JP5438149B2 - サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターを含むハイブリッドプロモーターを利用したマイナス鎖RNAウイルスベクターの製造方法 - Google Patents
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Description
〔1〕 マイナス鎖RNAウイルスベクターの製造方法であって、ウイルス生産細胞における (i) 該マイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖の転写および (ii) 該ゲノムRNAとリボヌクレオプロテインを形成するマイナス鎖RNAウイルス蛋白質の発現を、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターを含むプロモーターにより誘導することを特徴とする方法、
〔2〕 該ウイルス生産細胞において、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターを含むプロモーターの制御下にリボザイムとマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖とをコードするDNAが連結されたDNAを転写させる工程を含み、該リボザイムは、転写産物を該リボザイムとゲノムRNAまたはその相補鎖との間で切断する活性を有する、〔1〕に記載の方法、
〔3〕 該ウイルス生産細胞において、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターを含むプロモーターの制御下にバクテリオファージのRNAポリメラーゼをコードするDNAが連結されたDNAを発現させる工程、および該RNAポリメラーゼにより、該RNAポリメラーゼの認識配列の制御下に連結されたマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードするDNAを転写させる工程を含む、〔1〕に記載の方法、
〔4〕 該リボザイムがハンマーヘッドリボザイムである、〔2〕に記載の方法、
〔5〕 該RNAポリメラーゼをコードするDNAが連結されたDNAを、該ウイルス生産細胞においてエピソーマルに発現させる、〔3〕に記載の方法、
〔6〕 該RNAポリメラーゼをコードするDNAが連結されたDNAを、該ウイルス生産細胞の染色体から発現させる、〔3〕に記載の方法、
〔7〕 該バクテリオファージが、SP6ファージ、T3ファージ、およびT7ファージからなる群より選択される、〔3〕、〔5〕、または〔6〕に記載の方法、
〔8〕 該マイナス鎖RNAウイルスがセンダイウイルスである、〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の方法、
〔9〕 該ゲノムRNAまたはその相補鎖が、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の1つまたは複数を欠損しており、エンベロープ構成蛋白質をコードするDNAを、該細胞において発現させる工程をさらに含む、〔1〕から〔8〕のいずれかに記載の方法、
〔10〕 サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターとを含むプロモーターの制御下に、リボザイムとマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖とをコードするDNAが連結されたDNAであって、該リボザイムは、転写産物を該リボザイムとマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖との間で切断する活性を有する、DNA、
〔11〕 該ゲノムRNAまたはその相補鎖が、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の1つまたは複数を欠損している、〔10〕に記載のDNA、
〔12〕 該マイナス鎖RNAウイルスがセンダイウイルスである、〔10〕または〔11〕に記載のDNA、
〔13〕 該リボザイムがハンマーヘッドリボザイムである、〔10〕から〔12〕のいずれかに記載のDNA、
〔14〕 リコンビナーゼにより発現誘導可能である、〔10〕から〔13〕のいずれかに記載のDNA、
〔15〕 該リコンビナーゼがCreまたはFlpである、〔14〕に記載のDNA、
〔16〕 サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターを含むプロモーターの制御下にバクテリオファージのRNAポリメラーゼをコードするDNAが連結されたDNA、
〔17〕 該バクテリオファージが、SP6ファージ、T3ファージ、およびT7ファージからなる群より選択される、〔16〕に記載のDNA、
〔18〕 リコンビナーゼにより発現誘導可能である、〔16〕または〔17〕に記載のDNA、
〔19〕 該リコンビナーゼがCreまたはFlpである、〔18〕に記載のDNA、
〔20〕 〔10〕から〔15〕のいずれかに記載のDNAを保持する哺乳動物細胞、
〔21〕 マイナス鎖RNAウイルス生産用細胞である、〔20〕に記載の哺乳動物細胞、
〔22〕 該ゲノムRNAまたはその相補鎖が、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の1つまたは複数を欠損している、〔20〕または〔21〕に記載の哺乳動物細胞、
〔23〕 該マイナス鎖RNAウイルスがセンダイウイルスである、〔20〕から〔22〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞、
〔24〕 〔16〕から〔19〕のいずれかに記載のDNAを保持する哺乳動物細胞、
〔25〕 マイナス鎖RNAウイルス生産用細胞である、〔24〕に記載の哺乳動物細胞、
〔26〕 該RNAポリメラーゼの認識配列の制御下に連結されたマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードするDNAをさらに保持する、〔24〕または〔25〕に記載の哺乳動物細胞、
〔27〕 該ゲノムRNAまたはその相補鎖が、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の1つまたは複数を欠損している、〔26〕に記載の哺乳動物細胞、
〔28〕 該マイナス鎖RNAウイルスがセンダイウイルスである、〔25〕から〔27〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞、に関する。
(a)哺乳動物細胞において、マイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖の転写、および該マイナス鎖RNAウイルスのリボヌクレオプロテイン(RNP)を構成するウイルス蛋白質の発現を、CAプロモーターにより誘導する工程、および
(b)該細胞において生産されたマイナス鎖RNAウイルスまたはその増殖産物を回収する工程、を含む方法である。
マイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖(アンチゲノムRNA)は、マイナス鎖RNAウイルスのRNPを構成するウイルス蛋白質と共にRNPを形成し、ゲノムにコードされるウイルス蛋白質が発現して細胞内でゲノムRNAおよびアンチゲノムRNAが増幅し、エンベロープ構成蛋白質が取り込まれてウイルス粒子が生成する。これを回収することによって、ウイルスを得ることができる。
-17から-1までの領域は転写に必須であり、2本鎖であることが必要である。また、上記の+1から+6のうち、効率のよい転写を実現させるためには最初の2塩基(+1および+2)が GP (P=プリン (AまたはG)) であることが重要であり、その他の塩基は他の塩基に置換してもよい。好ましくは、上記の下線部に示した配列が用いられる。マイナス鎖RNAウイルスのゲノムcDNA(プラス鎖またはマイナス鎖)は、上記RNAポリメラーゼの認識配列の直下に結合される。効率の高いウイルスの製造のためには、プラス鎖を転写させるようにするとよい。
(1-1)CAプロモーターの制御下にバクテリオファージのRNAポリメラーゼをコードするDNAが連結されたDNA、および該RNAポリメラーゼの認識配列の制御下に連結されたマイナス鎖RNAウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードするDNA、を含むマイナス鎖RNAウイルス製造キット。
(1-2)CAプロモーターの制御下に連結された、該ゲノムRNAとRNPを形成するマイナス鎖RNAウイルス蛋白質をコードするDNAをさらに含む、上記(1-1)に記載のキット。
(1-3)該ゲノムRNAまたはその相補鎖が、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の1つまたは複数を欠損している、上記(1-1)または(1-2)に記載のキット。
(1-4)エンベロープ構成蛋白質をコードするDNAをさらに含む、上記(1-1)から(1-3)のいずれかに記載のキット。
(1-5)エンベロープ構成蛋白質をコードするDNAが、CAプロモーターの制御下に連結されている、上記(1-1)から(1-4)のいずれかに記載のキット。
(1-6)該マイナス鎖RNAウイルスがセンダイウイルスである、上記(1-1)から(1-5)のいずれかに記載のキット。
(1-7)該バクテリオファージが、SP6ファージ、T3ファージ、およびT7ファージからなる群より選択される、上記(1-1)から(1-6)のいずれかに記載のキット。
(1-8)該RNAポリメラーゼがリコンビナーゼにより発現誘導可能である、上記(1-1)から(1-7)のいずれかに記載のキット。
(1-9)該リコンビナーゼがCreまたはFlpである、上記(1-8)に記載のキット。
(2-2)CAプロモーターの制御下に連結された、該ゲノムRNAとRNPを形成するマイナス鎖RNAウイルス蛋白質をコードするDNAをさらに含む、上記(2-1)に記載のキット。
(2-3)該ゲノムRNAまたはその相補鎖が、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の1つまたは複数を欠損している、上記(2-1)または(2-2)に記載のキット。
(2-4)エンベロープ構成蛋白質をコードするDNAをさらに含む、上記(2-1)から(2-3)のいずれかに記載のキット。
(2-5)エンベロープ構成蛋白質をコードするDNAが、CAプロモーターの制御下に連結されている、上記(2-1)から(2-4)のいずれかに記載のキット。
(2-6)該マイナス鎖RNAウイルスがセンダイウイルスである、上記(2-1)から(2-5)のいずれかに記載のキット。
(2-7)該バクテリオファージが、SP6ファージ、T3ファージ、およびT7ファージからなる群より選択される、上記(2-1)から(2-6)のいずれかに記載のキット。
(2-8)該RNAポリメラーゼがリコンビナーゼにより発現誘導可能である、上記(2-1)から(2-7)のいずれかに記載のキット。
(2-9)該リコンビナーゼがCreまたはFlpである、上記(2-8)に記載のキット。
(3-2)該ゲノムRNAまたはその相補鎖が、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の1つまたは複数を欠損している、上記(3-1)に記載のキット。
(3-3)エンベロープ構成蛋白質をコードするDNAをさらに含む、上記(3-1)または(3-2)に記載のキット。
(3-4)エンベロープ構成蛋白質をコードするDNAが、CAプロモーターの制御下に連結されている、上記(3-1)から(3-3)のいずれかに記載のキット。
(3-5)該マイナス鎖RNAウイルスがセンダイウイルスである、上記(3-1)から(3-4)のいずれかに記載のキット。
(3-6)該バクテリオファージが、SP6ファージ、T3ファージ、およびT7ファージからなる群より選択される、上記(3-1)から(3-5)のいずれかに記載のキット。
(3-7)上記(i)および/または(ii)のDNAがリコンビナーゼにより発現誘導可能である、上記(3-1)から(3-6)のいずれかに記載のキット。
(3-8)該リコンビナーゼがCreまたはFlpである、上記(3-7)に記載のキット。
なおリコンビナーゼにより発現誘導可能とは、CAプロモーターとその下流のDNAとの間に該リコンビナーゼの認識配列に挟まれたDNAが挿入されており、該リコンビナーゼにより認識配列に挟まれたDNAが除去され、CAプロモーターの下流のDNAの発現が誘導されるようになっていることである。
レスピロウイルス属 NP P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 NP P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 NP P/C/V M F H - L
外来遺伝子を組み込む場合は、まず、目的の外来遺伝子のcDNA塩基配列を含むDNA試料を用意する。DNA試料は、25ng/micro-l以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、NotI部位を利用してウイルスゲノムRNAをコードするDNAに外来遺伝子を挿入する場合を例にとって説明する。目的とするcDNA塩基配列の中にNotI認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異導入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、NotI部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から目的の遺伝子断片をPCRにより増幅し回収する。2つのプライマーの5'部分にNotI部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端をNotI部位とする。ウイルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子のORFとその両側のウイルス遺伝子のORFとの間にE-I-S配列が配置されるように、プライマー中にE-I-S配列を含めるようにする。合成DNAの長さは、付加したE-I-S配列を含む最終的な挿入断片の鎖長が6の倍数になるように塩基数を設計する(いわゆる「6のルール(rule of six)」; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-899, 1998; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67:4822-4830, 1993; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993)。E-I-S配列は、例えば挿入断片のオリゴDNAの3'側にセンダイウィルスのマイナス鎖のS配列、I配列、およびE配列、例えばそれぞれ5'-CTTTCACCCT-3'(配列番号:20)、5'-AAG-3'、および 5'-TTTTTCTTACTACGG-3'(配列番号:21)を用いることができる。
pCAGGS-NP 0.1μg〜2μg (より好ましくは0.3μg)
pCAGGS-P 0.1μg〜2μg (より好ましくは0.5μg)
pCAGGS-L(TDK) 0.5μg〜4.5μg (より好ましくは2.0μg)
pCAGGS-F5R 0.1μg〜5μg (より好ましくは0.5μg)
pCAGGS-SeV 0.5μg〜5μg (より好ましくは5μg)
(pCAGGS-SeV/ΔF-GFP)
マイナス鎖RNAウイルスのゲノムをバクテリオファージのRNAポリメラーゼを介して転写させる方法においては、NP発現プラスミドを0.1μg〜2μg(より好ましくは0.5μg)、P発現プラスミドを0.1μg〜2μg(より好ましくは0.5μg)、L発現プラスミドを0.5μg〜4.5μg(より好ましくは2.0μg)、F発現プラスミドを0.1μg〜5μg(より好ましくは0.5μg)、ウイルスゲノムRNA (プラス鎖またはマイナス鎖) をコードするプラスミドを0.5μg〜5μg(より好ましくは5μg) 用いるとよい。例えばSeVの製造のためには、実施例に記載の各プラスミドを以下の量でトランスフェクションに使用するとよい。
pCAGGS-NP 0.1μg〜2μg (より好ましくは0.5μg)
pCAGGS-P 0.1μg〜2μg (より好ましくは0.5μg)
pCAGGS-L(TDK) 0.5μg〜4.5μg (より好ましくは2.0μg)
pCAGGS-F5R 0.1μg〜5μg (より好ましくは0.5μg)
pCAGGS-SeV 0.5μg〜5μg (より好ましくは5μg)
(pCAGGS-SeV/ΔF-GFP)
・pCAGGS(Btype)の構築
pCALNdLw (Arai, T. et al. J. Virology 72, 1998, p1115-1121) をXho Iで消化し、Qiaquick PCR Purification kitで精製し、ライゲーションを行った。Xho I断片が除かれたものを選別し、得たものをpCAGGS(B type)とした。pCAGGS(B type)をSal Iで消化し、Pfu DNA polymeraseでブラント化し、Qiaquick PCR Purification kitで精製し、ライゲーションを行った。Sal Iサイトがつぶれたものを選別し、pCAGGS(BSX)とした。
pCALNdLwをSpe I及びEcoT22Iで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した。2651 bp断片と3674 bp断片を切り出し、Qiaquick gel Extraction kit で精製した。2651 bp断片をさらにXho Iで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、1761 bpのバンドを精製した。Zeocin抵抗性遺伝子をpcDNA3.1/Zeo(+)をテンプレートにしてプライマー 5'-TCTCGAGTCGCTCGGTACGATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCAC-3' (配列番号:22) 及びプライマー 5'-AATGCATGATCAGTAAATTACAATGAACATCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3' (配列番号:23) を用いてPCRにより増幅しXhoI及びEcoT22Iで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、438 bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction kitで精製した。このZeocin抵抗性遺伝子を含むバンドと上記3674 bp及び1761bpの3種類の断片をライゲーションにより連結してpCALNdLw-Zeoを得た。このpCALNdLw-ZeoをSwaIで消化しEco RIリンカー (STRATAGENE) を挿入することでpCALNdLWE-Zeoを得た。マルチクローニングサイトが導入されたセンダイウイルスcDNA (特開2002-272465) (以下pSeV(TDK)と称す) をNot I及びXho Iで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、1669 bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction kitで精製した。このNP遺伝子を含む断片をNot I及びXho I消化したpGEM11Zf(+) (Promega)へ挿入し、pGEM-NP(Z)PCR14-3とした。これをテンプレートにしてプライマー 5'-CCGGAATTCAACAAATGGCCGGGTTGTTGAGCACCTTCGA-3' (配列番号:24) 及び5'-CCGGAATTCCTAGATTCCTCCTATCCCAGCTACTGCTGCTCG-3' (配列番号:25) を用いてPCRにより増幅し、Eco RI消化後、pCALNdLWE-ZeoのEco RIサイトに導入し、pCALNdLWE-Zeo-NP(Z)を得た。次にpCALNdLWE-Zeo-NP(Z)をXho I消化し、ライゲーションを行い、Xho I断片を除いたプラスミドを構築し、これをpCAGGS-NPとした。
pCALNdLw-HygroM (Inoue, M. et al. J. Virology 77, 2003, p6419-6429) をXhoIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、Hygromycin抵抗性遺伝子を含む1679 bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction kitで精製した。pCALNdLwをXho I消化し、アガロースゲル電気泳動後4864 bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction kitで精製した。両方の断片を用いてライゲーションを行いpCALNdLw-Hygroを構築した。このpCALNdLw-HygroをSwaIで消化し、Nhe Iリンカー (STRATAGENE) を挿入することでpCALNdLWN-Hygroを得た。4C(-)SeV cDNA(Kurotani, Kato, Nagai,et al Genes to Cells 3, 1998, p111-124)をテンプレートにして 5'-CTAGCTAGCCCACCATGGATCAAGATGCCTTCATTCTAAAAGAAGATTCT-3' (配列番号:26) 及び 5'-CTAGCTAGCCTAGTTGGTCAGTGACTCTATGTCCTCTTCTACGAGTTCCA-3' (配列番号:27) を用いてKOD-PLUS DNA Polymerase (TOYOBO) でPCRを行た。gene clean kitを用いて精製し、PCR産物をNhe Iで消化し、gene clean kit で精製した。これを、上記のpCALNdLWN-hygroのNhe Iサイトに導入し、pCALNdLWN-hygro-P(Z)k4C(-)を得た。これをXho Iで消化し、Qiaquick PCR Purification kitで精製後、ライゲーションを行いXho I断片(Hygromycin抵抗性遺伝子領域)を除いたものを選択し、pCAGGS-P4C(-)を得た。
pSeV(TDK) をFse I及び Sac IIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、6732 bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction kitで精製した。Pfu DNA PolymeraseとdNTPを使用し、72℃で10分間反応させブラント化した。Qiaquick PCR purification kitで精製後、pCAGGS(BSX)のSwa Iサイトに導入しpCAGGS-L(TDK)を得た。
pCALNdLw/F (Li, H.-O. et al. J. Virology 74, 2000, p6564-6569) をXho I消化、精製後、ライゲーションを行いXho I断片(Neomycin耐性遺伝子領域)が除かれたものを選択し、pCAGGS-Fを得た。pCALNdLw-ZeoF (特願2001-283451) をテンプレートにして条件(I) 5'-CATTTTGGCAAAGAATTGATTAATTCGAG-3' (配列番号:28) 及び 5'-TCACAGCACCCAAGAATCTCTTCTGGCGAGCACCGGCATTTTGTGTC-3' (配列番号:29) のプライマーの組み合わせと、条件(II) 5'-GACACAAAATGCCGGTGCTCGCCAGAAGAGATTCTTGGGTGCTGTGA-3' (配列番号:30) 及び 5'-GATCGTAATCACAGTCTCTCGAGAGTTGTACCATCTACCTAC-3' (配列番号:31) のプライマーの組み合わせを用いてPfu Turbo (STRATAGENE) を使用してPCRを行った。PCR産物はアガロースゲル電気泳動で分離後、条件(I)の1470 bpのバンドと条件(II)の1190 bpのバンドをそれぞれ切り出し、GENE CLEAN KITを使用して回収した(それぞれPCR産物(I)、PCR産物(II)とする)。精製したPCR産物(I)とPCR産物(II)をそれぞれ10倍希釈したものを1μlずつを混合し、さらに 5'-CATTTTGGCAAAGAATTGATTAATTCGAG-3' (配列番号:28) 及び 5'-GATCGTAATCACAGTCTCTCGAGAGTTGTACCATCTACCTAC-3' (配列番号:31) のプライマーの組み合わせでPfu Turboを使用しPCRを行った。PCR産物 5μlをアガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、予想される2.6 kbのバンドが検出された。そこで、残りのPCR産物をQiaquick PCR Extraction kitで精製した。その後Dra IIIとMfe Iで連続的に制限酵素処理を行い、アガロースゲル電気泳動で分離後、約2.0 kbのバンドを切り出した。pCALNdLw-Zeo-Fを Dra IIIとMfe Iで連続的に消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し、約6kpのバンドを切り出し、GENECLEAN II KIT (BIO) で精製した。このpCALNdLw-Zeo-F DraIII-Mfe I断片と上記PCR DraIII-Mfe I断片をライゲーションすることによりpCALNdLw-Zeo-F furinを得た。次にこのpCALNdLw-Zeo-F furinをテンプレートにして、条件(I) 5'-CATTTTGGCAAAGAATTGATTAATTCGAG-3' (配列番号:28) 及び 5'-TCACAGCACCGAAGAATCTCCTCCGGCGACGACCGGCATTTTGTGTCGTATC-3' (配列番号:32) のプライマーの組み合わせ、条件(II) 5'-GATACGACACAAAATGCCGGTCGTCGCCGGAGGAGATTCTTCGGTGCTGTGA-3' (配列番号:33) 及び5'-AAATCCTGGAGTGTCTTTAGAGC-3' (配列番号:34) のプライマーの組み合わせでPCRを行った。電気泳動で分離後、条件(I)の約1.4 kbpのバンドと条件(II)の約200 bpのバンドを切り出し、Qiaquick gel Extraction kit でそれぞれ精製した。50倍希釈したものを1μlずつ混合し、さらに 5'-CATTTTGGCAAAGAATTGATTAATTCGAG-3' (配列番号:28) 及び 5'-AAATCCTGGAGTGTCTTTAGAGC-3' (配列番号:34) のプライマーの組み合わせでPfu Turboを使用してさらにPCRを行った。5μlのPCR産物をアガロースゲル電気泳動で分離後、染色し、約1.6 kbpのバンドを確認した。残りをQiaquick PCR Purification kitで精製しCla IとFseIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、約1 kbpのバンドを切り出し、Qiaquick PCR Purification kitで精製した。pCALNdLw-Zeo-F furinをCla IとFse Iで消化、アガロースゲル電気泳動で分離後、約8 kbpのバンドを切り出しQiaquick PCR Purification kitで精製した。これと上記PCR産物のClaI-Fse I消化精製物でライゲーションすることによりpCALNdLw-Zeo F5Rを得た。このpCALNdLw-Zeo F5RをXho Iで消化し、精製後ライゲーションを行いXho I断片(Zeocin抵抗性遺伝子を含む)を含まないものを選択し、pCAGGS-F5Rを得た。
pTF7-3 (ATCC No.67202) をBam HIで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、T7 RNA Polymerase遺伝子を含む2.65 kbpの断片を回収し、pMW219 (ニッポンジーン) のBam HIサイトに挿入しpMW219-T7を得た。このpMW219-T7をSal Iで消化後、DNA Blunting kit (TaKaRa) を使用して平滑末端にし、Eco RIリンカー(Stratagene #901026)を導入し、pMW219-T7-Eco RIを得た。このpMW219-T7-Eco RIをEco RIで消化し、T7 RNA Polymeraseを含むEco RI断片を精製し、上記pCALNdLWEのEco RIサイトに導入することでpCALNdLWE-T7を得た。
pSeV(TDK)をNot I及びKpn Iで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、2995 bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction kitで精製した。MlinkerF 5'-GGCCGCGTCGACATCGATGCTAGCCTCGAGCCGCGGTAC-3' (配列番号:35) とMlinkerR 5'-CGCGGCTCGAGGCTAGCATCGATGTCGACGC-3' (配列番号:36) を各2μg (2μl) と H2O を 21μl を混合し、95℃5分、85℃15分、65℃15分、37℃15分、25℃15、分4℃でアニーリングさせた。この混合液とpSeV(TDK) NotI-Kpn I精製液をライゲーションし、pSeV/Linkerを得た。このpSeV/Linkerをテンプレートにして、pGEM-F5 5'-CTTAACTATGCGGCATCAGAGC-3' (配列番号:37) 及びpGEM-R1 5'-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3' (配列番号:38) を使用し、KOD-Plus (TOYOBO) を用いてPCR反応を行いQiaquick PCR Purification kitを使用して精製した。その精製液をテンプレートとしてRibLF1 5'-CTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACCAAACAAGAG-3' (配列番号:39) とpGEM-R1 5'-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3' (配列番号:38) を使用し、KOD-PLUS (TOYOBO) を用いてPCR反応を行いQiaquick PCR Purification kitを使用して精製した。この精製液をテンプレートにして、RibLF2 5'-GATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTC-3' (配列番号:40) とpGEM-R1 5'-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3' (配列番号:38) を使用し、KOD-Plus (TOYOBO) を用いてPCR反応を行いQiaquick PCR Purification kitを使用して精製した。さらにこの精製液をテンプレートにしてRibLF3 5'-GCGGGCCCTCTCTTGTTTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGAC-3' (配列番号:41) とpGEM-R1 5'-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3' (配列番号:38) を使用し、KOD-Plus (TOYOBO) を用いてPCR反応を行いQiaquick PCR Purification kitを使用して精製した。この精製PCR産物をpCAGGS(BSX)のSwa Iサイトに導入し、pCAGGS-SeV(m)とした。次にpSeV18+b(+)/ΔF-EGFP (Li, H.-O. et al. J. Virology 74, 2000, p6564-6569) をNot I 及びSal Iで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、1972 bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction kitで精製し、Not I及びSal I消化し、精製したpCAGGS-SeV(m) とライゲーションし、pCAGGS-SeV(m)A を得た。pSeV(+)18/ΔFをNhe I 及びKpn Iで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、3325 bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction kitで精製し、Not I及びSal I消化し、精製したpCAGGS-SeV(m)とライゲーションし、pCAGGS-SeV(m)ACを得た。
pMAMneo-Luci(Clontech)からBam HIで消化して得たルシフェラーゼフラグメントをpTM1(Nature, 348,1, November, 1990, 91-92)のBam HIサイトへ導入しpGEM-IRES-Luciを構築した。
上記で構築したpCALNdLWE-T7をBHK-21細胞(ATCC CCL-10)にmammalian transfection kit (Stratagene)または、SuperFect (Qiagen)を使用してトランスフェクションを行った。400μg/mlのG418を含むD-MEMで37℃、5% CO2下で2週間培養し、単一の細胞から増殖した薬剤耐性クローンを得た。得られた薬剤耐性クローンはCre DNA recombinaseを発現する組み換えアデノウイルス(AxCANCre)をMoi=4で感染し、24時間後に細胞をPBSで1回洗浄した後に、細胞を回収し、anti-T7 RNA Polymerase rabbit Polyclonal antibodyを使用したウエスタンブロット解析によってT7 RNA Polymeraseの発現を確認した。
発現を確認出来たクローンに関してpGEM-IRES-LuciをSuperFectを使用してトランスフェクションした。24時間後に細胞を回収しデュアルルシフェラーゼレポーターシステム(Promega)キットを使用しMiniLumat LB9506 (EG&G BERTHOLD) にてルシフェラーゼ活性を測定しT7 RNA Polymeraseの活性を確認した。
LLC-MK2 細胞を 5×106 cells/dish で100 mm ペトリ皿に蒔き、24時間培養後、血清を含まない MEM で 1 回洗浄した後、3μg/ml のソラレンと長波長紫外線 (365nm) で 5 分間処理した T7 RNA ポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス (Fuerst, T.R. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 8122-8126(1986)) に室温で 1 時間感染させた (moi=2)。細胞を血清を含まない MEM で 2 回洗浄した後、LacZ 搭載 F 欠失型センダイウイルスベクター cDNA (pSeV (+18:LacZ)ΔF), pGEM/NP, pGEM/P, 及びpGEM/L (Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579(1996)) をそれぞれ 12μg, 4μg, 2μg, 4μg/dish およびエンベローププラスミド pGEM/FHN を4μg/dish加え、 Opti-MEM (GIBCO) に懸濁し、SuperFect transfection reagent (1μg DNA/5μl のSuperFect, QIAGEN) を入れ、室温で 15 分間放置後、最終的に 3% FBSを含むOpti-MEM 3 ml に入れた DNA-SuperFect 混合物を細胞に添加して培養した。3時間培養後、細胞を、血清を含まないMEMで2回洗浄し、シトシンβ-D-アラビノフラノシド 40μg/ml (AraC, Sigma) とトリプシン 7.5μg/ml を含むMEM で24時間培養した。培養上清を取り除き、血清を含まない MEM (40μg/ml AraC, 7.5μg/m トリプシンを含む) に懸濁された100 mm ペトリ皿 1 枚分のF発現 LLC-MK2/F7 細胞(F発現を誘導した細胞は LLC-MK2/F7/Aと記載する;Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569 (2000), WO00/70070)懸濁液 5 ml を重層した。さらに培養48時間後、これらの細胞と上清を回収し、それぞれ P0-d3 サンプルとした。P0-d3のペレットを Opti-MEM に懸濁し (2×107 cells/ml)、凍結融解を3回繰り返して lipofection reagent DOSPER (Boehringer mannheim) と混合し (106 cells/25μl DOSPER) 室温で15分間放置した後、F発現 LLC-MK2/F7 細胞株(LLC-MK2/F7/A)にトランスフェクション (106 cells/well 24-well-plate) し、血清を含まないMEM (40μg/ml AraC, 7.5μg/m トリプシンを含む) で培養した。培養後7日目に上清を回収し、P1-d7サンプルとした。さらに上清全量を12-well-plateに捲いたF発現 LLC-MK2/F7 細胞株(LLC-MK2/F7/A)に 37℃1時間感染後、MEM 培地で一回洗浄した後、血清を含まないMEM (40μg/ml AraC, 7.5μg/ml トリプシンを含む) で培養した。培養後7日目に上清を回収し、P2-d7サンプルとした。さらに上清全量を6-well-plateに捲いたF発現 LLC-MK2/F7 細胞株(LLC-MK2/F7/A)に 37℃1時間感染後、MEM培地で一回洗浄した後、血清を含まないMEM (7.5μg/ml トリプシンを含む) で培養した。培養後7日目に上清を回収し、P3-d7サンプルとした。さらに上清全量を10 cm plateに捲いたF発現 LLC-MK2/F7細胞株(LLC-MK2/F7/A)に37℃1時間感染後、MEM 培地で一回洗浄した後、血清を含まないMEM (40μg/ml AraC, 7.5μg/ml トリプシンを含む) で培養した。培養後7日目に上清を回収し、P4-d7サンプルとした。
・pCAGGSにハンマーヘッドリボザイムを付加したセンダイウイルスゲノムを使用したセンダイウイルスベクターの回収方法(以下HamRbz法とする)
293T 細胞をトランスフェクションする前日に 1×106 cells/well/2 ml 10% FBS入りのD-MEM で6 well plateに蒔いた。トランスフェクションは以下の様にして行った。Opti-MEM 30μlにTransIT-LT1 (Mirus) を15μlを混合し、室温で10〜15分間培養した。この間にDNA溶液を調整した。Opti-MEM 20μlにpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-SeVをそれぞれ 0.5μg, 0.5μg, 2μg, 2μgで溶解した。10〜15分後にTransIT-LT1溶液とDNA溶液を混合し室温で15分間静置した。この間に細胞の培地を抜いて新しい10% FBS入りのD-MEMを1 ml/wellで静かに添加した。15分後、Opti-MEM (GIBCO) 500μlをDNA-TransIT-LT1 混合物に加え、全量を細胞に添加して培養した。37℃, 5% CO2 下で4日間培養後、培養液を捨て、トリプシン 7.5μg/ml を含む(血清を含まない)MEM(以下Try-MEM)に1×106 cells/ mlになるように懸濁したLLC-MK2/F7/A細胞を1ml/well で重層し、37℃, 5% CO2 下で4日間培養した。LLC-MK2/F7/A重層4日後に上清を回収し、HA アッセイを行った。HAはネガティブだったので、回収した上清を10日間孵卵させた鶏卵3個に100μlを接種し、孵卵機にて35℃で3日間培養した。その後、尿液を回収し、HA アッセイを行った。その結果、3個中2個の鶏卵から回収した尿液でHA活性が認められた。したがって、本方法により野生型のセンダイウイルスベクターを回収することが可能であることが示された(図12)。
293T細胞をトランスフェクションする前日に 1×106 cells/well/2 ml 10% FBS入りのD-MEM で6 well plateに蒔いた。トランスフェクションは以下の様にして行った。Opti-MEM 30μlにTransIT-LT1 (Mirus) を15μlを混合し、室温で10〜15分間培養した。この間にDNA溶液を調整した。Opti-MEM 20μlにpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-F5R, pCAGGS-SeV/ΔF-GFPをそれぞれ 0.3μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 0.5〜5μgで溶解した。10〜15分後にTransIT-LT1溶液とDNA溶液を混合し室温で15分間静置した。この間に細胞の培地を抜いて新しい10% FBS入りのD-MEMを1ml/wellで静かに添加した。15分後、Opti-MEM (GIBCO) 500μlをDNA-TransIT-LT1 混合物に加え、全量を細胞に添加して培養した。37℃, 5% CO2下で72時間培養後、培養液を捨て、トリプシン 7.5μg/ml を含む(血清を含まない)MEM(以下Try-MEM)に1×106 cells/ mlになるように懸濁したLLC-MK2/F7/A細胞を1 ml/well で重層し、37℃, 5% CO2下で培養した。それから24時間後に培養液1 mlを回収し、新しいTry-MEMを1 ml加え、37℃, 5% CO2下で培養した。48時間後に培養液1 mlを回収し、新しいTry-MEMを1 ml加え、37℃, 5% CO2下で培養した。72時間後に培養液1 mlを回収した。回収した培養液は、7.5% BSAを133μl 加え(最終濃度1% BSA)、CIUを測定するまで-80℃で保存した。
CIUアッセイの2〜3日前にLLC-MK2 細胞を12 well-plateに蒔いた。2日前の場合は1.5×105 cells/wellの割合で、10% FBS入りのMEM 1ml/wellで蒔き、3日前の場合は、8.0×104 cells/wellの割合で、10% FBS入りのMEM 1ml/wellで蒔いた。CIUアッセイの当日に血清を含まない MEM で 1 回洗浄した後、重層後24、48、72時間目に回収した培養液の1/10希釈系列をMEM 培地で作製し、37℃1時間感染後、MEM 培地で一回洗浄し、MEM 培地 1 ml を添加した。37℃で2日培養後、細胞を蛍光顕微鏡で観察し、適度な希釈のウェルのGFP陽性細胞の数を数えた。その結果、重層72時間後に、1×105〜1×107 GFP-CIU/mlのウイルスベクターが回収された(図13)。
pCAGGSでFタンパク質を供給する時に、野生型のF遺伝子を用いた場合とfurin認識配列を導入したF5Rの場合とで再構成効率の比較を行った。293T 細胞をトランスフェクションする前日に 1×106 cells/well/2 ml 10% FBS入りのD-MEM で6 well plateに蒔いた。トランスフェクションは以下の様にして行った。Opti-MEM 30μlにTransIT-LT1 (Mirus)を15μlを混合し、室温で10〜15分間培養した。この間にDNA溶液を調整した。Opti-MEM 20μlに、pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L, pCAGGS-SeV/ΔF-GFPをそれぞれ0.3μg, 0.5μg, 2μg, 2μgに固定し、pCAGGS-FまたはpCAGGS-F5Rを0.1μg, 0.3μg, 0.5μg, 0.7μg, 0.9μgと条件を振って溶解した。10〜15分後にTransIT-LT1溶液とDNA溶液を混合し室温で15分間静置した。この間に細胞の培地を抜いて新しい10% FBS入りのD-MEMを1 ml/wellで静かに添加した。15分後、Opti-MEM (GIBCO) 500μlをDNA-TransIT-LT1 混合物に加え、全量を細胞に添加して培養した。37℃, 5% CO2下で72時間培養後、培養液を捨て、トリプシン 7.5μg/ml を含む(血清を含まない)MEM(以下Try-MEM)に1×106 cells/ mlになるように懸濁したLLC-MK2/F7/A細胞を1 ml/well で重層し、37℃, 5%CO2下で培養した。それから24時間後に培養液1 mlを回収し、新しいTry-MEMを1ml加え、37℃, 5%CO2下で培養した。48時間後に培養液1 mlを回収し、新しいTry-MEMを1ml加え、37℃, 5%CO2下で培養した。72時間後に培養液1 mlを回収した。回収した培養液は、7.5% BSAを133μl 加え(最終濃度1% BSA)、CIUを測定するまで-80℃で保存した。全てのサンプルを回収後にCIU アッセイを行った。その結果、pCAGGS-Fは0.7μgの時が最も再構成効率が良く、重層24時間目、48時間目、72時間目でそれぞれ0 CIU/ml, 7.9×102 CIU/ml, 3.3×104 CIU/mlのウイルスベクターを含んでいた。一方で、pCAGGS-F5Rを使用した場合は、0.5μgの時が最も良く重層24時間目、48時間目、72時間目でそれぞれ3.2×104 CIU/ml, 5.7×105 CIU/ml, 1.2×107 CIU/mlのウイルスベクターを含んでいた。両者で再構成効率が最も良かった条件で比較してみると、pCAGGS-F5Rを使用する場合の方がpCAGGS-Fを使用する場合よりも再構成効率がはるかによく、重層72時間目で373倍高いウイルスベクターを得ることが出来た(図14)。
・pCAGGS-T7を使用したセンダイウイルスベクターの回収方法(以下pCAGGS-T7法とする)
5−1[伝播型SeVベクターの回収]
トランスフェクションする前日に各細胞を6 well plateに蒔いた(293T 細胞:1×106 cells/well/2 ml 10% FBS入りのD-MEM、LLC-MK2細胞:5.0×105 cells/well/2 ml 10% FBS入りのD-MEM、BHK-21細胞:2.5×105 cells/well/2 ml 10% FBS入りのD-MEM、BHK/T7細胞:2.5×105 cells/well/2 ml 10% FBS入りのD-MEM)。トランスフェクションは以下の様にして行った。Opti-MEM 30μlにTransIT-LT1 (Mirus) 15μlを混合し、室温で10〜15分間培養した。この間にDNA溶液を調整した。Opti-MEM 20μlにpCAGGS-T7, pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pSeV(TDK)18+GFPをそれぞれ 0.5μg, 0.5μg, 0.5μg, 2μg, 5μgで溶解した。10〜15分後にTransIT-LT1溶液とDNA溶液を混合し室温で15分間静置した。この間に細胞の培地を抜いて新しい10% FBS入りのD-MEMを1 ml/wellで静かに添加した。15分後、Opti-MEM (GIBCO) 500μlをDNA-TransIT-LT1 混合物に加え、全量を細胞に添加して培養した。37℃, 5% CO2下で3日間培養した。このとき、GFP陽性細胞の数をカウントした結果、293T細胞で246個、LLC-MK2細胞で16個、BHK-21細胞で288個、BHK/T7細胞で405個であった。その後、培養液を捨て、PBS(-) 1 mlを細胞に添加し、セルスクレーパーで剥がし、エッペンドルフチューブに回収した。1回凍結融解をした後に、希釈しない細胞懸濁液とPBS(-)で10倍、100倍、1000倍希釈した細胞懸濁液100μlを10日鶏卵にそれぞれ接種した。孵卵機にて35℃で3日間培養した。その後、尿液を回収し、HA アッセイを行った。その結果、希釈しない293T細胞、BHK-21細胞、BHK/T7細胞懸濁液を接種した鶏卵でウイルスの増殖を確認出来た(図15)。
293T 細胞をトランスフェクションする前日に 1×106 cells/well/2 ml 10% FBS入りのD-MEM で6 well plateに蒔いた。トランスフェクションは以下の様にして行った。Opti-MEM 30μlにTransIT-LT1 (Mirus) を15μlを混合し、室温で10〜15分間培養した。この間にDNA溶液を調整した。Opti-MEM 20μlにpCAGGS-T7, pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-F5R, pSeV/ΔF-GFP (WO00/70070) をそれぞれ 0.5μg, 0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 0.5〜5μgで溶解した。10〜15分後にTransIT-LT1溶液とDNA溶液を混合し室温で15分間静置した。この間に細胞の培地を抜いて新しい10% FBS入りのD-MEMを1ml/wellで静かに添加した。15分後、Opti-MEM (GIBCO) 500μlをDNA-TransIT-LT1 混合物に加え、全量を細胞に添加して培養した。37℃, 5% CO2 下で72時間培養後、培養液を捨て、Try-MEMに1×106 cells/ mlになるように懸濁したLLC-MK2/F7/A細胞を1ml/well で重層し、37℃, 5% CO2 下で培養した。それから24時間後に培養液1 mlを回収し、新しいTry-MEMを1ml加え、37℃, 5% CO2下で培養した。48時間後に培養液1 mlを回収し、新しいTry-MEMを1ml加え、37℃, 5% CO2下で培養した。72時間後に培養液1 mlを回収した。回収した培養液は、7.5% BSAを133μl 加え(最終濃度1% BSA)、CIUを測定するまで-80℃で保存した。
CIUアッセイの2〜3日前にLLC-MK2 細胞を12 well-plateに蒔いた。2日前の場合は1.5×105 cells/wellの割合で、10% FBS入りのMEM 1ml/wellで蒔き、3日前の場合は、8.0×104 cells/wellの割合で、10% FBS入りのMEM 1ml/wellで蒔いた。CIUアッセイの当日に血清を含まない MEM で 1 回洗浄した後、重層後24、48、72時間目に回収した培養液の1/10希釈系列をMEM 培地で作製し、37℃1時間感染後、MEM培地で一回洗浄し、MEM 培地 1 ml を添加した。37℃で2日培養後、細胞を蛍光顕微鏡で観察し、適度な希釈のウェルのGFP陽性細胞の数を数えた。その結果、重層72時間後に、1×106 〜 1×107 GFP-CIU/mlのウイルスベクターが回収された(図16)。
このpCAGGS-T7法はプラスミドの導入細胞に293T細胞を使用した時は、リン酸カルシウム法によってもSeV18+GFP/ΔFの回収に成功した。効率は、TransIT-LT1と同等以上であった(図17)。
pCAGGS-T7法が293T以外の細胞でもセンダイウイルスベクターの回収が出来るかどうかを検討するために、LLC-MK2, BHK-21, BHK/T7, 293T細胞で回収することが出来るかを試みた。各細胞をトランスフェクションする前日に 6 well plateに蒔いた(LLC-MK細胞:5×105 cells/well, BHK-21細胞:2.5×105 cells/well, BHK/T7細胞:2.5×105 cells/well, 293T細胞:1.0×106 cells/well)。トランスフェクションは以下の様にして行った。Opti-MEM 30μlにTransIT-LT1(Mirus)を15μlを混合し、室温で10〜15分間培養した。この間にDNA溶液を調整した。Opti-MEM 20μlにpCAGGS-T7, pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-F5R, pSeV/ΔF-GFPをそれぞれ 0.5μg, 0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 2μgで溶解した(ただし、BHK/T7細胞を使用する時はpCAGGS-T7は添加していない)。10〜15分後にTransIT-LT1溶液とDNA溶液を混合し室温で15分間静置した。この間に細胞の培地を抜いて新しい10% FBS入りのD-MEMを1ml/wellで静かに添加した。15分後、Opti-MEM (GIBCO) 500μlをDNA-TransIT-LT1 混合物に加え、全量を細胞に添加して培養した。37℃, 5% CO2下で72時間培養後、培養液を捨て、Try-MEMに1×106 cells/mlになるように懸濁したLLC-MK2/F7/A細胞を1 ml/well で重層し、37℃, 5% CO2下で培養した。それから24時間後に培養液1 mlを回収し、新しいTry-MEMを1ml加え、37℃, 5% CO2下で培養した。48時間後に培養液1 mlを回収し、新しいTry-MEMを1ml加え、37℃, 5% CO2下で培養した。72時間後に培養液1 mlを回収した。回収した培養液は、7.5% BSAを133μl 加え(最終濃度1% BSA)、CIUを測定するまで-80℃で保存した。n=3で行った。その結果、テストした全ての細胞種からベクターが回収された。ベクターの回収効率はBHK/T7細胞>BHK-21細胞>293T細胞>LLC-MK2細胞の順であった(図18)。また、BHK/T7発現株にはpCAGGS-T7はトランスフェクションしていないことから、T7発現株においてCAプロモーターを使用しても、F欠失型SeV/ΔF-GFPの回収が可能であることが示された。
293T 細胞をトランスフェクションする前日に 1×106 cells/well/2 ml 10% FBS入りのD-MEM で6 well plateに蒔いた。トランスフェクションは以下の様にして行った。Opti-MEM 30μlにTransIT-LT1 (Mirus) を15μlを混合し、室温で10〜15分間培養した。この間にDNA溶液を調整した。Opti-MEM 20μlにpCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-F5R, pCAGGS-SeV/ΔF-GFPをそれぞれ 0.3μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 5μgで溶解した。10〜15分後にTransIT-LT1溶液とDNA溶液を混合し室温で15分間静置した。この間に細胞の培地を抜いて新しい10% FBS入りのD-MEMを1 ml/wellで静かに添加した。15分後、Opti-MEM (GIBCO) 500μlをDNA-TransIT-LT1 混合物に加え、全量を細胞に添加して培養した。37℃, 5% CO2 下で72時間培養後、培養液を捨て、トリプシン 7.5μg/ml を含む(血清を含まない)MEM(以下Try-MEM)に1×106 cells/ mlになるように懸濁したLLC-MK2/F7/A細胞を1 ml/well で重層し、37℃, 5% CO2下で培養した。それから24時間後に培養液1 mlを回収し、新しいTry-MEMを1ml加え、37℃, 5% CO2下で培養した。48時間後に培養液1 mlを回収し、新しいTry-MEMを1ml加え、37℃, 5% CO2下で培養した。72時間後に培養液1 mlを回収した。回収した培養液は、7.5% BSAを133μl 加え(最終濃度1% BSA)、CIUを測定するまで-80℃で保存した。
pCAGGS-T7法によるM遺伝子欠失型センダイウイルスベクター(SeV/ΔM)、およびMF両遺伝子欠失型センダイウイルスベクタ一(SeV/ΔMΔF-GFP)の再構成を行った。
・SeV/ΔMベクターの再構成
293T細胞をトランスフェクションする前日に 1×106 cells/well/2 ml 10%FBS入りのD-MEMで6well plateに蒔いた。トランスフェクションは以下の様にして行った。Opti-MEM 30μlにTransIT-LT1 (Mirus) を15μlを混合し、室温でl0〜15分間培養した。この間にDNA溶液を調整した。Opti-MEM 20μlに、pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-M, pCAGGS-T7, pSeV/ΔM-GFPをそれぞれ 0.5μg, 0.5μg, 2μg, 1.0μg, 0.5μg, 5μgで溶解した。10〜15分後にTransIT-LT1溶液とDNA溶液を混合し、室温で15分間静置した。この間に細胞の培地を抜いて、新しい10% FBS入りのD-MEMを 1 ml/well で静かに添加した。15分後、Opti-MEM (GIBCO) 500μlをDNA-TransIT-LT1混合物に加え、全量を細胞に添加して培養した。37℃, 5% CO2下で72時間培養後、培養液を捨て、トリプシン 7.5μg/ml を含む (血清を含まない) MEM (以下Try-MEM) に1×106 cells/ml になるように懸濁したセンダイウイルスのM遺伝子とF遺伝子の両方を発現するLLC-MK2細胞 (以下LLC-M/Fとする) を 1 ml/wellで重層し、37℃、5%CO2下で培養した。重層後3日間は毎日培地を新しいTry-MEMと交換した。その後は2〜3日毎に交換した。トランスフェクション後9日目に培養液を新しいLLC-MK2-M/F細胞に添加し、32℃、5%CO2下で9日間培養した (2〜3日毎に培地交換した)。その上清を新しいLLC-MK2-M/F細胞に添加し、同様に4日間培養した。この培養上清中には5.4×108 CIU/mlのSeV/ΔM-GFPベクターが存在していることを確認した。トランスフェクション後4日間培養した細胞(P0d4)、一回目の継代後7日間培養した細胞(P1d7)、二回目の継代後4日間培養した細胞(P2d4)のベクター感染細胞の広がりをGFPの蛍光で観察した結果を図20に示した。
293T細胞をトランスフェクションする前日に1×106 cells/well/2ml 10%FBS入りのD-MEMで6 well plateに蒔いた。トランスフェクションは以下の様にして行った。Opti-MEM 30μlにTransIT-LT1 (Mirus) 15μlを混合し、室温で10〜15分間培養した。この間にDNA溶液を調整した。Opti-MEM 20μlに、pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-F5R, pCAGGS-M, pCAGGS-T7, pSeV/ΔMΔF-GFPをそれぞれ 0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 1.0μg, 0.5μg, 5μgで溶解した。10〜15分後にTransIT-LT1溶液とDNA溶液を混合し室温で15分間静置した。この間に細胞の培地を抜いて新しい10% FBS入りのD-MEMを1ml/wellで静かに添加した。15分後、Opti-MEM (GIBCO) 500μlを DNA-TransIT-LT1混合物に加え、全量を細胞に添加して培養した。37℃, 5%CO2下で72時間培養後、培養液を捨て、トリプシン 7.5μg/mlを含む (血清を含まない) MEM (以下Try-MEM) に1×106cells/mlになるように懸濁したLLC-M/Fを 1 ml/wellで重層し、37℃、5%CO2下で培養した。重層後3日間は毎日培地を新しいTry-MEMと交換した。その後は2〜3日毎に交換した。トランスフェクション後9日目に培養液を新しいLLC-M/F細胞に添加し、32℃、5% CO2下で9日間培養した (2〜3日毎に培地交換した)。その上清を新しいLLC-M/F細胞に添加し、同様に4日間培養した。さらに、その上清を新しいLLC-M/F細胞に添加し、同様に3日間培養した。この培養上清中には4.6×107 CIU/mlのSeV/ΔMΔF-GFPベクターが存在していることを確認した。トランスフェクション後4日間培養した細胞(P0d4)、一回目の継代後9日間培養した細胞(P1d9)、二回目の継代後4日間培養した細胞(P2d4)、三回目の継代後3日間培養した細胞(P3d3)のベクター感染細胞の広がりをGFPの蛍光で観察した結果を図21に示した。
CMVプロモーターとCAプロモーターの比較のために、CMVプロモ一ター支配下のNP, P, L, F5R, T7 RNA polymeraseをpCl-neo (Promega) に搭載した(それぞれpCl-neo-NP, pCl-neo-P4C(-), pCl-neo-L(TDK), pCl-neo-F5R, および pCl-neo-T7)。293T細胞をトランスフェクションする前日に、1×106 cells/well/2ml 10%FBS入りのD-MEMで6 well plateに蒔いた。トランスフェクションは以下の様にして行った。Opti-MEM 30μlにTransIT-LT1 (Mirus) 15μlを混合し、室温で10〜15分間培養した。この間にDNA溶液を調整した。CAプロモーター (pCAGGSプラスミド) を使用する場合は、Opti-MEM 20μlに、pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-F5R, pCAGGS-T7, pSeV/ΔF-GFPをそれぞれ 0.5μg, 0.5μg, 2μg, 0.5μg, 0.5μg, 5μgで溶解した。CMVプロモーター (pCl-neo) を使用する場合は、Opti-MEM 20μlにpCl-neo-NP, pCl-neo-P4C(-), pCl-neo-L(TDK), pCl-neo-F5R, pCl-neo-T7, pSeV/ΔF-GFPをそれぞれ 0.5μg, 0.5μg, 5μg, 0.5μg, 1μg, 5μgで溶解した。10〜15分後にTransIT-LT1溶液とDNA溶液を混合し室温で15分間静置した。この間に細胞の培地を抜いて新しい10% FBS入りのD-MEMを1 ml/wellで静かに添加した。15分後、Opti-MEM (GIBCO) 500μlをDNA-TransIT-LT1混合物に加え、全量を細胞に添加して培養した。37℃, 5% CO2下で72時間培養後、培養液を捨て、トリプシン 7.5μg/mlを含む (血清を含まない) MEM (以下Try-MEM) に1×106 cells/mlになるように懸濁したLLC-MK2/F7/A細胞を1 ml/well で重層し、37℃, 5% CO2下で培養した。それから24時間後に培養液 1 mlを回収し、新しいTry-MEMを 1 ml加え、37℃, 5% CO2下で培養した。48時間後に培養液 1 mlを回収し、新しいTry-MEMを 1 ml加え、37℃, 5%CO2下で培養した。72時間後に培養液 1 mlを回収した。回収した培養液は、7.5% BSAを133μl加え (最終濃度 1%BSA)、CIUを測定するまで-80℃で保存した。
また、CMVプロモーター支配下の遺伝子とCAプロモーター支配下の遺伝子の組み合わせでの検討を行ったところ、ヘルパープラスミドの全てをCAプロモーターでドライブする方がCMVとCAの組み合わせよりもベクターの回収効率ははるかに良かった。
Claims (13)
- センダイウイルス生産細胞において、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターを含むプロモーターの制御下にリボザイムとセンダイウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖とをコードするDNAが連結されたDNAを転写させる工程、および、該ゲノムRNAとリボヌクレオプロテインを形成するセンダイウイルス蛋白質の発現を、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターを含むプロモーターにより誘導する工程を含み、該リボザイムは、転写産物を該リボザイムとゲノムRNAまたはその相補鎖との間で切断する活性を有する、センダイウイルスベクターの製造方法。
- 該リボザイムがハンマーヘッドリボザイムである、請求項1に記載の方法。
- 該ゲノムRNAとリボヌクレオプロテインを形成するセンダイウイルス蛋白質が、センダイウイルスのN(ヌクレオキャプシド)、P(ホスホ)、およびL(ラージ)蛋白質である、請求項1または2に記載の方法。
- 該ゲノムRNAまたはその相補鎖が、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の1つまたは複数を欠損しており、エンベロープ構成蛋白質をコードするDNAを、該細胞において発現させる工程をさらに含む、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- (a)サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターを含むプロモーターの制御下に、リボザイムとセンダイウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖とをコードするDNAが連結されたDNAであって、該リボザイムは、転写産物を該リボザイムとセンダイウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖との間で切断する活性を有するDNA、および(b)サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターを含むプロモーターの制御下に連結された、該ゲノムRNAとリボヌクレオプロテインを形成するセンダイウイルス蛋白質をコードするDNA、を含むセンダイウイルス生産用キット。
- 該ゲノムRNAまたはその相補鎖が、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の1つまたは複数を欠損している、請求項5に記載のキット。
- 該ゲノムRNAとリボヌクレオプロテインを形成するセンダイウイルス蛋白質が、センダイウイルスのN(ヌクレオキャプシド)、P(ホスホ)、およびL(ラージ)蛋白質である、請求項5または6に記載のキット。
- リコンビナーゼにより該ゲノムRNAまたはその相補鎖を発現誘導可能である、請求項5から7のいずれかに記載のキット。
- 該リコンビナーゼがCreまたはFlpである、請求項8に記載のキット。
- (a)サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターを含むプロモーターの制御下に、リボザイムとセンダイウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖とをコードするDNAが連結されたDNAであって、該リボザイムは、転写産物を該リボザイムとセンダイウイルスのゲノムRNAまたはその相補鎖との間で切断する活性を有するDNA、および(b)サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターを含むプロモーターの制御下に連結された、該ゲノムRNAとリボヌクレオプロテインを形成するセンダイウイルス蛋白質をコードするDNA、を保持する哺乳動物細胞。
- センダイウイルス生産用細胞である、請求項10に記載の哺乳動物細胞。
- 該ゲノムRNAまたはその相補鎖が、エンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子の1つまたは複数を欠損している、請求項10または11に記載の哺乳動物細胞。
- 該ゲノムRNAとリボヌクレオプロテインを形成するセンダイウイルス蛋白質が、センダイウイルスのN(ヌクレオキャプシド)、P(ホスホ)、およびL(ラージ)蛋白質である、請求項10から12のいずれかに記載の哺乳動物細胞。
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