JP2824434B2

JP2824434B2 - 新規発現ベクター

Info

Publication number: JP2824434B2
Application number: JP30978589A
Authority: JP
Inventors: 純一宮崎; 研一山村; 正健荒木; 福三郎濱田
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1989-11-28
Filing date: 1989-11-28
Publication date: 1998-11-11
Anticipated expiration: 2013-11-11
Also published as: JPH03168087A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモータ
ーを一部改良したハイブリッドプロモーターを有する外
来遺伝子の高発現を目的とした新規発現ベクターに関す
る。

発明の背景および従来技術遺伝子組換え技術の進歩に伴って、遺伝子組換えを利
用した有用物質の生産は近年急速に進歩してきている。
遺伝子組換え技術を利用して外来遺伝子を発現させる場
合には、適当な宿主細胞と、これに応じた外来遺伝子発
現用プロモーターを有する発現ベクターが用いられる。
これまでは、大腸菌や酵母等の取扱いが容易な微生物が
発現の宿主細胞として広く研究されてきたが、このよう
な微生物では外来遺伝子の発現において一部に限界があ
ることが確認されてきており、近年では高等動物培養細
胞等の動物細胞を発現宿主細胞とした発現系が盛んに研
究されてきている。

これまでに知られている動物細胞を宿主とした発現系
としては、多くの動物ウイルス遺伝子プロモーターおよ
び動物細胞遺伝子プロモーターを用いた系が報告されて
いる。前者の例として、SV40遺伝子プロモーター、アデ
ノウイルス主要後期遺伝子プロモーター、Ｂ型肝炎ウイ
ルス遺伝子プロモーター等が使用されている。また、後
者の例としてはチミジンキナーゼ（tK）遺伝子プロモー
ター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、インター
フェロン遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プ
ロモーター等が使用されている。

上記プロモーターの中では、特にSV40初期遺伝子プロ
モーター、SV40後期遺伝子プロモーターおよびアデノウ
イルス主要後期遺伝子プロモーターが強力なプロモータ
ー活性を有するとされているが、工業的生産に用いられ
るほど生産性が充分ではなく、さらに強力なプロモータ
ー並びに高発現ベクターの開発が求められている。

このような状況において、先に本発明者らは、ニワト
リのβ−アクチン遺伝子プロモーターを用いて外来遺伝
子発現用ベクターを構築し、これに種々の外来遺伝子を
組み込んでその成果を調べたところ、いずれの外来遺伝
子を組み込んだ場合にも目的遺伝子産物を従来プロモー
ターより非常に高く発現させることが可能であることを
見いだした（特願昭63−157579号）。このニワトリのβ
−アクチン遺伝子プロモーターを用いたベクターは、こ
れまでによく知られているSV40初期プロモーターを利用
したベクターと比較して、少なくとも５〜10倍の発現量
が期待でき、しかもマウス由来細胞（例えばＬ細胞）の
みならず、ハムスター由来細胞（CHO細胞等）、アフリ
カミドリザル由来細胞（COS細胞等）や他の動物細胞に
おいても同様に強力なプロモーター活性を有することが
先に本発明者らにより確認されている。

さらに、本発明者らは、ニワトリβ−アクチン遺伝子
プロモーターを用いた研究を進め、このプロモーターを
一部改良することによりさらに有効なプロモーターおよ
びこれを用いたベクターを開発することに成功し特許出
願した（特願昭63−312444号）。すなわち、本発明者ら
は、ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターと他の
遺伝子とを融合させることにより、本来のニワトリのβ
−アクチンプロモーターよりさらにプロモーター活性の
高い新規プロモーターを得ることに成功した。

発明の目的本発明者らは、上記の発明で得られた知見を基に、外
来遺伝子の高発現を目的として、さらに有効な発現ベク
ターの開発を進めた結果、極めて有効な発現ベクターを
開発した。そのベクターとは、ニワトリのβ−アクチン
遺伝子プロモーターの一部の塩基配列をウサギのβ−グ
ロビン由来の遺伝子に置き換えたハイブリッドプロモー
ターを有し、さらにターミネーター配列を外来遺伝子発
現用の制御配列として有することを特長とする発現ベク
ターである。

すなわち、本発明は動物細胞を用いた発現系において
外来遺伝子を高発現させることが可能な、これまでにな
い強力な新規発現ベクターを提供することを目的とす
る。

発明の構成および効果本発明の中で用いられるニワトリβ−アクチン遺伝子
プロモーターの塩基配列については、先にT.A.Kostらに
よって報告されている。（Nucleic Acids Research 11,
No.23,8287−8286,1983）。

本発明に用いられるニワトリのβ−アクチン遺伝子プ
ロモーターは、全体的にＧ（グアニン）Ｃ（シトシン）
含量が高く、TATAボックス（ANN RES BIOCHEM,50,349−
383,1981）やCCAATボックス（NUCLECI ACDS RES,８,127
−142,1980）などプロモーターに特徴的な配列が備わっ
ている遺伝子断片である。

ニワトリのβ−アクチンプロモーターにおいては、本
来のβ−アクチン構造遺伝子の翻訳開始コドン（ATG）
の上流−909の位置のＧ（グアニン）から−７の位置の
Ｇ（グアニン）までのDNA領域はメッセンジャーRNAに転
写された後で、削除（スプライス）される遺伝子領域
（イントロン）と考えられる。

本発明の発現ベクターに使用されるβ−アクチンハイ
ブリッドプロモーターには、ニワトリのβ−アクチンプ
ロモーターのイントロン領域の途中からその下流（３′
端側）のスプライシングアクセプター配列を含めた遺伝
子をすべて除去し、これにスプライシングアクセプター
配列を含むウサギのβ−グロビン遺伝子を接続したこと
を特徴とするハイブリッドプロモーターが用いられる。
このようなスプライシングアクセプター配列を有するウ
サギβ−グロビン遺伝子とは、例えば、ウサギのβ−グ
ロビン構造遺伝子に含まれるスプライシングアクセプタ
ー配列を有する遺伝子断片が使用される。このようにニ
ワトリのβ−アクチンプロモーターのスプライシングア
クセプター配列をウサギβ−グロビン遺伝子に変換する
ことにより、ニワトリのβ−アクチンプロモーターが持
つ本来のプロモーター活性よりさらに活性が上昇する。

ウサギβ−グロビン遺伝子をニワトリのβ−アクチン
プロモーターに融合させる場合には、β−アクチンプロ
モーターのイントロン領域の途中から、その下流のβ−
アクチンプロモーター遺伝子を除去し、これにスプライ
シングアクセプター配列を含むウサギβ−グロビン遺伝
子を融合させるが、融合させる具体的な部位としては、
β−アクチンプロモーター配列中のMbo II部位がその好
ましい部位として挙げられる。

本発明の発現ベクターの基本的な構造としては、上述
のニワトリのβ−アクチンハイブリッドプロモーターを
有し、該プロモーター下流に外来遺伝子を組み込むこと
が可能な適当な制限酵素切断部位を有する。このような
制限酵素切断部位は、ひとつの制限酵素による認識部位
があれば足りるが、種々の外来遺伝子を組み込み易くす
るために２つ以上の制限酵素による認識部位を有するこ
とも可能である。また、本発明の発現ベクターには目的
の外来遺伝子を組み込む部位の下流にターミネーター
（ポリアデニレーション配列）が組み込まれる。このタ
ーミネーター配列の例としては、SV40由来の遺伝子、ウ
サギβ−グロビン由来の遺伝子等が使用されるが、特に
ウサギβ−グロビン由来のターミネーター配列を組み込
むことが好ましい。また、本発明に従えば、使用する宿
主細胞に応じて、さらにエンハンサー配列が組み込まれ
る。このようなエンハンサー配列は、上記ハイブリッド
プロモーターの上流に組み込まれる。このようなエンハ
ンサー配列としては、特にサイトメガロウイルス由来の
エンハンサー配列を使用することが望ましい。このサイ
トメガロウイルス由来のエンハンサーは、特にマウスＬ
細胞等を発現の宿主細胞として使用する場合に有効であ
る。

さらに形質転換動物細胞をクローニングするために適
当なマーカー遺伝子を組み込むことが好ましい。

また、このような本発明の発現ベクターは、大腸菌で
のクローニングを行い易くするために大腸菌プラスミド
由来の遺伝子を有する。そのような大腸菌プラスミド由
来遺伝子としては、大腸菌体内で複製するためのori、
並びにクローニングの際に選択マーカーとなりうる適当
な遺伝子、例えばアンピシリンや、テトラサイクリン等
に対する薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、このよう
な遺伝子としてプラスミドpBR322由来の遺伝子を組み込
む場合には、pBR322複製開始点（ori）の近くにある、
宿主細胞での複製を阻害する毒性配列を除去することが
好ましい。

また、目的の外来遺伝子を発現させる宿主細胞として
SV40のラージＴ抗原を産生する細胞、例えばCOS（アフ
リカミドリザル腎臓由来）細胞を用いる場合には、上記
の発現ベクターに動物細胞内で機能する複製開始点（例
えばSV40 ori）を組み込むことによりさらに効率よく外
来遺伝子を発現させることが可能となる。

さらに、外来遺伝子の発現効率を上げるためには、ジ
ヒドロ葉酸還元化酵素（DHFR）遺伝子を本発明の発現ベ
クターに組み込むことも可能であり、または、形質転換
の際にDHFR発現プラスミドと共に形質転換することもで
きる。この場合には、宿主細胞としてはDHFR遺伝子欠損
細胞を用いることが望ましく、培地中にメトトレキセー
トを添加することで形質転換体内の遺伝子を増幅させ、
より高い発現量を得ることが可能となる。このようなDH
FR遺伝子を用いた発現効率アップの手法は、すでに知ら
れている手法であるが、本発明の発現ベクターに応用す
れば、飛躍的に発現効率を向上させることが可能とな
る。

β−アクチンは多種の動物細胞に存在することから、
β−アクチンプロモーターを利用している本発現系は高
能率であるばかりでなく、宿主域が広く、従って産業上
の有用性がきわめて高い発現系であるといえる。

本発明の動物細胞用発現ベクターは、これまでにない
極めて高発現が可能な動物細胞用発現ベクターであり、
工業的レベルの生産においても十分利用可能な新規な外
来遺伝子発現系を提供するものである。

以下、本発明のハイブリッドプロモーターを用いた発
現ベクターが実際に非常に有用であることを示す一例と
して大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子並びにＢ型肝
炎ウイルス表面抗原（HBsAg）遺伝子を用いて、下記の
調製例、実施例に沿って本発明をさらに詳細に説明す
る。調製例では、比較実験の為の本来のニワトリβ−ア
クチン遺伝子プロモーターを用いた発現ベクターの構築
およびハイブリッドプロモーターを用いた発現ベクター
の構築、そして実施例では、本発明の新規発現ベクター
の構築ならびにその応用例を示す。

実施例中のファージ、プラスミド、DNA、種々の酵
素、大腸菌、培養細胞などを扱う諸操作は以下にあげる
雑誌、成書を参考とした。

1.遺伝子操作実験法、高木康敬、編著（1980）、講談社 2.遺伝子操作マニュアル、高木康敬、編著（1982）、講
談社 3.MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL.T.MANIATIS
ら編、（1982）、COLD SPRING HARBOR LABORATORY. 4.METHODS IN ENZYMOLOGY、65巻、L.GROSSMAN、ら編、
（1980）、ACADEMIC PRESS 実施例中には次の略号を用いた。

CAT:クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラ
ーゼ lacZ:β−ガラクトシダーゼ（β−gal）構造遺伝子調製例（１）：ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモータ
ー領域の調製ニワトリのβ−アクチン遺伝子の第１エクソン、第１
イントロン及び第２エクソンの一部と、それに融合した
形で続くCAT遺伝子を有するプラスミドpAZ1037［NATUR
E,314,P286〜289（1985）］を制限酵素Nco I（NEB ＃19
3）で消化した。本発明においては、発現ベクターとし
て使用する際にニワトリβ−アクチン遺伝子の第１イン
トロンと第２エクソンの間のスプライス部位が正確に機
能することを目的として以下の操作を行った。

すなわち、Nco I消化後のDNAを修飾酵素S1ヌクレアー
ゼ（タカラ＃2410A）で処理し、５′末端突出部位及び
そのとなりの１塩基対のみを削除した。この反応は、30
mM酢酸ナトリウム,pH4.6,100mM NaCl,1mM ZnSO₄溶液80
μ中、サンプルDNA10μｇをS1ヌクレアーゼ150単位を
用い、37℃で１〜４分間行った。

このようにしてDNAをS1ヌクレアーゼで処理した後、
修飾酵素T4 DNAポリメラーゼ（タカラ＃2040A）を作用
させて一本鎖DNA部分を修飾し、５′末端がリン酸化さ
れた合成DNA pCCAAGCTTGG（pHind IIIリンカー、NEB ＃
1050）と共に、T4 DNAリガーゼ（タカラ＃2011A）を用
いて連結環状化した。得られたDNA溶液で大腸菌HB101株
を形質転換し、単一のコロニーを分離した後、形質転換
体中のプラスミドDNAを回収し、制限酵素Hind III（NEB
＃104）およびNar I（NEB＃191）で消化し、６％アクリ
ルアミドゲル電気泳動を行い、適当なサイズのDNA断片
が検出されたクローンをまず選択し、そのDNA断片をフ
ァージベクターM13mp19（NEB＃400−19）のSal I−Kpn
I部位にクローニングし、Hind III部位付近の塩基配列
をジデオキシ法（PRO N A S,74,5463−5467,1977））に
より決定し、目的とするクローンのスクリーニングを行
った。

このようにして得られたプラスミドクローンP28は、
本来のニワトリβ−アクチン遺伝子のスプライシング部
位から構造遺伝子にかけての塩基配列を保持しており、
かつ開始コドンATGを含めてその３′側の遺伝子（構造
遺伝子を含む）が除去され、新たにHind III部位が導入
されている。

調製例（２）：ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモータ
ーを組み込んだ発現ベクターpAc−２の構築 SV40初期転写のスプライシング部位及びポリアデニレ
ーションシグナルを含むプラスミドpSV2−cat［Mol.Cel
l Biology,2,p1044−1051（1982）］を制限酵素Mfl I
（タカラ＃1070A）で消化し、T4DNAポリメラーゼで末端
を修復した後、リン酸化したHind IIIリンカーをT4 DNA
リガーゼによって結合させた。これをさらにHind III及
びBamH I（NEB＃136）で消化し、６％アクリルアミドゲ
ル電気泳動を行って約900bpのHind III−BamH I断片を
抽出した。次に（１）で構築したp28を制限酵素Hind II
I及びBamH Iで消化し、仔牛小腸由来アルカリホスファ
ターゼ（タカラ＃2250A）の作用により脱リン酸化し
た。これと前述した約900bpのHind III−BamH I断片
を、T4 DNAリガーゼで連結環状化し、プラスミドpAc−
２を得た。

調製例（３）：β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドpA
c−lacZの構築 β−ガラクトシダーゼをコードしているlacZ遺伝子全
領域を含むプラスミドpCH110〔ファルマシア＃27−4508
−01〕を制限酵素Hind III及びBamH Iで消化し、１％ア
ガロースゲル電気泳動により約3.8kbpのHind III−BamH
Iフラグメントを調製した。なお、このフラグメントの
中には、SV40初期遺伝子転写物のスプライシング部位及
びポリアデニレーション部位も含まれている。

前記（１）で構築したプラスミドp28を、制限酵素Hin
d III及びBamH Iで消化し、仔牛小腸由来アルカリホス
ファターゼを用いて脱リン酸化した。これに上記の処理
により得た約3.8kb Hind III−BamH Iフラグメントを加
えてT4 DNAリガーゼで連結環状化させることによりプラ
スミドpAc−lacZを構築した。

調製例（４）：β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドpA
c−lacZ−Xba Iの構築調製例（２）で使用したプラスミドpSV2−catを制限
酵素Pvu II（タカラ＃1076A）及びHind IIIで消化し、
６％アクリルゲル電気泳動により、SV40初期プロモータ
ーを含む約34bpのPvu II−Hind IIIフラグメントを調製
した。このPvu II−Hind IIIフラグメントの末端をT4 D
NAポリメラーゼで修復し、リン酸化したXba Iリンカー
をT4 DNAリガーゼによって結合させた。制限酵素Xba I
（タカラ＃1093A）で消化した後、６％アクリルゲル電
気泳動により、約350bpのXba I−Xba Iフラグメントを
調製した。次に、プラスミドpSAc−２（特願昭63−1575
69号）を制限酵素Xba IとPst Iで消化し、１％アガロー
スゲル電気泳動により、約1.6kbpのXba I−Pst Iフラグ
メントを調製した。これを、制限酵素Mbo II（NEB＃14
8）で消化し、T4 DNAポリメラーゼで末端を修復した
後、リン酸化したXba IリンカーをT4 DNAリガーゼによ
って結合させた。それから、制限酵素Xho I及びHind II
Iで消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行い、約1.3
kbpのXho I−Hind IIIフラグメントを調製した。

次に、調製例（３）で構築したプラスミドpAc−lacZ
を制限酵素Xho I及びHind IIIで消化し、１％アガロー
スゲル電気泳動により約5.8kbpのXho I−Hind IIIフラ
グメントを調製した。これに、先の約1.3kbp Xho I−Hi
nd IIIフラグメントを混合し、制限酵素Xba Iで消化し
た後、T4 DNAリガーゼで連結環状化させ、プラスミドpA
c−lacZ−Xba Iを構築した。

調製例（５）：ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモータ
ーとウサギβ−グロビン遺伝子とのハイブリッドプロモ
ーターを用いた発現プラスミドpAG−lacZ及びpAG−２の
構築ウサギβ−グロビン遺伝子の第２エクソンの途中から
第３エクソンの途中までを含むプラスミドpKCR［Pro.Na
tl.Acid.Sci.USA,78,1527−1531（1981）］を、制限酵
素Apa I（NEB＃Apa I）で消化し、末端をT4 DNAポリメ
ラーゼで修復した後、リン酸化したXba IリンカーをT4
DNAリガーゼによって結合させた。この後、制限酵素Eco
R Iで消化し、DNAポリメラーゼＩで末端を修復した。pH
ind IIIリンカーをT4DNAリガーゼを用いて結合させ、制
限酵素Xba I及びHind IIIで消化した後、６％アクリル
ゲル電気泳動により、約90bpのXba I−Hind IIIフラグ
メントを調製した。この中には、ウザギβ−グロビン遺
伝子の第２イントロンのスプライスアクセプターサイト
が含まれている。

次に、調製例（４）で構築したプラスミドpAc−lacZ
−Xba Rを、制限酵素Xba I及びHind IIIで消化し、１％
アガロースゲル電気泳動により、約7kbpのXba I−Hind
IIIフラグメントを調製した。これに、先の約90bp Xba
I−Hind IIIフラグメントを混合し、T4 DNAリガーゼに
より連結させ、プラスミドpAG−lacZを構築した。この
プラスミドには、ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモ
ーターとウサギβ−グロビン由来遺伝子とのハイブリッ
ドプロモーターとして、第１図に示した塩基配列を有す
る。

このプラスミドpAG−lacZを、制限酵素Hind III及びB
amH Iで消化し、１％アガロースゲル電気泳動により、
約3.3kbp Hind III−BamH Iフラグメントを調製した。
この約3.3kbp Hind III−BamH Iフラグメントと、実施
例１で調製した約900bp Hind III−BamH Iフラグメント
を混合し、T4 DNAリガーゼを用いて連結させ、プラスミ
ドpAG−２を構築した。

調製例（６）:SV40 oriを有する発現プラスミドpAGS−l
acZ及びpAGS−２の構築調製例（２）で使用したプラスミドpSV2−catを制限
酵素Hpa I（NEB＃105）及びHind IIIで消化し、末端をT
4 DNAポリメラーゼで修復した後、T4 DNAリガーゼでで
連結環状化させ、プラスミドpS−１を調製した。

このプラスミドpS−１を制限酵素Sph Iで消化し、末
端をT4 DNAポリメラーゼで修復した後、リン酸化したBa
mH Iリンカー（NEB＃1021）を添加して、T4 DNAリガー
ゼにより連結環状化させ、プラスミドpS−２を調製し
た。

このプラスミドpS−２を制限酵素BamH Iで消化し、６
％アクリルゲル電気泳動により、約350bp BamH I−BamH
Iフラグメントを得た。この中には、SV40oriと、SV40
初期プロモーターのポリアデニレーションシグナルが含
まれている。

次に、調製例（５）で構築したプラスミドpAG−lacZ
を制限酵素BamH Iで消化し、先の約350bp BamH I−BamH
Iフラグメントを添加して、T4 DNAリガーゼにより連結
環状化させて、プラスミドpAGS−lacZを構築した。

又、調製例（５）で構築したプラスミドpAG−２を制
限酵素BamH Iで消化し、先の約350bp BamH I−BamH Iフ
ラグメントを添加して、T4 DNAリガーゼにより連結環状
化させて、プラスミドpAGS−２を構築した。

実施例1:発現ベクターpAGGの構築調製例（５）で構築したプラスミドpAG−２を制限酵
素Xho I及びEcoR Iで消化し、１％アガロースゲル電気
泳動により約1.3kbpのXho I−EcoR Iフラグメント（フ
ラグメントＡ）を調製した。

次に、調製例（５）で使用したプラスミドpKCRを制限
酵素Bgl IIで部分消化し、末端をT4 DNAポリメラーゼで
修復後、リン酸化したXho IリンカーをT4 DNAリガーゼ
によって結合させた。この後、制限酵素EcoR Iで消化
し、フラグメントＡをT4 DNAリガーゼにより結合させ
た。それから制限酵素Xho Iで消化し、１％アガロース
ゲル電気泳動を行って、約1.8kbpのXho I−EcoR I−Xho
Iフラグメント（フラグメントＢ）を調製した。このフ
ラグメントＢは、ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモー
ターとウサギβ−グロビン遺伝子とのハイブリッドプロ
モーターの下流に、ウサギβ−グロビン遺伝子のポリア
デニレーションシグナルが結合した形になっている。

さらに、クローニング用ベクターとして一般的に使用
されているpUC13［Gene,33,103−119（1985）］を制限
酵素Eco0109 Iで消化し、末端T4 DNAポリメラーゼで修
復した後、リン酸化したXho IリンカーT4 DNAリガーゼ
によって結合させた。それから制限酵素Xho I及びSal I
で消化し、得られた2.2kbpのXho I−Sal Iフラグメント
とフラグメントＢとをT4 DNAリガーゼにより結合させ
た。可能ないくつかのプラスミドの中から、制限酵素Xb
a I及びPvu IIで消化した時に約800bpと約3.3kbpの２本
のバンドが生じるプラスミドを選択することにより発現
ベクターpAGG（第２図参照）を構築した。

実施例2:発現ベクターpCAGGの構築サイトメガロウイルス（CMV）のプロモーター領域を
含むプラスミドpCDM8［フナコシ社製］を制限酵素Hinc
II及びHind IIIで消化し、１％アガロースゲル電気泳動
により約650bpのHinc II−Hind IIIフラグメント（フラ
グメントＣ）を調製した。プラスミドpUC18を制限酵素H
inc II及びHind IIIで消化し、T4 DNAリガーゼによりフ
ラグメントＣを結合させ、プラスミドpUC−CMPを調製し
た。pUC−CMPを制限酵素Nco Iで消化し、末端をT4 DNA
ポリメラーゼで修復した後、リン酸化したSal Iリンカ
ーをT4 DNAリガーゼによって結合させた。それから、制
限酵素Sal Iで消化し、１％アガロールゲル電気泳動に
より約350bpのSal I−Sal Iフラグメント（フラグメン
トＤ）を調製した。このフラグメントＤには、サイトメ
ガロウイルスのエンハンサー領域が含まれている。次
に、実施例（１）で構築したプラスミドpAGGを、制限酵
素Aat IIで消化し、末端をT4 DNAポリメラーゼで平滑に
した後、リン酸化したSal IリンカーをT4 DNAリガーゼ
により結合させた。さらに制限酵素Sal Iで消化した
後、T4 DNAリガーゼによりフラグメントＤを結合させ、
発現ベクターpCAGG（第３図参照）を構築した。

実施例3:発現ベクターpCAGGSの構築調製例（６）で構築したプラスミドpAGS−２を制限酵
素BamH Iで消化し、１％アガロースゲル電気泳動により
約350bpのBamH I−BamH Iフラグメント（フラグメント
Ｅ）を調製した。フラグメントＥには、SV40 oriとSV40
初期転写のポリアデニレーションシグナルが含まれてい
る。

次に、実施例（２）で構築したプラスミドpCAGGを制
限酵素Pvu IIで消化し、リン酸化したBamH Iリンカーを
T4 DNAリガーゼによって結合させた。それから制限酵素
BamH Iで消化し、T4 DNAリガーゼによりフラグメントＥ
を結合させ、発現ベクターpCAGGS（第４図参照）を構築
した。

実施例4:β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドpAGG−la
cZ,pCAGG−lacZ及びpCAGGS−lacZの構築 β−ガラストシダーゼ遺伝子融合ベクターpMC1871
［ファルマシア社製］を制限酵素Sal Iで消化し、１％
アガロースゲル電気泳動により約3.1kbpのSal I−Sal I
フラグメント（フラグメントＦ）を調製した。フラグメ
ントＦには、開始コドン（ATG）を欠いたlacZ遺伝子の
ほぼ全長が含まれている。

次に、実施例（３）で構築したプラスミドpCAGGSを制
限酵素EcoR Iで消化し、末端をT4 DNAポリメラーゼで修
復した後、リン酸化したXho IリンカーをT4 DNAリガー
ゼによって結合させることにより、プラスミドpCAGGS
（Xho I）を調製した。それから、このプラスミドpCAGG
S（Xho I）でを制限酵素Xho I消化し、T4 DNAリガーゼ
によりフラグメントＦを結合させた後、さらに制限酵素
Xba I及びEcoR Vで消化し、１％アガロースゲル電気泳
動を行うことにより約6.3kbpのXba I−EcoR Vフラグメ
ント（フラグメントＧ）を調製した。

調製例（５）で構築したプラスミドpAG−lacZを制限
酵素Xba I及びEcoR Vで消化し、１％アガロースゲル電
気泳動により約1.5kbpのXba I−EcoR Vフラグメント
（フラグメントＨ）を調製した。このフラグメントＨに
は、開始コドン（ATG）を含むlacZ遺伝子の５′末端側
約1.4kbpが含まれている。

このフラグメントＨと、先のフラグメントＧとをT4 D
NAリガーゼで結合させることにより、β−ガラクトシダ
ーゼ発現プラスミドpCAGGS−lacZを構築した。

このプラスミドpCAGGS−1acZを制限酵素Hind IIIで消
化し、１％アガロースゲル電気泳動により約3.6kbpのHi
nd III−Hind IIIフラグメント（フラグメントＩ）を調
製した。このフラグメントＩには、開始コドン（ATG）
を含むlacZ遺伝子全長が含まれている。次に、実施例
（１）で構築したプラスミドpAGGを制限酵素EcoR Iで消
化し、T4 DNAポリメラーゼ処理後、リン酸化したHind I
IIリンカーをT4 DNAリガーゼにより結合させた。それか
ら、制限酵素Hind IIIで消化し、T4 DNAリガーゼを用い
て先のフラグメントＩを結合させることによってβ−ガ
ラクトシダーゼ発現プラスミドpAGG−lacZを構築した。

同様にして、実施例（２）で構築したプラスミドpCAG
Gから、β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCAGG−la
cZを構築した。

実施例5:発現ベクターpCAG−２及びpCAGS−２の構築調製例（５）で構築したプラスミドpAG−２を制限酵
素Xho Iで消化し、これに実施例（２）で調製したフラ
グメントＤを結合させることにより発現ベクターpCAG−
２を構築した。

同様に、調製例（６）で構築したプラスミドpAGS−２
から発現ベクターpCAGS−２（第５図）を構築した。

実施例6:β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCAG−la
cZ及びpCAGS−lacZの構築調製例（５）で構築したプラスミドpAG−lacZを制限
酵素Xho Iで消化し、これに実施例（２）で調製したフ
ラグメントＤを結合させることによりβ−ガラクトシダ
ーゼ発現プラスミドpCAG−lacZを構築した。

同様に、調製例（６）で構築したプラスミドpAGS−la
cZからβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCAGS−lac
Zを構築した。

実施例7:各種発現プラスミドによるβ−ガラクトシダー
ゼの産生 100mm円形シャーレに、COS−細胞又はＬ−細胞１×10
⁶細胞/dishをまき、常法に従いリン酸カルシウム法によ
り種々のプラスミド（pCH110、pAc−lacZ、pAG−lacZ、
pAGS−lacZ、pAGG−lacZ、pAGGS−lacZ、pCAG−lacZ、p
CAGS−lacZ、pCAGG−lacZ、pCAGGS−lacZ）DNA各20μｇ
をこれらの宿主細胞に導入した。

リン酸カルシウム−DNAゲルを細胞と24時間接触させ
た後、更に10％FCS−DMEで24時間培養した。トリプシン
処理により細胞をdishからはがし、低速遠心によりペレ
ッティングした後、Ｆ−T buffer（250mMショ糖、10mMT
ris・HCl、pH7.5、10mM EDTA）200μに懸濁し、凍結
融解を３回繰り返した後遠心し、上清を回収した。

このようにして得られた細胞抽出液200μから10μ
を分取し、β−gal活性の測定に用いた。β−gal活性
は、常法に従い、ONPG（ｏ−NITROPHENYL−β−Ｄ−GAL
ACTOPYRANOSIDE）の発色に伴う420nmの吸光度の変化を
調べることによって行った。その際SV40初期プロモータ
ーを用いたプラスミドpCH110［ファルマシア社製］によ
って形質転換されたCOS−細胞又はＬ−細胞の細胞抽出
液が示した吸光度を１としたときの相対的な値を表１に
示した。

上記の表から明かなように、本願発明の各種新規ベク
ターにlacZ遺伝子を組み込んだプラスミドでは、本来の
ニワトリのβ−アクチンプロモーターを用いたベクター
と比較して、非常に高い発現量を示した。

実施例8:各種新規発現プラスミドによるHBsAgの産生（１）HBsAg発現プラスミドpAG−HBs、pAGG−HBs、pCAG
−HBs、pCAAG−HBs、pAGS−HBs、pAGGS−HBs、pCAGS−H
Bs及びpCAGGS−HBsの構築酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモーターを有
し、酵母を形質転換することによりHBsAgを産生するこ
とのできるプラスミドpAS101（特公昭61−55951）（10
μｇ）をXho I（10u）で37℃４時間反応させ、６％アガ
ロースゲルにて電気泳動させる。HBs遺伝子を含む1.3Kb
のバンドをアガロースゲルから切り出し、透析チューブ
に入れ再び電気泳動させる。ゲル断片からDNAが溶出さ
れたのち、透析チューブよりDNA溶液のみを取り出し、
エタノール沈殿によりDNAを抽出する。抽出したHBs遺伝
子を含むDNA断片１μｇをT4 DNAポリメラーゼ（1u）で3
7℃30分間反応させる。フェノール処理、エタノール沈
澱によりDNAを抽出する。

次に、前述の調製例（５）、（６）及び実施例１〜４
で構築した８種類のプラスミドpAG−２、pA GG、pCAG−
２、pCA GG、pAGS−２、pAG GS、pCAGS及びpCAGGSを、
それぞれ制限酵素Sal Iで消化した後、仔牛小腸由来ア
ルカリフォスターゼの作用により脱リン酸化した。そし
て、それぞれに、先のHBsAg遺伝子を含む約1.3kbpのDNA
断片を添加し、T4DNAリガーゼの作用により連結環状化
することにより、pAG−H Bs、pAGG−H Bs、pCAG−H B
s、pCAGG−H Bs、pAGS−H Bs、pAGGS−H Bs、pCAGS−HB
s及びpCAGGS−HBsを構築した。

また、HBsAgの発現量評価のための参照発現プラスミ
ドpSVES−HBsは以下のごとく構築した。

上記と同様に、プラスミドpAS101を制限酵素Xho Iで
消化し、アクリルアミドゲル電気泳動によりHBsAg遺伝
子を含む約1.3kbpのDNA断片を抽出した。

一方、SV40初期遺伝子プロモーターを持つプラスミド
pKSV−10（ファルマシア）１μｇをBgl II（1u）で37℃
１時間反応させる。フェノール処理、エタノール沈澱に
よりDNAを抽出する。抽出したDNAを上記と同様にT4 DNA
ポリメラーゼ処理を行う。T4DNAポリメラーゼ反応によ
り末端を平滑末端に変換したHBs遺伝子断片500ngとpKSV
−1050ngとをT4 DNAリガーゼ（1u）で４℃、12時間反応
させる。この反応液と大腸菌HB101を形質転換させる。
形質転換体からプラスミドを抽出し、pKSV−10にHBs遺
伝子が挿入されたプラスミドpSVES−HBsを得ることがで
きた。

（２）COS細胞におけるHBsAgの発現ファルコン細胞培養６穴プレートに、１×10⁵細胞／
穴のCOS−細胞をまき、常法通りDEAE−Dextran法により
下記プラスミドDNA各５μｇを導入した。Cell Phect Tr
ansfection Kit（ファルマシア社製）を用いて、DNA導
入後３日後の培養上清を分取し、HBsAg検出キット「オ
ーストリアII」（ダイナボット社製）を用いてHBsAg活
性を測定した（表２）。

その結果、本発明において構築した新規発現プラスミ
ドは、いずれも、SV初期遺伝子プロモーターを用いたpS
VE−HBsよりも高いHBsAg活性を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、調製例で構築したpAG−２が有するニワトリ
のβ−アクチンプロモーターとウサギのβ−グロビン遺
伝子とのハイブリッドプロモーターの塩基配列を示す。第２図は、本発明の新規ベクターpAGGの構造を示す。第３図は、本発明の新規ベクターpCAGGの構造を示す。第４図は、本発明の新規ベクターpCAGGSの構造を示す。第５図は、本発明の新規ベクターpCAGS−２の構造を示
す。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/08 C12N 5/00 - 5/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｓｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモータ
ーにおける、イントロン領域の途中からその下流（３′
端側）のスプライスアクセプター配列を含めた３′端側
の遺伝子を除去し、これにウサギのβ−グロビンのスプ
ライシングアクセプター配列を含む外来遺伝子を接続し
たハイブリッドプロモーターを有しさらに、ターミネー
ター配列を外来遺伝子発現用の制御配列として有するこ
とを特徴とする発現ベクター。
【請求項２】スプライシングアクセプター配列が、ウサ
ギのβ−グロビン構造遺伝子に含まれるスプライシング
アクセプター配列を有する遺伝子断片である前記第
（１）項記載の発現ベクター。
【請求項３】ターミネーター配列が、β−クロビン遺伝
子由来の遺伝子である前記第（１）項記載の発現ベクタ
ー。
【請求項４】外来遺伝子発現用の制御配列としてエンハ
ンサーをさらに有する前記第（１）項記載の発現ベクタ
ー。
【請求項５】該エンハンサーがサイトメガロウイルス由
来の遺伝子である前記第（４）項記載の発現ベクター。
【請求項６】ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモータ
ーにおける、イントロン領域の途中からその下流（３′
端側）のスプライスアクセプター配列を含めた３′端側
の遺伝子を除去し、これにウサギのβ−グロビンのスプ
ライシングアクセプター配列を含む外来遺伝子を接続し
たハイブリッドプロモーターを有しさらにターミネータ
ー配列を外来遺伝子発現用の制御配列として有する発現
ベクターを用い、このベクターのハイブリッドプロモー
ター下流に外来構造遺伝子を組み込んだ組換えプラスミ
ドにより真核細胞を形質転換し、これを培養することを
特徴とする外来遺伝子の発現方法。