因、Nanog基因、Eras基因、ECAT15-2基因、TclI基因、β-catenin(活性型突变体S33Y)
(4)Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、c-Myc基因、hTERT基因、SV40LargeTantigen(以下为SV40LT)基因
(5)Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、c-Myc基因、hTERT基因、HPV16E6基因
(6)Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、c-Myc基因、hTERT基因、HPV16E7基因
(7)Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、c-Myc基因、hTERT基因、HPV6E6基因、HPV16E7基因
(8)Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、c-Myc基因、hTERT基因、Bmil基因
(关于上述(1)～(8)的组合中，参见国际公开第2007/069666号(其中，上述(2)的组合中，关于由Sox2基因替换为Sox18基因、由K1f4基因替换为K1f1基因或者K1f5基因，参见Nature Biotechnology，26，101-106(2008))。关于“Oct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因、c-Myc基因”的组合，也可参见Cell，126，663-676(2006)、Cell，131，861-872(2007)等。关于“Oct3/4基因、Sox2基因、K1f2(或K1f5)基因、c-Myc基因”的组合，也可参见Nat.CellBiol.，11，197-203(2009)。关于“Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、c-Myc基因、hTERT基因、SV40LT基因”的组合，也可参见Nature，451，141-146(2008)。)
(9)Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因(参见Nature Biotechnology，26，101-106(2008))
(10)Oct3/4基因、Sox2基因、Nanog基因、Lin28基因(参见Science，318，1917-1920(2007))
(11)Oct3/4基因、Sox2基因、Nanog基因、Lin28基因、hTERT基因、SV40LT基因(参见Stem Cells，26，1998-2005(2008))
(12)Oct3/4基因、Sox2基因、Klf：4基因、c-Myc基因、Nanog基因、Lin28基因(参见Cell Research(2008)600-603)
(13)Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、c-Myc基因、SV40LT基因(参见Stem Cells，26，1998-2005(2008))
(14)Oct3/4基因、K1f4基因(参见Nature 454：646-650(2008)、Cell Stem Cell，2：525-528(2008))
(15)Oct3/4基因、c-Myc基因(参见Nature 454：646-650(2008))
(16)Oct3/4基因、Sox2基因(参见Nature，451，141-146(2008)，国际公开第2008/118820号)
(17)Oct3/4基因、Sox2基因、Nanog基因(参见国际公开第2008/118820号)
(18)Oct3/4基因、Sox2基因、Lin28基因(参见国际公开第2008/118820号)
(19)Oct3/4基因、Sox2基因、c-Myc基因、Esrrb基因(Essrrb基因可以用Esrrg基因替换。参见Nat.Cell Biol.，11，197-203(2009))
(20)Oct3/4基因、Sox2基因、Esrrb基因(参见Nat.Cell Biol.，11，197-203(2009))
(21)Oct3/4基因、K1f4基因、L-Myc基因
(22)Oct3/4基因、Nanog基因
(23)Oct3/4基因
(24)Oct3/4基因、K1f4基因、c-Myc基因、Sox2基因、Nanog基因、Lin28基因、SV40LT基因(参见Science，324：797-801(2009))
上述(1)～(24)的组合中，也可以使用其他Oct基因家族的成员基因(例如Oct1A、Oct6等)来代替Oct3/4基因。也可以使用其他Sox基因家族的成员基因(例如Sox7基因等)来代替Sox2基因(或Sox1基因、Sox3基因、Sox15基因、Sox17基因、Sox18基因)。也可以使用其他Lin基因家族的成员基因(例如Lin28b基因等)来代替Lin28基因。
不属于上述(1)～(24)的组合但包含它们中任一项的全部构成要素、且还包含任意的其他物质的组合也可包含在本发明中的“核重编程物质”的范畴中。在作为核重编程的对象的体细胞以足以用于核重编程的水平内源性地表达上述(1)～(24)的组合中任一项的构成要素的一部分的条件下，除了所述构成要素之外的仅剩下的构成要素的组合也可包含在本发明中的“核重编程物质”的范畴中。
在上述的核重编程物质之外，可以组合选自由Fbx15基因、ERas基因、ECAT15-2基因、Tcl1基因、及β-catenin基因组成的组中的一种以上的核重编程物质，及/或也可以组合选自由ECAT1基因、Esg1基因、Dnmt3L基因、ECAT8基因、Gdf3基因、Myb12基因、ECAT15-1基因、Fth117基因、Sall4基因、Rex1基因、UTF1基因、Stella基因、Stat3基因、及Grb2基因组成的组中的一种以上的核重编程物质。关于这些组合，在国际公开第2007/69666号中具体地进行了说明。
作为优选的核重编程物质，可例示出选自由Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、c-Myc基因(或L-Myc基因)、Lin28基因、Nanog基因、及这些基因的基因产物组成的组中的至少一者。优选选自由Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、c-Myc基因(或L-Myc基因)、Lin28基因、Nanog基因、它们的基因产物组成的组中的至少两者以上的组合，更优选为三者以上的组合。其中，作为优选至少被导入的核重编程物质的组合，可举出(1)Oct3/4基因或其基因产物、Sox2基因或其基因产物、及K1f4基因或其基因产物；(2)Oct3/4基因或其基因产物、Sox2基因或其基因产物、Klf4基因或其基因产物、及c-Myc基因或其基因产物；(3)Oct3/4基因或其基因产物、Sox2基因或其基因产物、K1f：4基因或其基因产物、及L-Myc基因或其基因产物。其中，优选Oct3/4基因或其基因产物、Sox2基因或其基因产物、及K1f：4基因或其基因产物的组合、以及Oct3/4基因或其基因产物、Sox2基因或其基因产物、K1f4基因或其基因产物、及L-Myc基因或其基因产物的组合。其中，更优选为Oct3/4基因、Sox2基因、及Klf4基因的组合、以及Oct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因、及L-Myc基因的组合。
核重编程物质为基因或其基因产物的情况下，作为该基因所源自的生物种类，没有特别限制，可以根据目的适当选择，例如可举出人、小鼠、大鼠、牛、绵羊、马、猴等任意的哺乳动物。
上述的各核重编程物质的cDNA序列信息可以从已知的数据库获得。例如，可以参见国际公开第2007/069666号中记载的GenBank中的登录号。Nanog基因在前述公报中以“ECAT4”的名称被记载。
以下记载上述的各核重编程物质之中特别优选的4个基因(Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、L-Myc基因)的小鼠及人cDNA序列信息。
基因名称小鼠人
Oct3/4NM_013633NM_002701
Sox2 NM_011443NM_003106
Klf4 NM_010637NM_004235
L-Myc NM_008506NM_001033081
将上述GenBank登录号中登记的人的Oct3/4基因的cDNA序列示于序列号5，将人的Oct3/4蛋白的氨基酸序列示于序列号6。将人的Sox2基因的cDNA序列示于序列号7，将人的Sox2蛋白的氨基酸序列示于序列号8。将人的K1f4基因的cDNA序列示于序列号9，将人的Klf4蛋白的氨基酸序列示于序列号10。将人的L-Myc基因的cDNA序列示于序列号11，将人的L-Myc蛋白的氨基酸序列示于序列号12。
另外，以下记载上述的各核重编程物质之中、国际公开第2007/069666号中未记载GenBank登录号的基因的小鼠及人cDNA序列信息。
基因名称小鼠人
Lin28 NM_145833NM_024674
Lin28b NM_001031772NM_001004317
Esrrb NM_011934NM_004452
Esrrg NM_011935NM_001438
上述各核重编程物质的cDNA可以基于上述的cDNA序列信息或已知的数据库中登记的序列信息使用PCR法等已知的方法从该序列所源自的生物的细胞容易地分离。
核重编程物质为上述各基因或其mRNA的情况下，它们的核苷酸序列不限于野生型基因的核苷酸序列，只要具有核重编程作用，也可以包含突变。上述各基因的各核苷酸序列可以仅为蛋白质编码序列，也可以包含除此以外的部分(例如，内含子、5’UTR、3’UTR等)。
核重编程物质为由上述各基因编码的蛋白质的情况下，它们的氨基酸序列不限于野生型蛋白的氨基酸序列，只要具有核重编程作用，也可以包含突变。
本说明书中，“核重编程作用”意指通过导入至体细胞从而将该体细胞诱导成iPS细胞的作用。
核重编程物质为基因或mRNA的情况下。作为核重编程物质，例如，可举出以下的(a)～(g)。
(a)作为上述核重编程物质而例示的野生型基因或野生型mRNA
(b)由编码作为上述核重编程物质而例示的野生型蛋白的核苷酸序列构成的多核苷酸
(c)编码由作为上述核重编程物质而例示的野生型蛋白中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、且具有核重编程作用的蛋白质的多核苷酸
(d)编码由与作为上述核重编程物质而例示的野生型蛋白的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成、且具有核重编程作用的蛋白质的多核苷酸
(e)编码由作为上述核重编程物质而例示的野生型基因的核苷酸序列中1个或多个核苷酸突变而得的核苷酸序列构成、且具有核重编程作用的蛋白质的多核苷酸
(f)由与作为上述核重编程物质而例示的野生型基因的核苷酸序列具有70％以上的序列同一性的核苷酸序列构成、且编码具有核重编程作用的蛋白质的多核苷酸
(g)与作为上述核重编程物质而例示的野生型基因的核苷酸序列在严格性条件下杂交、且编码具有核重编程作用的蛋白质的多核苷酸
上述(c)及(e)中，“突变”可以是缺失、取代、添加及插入中的任一者，也可以是它们的组合。
对于上述(c)而言，“多个”只要作为结果而产生的蛋白质具有核重编程活性就没有特别限定，例如，可例示出2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，进一步优选为2～5个，特别优选为2个或3个。
上述(e)中，“多个”只要作为结果而产生的多核苷酸编码具有核重编程作用的蛋白质就没有特别限定，例如，可例示出2～60个，优选为2～50个，更优选为2～40个或2～30个，进一步优选为2～20个或2～10个，特别优选为2～5个或2个或者3个。
上述(d)及(f)中，序列同一性只要为70％以上就没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上。
上述(g)中，所谓“严格性条件”，可举出与上述“[iPS细胞的品质改善剂]、<第一实施方式>、(H1foo基因)”项中例示的条件同样的条件。
上述(b)～(e)中，简并密码子优选使用在使用本实施方式的iPS细胞的品质改善剂的体细胞中密码子使用频率高的密码子。例如，用于人的体细胞的情况下，优选使用人细胞中使用频率高的密码子。即，优选按人密码子进行优化。另外，用于小鼠的体细胞的情况下，优选使用小鼠细胞中使用频率高的密码子。即，优选按小鼠密码子进行优化。
核重编程物质为基因的情况下，该基因优选插入表达载体中。作为表达载体，可举出与上述“[iPS细胞的品质改善剂]、(多核苷酸)”项中举出的表达载体同样的表达载体。其中，作为表达载体，优选仙台病毒载体。使用表达载体的情况下，在一个表达载体中可以仅插入一种核重编程物质，也可以插入两种以上的核重编程物质。表达载体包含两种以上的核重编程物质的情况下，也可以使编码2A肽等自切割肽的碱基序列、IRES序列等介于作为核重编程物质的两种以上的基因间。
核重编程物质为蛋白质的情况下，作为核重编程物质，例如，可举出以下的(A)～(C)。
(A)作为上述核重编程物质而例示的野生型蛋白
(B)由作为上述核重编程物质而例示的野生型蛋白的氨基酸序列中1个或多个氨基酸突变而得的氨基酸序列构成、且具有核重编程活性的蛋白质
(C)由与作为上述核重编程物质而例示的野生型蛋白具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成、且具有核重编程活性的蛋白质
上述(B)中，“突变”可以是缺失、取代、添加及插入中的任一者，也可以是它们的组合。
上述(B)中，“多个”只要作为结果而产生的蛋白质具有核重编程活性就没有特别限定，例如，可例示出2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，进一步优选为2～5个，特别优选为2个或3个。
上述(C)中，序列同一性只要为70％以上就没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上。
核重编程物质为蛋白质的情况下，为了向体细胞导入，也可以连接蛋白转导结构域(PTD)。
核重编程物质为基因或其基因产物的情况下，可以是仅使用基因的形态，可以是仅使用其基因产物的形态，也可以是使用基因和其基因产物这两者的形态。核重编程物质为基因或其基因产物、且同时使用两种以上的“基因或其基因产物”的情况下，也可以是针对某基因使用基因产物、针对其他基因使用基因的形态。
核重编程物质优选为上述例示的基因或基因的组合，更优选为表达载体的形态。
(体细胞)
体细胞没有特别限定，可以根据目的适当选择。作为体细胞，例如，可举出胚胎期的体细胞、成熟的体细胞等。作为成熟的体细胞的具体例，可举出间充质干细胞、造血干细胞、源自脂肪组织的基质细胞、源自脂肪组织的基质干细胞、神经干细胞、精原干细胞等组织干细胞(成体干细胞)；组织祖细胞；成纤维细胞、上皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞等已经分化的细胞；等等。
体细胞所源自的生物种类没有特别限定，可以根据目的适当选择。作为体细胞所源自的生物种类，例如，可举出人、小鼠、大鼠、牛、绵羊、马、猴等任意的哺乳动物。体细胞所源自的生物种类与核重编程物质所源自的生物种类可以不同，但优选相同。上述实施方式的iPS细胞的品质改善剂中所含的H1foo基因或H1foo蛋白所源自的生物种类与体细胞所源自的生物种类可以不同，但优选相同。
作为体细胞所源自的个体，没有特别限制，可以根据目的适当选择。其中，将用本实施方式的方法制备的iPS细胞用于再生医疗用途的情况下，从排斥反应的观点考虑，优选作为该再生医疗的对象的个体本身、或与作为该再生医疗的对象的个体的MHC类型相同或者实质相同的其他个体。此处，上述MHC类型实质相同是指，MHC类型以将由源自上述体细胞的iPS细胞分化诱导而得到的细胞移植至个体的情况下、通过使用免疫抑制剂等而使移植细胞能植活的程度一致。
为了使iPS细胞的筛选变得容易，体细胞可以为导入异体基因的重组体细胞。作为重组体细胞的具体例，可举出在于分化多能性细胞(pluripotent cell)中特异性高表达的基因的基因座上整合有报告基因及耐药基因中的至少一者的重组体细胞。作为于分化多能性细胞中特异性高表达的基因，例如，可举出Fbx15基因、Nanog基因、Oct3/4基因等。作为报告基因，例如，可举出绿色荧光蛋白(GFP)基因、萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因等。作为上述耐药基因，可举出杀稻瘟素基因、潮霉素基因、嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因等。
体细胞的培养条件没有特别限定，可以根据目的适当选择。例如，可举出培养温度为约37℃，CO2浓度为约2％～5％，O2浓度为约5％～20％等。体细胞的培养中使用的培养基没有特别限定，可以根据目的适当选择。例如，可举出包含5质量％～20质量％的血清的最少必需培养基(MEM)、Dulbecco改良培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等。本说明书中，关于浓度，简记为“％”的情况意指“容量％”。
(向体细胞导入)
将核重编程物质和上述实施方式的iPS细胞的品质改善剂(以下，简称为“品质改善剂”)导入至体细胞的方法没有特别限定，可以根据目的适当选择。若考虑向体细胞导入的容易度，则核重编程物质较之以蛋白质的形态导入体细胞，优选以基因的形态、或该基因的mRNA的形态导入体细胞，更优选以基因的形态导入至体细胞。特别优选核重编程物质以表达载体的形态导入至体细胞。同样地，品质改善剂中所含的多核苷酸也优选为表达载体的形态。
将表达载体导入至体细胞的方法没有特别限定，可以根据目的适当选择。作为表达载体向体细胞导入的方法，例如，可举出脂质体转染法、显微注射法、DEAE葡聚糖法、基因枪法、电穿孔法、磷酸钙法等。表达载体为病毒载体的情况下，作为使体细胞感染病毒载体的方法，例如，可举出凝聚胺法。
使用仙台病毒载体作为表达载体的情况下，核重编程物质或品质改善剂、或者搭载有核重编程物质及品质改善剂的仙台病毒载体通过将该载体(仙台病毒粒子)添加于包含体细胞的培养基中并使该体细胞感染而导入至该体细胞内。仙台病毒载体的用量可以适当调节，例如，可以以感染复数(MOI)0.1以上、优选0.3以上、0.5以上、1以上、2以上、或3以上、且100以下、优选90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下、20以下、10以下、或5以下使其感染。以优选MOI 0.3～100、更优选MOI 0.5～50、MOI 1～40、MOI 1～30、MOI 2～30、或MOI 3～30使其感染。
仙台病毒载体为RNP的形态的情况下，例如可以通过电穿孔、脂质体转染、显微注射等手法而导入至细胞内。
核重编程物质为mRNA的情况下，将mRNA(信使RNA)导入至体细胞的方法没有特别限定，可以适当选择并使用已知的方法。例如，mRNA可以使用Lipofectamine(注册商标)MessengerMAX(Life Technologies公司制)等市售的RNA转染试剂等导入至体细胞。
核重编程物质为蛋白质的情况下，将蛋白质导入至体细胞的方法没有特别限定，可以适当选择并使用已知的方法。作为这样的方法，例如，可举出使用蛋白质导入试剂的方法、使用蛋白转导结构域(PTD)融合蛋白的方法、显微注射法等。品质改善剂包含H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白的情况也可以适当选择已知的方法导入至体细胞。
作为蛋白质导入试剂，以阳离子性脂质为基础的BioPOTER(注册商标)蛋白转运试剂(Protein Delivery Reagent)(Gene Therapy Systmes公司制)及Pro-JectTM蛋白转染试剂(Pro-JectTM Protein Transfection Reagent)(PIERCE公司制)；以脂质为基础的Profect-1(Targeting Systems公司制)；以膜透过性肽为基础的Penetratin Peptide(Qbiogene公司制)及Chariot Kit(Active Motif公司制)；利用了HVJ包膜(灭活仙台病毒)的GenomONE(石原产业公司制)等已有市售。蛋白质的导入可以按照上述试剂随附的方案而进行，通常的步骤如下所述。将蛋白质稀释于适宜的溶剂(例如，PBS、HEPES等缓冲液)，加入导入试剂于室温孵育5～15分钟左右而形成复合体，将其添加于更换为无血清培养基的细胞并于37℃孵育1小时～数小时。然后，除去培养基并更换为含血清培养基。
作为PTD，可举出与上述“[iPS细胞的品质改善剂]、<第二实施方式>、(融合蛋白)”项中举出的PTD同样的PTD。使用PTD的情况下，除不添加蛋白质导入试剂以外，也可以与上述同样的方式进行。
显微注射法是将蛋白质加入至前端直径1μm左右的玻璃针，穿刺导入细胞的方法，可以可靠地将蛋白质导入至细胞内。以前，在小鼠及人中，开发了将蛋白质的形态的核重编程物质与聚精氨酸、TAT等CPP(cell penetrating peptide)一同导入而建立iPS细胞的方法，也可以使用这些手法(Cell Stem Cell，4：381-384(2009))。
本实施方式的iPS细胞的制备方法中，核重编程物质及品质改善剂向体细胞导入的次数可以为1次，也可以为2次以上。其导入时期没有特别限定，可以根据目的适当选择。可以将核重编程物质及品质改善剂的全部在同时期导入，也可以将一部分或全部在不同的时期导入。优选核重编程物质及品质改善剂全部在同时期导入至体细胞。导入次数优选为1次。
核重编程物质基因或其基因产物的情况下，作为核重编程物质向体细胞的导入量，只要能对该体细胞的核进行重编程就没有特别限制，可以将所使用的全部基因或其基因产物分别等量导入，也可以按不同的量导入。关于基因或其基因产物，作为使用基因的情况的例子，可举出将Oct3/4基因以相对于Sox2基因、Klf4基因、或c-Myc基因或者L-Myc基因而言为更多量(例如约3倍量)的方式导入的方法(PNAS 106(31)：12759-12764(2009)、J.Biol.Chem.287(43)：36273-36282(2012))。
本实施方式的iPS细胞的制备方法中使用的核重编程物质为低分子化合物的情况下，该低分子化合物与体细胞的接触可以通过下述方式实施：将该低分子化合物以适宜的浓度溶解于水性或非水性溶剂，在适合体细胞培养的培养基(例如，包含约5～20％的胎牛血清的最少必需培养基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等)中以该低分子化合物的浓度为足以在体细胞中发生核重编程、且未观察到细胞毒性的范围内的方式添加该低分子化合物溶液，对细胞进行一定时间培养。作为核重编程物质的低分子化合物的浓度根据所使用的该低分子化合物的种类的不同而有所不同，可以在约0.1nM～约100nM的范围内适当选择。接触时间只要是足以完成细胞的核重编程的时间就没有特别限制，通常只要与培养基共存直至阳性集落出现即可。
《其他步骤》
本实施方式的iPS细胞的制备方法在上述导入步骤之外也可根据需要还包括其他步骤。作为其他步骤，只要不损害本发明的效果就没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，可举出对导入核重编程物质及品质改善剂的体细胞(以下，简记为“导入细胞”)进行培养的步骤(以下，简单表述为“导入细胞培养步骤”)等。
(导入细胞培养步骤)
导入细胞培养步骤是培养导入细胞的步骤。作为导入细胞的培养条件，没有特别限定，可以使用通常所使用的干细胞的培养条件，例如，作为培养条件，可举出适合ES细胞培养的条件。作为该条件，例如，可举出培养温度为约37℃，CO2浓度为约2％～5％，O2浓度为约5％～20％等。导入细胞的培养所使用的培养基没有特别限定，可以根据目的适当选择。小鼠细胞的情况下，在通常的培养基中添加作为分化抑制因子的Leukemia InhibitoryFactor(LIF)而进行培养。另一方面，人细胞的情况下，根据培养条件添加LIF或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及/或干细胞因子(SCF)。通常细胞在作为饲养细胞的、用放射线、抗生素进行处理而停止了细胞分裂的源自小鼠胚胎的成纤维细胞(MEF)的共存下进行培养。作为MEF，通常多使用STO细胞等，但iPS细胞的诱导中多使用SNL细胞(McMahon，A.P.&Bradley，A.Cell 62，1073-1085(1990))等。与饲养细胞的共培养可以在导入核重编程物质及品质改善剂之前开始，也可以在该导入时期开始、或者自该导入后(例如1～10天后)起开始。
作为上述的导入细胞培养步骤的时间，没有特别限制，可以根据目的适当选择。
本实施方式的iPS细胞的制备方法可以在核重编程物质及品质改善剂导入至体细胞后，通过品质改善剂中所含的调控序列对H1foo蛋白的在细胞内的存在时期及存在量中的至少一者进行调控。因此，可以适当调控H1foo蛋白的存在时期或存在量，其结果，可以获得品质高的iPS细胞。
<第二实施方式>
一个实施方式中，本发明提供包括将核重编程物质和H1foo基因导入至体细胞的步骤的、iPS细胞的制备方法。由已导入前述体细胞的前述H1foo基因表达的H1foo蛋白的在前述体细胞内的存在时期及存在量中的至少一者被调控。
《导入步骤》
本实施方式的制备方法包括将核重编程物质和H1foo基因导入至体细胞的步骤。
(核重编程物质)
核重编程物质与上述“<第一实施方式>”中说明的核重编程物质同样。优选的核重编程物质也可举出与上述“<第一实施方式>”中举出的核重编程物质同样的物质。
(H1foo基因)
H1foo基因与上述“[iPS细胞的品质改善剂]、<第一实施方式>(H1foo基因)”中说明的H1foo基因同样。优选的H1foo基因也可举出与上述“[iPS细胞的品质改善剂]、<第一实施方式>(H1foo基因)”中举出的H1foo基因同样的基因。
本实施方式的iPS细胞的制备方法中，由已导入至体细胞的H1foo基因表达的H1foo蛋白的在体细胞内的存在时期及存在量中的至少一者被调控。对前述H1foo蛋白在体细胞内的存在时期及存在量进行调控的方法没有特别限定，可以使用已知的方法。
作为对H1foo蛋白的存在时期及存在量进行调控的方法，可优选举出使用“[iPS细胞的品质改善剂]、<第一实施方式>(调控序列)”中举出的调控序列的方法。例如，可举出将不稳定结构域基因连接于H1foo基因，导入至体细胞时，作为H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白进行表达的方法。该情况下，该融合蛋白由于具有不稳定结构域，因此在细胞内生成后迅速地被蛋白酶体降解。由H1foo基因与不稳定结构域基因的融合基因转录及翻译而生成融合蛋白、融合蛋白生成后被蛋白酶体降解为止的时间例如为6小时以内，优选为4小时以内，进一步优选为3小时以内，特别优选为2小时以内。
融合蛋白的存在时期及存在量可以通过添加稳定化物质而进行调控。例如，通过向导入细胞的培养基中添加稳定化物质、或者从该培养基中回收细胞并转移至不含稳定化物质的培养基，可以使融合蛋白在所期望的时期存在于细胞内。另外，通过调节稳定化物质的添加量，可以对融合蛋白在细胞内的存在量进行调控。
或者，也可以将刺激应答性启动子连接于H1foo基因的上游，导入至体细胞时，H1foo基因在该刺激应答性启动子的调控下表达。该情况下，通过对导入细胞给予该刺激应答性启动子所应答的“刺激”，可以对H1foo蛋白的存在时期及存在量进行调控。刺激应答性启动子为四环素应答性启动子的情况下，可以使用四环素或其衍生物(多西环素等)对H1foo基因的表达时期及表达量进行调控，作为其结果，可以对H1foo蛋白的在导入细胞内的存在时期及存在量进行调控。
(向体细胞的导入)
作为将核重编程物质及H1foo基因导入至体细胞的方法，可举出与上述“<第一实施方式>”举出的方法同样的方法。
<其他步骤>
本实施方式的iPS细胞的制备方法在上述导入步骤之外还可根据需要包括其他步骤。作为其他步骤，只要不损害本发明的效果就没有特别限制，可以根据目的适当选择。作为其他步骤，例如，与上述“<第一实施方式>”同样地，可举出导入细胞培养步骤等。导入细胞培养步骤可以与上述“<第一实施方式>”举出的方法同样地进行。
本实施方式的iPS细胞的制备方法也可以包括对导入细胞中H1foo蛋白的存在量及存在时期中的至少一者进行调控的步骤(以下称为“H1foo蛋白调控步骤”)。例如，H1foo蛋白作为与稳定结构域的融合蛋白而表达的情况下，H1foo蛋白的存在量及存在时期的调控可以使用稳定化物质而进行。另外，例如，H1foo基因在刺激应答性启动子的调控下表达的情况下，通过对导入细胞给予该应答性启动子所应答的刺激，可以对H1foo蛋白的存在量及存在时期进行调控。
就在导入细胞内的H1foo蛋白的存在量及存在时期而言，以制备iPS细胞时、成为体细胞的重编程完成为止的最大表达量的50％以下、优选30％以下、进一步优选20％以下的方式进行调控。更具体而言，以自导入至细胞的H1foo蛋白在细胞内的表达达到最大起24小时后成为50％以下、优选30％以下、进一步优选20％以下的方式进行调控。或者，核重编程物质向体细胞导入后的H1foo基因的表达持续时间也可以为前述导入后24小时以内。或者，导入核重编程物质的细胞中的H1foo蛋白的存在量在前述导入后经过5天左右的时期，与前述导入后的H1foo蛋白的最大存在量相比为小于约50％。
本实施方式的iPS细胞的制备方法可以适度对H1foo蛋白的在细胞内的存在时期及存在量中的至少一者进行调控。其结果，可以获得品质高的iPS细胞。
[iPS细胞]
一个实施方式中，本发明提供通过上述实施方式的iPS细胞的制备方法制备的iPS细胞。
iPS细胞是由体细胞诱导的多能干细胞，具有分化多能性(pluripotency)及自我复制能力。分化多能性意指可以分化成所有三胚层谱系。另外，前述自我复制能力意指能够保持着未分化状态而进行增殖的能力。
通过上述实施方式的iPS细胞的制备方法制备的细胞是否为iPS细胞的确认可以利用已知的方法进行。例如，可以通过未分化标志物的表达、类胚体形成能力、及/或嵌合体形成能力等来确认是否为iPS细胞。
通过上述实施方式的iPS细胞的制备方法制备的细胞可以为包含核重编程物质和上述实施方式的iPS细胞的品质改善剂的iPS细胞。通过上述实施方式的iPS细胞的制备方法制备的细胞可以为包含核重编程物质、H1foo基因和调控序列的细胞。通过上述实施方式的iPS细胞的制备方法制备的细胞也可以为包含核重编程物质、和H1foo基因与调控序列(例如，不稳定结构域基因)的融合基因的细胞。通过上述实施方式的iPS细胞的制备方法制备的细胞也可以为包含核重编程物质、和功能性地连接于刺激应答性启动子的H1foo基因的细胞。
用上述实施方式的制备方法制备的iPS细胞由于对导入细胞中H1foo蛋白的存在时期及存在量进行了适当调控，因此是品质高于用现有方法制备的iPS细胞的iPS细胞。尤其是，本实施方式的iPS细胞中，表达Tra-1-60的集落形成数提高。另外，原始态iPS细胞的生成能力提高。为原始态iPS细胞这一点，通过呈集落原始态特异性的圆顶形的形状、高表达原始态特异性的基因来进行确认。另外，分化为目的细胞(例如，心肌细胞、原始内胚层细胞)的能力提高。此外，用上述实施方式的制备方法制备的iPS细胞的细胞群为基因表达没有偏差的均一的细胞群。
[iPS细胞制备用组合物]
一个实施方式中，本发明提供iPS细胞制备用组合物。本实施方式的iPS细胞制备用组合物包含核重编程物质和上述实施方式的iPS细胞的品质改善剂。
核重编程物质与上述“[iPS细胞的制备方法]<第一实施方式>”中说明的核重编程物质同样。优选的核重编程物质也可举出与上述“<第一实施方式>”举出的核重编程物质同样的物质。
iPS细胞的品质改善剂与上述“[iPS细胞的品质改善剂]”中说明的iPS细胞的品质改善剂同样。优选的品质改善剂也可举出与上述“[iPS细胞的品质改善剂]”举出的品质改善剂同样的品质改善剂。
本实施方式的iPS细胞制备用组合物中，各核重编程物质及品质改善剂的量没有特别限定，可以全部为等量，也可以为各自不同的量。例如，使用Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、c-Myc基因或L-Myc基因作为核重编程物质的情况下，可以设为Oct3/4基因的量相对于Sox2基因、Klf4基因、或c-Myc基因或者L-Myc基因而言为更多量、例如约3倍量。
本实施方式的iPS细胞制备用组合物在核重编程物质及品质改善剂之外也可包含其他成分。作为其他成分，没有特别限定，例如，可举出缓冲液、基因导入试剂、蛋白质导入试剂等。
[其他实施方式]
作为其他实施方式，本发明提供包括将上述实施方式的iPS细胞的品质改善剂导入至体细胞的步骤的、iPS细胞的品质的改善方法。
作为其他实施方式，本发明提供H1foo基因与不稳定结构域基因的融合基因在iPS细胞的品质改善剂的制备中的用途。
作为其他实施方式，本发明提供H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白在iPS细胞的品质改善剂的制备中的用途。
作为其他实施方式，本发明提供连接于刺激应答性启动子的下游的H1foo基因在iPS细胞的品质改善剂的制备中的用途。
作为其他实施方式，本发明提供核重编程物质、及H1foo基因与不稳定结构域的融合基因在iPS细胞制备用组合物的制备中的用途。
作为其他实施方式，本发明提供核重编程物质、及H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白在iPS细胞制备用组合物的制备中的用途。
作为其他实施方式，本发明提供核重编程物质、及连接于刺激应答性启动子的下游的H1foo基因在iPS细胞制备用组合物的制备中的用途。
作为其他实施方式，本发明提供包含核重编程物质和上述实施方式的iPS细胞的品质改善剂的iPS细胞制备用试剂盒。核重编程物质、及品质改善剂可以分开在单独的容器中，可以汇总在1个容器中，也可以按任意数量汇总在容器中。另外，也可以包含基因导入试剂、蛋白质导入试剂、包装细胞、缓冲液、稀释液等。
实施例
以下利用实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不限于这些实施例。以下所有实验均按照庆应义塾大学及京都大学的动物及DNA实验指南进行，以被庆应义塾大学及京都大学的伦理委员会认可的、美国国立卫生研究院关于实验动物的管理和使用的指南为基准。
[实施例1]包含H1FOO基因的仙台病毒载体的构建
使用仙台病毒载体(SeV18；IDPHARMA公司制)和ProteoTunerTMShield System(Clontech公司制)，制作包含H1FOO cDNA(Teranishi，T.，等，Rapid replacement ofsomatic linker histones with the oocyte-specific linker histone H1foo innuclear transfer.Developmental Biology 266，76-86(2004).)的三种仙台病毒载体(图1)。
(a)SeV18+H1FOO/TS15ΔF是不含ProteoTunerTM Shield System的不稳定结构域(Destabilized domain：DD)的载体。
(b)SeV18+H1FOO-DD/TS15ΔF是包含在H1FOO cDNA的3’末端添加有DD编码序列的序列的载体。(b)的载体表达在H1FOO的C末端添加有DD的融合蛋白，促进H1FOO的降解。
(c)SeV18+DD-H1FOO/TS15ΔF是包含在H1FOO cDNA的5’末端添加有DD编码序列的序列的载体。(c)的载体表达在H1FOO的N末端添加有DD的融合蛋白，促进H1FOO的降解。
将上述(a)～(c)的载体中的各序列以以下的序列号表示。
DD编码序列：序列号13
H1FOO-DD编码序列：序列号15
DD-H1FOO编码序列：序列号17
另外，将上述载体(a)～(c)的制作使用的引物序列示于表1。
[表1]
[实施例2]H1FOO蛋白的Western印迹法
将包含H1FOO基因的上述(a)～(c)的各仙台病毒载体分别以感染复数(MOI)3导入至人皮肤成纤维细胞(TIG120株，由东京都老人综合研究所分售，Kondo等，Exp CellRes.1995 Oct；220(2)：501-4)，进行5天培养后，回收各细胞，使用抗H1FOO抗体(HPA037992；Sigma-A1drich公司制)，进行Western印迹法。
将结果示于图2。图2中，(1)～(4)分别示出了将(1)不含H1FOO的对照、(2)H1FOO(载体(a))、(3)H1FOO-DD(载体(b))、及(4)DD-H1FOO(载体(c))的各载体分别导入而得的各人皮肤成纤维细胞的结果。需要说明的是，5天后，(2)H1FOO中，H1FOO蛋白的表达量明显较高。另一方面，(3)H1FOO-DD、及(4)DD-H1FOO中，H1FOO-DD融合蛋白或DD-H1FOO融合蛋白的表达量降低。
(1)不含H1FOO的对照中，使用了在上述(a)的载体中代替H1FOO基因而包含Azami-Green基因的仙台病毒载体。
[实施例3]始发态人iPS细胞的制作和培养条件
人iPS细胞的制作按照文献(Ban，H.，Nishishita，N.，Fusaki，N.，Tabata，T.，Saeki，K.，Shikamura，M.，Takada，N.，Inoue，M.，Hasegawa，M.，Kawamata，S.，Nishikawa，S.，Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stemcells(iPSCs)by temperature-sensitive Sendai virus vectors，Proc Natl Acad SciU S A 108，14234-9，2011及Seki，T.，Yuasa，S.，Fukuda，K.，Generation of inducedpluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using acombination of activated T cells and Sendai Virus，Nature Protocols 7，718-728，2012)中记载的试验方案进行。与包含Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因及L-Myc基因的仙台病毒载体一同使用上述实施例1中制作的(a)～(c)中的任一种仙台病毒载体，自人皮肤成纤维细胞(TIG120株)及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells)(产品编号：CTL-UP1、Lot：HHU20140120、Cellular Technology Ltd.)制作始发态iPS细胞(以感染复数0.1～0.3使各细胞感染)。作为对照，使用在上述(a)的载体中代替H1FOO基因而包含Azami-Green基因的仙台病毒载体，制作iPS细胞(对照-iPS)。需要说明的是，本实验按照庆应义塾大学及京都大学的基因重组实验指南而进行。
以上述方式制作的人iPS细胞在StemFit AK02N(味之素公司制)培养液(以下称为“始发态人iPS细胞培养液”)中、用iMatrix-511(Nippi.Inc.制)进行了包被的培养皿上进行培养及维持。始发态人iPS细胞的培养液每2天进行更换，细胞每5～7天使用StemProAccutase(Gibco公司制)进行传代。
[实施例4]原始态人iPS细胞的制作和培养条件
人iPS细胞的制作按照文献(Ban，H.等，Proc Natl Acad Sci U S A 108，14234-9，2011；Seki，T.等，Nature Protocols 7，718-728，2012；Liu，X等，Nature Methods 14，1055-1062，2017)中记载的实验方案进行。与包含Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因及L-Myc基因的仙台病毒载体一同使用上述实施例1中制作的(a)～(c)中的任一种仙台病毒载体，由人皮肤成纤维细胞及人外周血单个核细胞制作原始态iPS细胞(以感染复数0.1～0.3使各细胞感染)。为原始态iPS细胞这一点，通过呈集落原始态特异性的圆顶形的形状、高表达原始态特异性的基因(关于KLF17、TFCP2L1、PRDM14、及DPPA3基因，通过定量PCR及免疫染色法确认)来进行确认。作为对照，使用在上述(a)的载体中代替H1FOO基因而包含Azami-Green基因的仙台病毒载体，制作iPS细胞(对照-iPS)。本实验按照庆应义塾大学及京都大学的基因重组实验指南而进行。
以上述方式制作的人iPS细胞在于NDiff227(Takara Bio公司制)中添加有CHIR99021(Sigma-Aldrich公司制)、PD0325901(Sigma-Aldrich公司制)、Go6983(Sigma-Aldrich公司制)、及Human recombinant leukemia inhibitory factor(FUJIFILM WakoPure Chemical Corporation制)的培养液(以下称为“原始态人iPS细胞培养液”)中、接种了放射线照射后小鼠胚胎成纤维细胞的培养皿上进行培养及维持。原始态人iPS细胞的培养液每2天进行更换，细胞每3～4天使用StemPro Accutase(Gibco公司制)进行传代。使用可调节氧浓度的培养箱在氧浓度5％的低氧环境下进行培养及传代。
[实施例5]基于ALP阳性iPS细胞集落数量的计数的iPS细胞建立效率的比较
按照上述实施例3中记载的方法，由人皮肤成纤维细胞制作始发态的(1)对照-iPS、(2)H1FOO-iPS、(3)H1FOO-DD-iPS、及(4)DD-H1FOO-iPS后，在始发态人iPS细胞培养液中培养15天，测定ALP阳性的集落数量。ALP作为干细胞标志物而为人所知。
将结果示于图3。显示(3)H1FOO-DD-iPS及(4)DD-H1FOO-iPS与(1)对照-iPS相比，ALP阳性细胞集落数量显著增加。
接着，为了验证由原本的细胞种类带来的效果的偏差，由人外周血单个核细胞制作始发态的(1)对照-iPS及(3)H1FOO-DD-iPS细胞，在始发态人iPS细胞培养液中培养15天，测定ALP阳性的集落数量。进一步为了比较原始态iPS细胞的建立效率，按照上述实施例4中记载的方法，分别由人皮肤成纤维细胞及人外周血单个核细胞制作原始态的(1)对照-iPS及(3)H1FOO-DD-iPS细胞，在原始态人iPS细胞培养液中培养15天，测定ALP阳性的集落数量。
将结果示于图4A～4C。显示图4A(由人外周血单个核细胞建立的始发态人iPS细胞)、图4B(由人皮肤成纤维细胞建立的原始态人iPS细胞)、及图4C(由人外周血单个核细胞建立的原始态人iPS细胞)均与图3的结果同样，(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，ALP阳性细胞集落数量显著增加。
由以上的结果表明了，无论原本的细胞种类及建立的iPS细胞的种类如何，H1FOO-DD均可改善人iPS细胞的建立效率。
[实施例6]基因表达量的偏差的比较
按照上述实施例3中记载的方法，由人皮肤成纤维细胞制作始发态的(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS。在始发态人iPS细胞培养液中培养约210天(28次传代)，针对(1)及(3)选择各8个克隆，进行RNA-seq。基于RNA-seq的数据分析结果，在(1)的8个克隆中，得到基因的表达量的平均绝对误差(mean absolute error：MAE)大于2.0(偏差大)的基因数。用同样的方法在(3)的8个克隆中也得到MAE大于2.0的基因数。将该结果示于图5A。
按照上述实施例4中记载的方法，由人皮肤成纤维细胞制作原始态的(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS。在原始态人iPS细胞培养液中培养约190天(45次传代)，针对(1)及(3)选择各8个克隆，进行RNA-seq。用与上述始发态人iPS细胞同样的方法在(1)及(3)的各8个克隆中得到MAE大于2.0的基因数。将该结果示于图5B。
始发态及原始态中的任意人iPS细胞中，(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，克隆间表达量的偏差大的基因数均被抑制在半数左右。这些结果表明，H1FOO-DD-iPS中，全局基因表达在克隆间更均一。
[实施例7]DNA甲基化的偏差的比较
针对上述实施例6中选择的始发态人iPS细胞的(1)对照-iPS的8个克隆及(3)H1FOO-DD-iPS的8个克隆，使用DNA甲基化阵列(Infinium Human Methylation 450K BeadChip Kit、Illumina)，进行DNA甲基化的分析。基于由DNA甲基化阵列得到的分析结果，在(1)的8个克隆中，得到平均绝对误差(mean absolute error：MAE)大于2.0的(偏差大)甲基化探针数。用同样的方法在(3)的8个克隆中也得到MAE大于2.0的基因数。将该结果示于图6A。
针对上述实施例6中选择的原始态人iPS细胞的(1)对照-iPS的8个克隆及(3)H1FOO-DD-iPS的8个克隆，使用DNA甲基化阵列，进行DNA甲基化的分析。用与上述始发态人iPS细胞同样的方法在(1)及(3)的各8个克隆中得到MAE大于2.0的甲基化探针数。将该结果示于图6B。
始发态及原始态中的任意人iPS细胞中，(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，克隆间的偏差大的甲基化探针数均被抑制在半数左右。这些结果表明H1FOO-DD-iPS中，DNA甲基化在克隆间更均一。
[实施例8]心肌细胞分化能力的比较
按照上述实施例3中记载的方法，自人外周血单个核细胞制作始发态的(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS。针对(1)及(3)选择各3个克隆，在心肌分化诱导培养基中进行培养，进行向心肌细胞的分化诱导(Tohyama，S.，等，(2013).Cell Stem Cell 12(1)：127-137.)。自在心肌分化诱导培养基中的培养开始起第10天，回收细胞。使用流式细胞仪对回收的细胞中的TNNT2的表达进行检测，算出TNN2阳性细胞的比例。TNNT2是代表性的心肌细胞标志物。针对各克隆，分别各进行6次向心肌细胞的分化诱导试验。
图7A示出基于流式细胞仪的TNNT2阳性细胞的比例(％)的测定例。左图是(1)对照-iPS的测定例，右图是(3)H1FOO-DD-iPS的测定例。(1)对照-iPS中，仅全部细胞的约6％为TNNT2阳性，向心肌细胞的分化不良。(3)H1FOO-DD-iPS中，全部细胞的约95％为TNNT2强阳性，显示良好的心肌分化能力。
图7B示出各克隆中的TNNT2阳性细胞的比例(％)。(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，TNNT2阳性细胞的比例高。另外，确认到(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，各心肌细胞分化诱导试验间偏差小，能够更稳定地分化诱导心肌细胞。这些结果表明，H1FOO-DD-iPS具有优异的心肌细胞分化能力，且能够分化为均一性更高的心肌细胞。
[实施例9]内胚层分化能力的比较
按照上述实施例3中记载的方法，由人皮肤成纤维细胞制作始发态的(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS。针对(1)及(3)选择各8个克隆，利用STEMdiff Trilineagediffrerentiation kit(Cat：ST-05230、VERITAS)进行向三胚层成分的分化诱导。自分化诱导开始起第5天回收细胞。所回收的细胞中，使用TaqMan hPSC Scorecard kit(Cat：A15876、ThermoFisher SCIENTIFIC)，用qPCR 半穷举地对与内胚层相关的标志物的表达进行评价。
将结果示于图8。(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，算法评分(algorithmicscore)高。另外，确认到(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，各克隆间的偏差小，能够更稳定地分化诱导内胚层。这些结果表明，H1FOO-DD-iPS具有优异的内胚层分化能力，且可以分化为均一性更高的内胚层。
[实施例10]肝细胞分化能力的比较(1)
按照上述实施例3中记载的方法，自人外周血单个核细胞制作始发态的(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS。针对(1)及(3)选择各10个克隆，进行向肝细胞(内胚层谱系的终末分化细胞的一种)的分化诱导(Kajiwara，M.，等，(2012).Proc Natl Acad Sci U S A109(31)：12538-12543.；Takebe，T.，等，(2017).Cell Rep 21(10)：2661-2670.)。在自分化诱导开始起第21天回收细胞。所回收的细胞中，用qRT-PCR对作为代表性的成熟肝细胞标志物之一的ASGR1进行定量评价。
将结果示于图9。(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，整体的AGSR1的表达量高，中值(Median)及平均值(Average)高。另外，确认到(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，各克隆间的偏差(STDVP、CV)小，能够更稳定地分化诱导肝细胞。这些结果表明，H1FOO-DD-iPS具有优异的肝细胞分化能力，且可以分化为均一性更高的肝细胞。
[实施例11]肝细胞分化能力的比较(2)
按照上述实施例3中记载的方法，由人外周血单个核细胞制作始发态的(1)对照-iPS、及(3)H1 FOO-DD-iPS。针对(1)及(3)选择各10个克隆，与实施例11同样地，进行向肝细胞的分化诱导。在自分化诱导开始起第21天回收培养上清液。所回收的培养上清液中，通过ELISA对分泌白蛋白的量进行定量评价。成熟肝细胞产生并分泌白蛋白，因此白蛋白与ASGR1同样地作为成熟肝细胞的标志物而使用。
将结果示于图10。(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，整体的白蛋白的分泌量高，且中位值(Median)高。另外，确认到(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，各克隆间的偏差(STDVP、CV)小，能够更稳定地分化诱导肝细胞。这些结果表明，H1FOO-DD-iPS具有优异的肝细胞分化能力，且可以分化为均一性更高的肝细胞。
[实施例12]原始内胚层分化能力的比较
按照上述实施例4中记载的方法，由人皮肤成纤维细胞及人外周血单个核细胞制作原始态的(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS。针对(1)及(3)选择各6个克隆(源自人皮肤成纤维细胞：4个克隆，源自人外周血单个核细胞：2个克隆)，在原始内胚层分化诱导培养基中进行培养，进行向原始内胚层的分化诱导(国际公开第2019/093340号)。在自原始内胚层分化诱导培养基中的培养开始起第3天回收细胞。使用流式细胞仪对所回收的细胞中的PDGFRA及ANPEP的表达进行检测，算出PDGFRA阳性细胞及ANPEP阳性细胞的比例。PDGFRA及ANPEP是代表性的原始内胚层标志物。针对各克隆，分别各进行3次向原始内胚层的分化诱导试验。
原始内胚层分化诱导培养基通过向N2B27培养基(NDiff227)中添加25ng/mL的FGF4(Peprotech)、1μg/mL的Heparin(Wako)、10ng/mL的BMP4(R&D)、10ng/mL的PDGFRA(Peprotech)、1μM的XAV939(Wako)、3μM的A83-01(Wako)、及0.1μM的Retinoic Acid(Sigma)而制备。在分化诱导开始后第2天添加10ng/mL的IL-6(R&D)。
图11A示出基于流式细胞仪的PDGFRA阳性细胞及ANPEP阳性细胞的比例(％)的测定例。左图是(1)对照-iPS的测定例。PDGFRA及ANPEP这两者阳性的细胞的比例为全部细胞的约19％。
右图是(3)H1FOO-DD-iPS的测定例。PDGFRA及ANPEP这两者阳性的细胞的比例是全部细胞的约37％。
图11B示出各克隆中的PDGFRA及ANPEP这两者阳性的细胞的比例(％)。(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，阳性细胞的比例高。另外，确认到(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，各克隆间的偏差小，能够更稳定地分化诱导原始内胚层。这些结果表明，H1FOO-DD-iPS具有优异的原始内胚层分化能力，且可以分化为均一性更高的原始内胚层。
[实施例13]代谢功能的验证
按照上述实施例4中记载的方法，由人皮肤成纤维细胞及人外周血单个核细胞制作原始态的(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS。针对(1)及(3)选择各6个克隆，使用细胞外流量分析仪(Agilent Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer，PrimetechCorporation)，测定备用呼吸能力(Spare respiratory capacity；电子传递系统的功能评价)。
将结果示于图12A。(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，备用呼吸能力高。
按照上述实施例4中记载的方法，由人皮肤成纤维细胞或人外周血单个核细胞制作原始态的(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS。针对(1)及(3)选择各6个克隆，使用细胞外流量分析仪(Agilent Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer、PrimetechCorporation)，测定耗氧速率(OCR、电子传递系统的功能评价)及细胞外酸化速率(ECAR、糖酵解系统的功能评价)。
将结果示于图12B。X轴表示ECAR，反映无氧代谢能力。Y轴表示OCR，反映有氧代谢能力。各点图(plot)表示1个克隆进行6次测定而得的平均值。(3)H1FOO-DD-iPS与(1)对照-iPS相比，点图整体存在于右上部分，ECAR及OCR均处于高的状态。这些结果表明，H1FOO-DD-iPS具有更为原始态的代谢能力。
[实施例14]X染色体激活的有无的验证
原则上，源自女性的体细胞及始发态iPS/ES细胞中一条X染色体失活。另一方面，已知原始态、特别是着床前的上胚层中，两条X染色体为激活型。为了对此进行验证，针对原始态的(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS的各4个克隆进行mRNA-FISH，对三个标志物的表达进行比较验证。
按照上述实施例4中记载的方法，自人皮肤成纤维细胞及人外周血单个核细胞制作原始态的(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS。针对(1)及(3)选择各个4克隆，通过mRNA-FISH来确认UTX、HUWE1、及XIST的表达(Sahakyan，A.，等，(2017).Cell Stem Cell20(1)：87-101.)。
当前得到的原始态人iPS细胞产生大量多倍体细胞，因此为了正确的评价，需要选择染色体数正常的细胞。无论X染色体有无激活，UTX均进行表达。因此，选择表达2个UTX的细胞作为正常的细胞。接着，通过mRNA-FISH研究HUWE1(X染色体激活时表达)、及XIST(虽然原本参与X染色体失活，但是已知其在着床前上胚层中于两条X染色体中表达)的表达。
图13A示出mRNA-FISH的荧光显微镜图像的例子。左图是HUWEI+/+XIST+/+的例子。右图是HUWEI+/-XIST-/-的例子。
图13B示出针对各克隆的100个细胞将HUWE1及XIST的表达模式汇总而得的结果。图13B中，柱状图下的数字表示(1)对照-iPS、及(3)H1FOO-DD-iPS的克隆编号(No.)。1号及2号克隆源自皮肤成纤维细胞，5号及6号克隆源自人外周血单个核细胞。
最接近着床前上胚层的表型是HUWE1+/+且XIST+/+，就以此为基准的表型而言，为HUWE1+/+且XIST+/-的(1)对照-iPS中，有呈现接近始发态的表型的细胞占多数的克隆(1、2号克隆)。另一方面，(3)H1FOO-DD-iPS中，在所有克隆中，呈现原始态的表型的细胞占多数。这些结果表明，H1FOO-DD-iPS具有更接近原始态的表型。
[实施例15]FKBP1A的表达量的比较
使用实施例1中制作的(c)的仙台病毒载体，向人成纤维细胞(TIG120)中导入H1FOO-DD(H1FOO OE HDF)。使用仙台病毒载体向人成纤维细胞(TIG120)中导入Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因、及L-Myc基因，制作iPS细胞(OSKL)。与包含Oct3/4基因、Sox2基因、K1f4基因及L-Myc基因的仙台病毒载体一同使用上述实施例1中制作的(c)的仙台病毒载体，向人成纤维细胞(TIG120)中导入前述各基因，制作H1FOO-DD-iPS(OSKLH)。
对上述中制作的H1FOO OE HDF、OSKL、及OSKLH进行培养，回收自导入前述各基因起第2天的细胞。接着，利用qRT-PCR测定FKBP1A的表达量。作为对照，针对成纤维细胞(HDF)、及H9 ES细胞(H9 ESC)也同样地测定FKBP1A的表达量。FKBP1A的表达量基于GAPDH的表达量进行了标准化。
将结果示于图14。图中，HDF表示人皮肤成纤维细胞，H9 ESC表示H9 ES细胞，H1FOOOE HDF表示H1FOO OE HDF制作后培养了2天的细胞、OSKL day2表示OSKL制作后培养了2天的细胞，OSKLH day2表示OSKLH制作后培养了2天的细胞。FKBP1A的表达量以将OSKLH day2的表达量设为1.0时的相对表达量的形式表示。
如图14所示，FKBP1A的表达量仅在OSKLH day2中显著较高。OSKLH第2天中，与其他细胞相比，FKBP1A的表达量高10倍左右。该结果表明，通过与核重编程物质一同导入H1FOO-DD，在核重编程诱导早期的细胞中，FKBP1A的表达量上升。此外，虽然结果省略说明，但确认到FKBP1A抑制作为固有免疫应答表达标志物的IFIT1、IFNA的表达。因此，推测通过与核重编程物质一同导入H1FOO-DD，固有免疫应答标志物的表达被抑制。根据这些结果，暗示了固有免疫应答标志物的表达抑制可能有助于提高iPS细胞的品质。
产业上的可利用性
根据本发明，提供能制备品质良好的iPS细胞的、iPS细胞的品质改善剂、iPS细胞的制备方法、利用该制备方法制备的iPS细胞、及iPS细胞制备用组合物。
以上，对本发明的优选实施方式进行了说明及图示，但应理解这些仅是例示本发明，不应视为限定性的解释。可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下进行追加、省略、替换及其他变更。因此，本发明并不限定于前述说明，其仅由所附的权利要求书限定。
Claims (19)
1.iPS细胞的品质改善剂，其包含多核苷酸，所述多核苷酸具有：
H1foo基因；和
调控序列，其能在所述H1foo基因被导入至细胞的情况下对由所述H1foo基因表达的H1foo蛋白的在细胞内的存在量及存在时期中的至少一者进行调控。
2.如权利要求1所述的iPS细胞的品质改善剂，其中，所述多核苷酸以在导入其的细胞内能表达所述H1foo基因的状态插入至表达载体。
3.如权利要求2所述的iPS细胞的品质改善剂，其中，所述表达载体为仙台病毒载体。
4.如权利要求1～3中任一项所述的iPS细胞的品质改善剂，其中，
所述调控序列包含编码不稳定结构域的核苷酸序列，所述不稳定结构域是促进包含所述不稳定结构域的融合蛋白的基于蛋白酶体的降解的结构域，
所述调控序列以能表达所述不稳定结构域与所述H1foo蛋白的融合蛋白的方式与所述H1foo基因连接。
5.如权利要求1～4中任一项所述的iPS细胞的品质改善剂，其中，所述调控序列包含对化学刺激做出响应而调控所述H1foo基因的转录的启动子序列。
6.iPS细胞的品质改善剂，其包含H1foo蛋白与不稳定结构域的融合蛋白，其中，
所述不稳定结构域是促进所述融合蛋白的基于蛋白酶体的降解的结构域。
7.iPS细胞的制备方法，所述方法包括：将核重编程物质和权利要求1～6中任一项所述的iPS细胞的品质改善剂导入至体细胞的步骤。
8.如权利要求7所述的iPS细胞的制备方法，其中，所述iPS细胞为始发态或原始态iPS细胞。
9.如权利要求7或8所述的iPS细胞的制备方法，其中，
所述核重编程物质包含选自由Oct基因家族的基因、Sox基因家族的基因、Klf基因家族的基因、Myc基因家族的基因、Lin基因家族的基因、及Nanog基因、以及它们的基因产物组成的组中的至少一者。
10.如权利要求7～9中任一项所述的iPS细胞的制备方法，其中，
所述核重编程物质为Oct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因、L-Myc或者c-Myc、及它们的基因产物。
11.如权利要求7～9中任一项所述的iPS细胞的制备方法，其中，
所述核重编程物质为选自由Oct基因家族的基因、Sox基因家族的基因、Klf基因家族的基因、Myc基因家族的基因、Lin基因家族的基因、及Nanog基因组成的组中的至少一个基因，
所述至少一个基因以能在导入所述至少一个基因的细胞内表达所述至少一个基因的状态插入至表达载体。
12.如权利要求11所述的iPS细胞的制备方法，其中，所述表达载体为仙台病毒载体。
13.iPS细胞的制备方法，所述方法包括将核重编程物质和H1foo基因导入至体细胞的步骤，
其中，由已导入至所述体细胞的所述H1foo基因表达的H1foo蛋白的在所述体细胞内的存在时期及存在量中的至少一者被调控。
14.如权利要求13所述的iPS细胞的制备方法，其中，所述H1foo基因以能在导入所述H1foo基因的细胞内表达所述H1foo基因的状态插入至表达载体。
15.如权利要求13或14所述的iPS细胞的制备方法，其中，
所述核重编程物质为选自由Oct基因家族的基因、Sox基因家族的基因、K1f基因家族的基因、Myc基因家族的基因、Lin基因家族的基因、及Nanog基因组成的组中的至少一个基因，
所述至少一个基因被编码在能表达所述至少一个基因的表达载体中。
16.如权利要求14或15所述的iPS细胞的制备方法，其中，所述表达载体为仙台病毒载体。
17.iPS细胞，其通过权利要求7～16中任一项所述的iPS细胞的制备方法而制备。
18.iPS细胞制备用组合物，其包含核重编程物质和权利要求1～6中任一项所述的iPS细胞的品质改善剂。
19.iPS细胞的制备方法，所述方法包括将核重编程物质、和在与所述核重编程物质一同被导入至体细胞起第2～15天中的任一天诱导所述体细胞的重编程、并且具有抑制固有免疫的功能的物质导入至所述体细胞的步骤。
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