WO2011040526A1 - α-ガラクトースエピトープ発現ウイルス及びワクチンの作製方法 - Google Patents

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晴子 小川
邦俊 今井
貴寛 田上
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国立大学法人帯広畜産大学
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Definitions

  • the present invention relates to a virus that inoculates a cell line in which an ⁇ -galactose epitope (Gal ⁇ 1-3Gal ⁇ 1-4GlcNAc-R: hereinafter sometimes abbreviated as ⁇ -Gal) is expressed by gene transfer to express ⁇ -Gal. And a method for producing a vaccine using this virus.
  • ⁇ -Gal ⁇ -galactose epitope
  • Vaccines made from growing chicken eggs are effective for preventing influenza.
  • Current human influenza vaccines do not contain immune enhancing agents that may cause side effects, but if new influenza occurs in the future, it is assumed that the vaccine will be used urgently.
  • the development of a method for enhancing the vaccine effect is an important issue.
  • by providing a highly effective vaccine even in a small amount it is necessary to secure technology that allows more people to be vaccinated.
  • Patent Document 1 A method for producing a vaccine against influenza virus using a cultured cell system is described in Patent Document 1, for example.
  • avian embryonic stem cells are used, but there is no disclosure of a technique for safely enhancing the vaccine effect.
  • ⁇ -galactose epitope is a sugar antigen similar in structure to the ABO blood group antigen, and is activated by ⁇ 1,3-galactose transferase (hereinafter abbreviated as ⁇ 1,3GT) Expressed on the surface.
  • ⁇ -Gal is expressed in most mammals, but ⁇ -Gal is not expressed in humans and birds because the ⁇ 1,3GT gene does not function. Therefore, humans and birds recognize ⁇ -Gal as a foreign antigen and possess a natural antibody against ⁇ -Gal (anti- ⁇ -Gal antibody) (Non-patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 The reaction between ⁇ -Gal and anti- ⁇ -Gal antibody is a cause of hyperacute rejection in organ transplantation between different species such as pigs and humans. Ogawa, one of the inventors of the present invention, worked on the control technology of ⁇ -Gal and anti- ⁇ -Gal antibody in xenotransplantation, and also engaged in research on the antigenicity enhancement of cancer vaccine using this reaction, and confirmed its effectiveness (Non-Patent Document 2).
  • anti- ⁇ -Gal antibody binds to the virus in humans and birds.
  • Galili et al. Have reported that binding to the Fc ⁇ receptor of antigen-presenting cells results in effective antigen presentation and may enhance the immune response to the virus (opsonization) (non-patented). Reference 3). Galili et al. Also reported an experiment on AIDS virus (Non-patent Document 4).
  • Non-Patent Documents 1 to 7 The entire description of Non-Patent Documents 1 to 7 is specifically incorporated herein by reference.
  • Non-patent Documents 3 and 4 In vitro enzyme reactions have been used as a method for expressing ⁇ -Gal in viruses (Non-patent Documents 3 and 4). However, this method requires the enzyme used for the reaction, requires the enzyme reaction time, requires removal of the enzyme reaction solution, etc. It is considered difficult to prepare a Gal-expressing virus.
  • an object of the present invention is to provide a method capable of producing an ⁇ -Gal expression virus having an enhanced immune response to the virus without using an enzyme. Furthermore, an object of the present invention is to provide a highly effective (antigenic) vaccine, particularly an influenza virus vaccine, using the ⁇ -Gal expression virus prepared by this method.
  • the present inventors introduced ⁇ 1, 3-galactose transferase gene into a cell line that does not naturally express ⁇ -Gal in a state capable of expressing the ⁇ 1,3-galactosyltransferase gene, and infects the resulting cell line with a virus, thereby allowing ⁇ - The ability to produce a virus that expresses Gal ( ⁇ -galactose epitope), and furthermore, by using this ⁇ -Gal-expressing virus, compared to the conventional vaccine using a virus that does not express ⁇ -Gal, The present invention was completed by finding that a vaccine with an enhanced immune response was obtained.
  • the present invention is as follows. [1] (1) Introducing ⁇ -Gal into a cell line that does not express an ⁇ -galactose epitope (Gal ⁇ 1-3Gal ⁇ 1-4GlcNAc-R: ⁇ -Gal) in a state capable of expressing an ⁇ 1,3-galactosyltransferase gene. Obtaining a cell line capable of expression; (2) inoculating a cell line capable of expressing ⁇ -Gal with a virus to obtain a virus-infected cell line; and (3) A method for producing an ⁇ -Gal-expressing virus, comprising culturing the virus-infected cell line to obtain a virus that expresses ⁇ -Gal from the culture solution.
  • [2] The method for producing an ⁇ -Gal-expressing virus according to [1], wherein the cell line that does not express ⁇ -Gal is a cell line derived from an organism belonging to birds or primates.
  • the ⁇ 1,3-galactosyltransferase gene is introduced by introducing a vector containing the ⁇ 1,3-galactosetransferase gene in a state capable of expressing the ⁇ 1,3-galactosyltransferase gene, according to [1] or [2]. Manufacturing method.
  • the vector containing the ⁇ 1,3-galactosyltransferase gene in a state capable of expressing the gene contains the ⁇ 1,3-galactosyltransferase gene in the expression vector, and the expression vector has a CAG promoter or a CMV promoter [3] Of ⁇ -Gal-expressing virus.
  • [6] The virus according to any one of [1] to [5], which is an influenza virus, smallpox virus, measles virus, mumps virus, rubella virus, AIDS virus, Newcastle disease virus, or Marek's disease virus.
  • the method for producing a vaccine according to [7] wherein the production of the vaccine comprises a step of inactivating a virus.
  • the method for producing a vaccine according to [7], wherein the production of the virus comprises a step of using the virus as a subunit.
  • the method for producing a vaccine according to [7], wherein the production of the virus comprises a step of making the virus an attenuated virus.
  • the method for producing a vaccine according to any one of [7] to [10], wherein the production of the vaccine further comprises a step of allowing the virus to contain an adjuvant.
  • ⁇ -Gal a large amount of ⁇ -Gal can be obtained without changing the cells that proliferate the virus from cells that do not express ⁇ -Gal to cells that express ⁇ -Gal. Expression virus production is possible.
  • Non-patent Document 1 It is known that ⁇ -Gal can be expressed in viruses grown in ⁇ -Gal-expressing cells.
  • ⁇ -Gal is expressed in an ⁇ -Gal non-expressing cell derived from an avian or primate used to propagate many vaccine viruses such as influenza virus, and this cell is used.
  • the advantage is that a vaccine virus expressing ⁇ -Gal can be obtained.
  • ⁇ -Gal that is recognized as a foreign antigen in humans and birds that possess natural antibodies against ⁇ -Gal.
  • the analysis result of the a-Gal expression by the flow cytometry in the chicken embryo fibroblast cell line (CEF-DF1) which is an alpha-gal expression cell in Example 1 is shown.
  • A No cells to which GS-IB 4 binds are observed in the original cells (dashed circle).
  • B A1,3GT transgenic GS-IB 4 binds to all cells in a cell (solid line circle), it was confirmed that express a-Gal.
  • the result (analysis of MALII binding) of the sialic acid expression level in the chicken embryo fibroblast cell line (CEF-DF1) in Example 1 by flow cytometry is shown.
  • H9N2 (H9N2-gal) virus was obtained from chicken embryo fibroblasts expressing ⁇ -Gal (binding of GS-IB 4 in ELISA). The results are shown. GS-IB binding 4 is not observed at all in the H9N2 virus grown in the original cell which does not express a-Gal (H9N2), H9N2 -gal virus grown in cells expressing a-Gal (H9N2 -gal) was clearly observed, and high a-Gal expression was confirmed.
  • FIG. 7 shows the results of confirmation (HI test) of anti-influenza antibody production in a1,3GT-KO mice (male) by administration of an influenza vaccine expressing a-Gal in Example 3.
  • FIG. 7 shows the results of confirmation (HI test) of anti-influenza antibody production in a1,3GT-KO mice (male) by administration of an influenza vaccine expressing a-Gal in Example 3.
  • FIG. 7 shows the results of confirmation (HI test) of anti-influenza antibody production
  • the antibody production was not confirmed in the H9N2 vaccine-administered mice, but the antibody production was confirmed in any of the H9N2-gal vaccine-administered mice.
  • flow cytometry using the GS-IB 4 the analysis results of the alpha-Gal expression in cells CEF-gal and CEF-gal2 obtained in Example 5 shows the (GS-IB 4 stain).
  • the expression level of ⁇ -Gal was found to be slightly lower in CEF-gal2 than in CEF-gal.
  • MFI mean fluorescence intensity (intermediate value of fluorescence intensity) It shows the result of the check by Western the alpha-Gal expression in H9N2 virus obtained from CEF-gal2 using GS-IB 4 blotting (right) and ELISA (left) in Example 5.
  • ELISA left figure
  • Western blotting also confirmed that the same level of ⁇ -Gal was expressed in H9N2-gal (lane 2) and H9N2-gal2 (lane 4).
  • no ⁇ -Gal expression was observed in the H9N2 virus grown in the original cell CEF (left: H9N2, right: lane 1).
  • FIG. 1 is a schematic explanatory diagram illustrating an influenza virus as an example.
  • ⁇ -Gal is expressed by introducing ⁇ 1,3-galactosyltransferase ( ⁇ 1,3GT) gene, which is a synthase of ⁇ -Gal, into cells that do not express ⁇ -Gal. Change into expressing cells.
  • ⁇ 1,3GT ⁇ 1,3-galactosyltransferase
  • the obtained cells are inoculated with an influenza virus that does not express ⁇ -Gal and allowed to proliferate to obtain an influenza virus that expresses ⁇ -Gal.
  • this virus is vaccinated.
  • the obtained vaccine is used for the prevention of influenza in people and chickens who possess anti- ⁇ -Gal antibodies.
  • the method for producing an ⁇ -Gal expression virus of the present invention includes the following steps (1) to (3). (1) introducing into a cell line that does not express ⁇ -Gal in a state in which the ⁇ 1,3-galactosyltransferase gene can be expressed, to obtain a cell line that can express ⁇ -Gal; (2) inoculating a cell line capable of expressing ⁇ -Gal with a virus to obtain a virus-infected cell line; and (3) culturing the virus-infected cell line to obtain a virus expressing ⁇ -Gal from the culture solution
  • ⁇ -galactose epitope is a sugar chain represented by Gal ⁇ 1-3Gal ⁇ 1-4GlcNAc-R, and is a glycoprotein that expresses N-acetyllactosamine (Gal ⁇ 1-4GlcNAc-R, R represents protein) It is a sugar chain produced by allowing ⁇ 1,3-galactose transferase to act and galactose as a substrate to be ⁇ 1-3 linked to the galactose group of N-acetyllactosamine.
  • Step (1) is a step of obtaining a cell line capable of expressing ⁇ -Gal.
  • the cell line used in step (1) is a cell line that does not express ⁇ -Gal.
  • Examples of cell lines that do not express ⁇ -Gal include cell lines derived from birds and primates such as humans, apes and Old World monkeys. However, cell lines derived from species other than these species can be used in the present invention as long as they have cell lines that do not express ⁇ -Gal.
  • Birds from which the cell line is derived are intended to refer to any species, subspecies or breed of the taxonomic classification "Aves” (including but not limited to chickens, turkeys, ducks, geese) , Creatures such as quail, pheasant, parrot, finch, hawk, crow, ostrich, emu, and cassowary).
  • the terms include Gallus gallus or chicken (e.g.
  • Cells derived from birds used in the production method of the present invention are preferably chicken cells.
  • Humans and apes from which cell lines are derived are animals belonging to the primate monkey suba, narrow nose, human superfamily, and non-human examples include chimpanzees, gorillas, orangutans, gibbons, etc. it can. However, it is not intended to be limited to these.
  • the Old World monkeys from which the cell line originates are animals belonging to the primate monkeys A., N. nasophata, and rhesus superfamily, and include, for example, Japanese monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, and baboons. However, it is not intended to be limited to these.
  • the type of cell line is not particularly limited, but from the viewpoint of being used for virus propagation, examples include a fibroblast line, an epithelial cell line, and an embryonic stem cell line.
  • avian-derived cell lines include chicken embryo-derived fibroblasts, chicken embryo-derived stem cell lines, and Old World monkey-derived cell lines such as African green monkey-derived kidney epithelial cell lines, primate-derived cell lines Specific examples of these include human embryonic kidney epithelial cell line. However, it is not intended to be limited to these.
  • ⁇ 1,3-galactosyltransferase gene into a cell line that does not express ⁇ -Gal is carried out using any known method for introducing a foreign gene into an expression vector and then introducing it into a host cell system. be able to.
  • gene introduction methods into host cell systems include physicochemical methods such as calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method, gene gun method, and biological methods using viral vectors and the like. it can.
  • the expression vector used in the introduction method using an expression vector is, for example, 1) a multi-cloning site (MCS) for introducing the insertion sequence, 2) a promoter and poly A addition sequence for expressing the insertion sequence, 3) Drug resistance marker gene for selecting cells into which the gene has been introduced, promoter and poly A addition sequence for expressing the gene, 4) ori sequence for replication in prokaryotic cells, 5) drug in prokaryotic cells It consists of antibiotic resistance genes for selection, etc.
  • MCS multi-cloning site
  • expression vectors used for gene transfer include pcDNA3.1 having a neomycin resistance gene, pcDNA3.1 / Hygro having a hygromycin resistance gene, and a zeocin resistance gene having the same MCS as pcDNA3.1.
  • pcDNA3.1 / Zeo with In addition to the pcDNA series, there are many vectors such as the pEF series, the pTriEx series, and the pLP series, and these expression vectors are commercially available.
  • the CAG promoter is a hybrid promoter in which a promoter and a poly A sequence are composed of a cytomegalovirus enhancer, a chicken ⁇ -actin promoter, a rabbit ⁇ globin splicing acceptor, and a poly A sequence (Japanese Patent Laid-Open No. 3-168087, JP 2006-121 publication).
  • the CAG promoter is one type of promoter known as a high expression promoter, and a high expression promoter such as a CMV promoter or an EF1 ⁇ promoter can be used instead of the CAG promoter.
  • an expression vector having the above-mentioned high expression promoter in particular, the CAG promoter
  • a cell line in which the expression level of ⁇ -Gal is slightly suppressed can be obtained.
  • influenza virus grows to the same extent as the original cell.
  • the amount of ⁇ -Gal can be added to the extent.
  • Example 1 in the ⁇ -Gal-expressing chicken embryo fibroblasts (CEF-gal), the growth of influenza virus is slightly inferior to that of the original cells (CEF). Was about 1-log lower (FIG. 5). It was speculated that this phenomenon was associated with a slight decrease in the expression of sialic acid, an influenza virus receptor, due to high expression of ⁇ -Gal.
  • Example 5 the GT gene-expressing promoter was converted to the CAG promoter to obtain a cell line in which the expression level of ⁇ -Gal was slightly suppressed. As a result, the titer of the virus obtained was equivalent to that of the virus obtained in the original cells (CEF) (Table 1).
  • the ⁇ 1,3-galactosyltransferase gene is known to be derived from mouse, porcine, bovine, etc., and gene sequence information can be obtained from GenBank [Mouse: GenBank accession number M85153; J. Biol. Chem. 267, 5534-5541, 1992 (SEQ ID NO: 1), Pig: GenBank accession number L36535; Xenotransplantation 1, 81-88, 1994 (SEQ ID NO: 2), Cattle: GenBank accession number J04989; J. Biol. Chem. , 14290-14297, 1989 (SEQ ID NO: 3)].
  • a vector in which the ⁇ 1,3-galactose transferase gene is incorporated as a foreign gene in the MCS of the above expression vector can be constructed by a conventional method.
  • the constructed vector is introduced into a cell line that does not express ⁇ -Gal by a conventional method, and after selection with an antibiotic, the ⁇ 1,3-galactosyltransferase gene is introduced in a state in which the gene can be expressed.
  • -A cell line capable of expressing Gal can be obtained.
  • Step (2) is a step of inoculating a cell line capable of expressing ⁇ -Gal with a virus to obtain a virus-infected cell line.
  • the virus used for inoculation is not particularly limited as long as it has a glycoprotein on the surface of the virus.
  • the mechanism will be described later with reference to FIG. 2.
  • a virus containing a glycoprotein on the virus surface is inoculated into a cell line containing ⁇ 1,3-galactosyltransferase, ⁇ -Gal-expressing virus can be propagated. it can.
  • viruses having glycoproteins on the virus surface include influenza virus, smallpox virus, measles virus, epidemic parotitis virus, rubella virus, Newcastle disease virus, Marek's disease virus and the like.
  • AIDS virus retrovirus
  • examples of influenza viruses include human soluenevirus A soviet type (H1N1 subtype) virus, A Hong Kong type (H3N2 subtype) virus, highly pathogenic avian influenza virus H5N1 subtype virus, and low pathogenic avian virus.
  • H9N2 subtype virus of influenza virus As for the H1N1 subtype inluenza virus, although the method is different from that of the present invention, Galili has reported a method for expressing ⁇ -Gal (Non-patent Document 3).
  • Inoculation of the virus into the cell line follows a conventional method.
  • inoculation of influenza virus into a chicken embryo-derived fibroblast cell line can be performed according to the WHO method (see Non-Patent Document 6).
  • inoculate the original virus liquid not expressing ⁇ -Gal and adsorbed for about 30 minutes By adding the virus growth medium and continuing the cell culture, it is possible to inoculate the cell line with the virus.
  • Step (3) is a step of culturing the virus-infected cell line obtained in step (2) to obtain a virus expressing ⁇ -Gal from the culture solution.
  • a virus that expresses ⁇ -Gal has ⁇ -Gal on the surface of the virus, and ⁇ -Gal present on the surface of the virus is a foreign antigen in humans and birds that possess natural antibodies against ⁇ -Gal. Be recognized.
  • the production of an ⁇ -Gal-expressing virus using a cell line infected with a virus can be performed, for example, as follows. Since the virus inoculated into ⁇ -Gal-expressing cells is released outside the cell as ⁇ -Gal-expressing virus in the process of replication within the cell, ⁇ -Gal-expressing virus is included in the cell culture medium. . A few days after inoculating the cells with the virus, cytopathic effect (CPE) due to the virus is observed under the microscope, but the cells are cultured until sufficient CPE is observed, and then the ⁇ -Gal expressing virus is abundant. Collect the cell culture supernatant.
  • CPE cytopathic effect
  • an ⁇ -Gal-expressing virus having ⁇ -Gal on the surface of the virus can be produced by infecting the cell line capable of expressing ⁇ -Gal with the virus will be specifically described with reference to FIG.
  • a virus particle component protein is synthesized in a cell inoculated with a virus (upper left in the figure). If it is a ⁇ glycoprotein '', it is synthesized by a glycosyltransferase possessed by the cell. "Sugar" is added to the protein. Therefore, ⁇ -Gal can be added to a glycoprotein synthesized in a cell in which ⁇ -galactosyltransferase functions.
  • ⁇ -Gal expressing cells having ⁇ -galactose transferase
  • a virus influenza virus, measles virus, AIDS virus, etc.
  • the ⁇ -Gal-expressing virus obtained by the production method of the present invention has an immune response against the virus in humans and birds that possess natural antibodies against ⁇ -Gal compared to the same type of virus that does not express ⁇ -Gal. Can be enhanced. It shows a so-called opsonization action. This is because, in the case of ⁇ -Gal-expressing virus, anti- ⁇ -Gal antibody binds to the virus in humans and birds, and this binds to the Fc ⁇ receptor of antigen-presenting cells, resulting in effective antigen presentation. It is done.
  • the present invention includes a method for producing a vaccine using the ⁇ -Gal expression virus obtained by the production method of the present invention.
  • ⁇ -Gal-expressing virus is recovered as a cell culture supernatant rich in ⁇ -Gal-expressing virus.
  • This cell culture supernatant can be used as it is for preparation of a vaccine, but can also be purified by a conventional method.
  • the purification method include a method performed by ultracentrifugation using a sucrose solution according to the method described in Non-Patent Document 7.
  • the virus obtained by the production method of the present invention can be, for example, an inactivated virus.
  • the virus contained in the vaccine can also be a viral subunit.
  • the virus contained in the vaccine can be an attenuated virus.
  • Virus inactivation can be appropriately performed using a known method as a virus inactivation treatment method.
  • the inactivation treatment include a method of inactivating the purified virus with formalin, ultraviolet light or ⁇ -propiolactone.
  • Virus subunits can be appropriately prepared using known methods. For example, after mixing the virus solution and 1% Tween 20 at a ratio of 9: 1 and leaving it for 30 minutes, add an equal amount of ether, mix vigorously, and centrifuge the resulting aqueous phase fraction as described above. A subunit vaccine can be obtained by inactivation in the same manner.
  • Attenuated virus can be obtained by reducing pathogenicity by a known method such as gene mutation.
  • viruses that are prone to mutation such as influenza virus
  • vaccines using inactivated viruses and subunit vaccines are used instead of attenuated viruses. .
  • the vaccine obtained by the production method of the present invention may contain the above virus alone or may further contain an adjuvant.
  • the adjuvant include vegetable oils such as sesame oil and rapeseed oil, mineral oils such as light liquid paraffin, aluminum hydroxide gel, and aluminum phosphate gel.
  • the administration route of the vaccine obtained by the production method of the present invention includes instillation, nasal drop, intramuscular, or subcutaneous. Moreover, when administering as an inactivated vaccine, intramuscular, intraperitoneal, or subcutaneous administration is preferable.
  • the vaccine obtained by the production method of the present invention is used for treatment for prevention and / or treatment of humans and birds infected with the virus.
  • Test Method The test method used in the following examples is described.
  • (1a) Flow cytometry using Griffonia Simplicifolia lectin I-Isolectin B 4 (GS-IB 4 ) ⁇ -Gal expressed on cells using fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled GS-IB 4 (Vector Laboratories Inc.) After washing at 4 ° C. for 30 minutes, the cells were washed and analyzed with a FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the ELISA method for examining ⁇ -Gal expressed in the virus was performed as follows. A solution containing the purified virus and 2% Triton X-100 and 1 M KCl was mixed at a ratio of 9: 1 and allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes. The solution was diluted with carbonate buffer (pH 9.6) to prepare a 5 mg / ml virus solution, and coated on a 96-well ELISA plate by 50 ml / well.
  • HI test method Anti-H9N2 antibody titer in mouse plasma was evaluated by HI test. Specifically, it is as follows. Mouse plasma is treated with RDE (Denka Seiken) to remove non-specific hemagglutination inhibitors, and then mixed at a volume ratio of 5 volumes of plasma to 1 volume of chicken erythrocytes to remove natural agglutinin in plasma. It was. The supernatant obtained by centrifuging this was used for the HI test as a processed plasma sample.
  • RDE Denka Seiken
  • a virus solution containing 4 units of hemagglutinin (HA) was added to each well in an equal volume (25 ml) to room temperature. For 1 hour. Thereafter, 0.5% chicken erythrocyte solution (50 ml) was added to observe hemagglutination.
  • HA hemagglutinin
  • Example 1 Using pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) in which the ⁇ 1,3-galactose transferase ( ⁇ 1,3GT) gene of a cell line mouse that expressed ⁇ -Gal was introduced by gene transfer, the chicken was generated using FuGENE HD (Roche) The ⁇ 1,3GT gene was introduced into embryonic fibroblast cell line CEF-DF1 (ATCC CRL-12203: hereinafter CEF). Dulbecco's modified Eagle medium supplemented with fetal calf serum, L-glutamine, penicillin and streptomycin was used for CEF culture. Cells were passaged the day after the gene transfer, and selection was performed using 100 ⁇ g / ml G418 from the next day, and cloning was performed 2 weeks later. Cell culture after selection was performed by adding G418 to the medium.
  • sialic acid was evaluated by analyzing the binding of Maackia Amurensis lectin II (MALII, Vector) and Sambucus gragralectin (SNA, Vector) by flow cytometry.
  • MALII Maackia Amurensis lectin II
  • SNA Sambucus gragralectin
  • sialic acid expression in cells is a receptor when influenza virus is infected, sialic acid expression in cells in which influenza virus is to be propagated is necessary, that is, sialic acid expression is greatly increased by ⁇ -Gal expression. It is not desirable to decrease. In the present invention, the decrease in sialic acid expression due to the expression of ⁇ -Gal was not observed in the analysis by flow cytometry. However, in ⁇ -Gal-expressing chicken embryo fibroblasts (CEF-gal), the growth of influenza virus was slightly inferior to the original cells (CEF).
  • An ⁇ -Gal-expressing CEF cell line (CEF-gal) was a cell clone that expressed ⁇ -Gal and had good proliferation.
  • Example 2 Virus expressing ⁇ -Gal grown in a cell line expressing ⁇ -Gal CEF-gal prepared in Example 1 was added to the H9N2 subtype avian influenza virus (A / chicken / Yokohama / aq55 / 01: H9N2 virus) (See Non-Patent Document 5) Infection and several days later, the culture supernatant of the cells in which the cytopathic effect was observed was collected and used as a virus solution. According to the method of WHO (Non-patent Document 6), the culture medium of the cells inoculated with the virus was replaced with a virus growth medium.
  • H9N2 subtype avian influenza virus A / chicken / Yokohama / aq55 / 01: H9N2 virus
  • FIG. 6 shows the results of confirmation of a-Gal expression (binding of GS-IB 4 in ELISA) in influenza virus obtained from chicken embryo fibroblasts expressing a-Gal. Binding of GS-IB 4 is not observed at all in the H9N2 virus grown in the original cell which does not express a-Gal, clearly observed in the H9N2-gal virus grown in cells expressing a-Gal And high a-Gal expression was confirmed.
  • Example 2 an example of the H9N2 virus was shown, but a virus expressing ⁇ -Gal can be obtained by the same method for other influenza viruses.
  • Example 3 Preparation of ⁇ -Gal-expressing virus vaccine
  • the virus solution prepared in Example 2 was purified by ultracentrifugation using a sucrose solution according to a conventional method (Non-patent Document 7).
  • the obtained purified virus was inactivated with formalin, ultraviolet light or ⁇ -propiolactone to prepare an inactivated vaccine.
  • the virus solution and 1% Tween 20 were mixed at a ratio of 9: 1 and allowed to stand for 30 minutes, then added with an equal amount of ether, mixed vigorously, and centrifuged to obtain water. The phase fraction was inactivated and used in the same manner as described above.
  • These vaccines were used alone or in combination with adjuvants (Ribijuadjuvant system, Corixa: Abisco, Isconova).
  • Example 4 The ⁇ 1, GGT expressing virus vaccine was tested using ⁇ 1,3GT gene knockout mice ( ⁇ 1,3GT-KO mice) that do not express ⁇ -Gal and possess anti- ⁇ -Gal antibodies as in humans and birds.
  • H9N2 vaccine not expressing ⁇ -Gal or H9N2-gal vaccine expressing ⁇ -Gal 1.0 ⁇ g each was mixed with Ribi adjuvant system and administered subcutaneously to mice.
  • As the vaccine a formalin-inactivated subunit vaccine was used.
  • Vaccine administration was performed twice at 2-week intervals, and then anti-H9N2 antibody titer in mouse plasma was evaluated by HI test. As a result, antibody production was not confirmed in the H9N2 vaccine-treated mice, but antibody production was confirmed in any of the H9N2-gal vaccine-treated mice. The results are shown in FIG.
  • Example 5 The expression vector pCAGGS incorporating the mouse ⁇ 1,3GT gene was transfected into CEF-DF1 with fuGENE HD together with pcDNA3.1 (+), and the ⁇ 1,3GT gene was integrated into the chromosome in the same manner as in Example 1.
  • Cell clone CEF-gal2
  • the degree of alpha-Gal expression in the resulting cells was confirmed by flow cytometric analysis of GS-IB 4.
  • FIG. 1 the titer of the virus solution obtained by infecting CEF-gal2 with H9N2 virus was measured, and the virus proliferation in the same cells was evaluated.
  • Table 1 Furthermore, it was confirmed by ELISA and Western blotting of the alpha-Gal expression in H9N2 virus obtained from CEF-gal2 using GS-IB 4. The results are shown in FIG.
  • FIG. 8 shows the results of analysis of ⁇ -Gal expression (GS-IB 4 staining) in CEF-gal and CEF-gal2 by flow cytometry. It was revealed that the expression level of ⁇ -Gal expressed on the cell surface was slightly lower in CEF-gal2 than in CEF-gal.
  • MFI mean fluorescence intensity (intermediate value of fluorescence intensity) (FIG. 8).
  • FIG. 9 shows the results of ELISA and Western blotting analysis ( ⁇ -IB 4 binding) for ⁇ -Gal expression in H9N2 virus grown in various cells.
  • ELISA Western blotting analysis
  • Table 1 shows the titers of viruses grown on CEF-gal2.
  • the titer of the virus grown with CEF-gal2 was equivalent to that of the virus grown with CEF (original cell) (Experiment 2), and it was confirmed that the virus had grown to the same extent.
  • the titer of the virus grown with CEF-gal was inferior by 1? Log (Experiment 1).
  • CEF-gal2 it was confirmed that the H9N2 virus grew to the same extent as CEF, the original cell (Table 1).
  • TCID 50 indicates 50% cultured cell infection amount (virus titer).
  • the present invention is useful in the field of producing vaccines such as influenza viruses.

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Abstract

酵素を用いることなく、ウイルスに対する免疫応答が増強されたα-Gal発現ウイルスを作製できる方法、及びこの方法で作製したα-Gal発現ウイルスを用いた、効果（抗原性）の高いインフルエンザウイルスワクチン等を提供する。α-Gal発現ウイルスの作製方法。(1)α-ガラクトースエピトープ（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R：以下α-Gal）を発現しない細胞系に、α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を発現し得る状態で導入して、α-Galを発現し得る細胞系を得る工程、(2)α-Galを発現し得る細胞系にウイルスを接種して、ウイルス感染した細胞系を得る工程、および(3)ウイルス感染した細胞系を培養して、培養液からα-Galを発現するウイルスを得る工程を含む。この方法でα-Galを発現するウイルスを作製し、得られたウイルスからワクチンを作製する、ワクチンの作製方法。

Description

α-ガラクトースエピトープ発現ウイルス及びワクチンの作製方法 関連出願の相互参照
　本出願は、２００９年９月３０日出願の日本特願２００９－２２７７５３号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明は、遺伝子導入によりα-ガラクトースエピトープ（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R：以下α-Galと略記することがある）を発現させた細胞系にウイルスを接種してα-Galを発現するウイルスを作製する方法、及びこのウイルスを用いてワクチンを作製する方法に関する。
　高病原性鳥インフルエンザおよび新型インフルエンザの世界的な発生拡大が続く中、今後、家禽のみならず人における流行の危険性も指摘されている。そのため、これまで以上にインフルエンザの予防と制御への取り組みが求められている。インフルエンザ予防には発育鶏卵で作製されるワクチンが有効とされる。現在のヒト用のインフルエンザワクチンには副作用のおそれのある免疫増強剤が含まれていないが、今後、新型インフルエンザが発生した場合は、ワクチンが緊急的に用いられる事が想定されているため、安全にワクチン効果を増強する手法の開発は重要な課題である。さらに、少量でも効果の高いワクチンを提供することで、より多くの人にワクチンを接種できる技術の確保が必要とされる。
　インフルエンザウイルスに対するワクチンを、培養細胞系を用いて作製する方法は、例えば、特許文献１に記載されている。この方法では、鳥類胚性幹細胞が用いられているが、安全にワクチン効果を増強する手法についての開示はない。
　α-ガラクトースエピトープ(α-Gal)はABO式血液型抗原に構造が類似した糖抗原であり、α1,3-ガラクトース転移酵素(以下、α1,3GTと略記することがある)が作用して細胞表面に発現する。α-Galは大部分の哺乳動物に発現するが、人や鳥類ではα1,3GT遺伝子が機能していないためにα-Galの発現が無い。そのため、人や鳥類ではα-Galを外来抗原として認識し、α-Galに対する自然抗体(抗α-Gal抗体)を保有する(非特許文献1)。α-Galと抗α-Gal抗体の反応は、豚から人等の異種間の臓器移植等における超急性拒絶反応の原因である。本発明者のひとりである小川は、異種移植におけるα-Galと抗α-Gal抗体の制御技術に取り組むとともに、この反応を利用したガンワクチンの抗原性増強に関する研究に携わり、その有効性を確認した(非特許文献2)。
　上記α-Galを用いた抗原性増強方法をインフルエンザに応用し、α-Galを発現させたインフルエンザウイルスを作製することが出来れば、人や鳥類ではウイルスに抗α-Gal抗体が結合し、これが抗原提示細胞のFcγ受容体に結合する結果、抗原提示が効果的に行われ、ウイルスに対する免疫応答が増強される(オプソニン作用)可能性がある事は、Galiliらが報告している(非特許文献3)。エイズウイルスについての実験についてもGaliliらは報告している(非特許文献4)。
特表２００８－５３７６８１号公報
Galili U and Avila JL. α-Gal and Anti-Gal. 1999. Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York, N.Y. Deriy L, Ogawa H, Gao GP, Galili U. In vivo targeting of vaccinating tumor cells to antigen-presenting cells by a gene therapy method with adenovirus containing the α1,3galactosyltransferase gene. Cancer Gene Ther. 2005; 12: 528-539. Abdel-Motal UM, Guay HM, Wigglesworth K, Welsh RM, Galili U. Immunogenicity of influenza virus vaccine is increased by anti-gal-mediated targeting to antigen-presenting cells. J. Virol. 2007; 81: 9131-9141. Abdel-Motal U, Wang S, Lu S, Wigglesworth K, Galili U. Increased immunogenicity of human immunodeficiency virus gp120 engineered to express Gala1-3Galb1-4GlcNAc-R epitopes. J. Virol. 2006; 80: 6943-6951. Eto M, Mase M. Isolation of the Newcastle disease virus and the H9N2 influenza A virus from chicken imported from China. J. Jpn. Vet. Med. Assoc. 2003; 56: 333-339. WHO. WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance.2002. WHO, Geneva,  Switzerland. Killington RA, Stokes A, Hierholzer JC. Virus purification. pp: 71-89. In: Virology Methods Manual. Mahy BWJ, Kangro HO (Ed). 1996. Academic Press Limited, London.
　非特許文献１～７の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　ウイルスにα-Galを発現させる方法としては、in vitroにおける酵素反応が用いられてきている（非特許文献3、4）。しかし、この方法は、反応に用いる酵素を必要とする事、酵素反応時間を必要とする事、酵素反応液の除去を必要とする事などの点から、同方法によってワクチン用の大量のα-Gal発現ウイルスを準備する事は困難であると考えられる。
　そこで、本発明の目的は、酵素を用いることなく、ウイルスに対する免疫応答が増強されたα-Gal発現ウイルスを作製できる方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、この方法で作製したα-Gal発現ウイルスを用いた、効果（抗原性）の高いワクチン、特にインフルエンザウイルスワクチンを提供することにある。
　本発明者らは、天然にはα-Galを発現しない細胞系にα1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を発現し得る状態で導入し、得られた細胞系にウイルスを感染させることで、α-Gal(α-ガラクトースエピトープ)を発現するウイルスを作製できること、さらには、このα-Galを発現するウイルスを用いることで、従来のα-Galを発現しないウイルスを用いたワクチンに比べて、ウイルスに対する免疫応答が増強されたワクチンが得られることを見出して、本発明を完成させた。
　本発明は以下のとおりである。
[1]
(1)α-ガラクトースエピトープ（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R：以下α-Gal）を発現しない細胞系に、α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を発現し得る状態で導入して、α-Galを発現し得る細胞系を得る工程、
(2)前記α-Galを発現し得る細胞系にウイルスを接種して、ウイルス感染した細胞系を得る工程、および
(3)前記ウイルス感染した細胞系を培養して、培養液からα-Galを発現するウイルスを得る工程
を含むα-Gal発現ウイルスの作製方法。
[2]
前記α-Galを発現しない細胞系が、鳥類または霊長類に属する生物に由来する細胞系である[1]に記載のα-Gal発現ウイルスの作製方法。
[3]
α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子の導入は、α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を発現し得る状態で含むベクターを導入することで行う、[1]または[2]に記載のα-Gal発現ウイルスの作製方法。
[4]
α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を発現し得る状態で含むベクターは、発現ベクターにα1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を含み、発現ベクターはCAGプロモーターまたはCMVプロモーターを有するものである[3]に記載のα-Gal発現ウイルスの作製方法。
[5]
α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子がマウス、ブタまたはウシ由来である[1]～[4]のいずれかに記載のα-Gal発現ウイルスの作製方法。
[6]
前記ウイルスがインフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、エイズウイルス、ニューカッスル病ウイルス、またはマレック病ウイルスである[1]～[5]のいずれかに記載のα-Gal発現ウイルスの作製方法。
[7]
[1]～[6]のいずれかに記載の方法で、α-Galを発現するウイルスを作製し、得られたウイルスからワクチンを作製する、ワクチンの作製方法。
[8]
ワクチンの作製は、ウイルスを不活性化する工程を含む[7]に記載のワクチンの作製方法。
[9]
ウイルスの作製は、ウイルスをサブユニットとする工程を含む[7]に記載のワクチンの作製方法。
[10]
ウイルスの作製は、ウイルスを弱毒化ウイルスとする工程を含む[7]に記載のワクチンの作製方法。
[11]
ワクチンの作製は、ウイルスにアジュバントを含有させる工程をさらに含む[7]～[10]のいずれかに記載のワクチンの作製方法。
　元来はα-Galを発現しない細胞に遺伝子導入によってα-Galを発現させ、その細胞を用いてウイルスを増殖させる事によってα-Galを発現するウイルスを得る手段については、これまで知られていなかった。
　本発明によれば、ウイルスを増殖させる細胞を、α-Galを発現しない細胞からα-Galを発現する細胞に変えるだけで、特別な酵素も反応時間も必要とせずに、大量のα-Gal発現ウイルス生産が可能である。
　α-Gal発現細胞で増殖したウイルスにα-Galが発現し得る事は既知である(非特許文献１)。しかし、本発明では、インフルエンザウイルス等の多くのワクチンウイルスを増殖させるために用いられている鳥類または霊長類に由来するα-Gal非発現細胞にα-Galを発現させ、この細胞を用いて、α-Galを発現するワクチンウイルスを得ることができる点が優れた点である。
　本発明によれば、α-Galに対する自然抗体を保有する人や鳥類においては外来抗原として認識されるα-Galを発現するウイルスを提供することができる。
　加えて本発明によれば、α-Galを発現するウイルスを用いることで、従来のα-Galを発現しないウイルスを用いたワクチンに比べて、α-Galに対する自然抗体を保有する人と鳥類においては、ウイルスに対する免疫応答が増強されたワクチンを提供することができる。
本発明のウイルスの作製方法およびこのウイルスから作製したワクチンの利用についての概略説明図である。α-Galを発現させた細胞系を用いてインフルエンザワクチンを作製し、それを利用する様子の説明図である。 ウイルス表面に糖タンパクを保有するウイルスを、α-ガラクトース転移酵素を保有し、α-Galを発現させた細胞系に接種すると、細胞内においてインフルエンザウイルスの複製とα-Galの付加が行われ、α-Gal発現ウイルスを増殖させる事ができることの概略説明図である。 実施例１における、α-gal発現細胞である鶏胚線維芽細胞系(CEF-DF1)でのフローサイトメトリーによるa-Gal発現の解析結果を示す。（Ａ）元の細胞ではGS-IB4が結合する細胞は認められない（破線円）。（Ｂ）a1,3GT遺伝子導入細胞では全ての細胞にGS-IB4が結合し(実線円)、a-Galを発現する事が確認された。 実施例１における、鶏胚線維芽細胞系(CEF-DF1) でのシアル酸発現量のフローサイトメトリーによる解析(MALIIの結合)結果を示す。（Ａ）元の細胞と（Ｂ）a1,3GT遺伝子導入細胞において、MALIIの結合(a2,3シアル酸発現) に差は認められなかった。 実施例１において得られたα-Gal発現細胞である鶏胚線維芽細胞系(CEF-DF1)でのインフルエンザウイルスの増殖性に関する結果を示す。元の細胞(CEF)で増殖させたウイルスの力価に比較して、a-Galを発現させた細胞(CEF-gal)で増殖させたウイルスの力価は1-log低いが、高いウイルス力価を維持した。 実施例２において目的とおり、α-Galを発現させた鶏胚線維芽細胞からH9N2(H9N2-gal)ウイルスが得られた事をELISAで解析して(ELISAにおけるGS-IB4の結合を）確認した結果を示す。GS-IB4の結合は、a-Galを発現しない元の細胞で増殖したH9N2ウイルス(H9N2)には全く認められないが、a-Galを発現させた細胞で増殖したH9N2-galウイルス(H9N2-gal)には明らかに認められ、高いa-Gal発現が確認された。 実施例３における、a-Galを発現させたインフルエンザワクチンの投与によるa1,3GT-KOマウス(雄)における抗インフルエンザ抗体産生の確認 (HI試験)結果を示す。H9N2ワクチン投与マウスでは抗体産生が確認されなかったが、H9N2-galワクチン投与マウスではいずれも抗体産生が確認されたことを示す。 GS-IB4を用いたフローサイトメトリーによる、実施例５で得られた細胞CEF-galとCEF-gal2におけるα-Gal発現の解析結果(GS-IB4染色）を示す。α-Galの発現程度はCEF-galよりもCEF-gal2が若干低い事が明らかとなった。MFI： mean fluorescence intensity (蛍光強度の中間値) 実施例５においてCEF-gal2から得られたH9N2ウイルスにおけるα-Gal発現をGS-IB4を用いたWestern blotting(右図）及びELISA(左図）により確認した結果を示す。ELISA(左図）において、CEF-galで増殖したウイルスH9N2-galとCEF-gal2で増殖したウイルスH9N2-gal2に同程度のα-Galが発現している事が確認された。Western blotting(右図）によっても、 H9N2-gal (レーン2) とH9N2-gal2 (レーン4) には同程度のα-Galが発現している事が確認された。一方、いずれにおいても、元細胞CEFで増殖したH9N2ウイルスにはα-Galの発現が認められなかった (左図:H9N2, 右図: レーン1)。
　本発明は、主に、α-Gal発現ウイルスの作製方法とこのウイルスを用いたワクチンの作製方法に関する。図１に、インフルエンザウイルスを例に概略説明図を示す。α-Gal発現ウイルスの作製方法では、α-Galを発現しない細胞に、α-Galの合成酵素であるα1,3-ガラクトース転移酵素(α1,3GT)の遺伝子を導入する事によってα-Galを発現する細胞に変化させる。次いで、得られた細胞に、α-Galを発現しないインフルエンザウイルスを接種して増殖させ、α-Galを発現するインフルエンザウイルスを得る。ワクチンの作製方法では、このウイルスをワクチン化する。得られたワクチンは、抗α-Gal抗体を保有する人や鶏のインフルエンザ予防に用いる。
[α-Gal発現ウイルスの作製方法]
　本発明のα-Gal発現ウイルスの作製方法は、以下の(1)～(3)の工程を含む。
(1)α-Galを発現しない細胞系に、α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を発現し得る状態で導入して、α- Galを発現し得る細胞系を得る工程、
(2)前記α-Galを発現し得る細胞系にウイルスを接種して、ウイルス感染した細胞系を得る工程、および
(3)前記ウイルス感染した細胞系を培養して、培養液からα-Galを発現するウイルスを得る工程
　α-ガラクトースエピトープ(α-Gal)は、Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-Rで示される糖鎖であり、N-アセチルラクトサミンを発現する糖タンパク(Galβ1-4GlcNAc-R、Rはタンパクを表す)にα1,3-ガラクトース転移酵素を作用させて、基質としてのガラクトースをN-アセチルラクトサミンのガラクトース基にα1-3結合させることで、生成される糖鎖である。
工程(1)
　工程(1)は、α-Galを発現し得る細胞系を得る工程である。工程(1)で用いる細胞系は、α-Galを発現しない細胞系である。α-Galを発現しない細胞系は、例えば、鳥類、並びに人、類人猿、及び旧世界サル類等の霊長類等に由来する細胞系を挙げることができる。但し、これらの種以外の種に由来する細胞系も、α-Galを発現しない細胞系を有するものであれば、特に制限なく、本発明では使用できる。
　細胞系の由来となる鳥類とは、分類学的分類「Aves」の生物のいずれもの種、亜種または品種を指すことを意図する（限定されるものではないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミュー、およびヒクイドリのような生物など）。前記用語は、セキショクヤケイ(Gallus gallus)またはニワトリ（例えば、ホワイトレグホン(White Leghorn)、ブラウンレグホン(Brown Leghorn)、バールロック(Barred-Rock)、サセックス(Sussex)、ニューハンプシャー(New Hampshire)、ロードアイランド(Rhode Island)、オーストラロープ(Australorp)、ミノルカ(Minorca)、アムロックス(Amrox)、カリフォルニアグレイ(California Gray)、イタリアンパーティッジカラード(Italian Partidge-colored)）の様々な系統、ならびに一般に繁殖されるシチメンチョウ、キジ、ウズラ、アヒル、ダチョウ、および他の家禽の系統を包含する。本発明の作製方法で使用される鳥類に由来する細胞は、好ましくはニワトリ細胞である。
　細胞系の由来となる人及び類人猿とは、霊長類の真猿亜目、狭鼻下目、ヒト上科に属する動物であり、人以外では例えば、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、テナガザルなどを挙げることができる。但し、これらに制限される意図ではない。
　細胞系の由来となる旧世界サル類とは、霊長類の真猿亜目、狭鼻下目、オナガザル上科に属する動物であり、例えば、ニホンザル、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒなどを挙げることができる。但し、これらに制限される意図ではない。
　細胞系の種類は、特に制限はないが、ウイルス増殖に用いられるという観点からは、例えば、線維芽細胞系、上皮細胞系、胚性幹細胞系等を挙げることができる。
　鳥類由来細胞系の具体例としては、鶏胚由来線維芽細胞系、鶏胚由来幹細胞系、旧世界サル類由来細胞系の具体例としては、アフリカミドリザル由来腎臓上皮細胞系、霊長類由来細胞系の具体例としては、ヒト胎児由来腎臓上皮細胞系等を挙げることができる。但し、これらに制限される意図ではない。
　α-Galを発現しない細胞系へのα1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子の導入は、外来遺伝子を、発現ベクターへ組み込んだ後、宿主細胞系に導入する公知のいずれの方法を用いても実施することができる。宿主細胞系への遺伝子導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法等の物理化学的方法と、ウイルスベクター等を用いた生物学的方法を挙げることができる。
　発現ベクターを用いた導入法において用いられる発現ベクターは、例えば、１）挿入配列を導入するためのマルチクローニングサイト（MCS）、２）挿入配列を発現するためのプロモーター及びポリA付加配列、３）遺伝子が導入された細胞を選択するための薬剤耐性マーカー遺伝子とこれを発現するためのプロモーター及びポリA付加配列、４）原核細胞内で複製されるためのori配列、５）原核細胞での薬剤選択用の抗生物質耐性遺伝子、等から構成されるものである。そのような発現ベクターとしては種々のものが知られており、適宜選択して使用できる。遺伝子導入に用いる発現ベクターとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を有するpcDNA3.1、pcDNA3.1と同一のMCSを有したベクターでありながら、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有するpcDNA3.1/Hygroやゼオシン耐性遺伝子を有するpcDNA3.1/Zeoがある。pcDNAシリーズの他、pEFシリーズ、pTriExシリーズ、pLPシリーズなど、多くのベクターがあり、これらの発現ベクターは市販品として入手可能である。
　さらに遺伝子導入に用いる発現ベクターとしては、挿入配列を発現するためのプロモーターとしてCAGプロモーターを有するものを用いることが好ましい。CAGプロモーターは、プロモーターおよびポリＡ 配列が、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプターおよびポリＡ 配列からなるハイブリッドプロモーターである(特開平3-168087号公報、特開2006-121号公報参照)。CAGプロモーターは高発現プロモーターとして知られるプロモーターの1種であり、CAGプロモーターの代りに、CMVプロモーターやEF1αプロモーター等の高発現プロモーターも使用できる。上記高発現プロモーター、特に、CAGプロモーターを有する発現ベクターを用いることで、α-Galの発現程度を若干抑えた細胞系を得ることができる。α-Galの発現程度を若干抑えた細胞系では、元の細胞と同程度にインフルエンザウイルスが増殖し、さらに、この細胞で増殖したウイルスには、α-Gal高発現細胞で増殖したウイルスと同程度にα-Gal量を付加することができる。
　実施例1に示すように、α-Gal発現鶏胚線維芽細胞（CEF-gal）では、元の細胞(CEF)に比べてインフルエンザウイルスの増殖性が若干劣るため、得られたウイルスの力価が約1-log低かった（図５）。この現象には、α-Galの高発現によってインフルエンザウイルスの受容体であるシアル酸の発現がやや低下する事が関与するものと推測された。それに対して、実施例5では、GT遺伝子を発現させるプロモーターをCAGプロモーターに変換し、α-Galの発現程度を若干抑えた細胞系を得た。その結果、得られたウイルスの力価は、元の細胞(CEF)で得られたウイルスの力価と同等であった(表1)。
　α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子は、マウス由来、ブタ由来、ウシ由来のもの等が知られており、GenBankから遺伝子配列情報を入手することができる[マウス：GenBank accession number M85153; J. Biol. Chem. 267, 5534-5541, 1992(配列番号1), ブタ：GenBank accession number L36535；Xenotransplantation 1, 81-88, 1994(配列番号2), ウシ：GenBank accession number J04989; J. Biol. Chem. 264, 14290-14297, 1989(配列番号3)]。
　上記発現ベクターのMCSに、常法により、外来遺伝子としてα1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を組み込んだベクターを構築することができる。構築されたベクターを、常法により、α-Galを発現しない細胞系に導入し、抗生物質により選択を経て、α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子が発現し得る状態で導入された細胞において、α-Galを発現し得る細胞系を得ることができる。
工程(2)
　工程(2)は、α-Galを発現し得る細胞系にウイルスを接種して、ウイルス感染した細胞系を得る工程である。
　接種に用いるウイルスは、ウイルス表面に糖タンパクを保有するウイルスであれば、特に制限はない。機構の説明は図2を用いて後述するが、ウイルス表面に糖タンパクを保有するウイルスを、α1,3-ガラクトース転移酵素を保有する細胞系に接種すると、α-Gal発現ウイルスを増殖させる事ができる。
　ウイルス表面に糖タンパクを保有するウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マレック病ウイルス 等であることができる。尚、エイズウイルス（レトロウイルス）については、エンベロープ上に糖タンパクがあり、手法は本発明と異なるが、α-Galを発現する方法をGaliliが報告している(非特許文献4)。さらに、インフルエンザウイルスとしては、例えば、ヒトインルエンザウイルスのAソ連型(H1N1亜型)ウイルスやA香港型(H3N2亜型)ウイルス、高病原性トリインフルエンザウイルスのH5N1亜型ウイルス、低病原性トリインフルエンザウイルスのH9N2亜型ウイルス等を挙げることができる。尚、H1N1亜型インルエンザウイルスについては、手法は本発明と異なるが、α-Galを発現する方法をGaliliが報告している(非特許文献3)。
　細胞系へのウイルス接種は常法に従うが、例えば鶏胚由来線維芽細胞系へのインフルエンザウイルスの接種は、WHOの方法(非特許文献6参照)に準じて行うことができる。具体的には、細胞増殖培地を用いて単層に増殖させた細胞の培養液を除いた後、α-Galを発現していない元のウイルス液を接種して30分間程吸着させ、その後にウイルス増殖培地を添加して細胞の培養を続けることで、細胞系へのウイルス接種を行うことができる。
工程(3)
　工程(3)は、工程(2)で得られたウイルス感染した細胞系を培養して、培養液からα-Galを発現するウイルスを得る工程である。α-Galを発現するウイルスとは、ウイルスの表面にα-Galを有するものであり、ウイルスの表面に存在するα-Galは、α-Galに対する自然抗体を保有する人や鳥類では外来抗原として認識される。
　ウイルスに感染した細胞系を用いてのα-Gal発現ウイルスの作製は、例えば、以下のように実施することができる。α-Gal発現細胞に接種したウイルスは、細胞内で複製される過程でα-Galを発現するウイルスとなって細胞外へ放出されるため、α-Gal発現ウイルスは細胞培養液中に含まれる。細胞へウイルスを接種した数日後には顕微鏡下でウイルスによる細胞変性効果（CPE）が観察されるが、十分なCPEが認められる段階まで細胞を培養し、その後、α-Gal発現ウイルスが豊富に含まれる細胞培養上清を回収する。
　上記α-Galを発現し得る細胞系にウイルスを感染させることによって、ウイルスの表面にα-Galを有するα-Gal発現ウイルスを作製できることを、図2を用いて具体的に説明する。一般に、ウイルス(図中の左上)が接種された細胞内では、ウイルス粒子の構成タンパクが合成されるが、それが「糖タンパク」である場合には、細胞が保有する糖転移酵素によって合成された「糖」がタンパクに付加される。そのため、α-ガラクトース転移酵素が機能する細胞内で合成された糖タンパクにはα-Galが付加され得る事になる。従って、本発明のように、ウイルス表面に糖タンパクを保有するウイルス（インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、エイズウイルス等）をα-Gal発現細胞（α-ガラクトース転移酵素を保有）に接種すると、α-Gal発現ウイルスを増殖させる事ができる。
　本発明の作製方法で得たα-Gal発現ウイルスは、α-Galを発現しない同タイプのウイルスと比較して、α-Galに対する自然抗体を保有する人や鳥類においては、ウイルスに対する免疫応答が増強され得る。所謂、オプソニン作用を示す。これは、α-Gal発現ウイルスの場合、人や鳥類ではウイルスに抗α-Gal抗体が結合し、これが抗原提示細胞のFcγ受容体に結合する結果、抗原提示が効果的に行われるためと考えられる。
[ワクチンの作製方法]
　本発明は、上記本発明の作製方法で得たα-Gal発現ウイルスを用いて、ワクチンを作製する方法を包含する。
　上述のように、α-Gal発現ウイルスは、α-Gal発現ウイルスが豊富に含まれる細胞培養上清として回収される。この細胞培養上清は、そのままワクチンの作製に用いることもできるが、常法により精製することもできる。精製方法としては、例えば、非特許文献7に記載の方法に従いスクロース液を用いた超遠心により行う方法を挙げることができる。
　本発明の作製方法で得られるウイルスは、例えば、不活性化されたウイルスであることができる。また、ワクチンに含有されるウイルスは、ウイルスのサブユニットであることもできる。さらに、ワクチンに含有されるウイルスは、弱毒化ウイルスであることもできる。
　ウイルスの不活性化は、ウイルスの不活性化処理方法として公知の方法を用いて適宜行うことができる。不活性化処理としては、例えば、精製ウイルスをホルマリン、紫外線またはβ-プロピオラクトンにより不活化する方法を挙げることができる。
　ウイルスのサブユニット(成分)は、公知の方法を用いて適宜作製することができる。例えば、ウイルス液と1％ Tween 20を9：1の割合で混和して30分間放置した後、等量のエーテルを加えて激しく混和し、それを遠心して得られた水相画分を上述と同様の方法で不活化することで、サブユニットワクチンを得ることができる。
　弱毒化ウイルスは、遺伝子変異などの公知の方法によって病原性を低減させることで得ることができる。但し、インフルエンザウイルスのような変異を起こしやすいウイルスについては、弱毒化ワクチンの使用は懸念が多いため、一般には、弱毒化ウイルスではなく、不活性化ウイルスを用いたワクチンやサブユニットワクチンが用いられる。
　本発明の作製方法で得られるワクチンは、上記ウイルスを単独で含む場合と、アジュバントをさらに含有する場合がある。アジュバントとしては、例えば、ゴマ油、菜種油等の植物油、軽質流動パラフィン等の鉱物オイル、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲル等を挙げることもできる。
　本発明の作製方法で得られるワクチンの投与経路としては、点眼、点鼻、筋肉内、又は皮下が挙げられる。また、不活化ワクチンとして投与する場合には筋肉内、腹腔内又は皮下への投与が好ましい。
　本発明の作製方法で得られるワクチンは、前記ウイルスに感染するヒトや鳥類の予防および／または治療のための処置に用いられる。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
試験方法
　以下の実施例で用いた試験方法について記載する。
(1a) Griffonia Simplicifolia lectin I-Isolectin B4(GS-IB4)を用いたフローサイトメトリー
　細胞上に発現するα-Galをfluorescein isothiocyanate (FITC) 標識GS-IB4 (Vector Laboratories Inc.) を用いて４℃で30分間染色した後に洗浄し、FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences) にて解析した。
(1b)Maackia Amurensis lectin II(MALII)及びSambucus Nigra lectin (SNA)を用いたフローサイトメトリー
　細胞に発現するα2,3シアル酸またはα2,6シアル酸を、それぞれbiotin標識MAL II(Vector)もしくはbiotin標識SNA (Vector) と４℃で30分間反応させた後に洗浄し、Phycoerythrin (PE) 標識streptavidin (Vector)を用いて染色した。染色後の細胞をFACSCanto flow cytometer (BD Biosciences)にて解析した。
(2) ELISA法
　ウイルスに発現するα-Galを調べるためのELISA法は以下のように行った。精製したウイルスと2％ Triton X-100及び1 M KClを含む溶液を9 :1の割合で混合した後に４℃に30分間静置した。その溶液をcarbonate buffer (pH 9.6) で希釈して5 mg/mlのウイルス液を作製し、96穴ELISAプレートに50 ml/wellずつコーティングした。その後、1% 牛血清アルブミンを含むPBS (BSA/PBS)によりブロッキングし、HRP標識GS-IB4 (Sigma-Aldrich) と室温で1時間反応させ、Tetramethyl benzidine(TMB: BD Bioscience)で発色させて吸光度 (O.D. 450 nm) を測定した。
(3) Western blotting法
　ウイルスに発現するα-Galを調べるためのWestern blottingは以下のように行った。ウイルスのタンパクを2-mercaptoethanolの存在下でSodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) により分離した後、polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad) に転写し、1％ Alkali-soluble Casein (Novagen) を用いてブロッキングを行った。その後、HRP標識GS-IB4 (Sigma-Aldrich)と室温で１時間反応させ、反応後のPVDF membraneをECL Western blotting analysis system (Amersham Biosciences)によって発光させ、LAS-3000 (FujiFilm)を用いて解析した。
(4) HI試験法
　マウス血漿中の抗H9N2抗体価についてHI試験により評価した。具体的には、以下のとおりである。
　マウス血漿をRDE (デンカ生研) で処理して非特異的な血球凝集抑制物質を除去した後、鶏赤血球 1容量に対して血漿5容量の体積比で混和して血漿中の自然凝集素を除いた。これを遠心して得られた上清を処理済みの血漿サンプルとしてHI試験に使用した。試験では、血漿サンプルをV字底96穴マイクロプレートにおいて2倍階段希釈した後、4単位の赤血球凝集素 (HA) を含むウイルス液を各ウェルに血漿サンプルと等量(25 ml)加え、室温で1時間反応させた。その後に0.5％鶏赤血球液(50 ml)を添加して赤血球凝集性を観察した。
実施例1
遺伝子導入によりα-Galを発現させた細胞系
　マウスのα1,3-ガラクトース転移酵素(α1,3GT)遺伝子を組み込んだpcDNA3.1(+)(Invitrogen)を用いて、FuGENE HD(Roche)により鶏胚線維芽細胞系CEF-DF1(ATCC CRL-12203：以下CEF)へα1,3GT遺伝子を導入した。CEFの培養には牛胎子血清、L-グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地を使用した。遺伝子導入の翌日に細胞を継代し、更にその翌日から100μg/mlのG418を用いてセレクションを行い、その2週間後にクローニングを行った。セレクション以降の細胞培養は、培地にG418を加えて行った。
　得られた各細胞クローンにおけるα-Galの発現については、Griffonia Simplicifolia lectin I-Isolectin B4(GS-IB4, Vector Laboratories Inc.)の結合をフローサイトメトリー、ELISA、またはWestern blottingにより解析して評価した。フローサイトメトリーの結果を図３に示す。
　また、シアル酸の発現については、Maackia Amurensis lectin II (MALII, Vector)及びSambucus Nigra lectin(SNA, Vector)の結合をフローサイトメトリーにより解析して評価した。
　シアル酸の発現量についてはフローサイトメトリーによる解析で変化は認められなかった。結果を図４に示す。
　α-Galとシアル酸はいずれも糖鎖の末端構造であり基質を同じくするため、α-Gal発現によってシアル酸発現が低下する可能性がある事は予測された。細胞に発現するシアル酸はインフルエンザウイルスが感染する際の受容体であるため、インフルエンザウイルスを増殖させようとする細胞におけるシアル酸発現は必要であり、即ち、α-Gal発現によってシアル酸発現が大きく低下する事は望ましくない。本発明においては、α-Galを発現させた事によるシアル酸発現の低下はフローサイトメトリーによる解析においては観察されなかった。しかしながら、α-Gal発現鶏胚線維芽細胞（CEF-gal）では、元の細胞(CEF)に比べてインフルエンザウイルスの増殖性が若干劣っていたことから、α-Galの高発現によってシアル酸の発現が若干なりとも低下している可能性が考えられた。この事より、インフルエンザウイルスの十分な増殖が得られる細胞系の確立が課題となった。得られているα-Gal発現細胞では、元の細胞よりは若干劣るものの、インフルエンザウイルスの十分な増殖が得られている。結果を図５に示す。
　α-Galを発現しかつ増殖の良い細胞クローンを、α-Gal発現CEF細胞系(CEF-gal)とした。
実施例2
α-Galを発現させた細胞系で増殖したα-Galを発現するウイルス
　実施例１で作製したCEF-galに、H9N2亜型鳥インフルエンザウイルス (A/chicken/Yokohama/aq55/01:H9N2ウイルス)(非特許文献5参照)を感染させ、その数日後、細胞変性効果がみられた細胞の培養上清を回収してウイルス液とした。WHOの方法(非特許文献6)に従い、ウイルスを接種する細胞の培養液はウイルス増殖培地に交換した。
　目的とおりのα-Galを発現するH9N2ウイルスが得られた事は、GS-IB4の結合をフローサイトメトリー、ELISA、またはWestern blottingにより解析して確認した 。a-Galを発現させた鶏胚線維芽細胞から得られたインフルエンザウイルスにおけるa-Gal発現の確認 (ELISAにおけるGS-IB4の結合）の結果を図６に示す。GS-IB4の結合は、a-Galを発現しない元の細胞で増殖したH9N2ウイルスには全く認められないが、a-Galを発現させた細胞で増殖したH9N2-galウイルスには明らかに認められ、高いa-Gal発現が確認された。
　尚、実施例2では、H9N2ウイルスの例を示したが、これ以外のインフルエンザウイルスについても同様の方法により、α-Galを発現するウイルスを得ることができる。
実施例3
α-Gal発現ウイルスワクチンの作製
　上記実施例2で作製したウイルス液を、常法(非特許文献7)に従いスクロース液を用いた超遠心により精製した。得られた精製ウイルスをホルマリン、紫外線またはβ-プロピオラクトンにより不活化し、不活化ワクチンを作製した。
　また、サブユニットワクチンとしては、ウイルス液と1％ Tween 20を9：1の割合で混和して30分間放置した後、等量のエーテルを加えて激しく混和し、それを遠心して得られた水相画分を上述と同様の方法で不活化して用いた。これらのワクチンを単独、あるいはアジュバンド（Ribi adjuvant system, Corixa：Abisco,Isconova）と混合してワクチンとして用いた。
実施例4
α-Gal発現ウイルスワクチンの評価
　実験には、人や鳥類と同じくα-Galを発現せず抗α-Gal抗体を保有するα1,3GT遺伝子ノックアウトマウス(α1,3GT-KOマウス)を用いた。α-Galを発現しないH9N2ワクチンまたはα-Galを発現するH9N2-galワクチン各1.0μgをRibi adjuvant systemと混和してマウスに皮下投与した。ワクチンは、ホルマリン不活化サブユニットワクチンを用いた。ワクチン投与は２週間隔で２回行い、その後、マウス血漿中の抗H9N2抗体価についてHI試験により評価した。その結果、H9N2ワクチン投与マウスでは抗体産生が確認されなかったが、H9N2-galワクチン投与マウスではいずれも抗体産生が確認された。結果を図７に示す。
実施例5
　マウスのα1,3GT遺伝子を組み込んだ発現ベクターpCAGGSを、pcDNA3.1(+)とともにFuGENE HDによりCEF-DF1へトランスフェクションし、実施例1と同様の方法により、α1,3GT遺伝子が染色体に組み込まれた細胞クローン(CEF-gal2)を選択した。得られた細胞におけるα-Gal発現の程度は、GS-IB4を用いたフローサイトメトリー解析で確認した。結果を図８に示す。また、CEF-gal2にH9N2ウイルスを感染させる事によって得られたウイルス液の力価を測定し、同細胞におけるウイルスの増殖性を評価した。結果を表1に示す。更に、CEF-gal2から得られたH9N2ウイルスにおけるα-Gal発現をGS-IB4を用いたELISA及びWestern blottingにより確認した。結果を図９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図８にフローサイトメトリーによるCEF-galとCEF-gal２におけるα-Gal発現の解析 (GS-IB4染色)結果を示す。細胞表面に発現するα-Galの発現程度はCEF-galよりもCEF-gal２が若干低い事が明らかとなった。MFI： mean fluorescence intensity (蛍光強度の中間値)(図８)。
　図９に、各種細胞で増殖させたH9N2ウイルスにおけるα-Gal発現についてのELISA及びWestern blottingによる解析 (GS-IB4の結合）結果を示す。ELISA (左図）において、CEF-galで増殖したウイルスH9N2-galとCEF-gal2で増殖したウイルスH9N2-gal2に同程度のα-Galが発現している事が確認された。また、Western blotting (右図）によっても、 H9N2-gal(レーン2)とH9N2-gal2(レーン4)には同程度のα-Galが発現している事が確認された。一方、いずれにおいても、元細胞CEFで増殖したH9N2ウイルスにはα-Galの発現が認められなかった (左図:H9N2, 右図:レーン1)。
　更に、表1に、CEF-gal2で増殖させたウイルスの力価を示す。CEF-gal2で増殖させたウイルスの力価は、CEF（元細胞）で増殖させたウイルスの力価と同等であり（実験２）、同程度にウイルスが増殖した事が確認できた。一方、CEF-galで増殖させたウイルスの力価は１?log劣っていた（実験１）。CEF-gal2では、元細胞であるCEFと同程度にH9N2ウイルスが増殖する事も確認できた（表1）。尚、TCID50は50%培養細胞感染量（ウイルス力価）を示す。
　以上より、α-Galを発現させたCEF-gal2を用いることにより、目的通りにα-Galを高度に発現させたインフルエンザウイルスを元細胞と同等量得られる事が確認できた。この結果は、α-Gal発現細胞を用いてインフルエンザワクチンを大量生産できる可能性を示すものである。
　本発明は、インフルエンザウイルス等のワクチン製造分野に有用である。

Claims (11)

  1. (1)α-ガラクトースエピトープ（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R：以下α-Gal）を発現しない細胞系に、α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を発現し得る状態で導入して、α-Galを発現し得る細胞系を得る工程、
    (2)前記α-Galを発現し得る細胞系にウイルスを接種して、ウイルス感染した細胞系を得る工程、および
    (3)前記ウイルス感染した細胞系を培養して、培養液からα-Galを発現するウイルスを得る工程
    を含むα-Gal発現ウイルスの作製方法。
  2. 前記α-Galを発現しない細胞系が、鳥類または霊長類に属する生物に由来する細胞系である請求項1に記載のα-Gal発現ウイルスの作製方法。
  3. α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子の導入は、α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を発現し得る状態で含むベクターを導入することで行う、請求項1または2に記載のα-Gal発現ウイルスの作製方法。
  4. α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を発現し得る状態で含むベクターは、発現ベクターにα1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子を含み、発現ベクターはCAGプロモーターまたはCMVプロモーターを有するものである請求項3に記載のα-Gal発現ウイルスの作製方法。
  5. α1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子がマウス、ブタまたはウシ由来である請求項1～4のいずれかに記載のα-Gal発現ウイルスの作製方法。
  6. 前記ウイルスがインフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、エイズウイルス、ニューカッスル病ウイルス、またはマレック病ウイルスである請求項1～5のいずれかに記載のα-Gal発現ウイルスの作製方法。
  7. 請求項1～6のいずれかに記載の方法で、α-Galを発現するウイルスを作製し、得られたウイルスからワクチンを作製する、ワクチンの作製方法。
  8. ワクチンの作製は、ウイルスを不活性化する工程を含む請求項7に記載のワクチンの作製方法。
  9. ウイルスの作製は、ウイルスをサブユニットとする工程を含む請求項7に記載のワクチンの作製方法。
  10. ウイルスの作製は、ウイルスを弱毒化ウイルスとする工程を含む請求項7に記載のワクチンの作製方法。
  11. ワクチンの作製は、ウイルスにアジュバントを含有させる工程をさらに含む請求項7～10のいずれかに記載のワクチンの作製方法。
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