CN1934260B - 利用含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的杂合启动子制造负链RNA病毒载体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种负链RNA病毒载体的制备方法,其特征在于使用含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子来诱导负链RNA病毒载体的基因组RNA的转录及与该基因组RNA形成核蛋白的负链RNA病毒蛋白质的表达。本发明的方法可以高效地制备具有高度安全性的负链RNA病毒载体。特别地,本发明的方法可用于制备缺失了包膜构成蛋白质基因的负链RNA病毒载体。
Description
技术领域
本发明是关于负链RNA病毒载体的制备方法。
背景技术
传统上,负链RNA病毒的回收,主要是使用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒(vTF7-3:Fuerst,T.R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-8126(1986),MVA-T7:Sutter,G.等.FEBS Lett.371:9-12(1995))和在T7启动子控制下表达NP、P、L基因和负链RNA病毒基因组的质粒(Kolakofsky等,EMBO J.14:6087-6094(1995);Kato,A.等,Genes Cells 1:569-579(1996))。通过重组痘苗病毒表达的T7 RNA聚合酶的作用,提供了NP、P、L和反基因组(antigenome)RNA,并在痘苗病毒加帽酶的作用下,在NP、P和L的mRNA的5’末端形成帽子结构。然后所述mRNA被翻译成蛋白质。这些蛋白质与反基因组RNA相互作用,构成功能性的RNP。然后,从反基因组RNP复制基因组RNP,进而发生病毒蛋白质的翻译,开始感染周期,之后所述病毒被回收。
虽然可以通过使用重组痘苗病毒回收负链RNA病毒载体,但制备最终的载体制品时必须除去痘苗病毒,因而耗费成本和时间。在载体用于基因治疗时,从安全性考虑,也希望载体的回收最好不使用痘苗病毒。
非专利文献1:Fuerst T.R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,8122-8126(1986)
非专利文献2:Sutter,G.等.FEBS Lett.371:9-12(1995)
非专利文献3:Kolakofsky等,EMBO J.14:6087-6094(1995)
非专利文献4:Kato,A.等,Genes Cells 1:569-579(1996)
本发明的公开
本发明要解决的问题
本发明提供了利用含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的杂合启动子,不使用痘苗病毒而制造负链RNA病毒载体的方法。
解决问题的手段
迄今为止,在数种单股负链病毒(mononegaviruses)中开发了不使用重组痘苗病毒的病毒回收方法。其中之一是使用持久的表达T7 RNA聚合酶的哺乳动物细胞株。在这些方法中,由于没有例如使用痘苗病毒时的加帽酶,为了表达NP、P和L蛋白质,使用具有IRES序列的表达质粒,该序列可以进行不依赖加帽的翻译。至今已报道了使用该方法进行牛呼吸道合胞病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)(Ursula等,J.Virol.73:251-259)、狂犬病毒(Rabies Virus)(Stefan等,J.Virol.73:3818-3825(1999))、新城疫病毒(NDV)(Newcastle disease Virus)(Romer-Oberdorfer等,J.General Virology 80:2987-2995(1999))、仙台病毒(F.Iseni等,EMBO J.Vol.21:5141-5150(2002))的回收。对于SV5,报道了使用BSR-T7/5细胞(即如上述同样的细胞),利用T7 RNA聚合酶转录反基因组,和利用来自细胞的RNA聚合酶II表达NP、P和L蛋白质的方法(David L.Waning等,J.Virol.76:9284-9297(2002)),其中所述质粒是通过CAG启动子驱动的pCAGGS质粒。
第二个方法是已报道的狂犬病毒的回收方法,该方法中NP、P、L和基因组全部用巨细胞病毒启动子来驱动(K.Inoue,等,J.Virological Method.107:229-236(2003))。该方法中将锤头核酶添加到反基因组的5’末端以正确地切割出基因组的末端,因而该方法不使用T7 RNA聚合酶的表达细胞株也可以回收病毒。
但是,这些方法全都是重建具有传播能力的病毒的方法。迄今为止,还没有不使用痘苗病毒来重建无传播能力的病毒的例子。为了重建缺失了传播能力的病毒,必须使编码包膜构成蛋白的基因从病毒基因组中缺失掉,并在重建病毒时反式地提供包膜构成蛋白而形成感染性病毒粒子。因此,为了高效地重建缺失型病毒,需要比重建传播型病毒更高效的病毒生产系统。
本发明人为了开发更有效地生产和回收负链RNA病毒的方法,对病毒生产细胞中病毒基因组转录的驱动方法进行了改良。结果发现,通过用含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的杂合启动子(称为CA启动子)来直接或间接地驱动负链RNA病毒基因组RNA的转录及与该基因组RNA形成核蛋白的全部负链RNA病毒蛋白质的表达,可以实现高效的病毒生产。本发明中基因组RNA是这样转录的:在CA启动子的调控下,将编码 负链RNA病毒基因组RNA的DNA可操作地连接,由CA启动子直接诱导基因组RNA的转录;或者,先在编码基因组RNA的DNA上游连接来自噬菌体RNA聚合酶的信号序列,由CA启动子表达该RNA聚合酶,再以该RNA聚合酶诱导基因组RNA的转录。通过该方法,可以无需使用痘苗病毒而生产高效价的病毒。
藉此,本发明人使用上述的方法,首次不使用痘苗病毒而成功地回收了负链RNA病毒缺失了属于包膜构成蛋白的F蛋白,或M蛋白,或F和M蛋白的非传播型负链RNA病毒。本发明的方法使在完全不使用痘苗病毒的情况下生产出高效价的负链RNA病毒成为可能,因此可用于基因治疗等具有高度安全性的病毒的制备。
由此,本发明涉及负链RNA病毒的制造方法,其特征在于使用CA启动子来诱导负链RNA病毒基因组RNA的转录及与该基因组RNA形成核蛋白的负链RNA病毒蛋白质的表达;更具体地,涉及各权利要求项所述的发明。而且本发明还涉及包括各权利要求项所述发明的一个或多个(或者全部)的所希望的组合的发明,具体地,包含引用同一独立权利要求项(涉及别的权利要求所述的发明中所不包含的发明的权利要求)的权利要求项(即从属权利要求项)所述发明的一个或多个的所希望的组合的发明。各独立权利要求项所述的发明也包括包含其从属权利要求项的任意组合的发明。由此,本发明涉及:
.负链RNA病毒载体的制造方法,其特征在于用含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子诱导病毒生产细胞中的(i)该负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链的转录,及(ii)与该基因组RNA形成核蛋白的负链RNA病毒蛋白质的表达。
.[1]所述的方法,其包括在所述产生病毒的细胞中转录与含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子可调控地连接的编码核酶以及负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链的DNA的步骤;其中所述核酶具有在该核酶与基因组RNA或其互补链之间切断转录产物的活性。
.[1]所述的方法,其包括:在所述产生病毒的细胞中表达与含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子可调控地连接的编码噬菌体RNA聚合酶的DNA的步骤;及在所述产生病毒的细胞中通过该RNA聚合酶转录与该RNA聚合酶的识别序列可调控地连接的编码负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA的步骤。
.[2]所述的方法,其中所述核酶是锤头核酶。
.[3]所述的方法,其中所述编码RNA聚合酶的DNA在所述病毒生产细胞中作为游离基因表达。
.[3]所述的方法,其中所述编码RNA聚合酶的DNA从所述病毒生产细胞的染色体表达。
.[3]、[5]、或[6]所述的方法,其中所述噬菌体选自SP6噬菌体、T3噬菌体和T7噬菌体。
.[1]到[7]的任一项的方法,其中所述负链RNA病毒是仙台病毒。
.[1]到[8]的任一项的方法,其中所述基因组RNA或其互补链缺失了一个或多个编码包膜构成蛋白质的基因;且其中进一步包括在所述细胞内表达编码包膜构成蛋白的DNA的步骤。
.该DNA是,与含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子可调控地连接的编码核酶和负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA,其中所述核酶具有在该核酶与所述负链RNA病毒基因组RNA或其互补链之间切断转录产物的活性。
.[10]所述的DNA,其中所述基因组RNA或其互补链缺失了一个或多个编码包膜构成蛋白质的基因。
.[10]或[11]的DNA,其中所述负链RNA病毒是仙台病毒。
.[10]到[12]的任一项的DNA,其中所述核酶是锤头核酶。
.[10]到[13]的任一项的DNA,其中所述DNA可以被重组酶诱导表达。
.[14]的DNA,其中所述重组酶是Cre或Flp。
.与含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子可调控性地连接的编码噬菌体RNA聚合酶的DNA。
.[16]的DNA,其中所述噬菌体选自SP6噬菌体、T3噬菌体和T7噬菌体。
.[16]或[17]的DNA,其中所述DNA可以被重组酶诱导表达。
.[18]的DNA,其中所述重组酶是Cre或Flp。
.保持有[10]到[15]的任一项的DNA的哺乳动物细胞。
.[20]的哺乳动物细胞,其是所述细胞是生产负链RNA病毒的细胞。
.[20]或[21]的哺乳动物细胞,其中所述基因组RNA或其互补链缺失了一个或多个编码包膜构成蛋白质的基因。
.[20]到[22]的任一项哺乳动物细胞,其中所述负链RNA病毒是仙台病毒。
.保持有[16]到[19]的任一项的DNA的哺乳动物细胞。
.[24]的哺乳动物细胞,其是所述细胞是生产负链RNA病毒的细胞。
.[24]或[25]的哺乳动物细胞,其进一步保持有与所述RNA聚合酶的识别序列可调控地连接的编码负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链的DNA。
.[26]的哺乳动物细胞,其中所述基因组RNA或其互补链缺失了一个或多个编码包膜构成蛋白质的基因。
.[25]到[27]的任一项的哺乳动物细胞,其中所述负链RNA病毒是仙台病毒。
附图简述
[图1]pCAGGS(B型)和pCAGGS(BSX)的构建程序
[图2]pCALNdL WE-zeo-NP(Z)的构建程序
[图3]pCAGGS-P4C(-)的构建程序
[图4]pCAGGS-L(TDK)的构建程序
[图5]pCAGGS-F的构建程序
[图6]pCAGGS-F5R的构建程序
[图7]pCAGGS-F5R的构建程序(续图6)
[图8]pCAGGS-T7的构建程序
[图9]pCAGGS-SeV及pCAGGS-SeV/ΔF-GFP的构建程序
[图10]pCAGGS-SeV及pCAGGS-SeV/ΔF-GFP的构建程序(续图9)
[图11]pCAGGS-SeV的构建程序(续图10)
[图12]用HamRbz法回收的传播型SeV载体的HA测定结果的照片
[图13]通过CIU测定考察HamRbz法中使基因组DNA的量变化时SeV/ΔF-GFP的回收效率的结果
[图14]考察HamRbz法回收SeV/ΔF-GFP时,使用pCAGGS-F和pCAGGS-F5R的SeV/ΔF-GFP回收效率的结果。使用pCAGGS-F5R的回收效率明显提高。
[图15]用pCAGGS-T7法回收的传播型SeV(SeV(TDK)18+GFP)的HA测定结果的照片。只有用未稀释的BHK-21、BHK/T7和293T接种鸡卵 时检出了HA活性。
[图16]表示通过CIU测定考察pCAGGS-T7法中改变基因组DNA的量时SeV/ΔF-GFP的回收效率的结果。尽管使用5μg基因组DNA时回收效率最佳,但回收效率在使用0.5-5.0μg基因组DNA时几乎没有变化。
[图17]通过CIU测定考察pCAGGS-T7法中改变导入试剂时SeV/ΔF-GFP的回收效率的结果。使用磷酸钙的回收效率等于或大于使用TransIT-LT-1的回收效率。
[图18]通过CIU测定考察pCAGGS-T7法中改变细胞种类时SeV/ΔF-GFP的回收效率的结果。从所有的被试细胞中都回收到了病毒。回收效率的顺序是BHK/T7>BHK-21>293T>LLC-MK2(但使用BHK/T7时没有添加pCAGGS-T7)。
[图19]通过CIU测定比较HamRbz法和pCAGGS-T7法的SeV/ΔF-GFP回收效率的结果。pCAGGS-T7法的重建效率优于HamRbz法。
[图20]通过pCAGGS-T7法的SeV/ΔM-GFP的重建。
[图21]通过pCAGGS-T7法的SeV/ΔMΔF-GFP的重建。
[图22]使用CA启动子的载体重建和使用CMV启动子的载体重建的比较结果。使用CA启动子的载体重建的效率高得多。
本发明优选的实施方案
本发明涉及负链RNA病毒载体的制备方法,其特征在于通过用含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的杂合启动子(本发明称之为CA启动子)来诱导病毒生产细胞中负链RNA病毒基因组RNA的转录及与该基因组RNA形成核蛋白(RNP)的全部负链RNA病毒蛋白质的表达。本发明的方法用CA启动子直接或间接地诱导负链RNA病毒基因组RNA的转录。用CA启动子直接诱导负链RNA病毒基因组RNA的转录时,在CA启动子的调控下,与编码负链RNA病毒基因组RNA(负链)或其互补链(正链)的DNA连接。这里,“可调控地连接”是指将编码目的基因的DNA连接在该启动子下游,以使得该目的基因依照启动子的活性被转录。用CA启动子间接诱导负链RNA病毒基因组RNA的转录时,例如构建与CA启动子可调控地连接的编码RNA聚合酶的DNA,和与该RNA聚合酶的识别序列的调控下,可调控地连接的编码负链RNA病毒基因组RNA或其互补链(即可以是正链也可以是负链)的DNA,并将它们导入细胞。这里,“RNA聚 合酶的识别序列”是指作为该聚合酶引发转录的信号的DNA序列。通过将该识别序列与编码负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA连接,可通过该聚合酶使负链RNA病毒的基因组RNA或反基因组RNA转录。CA启动子诱导RNA聚合酶的表达,该RNA聚合酶诱导负链RNA病毒基因组的转录。如实施例所示,通过RNA聚合酶的诱导间接地诱导负链RNA病毒基因组RNA的转录比用CA启动子直接诱导负链RNA病毒基因组RNA的转录可以制造效价更高的病毒。
“与基因组RNA构成RNP的蛋白质”是指与负链RNA病毒基因组RNA形成复合体,并且是基因组RNA的复制及基因组编码的基因的表达所需要的病毒蛋白质群体。为了如上所述表达这些蛋白质,可以使用将这些蛋白质的编码序列简单地连接在CA启动子下游的表达载体。由此可以用CA启动子直接诱导该蛋白质群体的表达。这些蛋白质是除了病毒包膜的形成病毒核心的蛋白质,典型地为N(nucleocapsid,核衣壳)、P(phospho-,磷-)和L(large,大)蛋白。因病毒种类不同,其命名可能也会不同,但其对应的蛋白质对本领域的技术人员是显然自明的(Anjeanette Robert等,Virology 247:1-6(1998))。例如N有时也可以称为NP。
本发明的负链RNA病毒载体的制备方法,具体步骤包括(a)在哺乳动物细胞中用CA启动子诱导负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的转录及构成该负链RNA病毒的核蛋白(RNP)的病毒蛋白的表达;和(b)回收从该细胞中生产的负链RNA病毒或其增殖产物。
负链RNA病毒基因组RNA或其互补链(反基因组RNA)与构成负链RNA病毒RNP的病毒蛋白共同形成RNP。基因组编码的病毒蛋白被表达,从而在细胞内使基因组RNA和反基因组RNA得以扩增,然后被包膜构成蛋白质包被后形成病毒粒子。通过回收病毒粒子可以得到病毒。
生成的病毒可以适当地扩增。携带包膜基因的传播型病毒在感染哺乳动物细胞时通过一般的病毒扩增循环就可以得到增殖。而对于缺失了包膜构成蛋白质的编码基因的没有传播能力的病毒,则可以通过将其导入表达包膜构成蛋白的细胞(辅助细胞)而增殖感染性的病毒。
在本发明中“含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子”(CA启动子)是指含有(i)巨细胞病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的增强子序列,及(ii)鸡β-肌动蛋白基因的启动子序列的启动子。对于CMV IE增强子,可以使用来自所希望的CMV株的立即早期基因的增强子, 例如包含序列号:1的核苷酸序列的DNA。
另外,对于鸡β-肌动蛋白启动子,可以使用包含鸡β-肌动蛋白基因的基因组DNA的转录起始位点的具有启动子活性的DNA片段。关于鸡β-肌动蛋白基因启动子的核苷酸序列的报道有例如T.A.Kost等(Nucl.Acids.Res.11,8287-8301,1983)。鸡β-肌动蛋白基因启动子是具有较高的G(鸟嘌呤)和C(胞嘧啶)含量、且含有例如TATA盒(Ann.Rev.Biochem.50,349-383,1981)和CCAAT盒(Nucl.Acids.Res.8,127-142,1980)等启动子特征性序列的基因片段。鸡β-肌动蛋白基因启动子中,从原本的β-肌动蛋白结构基因的翻译起始密码子(ATG)的上游-909位点的G(鸟嘌呤)到-7位置的G(鸟嘌呤)的区域被认为是内含子。由于该内含子具有促进转录的活性,优选使用至少含有此内含子的一部分的基因组DNA片段。具体地,这样的鸡β-肌动蛋白启动子的例子有,例如,含有序列号:2的核苷酸序列的DNA。内含子接纳体序列(intron acceptor sequence)优选使用别的基因的内含子接纳体序列,例如可以使用兔β-球蛋白的剪接接纳体序列(splicing acceptor sequence)。具体地,可以使用位于兔β-球蛋白的起始密码子前面紧邻的第二内含子的接纳体位点。更具体地,可以使用例如含有序列号:3的核苷酸序列的DNA。本发明中,CA启动子优选为这样的DNA:CMV IE增强子序列的下游连接含有部分所述内含子的鸡β-肌动蛋白启动子,在其下游附加所希望的内含子接纳体序列。例如,序列号:4的核苷酸序列的DNA。为表达蛋白质,可以将此序列最后的ATG作为起始密码子,再附加上目的蛋白质的编码序列。另外,为转录负链RNA病毒基因组,将编码负链RNA病毒基因组RNA或其互补链(正链或负链都可以)的DNA连接在上述内含子接纳体序列的下游。但是如后所述,内含子接纳体序列和编码负链RNA病毒基因组的DNA之间,优选地插入编码自身剪切型核酶的DNA。
杂合启动子所用的CMV增强子序列及鸡β-肌动蛋白基因启动子,其序列可能因分离株或分离个体不同而具有多样性。另外,这些序列可以作轻微的改变以添加或删除限制酶识别位点或插入接头序列。具体地,这些序列即使和序列号:4所示的序列不完全一致,只要其具有同等或更高(例如70%或更高,优选80%或更高,90%或更高,或100%或更高)的启动子活性,就可以适用。向核苷酸序列中导入变异的方法是本领域技术人员熟知的(Molecular cloning:a laboratory manual.,3rd ed.,Joseph Sambrook,David W.Russell.Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)。CMV增强子序列和鸡 β-肌动蛋白启动子序列的变体有例如Genbank登录号AF334827、AY237157、AJ575208及X00182等,这些序列可以用于本发明。要从上面的序列中特别确定构建CA启动子所必需的序列,可以与序列号:1或2进行比对,并选择相匹配的区域。另外,可以从pCAGGS(Niwa,H.等.(1991)Gene.108:193-199、特开平3-168087(未实审已公开的日本专利申请))或pCALNdLw(Arai,T.等.J.Virology 72,1998,p1115-1121)中切割出DNA用于构建CA启动子。
如上所述的CMV IE增强子序列和鸡β-肌动蛋白启动子的变体包括如下的序列,它们包含在序列号:1所示的CMV IE增强子序列和序列号:2所示的鸡β-肌动蛋白启动子中具有30%或以下,优选20%或以下,更优选15%或以下,更优选10%或以下,更优选5%或以下,更优选3%或以下的核苷酸取代、缺失和/或插入的核苷酸序列,并表现同等的启动子活性。这些序列分别与序列号:1或序列号:2所示的核苷酸序列显示出高度的同源性。高度的同源性是指例如具有70%或以上,更优选75%或以上,更优选80%或以上、更优选85%或以上,更优选90%或以上,更优选93%或以上,更优选95%或以上,更优选96%或以上的同一性的核苷酸序列。核苷酸序列的同一性可以利用例如BLAST程序(Altschul,S.F.等,1990,J.Mol.Biol.215:403-410)来确定。例如在NCBI(National Center for BiotechnologyInformation,国立生物技术信息中心)的BLAST网页中关闭所有包含低复杂度(low complexity)的过滤器(filter),用默认的参数进行检索(AlschulS.F.等(1993)Nature Genet.3:266-272;Madden,T.L.等(1996)Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul,S.F.等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402;Zhang,J.&Madden,T.L.(1997)Genome Res.7:649-656)。例如可以利用比较两个序列的blast2sequences程序(Tatiana A等(1999)FEMS Microbiol Lett.174:247-250)进行两个序列的比对并确定序列的同一性。缺口与错配同样处理;例如计算对于序列号:1所示的全部序列和序列号:2所示的全部序列的同一性的值。具体地说,计算比对中序列号:1或2的总核苷酸数(包含缺口)中一致的核苷酸数的比例。比对中序列号:1或2以外的缺口被排除在计算之外。
另外,CMV增强子序列和鸡β-肌动蛋白启动子序列可以通过杂交分别从CMV的基因组核酸和鸡基因组DNA中分离。本发明中使用的CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子可以是分别与序列号:1所示核苷酸序列或序列 号:2所示核苷酸序列或其互补序列在严紧条件下杂交的DNA,也可以是与上述具有同等的启动子活性的DNA。在杂交时,可以通过例如从序列号:1所示核苷酸序列或序列号:2所示核苷酸序列或它们的互补序列的核苷酸序列制备探针,或者从预杂交的DNA制备探针,再通过检测这些探针是否与其他DNA杂交而进行鉴定。严紧的杂交条件包括例如在含有5×SSC、7%(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑精DNA、5×Denhardt’s溶液(1×Denhardt’s溶液含0.2%聚乙烯吡咯烷酮,0.2%牛血清白蛋白和0.2%Ficoll)的溶液中,在60℃,优选65℃,更优选68℃进行杂交,然后在与杂交相同的温度下,在2×SSC中,优选1×SSC中,更优选0.5×SSC中,更优选0.1×SSC中振荡洗涤2小时。
本发明的负链RNA病毒制造方法的实施方式之一是在病毒生产细胞中转录与CA启动子可调控地连接的编码核酶和负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链的DNA的方法。从该DNA转录的早期转录产物包含核酶和负链RNA病毒基因组RNA(正链或负链)。这里,核酶被设计为具有在该核酶和负链RNA病毒基因组之间切断的活性。转录的RNA中的核酶顺式或反式地作用,在该核酶与负链RNA病毒基因组RNA之间切断,从而生成具有正确的基因组末端的负链RNA病毒基因组RNA(Inoue,K.等J.Virol.Methods 107 2003,229-236)。在使用核酶的方法中,只要DNA转录生成RNA,具有正确末端的负链RNA病毒基因组RNA就会自动生成,因此该方法具有病毒的制造方法简便,不需要特别的细胞的优点。
切断特定序列的核酶可以基于公知的技术设计。例如锤头核酶,在自然中可以从类病毒等中分离到(J.M.Buzayan等,Nature,1986,323:349-353;G.A.Prody等,Science,1986,231:1577-1580);其本身有具有3个环和3个螺旋的锤状结构,除了顺式作用外,还可以通过将具有催化活性的RNA区域与目标RNA分离而进行反式作用。这样的核酶例如具有1个环和1个螺旋,并与目标序列形成类环(quasi-loop)(Turner,P.C.,The Biochemistry of theHammerhead Ribozyme.于:Scanlon,KJ.和Kashani-Sabet,M.编,Ribozymesin the Gene Therapy of Cancer(Medical Intelligence UNIT 4)中,R.G.LandesCompany,1998;3-14)。锤头核酶的结构是十分清楚的;烟草环斑病毒的核酶特异性地切断NUH(N=A、G、C或U;H=A、C或U)的核苷酸序列的3’侧。因此,有可能造出特异性地切断所希望的目标RNA中含有UC、UU或UA序列的部位的核酶(M.Koizumi等,FEBS Lett.239:285,1988;小泉诚 及大塚荣子,蛋白质核酸酵素,35:2191,1990;M.Koizumi等,Nucleic AcidRes.17:7059,1989)。
另外,发夹型核酶也可用于本发明。发夹型核酶在例如烟草环斑病毒的卫星RNA的负链中被发现(J.M.Buzayan,Nature 323:349,1986)。已经证明也可设计这种核酶使得其以目标特异性的方式切断RNA(Y.Kikuchi和N.Sasaki,Nucleic Acids Res.19:6751,1992;菊池洋,化学と生物30:112,1992)。
可以对这些核酶作合适的改变。已知有利用体外进化系统改变天然核酶而获得高活性的修饰核酶的方法(Joyce.1992.Selective AmplificationTechniques for Optimization of Ribozyme Function.于Antisense RNA and DNA中,pp.353-372.Wiley-Liss Inc.)。还可以使用以二聚体形式发挥功能的核酶。
具有RNA切断活性的核酶一般含有催化活性所必需的序列和识别目标RNA所必需的目标识别序列。锤头核酶的催化所必需的序列包括但不限于,例如,
5’-1C2U3G4A5N6G7A8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20G21A22A23A24 N-3’(序列号:5)。这里N为G、A、U或C;并且设计5’-8N9N10N11N-3’和5’-16N17N18N19N-3’为彼此互补序列以使碱基对得以形成。例如5’-8N9N10N11N-3’包括但不限于5’-GUCC-3’;并且5’-16N17N18N19N-3’包括但不限于5’-GGAC-3’。12N13N14N15N的四个碱基优选地形成环。这里,也可以不是4个核苷酸,而是约2-7个核苷酸(即N2~7),例如约3~5个核苷酸(即N3~5)。23A24N与目标识别序列重叠,使24N成为与上述目标位点NUH中的N互补的核苷酸。例如5’-GUGA-3’。更具体的序列显示在实施例中。在该序列两端加上目标识别序列。目标识别序列设定为与核酶和负链RNA病毒基因组之间的序列互补的序列。
本发明的方法的另一个实施方式是在病毒生产细胞中表达与CA启动子可调控地连接的编码噬菌体RNA聚合酶的DNA。这里,使所述病毒生产细胞含有连接在所述RNA聚合酶识别序列的下游并编码负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA。表达的RNA聚合酶转录连接在所述RNA聚合酶识别序列的下游的编码负链RNA病毒基因组RNA的DNA,生成病毒基因组RNA。所用的RNA聚合酶包括识别特定的序列(RNA聚合酶的目标序列,一般也称为启动子序列)并起始转录的所希望的噬菌体来源的 RNA聚合酶,具体有例如大肠杆菌T3噬菌体和T7噬菌体,及沙门氏菌SP6噬菌体等(Kreig,P.A.和Melton,D.A.1987.In vitro RNA synthesis with SP6RNA polymerase.Methods Enzymol.155:397-15;Milligan,J.F.,Groebe,D.R.,Witherell,G.W.,和Uhlenbeck,O.C.1987.Oligoribonucleotide synthesis usingT7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.Nucleic Acids Res.15:8783-798;Pokrovskaya,I.D.和Gurevich,V.V.1994.In vitro transcription:Preparative RNA yields in analytical scale reactions.Anal.Biochem.220:420-23)。
T3、T7及SP6的典型的识别序列(启动子序列)如下所示。这里“+1”表示第一个被转录的核苷酸。
+1
T7:TAATACGACTCACTATAGGGAGA(序列号:6)
T3:AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA(序列号:7)
SP6:ATTTAGGTGACACTATAGAAGNG(序列号:8)(N=A,G,C,或T)
-17到-1的区域是转录所必需的,且必须是双链。另外在上述+1到+6中,最初两个核苷酸(+1和+2)为GP(P=嘌呤(A或G))对于实现高效转录是重要的,其余的核苷酸可以换成别的核苷酸。优选地,使用上面下划线部分所示的序列。负链RNA病毒的基因组的cDNA紧接在上述RNA聚合酶的识别序列的下游。为了高效率地制备病毒,可以转录正链。
上述的负链RNA病毒基因组的转录载体及噬菌体RNA聚合酶的表达载体可以是所希望的DNA载体或者导入细胞后转变为DNA的载体如反转录病毒,通常使用质粒载体。载体可以是在导入细胞后作为附加体存在和表达的载体,或者是整合到细胞染色体中表达的染色体整合型载体。例如使用质粒时,可以通过转染瞬时表达,或者也可以选择质粒整合到染色体的稳定导入株。特别地,稳定地表达噬菌体RNA聚合酶的细胞株是有用的,因为它们可以简化病毒生产的程序,使稳定地生产高效价的病毒成为可能(参见实施例2)。另外,载体可以是持久性表达的,也可以是能在必要的时候诱导表达的诱导表达型载体。例如,可以使用序列特异性的重组酶(重组酶)实现诱导表达。可用于此目的的重组酶包括Cre重组酶和FLP重组酶。通过在CA启动子与所述核酶或RNA聚合酶的编码序列之间插入被重组酶的目标序列所侧翼包夹的DNA,可以使所述表达响应于重组酶而被诱导。
Cre是噬菌体P1所具有的约38kDa的环化重组酶,特异性地在loxP位 点之间产生位点特异性DNA重组(Sauer B,Henderson N.1988.Site-specificDNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase ofbacteriophage P1.Proc Natl Acad Sci USA 85:51 66-70;Stemberg N,HamiltonD.1981 Bacteriophage P1 site-specific recombination.I.Recombinationbetween loxP sites.J Mol Biol 150:467-86;Brian Sauer,Methods ofEnzymology;1993,Vol.225,890-900;Nagy A.2000.Cre recombinase:theuniversal reagent for genome tailoring.Genesis 26:99-109)。loxP是包括8bp的间隔区的13bp的不对称反向重复序列(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT;下划线部分是反向重复序列)(序列号:9)。
FLP重组酶是来自酵母酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)的2μm质粒的约49kDa的翻转酶重组酶(flippase recombinase),其以FLP重组酶目标(FLP recombinase target,FRT)序列作为目标进行重组(Utomo AR,NikitinAY,Lee WH.1999.Temporal,spatial,and cell type-specific control ofCre-mediated DNA recombination in transgenic mice.Nat Biotechnol 17:1091-6;Broach,J.R.,Guarascio,V.R.& Jayaram,M.(1982)Cell 29,227-34;Cox M.M.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,4223-227;Vetter,D.,Andrews,B.J.,Roberts-Beatty,L.& Sadowski,P.D.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci USA 80,7284-288;Abremski,K.& Hoess,R.(1984)J.Biol.Chem.259,1509-514;Stark,W.M.,Boocock,M.R.& Sherratt,D.J.(1992)Trends Genet.9,413-21)。和loxP一样,FRT序列也是由包括8bp的间隔区的13bp的重复序列构成的(GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC;序列号:10)(Andrews,B.J.等(1985).The FLP Recombinase of the 2 Micron Circle DNAof Yeast:Interaction with its Target Sequences.Cell 40,795-803)。另外,也可以利用上述loxP位点和FRT位点的变异序列进行目标特异性的重组(Baszczynski,Christopher L.等,美国专利申请20040003435)。
为了构建通过重组酶可诱导表达的DNA,将被一对重组酶目标序列所侧翼包夹的DNA插入到CA启动子与核酶或噬菌体RNA聚合酶的编码序列之间。在这种状态下,由于被插入的DNA片段所妨碍,无法由CA启动子表达负链RNA病毒的基因组(其附加了核酶)或噬菌体RNA聚合酶。但是,重组酶作用于DNA后,目标序列所侧翼包夹的DNA被切割出,使负链RNA病毒的基因组或噬菌体RNA聚合酶得以由CA启动子表达。这 样,就可以通过重组酶诱导由CA启动子所驱动的表达。优选地,使被重组酶目标序列侧翼包夹的DNA中包含转录终止信号和/或终止密码子,以在重组酶不作用时,切实地阻断连接在下游的负链RNA病毒基因组或噬菌体RNA聚合酶基因的表达。另外,还可以在被重组酶目标序列侧翼包夹的DNA中插入合适的标记基因。
本说明书所述的用于制造病毒的DNA和细胞可以适当地组合成制备病毒用的试剂盒。例如本发明涉及如下的试剂盒。
(1-1)制备负链RNA病毒的试剂盒,其包含与CA启动子可调控地连接的且编码噬菌体RNA聚合酶的DNA,和与该RNA聚合酶的识别序列可调控地连接且编码负链RNA病毒基因组或其互补链的DNA。
(1-2)上述(1-1)所述的试剂盒,其还包含与CA启动子可调控地连接且编码与RNA形成RNP的负链RNA病毒蛋白质的DNA。
(1-3)上述(1-1)或(1-2)所述的试剂盒,其中所述基因组RNA或其互补链缺失了一个或多个编码包膜构成蛋白质的基因。
(1-4)上述(1-1)到(1-3)的任一项所述的试剂盒,其进一步含有编码包膜构成蛋白质的基因。
(1-5)上述(1-1)到(1-4)的任一项所述的试剂盒,其中编码包膜构成蛋白质的DNA与CA启动子可调控地连接。
(1-6)上述(1-1)到(1-5)的任一项所述的试剂盒,其中所述负链RNA病毒是仙台病毒。
(1-7)上述(1-1)到(1-6)的任一项所述的试剂盒,其中所述噬菌体选自SP6噬菌体、T3噬菌体和T7噬菌体。
(1-8)上述(1-1)到(1-7)的任一项所述的试剂盒,其中所述RNA聚合酶的可以被重组酶诱导表达。
(1-9)上述(1-8)所述的试剂盒,其中所述重组酶是Cre或Flp。
(2-1)制造负链RNA病毒的试剂盒,其包含:保持有与CA启动子可调控地连接且编码噬菌体RNA聚合酶的DNA、和与该RNA聚合酶的识别序列可调控地连接并编码负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链的DNA的哺乳动物细胞。
(2-2)上述(2-1)所述的试剂盒,其进一步包含与CA启动子可调控地连接,且编码与RNA形成RNP的负链RNA病毒蛋白质的DNA。
(2-3)上述(2-1)或(2-2)所述的试剂盒,其中所述基因组RNA或 其互补链缺失了一个或多个编码包膜构成蛋白质的基因。
(2-4)上述(2-1)到(2-3)的任一项所述的试剂盒,其进一步含有编码包膜构成蛋白质的基因。
(2-5)上述(2-1)到(2-4)的任一项所述的试剂盒,其中编码包膜构成蛋白质的DNA与CA启动子可调控地连接。
(2-6)上述(2-1)到(2-5)的任一项所述的试剂盒,其中所述负链RNA病毒是仙台病毒。
(2-7)上述(2-1)到(2-6)的任一项所述的试剂盒,其中所述噬菌体选自SP6噬菌体、T3噬菌体和T7噬菌体。
(2-8)上述(2-1)到(1-7)的任一项所述的试剂盒,其中所述RNA聚合酶可以被重组酶诱导表达。
(2-9)上述(2-8)所述的试剂盒,其中所述重组酶是Cre或Flp。
(3-1)制备负链RNA病毒的试剂盒,其包含:(i)与CA启动子可调控地连接、并编码核酶和负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA,其中所述核酶具有在该核酶和负链RNA病毒基因组RNA或其互补链之间切断转录产物的活性;和(ii)与CA启动子可调控地连接,且编码与RNA形成RNP的负链RNA病毒蛋白质的DNA。
(3-2)上述(3-1)所述的试剂盒,其中所述基因组RNA或其互补链缺失了一个或多个编码包膜构成蛋白质的基因。
(3-3)上述(3-1)或(3-2)所述的试剂盒,其进一步含有编码包膜构成蛋白质的DNA。
(3-4)上述(3-1)到(3-3)的任一项所述的试剂盒,其中编码包膜构成蛋白质的DNA与CA启动子可调控地连接。
(3-5)上述(3-1)到(3-4)的任一项所述的试剂盒,其中所述负链RNA病毒是仙台病毒。
(3-6)上述(3-1)到(3-5)的任一项所述的试剂盒,其中所述噬菌体选自SP6噬菌体、T3噬菌体和T7噬菌体。
(3-7)上述(3-1)到(1-6)的任一项所述的试剂盒,其中所述RNA聚合酶的可以被重组酶诱导表达。
(3-8)上述(3-7)所述的试剂盒,其中所述重组酶是Cre或Flp。
另外,“可以被重组酶诱导表达”是指被该重组酶的识别序列所侧翼包夹的DNA插入CA启动子与下游DNA之间,当除去被重组酶识别序列所 侧翼包夹的DNA时,可被CA启动子下游的DNA诱导表达。
本发明中“负链RNA病毒”是指含有负链(与有义地编码病毒蛋白质的链互补的反义链)RNA作为基因组的病毒。负链RNA(minus strand RNA)又称为负链RNA(negative strand RNA)。用于本发明的负链RNA病毒具体地如单链负链RNA病毒(又称非分节型(non-segmented)负链RNA病毒)。“单链负链(negative strand)RNA病毒”指基因组中具有单链负链(即“单链负链(minus strand)”)的RNA病毒。这样的病毒包括属于副粘病毒科(Paramyxoviridae,包括副粘病毒属(Paramyxovirus)、麻疹病毒属(Morbillivirus)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)、及肺病毒属(Pneumovirus))、弹状病毒科(Rhabdoviridae,包括水泡性病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病毒属(Lyssavirus)及短暂热病毒属(Ephemerovirus))、纤丝病毒科(Filoviridae)等等病毒。
另外,“负链RNA病毒载体”是指用作将基因导入细胞的载体的基于负链RNA病毒的有感染力的病毒。这里“感染力”是指负链RNA病毒载体保持细胞粘附能力和向被粘附的细胞内部导入载体所含基因的能力。另外“基因”是指本发明中制造的负链RNA病毒载体所具有的任何遗传物质,不限于外源基因。换言之,负链RNA病毒载体可以带有也可以不带有外源基因。本发明的方法适用于有传播能力的病毒载体的制备,也适用于无传播能力的缺陷型载体的制备。特别是具有能够高效地制备无传播能力的缺陷型载体的优点。这里“有传播能力”是指病毒载体感染宿主细胞时,病毒在该细胞中复制,产生感染性的病毒粒子。
“重组病毒”是指通过重组多核苷酸产生的病毒或该病毒的扩增产物。“重组多核苷酸”是指两端或者一端以与自然状态不同的方式连接的多核苷酸。具体而言,重组多核苷酸是多聚核苷酸链的连接被人为地改变(切断和/或连接)的多核苷酸。重组多核苷酸可以通过组合多核苷酸合成、核酸酶处理、连接酶处理等手段,利用公知的基因重组方法来产生。重组病毒可以通过表达编码由基因操作构建的病毒基因组的多核苷酸,并重建病毒而产生。例如,已知有从编码病毒基因组的cDNA重建病毒的方法(Y. Nagai,A.Kato,Microbiol.Immunol.,43,613-624(1999))。
本发明中“基因”指遗传物质,编码转录单位的核酸。基因可以是RNA也可以是DNA。本发明中编码蛋白质的核酸称为该蛋白质的基因。另外,一般地,基因也可以不编码蛋白质,例如基因也可以编码核酶或反义RNA等功能性RNA。一般地,基因可以是天然存在的或人工设计的序列。另外,本发明中“DNA”包含单链和双链的DNA。另外,“编码蛋白质”是指多核苷酸有义地或反义地含有编码蛋白质的氨基酸序列的ORF,使得该蛋白质可以在合适的条件下表达。
本发明中适用的负链RNA病毒包括,例如,副粘病毒科的仙台病毒(Sendai virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(Mumpsvirus)、麻疹病毒(Measles virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytialvirus)、牛瘟麻疹病毒(rinderpest virus)、温热病病毒(distemper virus)、猿猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1、2、3型、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病毒(Rabies virus)等等。
可用于本发明的病毒的例子还包括,例如,仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(human parainfluenza virus-1)(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹温热病毒(phocine distemper virus)(PDV)、犬温热病毒(canine distempervirus)(CDV)、海豚麻疹病毒(dolphin molbillivirus)(DMV)、小反刍动物瘟病毒(peste-des-petits-ruminants virus)(PDPR)、麻疹病毒(measles virus)(MV)、牛瘟麻疹病毒(rinderpest virus)(RPV)、亨德拉病毒(hendra virus)(Hendra)、Nipah病毒(Nipah)、人副流感病毒-2(HPIV-2)、猿猴副流感病毒5(simian parainfluenza virus)(SV5)、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒-4b(HPIV-4b)、腮腺炎病毒(Mumps)、及新城疫病毒(NDV)。更优选的例子是选自仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹温热病毒(PDV)、猫温热病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反刍动物瘟病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟麻疹病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)和Nipah病毒(Nipah)的病毒。
本发明制造的负链RNA病毒更优选地为属于副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属(Respirovirus)、腮腺炎病毒属和麻疹病毒属)的病毒或其衍生 物,更优选为属于呼吸道病毒属(genus Respirovirus)(也称副粘病毒属(Paramyxovirus))的病毒或其衍生物。所述衍生物包括在无损于病毒的基因转导能力的条件下进行了基因修饰或化学修饰的病毒等。可应用于本发明的呼吸病毒属病毒包括,例如,人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、牛副流感病毒-3(BPIV-3)、仙台病毒(Sendai virus;也称鼠副流感病毒-1)、及猿猴副流感病毒-10(SPIV-10)等。本发明中副粘病毒最优选为仙台病毒。这些病毒可以来自天然株、野生株、变异株、实验室传代株及人工构建株等等。
负链RNA病毒载体上所携带的基因以反义方向位于病毒基因组RNA中。“病毒基因组RNA”是指具有下述功能的RNA:该RNA与负链RNA病毒的病毒蛋白质一起形成核蛋白(RNP);通过该RNP表达基因组中所包含的基因;从而复制该基因组RNA并形成子RNP。一般地,在负链RNA病毒基因组中具有这样的构造:病毒基因以反义序列的形式排列在3’前导序列区(leader region)和5’尾随序列区(trailer region)之间。各个基因的ORF之间存在转录终止序列(E序列)-间插序列(I序列)-转录起始序列(S序列),藉此各基因的ORF的编码RNA被作为单独的顺反子转录。本发明病毒中的基因组RNA含有编码N(nucleocapsid,核衣壳)、P(phospho-,磷-)和L(large,大)蛋白的反义RNA,所述蛋白是该RNA所编码的基因群的表达及该RNA自身的自主复制所必需的病毒蛋白质。另外,该RNA也可以编码病毒粒子形成所必需的M(matrix,基质)蛋白。进一步地,该RNA还可以编码病毒粒子感染所必需的包膜蛋白。负链RNA病毒的包膜蛋白包括例如引起细胞膜融合的蛋白质F(fusion,融合)蛋白及粘附细胞所必需的HN(血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuroaminidase))蛋白。但是对于某些类型的细胞,HN蛋白不是感染所必需的(Markwell,M.A.等,Proc.Natl.Acad.Sci USA 82(4):978-982(1985)),只需F蛋白就可以完成感染。另外,该RNA也可以编码F蛋白和/或HN蛋白以外的病毒包膜蛋白。
例如各种属于副粘病毒亚科的病毒中的各个基因一般用下面的方式表示。一般地,NP基因也可表示为“N”。另外,HN在没有神经氨酸酶活性时表示为H。
呼吸道病毒属 NP P/C/V M F HN - L
弹状病毒属 NP P/V M F HN (SH) L
麻疹病毒属 NP P/C/V M F H - L
例如,仙台病毒的各个基因的数据库登记号如下:NP基因为M29343,M30202,M30203,M30204,M51331,M55565,M69046和X17218;P基因为M30202,M30203,M30204,M55565,M69046,X00583,X17007和X17008;M基因为D11446,K02742,M30202,M30203,M30204,M69046,U31956,X00584和X53056;F基因为D00152,D11446,D17334,D17335,M30202,M30203,M30204,M69046,X00152和X02131;HN基因为D26475,M12397,M30202,M30203,M30204,M69046,X00586,X02808和X56131;L基因为D00053,M30202,M30203,M30204,M69040,X00587,和X58886。其他病毒所编码的病毒基因例如,N基因有CDV,AF014953;DMV,X75961;HPIV-1,D01070;HPIV-2,M55320;HPIV-3,D10025;Mapuera,X85128;Mumps,D86172;MV,K01711;NDV,AF064091;PDPR,X74443;PDV,X75717;RPV,X68311;SeV,X00087;SV5,M81442;和Tupaia,AF079780;P基因有CDV,X51869;DMV,Z47758;HPIV-1,M74081;HPIV-3,X04721;HPIV-4a,M55975;HPIV-4b,M55976;Mumps,D86173;MV,M89920;NDV;M20302;PDV,X75960;RPV,X68311;SeV,M30202;SV5,AF052755;和Tupaia,AF079780;C基因有CDV,AF014953;DMV,Z47758;HPIV-1,M74081;HPIV-3,D00047;MV,ABO16162;RPV,X68311;SeV,AB005796;和Tupaia,AF079780;M基因有CDV,M12669;DMV,Z30087;HPIV-1,S38067;HPIV-2,M62734;HPIV-3,D00130;HPIV-4a,D10241;HPIV-4b,D10242;Mumps,D86171;MV,AB012948;NDV,AF089819;PDPR,Z47977;PDV,X75717;RPV,M34018;SeV,U31956;和SV5,M32248;F基因有CDV,M21849;DMV,AJ224704;HPN-1,M22347;HPIV-2,M60182;HPIV-3,X05303;HPIV-4a,D49821;HPIV-4b,D49822;Mumps,D86169;MV,AB003178;NDV,AF048763;PDPR,Z37017;PDV,AJ224706;RPV,M21514;SeV,D17334;和SV5,AB021962;FIN(H或G)基因有CDV,AF”2189;DMV,AJ224705;HPIV-1,U709498;HPIV-2,D000865;HPIV-3,AB012132;HPIV-4A,M34033;HPIV-4B,AB006954;Mumps,X99040;MV,K01711;NDV,AF204872;PDPR,Z81358;PDV,Z36979;RPV,AF132934;SeV,U06433;和SV-5,S76876。但是每种病毒都有多个已知的株,由于病毒株的不同,也可以包括上述序列以外的序列的基因。
这些编码蛋白质的ORF及外来基因的ORF在基因组RNA中通过上述的E-I-S序列被反义地排列。对基因组RNA中最接近3’末端的ORF而言, 只有3’前导序列区和该ORF之间的S序列是必需的,E和I序列不是必需的。而对基因组RNA中离5’末端最近的ORF而言,只有5’尾随序列区和该ORF之间的E序列是必需的,I和S序列不是必需的。另外,利用例如IRES(internal ribosome entry segment,内部核糖体进入片段)序列,两个ORF可以作为同一个顺反子而被转录。在这种情况下,这两个ORF之间的E-I-S序列不是必需的。例如,野生型副粘病毒中,典型的RNA基因组在3’前导序列之后顺序地排列着反义地编码N、P、M、F、HN和L蛋白的6个ORF,接下来在另一端具有5’尾随序列区。本发明中,病毒基因的排列方向并不限于上面所述的方式,但优选地,和野生型病毒相似,在3’前导序列之后顺序地排列着反义地编码N、P、M、F、HN和L蛋白的ORF,然后排列着5’尾序列。在某些种类的病毒中病毒基因不同,但各个病毒基因仍优选地如上所述与野生型类似地排列。一般地,保持着N、P和L基因的载体在细胞内自主地从RNA基因组表达基因,从而使基因组RNA得以复制。进一步,通过F基因、HN基因等编码包膜的刺突蛋白质的基因以及M基因的作用,感染性的病毒粒子得以形成并被释放到细胞外。由此,这样的载体就成了具有传播能力的病毒载体。要让该载体携带外源基因时,可如后所述,将外源基因插入该基因组中的非蛋白质编码区域。
另外,负链RNA病毒载体也可以缺失野生型病毒所具有的任一基因。例如,缺失了病毒包膜构成蛋白质的基因的病毒可以用作高度安全性的基因导入载体。根据本发明的方法,可以在不使用痘苗病毒载体的条件下回收高效价的缺失了病毒包膜构成蛋白质的基因的病毒。“包膜构成蛋白质”是指作为病毒包膜成分的病毒蛋白质,包括暴露在包膜表面、在对细胞的粘附及感染中起作用的刺突蛋白质,和在包膜形成等中起作用的基质蛋白等。具体地,包膜构成蛋白质的基因包括例如F、HN和M基因,根据病毒种类不同还可以包括H、M1和G等基因。缺失了一个或者多个这样的包膜构成蛋白质基因的病毒在感染细胞中不能形成感染性的病毒粒子,因此具有高度的安全性。这样的病毒可以通过例如从外源提供缺失的基因产物而被重建。或者,也可以用完全不同的包膜蛋白来补全病毒的感染性。这样的包膜蛋白包括,例如VSV-G。即,只要能保证病毒的形成和感染性,在缺失了包膜构成蛋白质基因的病毒的构建中所用到的包膜蛋白质基因并不只限于缺失掉的基因。这样制备的病毒可以与野生型病毒类似地粘附到宿主细胞并引起细胞融合,但由于导入细胞的病毒基因组有病毒基因的缺失, 其不能形成具有同原载体相同的感染力的子代病毒粒子。因此,该载体可以作为一次性基因导入的安全的病毒载体而被使用(WO00/70055、WO00/70070及WO03/025570;Li,H.-O.等,J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。从基因组缺失的基因包括,例如,F基因、HN基因、M基因或其任意组合。例如,通过将表达缺失了F基因的重组负链RNA病毒基因组的质粒、F蛋白的表达载体和NP、P及L蛋白的表达载体共同转染到宿主细胞,可以重建重组病毒(见实施例4-5)。另外,例如,也可以利用染色体中整合了F基因的宿主细胞来制造病毒。此时,为使F基因可以诱导表达,优选地使用前面所述的重组酶目标序列,使表达可以被重组酶特异性地诱导。这些在病毒生产细胞中表达的蛋白质的氨基酸序列不一定要与病毒来源的序列一样,可以引入变异或用其他病毒的同源的基因来取代,只要其在核酸导入过程中的活性与天然型相比同样或更高。
另外,如前所述,本发明还可以制被如下的重组病毒,其包膜中含有与病毒基因组所由来的病毒的包膜蛋白不同的蛋白质。例如,重建病毒时,通过在细胞中表达与骨骼病毒基因组原本编码的包膜蛋白不同的包膜蛋白,可以制备包含所希望的包膜蛋白的重组病毒。对于这样的蛋白并无特别限制。可以使用能够赋予细胞感染能力的所希望的蛋白质。例如,其他病毒的包膜蛋白,如水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus;VSV)的G蛋白(VSV-G)等。VSV-G蛋白可以来自任意VSV株。例如可以使用但不限于Indiana血清型株(J.Virology 39:519-528(1981))来源的VSV-G蛋白。另外,本发明的载体可以包括其他病毒来源的包膜蛋白的任意组合。例如,上述蛋白质优选地包括来源于感染人细胞的病毒的包膜蛋白。对于这样的蛋白没有特别的限制,包括反转录病毒的兼嗜性包膜蛋白。例如可以使用来自鼠白血病病毒(MuLV)4070株的包膜蛋白。另外,还可以使用MuMLV 10A1来源的包膜蛋白(例如pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux R.K.等,J.Virol.70:5701-5705(1996))。另外,作为疱疹病毒科(Herpesviridae)的蛋白质,包括例如单纯疱疹病毒的gB、gD、gH和gp85蛋白、EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)的蛋白质,有乙型肝炎病毒的S蛋白。这些蛋白质也可以作为融合蛋白的形式使用,所述融合蛋白中胞外域与F蛋白或HN蛋白的胞内域结合。如此,用于本发明的病毒载体包括假型病毒载体,该载体含有来源于基因组来源的病毒之外的病毒的包膜蛋白,例如VSV-G蛋白等。如果在病毒基因组中设计 使得上述包膜蛋白不被RNA基因组所编码,则病毒粒子感染细胞后,这些蛋白质是不会被病毒载体表达的。
另外,本发明还可以,例如,制备这样的病毒,在其包膜表面含有可粘附特定细胞的粘附因子、配体、受体等蛋白质,抗体或其片段,或者在胞外域中具有上述蛋白、在胞内域中具有来源于负链RNA病毒包膜蛋白的多肽的嵌合蛋白质等等。藉此,可以控制病毒载体的感染的特异性。这些蛋白可以由病毒基因组编码,也可以在病毒重建时,通过病毒基因组以外的基因(例如在其他表达载体或宿主染色体上存在的基因)的表达来提供。
另外,在病毒载体中,例如为了降低病毒蛋白质引起的免疫原性,或者为了提高RNA的转录效率或复制效率,病毒所含的任意病毒基因可以从野生型基因改变而来。具体地,例如可以考虑改变作为复制因子的N、P和L基因中的至少一个,从而提高转录或复制功能。另外,作为包膜蛋白之一的HN蛋白具有作为红细胞凝集素的血凝素(hemagglutinin)活性和神经氨酸酶(neuraminidase)活性,例如如果可以降低前者的活性,则可以提高病毒在血液中的稳定性;又例如通过改变后者的活性,则可以调节感染能力。另外,还可以通过改变F蛋白来调节膜结合能力。另外,例如,通过解析可作为细胞表面的抗原分子的F蛋白和/或HN蛋白的抗原表位,可以利用它们制备与这些蛋白质相关的抗原性降低的重组病毒载体。
另外,负链RNA病毒载体还可以缺失附属基因(accessory gene)。例如通过敲除SeV的附属基因之一的V基因,SeV针对小鼠等宿主的病原性显著降低,而培养细胞中的基因表达和复制不受妨碍(Kato,A等,1997,J.Virol.71:7266-7272;Kato,A.等,1997,EMBO J.16:578-587;Curran,J.等,WO01/04272,EP1067179)。这些减毒的载体作为无毒性的体内或回体基因导入用载体特别有用。
负链RNA病毒是优秀的基因导入载体,它只在宿主细胞的细胞质中进行转录和复制,由于没有DNA相,它不会整合(integration)到染色体中(Lamb,R.A和Kolakofsky,D.,Paramyxoviridae:The viruses and theirreplication.于:Fields BN,Knipe DM,Howley PM编,Fields of virology.Vol.2.Lippincott-Raven Publishers:Philadelphia,1996,pp.1177-1204)。因此,不会产生由于染色体异常而导致的恶变和永生化等安全方面的问题。负链RNA病毒的这个特征对其载体化时的安全性有很大的贡献。至于表达异源基因的结果,例如仙台病毒显示即使经过连续多代的传代,基本上没有发 现核苷酸变异;基因组稳定性高;长期稳定地表达插入的异源基因(Yu,D.等,Genes Cells 2,457-466(1997))。另外,由于不具有核衣壳结构蛋白,其在导入基因的大小或包装上的灵活性等性质上都具有长处。由此,提示负链RNA病毒载体可成为新型用于人基因治疗的高效率载体。有传播能力的SeV载体可以导入至少5kb的外源基因,通过添加转录单位,其可以同时表达2种以上的基因。
特别地,虽然已知仙台病毒对啮齿类具有病原性且会导致肺炎,但其对人则没有病原性。这一点也得到了先前关于使用非人类灵长类经鼻给药野生型仙台病毒后,并不显示严重的有害作用的报道的支持(Hurwitz,J.L.等,Vaccine 15:533-540,1997;Bitzer,M.等,J.Gene Med,5:543-553,2003;Slobod,K.S.等,Vaccine 22:3182-3186,2004)。仙台病毒的这些特征提示该病毒可以应用于人类的治疗。
病毒载体可以在其基因组RNA中编码所希望的外源基因。含有外源基因的重组病毒载体是通过将外源基因插入上述病毒载体的基因组中而得到的。外源基因的插入位置可以选择,例如病毒基因组的非蛋白质编码区域中的所希望的位点,例如可以插入基因组RNA的3’前导序列区域与最接近3’末端的病毒蛋白质ORF之间,和/或最接近5’末端的病毒蛋白质ORF与5’尾随序列区域之间。另外,在缺失M、F或HN基因等包膜构成蛋白基因的基因组中,可以在该缺失区域插入编码外源基因的核酸。当向副粘病毒导入外源基因时,优选上述的插入,使得插入基因组的片段的多核苷酸的链长为6的倍数(Journal of Virology,Vol.67,No.8,4822-4830,1993)。使得插入的外源基因和病毒ORF之间构成E-I-S序列。通过E-I-S序列可以将2个或更多的外源基因串联插入。
为了便于在cDNA中插入外源基因,可以设计用于向编码基因组RNA的cDNA中插入外来基因的克隆位点。该位点可以是例如基因组的非蛋白质编码区域的所希望的位置,具体地,可以在3’前导序列区域和接近3’末端的病毒蛋白质ORF之间、各病毒蛋白质ORF之间、和/或接近5’末端的病毒蛋白质ORF与5’尾随序列区域之间插入。在缺失包膜构成蛋白基因的基因组中,可以在该缺失区域设计克隆位点。克隆位点可以是例如限制酶的识别序列。克隆位点也可以是具有多种限制酶识别序列的所谓多克隆位点。克隆位点还可以存在基因组中的多个位置,以使得多个外源基因可以被插入基因组中的不同位置。
载体所携带的外源基因的表达水平可以通过附加在该基因上游(负链(minus或negative链)的3’侧)的转录起始序列的种类而调节(WO01/18823)。另外,可以通过外源基因的插入基因组的位置来控制,越靠近负链的3’末端插入表达水平就越高,而越靠近5’末端插入表达水平越低。这样,可以合适地控制外源基因的插入位置,以得到该基因的所希望的表达水平,且使其与前后的病毒蛋白编码基因处于最适合的组合中。一般地,由于认为外源基因高表达是有利的,优选将外源基因与高效的转录起始序列连接,并在负链基因组3’末端附近插入。具体地,在3’前导序列区和最接近3’末端的病毒蛋白质ORF之间插入。或者,也可以在最接近3’末端的病毒蛋白质基因和第二个最接近的病毒蛋白质基因的ORF之间,或者从最接近3’末端的第二个和第三个病毒蛋白质基因的ORF之间插入。在野生型副粘病毒中,最接近基因组的3’末端的病毒蛋白质基因是N基因,第二个最接近基因是P基因,第三个最接近基因是M基因。反过来,当不希望导入的基因的高表达时,可以通过例如尽量把外源基因的插入位置设计到负链基因组的5’一侧,或使用低效的转录起始序列等,降低来自病毒载体的表达的水平,从而获得合适的效果。
当编码外源基因的核酸插入基因组时附加的序列可以使用,例如,负链RNA病毒的所希望的S序列可以使用,对于仙台病毒而言,可以优选地使用3’-UCCCWVUUWC-5’(W=A或C;V=A,C,或G) (序列号:11)的序列。特别优选3’-UCCCAGUUUC-5’(序列号:12)、3’-UCCCACUUAC-5’(序列号:13)、及3’-UCCCACUUUC-5’(序列号:14)。这些序列用编码正链的DNA序列表示分别为:5’-AGGGTCAAAG-3’(序列号:15)、5’-AGGGTGAATG-3’(序列号:16)及5’-AGGGTGAAAG-3’(序列号17)。作为仙台病毒载体的E序列,优选例如3’-AUUCUUUUU-5’(序列号:18)(编码正链的DNA则是5’-TAAGAAAAA-3’(序列号:19))。I序列可以是例如任何3个核苷酸,具体地可以使用3’-GAA-5’(在正链DNA中则为’5-CTT-3’)。
为制备负链RNA病毒载体,在哺乳动物细胞中,利用CA启动子来诱导含有负链RNA病毒基因组RNA的RNP的重构所必需的蛋白质,即N、P及L蛋白的表达及编码负链RNA病毒基因组RNA的cDNA的转录。可以通过转录生成负链基因组(即与病毒基因组相同的反义链)或正链(反基因组。基因组RNA的互补链),来重建病毒RNP。为了提高载体的重建 效率,优选形成正链。优选地,RNA末端尽量正确地反映3’前导序列和5’尾随序列的末端,就像在天然病毒基因组中一样。这可由如上所述在转录产物的5’端附加自剪切型的核酶,使核酶正确地切割出负链RNA病毒基因组的末端而实现。或者,在另外的实施方案中,利用噬菌体的RNA聚合酶的识别序列作为转录起始序列,在细胞中表达该RNA聚合酶,以正确地控制转录产物的5’端。
为了控制转录产物的3’端,可以例如使转录产物的3’端编码自剪切型的核酶,使该核酶正确地切割出3’端(Hasan,M.K.等,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997;Kato,A.等,1997,EMBO J.16:578-587及Yu,D.等,1997,Genes Cells 2:457-466)。核酶可以使用丁型肝炎病毒的反基因组链(antigenomic strand)来源的自剪切核酶。
例如重组仙台病毒可以按照本说明书的公开以及Hasan,M.K.等,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997;Kato,A.等,1997,EMBO J.16:578-587及Yu,D.等,1997,Genes Cells 2:457-466等的描述如下所述构建。
纳入外源基因时,首先,准备含有目的外源基因的cDNA核苷酸序列的DNA样品。优选地,DNA样品以25ng/μl或25ng/μl以上的浓度用电泳确认其为单一质粒。下面,以利用NotI位点向编码病毒基因组RNA的DNA插入外源基因为例加以说明。在目的cDNA核苷酸序列中含有NotI识别位点时,优选事先使用定点诱变等手段,使核苷酸序列变化而其所编码的氨基酸序列不变,而除去该NotI位点。用PCR从该样品中扩增并回收目的基因片段。通过在两个引物的5’部分附加NotI位点使扩增片段的两端成为NotI位点。使引物中含有E-I-S序列,以使得插入病毒基因组之后的外源基因的ORF与其两侧的病毒基因的ORF之间置有E-I-S序列。合成DNA的长度设计为使得包含附加的E-I-S序列的最终插入片段的链长为6的倍数个核苷酸(即所谓“6法则”(rule of six);Kolakofski,D.等,J.Virol.72:891-899,1998;Calain,P.和Roux,L.,J.Virol.67:4822-4830,1993;Calain,P.和Roux,L.,J.Virol.67:4822-4830,1993;)。E-I-S序列例如可以在插入片段的寡聚DNA的3’侧使用仙台病毒的S序列、I序列和E序列,例如分别为5’-CTTTCCACCCT-3’(序列号:20)、5’-AAG-3’、及5’-CTTTCACCCT-3’(序列号:21)。
PCR可以通过使用Taq聚合酶或其他DNA聚合酶的常规方法进行。扩增的目的片段用NotI消化后,插入pBluescript等质粒载体的NotI位点。通 过测序确认所得PCR产物的核苷酸序列,选择序列正确的质粒。用NotI从该质粒中切割出插入序列,克隆到含有基因组cDNA的质粒的NotI位点中。另外,也可以不通过质粒载体的介导,将所述片段直接插入基因组cDNA的NotI位点而得到重组仙台病毒cDNA。
例如,重组仙台病毒基因组RNA可以根据文献记载的方法构建(Yu,D.等,Genes Cells 2:457-466,1997;Hasan,M.K.等,J.Gen.Virol.78:2813-2820,1997)。例如,合成在外源基因的有义链的3’端连接了E-I-S序列的双链DNA。将其插入到编码基因组正链的cDNA的所希望的S序列的紧邻3’侧。例如,在编码正链基因组的cDNA中,首先在所希望的病毒蛋白质基因的编码序列与转录该基因的S序列之间放置限制酶位点(例如NotI位点),利用此限制酶位点,在该位点插入编码外源基因E-I-S序列的DNA。(Tokusumi,T等,(2002)Virus Res 86(1-2),33-8)。
如此制得的编码病毒基因组RNA的DNA在细胞内通过CA启动子在上述病毒蛋白质(L、P及N)存在下转录,可以高效地重建病毒载体。本发明的方法可以应用于各种重组病毒的重建方法(WO97/16539;WO97/16538;WO03/025570;Durbin,A.P.等,1997,Virology 235:32 3-332;Whelan,S.P.等,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8388-8392;Schnell M.J.等,1994,EMBOJ.13:4195-4203;Radecke,F.等,1995,EMBO.J.14:5773-5784;Lawson,N.D.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4477-4481;Garcin,D.等,1995,EMBO J.14:6087-6094;Kato,A.等,1996,Genes Cells 1:569-579;Baron,M.D.和Barrett,T,1997,J.Virol.71:1265-1271;Bridgen,A.和Elliott,R.M.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:15400-15404)。通过将本发明的方法应用于上述的方法,能够从DNA高效地重建包括副流感病毒、水泡性口炎病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、仙台病毒等的负链RNA病毒。编码病毒基因组的DNA缺失F基因、HN基因和/或M基因等包膜构成蛋白基因时,虽然其本身不形成感染性的病毒粒子,但通过另外将这些缺失的基因和/或编码别的病毒的包膜蛋白的基因导入细胞并表达,仍可以形成感染性的病毒粒子(Hirata,T等,2002,J.Virol.Methods.104:125-133;Inoue,M.等,2003,J.Virol.77:6419-6429)。在病毒生产细胞中表达包膜构成蛋白时,这些包膜构成蛋白也优选地通过CA启动子表达。为此,将编码包膜构成蛋白的基因连接到CA启动子的下游。这样,就可以通过CA启动子直接表达包膜构成蛋白。
具体的方法包括,例如,一过性地产生病毒的方法。例如,一种方法是 将在CA启动子控制下转录编码核酶及负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA的载体和在CA启动子控制下表达构成含有负链RNA病毒基因组RNA的RNP的病毒蛋白的载体共同转染哺乳动物细胞。在构成RNP的病毒蛋白的存在下,通过CA启动子转录负链RNA病毒基因组RNA或反基因组RNA而形成功能性的RNP,从而重建病毒。
另外,在其他方法中,将:含有与CA启动子控制下编码噬菌体RNA聚合酶的DNA的载体、含有连接在该RNA聚合酶的识别序列下游的编码负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA的载体、和在CA启动子控制下表达构成含有负链RNA病毒基因组RNA的RNP的病毒蛋白(N、L和P)的载体共同转染哺乳动物细胞。在构成RNP的病毒蛋白的存在下,通过CA启动子表达RNA聚合酶,通过该RNA聚合酶表达负链RNA病毒基因组RNA或其互补链而形成功能性的RNP,从而重建病毒。通过回收在细胞中生产的负链RNA病毒或其扩增产物,可以获得负链RNA病毒载体。
用于转染的载体优选为例如质粒。既可以使各个质粒分别表达一种蛋白质,也可以使一个质粒表达多种蛋白质。为此,可以使一个质粒具有多个启动子,也可以利用IRES通过一个启动子产生多种蛋白质。例如通过IRES等非启动子机制由一个启动子表达2个以上的蛋白质时,若该启动子是CA启动子,则认为这些蛋白质是由CA启动子表达的。但优选地使构成含有负链RNA病毒基因组RNA的RNP的病毒蛋白(N、L和P)至少分别由不同的CA启动子驱动其表达。如上述借助转染的一过性病毒生产具有不使用特殊的细胞也可迅速地制造病毒的优点。
用核酸转染细胞可以使用例如磷酸钙法(Graham,F.L.和Van Der Eb,J.Virology,1973,52:456;Wigler,M和Silverstein S.1977,Cell 11:223)、使用各种转染试剂的方法或电穿孔法等。磷酸钙法可以根据Chen和Okayama(Chen,C和Okayama,H.,1987,Mol.Cell.Biol.7:2745)以2-4%CO2、35℃、15-24小时、沉淀混合液中的DNA浓度20-30μg/ml的条件实施。转染试剂可以使用DEAE-葡聚糖(Sigma#D-9885分子量5×105)、DOTMA(Roche)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)、TransIT-LT1(Mirus,Product No.MIR2300)等。为了防止转染试剂和DNA的复合体在内体中分解,可以加入氯喹(Calos,M.P.1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3015)。另外,电穿孔法由于没有细胞选择性而具有较高的通用性,通过优化脉冲电流持续时间、脉冲形状、电场(电 极的间隙,电压)强度、缓冲液的电导、DNA浓度和细胞密度应用电穿孔法。对于将DNA导入细胞以重建病毒,转染试剂法是适用的,因为其操作简便并可以使用大量的细胞进行多个样品的检测。优选地,可以使用Superfect Transfection Reagent(QIAGEN,Cat No.301305)、DOSPERLiposomal Transfection Reagent(Roche,Cat No.1811169)、或TransIT-LT1(Mirus,Product No.MIR2300)等,但不限于此。
本发明的病毒制造方法的其他实施方式中,由病毒生产细胞的染色体表达病毒生成所必需的蛋白质和/或RNA。这样的方法具体有,例如,使用哺乳动物细胞株的方法,所述哺乳动物细胞在其染色体中整合了由CA启动子转录的负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA,或由CA启动子表达的噬菌体来源的RNA聚合酶的DNA。通过克隆转化细胞并选择高表达量的细胞,可以制备能够生产更高效价的病毒的细胞。因此,该细胞可用于稳定地生产高效价的病毒。在这些细胞株中,还优选地使得通常条件下病毒基因组RNA和RNA聚合酶不被CA启动子所表达,而可随着刺激被诱导表达。可以使用上述loxP和FRT诱导性地由CA启动子表达基因。制备病毒时,通过表达Cre重组酶和FLP重组酶,诱导CA启动子引起的表达。
在上述细胞中,可以通过在构成含有负链RNA病毒基因组RNA的RNP的病毒蛋白(N、L和P)的存在下转录病毒基因组RNA或其互补链来重建负链RNA病毒。RNP构成蛋白可以通过用编码它们的质粒载体进行转染来提供。转染中使用的质粒载体的量如下例示:在用核酶切割出负链RNA病毒基因组的方法(例如HamRbz法)中,可使用NP表达质粒0.1μg到2μg(更优选0.3μg);P表达质粒0.1μg到2μg(更优选0.5μg)、L表达质粒0.5μg到4.5μg(更优选2.0μg)、F表达质粒0.1μg到5μg(更优选0.5μg)、编码病毒基因组RNA(正链或负链)的质粒0.5μg-5μg(更优选5μg)。例如制造SeV时,转染中可以以如下的量使用实施例记载的各种质粒。
pCAGGS-NP 0.1μg-2μg(更优选0.3μg)
pCAGGS-P 0.1μg-2μg(更优选0.5μg)
pCAGGS-L(TDK) 0.5μg-4.5μg(更优选2.0μg)
pCAGGS-F5R 0.1μg-5μg(更优选0.5μg)
pCAGGS-SeV 0.5μg-5μg(更优选5μg)
(pCAGGS-SeV/ΔF-GFP)
在通过噬菌体RNA聚合酶转录负链RNA病毒基因组的方法中,可使用NP表达质粒0.1μg到2μg(更优选0.5μg);P表达质粒0.1μg到2μg(更优选0.5μg)、L表达质粒0.5μg到4.5μg(更优选2.0μg)、F表达质粒0.1μg到5μg(更优选0.5μg)、编码病毒基因组RNA(正链或负链)的质粒0.5μg到5μg(更优选5μg)。例如制造SeV时,转染中可以如下的量使用实施例记载的各种质粒。
pCAGGS-NP 0.1μg-2μg(更优选0.5μg)
pCAGGS-P 0.1μg-2μg(更优选0.5μg)
pCAGGS-L(TDK) 0.5μg-4.5μg(更优选2.0μg)
pCAGGS-F5R 0.1μg-5μg(更优选0.5μg)
转染后经过大约48-72小时的培养,回收细胞,反复冻融约3次破坏细胞,用含有RNP的破碎物再次转染细胞,然后培养。或者,回收培养上清,将其加入细胞培养液使细胞感染,然后培养。可以通过例如与lipofectamine或多聚阳离子脂质体等形成复合物并导入细胞来进行转染。具体地,可以使用各种转染试剂,例如DOTMA(Roche)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Roche#1811169)、TransIT-LT1(Mirus,Product No.MIR2300)等。为了防止转染试剂和DNA的复合体在内体中被分解,可以加入氯喹(Calos,M.P.1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3015)。在RNP转导的细胞中,随着RNP的病毒基因表达和RNP复制,病毒被扩增。通过将所得的病毒溶液(培养上清)适当地稀释并重复进行扩增,可以除去可能混入的污染物。但是,本发明由于不使用表达T7RNA聚合酶的痘苗病毒,故而具有不需要通过重复扩增除去痘病毒白的优点。所得的载体可以在-80℃保存。为重建缺失了包膜构成蛋白编码基因的非传播型病毒,可以使用表达包膜构成蛋白的细胞(辅助细胞)进行转染,或者与表达包膜构成蛋白的载体共转染。另外,还可以在转染细胞上用表达包膜构成蛋白的细胞进行叠层培养来扩增包膜构成蛋白基因缺陷型病毒(参考国际公开号WO00/70055和WO00/70070)。
用于构建包膜构成蛋白基因缺失了的负链RNA病毒载体的辅助细胞可以通过例如用编码所缺失的包膜构成蛋白或其它的包膜蛋白(例如VSV-G和兼嗜性env等)的基因转染来制备(参照WO00/70055和WO00/70070;Hasan M.K.等,1997,J.General Virology 78:2813-2820)。为了实现诱导表达,可以将包膜蛋白基因搭载于具有重组酶目标序列的载体中,例如Cre/loxP可诱导型表达质粒pCALNdlw(Arai,T.等,J.Virology 72,1998,p1115-1121)。细胞可以使用例如常用于SeV扩增的猴肾来源的细胞株LLC-MK2细胞(ATCC CCL-7)。LLC-MK2细胞用添加了10%热处理灭活的胎牛血清(FBS)、青霉素G钠50单位/ml及链霉素50μg/ml的MEM在37℃、5%CO2下培养。由于SeV-F基因产物有细胞毒性,按照公知的规范操作用磷酸钙法(mammalian transfection kit(Stratagene))将上述pCALNdLw/F导入LLC-MK2细胞,其中该pCALNdLw/F被设计为使得包膜蛋白基因产物被Cre DNA重组酶诱导表达。通过有限稀释克隆细胞后,将细胞扩大培养,选择高表达导入的基因的细胞株。为此,可以例如根据齐藤等的方法(Saito等,Nucl.Acids Res.23:3816-3821(1995);Arai,T.等,J.Virol 72,1115-1121(1998)),用例如MOI=3-5感染,基于Western印迹或病毒生产来选择细胞。
刺突蛋白F或HN的基因的缺失可有效地使SeV载体变成非传播性,而包膜基质蛋白M基因的缺失可有效地使感染细胞不能形成病毒粒子。另外,缺失F、HN和M中至少2个基因的任意组合的载体更能保障其安全性。例如M和F基因双缺失的SeV(SeV/ΔMΔF)成为非传播性且粒子形成缺陷的载体。SeV/ΔMΔF在体外和体内保持高水平的感染性和基因表达能力,该水平与野生型SeV载体类似。SeV/ΔMΔF的这些特征被认为有助于提高SeV的安全性。
回收的病毒的效价可以通过例如CIU(Cell Infecting Unit,细胞感染单位)测定或红细胞凝集活性(HA)测定来确定(WO00/70070;Kato,A.等,1996,Genes Cells 1:569-579;Yonemitsu,Y.和Kaneda Y.,Hemaggulutinating virus ofJapan-liposome-dediated gene delivery to vascular cells.Baker AH编.Molecular Biology of Vascular Diseases.Method in Molecular Medicine:Humana Press:pp.295-306,1999)。或者,对于携带GFP(绿色荧光蛋白)等标记基因的载体,可以利用标记为指示物直接对感染细胞计数从而定量效价(例如作为GFP-CIU)。这样测定的效价可以与CIU同等对待(WO00/70070)。
只要病毒能够重建,对重建所用的宿主细胞没有特别限制。例如仙台病毒载体等的重建可以使用猴肾来源的LLC-MK2细胞和CV-1细胞(例如ATCC CCL-70)和仓鼠肾来源的BHK细胞(例如ATCC CCL-10)等培养细胞及人来源的细胞等。另外,为了大量地获得仙台病毒载体,可以用从上述宿主获得的病毒载体感染发育中的鸡卵来扩增载体。已经开发了使用鸡卵的病毒载体的制备方法(中西等编,1993《神経科学研究的尖端技術的实验方法III,分子神経细胞生理学》厚生社,大阪,pp.153-172)。具体地,例如,将受精卵放入孵化器37-38℃培养9-12天,使胚生长。将病毒载体接种到尿囊腔,将卵培养数天(例如3天)使病毒载体扩增。培养时间等条件可由所使用的重组仙台病毒不同而变化。然后,回收含有病毒的绒膜尿囊液。可以按照常规方法从该绒膜尿囊液分离和纯化仙台病毒(田代眞人,病毒実験方法,永井、石浜主编,Medical View社,pp.68-73,(1995))。
按照本发明所述的病毒制备方法,本发明的病毒载体可以以例如1×105 CIU或以上,优选1×106CIU或以上、更优选5×106CIU或以上、更优选1×107 CIU或以上、更优选5×107CIU或以上、更优选1×108CIU或以上、更优选5×108CIU或以上的效价从病毒产生细胞释放到细胞外液中。病毒的效价可以用本说明书或他处记载的方法测定(Kiyotani,K.等,Virology 177(1),65-74(1990);WO00/70070)。
回收的病毒载体可以纯化到基本纯。纯化方法可以是过滤、离心分离、吸附和柱纯化等公知的纯化/分离方法或者其任意组合。“基本纯”是指在含有病毒载体的溶液中该病毒组分占主要的比例。例如病毒载体组合物可以根据其溶液中所含总蛋白质(但作为载体(carrier)和稳定剂加入的蛋白质除外)中包含的作为病毒组分的蛋白质所占的比例为10%(重量/重量)或以上,优选20%或以上,更优选50%或以上,更优选70%或以上,更优选80%或以上,进一步优选90%或以上而确认为基本纯。例如对于副粘病毒载体,具体的纯化方法有,例如,使用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(特公昭62-30752号公报、特公昭62-33879号公报及特公昭62-30753号公报),和吸附到含有硫酸海藻糖的多糖和/或其分解物的方法(WO97/32010),但并不限于上述方法。
在含有本发明的病毒载体的组合物的制备中,所述载体根据需要可以和药学上可接受的承运体(担体)或介质组合。“药学上可接受的承运体(担体)或介质”是指可以与载体共同施用,而不显著地妨碍载体所介导的基 因导入的材料。这样的承运体(担体)或介质包括例如灭菌水、氯化钠溶液、葡萄糖溶液、含乳酸的Ringer’s溶液、培养基、血清、磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)等。可以考虑将这些与所述载体合适地组合配成制剂。另外,本发明的组合物还可以含有脂质体膜稳定剂(例如胆固醇等固醇类)。还可以含抗氧化剂(例如生育酚或维生素E等)。进一步地,还可以含有植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、杀生物剂等。另外还可以添加防腐剂或其他添加剂。本发明的组合物可以是水溶液、胶囊、悬浮液、糖浆等形态。另外本发明的组合物还可以是溶液、冻干物或气溶胶的形态。当其是冻干物时,可以含有作为稳定剂的山梨醇、蔗糖、氨基酸和各种蛋白质等。
利用负链RNA病毒载体来诱导免疫时,为了提高免疫原性,可以添加细胞因子、霍乱毒素和沙门氏菌毒素等免疫促进剂。另外,这样的疫苗组合物还可以与明矾、弗氏不完全佐剂、MF59(油乳剂)、MTP-PE(分枝杆菌细胞壁来源的胞壁酰三肽)、及QS-21(来源于皂树Quillaja saponaria)等佐剂组合。另外,施用所述组合物或细胞时,与提高佐剂效果的细胞因子类组合也是有效的。这样的基因包括,例如,(i)单链IL-12(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(15):8591-8596,1999)、(ii)干扰素-γ(美国专利第5,798,100号)、(iii)粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、(iv)GM-CSF和IL-4的组合(J.Neurosurgery 90(6),1115-1124(1999))等。
负链RNA病毒载体的体内给药量随疾患、患者的体重、年龄、性别、症状、给药的组合物的形态、给药方法、导入基因的不同而不同,但本领域的技术人员可以合适地决定。所给药的载体优选地以约105-约1011 CIU/ml,更优选约107-约109CIU/ml,最优选约1×108-约5×108CIU/ml的量在药学上可接受的载体(担体)中被给药。对人类单次给药的剂量优选为2×105CIU-2×1011CIU,给药的次数可以是1次或者多次,只要副作用在临床上可接受的范围内;每天的给药次数也是如此。对于人类以外的动物,可以用上述给药量按照例如目标动物与人的体重比或给药目标部位的体积比(例如平均值)换算后来施用。另外,传播性的负链RNA病毒载体给药于个体或者细胞后,在治疗完毕等需要抑制病毒载体增殖的情况下,可以通过给药RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂,特异性地仅抑制病毒载体的增殖而不危害宿主。体外给药时,在体外(例如试管或培养皿中)使载体与目的细胞接触。优选以MOI为1-500,更优选2-300,更优选3-200, 更优选5-100,更优选7-70的施用。作为本发明的负链RNA病毒载体的给药对象的生物没有特别限制,包括所希望的哺乳动物,所希望的哺乳动物包括人和非人哺乳动物;具体地有人、小鼠、大鼠、犬、猪、猫、牛、兔、绵羊、山羊、猴等。
实施例
下面通过实施例来详细说明本发明,但本发明不应被实施例所限制。另外,本说明书中引用的文献全部作为本说明书的一部分并入本发明。
实施例1:质粒的构建(图1)
pCAGGS(B型)的构建
用XhoI消化pCALNdLw(Arai,T.等,J.Virology 72,1998,p1115-1121),用Qiaquick PCR Purification试剂盒纯化后进行连接。选择XhoI片段被除去的质粒,所得质粒称为pCAGGS(B型)。将pCAGGS(B型)用SalI消化后,用Pfu DNA聚合酶平末端化,Qiaquick PCR Purification试剂盒纯化后进行连接,选择SalI位点被破坏的质粒,命名为pCAGGS(BSX)。
pCAGGS-NP的构建(图2)
用SpeI和EcoT22I消化pCALNdLw,用琼脂糖凝胶电泳分离。切割出2651bp和3674bp的片段,用Qiaquick PCR Purification试剂盒纯化。用XhoI进一步消化2651bp的片段,用琼脂糖凝胶电泳分离后,纯化1761bp的条带。用pcDNA3.1Zeo(+)作模板,使用下面的引物:
5’-TCTCGAGTCGCTCGGTACGATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCAC-3’(序列号:22)和引物
5’-AATGCATGATCAGTAAATTACAATGAACATCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3’(序列号:23)PCR扩增出zeocin抗性基因,然后用XhoI和EcoT22I消化,再用琼脂糖凝胶电泳分离,切割出438bp的条带,用Qiaquick Gel Extraction试剂盒纯化。将3种片段,即这个含有zeocin抗性基因的条带和上述的3674bp及1761bp的片段,进行连接得到pCALNdLw-zeo。用SwaI消化该pCALNdLw-Zeo,并插入EcoRI接头(STRATAGENE),从而得到pCALNdLWE-Zeo。将导入了多克隆位点的仙台病毒cDNA(特开2002-272465)(以下称为pSeV(TDK))用Not I和Xho I消化,用琼脂糖凝 胶电泳分离,切割出1669bp的片段,用Qiaquick Gel Extraction试剂盒纯化。将这个含有NP基因的片段插入到用Not I和Xho I消化的pGEM11Zf(+)(Promega)中,得到pGEM-NP(Z)PCR14-3。将它作为模板,使用引物5’-CCGGAATTCAACAAATGGCCGGGTTGTTGAGCACCTTCGA-3’(序列号:24)和5’-CCGGAATTCCTAGATTCCTCCTATCCCAGCTACTGCTGCTCG-3’(序列号:25)进行PCR扩增,然后用EcoRI消化,导入到pCALNdLWE-Zeo的EcoRI位点,得到pCALNdLWE-Zeo-NP(Z)。然后用Xho I消化pCALNdLWE-Zeo-NP(Z),进行连接,构建除去了Xho I片段的质粒,命名为pCAGGS-NP。
pCAGGS-P4C(-)的构建(图3)
用Xho I消化pCALNdLw-HygroM(Inoue,M.等.J.Virology 77,2003,p6419-6429),用琼脂糖凝胶电泳分离后,切割出含有潮霉素抗性基因的1679bp的条带,用Qiaquick Gel Extraction试剂盒纯化。用Xho I消化pCALNdLw,琼脂糖凝胶电泳后切割出4864bp的条带,用Qiaquick Gel Extraction试剂盒纯化。连接上述两个片段构建pCALNdLw-Hygro。用SwaI消化该pCALNdLw-Hygro,并插入Nhe I接头(STRATAGENE)而得到pCALNdLWN-Hygro。用4C(-)SeV cDNA(Kurotani,Kato,Nagai,等.Genes toCells 3,1998,p111-124)作模板,5’-CTAGCTAGCCCACCATGGATCAAGATGCCTTCATTCTAAAAGAAGATTCT-3’(序列号:26)和5’-CTAGCTAGCCTAGTTGGTCAGTGACTCTATGTCCTCTTCTACGAGTTCCA-3’(序列号:27)作引物,使用KOD-PLUS DNA聚合酶(TOYOBO)进行PCR。用Gene Clean试剂盒纯化PCR产物,用Nhe I消化,再用Gene Clean试剂盒纯化。将其导入上述pCALNdLWN-hygro的Nhe I位点,得到pCALNdLWN-hygro-P(Z)k4C(-)。用Xho I将其消化,用Qiaquick GelExtraction试剂盒纯化后进行连接,选择除去了Xho I片段(潮霉素抗性基因区域)的质粒,得到pCAGGS-P4C(-)。
pCAGGS-L(TDK)的构建(图4)
用Fse I和Sac II消化pSeV(TDK),用Qiaquick Gel Extraction试剂盒纯化后,切割出6732bp的条带,用Qiaquick Gel Extraction试剂盒纯化。使用Pfu DNA聚合酶和dNTP,72℃反应10分钟将其平末端化。用Qiaquick Gel Extraction试剂盒纯化后,导入pCAGGS(BSX)的Swa I位点而得到pCAGGS-L(TDK)。
pCAGGS-F和pCAGGS-F5R的构建(图5~7)
用Xho I消化pCALNdLw/F(Li,H.-O.等.J.Virology 74,2000,p6564-6569),纯化后进行连接,选择Xho I片段(新霉素抗性基因区域)被除去的质粒,得到pCAGGS-F。用pCALNdLw-ZeoF(特愿2001-283451)作模板,使用条件(I)的引物组合:5’-CATTTTGGCAAAGAATTGATTAATTCGAG-3’(序列号:28)和5’-TCACAGCACCCAAGAATCTCTTCTGGCGAGCACCGGCATTTTGTGTC-3’(序列号:29),及条件(II)的引物组合:5’-GACACAAAATGCCGGTGCTCGCCAGAAGAGATTCTTGGGTGCTGTGA-3’(序列号:30)和5’-GATCGTAATCACAGTCTCTCGAGAGTTGTACCATCTACCTAC-3’(序列号:31),用Pfu Turbo(STRATAGENE)进行PCR。PCR用琼脂糖凝胶电泳分离后,分别切割出条件(I)的1470bp的条带和条件(II)的1190bp的条带,用Gene Clean试剂盒回收(分别称为PCR产物(I)和PCR产物(II))。将纯化的PCR产物(I)与PCR产物(II)分别稀释10倍后各取1μl混合,再用:5’-CATTTTGGCAAAGAATTGATTAATTCGAG-3’(序列号:28)和5’-GATCGTAATCACAGTCTCTCGAGAGTTGTACCATCTACCTAC-3’(序列号:31)的引物组合用Pfu Turbo进行PCR。用5μl PCR产物进行电泳,溴化乙锭染色后,检测到预想的2.6kb的条带。然后,将剩下的PCR产物用Qiaquick Gel Extraction试剂盒纯化。然后先后用Dra III和Mfe I限制酶处理。用琼脂糖凝胶电泳分离后从凝胶中切割出大约2.0kb的条带。然后用Dra III和Mfe I先后消化pCALNdLw-Zeo-F,再用琼脂糖凝胶电泳进行分离。切割出大约6bp的条带,用GENECLEAN II试剂盒(BIO)纯化。pCALNdLw-Zeo-F的DraIII-MfeI片段和上述PCR DraIII-MfeI片段连接得到pCALNdLw-Zeo-F furin。然后用pCALNdLw-Zeo-F furin作为模板,使用条件(I):5’-CATTTTGGCAAAGAATTGATTAATTCGAG-3’(序列号:28)和5’-TCACAGCACCGAAGAATCTCCTCCGGCGACGACCGGCATTITGTGTCGTATC-3’(序列号:32)的引物组合,和条件(II) :5’-GATACGACACAAAATGCCGGTCGTCGCCGGAGGAGATTCTTCGGTGCTGTGA-3’(序列号:33)和5’-AAATCCTGGAGTGTCTTTAGAGC-3’(序列 号:34)的序列组合进行PCR。电泳分离后,切割出条件(I)的约1.4kbp的条带及条件(II)的约200bp的条带,分别用Qiaquick gel Extraction试剂盒纯化。PCR产物50倍稀释后分别取1μl混合,再使用5’-CATTTTGGCAAAGAATTGATTAATTCGAG-3’(序列号:28)和5’-AAATCCTGGAGTGTCTTTAGAGC-3’(序列号:34)的引物组合和PfuTurbo进一步进行PCR。用琼脂糖凝胶电泳分离5μl的PCR产物,染色后,确证了~1.6kbp的条带。剩下的PCR产物用Qiaquick PCR Purification试剂盒纯化,然后用ClaI和FseI消化,琼脂糖凝胶电泳分离后,切割出约1kb的条带,用Qiaquick PCR Purification试剂盒纯化。用ClaI和FseI消化pCALNdLw-Zeo-F furin,琼脂糖凝胶电泳分离后,切割出约8kbp的条带,用Qiaquick PCR Purification试剂盒纯化。将该DNA与上面的PCR产物经过ClaI-FseI消化并纯化的片段连接得到pCALNdLw-Zeo F5R。将pCALNdLw-Zeo F5R用Xho I消化、纯化后进行连接,选择不含Xho I片段(含有Zeocin抗性基因)的质粒,而得到pCAGGS-F5R。
pCAGGS-T7的构建(图8)
用BamHI消化pTF7-3(ATCC No.67202)。琼脂糖凝胶电泳分离后,回收含有T7 RNA聚合酶基因的2.65kbp的片段,将其插入pMW219(NipponGene Co.Ltd)的BamHI位点得到pMW219-T7。将pMW219-T7用SalI消化后,用DNA Blunting试剂盒(Takara)平末端化,导入DNA接头(Stratagene#901026)得到pMW219-T7-EcoRI。用EcoRI消化pMW219-T7-EcoRI,纯化出含有T7 RNA聚合酶基因的片段,将其导入上述pCALNdLWE的EcoRI位点而得到pCALNdLWE-T7。
pCAGGS-SeV和pCAGGS-SeV/ΔF-GFP的构建(图9到11)
用NotI和KpnI消化pSeV(TDK),琼脂糖凝胶电泳分离后,切割出2995bp的条带,用Qiaquick PCR Purification试剂盒纯化。将MlinkerF:5’-GGCCGCGTCGACATCGATGCTAGCCTCGAGCCGCGGTAC-3’(SEQ IDNO:35)和MlinkerR:5’-CGCGGCTCGAGGCTAGCATCGATGTCGACGC-3’(SEQ ID NO:36)各2μg(2μl)与21μl H2O混合,然后进行95℃ 5分钟、85℃ 15分钟、65℃ 15分钟、37℃ 15分钟、25℃ 15分钟,然后4℃的退火过程。将该混合液与纯化的pSeV(TDK)NotI-Kpn I溶液连接,得到pSeV/Linker。用该pSeV/Linker作模板,使用pGEM-F5:5’-CTTAACTATGCGGCATCAGAGC-3’(SEQ ID NO:37)和pGEM-R1:5’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(SEQ ID NO:38)及KOD-Plus(TOYOBO)进行PCR反应,产物用Qiaquick PCR Purification试剂盒纯化。用所得纯化的PCR产物的溶液作模板,使用RibLF1:5’-CTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACCAAACAAGAG-3’(SEQ ID NO:39)和pGEM-R1:5’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(SEQID NO:38)和KOD-PLUS(TOYOBO)进行PCR反应,产物用Qiaquick PCRPurification试剂盒纯化。用所得纯化的PCR产物的溶液作模板,使用RibLF2:5’-GATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTC-3’(SEQ IDNO:40)和pGEM-R1:5’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(SEQ ID NO:38)和KOD-PLUS(TOYOBO)进行PCR反应,产物用Qiaquick PCRPurification试剂盒纯化。进一步,用该纯化液作模板,使用RibLF3:5’-GCGGGCCCTCTCTTGTTTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGAC-3’(SEQID NO:41)和pGEM-R1:5’-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3’(SEQ IDNO:38)和KOD-PLUS(TOYOBO)进行PCR反应,产物用Qiaquick PCRPurification试剂盒纯化。将该纯化的PCR产物导入pCAGGS(BSX)的SwaI位点得到pCAGGS-SeV(m)。然后,用NotI和SalI消化pSeV18+b(+)/ΔF-EGFP(Li,H.-O.等J.Virology 74,2000,p6564-6569),琼脂糖凝胶电泳分离后,切割出1972bp的条带,用Qiaquick PCR Purification试剂盒纯化,Not I和SalI消化后,所得片段与纯化的pCAGGS-SeV(m)连接,得到pCAGGS-SeV(m)A。用NheI和KpnI消化pSeV(+)18/ΔF,用琼脂糖凝胶电泳分离后,切割出3325bp片段,用Qiaquick PCR Purification试剂盒纯化,用NotI和SalI消化,所得片段与纯化的pCAGGS-SeV(m)连接而得到pCAGGS-SeV(m)AC。
用SalI和NheI消化pSeV18+b(+)(Li,H.-O.等J.Virology 74,2000,p6564-6569)并用Qiaquick PCR Purification试剂盒纯化。然后,将所得片段导入LITMUS38(NEW ENGLAND BioLabs)的SalI-NheI位点得到Litmus38/SeV Sal I-Nhe I。用SalI和NheI消化该Litmus38/SeV Sal I-Nhe I并用琼脂糖凝胶电泳分离后,切割出9886bp的条带,用Qiaquick GelExtraction试剂盒纯化,再导入pCAGGS-SeV(m)AC的SalI-NheI位点得到pCAGGS-SeV。
用SalI和NheI消化pSeV/ΔF-EGFP(Li,H.-O.等J.Virology 74,2000,p6564-6569),用Qiaquick PCR purification试剂盒纯化。然后将所得片段插 入LITMUS38(NEW ENGLAND BioLabs)的SalI-NheI位点,得到Litmus38/Sal I-Nhe IΔF-GFP。用SalI和NheI消化该Litmus38/Sal I-NheIΔF-GFP,用琼脂糖凝胶电泳分离后,切割出8392bp的条带,用Qiaquick GelExtraction试剂盒纯化,导入pCAGGS-SeV(m)AC的SalI-NheI位点而得到pCAGGS-SeV/ΔF-GFP。
pGEM-IRES-Luci的构建
将用BamHI消化pMAMneo-Luci(Clontech)而得到的荧光素酶片段导入pTM1(Nature,348,1,November,1990,91-92)的BamHI位点而构建pGEM-IRES-Luci。
实施例2:表达T7 RNA聚合酶的BHK-21(以下作BHK/T7)的建立
使用哺乳动物转染试剂盒(mammalian transfection kit)(Stratagene)或Superfect(Qiagen)将如上构建的pCALNdLWE-T7转染到BHK-21细胞(ATCC CCL-10)。在含有400μg/ml的G418的D-MEM中37℃、5%CO2 下培养2周,得到由单一细胞扩增而来的抗药性克隆。所得的抗药性克隆用表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒以MOI=4感染,24小时后,用PBS洗净并回收细胞,用抗-T7 RNA聚合酶兔多克隆抗体进行Western印迹分析,确认了T7 RNA聚合酶的表达。
确认表达T7 RNA聚合酶的克隆用pGEM-IRES-Luci使用SuperFect转染。24小时后回收细胞,用Dual Luciferase Reporter System(Promega)试剂盒及MiniLumat LB9506(EG&G BERTHOLD)测定荧光素酶活性,确认T7RNA聚合酶活性。
实施例3:常规方法制备重组仙台病毒
将LLC-MK2细胞以5×106细胞/皿铺到100mm培养皿中,培养24小时后,用不含血清的MEM洗涤一次后,用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒在室温感染1小时(感染复数=2),所述重组痘苗病毒已先用3μg/ml补骨脂素和长波长紫外线(365nm)处理5分钟。用不含血清的MEM将细胞洗涤两次后,加入携带LaZ(pSeV(+18:LacZ)ΔF)的F缺陷型仙台病毒载体的cDNA、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L(Kato,A.等,Genes Cells 1,569-579(1996)),加入量分别为每皿12μg、4μg、2μg和4μg,并加入4μg/皿的包膜载体pGEM/FHN,悬浮在Opti-MEM(GIBCO)中,加入SuperFect 转染试剂(1g DNA/5μl SuperFect;QIAGEN),室温静置15分钟。将加在3ml MEM中的DNA-SuperFect混合物加到细胞中培养,所述MEM中含终浓度为3%的FBS。细胞培养3小时后,将细胞用不含血清的MEM洗涤两次,然后用含有40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC,Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM中培养24小时。除去培养上清,取单个100mm培养皿的F表达的LLC-MK2/F7细胞(F表达被诱导的细胞被称为“LLC-MK2/F7/A”;Li,H.-O.等,J.Virology 74.6564-6569(2000);WO 00/70070)用不含血清的MEM(含40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)重悬,取5ml悬液叠层。培养48小时后,收集细胞和上清分别用作P0-d3样品。将P0-d3的沉淀重悬于Opti-MEM(2×107个细胞/ml),反复冻融三次,与脂质转染试剂DOSPER(Boehringer Mannheim)(106个细胞/25μlDOSPER)混合,室温放置15分钟后,转染到F表达LLC-MK2/F7细胞系(LLC-MK2/F7/A)(106个细胞/孔,24孔板),用不含血清的MEM(含有40μg/ml AraC,7.5μg/ml胰蛋白酶)培养。培养7天后回收上清作为P1-d7样品。然后用全部上清在37℃感染铺在12孔培养板上的F表达LLC-MK2/F7细胞株(LLC-MK2/F7/A)1小时,用MEM培养基洗涤一次后,用不含血清的MEM(含有40μg/ml AraC,7.5μg/ml胰蛋白酶)培养。培养7天后,收集上清作为P2-d7样品。然后用全部上清在37℃感染铺在6孔培养板上的F表达LLC-MK2/F7细胞株(LLC-MK2/F7/A)1小时,用MEM培养基洗涤一次后,用不含血清的MEM(含有7.5μg/ml胰蛋白酶)培养。培养7天后,收集上清作为P3-d7样品。然后用全部上清在37℃感染铺在10cm培养皿上的F表达LLC-MK2/F7细胞株(LLC-MK2/F7/A)1小时,用MEM培养基洗涤一次后,用不含血清的MEM(40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培养。培养7天后,收集上清作为P4-d7样品。
实施例4:使用CA启动子的仙台病毒载体的回收方法1
使用pCAGGS上附加了锤头核酶的仙台病毒基因组的仙台病毒载体回收方法(以下称HamRbz方法)
4-1[传播型SeV载体的回收]
转染前一天将293T细胞以1×106个细胞/孔、以含10%FBS的2mlD-MEM接种到6孔培养板上。转染如下进行。将30μl Opti-MEM与15μlTransIT-LT1(Mirus)混合,室温温育10-15分钟。此过程中制备DNA溶 液。在20μl Opti-MEM中分别溶解pCAGGS-NP 0.5μg、pCAGGS-P4C(-)0.5μg、pCAGGS-L(TDK)2μg和pCAGGS-SeV2μg。10-15分钟后,将TransIT-LT1溶液与DNA溶液混合并在室温静置15分钟。在此过程中去除细胞的培养基,轻柔地以1ml/孔加入新鲜的含10%FBS的D-MEM。15分钟过后,向DNA-TransIT-LT1混合物加入500μl Opti-MEM(GIBCO),然后将混合物全部加到细胞中培养。37℃,5%CO2下培养4天后,去掉培养液,将LLC-MK2/F7/A细胞以1×106/ml重悬于含7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下称Try-MEM)中。该悬浮液以1ml/孔叠层,在37℃,5%CO2下培养4天。LLC-MK2/F7/A细胞叠层4天后,收集上清进行HA测定。由于发现上清为HA阴性,3个孵化了10天的鸡卵中每一个接种100μl所收集的上清,用孵化器35℃培养3天。然后,回收绒膜尿囊液进行HA测定。结果发现,从3个鸡卵中的两个回收的绒膜尿囊液中确认了HA活性。由此显示,可以通过本方法回收野生型的仙台病毒载体(图12)。
4-2[F缺陷型SeV载体的回收]
转染前一天,将293T细胞以1×106个细胞/孔、以含10%FBS的2mlD-MEM接种到6孔培养板上。转染如下进行。将30μl Opti-MEM与15μlTransIT-LT1(Mirus)混合,室温温育10-15分钟。此过程中制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解pCAGGS-NP 0.3μg、pCAGGS-P4C(-)0.5μg、pCAGGS-L(TDK)2μg、pCAGGS-F5R 0.5μg,和pCAGGS-SeV/ΔF-GFP0.5-5μg。10-15分钟后,将TransIT-LT1溶液与DNA溶液混合并在室温静置15分钟。在此过程中去除细胞培养基,轻柔地以1ml/孔加入新鲜的含10%FBS的D-MEM。15分钟过后,向DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μl Opti-MEM(GIBCO),然后将混合物全部加到细胞中培养。37℃,5%CO2 下培养72小时后,去掉培养液,将LLC-MK2/F7/A细胞以1×106/ml重悬于含7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下称Try-MEM)中。用该悬浮液以1ml/孔叠层,在37℃,5%CO2下培养。24小时后,回收1ml培养液,加入1ml新鲜Try-MEM,在37℃,5%CO2下培养。48小时后,回收1ml培养液,加入1ml新鲜Try-MEM,在37℃,5%CO2下培养。72小时后,回收1ml培养液。回收的培养液中加入133μl 7.5%BSA(最终浓度1%BSA),保存在-80℃直到CIU测定。
4-3[通过GFP表达细胞计数的CIU测定(GFP-CIU)]
CIU测定2到3天前,将LLC-MK2细胞铺到12孔板中。在测定前2 天铺板时,以1.5×105个细胞/孔的比例加入,细胞在1ml/孔的含10%FBS的MEM中;在测定前3天铺板时,以8.0×104个细胞/孔的比例加入,细胞在1ml/孔的含10%FBS的MEM中。CIU测定的当天用不含血清的MEM洗涤细胞一次,用MEM对用所述细胞叠层后24、48、72小时回收的培养液作1/10系列稀释;37℃感染1小时后,用MEM培养基洗涤一次,加入1ml的MEM培养基。37℃培养2天后,用荧光显微镜观察细胞,对在适度稀释的孔中的GFP阳性细胞进行计数。结果发现,在用所述细胞叠层后72小时后,有1×105-1×107GFP-CIU/ml的病毒载体被回收(图13)。
4-4[提供引入了弗林蛋白酶识别序列I的F基因(下面称为“F5R”)相对野生型F基因(下面称为“F”)对生产性能的改善]
对通过pCAGGS提供蛋白质时,使用野生型F基因和使用导入了弗林蛋白酶(furin)识别序列的F基因的重建效率进行了比较。在转染前一天,将293T细胞以1×106个细胞/孔、以2ml含10%FBS的D-MEM铺到6孔培养板中。转染按下述进行。将30μl Opti-MEM与15μl TransIT-LT1(Mirus)混合,室温温育10-15分钟。此过程中制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解固定量的pCAGGS-NP 0.3μg、pCAGGS-P4C(-)0.5μg、pCAGGS-L 2μg、和pCAGGS-SeV/ΔF-GFP 2μg;以及量在0.1μg、0.3μg、0.5μg、0.7μg和0.9μg间变化的pCAGGS-F或pCAGGS-F5R,10-15分钟后,将TransIT-LT1溶液与DNA溶液混合并在室温静置15分钟。在此过程中去除细胞培养基,轻柔地以1ml/孔加入新鲜的含10%FBS的D-MEM。15分钟过后,向DNA-TransIT-LT1混合物加入500μl Opti-MEM(GIBCO),然后将混合物全部加到细胞中培养。37℃,5%CO2下培养72小时后,去掉培养液,将LLC-MK2/F7/A细胞以1×106/ml重悬于含7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下称Try-MEM)中。用该悬浮液以1ml/孔叠层,在37℃,5%CO2下培养。24小时后回收1ml培养液,加入1ml新鲜Try-MEM,37℃,5%CO2下培养。48小时后回收1ml培养液,加入1ml新鲜Try-MEM,37℃,5%CO2下培养。72小时后回收1ml培养液。向回收的培养液中加入133μl 7.5%的BSA(终浓度1%BSA),在-80℃保存到CIU测定为止。回收所有样品后进行CIU测定。结果发现,当使用pAGGS-F时,重建效率最佳当使用为0.7μg,细胞叠层后第24小时、48小时、72小时分别含有0CIU/ml,7.9×102CIU/ml和3.3×104CIU/ml的病毒载体。另外,使用pAGGS-F5R时,重建效率最佳为0.5μg,细胞叠层后第24小时、 48小时、72小时分别含有3.2×104CIU/ml,5.7×105CIU/ml和1.2×107 CIU/ml的病毒载体。若在重建效率最佳的条件下比较两者,则使用pAGGS-F5R时的重建效率远比使用pAGGS-F的重建效率好,在细胞叠层后72小时可得到高出373倍的病毒载体(图14)。
实施例5:用CA启动子回收仙台病毒载体的方法(2)
利用pCAGGS-T7回收仙台病毒的方法(以下称pCAGGS-T7方法)
5-1[传播型仙台病毒载体的回收]
转染前一天将各种细胞铺到6孔板上(293T细胞:1×106个细胞/孔/2ml含10%FBS的D-MEM;LLC-MK2细胞:5.5×105个细胞/孔/2ml含10%FBS的D-MEM;BHK-21细胞:2.5×105个细胞/孔/2ml含10%FBS的D-MEM;BHK/T7细胞:2.5×105个细胞/孔/2ml含10%FBS的D-MEM)。转染如下述进行。将30μl Opti-MEM与15μl TransIT-LT1(Mirus)混合,室温温育10-15分钟。此过程中制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解pCAGGS-T7 0.5μg、pCAGGS-NP 0.5μg、pCAGGS-P4C(-)0.5μg、pCAGGS-L(TDK)2μg和pSeV(TDK)18+GFP 5μg。10-15分钟后,将TransIT-LT1溶液与DNA溶液混合并在室温静置15分钟。在此过程中去除细胞培养基,轻柔地以1ml/孔加入新鲜的含10%FBS的D-MEM。15分钟过后,向DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μl Opti-MEM(GIBCO),然后将混合物全部加到细胞中培养。37℃,5%CO2下培养3天。此时,对GFP阳性细胞的计数为:293T细胞246个、LLC-MK2细胞16个、BHK-21细胞288个,BHK/T7细胞405个。然后,去掉培养液,向细胞中加入1mlPBS(-),用细胞刮子将细胞刮下,回收到Eppendorf管中。进行一次冻融后,将未稀释的细胞悬液和用PBS(-)稀释了10倍、100倍、1000倍的细胞悬液100μl分别接种到10日鸡卵中。用孵化器在37℃孵育3天。然后,回收绒膜尿囊液进行HA测试。结果,确认在接种了未稀释的293T细胞、BHK-21细胞及BHK/T7细胞悬液的鸡卵中发生了病毒的扩增(图15)。
5-2[F缺陷型SeV载体的回收]
转染前一天将293T细胞以1×106个细胞/孔/2ml含10%FBS的D-MEM铺到6孔板上。转染如下进行。将30μl Opti-MEM与15μlTransIT-LT1(Mirus)混合,室温温育10~15分钟。此过程中制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解pCAGGS-T7 0.5μg、pCAGGS-NP 0.5μg、 pCAGGS-P4C(-)0.5μg、pCAGGS-L(TDK)2μg、pCAGGS-F5R 0.5μg及pSeV/ΔF-GFP(WO00/70070)0.5-5μg。10-15分钟后,将TransIT-LT1溶液与DNA溶液混合并在室温静置15分钟。在此过程中去除细胞培养基,轻柔地以1ml/孔加入新鲜的含10%FBS的D-MEM。15分钟过后,向DNA-TransIT-LT1混合物加入500μl Opti-MEM(GIBCO),然后将混合物全部加到细胞中培养。37℃,5%CO2下培养72小时后,去掉培养液,将LLC-MK2/F7/A细胞以1×106/ml重悬于含7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下称Try-MEM)中。用该悬浮液以1ml/孔叠层,在37℃,5%CO2下培养所述细胞。24小时后回收1ml培养液,加入1ml新鲜Try-MEM,37℃,5%CO2下培养。48小时后回收1ml培养液,加入1ml新鲜Try-MEM,37℃,5%CO2下培养。72小时后回收1ml培养液。回收的培养液加入133μl 7.5%的BSA(终浓度1%BSA),在-80℃保存到CIU测定为止。
5-3[通过GFP表达细胞计数的CIU测定(GFP-CIU)]
CIU测定2到3天前,将LLC-MK2细胞铺到12孔板中。在测定前2天铺板时,以1.5×105个细胞/孔的比例加入细胞,所述细胞处在1ml/孔的含10%FBS的MEM中;在测定前3天铺板时,以8.0×104个细胞/孔的比例加入细胞,所述细胞处在1ml/孔的含10%FBS的MEM中。CIU测定的当天用不含血清的MEM洗涤细胞一次,用MEM制备细胞叠层后第24、48、72小时回收的培养液的1/10系列稀释液;37℃感染1小时后,用MEM培养基洗涤一次,然后加入1ml的MEM培养基。37℃培养2天后,用荧光显微镜观察细胞,对在适度稀释的孔中的GFP阳性细胞进行计数。结果发现,在细胞叠层72小时后,有1×106-1×107GFP-CIU/ml的病毒载体被回收(图16)
在pCAGGS-T7法中,当将293T细胞用于导入质粒时,使用磷酸钙法也成功地回收了SeV18+GFP/AF。其效率与TransIT-LT1相似或更高(图17)。
实施例6:pCAGGS-T7法的细胞种类的评估
为了评估pCAGGS-T7法是否在293T细胞以外的细胞中也可以回收仙台病毒载体,对LLC-MK2,BHK-21,BHK/T7,293T细胞是否能回收所述载体进行了测试。转染前一天将各种细胞铺到6孔板上(LLC-MK细胞:5.0×105个细胞/孔;BHK-21细胞:2.5×105个细胞/孔;BHK/T7细胞:2.5×105个细胞/孔;293T细胞:1×106个细胞/孔)。转染如下述进行。将30 μl Opti-MEM与15μl TransIT-LT1(Mirus)混合,室温温育10-15分钟。此过程中制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解pCAGGS-T7 0.5μg、pCAGGS-NP 0.5μg、pCAGGS-P4C(-)0.5μg、pCAGGS-L(TDK)2μg、pCAGGS-F5R 0.5μg和pSeV/ΔF-GFP 2μg(但是使用BHK/T7细胞时不添加pCAGGS-T7)。10-15分钟后,将TransIT-LT1溶液与DNA溶液混合并在室温静置15分钟。在此过程中去除细胞的培养基,轻柔地以1ml/孔加入新鲜的含10%FBS的D-MEM。15分钟过后,向DNA-TransIT-LT1混合物中加入500μl Opti-MEM(GIBCO),然后将混合物全部加到细胞中培养。37℃,5%CO2下培养72小时后,去掉培养液,将LLC-MK2/F7/A细胞以1×106/ml重悬于Try-MEM中。用该悬浮液以1ml/孔叠层,在37℃,5%CO2 下培养。24小时后回收1ml培养液,向所述细胞中加入1ml新鲜Try-MEM,37℃,5%CO2下培养。48小时后回收1ml培养液,向所述细胞中加入1ml新鲜Try-MEM,37℃,5%CO2下培养。72小时后回收1ml培养液。回收的培养液加入133μl 7.5%的BSA(终浓度1%BSA),在-80℃保存到CIU测定为止。测定结果发现,从所有被测细胞种类都回收了载体(n=3)。载体的回收效率从大到小的次序为BHK/T7细胞>BHK-21细胞>293T细胞>LLC-MK2细胞(图18)。另外,由于BHK/T7表达细胞株没有被pCAGGS-T7转染,显示在T7表达细胞株中使用CA启动子也可以回收F缺陷型SeV/ΔF-GFP。
实施例7:HamRbz法和pCAGGS-T7法的比较
在转染前一天,将293T细胞以1×106个细胞/孔、以2ml含10%FBS的D-MEM铺到6孔培养板中。转染按下述进行。将30μl Opti-MEM与15μlTransIT-LT1(Mirus)混合,室温温育10-15分钟。此过程中制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解pCAGGS-NP 0.3μg、pCAGGS-P4C(-)0.5μg、pCAGGS-L(TDK)2μg、pCAGGS-F5R 0.5μg和pCAGGS-SeV/ΔF-GFP 5μg。10-15分钟后,将TransIT-LT1溶液与DNA溶液混合并在室温静置15分钟。在此过程中去除细胞的培养基,轻柔地以1ml/孔加入新鲜的含10%FBS的D-MEM。15分钟过后,向DNA-TransIT-LT1混合物加入500μlOpti-MEM(GIBCO),然后将混合物全部加到细胞中培养。37℃,5%CO2 下培养72小时后,去掉培养液,将LLC-MK2/F7/A细胞以1×106/ml重悬于含7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下称Try-MEM)中。该 悬浮液以1ml/孔叠层,在37℃,5%CO2下培养。24小时后回收1ml培养液,加入1ml新鲜Try-MEM,37℃,5%CO2下培养。48小时后回收1ml培养液,加入1ml新鲜Try-MEM,37℃,5%CO2下培养。72小时后回收1ml培养液。回收的培养液加入133μl 7.5%的BSA(终浓度1%BSA),在-80℃保存到CIU测定为止。
对于pCAGGS-T7法,在转染前一天,将293T细胞以1×106个细胞/孔、以2ml含10%FBS的D-MEM铺到6孔培养板中。转染按下述进行。将30μl Opti-MEM与15μl TransIT-LT1(Mirus)混合,室温温育10-15分钟。此过程中制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解固定量的pCAGGS-T7 0.5μg、pCAGGS-NP 0.5μg、pCAGGS-P4C(-)0.5μg、pCAGGS-L(TDK)2μg、pCAGGS-F5R 0.5μg和pCAGGS-SeV/ΔF-GFP 5μg。10-15分钟后,将TransIT-LT1溶液与DNA溶液混合并在室温静置15分钟。在此过程中去除细胞的培养基,轻柔地以1ml/孔加入新鲜的含10%FBS的D-MEM。15分钟过后,向DNA-TransIT-LT1混合物加入500μlOpti-MEM(GIBCO),然后将混合物全部加到细胞中培养。37℃,5%CO2 下培养72小时后,去掉培养液,将LLC-MK2/F7/A细胞以1×106/ml重悬于含7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下称Try-MEM)中。用该悬浮液以1ml/孔叠层,在37℃,5%CO2下培养。24小时后回收1ml培养液,加入1ml新鲜Try-MEM,37℃,5%CO2下培养。48小时后回收1ml培养液,加入1ml新鲜Try-MEM,37℃,5%CO2下培养。72小时后回收1ml培养液。回收的培养液加入133μl 7.5%的BSA(终浓度1%BSA),在-80℃保存到CIU测定为止。CIU测定的结果显示pCAGGS-T7法比HamRbz法的重建效率高(图19)。
实施例8:M基因缺陷型载体及M和F两基因缺陷型载体的构建
用pCAGGS-T7法构建M基因缺失型仙台病毒载体(SeV/ΔM)和M、F两基因缺失型的仙台病毒载体(SeV/ΔMΔF-GFP)。
SeV/ΔM载体的重建
在转染前一天,将293T细胞以1×106个细胞/孔、以2ml含10%FBS的D-MEM铺到6孔培养板中。转染按下述进行。将30μl Opti-MEM与15μlTransIT-LT1(Mirus)混合,室温温育10-15分钟。此过程中制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解pCAGGS-NP 0.5μg、pCAGGS-P4C(-)0.5 μg、pCAGGS-L(TDK)2μg、pCAGGS-M 1.0μg,pCAGGS-T7 0.5μg和pSeV/ΔM-GFP 5μg。10-15分钟后,将TransIT-LT1溶液与DNA溶液混合并在室温静置15分钟。在此过程中去除细胞的培养基,轻柔地以1ml/孔加入新鲜的含10%FBS的D-MEM。15分钟过后,向DNA-TransIT-LT1混合物加入500μl Opti-MEM(GIBCO),然后将混合物全部加到细胞中培养。37℃,5%CO2下培养72小时后,去掉培养液,将表达M和F基因的LLC-MK2细胞(以下称LLC-M/F细胞)以1×106/ml重悬于含7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下称Try-MEM)中。用该悬浮液以1ml/孔叠层,在37℃,5%CO2下培养。将细胞叠层后的3天中每天用新鲜Try-MEM更换培养基,再以后每2-3天更换。转染后第9天将培养液添加到新鲜制备的LLC-MK2-M/F细胞中,32℃、5%CO2下培养9天(每2-3天更换培养基)。将所得上清添加到新鲜制备的LLC-MK2-M/F细胞中,同样地培养4天。确认了此培养上清中存在5.4×108CIU/ml的SeV/ΔM-GFP载体。用GFP荧光观察转染后培养了4天的细胞(P0d4),第一次传代后培养了7天的细胞(P1d7)和第二次传代后培养了4天的细胞(P2d4),在这些细胞中观察到载体感染的细胞的扩增,结果如图20所示
SeV/ΔMΔF-GFP的重建
在转染前一天,将293T细胞以1×106个细胞/孔、以2ml含10%FBS的D-MEM铺到6孔培养板中。转染按下述进行。将30μl Opti-MEM与15μlTransIT-LT1(Mirus)混合,室温温育10-15分钟。此过程中制备DNA溶液。在20μl Opti-MEM中分别溶解pCAGGS-NP 0.5μg,pCAGGS-P4C(-)0.5μg,pCAGGS-L(TDK)2μg ,pCAGGS-F5R 0.5μg,pCAGGS-M 1.0μg,pCAGGS-T7 0.5μg,和pSeV/ΔMΔF-GFP 5μg。10-15分钟后,将TransIT-LT1溶液与DNA溶液混合并在室温静置15分钟。在此过程中去除细胞的培养基,轻柔地以1ml/孔加入新鲜的含10%FBS的D-MEM。15分钟过后,向DNA-TransIT-LT1混合物加入500μl Opti-MEM(GIBCO),然后将混合物全部加到细胞中培养。37℃,5%CO2下培养72小时后,去掉培养液,将LLC-M/F细胞以1×106/ml重悬于含7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下称Try-MEM)中。用该悬浮液以1ml/孔叠层,在37℃,5%CO2下培养。叠层后的3天中每天用新鲜Try-MEM更换培养基,再以后每2-3天更换。转染后第9天将培养液添加到新鲜制备的LLC-M/F细胞中,32℃、5%CO2下培养9天(每2-3天更换培养基)。将所得上清 添加到新鲜制备的LLC-M/F细胞,同样地培养4天,然后再将所得上清加入新鲜制备的LLC-M/F细胞中,同样培养3天。确认了此培养上清中存在4.6×107CIU/ml的SeV/ΔMΔF-GFP载体。用GFP荧光观察转染后培养了4天的细胞(P0d4),第一次传代后培养了9天的细胞(P1d9),第二次传代后培养了4天的细胞(P2d4),和第三次传代后培养了3天的细胞(P3d3),在这些细胞中观察到载体感染的细胞的扩增,结果如图21所示。
实施例9:CA和CMV启动子重建效率的比较
为了比较CMV和CA启动子,将CMV启动子控制下的NP、P、L、F5R和T7 RNA聚合酶装载到pCl-neo(Promega)中(分别为pCl-neo-NP,pCl-neo-P4C(-),pCl-neo-L(TDK),pCl-neo-F5R和pCl-neo-T7)。在转染前一天,将293T细胞以1×106个细胞/孔、以2ml含10%FBS的D-MEM铺到6孔培养板中。转染按下述进行。将30μl Opti-MEM与15μl TransIT-LT1(Mirus)混合,室温温育10-15分钟。此过程中制备DNA溶液。当使用CA启动子(pCAGGS质粒)时,在20μl Opti-MEM中分别溶解pCAGGS-NP0.5μg,pCAGGS-P4C(-)0.5μg,pCAGGS-L(TDK)2μg,pCAGGS-F5R 0.5μg,pCAGGS-T7 0.5μg,和pSeV/ΔF-GFP 5μg;当使用CMV启动子(pCl-neo)时,在20μl Opti-MEM中分别溶解pCl-neo-NP 0.5μg,pCl-neo-P4C(-)0.5g,pCl-neo-L(TDK)5μg,pCl-neo-F5R 0.5μg,pCl-neo-T7 1μg,和pSeV/ΔF-GFP5μg。10-15分钟后,将TransIT-LT1溶液与DNA溶液混合并在室温静置15分钟。在此过程中去除细胞的培养基,轻柔地以1ml/孔加入新鲜的含10%FBS的D-MEM。15分钟过后,向DNA-TransIT-LT1混合物加入500μlOpti-MEM(GIBCO),然后将混合物全部加到细胞中培养。37℃,5%CO2 下培养72小时后,去掉培养液,将LLC-MK2/F7/A细胞以1×106/ml重悬于含7.5μg/ml胰蛋白酶(不含血清)的MEM(以下称Try-MEM)中。用该悬浮液以1ml/孔叠层,在37℃,5%CO2下培养。24小时后回收1ml培养液,加入1ml新鲜的Try-MEM,37℃,5%CO2下培养所述细胞。48小时后回收1ml培养液,加入1ml新鲜的Try-MEM,37℃,5%CO2下培养所述细胞。72小时后回收1ml培养液。回收的培养液加入133μl 7.5%的BSA(终浓度1%BSA),在-80℃保存到CIU测定为止。
使用CA启动子时,在转染后72小时观察到了GFP的扩展,而且LLC-MK2/F7/A细胞叠层后也观察到高效的增殖。另一方面,使用CMV启 动子时,在转染后72小时没有观察到GFP荧光,而用LLC-MK2/F7/A细胞叠层48小时后才观察到GFP的小的扩展。对于载体的重建,CA启动子的效率比CMV启动子高1000倍或1000倍以上。因此,CA启动子远比CMV适合用于回收载体。
另外,对使用CMV启动子控制下的基因组合和CA启动子控制下的基因组合进行了考察,结果发现,用CA启动子驱动所有的辅助质粒比组合使用CMV和CA的回收效率高得多。
工业实用性
本发明可以在不使用痘苗病毒的条件下高效地制备负链RNA病毒载体,制备过程和产品都具有高度安全性。特别地,根据本发明,可以不依赖痘苗病毒制备缺失了F、HN和/或M基因等包膜构成蛋白基因的负链RNA病毒载体。本发明尤其适用于制造基因治疗用载体等需要高度安全性的载体。
Claims (27)
1.制造负链RNA病毒载体的方法,其特征在于,使用含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子来诱导病毒生产细胞中的(i)该负链RNA病毒的基因组RNA或其互补链的转录,及(ii)与该基因组RNA形成核蛋白的负链RNA病毒蛋白质的表达,
其中所述方法包括:
(a)在所述产生病毒的细胞中转录与含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子可调控地连接的编码核酶及负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA的步骤,其中所述核酶具有在该核酶与基因组RNA或其互补链之间切断转录产物的活性;或
(b)在所述产生病毒的细胞中表达与含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子可调控地连接的编码噬菌体RNA聚合酶的DNA,以及在所述产生病毒的细胞中用该RNA聚合酶转录与该RNA聚合酶的识别序列可调控地连接的编码负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA的步骤。
2.权利要求1所述的方法,其包括在所述产生病毒的细胞中转录与含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子可调控地连接的编码核酶及负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA的步骤;其中所述核酶具有在该核酶与基因组RNA或其互补链之间切断转录产物的活性。
3.权利要求1的方法,其包括:在所述产生病毒的细胞中表达与含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子可调控地连接的编码噬菌体RNA聚合酶的DNA的步骤;及在所述产生病毒的细胞中通过该RNA聚合酶转录与该RNA聚合酶的识别序列可调控地连接的编码负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA的步骤。
4.权利要求2的方法,其中所述核酶是锤头核酶。
5.权利要求3的方法,其中所述编码RNA聚合酶的DNA在所述病毒生产细胞中作为游离基因表达。
6.权利要求3的方法,其中所述编码RNA聚合酶的DNA从所述病毒生产细胞的染色体表达。
7.权利要求3的方法,其中所述噬菌体选自SP6噬菌体、T3噬菌体和T7噬菌体。
8.权利要求1的方法,其中所述负链RNA病毒是仙台病毒。
9.权利要求1的方法,其中所述基因组RNA或其互补链缺失了一个或多个编码包膜构成蛋白质的基因;且其中进一步包括在所述细胞内表达编码包膜构成蛋白的DNA的步骤。
10.一种DNA,其包含与含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子可调控地连接的编码核酶和负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA,其中所述核酶具有在该核酶与所述负链RNA病毒基因组RNA或其互补链之间切断转录产物的活性。
11.权利要求10的DNA,其中所述基因组RNA或其互补链缺失了一个或多个编码包膜构成蛋白质的基因。
12.权利要求10的DNA,其中所述负链RNA病毒是仙台病毒。
13.权利要求10的DNA,其中所述核酶是锤头核酶。
14.权利要求10的DNA,其中所述DNA可以被重组酶诱导表达。
15.权利要求14的DNA,其中所述重组酶是Cre或Flp。
16.一种用于生产负链RNA病毒的试剂盒,其包含:
(i)与含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子可调控地连接的编码噬菌体RNA聚合酶的DNA,和
(ii)与所述RNA聚合酶的识别序列可调控地连接且编码负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA。
17.权利要求16的试剂盒,其中所述噬菌体选自SP6噬菌体、T3噬菌体和T7噬菌体。
18.权利要求16的试剂盒,其中所述DNA可以被重组酶诱导表达。
19.权利要求18的试剂盒,其中所述重组酶是Cre或Flp。
20.保持有权利要求10的试剂盒的哺乳动物细胞。
21.权利要求20的哺乳动物细胞,其中所述细胞是生产负链RNA病毒的细胞。
22.权利要求20的哺乳动物细胞,其中所述基因组RNA或其互补链缺失了一个或多个编码包膜构成蛋白质的基因。
23.权利要求20的哺乳动物细胞,其中所述负链RNA病毒是仙台病毒。
24.一种哺乳动物细胞,其保持有:
(i)与含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的启动子可调控地连接的编码噬菌体RNA聚合酶的DNA,和
(ii)与所述RNA聚合酶的识别序列可调控地连接的编码负链RNA病毒基因组RNA或其互补链的DNA。
25.权利要求24的哺乳动物细胞,其中所述细胞是生产负链RNA病毒的细胞。
26.权利要求24的哺乳动物细胞,其中所述基因组RNA或其互补链缺失了一个或多个编码包膜构成蛋白质的基因。
27.权利要求25的哺乳动物细胞,其中所述负链RNA病毒是仙台病毒。
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