JPH03168087A - 新規発現ベクター - Google Patents
新規発現ベクターInfo
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- JPH03168087A JPH03168087A JP1309785A JP30978589A JPH03168087A JP H03168087 A JPH03168087 A JP H03168087A JP 1309785 A JP1309785 A JP 1309785A JP 30978589 A JP30978589 A JP 30978589A JP H03168087 A JPH03168087 A JP H03168087A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーター
を一部改良したハイブリッドプロモータ一を有する外来
遺伝子の高発現を目的とした新規発現ベクターに関する
． 遺伝子組換え技術の進歩に伴って、遺伝子組換えを利用
した有用物質の生産は近年急速に進歩してきている。遺
伝子組換え技術を利用して外来遺伝子を発現させる場合
には、適当な宿主細胞と、これに応じた外来遺伝子発現
用プロモーターを有する発現ベクターが用いられる．こ
れまでは、大腸菌や酵母等の取扱いが容易な微生物が発
現の宿主細胞として広く研究されてきたが、このような
微生物では外来遺伝子の発現において一部に限界がある
ことが確認されてきており、近年では高等動物培ＩＩ，
Ｉｌｌ胞等の動物細胞を発現宿主細胞とした発現系が盛
んに研究されてきている。
を一部改良したハイブリッドプロモータ一を有する外来
遺伝子の高発現を目的とした新規発現ベクターに関する
． 遺伝子組換え技術の進歩に伴って、遺伝子組換えを利用
した有用物質の生産は近年急速に進歩してきている。遺
伝子組換え技術を利用して外来遺伝子を発現させる場合
には、適当な宿主細胞と、これに応じた外来遺伝子発現
用プロモーターを有する発現ベクターが用いられる．こ
れまでは、大腸菌や酵母等の取扱いが容易な微生物が発
現の宿主細胞として広く研究されてきたが、このような
微生物では外来遺伝子の発現において一部に限界がある
ことが確認されてきており、近年では高等動物培ＩＩ，
Ｉｌｌ胞等の動物細胞を発現宿主細胞とした発現系が盛
んに研究されてきている。
これまでに知られている動物細胞を宿主とした発現系と
しては、多くの動物ウイルス遺伝子プロモーターおよび
動物細胞遺伝子プロモーターを用いた系が報告されてい
る。前者の例として、ＳＶ４０遺伝子プロモーター、ア
デノウイルス主要後期遺伝子プロモーター、Ｂ型肝炎ウ
イルス遺伝子プロモーター等が使用されている．また、
後者の例としてはチミジンキナーゼ（ｔＫ）遺伝子プロ
モーター メタロチオネイン遺伝子プロモーターインタ
ーフェロン遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子
プロモーター等が使用されている。
しては、多くの動物ウイルス遺伝子プロモーターおよび
動物細胞遺伝子プロモーターを用いた系が報告されてい
る。前者の例として、ＳＶ４０遺伝子プロモーター、ア
デノウイルス主要後期遺伝子プロモーター、Ｂ型肝炎ウ
イルス遺伝子プロモーター等が使用されている．また、
後者の例としてはチミジンキナーゼ（ｔＫ）遺伝子プロ
モーター メタロチオネイン遺伝子プロモーターインタ
ーフェロン遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子
プロモーター等が使用されている。
上記プロモーターの中では、特にＳＶ４０初期遺伝子プ
ロモーター ＳＶ４０後期遺伝子プロモーターおよびア
デノウイルス主要後期遺伝子プロモーターが強力なプロ
モーター活性を有するとされているが、工業的生産に用
いられるほど生産性が充分ではなく、さらに強力なプロ
モーター並びに高発現ベクターの開発が求められている
，このような状況において、先に本発明者らは、ニワト
リのβ−アクチン遺伝子プロモーターを用いて外来遺伝
子発現用ベクターを構築し、これに種々の外来遺伝子を
組み込んでその成果を調べたところ、いずれの外来遺伝
子を組み込んだ場合にも目的遺伝子産物を従来プロモー
ターより非常に高く発現させることが可能であることを
見いだした（特願昭６３−１５７５６９号）。このニワ
トリのβ−アクチン遺伝子プロモーターを用いたベクタ
ーは、これまでによく知られているＳＶ４０初期プロモ
ーターを利用したベクターと比較して、少なくとも５〜
１０倍の発現量が期待でき、しかもマウス由来細胞（例
えばＬ細胞）のみならず、ハムスター由来細胞（ＣＨＯ
細胞等）、アフリカミドリザル由来細胞（ＣＯＳ細胞等
）や他の動物細胞においても同様に強力なプロモーター
活性を有することが先に本発明者らにより確認されてい
る。
ロモーター ＳＶ４０後期遺伝子プロモーターおよびア
デノウイルス主要後期遺伝子プロモーターが強力なプロ
モーター活性を有するとされているが、工業的生産に用
いられるほど生産性が充分ではなく、さらに強力なプロ
モーター並びに高発現ベクターの開発が求められている
，このような状況において、先に本発明者らは、ニワト
リのβ−アクチン遺伝子プロモーターを用いて外来遺伝
子発現用ベクターを構築し、これに種々の外来遺伝子を
組み込んでその成果を調べたところ、いずれの外来遺伝
子を組み込んだ場合にも目的遺伝子産物を従来プロモー
ターより非常に高く発現させることが可能であることを
見いだした（特願昭６３−１５７５６９号）。このニワ
トリのβ−アクチン遺伝子プロモーターを用いたベクタ
ーは、これまでによく知られているＳＶ４０初期プロモ
ーターを利用したベクターと比較して、少なくとも５〜
１０倍の発現量が期待でき、しかもマウス由来細胞（例
えばＬ細胞）のみならず、ハムスター由来細胞（ＣＨＯ
細胞等）、アフリカミドリザル由来細胞（ＣＯＳ細胞等
）や他の動物細胞においても同様に強力なプロモーター
活性を有することが先に本発明者らにより確認されてい
る。
さらに、本発明者らは、ニワトリβ−アクチン遺伝子プ
ロモーターを用いた研究を進め、このプロモーターを一
部改良することによりさらに有効なプロモーターおよび
これを用いたベクターを開発することに戒功し特許出願
した（特願昭６３−３１２４４４号）。すなわち、本発
明者らは、ニワトリのβアクチン遺伝子プロモーターと
他の遺伝子とを融合させることにより、本来のニワトリ
のβ−アクチンプロモーターよりさらにプロモーター活
性の高い新規プロモーターを得ることに成功した。
ロモーターを用いた研究を進め、このプロモーターを一
部改良することによりさらに有効なプロモーターおよび
これを用いたベクターを開発することに戒功し特許出願
した（特願昭６３−３１２４４４号）。すなわち、本発
明者らは、ニワトリのβアクチン遺伝子プロモーターと
他の遺伝子とを融合させることにより、本来のニワトリ
のβ−アクチンプロモーターよりさらにプロモーター活
性の高い新規プロモーターを得ることに成功した。
発』生ｆ）ＪＬ飽
本発明者らは、上記の発明で得られた知見を基に、外来
遺伝子の高発現を目的として、さらに有効な発現ベクタ
ーの開発を進めた結果、極めて有効な発現ベクターを開
発した。そのベクターとは、ニワトリのβ−アクチン遺
伝子プロモーターの一部の塩基配列をウサギのβ−グロ
ビン由来の遺伝子に置き換えたハイブリッドプロモータ
ーを有し、さらにターミネーター配列を外来遺伝子発現
用の制御配列として有することを特長とする発現ベクタ
ーである。
遺伝子の高発現を目的として、さらに有効な発現ベクタ
ーの開発を進めた結果、極めて有効な発現ベクターを開
発した。そのベクターとは、ニワトリのβ−アクチン遺
伝子プロモーターの一部の塩基配列をウサギのβ−グロ
ビン由来の遺伝子に置き換えたハイブリッドプロモータ
ーを有し、さらにターミネーター配列を外来遺伝子発現
用の制御配列として有することを特長とする発現ベクタ
ーである。
すなわち、本発明は動物細胞を用いた発現系において外
来遺伝子を高発現させることが可能な、これまでにない
強力な新規発現ベクターを提供することを目的とする． 本発明の中で用いられるニワトリβ−アクチン遺伝子プ
ロモーターの塩基配列については、先にＴ． Ａ． Ｋ
ｏｓｔらによって報告されている， （ ｌＢ１ｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１， Ｎｏ．２３．
８２８７−８２８６． １９８３）．本発明に用い
られるニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターは、
全体的にＧ（グアニン〉Ｃ（シトシン）含量が高く、Ｔ
ＡＴＡボックス（ＡＮＮ ＲＢＳ ＢＩＯＣ肛Ｍ， ！
）ｌ， ３４９−３８３． １９８１）やＣＣＡＡＴ
ボックス（ＮＵＣＬＥＣＩ ＡＣＤＳ ＲＥＤ， ８，
１２７−１４２． １９８０）などプロモーターに特徴
的な配列が備わっている遺伝子断片である。
来遺伝子を高発現させることが可能な、これまでにない
強力な新規発現ベクターを提供することを目的とする． 本発明の中で用いられるニワトリβ−アクチン遺伝子プ
ロモーターの塩基配列については、先にＴ． Ａ． Ｋ
ｏｓｔらによって報告されている， （ ｌＢ１ｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１， Ｎｏ．２３．
８２８７−８２８６． １９８３）．本発明に用い
られるニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターは、
全体的にＧ（グアニン〉Ｃ（シトシン）含量が高く、Ｔ
ＡＴＡボックス（ＡＮＮ ＲＢＳ ＢＩＯＣ肛Ｍ， ！
）ｌ， ３４９−３８３． １９８１）やＣＣＡＡＴ
ボックス（ＮＵＣＬＥＣＩ ＡＣＤＳ ＲＥＤ， ８，
１２７−１４２． １９８０）などプロモーターに特徴
的な配列が備わっている遺伝子断片である。
ニワトリのβ−アクチンプロモーターにおいては、本来
のβ−アクチン構造遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）
の上流−９０９の位置のＧ（グアニン）から−７の位置
のＧ（グアニン）までのＤＮＡ領域はメッセンジャーＲ
ＮＡに転写された後で、削除（スプライス）される遺伝
子領域（イントロン〉と考えられる。
のβ−アクチン構造遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）
の上流−９０９の位置のＧ（グアニン）から−７の位置
のＧ（グアニン）までのＤＮＡ領域はメッセンジャーＲ
ＮＡに転写された後で、削除（スプライス）される遺伝
子領域（イントロン〉と考えられる。
本発明の発現ベクターに使用されるβ−アクチンハイブ
リッドプロモーターには、ニワトリのβ一アクチンプロ
モーターのイントロン領域の途中からその下流（３゜端
側〉のスブライシングアクセブター配列を含めた遺伝子
をすべて除去し、これにスブライシングアクセブター配
列を含むウサギのβ−グロビン遺伝子を接続したことを
特徴とするハイブリッドプロモーターが用いられる．こ
のようなスブライシングアクセブター配列を有するウサ
ギβ−グロビン遺伝子とは、例えば、ウサギのβ−グロ
ビン構造遺伝子に含まれるスブライシングアクセプター
配列を有する遺伝子断片が使用される。このようにニワ
トリのβ−アクチンプロモーターのスブライシングアク
セブター配列をウサギβ−グロビン遺伝子に変換するこ
とにより、ニワトリのβ−アクチンプロモーターが持つ
本来のプロモーター活性よりさらに活性が上昇する。
リッドプロモーターには、ニワトリのβ一アクチンプロ
モーターのイントロン領域の途中からその下流（３゜端
側〉のスブライシングアクセブター配列を含めた遺伝子
をすべて除去し、これにスブライシングアクセブター配
列を含むウサギのβ−グロビン遺伝子を接続したことを
特徴とするハイブリッドプロモーターが用いられる．こ
のようなスブライシングアクセブター配列を有するウサ
ギβ−グロビン遺伝子とは、例えば、ウサギのβ−グロ
ビン構造遺伝子に含まれるスブライシングアクセプター
配列を有する遺伝子断片が使用される。このようにニワ
トリのβ−アクチンプロモーターのスブライシングアク
セブター配列をウサギβ−グロビン遺伝子に変換するこ
とにより、ニワトリのβ−アクチンプロモーターが持つ
本来のプロモーター活性よりさらに活性が上昇する。
ウサギβ−グロビン遺伝子をニワトリのβ−アクチンプ
ロモーターに融合させる場合には、βアクチンプロモー
ターのイントロン領域の途中から、その下流のβ−アク
チンプロモーター遺伝子を除去し、これにスプライシン
グアクセブター配列を含むウサギβ−グロビン遺伝子を
融合させるが、融合させる具体的な部位としては、β−
アクチンプロモーター配列中のＭｂｏ Ｉｆ部位がその
好ましい部位として挙げられる。
ロモーターに融合させる場合には、βアクチンプロモー
ターのイントロン領域の途中から、その下流のβ−アク
チンプロモーター遺伝子を除去し、これにスプライシン
グアクセブター配列を含むウサギβ−グロビン遺伝子を
融合させるが、融合させる具体的な部位としては、β−
アクチンプロモーター配列中のＭｂｏ Ｉｆ部位がその
好ましい部位として挙げられる。
本発明の発現ベクターの基本的な構造としては、上述の
ニワトリのβ−アクチンハイブリッドプロモーターを有
し、該プロモーター下流に外来遺伝子を組み込むことが
可能な適当な制限酵素切断部位を有する。このような制
限酵素切断部位は、ひとつの制限酵素による認識部位が
あれば足りるが、種々の外来遺伝子を組み込み易くする
ために２つ以上の制限酵素による認識部位を有すること
も可能である。また、本発明の発現ベクターには目的の
外来遺伝子を効率よく発現させるために、目的外来遺伝
子を組み込む部位の下流にターミネーター（ボリアデニ
レーション配列）が組み込まれる。
ニワトリのβ−アクチンハイブリッドプロモーターを有
し、該プロモーター下流に外来遺伝子を組み込むことが
可能な適当な制限酵素切断部位を有する。このような制
限酵素切断部位は、ひとつの制限酵素による認識部位が
あれば足りるが、種々の外来遺伝子を組み込み易くする
ために２つ以上の制限酵素による認識部位を有すること
も可能である。また、本発明の発現ベクターには目的の
外来遺伝子を効率よく発現させるために、目的外来遺伝
子を組み込む部位の下流にターミネーター（ボリアデニ
レーション配列）が組み込まれる。
このターミネーター配列の例としては、ＳＶ４０由来の
遺伝子、ウサギβ−グロビン由来の遺伝子等が使用され
るが、特にウサギβ〜グロビン由来のターミネーター配
列を組み込むことが好ましい．また、本発明に従えば、
使用する宿主細胞に応じて、さらにエンハンサー配列が
組み込まれる．このようなエンハンサー配列は、上記ハ
イブリッドプロモーターの上流に組み込まれる。このよ
うなエンハンサー配列としては、特にサイトメガロウイ
ルス由来のエンハンサー配列を使用することが望ましい
．このサイトメガロウイルス由来のエンハンサーは、特
にマウスＬ細胞等を発現の宿主細胞として使用する場合
に有効である。
遺伝子、ウサギβ−グロビン由来の遺伝子等が使用され
るが、特にウサギβ〜グロビン由来のターミネーター配
列を組み込むことが好ましい．また、本発明に従えば、
使用する宿主細胞に応じて、さらにエンハンサー配列が
組み込まれる．このようなエンハンサー配列は、上記ハ
イブリッドプロモーターの上流に組み込まれる。このよ
うなエンハンサー配列としては、特にサイトメガロウイ
ルス由来のエンハンサー配列を使用することが望ましい
．このサイトメガロウイルス由来のエンハンサーは、特
にマウスＬ細胞等を発現の宿主細胞として使用する場合
に有効である。
さらに形質転換動物細胞をクローニングするために適当
なマーカー遺伝子を組み込むことが好ましい。
なマーカー遺伝子を組み込むことが好ましい。
また、このような本発明の発現ベクターは、大腸菌での
クローニングを行い易くするために大腸菌プラスミド由
来の遺伝子を有する．そのような大腸菌プラスミド由来
遺伝子としては、大腸菌体内で複製するためのｏｒｉ、
並びにクローニングの際に選択マーカーとなりうる適当
な遺伝子、例えばアンピシリンや、テトラサイクリン等
に対する薬剤耐性遺伝子が挙げられる．また、このよう
な遺伝子としてプラスミドｐＢＲ３２２由来の遺伝子を
組み込む場合には、ｐＢＲ３２２複製開始点（ｏｒｉ）
の近くにある、宿主細胞での複製を阻害する毒性配列を
除去することが好ましい。
クローニングを行い易くするために大腸菌プラスミド由
来の遺伝子を有する．そのような大腸菌プラスミド由来
遺伝子としては、大腸菌体内で複製するためのｏｒｉ、
並びにクローニングの際に選択マーカーとなりうる適当
な遺伝子、例えばアンピシリンや、テトラサイクリン等
に対する薬剤耐性遺伝子が挙げられる．また、このよう
な遺伝子としてプラスミドｐＢＲ３２２由来の遺伝子を
組み込む場合には、ｐＢＲ３２２複製開始点（ｏｒｉ）
の近くにある、宿主細胞での複製を阻害する毒性配列を
除去することが好ましい。
−ｌ〇一
また、目的の外来遺伝子を発現させる宿主細胞としてＳ
Ｖ４０のラージＴ抗原を産生ずる細胞、例えばＣＯＳ
（アフリカミドリザル腎臓由来）細胞を用いる場合には
、上記の発現ベクターに動物細胞内で機能する複製開始
点（例えばＳＶ４０ ｏｒ＋）を組み込むことによりさ
らに効率よく外来遺伝子を発現させることが可能となる
． さらに、外来遺伝子の発現効率を上げるためには、ジヒ
ドロ葉敢還元化酵素（ＤＩ｛ＰＲ）遺伝子を本発明の発
現ベクターに組み込むことも可能であり、または、形質
転換の際にＢＵＲ発現プラスミドと共に形質転換するこ
ともできる。この場合には、宿主細胞としてはＤＨＰＲ
遺伝子欠損細胞を用いることが望ましく、培地中にメト
トレキセートを添加することで形質転換体内の遺伝子を
増幅させ、より高い発現量を得ることが可能となる．こ
のようなＤＨＰＲ遺伝子を用いた発現効率アップの手法
は、すでに知られている手法であるが、本発明の発現ベ
クターに応用すれば、飛躍的に発現効率を向上させるこ
とが可能となる． −ｌ１− β−アクチンは多種の動物細胞に存在することから、β
−アクチンプロモーターを利用している本発現系は高能
率であるばかりでなく、宿主域が広く、従って産業上の
有用性がきわめて高い発現系であるといえる。
Ｖ４０のラージＴ抗原を産生ずる細胞、例えばＣＯＳ
（アフリカミドリザル腎臓由来）細胞を用いる場合には
、上記の発現ベクターに動物細胞内で機能する複製開始
点（例えばＳＶ４０ ｏｒ＋）を組み込むことによりさ
らに効率よく外来遺伝子を発現させることが可能となる
． さらに、外来遺伝子の発現効率を上げるためには、ジヒ
ドロ葉敢還元化酵素（ＤＩ｛ＰＲ）遺伝子を本発明の発
現ベクターに組み込むことも可能であり、または、形質
転換の際にＢＵＲ発現プラスミドと共に形質転換するこ
ともできる。この場合には、宿主細胞としてはＤＨＰＲ
遺伝子欠損細胞を用いることが望ましく、培地中にメト
トレキセートを添加することで形質転換体内の遺伝子を
増幅させ、より高い発現量を得ることが可能となる．こ
のようなＤＨＰＲ遺伝子を用いた発現効率アップの手法
は、すでに知られている手法であるが、本発明の発現ベ
クターに応用すれば、飛躍的に発現効率を向上させるこ
とが可能となる． −ｌ１− β−アクチンは多種の動物細胞に存在することから、β
−アクチンプロモーターを利用している本発現系は高能
率であるばかりでなく、宿主域が広く、従って産業上の
有用性がきわめて高い発現系であるといえる。
本発明の動物細胞用発現ベクターは、これまでにない極
めて高発現が可能な動物細胞用発現ベクターであり、工
業的レベルの生産においても十分利用可能な新規な外来
遺伝子発現系を提供するものである。
めて高発現が可能な動物細胞用発現ベクターであり、工
業的レベルの生産においても十分利用可能な新規な外来
遺伝子発現系を提供するものである。
以下、本発明のハイブリッドプロモーターを用いた発現
ベクターが実際に非常に有用であることを示す一例とし
て大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子並びにＢ型肝炎
ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡ３）遺伝子を用いて、下記
の調製例、実旌例に沿って本発明をさらに詳細に説明す
る。調製例では、比較実験の為の本来のニワトリβ−ア
クチン遺伝子プロモーターを用いた発現ベクターの構築
およびハイブリッドプロモーターを用いた発現ベクター
の構築、そして実施例では、本発明の新規発現ベク１２
− ターの構築ならびにその応用例を示す。
ベクターが実際に非常に有用であることを示す一例とし
て大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子並びにＢ型肝炎
ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡ３）遺伝子を用いて、下記
の調製例、実旌例に沿って本発明をさらに詳細に説明す
る。調製例では、比較実験の為の本来のニワトリβ−ア
クチン遺伝子プロモーターを用いた発現ベクターの構築
およびハイブリッドプロモーターを用いた発現ベクター
の構築、そして実施例では、本発明の新規発現ベク１２
− ターの構築ならびにその応用例を示す。
実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々の酵素
、大腸菌、培養細胞などを扱う諸操作は以下にあげる雑
誌、戒書を参考とした．１．遺伝子操作実験法、高木康
敬、編著（１９８０）、講談社 ２，遺伝子操作マニュアル、高木康敬、編著（１９８２
）、講談社 ３． ＭＯＬＢＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ Ａ ＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． Ｔ．ＭＡＮＩＡＴ
ＩＳら編、 （１９８２）、ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ１
｛ＡＲＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ．４． ＭＲＴＨ
ＯＩＩＳ ＩＮ ＥＷＺＹＭＯＬＯＧＹ、６５巻、Ｌ．
ＧＲＯＳＳＭＡＭ．ら編、 （１９８０）、＾ＣＡ
ＤＩ！ＭＩＣ ＰＲＥＳＳ実施例中には次の略号を用い
た． ＣＡＴ： クロラムフェニコール・アセチル・トランス
フェラーゼ １ａｃＺ： β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）構造
遺伝子 １３− え：」艷城ｆｉｌｌ製 ニワトリのβ−アクチン遺伝子の第１エクソン、第１イ
ントロン及び第２エクソンの一部と、それに融合した形
で続（ ＣＡＴ遺伝子を有するプラスミドｐＡ２１０３
７ ［ＮＡＴＵＲＲ， ３１４， Ｐ２８６〜２８９
（１９８５）］を制限酵素ＮｃｏＩ （ＮＲＢ ＃１９
３）で消化した．本発明においては、発現ベクターとし
て使用する際にニワトリβ−アクチン遺伝子の第１イン
トロンと第２エクソンの間のスプライス部位が正確に機
能することを目的として以下の操作を行った． すなわち、Ｎｅｏ ｌ消化後のＤＮＡを修飾酵索Ｓ１ヌ
クレアーゼ（ ９＃ラ＃２４１ＤＡ ）で処理し、５゛
末端突出部位及びそのとなりの１塩基対のみを削除した
。この反応は、３０ｍＭ酢酸ナトリウム． ｐＨ４．
６． １０［１ｍＭ ＮａＣ１，１ｍＭ ＺｎＳＯａ溶
液８〇一中、サンプルＩＩＮＡＩＯＪを８１ヌクレアー
ゼ１５０単位を用い、３７℃でｌ〜４分間行った．この
ようにしてＤＮＡを８１ヌクレアーゼで処理した後、修
飾酵素Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（クカテ＃２０４０Ａ
＞を作用させて一本鎖ＤＮＡ部分を修飾し、５゜末端
がリン酸化された合戒ＤＮＡ ｐＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ
（ ｐＨｉｎｄｍリンカ１４− −．ＮＥＢ ＃１０５０） と共に、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ（クカラ＃２０１１Ａ）を用いて連結環状化し
た。得られたＤＮＡ溶液で大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転
換し、単一のコロニーを分離した後、形質転換体中のプ
ラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ［ （
ＮＥＢ＃１０４）およびＮａｒＩ（ＮＥＢ＃１９１）で
消化し、６ｘアクリルアミドゲル電気泳動を行い、適当
なサイズのＩ）ＮＡ断片が検出されたクローンをまず選
択し、そのＤＮＡ断片をファージベクターＭ１３＋ｏｐ
ｌ９ （ＮＥＢ＃４００−１９＞のＳａｌ Ｉ −Ｋｐ
ｎ Ｉ部位にクローニングし、Ｈｉｎｄｍ部位付近の塩
基配列をジデオキシ法（ＰＲＯ Ｎ Ａ Ｓ， Ｕ，
５４６３−５４６７． １９７７） ）により決定し、
目的とするクローンのスクリーニングを行った。
、大腸菌、培養細胞などを扱う諸操作は以下にあげる雑
誌、戒書を参考とした．１．遺伝子操作実験法、高木康
敬、編著（１９８０）、講談社 ２，遺伝子操作マニュアル、高木康敬、編著（１９８２
）、講談社 ３． ＭＯＬＢＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ Ａ ＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． Ｔ．ＭＡＮＩＡＴ
ＩＳら編、 （１９８２）、ＣＯＬＤ ＳＰＲＩＮＧ１
｛ＡＲＢＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ．４． ＭＲＴＨ
ＯＩＩＳ ＩＮ ＥＷＺＹＭＯＬＯＧＹ、６５巻、Ｌ．
ＧＲＯＳＳＭＡＭ．ら編、 （１９８０）、＾ＣＡ
ＤＩ！ＭＩＣ ＰＲＥＳＳ実施例中には次の略号を用い
た． ＣＡＴ： クロラムフェニコール・アセチル・トランス
フェラーゼ １ａｃＺ： β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）構造
遺伝子 １３− え：」艷城ｆｉｌｌ製 ニワトリのβ−アクチン遺伝子の第１エクソン、第１イ
ントロン及び第２エクソンの一部と、それに融合した形
で続（ ＣＡＴ遺伝子を有するプラスミドｐＡ２１０３
７ ［ＮＡＴＵＲＲ， ３１４， Ｐ２８６〜２８９
（１９８５）］を制限酵素ＮｃｏＩ （ＮＲＢ ＃１９
３）で消化した．本発明においては、発現ベクターとし
て使用する際にニワトリβ−アクチン遺伝子の第１イン
トロンと第２エクソンの間のスプライス部位が正確に機
能することを目的として以下の操作を行った． すなわち、Ｎｅｏ ｌ消化後のＤＮＡを修飾酵索Ｓ１ヌ
クレアーゼ（ ９＃ラ＃２４１ＤＡ ）で処理し、５゛
末端突出部位及びそのとなりの１塩基対のみを削除した
。この反応は、３０ｍＭ酢酸ナトリウム． ｐＨ４．
６． １０［１ｍＭ ＮａＣ１，１ｍＭ ＺｎＳＯａ溶
液８〇一中、サンプルＩＩＮＡＩＯＪを８１ヌクレアー
ゼ１５０単位を用い、３７℃でｌ〜４分間行った．この
ようにしてＤＮＡを８１ヌクレアーゼで処理した後、修
飾酵素Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（クカテ＃２０４０Ａ
＞を作用させて一本鎖ＤＮＡ部分を修飾し、５゜末端
がリン酸化された合戒ＤＮＡ ｐＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ
（ ｐＨｉｎｄｍリンカ１４− −．ＮＥＢ ＃１０５０） と共に、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ（クカラ＃２０１１Ａ）を用いて連結環状化し
た。得られたＤＮＡ溶液で大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転
換し、単一のコロニーを分離した後、形質転換体中のプ
ラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ［ （
ＮＥＢ＃１０４）およびＮａｒＩ（ＮＥＢ＃１９１）で
消化し、６ｘアクリルアミドゲル電気泳動を行い、適当
なサイズのＩ）ＮＡ断片が検出されたクローンをまず選
択し、そのＤＮＡ断片をファージベクターＭ１３＋ｏｐ
ｌ９ （ＮＥＢ＃４００−１９＞のＳａｌ Ｉ −Ｋｐ
ｎ Ｉ部位にクローニングし、Ｈｉｎｄｍ部位付近の塩
基配列をジデオキシ法（ＰＲＯ Ｎ Ａ Ｓ， Ｕ，
５４６３−５４６７． １９７７） ）により決定し、
目的とするクローンのスクリーニングを行った。
このようにして得られたプラスミドクローンｐ２８は、
本来のニワトリβ−アクチン遺伝子のスプライシング部
位から構造遺伝子にかけての塩基配列を保持しており、
かつ開如コドンＡＴＧを含めてその３゛側の遺伝子（構
造遺伝子を含む〉が除去され、新たにＨｉｏｄｌｌ１部
位が導入されている。
本来のニワトリβ−アクチン遺伝子のスプライシング部
位から構造遺伝子にかけての塩基配列を保持しており、
かつ開如コドンＡＴＧを含めてその３゛側の遺伝子（構
造遺伝子を含む〉が除去され、新たにＨｉｏｄｌｌ１部
位が導入されている。
ロ
１５一
ー へ ー ＡｃＳＶ４０初期転
写のスブライシング部位及びポリアデニレーシＪンシグ
ナルを含むプラスミドｐｓＶ２−ｃａｔ［Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２． Ｐ１０４４
−１０５１（１９８２）コを制暉酵素Ｍｆｌ■（タカラ
＃１０７０Ａ）で消化し、ＴＡＤＮ＾ポリメラーゼで末
端を修復した後、リン酸化した旧ｎｄｌｌＩリンカーを
７４ ＤＮＡリガーゼによって結合させた．これをさら
に旧ｎｄｍ及びＢａｇ■Ｉ （ Ｎｌ！Ｂ＃１３６ ）
で消化し、６ｘアクリルアミドゲル電気泳動を行って約
９００ｂＰのＨｉ ｎｄｌｎ −Ｂａｗｌ Ｉ断片を抽
出した６ 次に（１）で構築したｐ２８を制限酵素Ｈｉ
ｎｄｍ及びＢａ叶■で消化し、仔牛小腸由来アルカリホ
スファターゼ（ク村＃２２５０Ａ ＞の作用により脱リ
ン酸化した．これと前述した約９００ｂｐのＨｉｎｄｍ
−ＢａｍＨ Ｉ断片を、Ｔ４ １１ＮＡリガーゼで連
結環状化し、プラスミドｐＡｃ−２を得た。
写のスブライシング部位及びポリアデニレーシＪンシグ
ナルを含むプラスミドｐｓＶ２−ｃａｔ［Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２． Ｐ１０４４
−１０５１（１９８２）コを制暉酵素Ｍｆｌ■（タカラ
＃１０７０Ａ）で消化し、ＴＡＤＮ＾ポリメラーゼで末
端を修復した後、リン酸化した旧ｎｄｌｌＩリンカーを
７４ ＤＮＡリガーゼによって結合させた．これをさら
に旧ｎｄｍ及びＢａｇ■Ｉ （ Ｎｌ！Ｂ＃１３６ ）
で消化し、６ｘアクリルアミドゲル電気泳動を行って約
９００ｂＰのＨｉ ｎｄｌｎ −Ｂａｗｌ Ｉ断片を抽
出した６ 次に（１）で構築したｐ２８を制限酵素Ｈｉ
ｎｄｍ及びＢａ叶■で消化し、仔牛小腸由来アルカリホ
スファターゼ（ク村＃２２５０Ａ ＞の作用により脱リ
ン酸化した．これと前述した約９００ｂｐのＨｉｎｄｍ
−ＢａｍＨ Ｉ断片を、Ｔ４ １１ＮＡリガーゼで連
結環状化し、プラスミドｐＡｃ−２を得た。
β−ガラクトシダーゼをコードしているＩａｃＺ遺伝子
全領域を含むプラスミドｐｃＨ１１ａ （ファルマシア
＃２７−４５０８−０１）を制限酵素旧ｎｄｌｌｌ及び
Ｂａｗｌ Ｉで消化−１６＝ し、１ｘアガロースゲル電気泳動により約３． ８ｋｂ
ｐのＨｉｎｄｍ −ＢａｍＨ Ｉフラグメントを調製し
た．なお、このフラグメントの中には、ＳＶ４０初期遺
伝子転写物のスプライシング部位及びポリアデニレーシ
ョン部位も含まれている。
全領域を含むプラスミドｐｃＨ１１ａ （ファルマシア
＃２７−４５０８−０１）を制限酵素旧ｎｄｌｌｌ及び
Ｂａｗｌ Ｉで消化−１６＝ し、１ｘアガロースゲル電気泳動により約３． ８ｋｂ
ｐのＨｉｎｄｍ −ＢａｍＨ Ｉフラグメントを調製し
た．なお、このフラグメントの中には、ＳＶ４０初期遺
伝子転写物のスプライシング部位及びポリアデニレーシ
ョン部位も含まれている。
前記（１）で構築したプラスミドｐ２８を、制限酵素Ｈ
ｉｎｄｍ及びＤａｍｎ Ｉで消化し、仔牛小腸由来アル
カリホスファターゼを用いて脱リン酸化した．これに上
記の処理により得た約３．８ｋｂ Ｈｉｎｄｍ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントを加えてＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結
環状化させることによりプラスミドｐＡｃ−１ａｃＺを
構築した．調製例（２）で使用したプラスミドｐｓＶ２
−ｃａｔを制限酵素ＰｖｕＩＩ （夕カラ＠ １０７６
Ａ）及び旧ｎｄｍで消化し、６ｘアクリルゲル電気泳動
により、ＳＶ４０初期プロモーターを含む約３４０ｂｐ
のＰｖｕｌｌ−ＨＩｎｄｌ［［フラグメントを調製した
。このＰｖｕ ＩＩ−Ｈｉｎｄｍフラグメントの末端を
７４ ＤＮＡポリメラーゼで修復し、リン酸化したＸｂ
ａ ＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼによって結合さ
せ１７− だ。制限酵素Ｘｂａｌ （タカラ＃ １０９３Ａ）で消
化した後、６％アクリルゲル電気泳動により、約３５０
ｂｐのＸｂ＆Ｉ−ＸｂａＩフラグメントを調製した．次
に、プラスミドｐｓＡｃ−２ （特願昭６３−１５７５
６９号）を制限酵素ＸｂａＩとＰｓｔ Ｉで消化し、１
％アガロースゲル電気泳動により、約１． ６ｋｂＰの
Ｘｂａ １ −Ｐｓｔ Ｉフラグメントを調製した．こ
れを、制限酵素Ｍｂｏｌｌ （ ＮＨＢ＃ １４８）で
消化し、Ｔ４ １１ＮＡポリメラーゼで末端を修復した
後、リン酸化したＸｂａ ＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼによって結合させた．それから、制限酵素Ｘｈｏ
Ｔ及び旧ｎｄ■で消化し、ＩＸアガロースゲル電気泳
動を行い、約１． ３ｋｂＰのＸｈｏ Ｉ一旧ｎｄｌ［
Ｉフラグメントを調製した。
ｉｎｄｍ及びＤａｍｎ Ｉで消化し、仔牛小腸由来アル
カリホスファターゼを用いて脱リン酸化した．これに上
記の処理により得た約３．８ｋｂ Ｈｉｎｄｍ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントを加えてＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結
環状化させることによりプラスミドｐＡｃ−１ａｃＺを
構築した．調製例（２）で使用したプラスミドｐｓＶ２
−ｃａｔを制限酵素ＰｖｕＩＩ （夕カラ＠ １０７６
Ａ）及び旧ｎｄｍで消化し、６ｘアクリルゲル電気泳動
により、ＳＶ４０初期プロモーターを含む約３４０ｂｐ
のＰｖｕｌｌ−ＨＩｎｄｌ［［フラグメントを調製した
。このＰｖｕ ＩＩ−Ｈｉｎｄｍフラグメントの末端を
７４ ＤＮＡポリメラーゼで修復し、リン酸化したＸｂ
ａ ＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼによって結合さ
せ１７− だ。制限酵素Ｘｂａｌ （タカラ＃ １０９３Ａ）で消
化した後、６％アクリルゲル電気泳動により、約３５０
ｂｐのＸｂ＆Ｉ−ＸｂａＩフラグメントを調製した．次
に、プラスミドｐｓＡｃ−２ （特願昭６３−１５７５
６９号）を制限酵素ＸｂａＩとＰｓｔ Ｉで消化し、１
％アガロースゲル電気泳動により、約１． ６ｋｂＰの
Ｘｂａ １ −Ｐｓｔ Ｉフラグメントを調製した．こ
れを、制限酵素Ｍｂｏｌｌ （ ＮＨＢ＃ １４８）で
消化し、Ｔ４ １１ＮＡポリメラーゼで末端を修復した
後、リン酸化したＸｂａ ＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼによって結合させた．それから、制限酵素Ｘｈｏ
Ｔ及び旧ｎｄ■で消化し、ＩＸアガロースゲル電気泳
動を行い、約１． ３ｋｂＰのＸｈｏ Ｉ一旧ｎｄｌ［
Ｉフラグメントを調製した。
次に、調製例（３）で構築したプラスミドｐＡｃ−１ａ
ｃ２を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及び旧ｎｄｍで消化し、１ｘ
アガロースグル電気泳動により約５． ８ｋｂＰのＸｈ
ｏｌ一旧ｎｄｌｌｌフラグメントを調製した。これに、
先の約１． ３ｋｂｐＸｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄｍフラグメ
ントを混合し、制限酵素Ｘｂａ Ｉで消化した後、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼで連結環状化させ、プラスミドｐＡｃ
−１ａｃＺ−Ｘｂａ Ｉを構築した．・ ″″
ｌ 一 ロ ー＝１８＝ ロビゝ ハ ウサギβ−グロビン遺伝子の第２エクソンの途中から第
３エクソンの途中までを含むプラスミドｐＫＣＲ［Ｐｒ
ｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，
７ｊ３，． １５２７１５３１ （１９８１）］を
、制限酵素ＡｐａＩ （ＮＥＢ ＃ＡｐａＩ ）で消化
し、末端を７４ ＤＮＡポリメラーゼで修復した後、リ
ン酸化したＸｂａ ＩリンカーをＴ４ ＩＩＮＡリガー
ゼによって結合させた。この後、制限酵素ＢｃｏＲＩで
消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩで末端を修飾した。ｐＨ
ｌｎｄｌｌ［リンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結
合させ、制限酵素Ｘｂａｌ及びＨｉｎｄｌｌＩで消化し
た後、６ｘアクリルゲル電気泳動により、約９０ｂｐの
Ｘｂａｌ −Ｈｉｎｄｌ［ｒフラグメントを調製した。
ｃ２を制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及び旧ｎｄｍで消化し、１ｘ
アガロースグル電気泳動により約５． ８ｋｂＰのＸｈ
ｏｌ一旧ｎｄｌｌｌフラグメントを調製した。これに、
先の約１． ３ｋｂｐＸｈｏ Ｉ−Ｈｉｎｄｍフラグメ
ントを混合し、制限酵素Ｘｂａ Ｉで消化した後、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼで連結環状化させ、プラスミドｐＡｃ
−１ａｃＺ−Ｘｂａ Ｉを構築した．・ ″″
ｌ 一 ロ ー＝１８＝ ロビゝ ハ ウサギβ−グロビン遺伝子の第２エクソンの途中から第
３エクソンの途中までを含むプラスミドｐＫＣＲ［Ｐｒ
ｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，
７ｊ３，． １５２７１５３１ （１９８１）］を
、制限酵素ＡｐａＩ （ＮＥＢ ＃ＡｐａＩ ）で消化
し、末端を７４ ＤＮＡポリメラーゼで修復した後、リ
ン酸化したＸｂａ ＩリンカーをＴ４ ＩＩＮＡリガー
ゼによって結合させた。この後、制限酵素ＢｃｏＲＩで
消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩで末端を修飾した。ｐＨ
ｌｎｄｌｌ［リンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結
合させ、制限酵素Ｘｂａｌ及びＨｉｎｄｌｌＩで消化し
た後、６ｘアクリルゲル電気泳動により、約９０ｂｐの
Ｘｂａｌ −Ｈｉｎｄｌ［ｒフラグメントを調製した。
この中には、ウザギβ−グロビン遺伝子の第２イントロ
ンのスプライスアクセプターサイトが含まれている。
ンのスプライスアクセプターサイトが含まれている。
次に、調製例（４）で構築したプラスミドｐＡｃ−１ａ
ｃＺ−Ｘｂａ Ｉを、制限酵素Ｘｂａ Ｉ及びＨｉｎｄ
ｍで消化し、１ｘアガロースゲル電気泳動により、約７
ｋｂｐのＸｂａ １１９− Ｈｉｎｄｌｌｒフラグメントを調製した．これに、先の
約９０ｂｐ Ｘｂａｌ−Ｈｉｎｄｍフラグメントを混合
し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより連結させ、プラスミド
ｐＡＧ−１ａｃＺを構築した．このプラスミドには、ニ
ワトリのβアクチン遺伝子プロモーターとウサギβ−グ
ロビン由来遺伝子とのハイブリッドプロモーターとして
、第１図に示した塩基配列を有する．このプラスミドｐ
ＡＧ−１ａｃＺを、制限酵素旧ｎｄｍ及びＢａｇ旧で消
化し、１κアガロースゲル電気泳動により、約３． ３
ｋｂｐ Ｈｉｎｄｎｌ−Ｂａａ旧フラグメントを調製し
た．この約３．３ｋｂｐ ＨｉｎｄＩ［［−Ｂａａ旧フ
ラグメントと、実施例１で調製した約９００ｂｐ Ｈｉ
ｎｄｍ−Ｂａａ旧フラグメントを混合し、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結させ、プラスミドｐＡＧ−２を構
築した．調製例（２〉で使用したプラスミドＰＳＶ２−
ｃａｔを制限酵素ＨｐａＩ （ＮＥＢ ＃１０５）及び
旧ｎｄｍで消化し、末端を７４ ＤＮＡポリメラーゼで
修復した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結環状化させ、
プラスミドｐｓ−１を調製−２０− した。
ｃＺ−Ｘｂａ Ｉを、制限酵素Ｘｂａ Ｉ及びＨｉｎｄ
ｍで消化し、１ｘアガロースゲル電気泳動により、約７
ｋｂｐのＸｂａ １１９− Ｈｉｎｄｌｌｒフラグメントを調製した．これに、先の
約９０ｂｐ Ｘｂａｌ−Ｈｉｎｄｍフラグメントを混合
し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより連結させ、プラスミド
ｐＡＧ−１ａｃＺを構築した．このプラスミドには、ニ
ワトリのβアクチン遺伝子プロモーターとウサギβ−グ
ロビン由来遺伝子とのハイブリッドプロモーターとして
、第１図に示した塩基配列を有する．このプラスミドｐ
ＡＧ−１ａｃＺを、制限酵素旧ｎｄｍ及びＢａｇ旧で消
化し、１κアガロースゲル電気泳動により、約３． ３
ｋｂｐ Ｈｉｎｄｎｌ−Ｂａａ旧フラグメントを調製し
た．この約３．３ｋｂｐ ＨｉｎｄＩ［［−Ｂａａ旧フ
ラグメントと、実施例１で調製した約９００ｂｐ Ｈｉ
ｎｄｍ−Ｂａａ旧フラグメントを混合し、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結させ、プラスミドｐＡＧ−２を構
築した．調製例（２〉で使用したプラスミドＰＳＶ２−
ｃａｔを制限酵素ＨｐａＩ （ＮＥＢ ＃１０５）及び
旧ｎｄｍで消化し、末端を７４ ＤＮＡポリメラーゼで
修復した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結環状化させ、
プラスミドｐｓ−１を調製−２０− した。
このプラスミドｐｓ−１を制限酵素ｓｐｈｔで消化し、
末端を７４ ＤＮＡポリメラーゼで修復した後、リン酸
化したＢ舖旧リンヵ一（ＮＥＢ ＃１０２１）を添加し
て、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより連結環状化させ、プラ
スミドｐｓ−２を調製した。
末端を７４ ＤＮＡポリメラーゼで修復した後、リン酸
化したＢ舖旧リンヵ一（ＮＥＢ ＃１０２１）を添加し
て、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより連結環状化させ、プラ
スミドｐｓ−２を調製した。
このプラスミドｐＳ−２を制限酵素Ｂａｇ旧で消化し、
６ｘアクリルゲル電気泳動により、約３５０ｂｐ Ｂａ
ａ旧Ｂａ■旧フラグメントを得た。この中には、Ｓ％’
４０ｏｒｉと、ＳＶ４０初期プロモーターのボリアデニ
レーションシグナルが含まれている。
６ｘアクリルゲル電気泳動により、約３５０ｂｐ Ｂａ
ａ旧Ｂａ■旧フラグメントを得た。この中には、Ｓ％’
４０ｏｒｉと、ＳＶ４０初期プロモーターのボリアデニ
レーションシグナルが含まれている。
次に、調製例（５）で構築したプラスミドｐＡＧ−１ａ
ｃＺを制限酵素Ｂｉｔ旧で消化し、先の約３５０ｂｐ
ＢａｍＨＩＢａＩ１旧フラグメントを添加して、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにより連結環状化させて、プラスミドｐ
ＡＧｓ−１ｉｃＺを構築した． 又、調製例（５）で構築したプラスミドｐＡＧ−２を制
限酵素Ｂａｍ旧で消化し、先の約３５０ｂｐ ＢａｍＨ
Ｉ−Ｂａａ旧フラグメントを添加して、Ｔ４ Ｉ）ＮＡ
リガーゼにより連結環状化させて、プラスミドｐＡＧｓ
−２を構築した。
ｃＺを制限酵素Ｂｉｔ旧で消化し、先の約３５０ｂｐ
ＢａｍＨＩＢａＩ１旧フラグメントを添加して、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにより連結環状化させて、プラスミドｐ
ＡＧｓ−１ｉｃＺを構築した． 又、調製例（５）で構築したプラスミドｐＡＧ−２を制
限酵素Ｂａｍ旧で消化し、先の約３５０ｂｐ ＢａｍＨ
Ｉ−Ｂａａ旧フラグメントを添加して、Ｔ４ Ｉ）ＮＡ
リガーゼにより連結環状化させて、プラスミドｐＡＧｓ
−２を構築した。
−２ｌ−
実施例１： ベ ーＡＧＧ
調製例（５）で構築したプラスミドｐＡＧ−２を制限酵
素Ｘｈｏｌ及びＥｃｏＲＩで消化し、１ｘアガロースゲ
ル電気泳動により約１．３ｋｂｐのＸｈｏｌ−ＥｃｏＲ
Ｔフラグメント（フラグメントＡ）を調製した． 次に、調製例（５）で使用したプラスミドｐＫｃＲを制
限酵素Ｂｇｌｌｌで部分消化し、末端を７４ ＤＮＡポ
リメラーゼで修復後、リン酸化したＸｈｏｌリンカーを
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって結合させた．この後、制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、フラグメントＡをＴ４ Ｄ
Ｎ＾リガーゼにより結合させた．それから制限酵素Ｘｈ
ｏｌで消化し、ｌπアガロースゲル電気泳動を行って、
約１．８ｋｂｐのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌフラ
グメント（フラグメントＢ〉を調製した．このフラグメ
ントＢは、ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーターと
ウサギβ−グロビン遺伝子とのハイブリッドプロモータ
ーの下流に、ウサギβ−グロビン遺伝子のボリアデニレ
ーションシグナルが結合した形になっている．さらに、
クローニング用ベクターとして一般的に使用されている
ｐＵｃｌ３ ［ Ｇｅｎｅ， ３３． １０３−１１９
（１９８５）］一２２− を制限酵索ＥｃｏＯ１０９Ｉで消化し、末端を７４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼで修復した後、リン酸化したＸｈｏ
ＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼによって結合させた
。それから制限酵素Ｘｈｏｌ及びＳａｌ Ｉで消化し、
得られた２．２ｋｂｐのＸｈｏｌ−Ｓａｔ Ｉフラグメ
ントとフラグメントＢとをＴ４ ＤＮＡリガーゼにより
結合させた。可能ないくつかのプラスミドの中から、制
限酵素Ｘｂａｌ及びＰｖｕ Ｕで消化した時に約８００
ｂｐと約３． ３ｋｂｐの２本のバンドが生じるプラス
ミドを選択することにより発現ベクターｐＡＧＧ（第２
図参照〉を構築した。
素Ｘｈｏｌ及びＥｃｏＲＩで消化し、１ｘアガロースゲ
ル電気泳動により約１．３ｋｂｐのＸｈｏｌ−ＥｃｏＲ
Ｔフラグメント（フラグメントＡ）を調製した． 次に、調製例（５）で使用したプラスミドｐＫｃＲを制
限酵素Ｂｇｌｌｌで部分消化し、末端を７４ ＤＮＡポ
リメラーゼで修復後、リン酸化したＸｈｏｌリンカーを
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって結合させた．この後、制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、フラグメントＡをＴ４ Ｄ
Ｎ＾リガーゼにより結合させた．それから制限酵素Ｘｈ
ｏｌで消化し、ｌπアガロースゲル電気泳動を行って、
約１．８ｋｂｐのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌフラ
グメント（フラグメントＢ〉を調製した．このフラグメ
ントＢは、ニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーターと
ウサギβ−グロビン遺伝子とのハイブリッドプロモータ
ーの下流に、ウサギβ−グロビン遺伝子のボリアデニレ
ーションシグナルが結合した形になっている．さらに、
クローニング用ベクターとして一般的に使用されている
ｐＵｃｌ３ ［ Ｇｅｎｅ， ３３． １０３−１１９
（１９８５）］一２２− を制限酵索ＥｃｏＯ１０９Ｉで消化し、末端を７４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼで修復した後、リン酸化したＸｈｏ
ＩリンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼによって結合させた
。それから制限酵素Ｘｈｏｌ及びＳａｌ Ｉで消化し、
得られた２．２ｋｂｐのＸｈｏｌ−Ｓａｔ Ｉフラグメ
ントとフラグメントＢとをＴ４ ＤＮＡリガーゼにより
結合させた。可能ないくつかのプラスミドの中から、制
限酵素Ｘｂａｌ及びＰｖｕ Ｕで消化した時に約８００
ｂｐと約３． ３ｋｂｐの２本のバンドが生じるプラス
ミドを選択することにより発現ベクターｐＡＧＧ（第２
図参照〉を構築した。
実施例２： ベ ーＣＡＧＧ
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター領域を
含むプラスミドｐｃＤＭ８ ［フナコシ社製コを制限酵
素Ｈｉｎｃｌｌ及び旧ｎｄｌ［Ｉで消化し、１％アガロ
ースゲル電気泳動により約６５０ｂｐの旧ｎｃＩ［−Ｈ
ｉｎｄｍフラグメント（フラグメントＣ〉を調製した．
プラスミドｐＵｃ１８を制限酵素旧ｎｃＵ及び旧ｎｄｎ
［で消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによりフラグメント
Ｃを結合させ、プラスミドｐＵｃ−ＣＭＰを調製した，
ｐＵｃ−ＣＭＰを制限酵素Ｎｃｏｌで消化し、末端
をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで修−２３一 復した後、リン酸化したＳａｌ Ｉリンヵ一をＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼによって結合させた。それから、制限酵素
Ｓａｔ Ｉで消化し、１％アガロースゲル電気泳動によ
り約３５０ｂｐのＳａｌ ｌ− Ｓａｌ ｌフラグメン
ト（フラグメン１−Ｄ）を調製した．このフラグメント
Ｄには、サイトメガロウイルスのエンハンサー領域が含
まれている．次に、実施例（１）で構築したプラスミド
ｐＡＧＧを、制限酵素Ａａｔｌｌで消化し、末端を７４
ＤＮＡポリメラーゼで平滑にした後、リン酸化したＳ
ａｉ１リンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼにより結合させ
た。さらに制限酵素Ｓａｌ Ｉで消化した後、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼによりフラグメントＤを結合させ、発現ベ
クターｐＣＡＧＧ （第３図参照〉を構築した。
含むプラスミドｐｃＤＭ８ ［フナコシ社製コを制限酵
素Ｈｉｎｃｌｌ及び旧ｎｄｌ［Ｉで消化し、１％アガロ
ースゲル電気泳動により約６５０ｂｐの旧ｎｃＩ［−Ｈ
ｉｎｄｍフラグメント（フラグメントＣ〉を調製した．
プラスミドｐＵｃ１８を制限酵素旧ｎｃＵ及び旧ｎｄｎ
［で消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによりフラグメント
Ｃを結合させ、プラスミドｐＵｃ−ＣＭＰを調製した，
ｐＵｃ−ＣＭＰを制限酵素Ｎｃｏｌで消化し、末端
をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで修−２３一 復した後、リン酸化したＳａｌ Ｉリンヵ一をＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼによって結合させた。それから、制限酵素
Ｓａｔ Ｉで消化し、１％アガロースゲル電気泳動によ
り約３５０ｂｐのＳａｌ ｌ− Ｓａｌ ｌフラグメン
ト（フラグメン１−Ｄ）を調製した．このフラグメント
Ｄには、サイトメガロウイルスのエンハンサー領域が含
まれている．次に、実施例（１）で構築したプラスミド
ｐＡＧＧを、制限酵素Ａａｔｌｌで消化し、末端を７４
ＤＮＡポリメラーゼで平滑にした後、リン酸化したＳ
ａｉ１リンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼにより結合させ
た。さらに制限酵素Ｓａｌ Ｉで消化した後、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼによりフラグメントＤを結合させ、発現ベ
クターｐＣＡＧＧ （第３図参照〉を構築した。
実施例３： べ −ＣＡＧＧＳ
調製例（６〉で構築したプラスミドｐＡＧｓ−２を制限
酵素Ｂａ＋ｏ旧で消化し、１％アガロースゲル電気泳動
により約３５０ｂｐのＲａｍ旧−Ｂａｍ旧フラグメント
（フラグメントＥ〉を調製した。フラグメントＥには、
ＳＶ４０ｏｒｉとＳＶ４０初期転写のボリアデニレーシ
ョンシグナルが含まれている。
酵素Ｂａ＋ｏ旧で消化し、１％アガロースゲル電気泳動
により約３５０ｂｐのＲａｍ旧−Ｂａｍ旧フラグメント
（フラグメントＥ〉を調製した。フラグメントＥには、
ＳＶ４０ｏｒｉとＳＶ４０初期転写のボリアデニレーシ
ョンシグナルが含まれている。
一２４一
次に、実施例（２）で構築したプラスミドｐＣＡＧＧを
制限酵素ＰｖｕｌＩで消化し、リン酸化したＢａＩＩ１
旧リンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼによって結合させた
．それから制限酵素Ｂａ＋ａＨＩで消化し、Ｔ４ ＩＩ
ＮＡリガーゼによりフラグメントＥを結合させ、発現ベ
クターｐＣＡＧＧＳ（第４図参照〉を構築した。
制限酵素ＰｖｕｌＩで消化し、リン酸化したＢａＩＩ１
旧リンカーをＴ４ ＤＮＡリガーゼによって結合させた
．それから制限酵素Ｂａ＋ａＨＩで消化し、Ｔ４ ＩＩ
ＮＡリガーゼによりフラグメントＥを結合させ、発現ベ
クターｐＣＡＧＧＳ（第４図参照〉を構築した。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合ベクターｐＭｃ１８７
１［ファルマシア社製］を制限酵素Ｓａｌ Ｉで消化し
、１ｘアガロースゲル電気泳動により約３． １ｋｂｐ
のＳａｌ ＩＳａｌ Ｉフラグメント（フラグメントＦ
〉を調製した。フラグメントＦには、開始コドン（ＡＴ
Ｇ）を欠いたＪａｃＺ３１１伝子のほぼ全長が含まれて
いる．次に、実施例（３）で構築したプラスミドｐｃＡ
ＧＧｓを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、末端を７４ Ｄ
ＩＩＩＡボリメラーゼで修復した後、リン酸化したＸｈ
ｏ ＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼによって結合させ
ることにより、プラスミドｐｃＡＧＧｓ （Ｘｈｏ Ｉ
）を調製した。それがら、このプラスミドｐｃＡＧＧ
ｓ（Ｘｈｏｌ）を制限酵素Ｘｈｏｌで消化一２５一 し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによりフラグメントＦを結合
させた後、さらに制限酵素Ｘｂａｌ及びＥｃｏＲＶで消
化し、１％アガロースゲル電気泳動を行うことにより約
６．３ｋｂｐのＸｂａｌ−ＥｃｏＲＶフラグメント《フ
ラグメントＧ）を調製した． 調製例（５）で構築したプラスミドｐＡＧ−１ａｃＺを
制限酵素Ｘｂａｌ及びＥｃｏＲＶで消化し、１％アガロ
ースゲル電気泳動により約１． ５ｋｂｐのＸｂａｌ
− ＥｃｏＲＶフラグメント（フラグメントＨ〉を調製
した．このフラグメントＨには、開始コドン（ＡＴＧ）
を含むｌａｃＺ遺伝子の５゜末端側約１． ４ｋｂｐが
含まれている．このフラグメントＨと、先のフラグメン
トＧとをＴ４ ＤＮＡリガーゼで結合させることにより
、βガラクトシダーゼ発現プラスミドｐｃＡＧＧｓ−１
ａｃＺを構築した． このプラスミドｐＣＡＧＧＳ−１ａｃＺを制限酵素旧ｎ
ｄｌｌＩで消化し、１ｘアガロースゲル電気泳動により
約３．６ｋｂｐの旧ｎｄｍ一旧ｎｄｍフラグメント（フ
ラグメントエ〉を調製した。このフラグメントＩには、
開始コドン（ＡＴＧ）を含むｌ ａｃＺ遺伝子全長が含
まれている．−２６− 次に、実施例（１）で構築したプラスミドｐＡＧＧを制
限酵素ＥｃｏＲＴで消化し、Ｔ４ １１ＮＡボリメラー
ゼ処理後、リン酸化したＨｉｎｄｌ［ＩリンカーをＴ４
ＤＮＡリガーゼにより結合させた．それから、制限酵
素Ｈｉｎｄｆｌｌで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用
いて先のフラグメントＩを結合させることによってβ−
ガラクトシダーゼ発現プラスミドｐＡＧＧ−１ａｃＺを
構築した．同様にして、実施例（２）で構築したプラス
ミドｐＣＡＧＧから、β−ガラクトシダーゼ発現プラス
ミドｐＣＡＧＧ−１ａｃＺを構築した。
１［ファルマシア社製］を制限酵素Ｓａｌ Ｉで消化し
、１ｘアガロースゲル電気泳動により約３． １ｋｂｐ
のＳａｌ ＩＳａｌ Ｉフラグメント（フラグメントＦ
〉を調製した。フラグメントＦには、開始コドン（ＡＴ
Ｇ）を欠いたＪａｃＺ３１１伝子のほぼ全長が含まれて
いる．次に、実施例（３）で構築したプラスミドｐｃＡ
ＧＧｓを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、末端を７４ Ｄ
ＩＩＩＡボリメラーゼで修復した後、リン酸化したＸｈ
ｏ ＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼによって結合させ
ることにより、プラスミドｐｃＡＧＧｓ （Ｘｈｏ Ｉ
）を調製した。それがら、このプラスミドｐｃＡＧＧ
ｓ（Ｘｈｏｌ）を制限酵素Ｘｈｏｌで消化一２５一 し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによりフラグメントＦを結合
させた後、さらに制限酵素Ｘｂａｌ及びＥｃｏＲＶで消
化し、１％アガロースゲル電気泳動を行うことにより約
６．３ｋｂｐのＸｂａｌ−ＥｃｏＲＶフラグメント《フ
ラグメントＧ）を調製した． 調製例（５）で構築したプラスミドｐＡＧ−１ａｃＺを
制限酵素Ｘｂａｌ及びＥｃｏＲＶで消化し、１％アガロ
ースゲル電気泳動により約１． ５ｋｂｐのＸｂａｌ
− ＥｃｏＲＶフラグメント（フラグメントＨ〉を調製
した．このフラグメントＨには、開始コドン（ＡＴＧ）
を含むｌａｃＺ遺伝子の５゜末端側約１． ４ｋｂｐが
含まれている．このフラグメントＨと、先のフラグメン
トＧとをＴ４ ＤＮＡリガーゼで結合させることにより
、βガラクトシダーゼ発現プラスミドｐｃＡＧＧｓ−１
ａｃＺを構築した． このプラスミドｐＣＡＧＧＳ−１ａｃＺを制限酵素旧ｎ
ｄｌｌＩで消化し、１ｘアガロースゲル電気泳動により
約３．６ｋｂｐの旧ｎｄｍ一旧ｎｄｍフラグメント（フ
ラグメントエ〉を調製した。このフラグメントＩには、
開始コドン（ＡＴＧ）を含むｌ ａｃＺ遺伝子全長が含
まれている．−２６− 次に、実施例（１）で構築したプラスミドｐＡＧＧを制
限酵素ＥｃｏＲＴで消化し、Ｔ４ １１ＮＡボリメラー
ゼ処理後、リン酸化したＨｉｎｄｌ［ＩリンカーをＴ４
ＤＮＡリガーゼにより結合させた．それから、制限酵
素Ｈｉｎｄｆｌｌで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用
いて先のフラグメントＩを結合させることによってβ−
ガラクトシダーゼ発現プラスミドｐＡＧＧ−１ａｃＺを
構築した．同様にして、実施例（２）で構築したプラス
ミドｐＣＡＧＧから、β−ガラクトシダーゼ発現プラス
ミドｐＣＡＧＧ−１ａｃＺを構築した。
実施例５： ベ ーＣＡＧ− ＣＡＧＳ調製
例（５）で構築したプラスミドｐＡＧ−２を制限酵素Ｘ
ｈｏｌで消化し、これに実施例（２）で調製したフラグ
メントＤを結合させることにより発現ベクターｐＣＡＧ
−２を構築した。
例（５）で構築したプラスミドｐＡＧ−２を制限酵素Ｘ
ｈｏｌで消化し、これに実施例（２）で調製したフラグ
メントＤを結合させることにより発現ベクターｐＣＡＧ
−２を構築した。
同様に、調製例（６〉で構築したプラスミドｐＡＧｓ２
から発現ベクターｐＣＡＧＳ−２ （第５図〉を構築し
た．調製例（５）で構築したプラスミドｐＡＧ−１ａｃ
Ｚを制限−２７− 酵素Ｘｈｏ Ｉで消化し、これに実施例〈２〉で調製し
たフラグメントＤを結合させることによりβ−ガラクト
シダーゼ発現プラスミドｐＣＡＧ−１ａｃＺを構築した
．同様に、調製例（６）で構築したプラスミドｐＡＧＳ
−ＩａｃＺからβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドｐ
ＣＡＧＳ−１ａｃＺを構築した。
から発現ベクターｐＣＡＧＳ−２ （第５図〉を構築し
た．調製例（５）で構築したプラスミドｐＡＧ−１ａｃ
Ｚを制限−２７− 酵素Ｘｈｏ Ｉで消化し、これに実施例〈２〉で調製し
たフラグメントＤを結合させることによりβ−ガラクト
シダーゼ発現プラスミドｐＣＡＧ−１ａｃＺを構築した
．同様に、調製例（６）で構築したプラスミドｐＡＧＳ
−ＩａｃＺからβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドｐ
ＣＡＧＳ−１ａｃＺを構築した。
１００＋ｍｍ円形シャーレに、ＣＯＳ−細胞又はＬ一細
胞１×１０’細胞／ｄｉｓｈをまき、常法に従いリン酸
カルシウム法により種々のプラスミド（ ｐｃＨ１１０
、ＰＡＣ−１＆ＣＺ、ｐＡＧ−１ａｃＺ．ｐＡＧｓ−１
ａｃＺ， ｐＡＧＧ−］ａｃＺ， ｐＡＧＧｓ−１ａ
ｃＺ、ｐＣＡＧ−１ａｃＺ．ｐｃＡＧｓ−１ａｃＺ．ｐ
ｃＡＧＧｌａｃＺ．ｐｃＡＧＧｓ−１ａｃＺ） ＤＮＡ
各２０μ９をこれらの宿主細胞に導入した。
胞１×１０’細胞／ｄｉｓｈをまき、常法に従いリン酸
カルシウム法により種々のプラスミド（ ｐｃＨ１１０
、ＰＡＣ−１＆ＣＺ、ｐＡＧ−１ａｃＺ．ｐＡＧｓ−１
ａｃＺ， ｐＡＧＧ−］ａｃＺ， ｐＡＧＧｓ−１ａ
ｃＺ、ｐＣＡＧ−１ａｃＺ．ｐｃＡＧｓ−１ａｃＺ．ｐ
ｃＡＧＧｌａｃＺ．ｐｃＡＧＧｓ−１ａｃＺ） ＤＮＡ
各２０μ９をこれらの宿主細胞に導入した。
リン酸力ルシウムーＤＮＡゲルを細胞と２４時間接触さ
せた後、更に１０％ＦＣＳ−ＤＭ１ｉで２４時間培養し
た．トリプシン処理により細胞をｄ ｉｓｈからはがし
、低速遠心によりベレッテイングした後、Ｆ−Ｔ ｂｕ
ｆｆｅｒ （２５０ｍＭシヨ糖、 １０ｍＭＴｒｉｓ−
１１ＣＩ．ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＲＤＴＡ）２００Ｊ
Ａに懸濁し、凍結融解を３回繰り返した後遠心−詔一 し、上清を回収した。
せた後、更に１０％ＦＣＳ−ＤＭ１ｉで２４時間培養し
た．トリプシン処理により細胞をｄ ｉｓｈからはがし
、低速遠心によりベレッテイングした後、Ｆ−Ｔ ｂｕ
ｆｆｅｒ （２５０ｍＭシヨ糖、 １０ｍＭＴｒｉｓ−
１１ＣＩ．ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＲＤＴＡ）２００Ｊ
Ａに懸濁し、凍結融解を３回繰り返した後遠心−詔一 し、上清を回収した。
このようにして得られた細胞抽出液２００−から１０一
を分取し、β−ｇａｌ活性の測定に用いた。β一ｇａ＋
活性は、常法に従い、ＯＮＰＧ （ ｏ−ＮＩＴＲＯＰ
ＨＥＮＹＬ−βＤ−ＧＡＬＡＣＴＯＰＹＲＡＮＯ３１Ｄ
Ｅ）の発色に伴う４２０ｎｍの吸光度の変化を調べるこ
とによって行った。その際Ｓ■４０初期プロモーターを
用いたプラスミドｐｃＨ１１０ ［ファルマシア社製］
によって形質転換されたＣＯＳ細胞又はＬ一細胞の細胞
抽出液が示した吸光度を１としたときの相対的な値を表
１に示した。
を分取し、β−ｇａｌ活性の測定に用いた。β一ｇａ＋
活性は、常法に従い、ＯＮＰＧ （ ｏ−ＮＩＴＲＯＰ
ＨＥＮＹＬ−βＤ−ＧＡＬＡＣＴＯＰＹＲＡＮＯ３１Ｄ
Ｅ）の発色に伴う４２０ｎｍの吸光度の変化を調べるこ
とによって行った。その際Ｓ■４０初期プロモーターを
用いたプラスミドｐｃＨ１１０ ［ファルマシア社製］
によって形質転換されたＣＯＳ細胞又はＬ一細胞の細胞
抽出液が示した吸光度を１としたときの相対的な値を表
１に示した。
表 １
ＣＯＳ−ｅｅｌ１
ｐｃＨ１１０ １．ＯｐＡｃ−
１ａｃＺ ４． ０ｐＡＧ−１ａ
ｃＺ １２．ＯｐＡＧＧ−１ａｃＺ
２１．４ｐＣＡＧ−１ ａｃＺ
６． ８ｐＣＡＧＧ−１ａｃＺ
１７．５Ｌ−ｃｅｌｌ １，０ ５．０ １０ｏ２ ２０．４ ７６．０ １１６．２ 一２９− 表１ つづき ｐＡＧｓ−１ａｃＺ ５５．８
７．４ｐＡＧＧｓ−１ａｃＺ １
６１． ０ １３． ３ｐｃＡＧｓ−１ａｃ
Ｚ ２５．２ ７２．１ｐ
ｃＡＧＧｓ−１ａｃＺ １０５．７
１２１．９上記の表から明かなように、本願発明の
各種新規ベクターに１ａｃＺ遺伝子を組み込んだプラス
ミドでは、本来のニワトリのβ−アクチンプロモーター
を用いたベクターと比較して、非常に高い発現量を示し
た。
１ａｃＺ ４． ０ｐＡＧ−１ａ
ｃＺ １２．ＯｐＡＧＧ−１ａｃＺ
２１．４ｐＣＡＧ−１ ａｃＺ
６． ８ｐＣＡＧＧ−１ａｃＺ
１７．５Ｌ−ｃｅｌｌ １，０ ５．０ １０ｏ２ ２０．４ ７６．０ １１６．２ 一２９− 表１ つづき ｐＡＧｓ−１ａｃＺ ５５．８
７．４ｐＡＧＧｓ−１ａｃＺ １
６１． ０ １３． ３ｐｃＡＧｓ−１ａｃ
Ｚ ２５．２ ７２．１ｐ
ｃＡＧＧｓ−１ａｃＺ １０５．７
１２１．９上記の表から明かなように、本願発明の
各種新規ベクターに１ａｃＺ遺伝子を組み込んだプラス
ミドでは、本来のニワトリのβ−アクチンプロモーター
を用いたベクターと比較して、非常に高い発現量を示し
た。
酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモーターを有し、
酵母を形質転換することによりＨＢｓＡｇを産生するこ
とのできるプラスミドｐＡｓ１０１ （特公昭６１−３
０一 ５５９５１） （１０μ９）をＸｈｏＩ （１０ｕ）
で３７℃４時間反応させ、６ｘアガロースゲルにて電気
泳動させる。ＨＢＳ遺伝子を含む１． ３Ｋｂのバンド
をアガロースゲルから切り出し、透析チューブに入れ再
び電気泳動させる。ゲル断片からＤＮＡが溶出されたの
ち、透析チューブよりＤＮＡ溶液のみを取り出し、エタ
ノール沈澱によりＤＮＡを抽出する．抽出したＨＢｓ遺
伝子を含むＤＮＡ断片１μ９を７４ ＤＮＡポリメラー
ゼ（ｌｕ）で３７℃３０分間反応させる。フェノール処
理、エタノール沈澱によりＤＮＡを抽出する。
酵母を形質転換することによりＨＢｓＡｇを産生するこ
とのできるプラスミドｐＡｓ１０１ （特公昭６１−３
０一 ５５９５１） （１０μ９）をＸｈｏＩ （１０ｕ）
で３７℃４時間反応させ、６ｘアガロースゲルにて電気
泳動させる。ＨＢＳ遺伝子を含む１． ３Ｋｂのバンド
をアガロースゲルから切り出し、透析チューブに入れ再
び電気泳動させる。ゲル断片からＤＮＡが溶出されたの
ち、透析チューブよりＤＮＡ溶液のみを取り出し、エタ
ノール沈澱によりＤＮＡを抽出する．抽出したＨＢｓ遺
伝子を含むＤＮＡ断片１μ９を７４ ＤＮＡポリメラー
ゼ（ｌｕ）で３７℃３０分間反応させる。フェノール処
理、エタノール沈澱によりＤＮＡを抽出する。
次に、前述の調製例（５）、ク６〉及び実施例１〜４で
構築した８種類のプラスミドＰＡＧ−２、ｐｋＧＧ．ｐ
ＣＡＧ−２、ｐｃＡＯＧ、ｐＡＧｓ−２、ｐＡＧＧｓ．
ｐｃＡＧｓ及びｐＣＡＧＧＳを、それぞれ制限酵素Ｓａ
ｌ Ｉで消化した後、仔牛小腸由来アルカリフ才スファ
ターゼの作用により脱リン酸化した。そして、それぞれ
に、先のＨＢｓ Ａｇ遺伝子を含む約１、３ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用により連
結環状化することにより、ｐＡＧ−Ｈｌｌｌｓ， ｐ
ＡＧＧ−ＨＢｓ．ｐＣＡＧ−ＨＢｓ， ｐＣＡＧＧ−
ＨＢｓ．ｐＡＧｓ−ＨＢｓ、ｐＡＧＧｓ−ＨＢｓ、ｐｃ
ＡＧｓ−ＨＢｓ及びｐｃＡＧＧｓ−ＨＢｓを構築した。
構築した８種類のプラスミドＰＡＧ−２、ｐｋＧＧ．ｐ
ＣＡＧ−２、ｐｃＡＯＧ、ｐＡＧｓ−２、ｐＡＧＧｓ．
ｐｃＡＧｓ及びｐＣＡＧＧＳを、それぞれ制限酵素Ｓａ
ｌ Ｉで消化した後、仔牛小腸由来アルカリフ才スファ
ターゼの作用により脱リン酸化した。そして、それぞれ
に、先のＨＢｓ Ａｇ遺伝子を含む約１、３ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を添加し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用により連
結環状化することにより、ｐＡＧ−Ｈｌｌｌｓ， ｐ
ＡＧＧ−ＨＢｓ．ｐＣＡＧ−ＨＢｓ， ｐＣＡＧＧ−
ＨＢｓ．ｐＡＧｓ−ＨＢｓ、ｐＡＧＧｓ−ＨＢｓ、ｐｃ
ＡＧｓ−ＨＢｓ及びｐｃＡＧＧｓ−ＨＢｓを構築した。
＝３１ー
また、ＨＢｓＡｇの発現量評価のための参照発現プラス
ミドｐｓＶＥｓ−ＦＩＢｓは以下のごとく構築した。
ミドｐｓＶＥｓ−ＦＩＢｓは以下のごとく構築した。
上記と同様に、プラス多ドｐＡＳＩＯＩを制限酵素ｘｈ
ｏｆで消化し、アクリルアミドゲル電気泳動にょりＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出
した．一方、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを持つプ
ラスミドｐ）［ＳＶ−１０ （ ７ ７ ルマシア〉１
μ９をＢｇｌＩ［（ｌｕ）で３７℃１時間反応させる．
フェノール処理、エタノール沈澱によりＤＮＡを抽出す
る。抽出したＤＮＡを上記と同様にＴ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ処理を行う． ＴＪＤＮＡポリメラーゼ反応に
より末端を平滑末端に変換しｔ．；ＨＢｓ遺伝子断片５
００ｎｇトｐＫｓＶ−１０５０ｎｇとをＴ４ ＩＩＮＡ
リガーゼ（１ｕ）で４℃、１２時間反応させる。この反
応液と大騙菌■ＢＩＯＩを形質転換させる。形質転換体
がらプラスミドを抽出し、ｐＫｓＶ−１０にＨＢｓ遺伝
子が挿入されたプラスミドｐｓｖＥ９４８ｓを得ること
ができた，（２） ＣＯＳＩＩＩ胞におけるＨＢｓＡｇ
の発現ファルコン細胞培養６穴プレートに、ＩＸＩＯ５
細胞／穴のｃｏｓ−細胞をまき、常法通りＤＲＡＥ−Ｄ
ｅｘｔｒａｎ法により下記プラスミドＤＮＡ各５μ９を
導入した， Ｃｅｌｌ−３２− Ｐｈｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （フ
ァルマシア社製）を用いて、ＤＮＡ導入後３日後の培養
上清を分取し、ＨＢｓＡｇ検出キット「オースリアＩＩ
Ｊ （ダイナボット社製）を用いてＨＢｓＡｇ活性を
測定したく表２）．ｐｓＶＥｓ−［｛Ｂｓ ｐＡＧ−ＨＢｓ ｐＡＧＧ−ＨＢｓ ｐＣＡＧ−ＨＢｓ ｐＣＡＧＧ−ＨＢｓ ｐＡＧｓ−ＨＢｓ ｐＡＧＧ３−ＨＢｓ ｐＣＡＧＳ−ＨＢｓ ８００ ２９００ ３１００ ２０００ ２６００ ７０００ ８ｌ００ ４２００ その結果、本発明において構築した新規発現プラスミド
は、いずれも、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを用い
たｐｓＶＥ−１１Ｂｓよりも高いＨＢｓＡｇ活性を示し
た． −３３一
ｏｆで消化し、アクリルアミドゲル電気泳動にょりＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出
した．一方、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを持つプ
ラスミドｐ）［ＳＶ−１０ （ ７ ７ ルマシア〉１
μ９をＢｇｌＩ［（ｌｕ）で３７℃１時間反応させる．
フェノール処理、エタノール沈澱によりＤＮＡを抽出す
る。抽出したＤＮＡを上記と同様にＴ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ処理を行う． ＴＪＤＮＡポリメラーゼ反応に
より末端を平滑末端に変換しｔ．；ＨＢｓ遺伝子断片５
００ｎｇトｐＫｓＶ−１０５０ｎｇとをＴ４ ＩＩＮＡ
リガーゼ（１ｕ）で４℃、１２時間反応させる。この反
応液と大騙菌■ＢＩＯＩを形質転換させる。形質転換体
がらプラスミドを抽出し、ｐＫｓＶ−１０にＨＢｓ遺伝
子が挿入されたプラスミドｐｓｖＥ９４８ｓを得ること
ができた，（２） ＣＯＳＩＩＩ胞におけるＨＢｓＡｇ
の発現ファルコン細胞培養６穴プレートに、ＩＸＩＯ５
細胞／穴のｃｏｓ−細胞をまき、常法通りＤＲＡＥ−Ｄ
ｅｘｔｒａｎ法により下記プラスミドＤＮＡ各５μ９を
導入した， Ｃｅｌｌ−３２− Ｐｈｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （フ
ァルマシア社製）を用いて、ＤＮＡ導入後３日後の培養
上清を分取し、ＨＢｓＡｇ検出キット「オースリアＩＩ
Ｊ （ダイナボット社製）を用いてＨＢｓＡｇ活性を
測定したく表２）．ｐｓＶＥｓ−［｛Ｂｓ ｐＡＧ−ＨＢｓ ｐＡＧＧ−ＨＢｓ ｐＣＡＧ−ＨＢｓ ｐＣＡＧＧ−ＨＢｓ ｐＡＧｓ−ＨＢｓ ｐＡＧＧ３−ＨＢｓ ｐＣＡＧＳ−ＨＢｓ ８００ ２９００ ３１００ ２０００ ２６００ ７０００ ８ｌ００ ４２００ その結果、本発明において構築した新規発現プラスミド
は、いずれも、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを用い
たｐｓＶＥ−１１Ｂｓよりも高いＨＢｓＡｇ活性を示し
た． −３３一
第１図は、調製例で構築したｐＡＧ−２が有するニワト
リのβ−アクチンプロモーターとウサギのβグロビン遺
伝子とのハイブリッドプロモーターの塩基配列を示す． 第２図は、本発明の新規ベクターｐＡＧＧの構造を示す
． 第３図は、本発明の新規ベクターｐＣＡＧＧの構造を示
す。 第４図は、本発明の新規ベクターｐｃＡＧＧｓの構造を
示す． 第５図は、本発明の新規ベクターｐｃＡＧｓ−２の構造
を示す．
リのβ−アクチンプロモーターとウサギのβグロビン遺
伝子とのハイブリッドプロモーターの塩基配列を示す． 第２図は、本発明の新規ベクターｐＡＧＧの構造を示す
． 第３図は、本発明の新規ベクターｐＣＡＧＧの構造を示
す。 第４図は、本発明の新規ベクターｐｃＡＧＧｓの構造を
示す． 第５図は、本発明の新規ベクターｐｃＡＧｓ−２の構造
を示す．
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターにお
ける、イントロン領域の途中からその下流（３’端側）
のスプライスアクセプター配列を含めた３’端側の遺伝
子を除去し、これにウサギのβ−グロビンのスプライシ
ングアクセプター配列を含む外来遺伝子を接続したハイ
ブリッドプロモーターを有しさらに、ターミネーター配
列を外来遺伝子発現用の制御配列として有することを特
徴とする発現ベクター。 （２）スプライシングアクセプター配列が、ウサギのβ
−グロビン構造遺伝子に含まれるスプライシングアクセ
プター配列を有する遺伝子断片である前記第（１）項記
載の発現ベクター。 （３）ターミネーター配列が、β−グロビン遺伝子由来
の遺伝子である前記第（１）項記載の発現ベクタ（４）
外来遺伝子発現用の制御配列としてエンハンサーをさら
に有する前記第（１）項記載の発現ベクタ（５）該エン
ハンサーがサイトメガロウイルス由来の遺伝子である前
記第（４）項記載の発現ベクター。 （６）ニワトリのβ−アクチン遺伝子プロモーターにお
ける、イントロン領域の途中からその下流（３’端側）
のスプライスアクセプター配列を含めた３’端側の遺伝
子を除去し、これにウサギのβ−グロビンのスプライシ
ングアクセプター配列を含む外来遺伝子を接続したハイ
ブリッドプロモーターを有しさらにターミネーター配列
を外来遺伝子発現用の制御配列として有する発現ベクタ
ーを用い、このベクタ−のハイブリッドプロモーター下
流に外来構造遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドによ
り真核細胞を形質転換し、これを培養することを特徴と
する外来遺伝子の発現方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1309785A JP2824434B2 (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | 新規発現ベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1309785A JP2824434B2 (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | 新規発現ベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03168087A true JPH03168087A (ja) | 1991-07-19 |
| JP2824434B2 JP2824434B2 (ja) | 1998-11-11 |
Family
ID=17997215
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1309785A Expired - Lifetime JP2824434B2 (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | 新規発現ベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2824434B2 (ja) |
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002034559A (ja) * | 2000-07-18 | 2002-02-05 | Nippon Inst For Biological Science | 遺伝子発現単位 |
| WO2003004641A1 (fr) | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Procede relatif a l'elaboration de thrombine humaine par modification genique |
| KR100379654B1 (ko) * | 1994-09-19 | 2004-12-03 | 스미또모 세이야꾸 가부시키가이샤 | 동물세포의형질감염을위한재조합dna바이러스벡터 |
| WO2005040364A1 (ja) | 2003-10-24 | 2005-05-06 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 新規なタンパク質高産生組換え動物細胞、その作製方法及びそれを用いたタンパク質を大量産生する方法 |
| WO2006134917A1 (ja) | 2005-06-14 | 2006-12-21 | Dnavec Corporation | 抗体の作製方法 |
| WO2007040162A1 (ja) | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 培養細胞による組換えヒトトロンビンの製造方法 |
| WO2007122975A1 (ja) | 2006-04-20 | 2007-11-01 | Kringle Pharma Inc. | Ｈｇｆ前駆体蛋白質改変体及びその活性型蛋白質 |
| WO2007139178A1 (ja) | 2006-05-31 | 2007-12-06 | Dnavec Corporation | アルツハイマー病治療薬 |
| WO2008096811A1 (ja) | 2007-02-07 | 2008-08-14 | Dnavec Corporation | 弱毒化マイナス鎖rnaウイルス |
| WO2009128474A1 (ja) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | 財団法人化学及血清療法研究所 | トロンビン固定化生体吸収性シート製剤の製造方法 |
| WO2010050586A1 (ja) | 2008-10-31 | 2010-05-06 | ディナベック株式会社 | 組み換え蛋白質の発現を増強する方法 |
| WO2011040526A1 (ja) | 2009-09-30 | 2011-04-07 | 国立大学法人帯広畜産大学 | α-ガラクトースエピトープ発現ウイルス及びワクチンの作製方法 |
| EP2392657A1 (en) | 2005-07-05 | 2011-12-07 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Modified transposon vector and its use |
| EP2434020A2 (en) | 2004-01-22 | 2012-03-28 | Dnavec Research Inc. | Method of producing minus strand RNA virus vector with the use of hybrid promoter containing cytomegalovirus enhancer and avian beta-actin promoter |
| JP2014502159A (ja) * | 2010-11-30 | 2014-01-30 | エルジー ライフ サイエンシーズ リミテッド | 新たなハイブリッドプロモーター及びそれを含む組換えベクター |
| EP2806027A1 (en) | 2003-07-29 | 2014-11-26 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Process for producing recombinant fibrinogen highly producing cell and highly producing cell |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2759593B1 (en) | 2007-06-22 | 2017-03-01 | The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Novel ADAMTS-13 mutant |
| JP5513120B2 (ja) | 2007-10-09 | 2014-06-04 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 糖鎖を持たない遺伝子組換え血液凝固第ｘ因子およびその製法 |
| DK2223999T3 (en) | 2007-11-30 | 2017-12-18 | Eisai R&D Man Co Ltd | EPHA4 POLYPEPTIDE WITH UNKNOWN ACTIVITY AND USE THEREOF |
-
1989
- 1989-11-28 JP JP1309785A patent/JP2824434B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| KR100379654B1 (ko) * | 1994-09-19 | 2004-12-03 | 스미또모 세이야꾸 가부시키가이샤 | 동물세포의형질감염을위한재조합dna바이러스벡터 |
| JP2002034559A (ja) * | 2000-07-18 | 2002-02-05 | Nippon Inst For Biological Science | 遺伝子発現単位 |
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| WO2003004641A1 (fr) | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Procede relatif a l'elaboration de thrombine humaine par modification genique |
| CN100347297C (zh) * | 2001-07-06 | 2007-11-07 | 财团法人化学及血清疗法研究所 | 利用基因工程技术制备人凝血酶的方法 |
| EP2806027A1 (en) | 2003-07-29 | 2014-11-26 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Process for producing recombinant fibrinogen highly producing cell and highly producing cell |
| WO2005040364A1 (ja) | 2003-10-24 | 2005-05-06 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 新規なタンパク質高産生組換え動物細胞、その作製方法及びそれを用いたタンパク質を大量産生する方法 |
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| WO2008096811A1 (ja) | 2007-02-07 | 2008-08-14 | Dnavec Corporation | 弱毒化マイナス鎖rnaウイルス |
| WO2009128474A1 (ja) | 2008-04-16 | 2009-10-22 | 財団法人化学及血清療法研究所 | トロンビン固定化生体吸収性シート製剤の製造方法 |
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| JP2014502159A (ja) * | 2010-11-30 | 2014-01-30 | エルジー ライフ サイエンシーズ リミテッド | 新たなハイブリッドプロモーター及びそれを含む組換えベクター |
| US9234211B2 (en) | 2010-11-30 | 2016-01-12 | Lg Life Sciences Ltd. | Hybrid promoter and recombinant vector comprising the same |
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| JP2824434B2 (ja) | 1998-11-11 |
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