JPWO2007083644A1 - 新規タンパク質発現系 - Google Patents
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Abstract
Description
上記のことから、ウイルスベクターおよびミニゲノムを用いた発現系の双方の利点を保持した新しい発現系の開発が求められている。
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
Vullienoz et al, Journal of General Virology, 86:171-180, 2005
さらに、上記共存粒子系のSeVミニゲノムにおいてRNAポリメラーゼIプロモーターを用いた場合、又は目的遺伝子にTag配列(HA-Tag)を付加した場合にも、目的遺伝子の標的細胞への高い導入効率、および該細胞内での高い発現効率が実現されることが明らかとなった。
〔1〕以下の(a)〜(c)の工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
(a)ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
(b)該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を回収する工程
(c)工程(b)で回収されたウイルス粒子を標的細胞に導入する工程
〔2〕工程(a)において、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現するベクターを、さらに生産細胞に導入する工程を含む、〔1〕に記載の方法。
〔3〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体または、ウイルス様粒子(VLP)である〔1〕に記載の方法。
〔4〕マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムが、一つまたは複数のプロモーターを保持していることを特徴とする、〔1〕に記載の方法。
〔5〕プロモーターの少なくとも一つがRNAポリメラーゼIプロモーターであることを特徴とする、〔4〕に記載の方法。
〔6〕マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔7〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターまたはマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムにより、パラミクソウイルスのNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現させることを特徴とする、〔6〕に記載の方法。
〔8〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、パラミクソウイルスのFタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現しないように改変され、5'端のトレイラー領域がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖RNAを含むベクターである、〔6〕に記載の方法。
〔9〕生産細胞が、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターにおいて発現しないように改変された、Fタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現していることを特徴とする、〔8〕に記載の方法。
〔10〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターの改変されたタンパク質が、Fタンパク質である、〔8〕または〔9〕に記載の方法。
〔11〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、P遺伝子および/またはC遺伝子に変異を保持することを特徴とする、〔8〕〜〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔12〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、下記(a)または(b)に記載のマイナス鎖一本鎖RNAを含む、〔11〕に記載の方法。
(a)配列番号:10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖RNA
(b)配列番号:10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするマイナス鎖一本鎖RNA
〔13〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔6〕に記載の方法。
〔14〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、野生型センダイウイルスベクターである〔6〕に記載の方法。
〔15〕生産細胞が、T7 RNAポリメラーゼを発現している細胞である〔1〕〜〔14〕のいずれかに記載の方法。
〔16〕in vitroにおける標的細胞において外来遺伝子を発現させることを特徴とする、〔1〕〜〔15〕のいずれかに記載の方法。
〔17〕標的細胞が、293T細胞、A549細胞、BHK-21細胞、C2C12細胞、HeLa細胞、LLC-MK2細胞、MDCK細胞、またはNIH3T3細胞のいずれかである、〔16〕に記載の方法。
〔18〕in vivoにおける標的細胞において外来遺伝子を発現させることを特徴とする、〔1〕〜〔15〕のいずれかに記載の方法。
〔19〕外来遺伝子にTag配列が付加されていることを特徴とする、〔1〕〜〔18〕のいずれかに記載の方法。
〔20〕Tag配列が、HA-Tagである〔19〕に記載の方法。
〔21〕パラミクソウイルスのFタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現しないように改変され、5'端のトレイラー領域がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖RNAを含む、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター。
〔22〕改変されたタンパク質が、Fタンパク質である、〔21〕に記載のベクター。
〔23〕P遺伝子および/またはC遺伝子に変異を保持することを特徴とする、〔21〕または〔22〕に記載のベクター。
〔24〕マイナス鎖一本鎖RNAが下記(a)または(b)に記載のマイナス鎖一本鎖RNAである、〔23〕に記載のベクター。
(a)配列番号:10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖RNA
(b)配列番号:10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするマイナス鎖一本鎖RNA
〔25〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体または、ウイルス様粒子(VLP)である〔21〕〜〔24〕のいずれかに記載のベクター。
〔26〕マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、〔21〕〜〔25〕のいずれかに記載のベクター。
〔27〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔26〕に記載のベクター。
〔28〕
外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔29〕一つまたは複数のプロモーターを保持していることを特徴とする、〔28〕に記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔30〕プロモーターの少なくとも一つがRNAポリメラーゼIプロモーターであることを特徴とする、〔29〕に記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔31〕マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、〔28〕〜〔30〕のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔32〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔31〕に記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔33〕外来遺伝子にTag配列が付加されていることを特徴とする、請求項28〜32のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔34〕Tag配列が、HA-Tagである請求項33に記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
〔35〕〔21〕〜〔27〕のいずれかに記載のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター、および〔28〕〜〔34〕のいずれかに記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを標的細胞に導入する工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
〔36〕以下の(a)および(b)の工程を含む、ウイルス粒子の製造方法。
(a)ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
(b)該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を回収する工程
〔37〕工程(a)において、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現するベクターを、さらに生産細胞に導入する工程を含む、〔36〕に記載の方法。
〔38〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体または、ウイルス様粒子(VLP)である〔36〕に記載の方法。
〔39〕マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムが、一つまたは複数のプロモーターを保持していることを特徴とする、〔36〕に記載の方法。
〔40〕プロモーターの少なくとも一つがRNAポリメラーゼIプロモーターであることを特徴とする、〔39〕に記載の方法。
〔41〕マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、〔36〕〜〔40〕のいずれかに記載の方法。
〔42〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターまたはマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムにより、パラミクソウイルスのNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現させることを特徴とする、〔41〕に記載の方法。
〔43〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、パラミクソウイルスのFタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現しないように改変され、5'端のトレイラー領域がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖RNAを含むベクターである、〔41〕に記載の方法。
〔44〕生産細胞が、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターにおいて発現しないように改変された、Fタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現していることを特徴とする、〔43〕に記載の方法。
〔45〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターの改変されたタンパク質が、Fタンパク質である、〔43〕または〔44〕に記載の方法。
〔46〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、P遺伝子および/またはC遺伝子に変異を保持することを特徴とする、〔43〕〜〔45〕のいずれかに記載の方法。
〔47〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、下記(a)または(b)に記載のマイナス鎖一本鎖RNAを含む、〔46〕に記載の方法。
(a)配列番号:10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖RNA
(b)配列番号:10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするマイナス鎖一本鎖RNA
〔48〕パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔41〕に記載の方法。
〔49〕ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、野生型センダイウイルスベクターである〔41〕に記載の方法。
〔50〕生産細胞が、T7 RNAポリメラーゼを発現している細胞である〔36〕〜〔49〕のいずれかに記載の方法。
〔51〕〔36〕〜〔50〕のいずれかに記載の方法において回収される、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子。
(a)ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
(b)該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を回収する工程
(c)工程(b)で回収されたウイルス粒子を標的細胞に導入する工程
レスピロウイルス属 N P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 N P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 N P/C/V M F H - L
ミニゲノムに搭載する遺伝子数が少ない(ゲノムサイズが短い)方が転写複製効率がよい。本発明のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム中のマイナス鎖一本鎖RNAウイルスを構成するタンパク質を全部欠失するのが最も好ましいが、複数を欠失していてもよい。
また、本発明の外来遺伝子には、Tag配列をコードする塩基配列を付加していてもよい。Tag配列を付加することによって、外来遺伝子の機能が不明な場合であっても、外来遺伝子の発現を確認することが可能となる。Tag配列が付加される位置は特に限定されるものではなく、外来遺伝子のアミノ末端側に付加されていてもよいし、カルボキシル末端側に付加されていてもよい。Tag配列の種類は特に限定されるものではないが、一例として、HA-Tag配列を用いることが可能である。
本発明のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターは、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体または、ウイルス様粒子(VLP)であってもよい。
(a)配列番号:10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖RNA
(b)配列番号:10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするマイナス鎖一本鎖RNA
以下において、本発明の発現系の各工程について説明する。
本発明の発現系においては、第一の工程として、上記に記載のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する。
本発明においては、上記工程において、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現するベクターを、さらに生産細胞に導入してもよい。
本発明において、「生産細胞」として好ましくは、所望の哺乳動物細胞などを用いることができるが、具体的には、例えば、サル腎由来のLLC-MK2細胞(ATCC CCL-7)およびCV-1細胞 (例えばATCC CCL-70)、ハムスター腎由来のBHK-21細胞 (例えばATCC CCL-10) などの培養細胞、ヒト由来細胞等が挙げられる。本発明において、より好ましい例としては、BHK-21細胞を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターの再構成は公知の方法により行うことができる。
このようなベクターは、一度細胞に感染すると、細胞内でRNPを増殖させることはできても、それ自身はエンベロープ遺伝子を持たないため、初めと同じようなエンベロープタンパク質を持つウイルスを再度生産することはできない。このようなベクターは、特に遺伝子治療など高い安全性が要求される分野に極めて有用である。
具体的には、実施例(図6)に示すように、T7 RNAポリメラーゼとSeVの融合タンパク質であるFタンパク質(変異型F5Rでも可)が発現している生産細胞にヘルパーSeV/ΔF(SeVagp55/ΔFが好ましい)と目的外来遺伝子(GOI)を搭載したSeVミニゲノムcDNAプラスミド (pSeVmini/GOI)が導入されると、T7 RNAポリメラーゼの働きでMiniSeV/GOIのRNAゲノムがpSeVmini/GOIから転写され、Helperの役割を担っているSeV/ΔFから発現しているNP,P,Lタンパク質を利用してMiniSeV/GOIのRNPが形成、複製される。このMiniSeV/GOIのRNPはHelper SeV/ΔFから発現したM,HNと生産細胞から発現したF/F5Rを利用して、感染性MiniSeV/GOI粒子としてパッケージングされ、感染性Helper SeV/ΔF粒子と共に培養上清に放出される。
回収したウイルス粒子(ウイルスベクター)は実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション(濾過)、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターを含む溶液中で該ウイルスの成分が主要な割合を占めることを言う。例えば実質的に純粋なウイルスベクター組成物は、溶液中に含まれる全タンパク質(但しキャリアーや安定剤として加えたタンパク質は除く)のうち、ウイルスベクターの成分として含まれるタンパク質の割合が10% (重量/重量) 以上、好ましくは20%以上、より好ましくは50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウイルスベクターであれば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法(特公昭62-30752号公報、特公昭62-33879号公報、および特公昭62-30753号公報)、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法(WO97/32010)等を例示することができるが、これらに制限されない。
ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターを使い分けることによって、様々な目的(導入・発現の向上、毒性の低下)を達成することができる。
本発明において「標的細胞」とは、本発明のウイルス粒子を導入することにより外来遺伝子を発現させたい所望の細胞を示す。
本発明において、ウイルス粒子を導入する標的細胞は、in vitroにおける標的細胞でもよいし、in vivoにおける標的細胞(すなわち動物において直接外来遺伝子を発現させる)でもよい。in vitroにおける標的細胞としては、293T細胞、A549細胞、BHK-21細胞、C2C12細胞、HeLa細胞、LLC-MK2細胞、MDCK細胞、またはNIH3T3細胞のいずれかを挙げることができるが、特に限定されるものではない。
本発明のウイルス粒子(またはウイルスベクター)が導入された細胞を12時間〜5日間(好ましくは1〜3日間)程度培養し、外来遺伝子を発現させる。
in vivoにおいてウイルス粒子を標的細胞に導入する場合は、本発明のウイルス粒子を直接動物に投与し、外来遺伝子を発現させる。
薬理学的に許容される所望の担体または媒体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤(EDTA等)、結合剤等を挙げることができる。
界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なるが、ポリソルベート20又はポリソルベート80の場合では、一般には0.001〜100 mg/mLであり、好ましくは0.003〜50 mg/mLであり、さらに好ましくは0.005〜2 mg/mLである。
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には1〜500mMであり、好ましくは5〜100mMであり、さらに好ましくは10〜20mMである。
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール(エタノール等)、ポリアルコール(プロピレングリコール、PEG等)、非イオン性界面活性剤(ポリソルベート80、HCO-50)等と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、pH調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。
使用される薬理学的に許容される所望の担体または媒体は、使用方法に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
ワクチンとして用いる場合、例えば腫瘍、感染症、およびその他の一般的な疾患に対し本発明のウイルス粒子を適用することが考えられる。例えば腫瘍治療としては、腫瘍細胞、またはDC細胞などの抗原提示細胞(APC)に本発明のベクターを用いて治療効果を有する遺伝子を発現させることができる。このような遺伝子としては、癌抗原 Muc-1 または Muc-1様ムチンタンデムリピートペプチド(米国特許第 5,744,144号)、メラノーマ gp100抗原などが挙げられる。このような遺伝子による治療は、乳癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌等、幅広い応用が示されている。また、アジュバント効果を高めるサイトカイン類を組み合わせることも有効である。このような遺伝子としては、例えば i)IL-2と一本鎖IL-12 との組み合わせ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, 1999)、ii)IL-2とインターフェロン-γ(米国特許第 5,798,100号)、iii)単独で用いられる顆粒球コロニー刺激因子(GM-CSF)、iv)脳腫瘍を治療対象とした GM-CSF と IL-4 の組み合わせ(J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999))などが挙げられる。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例1〕ヘルパーSeVのcDNA構築
1.1 pSeVagp55/ΔFの構築
図1に示したように、先ず、pSeV(TDK)を制限酵素Kas IとFse Iで処理、精製したSeV トレイラー配列(genome 5’ promoter)を含む断片をTemplateとして、Primer agp55-1F (5’-caggtttgaggatattatacatag, 24 mer(配列番号:1))とagp55-1R (5’-caggattttagtttttcttactattgtc, 28 mer(配列番号:2))を用いたPCRでFragment 1が得られ、Primer agp55-3F (5’- ctcttgtttggtgggtcggcatggcatctc, 30 mer(配列番号:3))とagp55-3R (5’- ttagctcactcattaggcaccccag, 25 mer(配列番号:4))を用いたPCRでFragment 3が得られた。また、pSeV(TDK)を制限酵素Kas IとNot Iで処理、精製したSeV Leader配列(genome 3’ promoter)を含む断片をTemplateとして、Primer agp55-2F (5’-gtaagaaaaactaaaatcctgtataacttc, 30 mer(配列番号:5))とagp55-2R (5’-gccgacccaccaaacaagagaaaaaacatg, 30 mer(配列番号:6))を用いたPCRでFragment 2が得られた。次に、Fragment 1, 2, 3をTemplateとして、Primer agp55-1Fとagp55-3Rを用いたPCRでSac IIとMlu I制限酵素サイトを含む断片が得られた。最後に、この断片をSac IIとMlu Iで処理、精製した後、同様にSac IIとMlu Iで処理して、SeV トレイラー配列を含む断片を取り除いたpSeV/ΔFベクターにインサートとして挿入し、pSeVagp55/ΔF(配列番号:7)が得られた。上記において、agp55とはLeader-Leaderタイプ(TrailerをLeaderに入れ替えたもの)であることを、ΔFはF遺伝子が欠損していることを示す。
図2に示したように、SeV/4C(-)/wを限外希釈法でウイルスクローニングを行い、各クローンからRNA genomeを抽出し、RT-PCRを行い、ゲノム配列を調べたところ、P/C遺伝子に多数の変異があるクローン4が得られた。このクローン4のRNA genomeをTemplateとして、Primer SeVF619 (5’-atgggtatcctgcatgcctaggag, 24 mer(配列番号:8))とSeVR2111 (5’-atcgattatcttgggtcgacg, 21 mer(配列番号:9))を用いたPCRで両端にSph I とSal I制限酵素サイトを持つ断片(配列番号:10)が得られた。この断片をSph I とSal Iで処理、精製し、インサートとして、pSeVagp55/ΔFベクターに対応する両端にSph I とSal I制限酵素サイトを含む配列と入れ替え、pSeVagp55/(P/C)m/ΔFが得られた。上記において、(P/C)m とはP遺伝子および/またはC遺伝子に変異が導入されていることを示す。pSeVagp55/(P/C)m/ΔFの全長配列を配列番号:11に示す。
2.1 準備
1) 細胞:前日〜8e5 BHK-21 cells/well (6-well plate)
2) 20%FBS/opti-MEM [Cat No. 31985-070, Lot No. 1183337, Invitrogen社] (P&S無添加)
3) opti-MEM (原液)
1) DNA溶液
1 well
opti-MEM (無添加原液) 250 μL
pCAGGS-NP (Z) , 1 μg/ μL 0.5 μL
pCAGGS-P (Z)/4C(-) , 1 μg/ μL 0.5 μL
pCAGGS-L (TDK), 1 μg/ μL 2.0 μL
pCAGGS-F5R, 1 μg/ μL 0.5 μL
pCAGGS-T7, 1 μg/ μL 0.5 μL
SeV cDNA, 1 μg/ μL 5 μL
2) LipofectAMINE 2000 reagent [Cat No. 11668-019, Lot No. 1188609, Invitrogen社] 溶液
1 well
opti-MEM (無添加原液) 250 μL
LipofectAMINE2000 18 μL
3) 2)の溶液を準備した5分後に、1)の溶液と混合、RTで20-30分置く。
3.1 SeV minigenomeのデザイン
図3に示したように、通常のSingle-promoter (GP)を有するSeVminiSP/GOIとDouble-promoter (GP58A-GPd12)を有するSeVminiDP/GOI、2種類のMinigenomeをデザインした。(参考文献:Nature of a paramyxovirus replication promoter influences a nearby transcription signal, Diane Vullienoz et al, Journal of General Virology, p171-180, v86, 2005)
図4Aに示したように、市販GFPプラスミドをTemplateとして、Primer Not I-GFP-N (5’- agttcacgcggccgcagatcttcacgatggtgagcaagggcgaggagctg, 50 mer(配列番号:12))とGFP-Sac II-C (5’- caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaattacttgtacagctcgtccatg, 65 mer(配列番号:13))を用いたPCRで得られたNot I-GFP-Sac II断片をNot IとSac IIで処理、精製し、GFPインサートとして、同様にNot IとSac IIで処理、NP,P,L,M,F,HN配列を含む断片を除いたpSeV(TDK)ベクター(Not IとSac IIサイトを含む。437〜670位はMiniSeVゲノム配列を示す。配列番号:14、特開2002-272465)に挿入し、pMiniSeVSP/GFPが得られた。
MiniSeVSP/GFPゲノム配列を配列番号:15に示す。なお、1〜137位および858〜996位はMiniSeVゲノム配列、138〜857位は搭載したGFPのORF配列を示す。
図4Bに示したように、GFP以外の他の目的遺伝子(GOI)を搭載したSeV minigenome cDNAを構築する場合、Primer Not I-GOI-NとGOI-Sac II-Cを用いたPCRでGOIの両側にNot IとSac II制限酵素サイトを付け、pMiniSeVSP/GFPのNot I-GFP-Sac II配列と入れ替えることで簡単に作製できる。
Primer Not I-GOI-Nの配列は「5’-agttcacgcggccgcagatcttcacg(配列番号:16)+GOI ORFのStart コドンを含む最初の18〜24 sense配列」になるよう、またPrimer GOI-Sac II-Cは「5’-caggtaccgcggagcttcgatcgttctgcacgatagggactaa(配列番号:17)+リンカー+GOI-ORFのStopコドンを含む最後の18〜24 antisense配列、リンカーが0〜2塩基でゲノム総塩基数が6の倍数になるよう調整する」になるよう設計する。
図5Aに示したように、pMiniSeVSP/GFPをTemplateとしてPrimer 224N (5’- ataccgcatcaggcgccattcg, 22 mer(配列番号:18))と(GP58A-GPd12)R (5’- gttttttagggtctggaacctgctcctcagggtggatactttgacactaaaatcctg, 57 mer(配列番号:19))を用いたPCRで得られた断片と、Primer (GP58A-GPd12)F (5’- ggttccagaccctaaaaaacatgtatgggatatg, 34 mer(配列番号:20))とGFP-Sac II-C (配列上記参照)を用いたPCRで得られた断片を精製した後、Templateとして、Primer 224N とGFP-Sac II-C を用いたPCRで得られた断片をKas IとSal Iで処理、精製し、インサートとして、同様にKas IとSal Iで処理してSingle-promoterを含む配列を除いたpMiniSeVSP/GFPベクターに挿入し、pMiniSeVDP/GFPが得られた。pMiniSeVDP/GFPの配列を、配列番号:21に示す。なお、437〜1516位はMiniSeVゲノム配列、そのうち658〜1377位は搭載したGFPのORF配列を示す。
図5Bに示したように、GFP以外の他の目的遺伝子(GOI)を搭載したSeV minigenome cDNAを構築する場合、Primer Not I-GOI-NとGOI-Sac II-C(設計方法は上記参照)を用いたPCRでGOIの両側にNot IとSac II制限酵素サイトを付け、pMiniSeVDP/GFPのNot I-GFP-Sac II配列と入れ替えることで簡単に作製できる。
図6に示したように、T7 RNAポリメラーゼとSeVの融合タンパク質であるFタンパク質(変異型F5Rでも可)が発現している生産細胞にHelper SeV/ΔF(SeVagp55/ΔFが好ましい)と目的遺伝子(GOI)を搭載したSeV ミニゲノムcDNAプラスミド (pSeVmini/GOI)が導入されると、T7 RNAポリメラーゼの働きでMiniSeV/GOIのRNA geonomeがpSeVmini/GOIから転写され、ヘルパーの役割を担っているSeV/ΔFから発現しているNP,P,Lタンパク質を利用してMiniSeV/GOIのRNPが形成、複製される。生産細胞はBHK-21細胞が好ましいが、それに限らない。T7 RNAポリメラーゼとF/F5Rの発現方法は特に制限されず、例えば、プラスミドなどで一時発現させる方法やT7 RNAポリメラーゼとF/F5R持続発現細胞を用いる方法などが挙げられる。T7 RNAポリメラーゼとF/F5R両蛋白持続発現細胞が好ましいが、どちらかを単独発現する細胞でもよい。このMiniSeV/GOIのRNPはHelper SeV/ΔFから発現したM,HNと生産細胞から発現したF/F5Rを利用して、感染性MiniSeV/GOI粒子として包装され、感染性Helper SeV/ΔF粒子と共に培養上清に放出される。この感染性MiniSeV/GOIとHelper SeV/ΔF粒子が共存した培養上清を回収し、目的細胞へ感染すると、Helper SeV/ΔFの転写複製システム(NP,P,Lタンパク質)を利用してMiniSeV/GOIに搭載した目的遺伝子GOIが発現される。
Helper SeVはここでSeV/ΔFを例として示したが、それに限らず、SeVの構成タンパク質NP,P,L,M,F,HNの任意一つ或いは複数を欠損したタイプでもよいが、それら欠損したタンパク質が生産細胞から別途発現する必要がある。
前日、3e5 cells/well (12-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK/T7/Ad(T7 RNAポリメラーゼ持続発現細胞)へSeV/ΔFとSeVagp55/ΔF(SeVゲノムの5'側55塩基配列を3'側55塩基のanitisense配列に換えたLeader/Leaderタイプ)をmoi 10で感染1h後、pCAGGS/F5R (1μg/well)とpMiniSeVSP/GFP (2μg/well)を導入した(導入試薬:Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2μL/μg)。培養(10%FBS/G-MEM培地)2日目、無血清培地VP-SFMで1回洗浄した後、5μg/mL Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、4日目の培養上清を回収した。4日まで毎日GFP写真を撮影した(図7A)。上記回収した培養上清を100μL/wellでLLC-MK2細胞(6-well plate)へ感染し、2日目GFP写真を撮影した(図7B)。
図7Aに示したように、SeVagp55/ΔFをHelper SeVとした場合の方が、通常のSeV/ΔFと比べて、ミニゲノムによるタンパク質の発現効率(GFP発現細胞の割合)が高かった。また、図7Bに示したGFP発現細胞数は生産された共存粒子中のMiniSeVの量を表しているが、SeVagp55/ΔFを用いた共存粒子の生産性がSeV/ΔFよりはるかに高かった。
前日、3e5 cells/well (12-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK/T7/Ad(T7 RNAポリメラーゼ持続発現細胞)へSeVagp55/ΔFをmoi 10で感染1h後、pCAGGS/F5R (1μg/well)とMinigenome cDNA (2μg/well)を導入した(導入試薬:Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2μL/μg)。ここでMiniSeV cDNAとしては、pMiniSeVSP/GFP、pMiniSeVDP/GFPの2種類を用いた。培養(10%FBS/G-MEM培地)2日目、無血清培地VP-SFMで1回洗浄した後、5μg/ml Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、4日目の培養上清を回収した。4日まで毎日GFP写真を撮影した(図8A)。上記回収した培養上清を用いて、CIU Assayを行った(図8B)。具体的には、サンプルを10倍ずつ希釈し、100μL/wellで6-well plateのLLC-MK2細胞へ1h感染させた後、無血清培地で培養して2日目に、GFP発現細胞数をカウントし、MiniSeVタイターとして計測した。また、Anti-SeV抗体DN2を用いて抗体染色を行い、DN2-positive細胞数をカウントし、ヘルパーSeVタイターとして計測した。
図8に示したようにSPとDPデザイン両方において高いGFP発現効率が得られたが、DPデザインにおいて、より高いMiniSeV生産性(GFP-CIU)および低いヘルパー SeV/MiniSeV量比が得られた。
前日3e5 cells/well (12-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK/T7/Ad(T7 RNAポリメラーゼ持続発現細胞)へSeVagp55/ΔFとSeVagp55/(P/C)m/ΔFをmoi 1, 3, 10で1h感染させた後、pCAGGS/F5R (1μg/well)とpMiniSeVDP/GFP (2μg/well)を導入した(導入試薬:Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2μL/μg)。培養(10%FBS/G-MEM培地)2日目、無血清培地VP-SFMで1回洗浄した後、5μg/mL Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、4日目の培養上清を回収した。4日まで毎日GFP写真を撮影した(図9A)。上記回収した培養上清を100μL/wellでLLC-MK2細胞(6-well plate)へ感染し、2日目にGFP写真を撮影した(図9B)。また、上記回収した培養上清を用いて、CIU Assayを行った(図9C)。
図9に示したように、SeVagp55/ΔFをHelper SeVとして共存粒子を生産した場合、より高いMiniSeV生産性が得られたが、Helper SeV/MiniSeVの量比(〜10倍)も高かった。一方、SeVagp55/(P/C)m/ΔFを用いて共存粒子を生産した場合は、比較的低いMiniSeV生産性であったが、Helper SeV/MiniSeVの量比(約1:1)が非常に低かった。目的によってこの2種類Helper SeVを使い分けることが可能である。
前日8e5 cells/well (6-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK-21細胞へSeVagp55/ΔFをmoi 0.5, 1, 2で1h感染させた後、「pCAGGS/T7 (1μg/well)、pCAGGS/F5R (4μg/well)およびpMiniSeVDP/GFP (5μg/well)」或いは「pCAGGS/NP,P,L (0.5,0.5,2μg/well)、pCAGGS/T7 (1μg/well)、pCAGGS/F5R (4μg/well)およびpMiniSeVDP/GFP (5μg/well)」を導入した(導入試薬:Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2μl/μg)。また、上記2条件プラスミドを導入した6時間後のBHK-21細胞へSeVagp55/ΔFをmoi 0.5, 1, 2で感染を行った。培養(10%FBS/G-MEM培地)1日目、無血清培地VP-SFMで1回洗浄した後、5μg/mL Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、3日目GFP写真を撮影し(図10A)、培養上清を回収した。上記回収した培養上清を用いてCIU Assayを行った(図10B)。
図10に示したように、MiniSeV cDNAを導入する時にNP,P,L発現するプラスミドを一緒に導入すると、生産された共存粒子中のMiniSeVの量に大きな変化はなかったが、Helper SeV/MiniSeVの量比が低下する傾向が見られた。
24-well collagen-coated plateで〜90%コンフルエントになるよう培養した293T, A549, BHK-21, C2C12, HeLa, LLC-MK2, MDCK, NIH3T3細胞へMiniSeVDP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子(2e6 GFP-CIU/mL, 7.7e6 DN2-CIU/mL)をMOI3で感染させた後、32℃で培養した。2日目にGFP写真を撮影した(図11)。
図11に示したように、MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子によって、検討した8種類細胞のすべてにおいて高いGFP導入、発現効率が得られた。
MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子を用いて(5e6 GFP-CIU/head)マウス(n=3)への鼻腔内投与を行った。コントロールとして同量SeV18+GFP/ΔFを投与した。2日目解剖、鼻腔を摘出し、GFP写真を撮影した(図12)。
図12に示したように、MiniSeVDP/GFP-SeVagp55/ΔF共存粒子を用いて高いin vivo発現(鼻腔内GFP発現)が得られた。
12-well collagen-coated plateで〜90%コンフルエントになるよう培養したBHK-21, HeLa細胞へHelper-SeVとしてのSeVagp55/T7/ΔF感染性粒子をmoi20で1h感染させた後、MiniSeVDP/GFP cDNA plasmidをLipofectamine 2000試薬 [Lipofectamine 2000/DNA=2.0 (μL/μg), 2 μg DNA/well]で導入し、2日目でGFP写真を撮影した(図13)。
図13に示すように、MiniSeVDP/GFPのcDNA プラスミドとSeVagp55/T7/ΔF感染性粒子を標的細胞へ導入することによって、高いミニゲノム蛋白発現効率が得られた。
SeVベクターはT7 promoterを用いているため、ウイルスを再構築する時にT7 polymeraseを供給する必要がある。上記実施例における共存粒子生産の際にも、minigenome cDNAを生産細胞へ導入すると同時にT7 polymerase発現プラスミドも一緒に導入する方法、又はT7 polymerase遺伝子を搭載したHelper-SeVを使用する方法によって、T7 polymeraseを供給しなければならない。前者の方法の場合、導入するプラスミドの種類が多く、生産コストと生産効率においてマイナス影響を与える恐れがある。また、後者の方法の場合、Helper-SeVがT7 polymeraseを、MiniSeVに搭載した目的遺伝子(GOI)と常に同時に発現するため、蛋白機能の解析にマイナス影響を与える可能性がある。これら問題を回避するため、T7 promoterの代わりにRNA polymerase I promoterを用いた共存粒子系を検討した。
図14に示したように、pMpolBDV plasmidをTemplateとして、Primer Apa I/polmPr-F (5’-gtacgggcccgtacgtctgaggccgagggaaag, 33mer (配列番号:31))とpolmPr/GP-R (5’- ctcttgtttggtacctatctccaggtccaatagg, 34mer(配列番号:32))を用いたPCRでApa I-polmPr Fragmentが得られた。また、pMiniSeVDP/GFPをTemplateとして、Primer polmPr/GP-F (5’- gacctggagataggtaccaaacaagagaaaaaac, 34mer (配列番号:33))とMiniDP/Not I-R (5’- gactagcggccgcgtgaactttggcag, 27mer (配列番号:34))を用いたPCRでDP-Not I Fragmentが得られた。次に、Apa I-polmPr FragmentとDP-Not I FragmentをTemplateとして、Primer Apa I/polmPr-FとMiniDP/Not I-Rを用いたPCRで得られたApa I-polmDP-Not I Fragmentを、Apa I/Not Iによって処理し、精製した。精製後の断片を、同様にApa I/Not I処理し、Apa IからNot Iまでの断片を取り除いたpMiniSeVDP/GFPに挿入し、pMiniSeVDPpolm/GFPを得た。
前日1e6 cells/well (6-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK-21細胞へSeVagp55/ΔFをmoi 10で1h感染させた後、「pCAGGS/F5R (5μg/well)およびpMiniSeVDPpolm/GFP (5μg/well)」を導入した(導入試薬:Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=2μl/μg)。また、「pCAGGS/NP,P,L (0.5,0.5,2μg/well)、pCAGGS/F5R (4μg/well)およびpMiniSeVDPpolm/GFP-Luci (5μg/well)」を導入した(導入試薬:Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=1.5μl/μg)翌日にSeVagp55/ΔFをmoi 10で感染を行った。培養(10%FBS/G-MEM培地)1日目、無血清培地VP-SFMで1回洗浄した後、3μg/ml Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、以後毎日培地交換及びGFP写真を撮影し、Day 4培養上清を用いてCIU Assayを行った(図16)。
図16に示したように、サイズが短い遺伝子(GFP, 0.7kb)と長い遺伝子(GFP-Luci, 2.3kb)の両方において、1e7 GFP-CIU/ml以上のMiniSeVを含む共存粒子が生産され、RNA polymerase I promoterを用いても共存粒子の高い生産性が得られることを確認した。
GFPなどマーカー遺伝子や免疫染色可能な抗体をコードする遺伝子を、本発明の共存粒子系に搭載した場合には、共存粒子中のMiniSeVのタイターを容易に測定することができる。しかしながら、性能不明な遺伝子を搭載した場合又は免疫染色可能な抗体をコードする遺伝子を搭載しない場合には、共存粒子中のMiniSeVのタイターを測定するのは困難である。この問題を解決するため、HA-Tag付きの遺伝子(GFP)を搭載した共存粒子系を検討した。
図15に示したように、GFPのN末端にHA-Tagを付けるため、minigenome cDNAの構築を行った。まず、GFP搭載プラスミドをTemplateとして、Primer HA-GFP-Not I-F (5’- atagcggccgcaatgtacccatacgacgtcccagactacgctgtgagcaagggcgaggagctg, 63mer (配列番号:42))とGFP-Not I-R2 (5’- tatgcggccgcttacttgtacagctcgtccatg, 33mer (配列番号:43))を用いたPCRでNot I-HA-GFP-Not I Fragmentが得られた。また、同じTemplateで、Primer GFP-Not I-F (上記実施例12参照)とGFP-HA-Not I-R (5’- tatgcggccgcttaagcgtagtctgggacgtcgtatgggtacttgtacagctcgtccatgccg, 63mer (配列番号:44))を用いたPCRでNot I-GFP-HA-Not I Fragmentが得られた。この2種類Fragment (Not I-HA-GFP-Not IとNot I-GFP-HA-Not I)をNot I処理し、インサートとして同じNot I処理した上記実施例12で得られたNot I-MiniSeVDPpolm-Not I Fragmentへ挿入し、pMiniSeVDPpolm/HA-GFPとpMiniSeVDPpolm/GFP-HAを得た。
前日1e6 cells/well (6-well collagen-coated plate, IWAKI)で播いたBHK-21細胞へSeVagp55/ΔFをmoi 10で1h感染させた後、「pCAGGS/F5R (5μg/well) + pMiniSeVDPpolm/GFP (5μg/well) or pMiniSeVDPpolm/HA-GFP (5μg/well) or pMiniSeVDPpolm/GFP-HA (5μg/well)」を導入した(導入試薬:Lipofectamine 2000, Invitrogen, Lipofectamine/DNA=1.5μl/μg)。培養(10%FBS/G-MEM培地)1日目、無血清培地VP-SFMで1回洗浄した後、3μg/ml Trypsinを添加したVP-SFMに培地交換し、以後毎日培地交換及びGFP写真を撮影し、Day 4培養上清を用いてCIU Assayを行った(図17)。また、Rabbit Anti-HA-Tag抗体を一次抗体、Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG抗体を二次抗体として、共存粒子で感染したLLC-MK2細胞を免疫染色した(図17)。
図17-Aに示したように、N末端或はC末端にHA-Tag付きGFPを搭載した場合、コントロール(HA-TagなしGFP搭載)と同レベルの共存粒子が生産された。また、図17-Bに示したように、HA-Tag抗体を用いた蛍光抗体染色で、HA-Tag付き遺伝子(GFP)を搭載した共存粒子に感染された細胞を特異的に染色できることが明らかとなった。
Claims (22)
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
(a)ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
(b)該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を回収する工程
(c)工程(b)で回収されたウイルス粒子を標的細胞に導入する工程 - 工程(a)において、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現するベクターを、さらに生産細胞に導入する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体または、ウイルス様粒子(VLP)である請求項1に記載の方法。
- マイナス鎖RNAウイルスミニゲノムが、一つまたは複数のプロモーターを保持していることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- プロモーターの少なくとも一つがRNAポリメラーゼIプロモーターであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- マイナス鎖RNAウイルスがパラミクソウイルスである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターまたはマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムにより、パラミクソウイルスのNPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質を発現させることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、パラミクソウイルスのFタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現しないように改変され、5'端のトレイラー領域がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖RNAを含むベクターである、請求項6に記載の方法。
- 生産細胞が、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターにおいて発現しないように改変された、Fタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現していることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターの改変されたタンパク質が、Fタンパク質である、請求項8または9に記載の方法。
- ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、P遺伝子および/またはC遺伝子に変異を保持することを特徴とする、請求項8〜10のいずれかに記載の方法。
- ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、下記(a)または(b)に記載のマイナス鎖一本鎖RNAを含む、請求項11に記載の方法。
(a)配列番号:10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖一本鎖RNA
(b)配列番号:10に記載の塩基配列を含むマイナス鎖RNAの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするマイナス鎖一本鎖RNA - パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項6に記載の方法。
- ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターが、野生型センダイウイルスベクターである請求項6に記載の方法。
- 生産細胞が、T7 RNAポリメラーゼを発現している細胞である請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- in vitroにおける標的細胞において外来遺伝子を発現させることを特徴とする、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 標的細胞が、293T細胞、A549細胞、BHK-21細胞、C2C12細胞、HeLa細胞、LLC-MK2細胞、MDCK細胞、またはNIH3T3細胞のいずれかである、請求項16に記載の方法。
- in vivoにおける標的細胞において外来遺伝子を発現させることを特徴とする、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- パラミクソウイルスのFタンパク質、Mタンパク質またはHNタンパク質のうち、いずれか一つまたは複数のタンパク質を発現しないように改変され、5'端のトレイラー領域がリーダー領域に置換された、マイナス鎖一本鎖RNAを含む、ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター。
- 外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノム。
- 請求項19に記載のヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクター、および請求項20に記載のマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを標的細胞に導入する工程を含む、標的細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
- 以下の(a)および(b)の工程を含む、ウイルス粒子の製造方法。
(a)ヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよび、外来遺伝子を搭載したマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムを生産細胞に導入する工程
(b)該生産細胞内で生産されたヘルパーマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびマイナス鎖RNAウイルスミニゲノムがそれぞれパッケージングされたウイルス粒子を回収する工程
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