JP2008537681A - 懸濁鳥類胚性幹細胞株においてウイルスワクチンを製造する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
背景
・個々の生産キャンペーンで大量の卵の調達および品質管理を必要とする、長く、煩雑な、資源消費する製造方法。この現在の卵に基づいた生産システムでは、潜在的利益率が低すぎるため、卵由来インフルエンザワクチンの事業を始めようと追随する製薬会社は現れない;
・インフルエンザシーズンの少なくとも6ヶ月前にどのウイルス株をワクチンに含めるかを選択する必要性。どの株をインフルエンザワクチンに含めるべきかについてのこの早期決定は必ずしも適当ではなく、そのワクチンを生産するには長い準備期間が必要とされることにより中途での是正処置は不可能である;
・増加し続ける需要を満たすのに十分なインフルエンザワクチンを毎年生産する必要性(2004年、先進工業国においては約250百万用量、米国だけで約100百万用量)。卵由来インフルエンザワクチン製造業者の英国にあるプラントの汚染による米国での2004〜2005年冬の最近のインフルエンザワクチン不足は、この問題を浮き彫りにしている。さらに、インフルエンザワクチンの現在の世界的な生産能力では、世界的な「高リスク」集団の一部を守るのでさえ十分ではない。実際には、世界的なインフラストラクチャーでパンデミックインフルエンザワクチンの適時配布および送達を処理することができるかどうかが問題である;
・ワクチンを製造するための何億もの受精鶏卵の必要条件。ドナーニワトリ群がエピデミック感染症である場合に卵の供給が不足するというリスクを伴う;
・弱毒化生インフルエンザウイルスの場合、高価な特定病原体不在の(SPF)鶏卵を使用する必要性;
・BSE非発生国(BSE-exempt countries)からのウシ血清の使用に伴うインフレ傾向のコスト(inflationist cost);
・一部の個体における卵由来成分のアレルゲン性;
・強毒性で、ニワトリにとって致命的なウイルスの増殖に卵を使用できないこと。
・個々の生産キャンペーンで大量の卵またはCEFの調達および品質管理を必要とする、長く、煩雑な、資源消費する製造方法;
・多くの場合、高価な特定病原体不在の(SPF)ニワトリ胚を使用する必要性;
・ドナーニワトリ群がエピデミック感染症である場合に卵の供給が不足するというリスク;
・BSE非発生国からのウシ血清の使用に伴うインフレーショニストコスト;
・一部の個体における卵のアレルゲン性;
・強毒性で、ニワトリにとって致命的なウイルスの増殖に卵を使用できないこと。
・パンデミック株が同定され、単離され、分配されたらすぐに、インフルエンザワクチンの生産を開始することができる;
・卵の製造に必要な、いわゆる高増殖性再集合体(High Growth Reassortants)(孵化鶏卵での高収率増殖に適合させたウイルス)の開発を待つ必要がない;
・卵で由来の方法の場合には6〜9ヶ月であるが、株の受取りのおよそ9週間後に一次ワクチンバッチが入手可能である;
・細胞由来の方法は、卵では十分に増殖できなかった株の生産を可能にする(例えば、1997年の鳥類香港インフルエンザ);
・パンデミック中に卵不足問題が起こらない。
胚幹細胞は以下の点で独特である:(i)胚幹細胞は未分化細胞としてin vitroで無限に自己複製することができる、(ii)胚幹細胞は無限の再生能を有する、(iii)胚幹細胞は安定した染色体の含有量を維持する;(iv)胚幹細胞は高レベルのテロメラーゼおよび特定の細胞表面マーカーを発現する。世界中で多く努力されているにもかかわらず、ES細胞は極めて限られた数の種(マウス、ヒト、サル)からしか単離に成功していない。本発明者は、ここ数年にわたって、様々な鳥類種からES細胞を単離し、確立するためにかなりの力を注いできた。かかる研究努力がニワトリES細胞の単離および特徴付けの成功につながった [Pain et al. 1999. Cell Tissues Organs 165: 212-219]。こうして、本発明者は、分化誘導を行わない、ニワトリES細胞の効率的なin vitro培養および大規模増殖を可能にする独自の手順を開発した。
次いで、本発明者はニワトリES細胞から安定した接着細胞株および懸濁細胞株を誘導する独自の方法を確立した。その方法には、細胞培養培地からの血清、フィーダー細胞、および増殖因子の段階的な除去および細胞の懸濁培養への適合が含まれる。これらの胚性ニワトリ細胞株は、ES細胞の所望の特徴の大部分(すなわち、無限増殖、テロメラーゼのようなES特異的マーカーの発現、核型の安定性)を維持しており、加えて、新しい「工業向きの」特徴(無血清培地中懸濁状態での増殖)も示した。
説明
好ましくは無動物血清培地で培養されたEBx細胞の培養物を目的のウイルスに感染させる工程;
該ウイルスを複製するために、感染EBx細胞を培養する工程;
細胞培養物上清中および/または該細胞内のウイルスを採取する工程
を含む方法を提供する。
a)前記EBx(登録商標)、より好ましくはEB14細胞を培養器内で、無血清培地N°1中、懸濁状態で(in suspension)増殖させる工程;
b)前記細胞密度が少なくとも150万細胞/mlであるときに、前記細胞を前記選択されたウイルスに感染させる工程;
c)感染直前に、感染と同時に、または感染直後に、前記細胞培養物に無血清培地N°2を添加する工程;および
d)ウイルス複製を可能にするために、前記感染細胞をさらに培養する工程;さらに
e)所望により、前記ウイルスを採取する工程
を含む。
前記細胞、滅菌酸素、様々な培養培地などを投入するのに適した注入口;
細胞および培地を除去するための排出口;および
前記バイオリアクター内で前記培養培地を攪拌する手段
を備えた連続攪拌槽型バイオリアクターである。
a)所望により、完全ウイルスを含む細胞培養物上清をデオキシリボ核酸制限酵素、好ましくはDNアーゼ(EC3.1.21群およびEC3.1.22群の分類参照)およびヌクレアーゼ(EC3.1.30群およびEC3.1.31群の分類参照))とともにインキュベートする工程。好ましくはDNA消化酵素はベンゾナーゼ(Benzonヌクレアーゼ)またはDNアーゼIである;
b)陽イオン洗剤の添加工程。陽イオン洗剤の例は;限定されるものではないが:セチルトリメチルアンモニウム塩(CTABなど)、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、DOTMAおよびTween(商標);
c)抗原タンパク質の単離工程。この最後の工程は遠心分離または限外濾過により実現し得る。
前記ワクチン中のウイルスは無傷ウイルス粒子としてまたは分解されたウイルスの粒子として存在することができる。一実施形態によれば、前記ワクチンは死菌ワクチンまたは不活化ワクチンである。もう1つの実施形態によれば、前記ワクチンは、本発明の方法により、好ましくは血清なしに、得ることが可能であり、所望により濾過および/または濃縮されており、かつ前記ウイルスを含んでいるEBx細胞培養物上清を主に含んでなる弱毒化生ワクチンである。第3の実施形態によれば、前記ワクチンは、本発明の方法に従って調製されたウイルスから得ることが可能なウイルス抗原タンパク質を含んでなっている。
実施例1:EBx(登録商標)細胞株の誘導方法
鳥類胚性幹細胞株EBx(登録商標)の確立方法はこれまでにWO03/076601およびWO05/007840において記載されている。簡潔には、EBx(登録商標)細胞株のこの確立方法は次の工程を含む:
a)鳥類細胞、好ましくは鳥類胚幹細胞の、それらの細胞の増殖を可能にするあらゆる因子を含む完全培養培地で、かつ、好ましくは不活性化し、動物血清を補給した、マウス繊維芽細胞のフィーダー層の存在下での単離、培養、および増殖;
b)前記因子、前記血清、および前記フィーダー層を段階的または完全除去するための、前記培養培地を改変することによる継代;
c)外因性増殖因子、不活性化フィーダー層、および低レベルの血清(または血清なし)の不在下での基礎培地で増殖させることができる接着または非接着鳥類細胞株を確立すること;
工程c)の基礎培地がまだ低レベルの血清(すなわち、およそ2%以下)を含む場合には、前記方法は、所望により、外因性増殖因子と不活性化フィーダー層はもう含んでいないが、低レベルの血清を含んでいる基礎培地を、以下の中から選択される培養培地と交換する追加の工程d)を含む場合がある:
血清を補給した無血清培地(ii)、連続継代の間、該培地(ii)で前記鳥類細胞を培養する(該培地(ii)中の血清の割合は無血清培地が得られるまで段階的に減少される);
無血清培地(iii)、培地(iii)で前記鳥類細胞を培養し、その後、培地の変更に適応させた前記鳥類細胞を無血清培地中に維持する。
フィーダー層/血清/増殖因子;
フィーダー層/増殖因子/血清;
血清/増殖因子/フィーダー層;
血清/フィーダー層/増殖因子;
増殖因子/血清/フィーダー層;
増殖因子/フィーダー層/血清。
好ましい実施形態では、離脱順序は増殖因子/フィーダー層/血清である。
好ましい実施形態では、前記血清枯渇は漸進的離脱により行われる
高い核−細胞質比、
内因性アルカリ性ホスファターゼ活性、
内因性テロメラーゼ活性、
SSEA−1(TEC01)、SSEA−3、およびEMA−1に対する特異的抗体との反応性。
それらの細胞はENS1遺伝子を発現する;
これらのEBx(登録商標)細胞株は、基礎培地、特に、当業者によって一般に使用される様々な添加剤を補給した、SAFC社のExcell培地、DMEM、GMEM、ハムF12、またはマッコイなどの培地で無限に増殖することが可能である。添加剤としては、非必須アミノ酸、ビタミンおよびピルビン酸ナトリウム、脂肪酸、酵母およびダイズ加水分解物が挙げられ得る。しかしながら、これらの細胞は、グルタミンを含まない基礎培地で増殖することが可能である。これらの細胞株およびそれらに由来する細胞は、接着細胞または懸濁細胞のいずれかとして増殖する特徴を有する。
2.1−EB14細胞核型
EB14細胞の核型解析は、Pr. Michel Franck Laboratory, Unite de zootechnie, ethnologie et economie rurale, Ecole Nationale Veterinaire, 1 avenue Bourgelat, 69280 Marcy I'Etoile, Franceで行われた。
105代継代:染色体構造の数=78(調べた中期細胞53個に関する平均:78.41−標準偏差:4.951)
118代継代:染色体構造の数=79(調べた中期細胞50個に関する平均:79.68−標準偏差:3.733)。
免疫抑制された新生ラットモデルにおいて127代継代のEB14細胞の腫瘍原性を評価した(Sanofi-Aventis, France)(WHO技術報告書番号878(1998)。Hela細胞を陽性対照として用いた。10匹の免疫抑制された新生ラットにEB14細胞1000万個を皮下注射し、さらなる10匹の免疫抑制された新生ラットにHela細胞1000万個を皮下注射した。総ての動物は、0日目、+2日目、+7日目、および+14日目に0.1mlの抗胸腺細胞ラット血清を受けた。注射部位の小結節を検出するため、動物を3週間の間定期的に観察した。3週間後、動物を殺し、注射部位および他の器官における細胞増殖を検出するために検査した。EB14細胞の注射部位または遠隔臓器では小結節も腫瘍も見られなかった。免疫抑制された新生ラットモデルではEB14は非腫瘍形成性である。
EB14細胞において鳥類インフルエンザウイルスに対する受容体(Sia 2−3Gal)およびヒトインフルエンザウイルスに対する受容体(Sia 2−6Gal)の検出を、ジゴキシゲニン標識レクチン(Boehringer)を用いることによる蛍光セルソーター解析により行う:
・Sambuca nigra (SNA) agglutininレクチンはSia 2−6Galと特異的に結合する;
・Maackia amurensis (MAA) agglutininレクチンはSia 2−3Galと特異的に結合する。
3.1−材料と方法
緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする組換えMVAウイルスを用いた。伝染性MVA−GFPウイルスの力価測定をDF−1細胞において行った。簡潔には、細胞を、5%ウシ胎児血清(FCS)(SAFC)および2mM L−グルタミン(Biowhittaker)を補給したDMEM培地(Biowhittaker)の入った96平底ウェルプレートに密度 15.103細胞/ウェルで播種した。24時間後、細胞を、DMEMで10倍連続希釈したサンプルに感染させ、37℃、5%CO2で加湿雰囲気中1週間インキュベートした。ウイルス感染性を、全体的な細胞変性効果(CPE)およびUV照射した感染細胞の顕微鏡観察により測定した。次いで、TCID50力価をReed and Muench法(1938, A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97)に従って算出した。
3.2.1−材料
容器:F175フラスコ(Starstedt, Ref. 83 1812502)
回転式攪拌装置:IKA社のKS260または等価物
ソニケーター:IKA社のU50(US50−3プローブでモニタリングされる)
培地:2.5mMグルタミン(Cambrex Ref. BE17605E)含有Excell 65319(SAFC-JRH);
工程1:EB14細胞の調製
細胞は感染試験開始の2週間前に調製する。
第0日目:EB14細胞をF175フラスコにおいて、2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地25ml中0.4×106細胞/mLで播種する[集塊破壊後の第1回目の播種]。細胞を攪拌下(60rpm)、37℃、7,5%CO2、加湿雰囲気でインキュベートする。
第1日目:2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地25mlを添加する。
第2日目:2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地50mlを添加する。
第3日目:細胞を計数する。1アリコートのEB14細胞を新しいF175フラスコにおいて、2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地25ml中0.4×106細胞/mLで播種する。これが希釈+1となる。
第4日目:2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地25mlを添加する。
第5日目:2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地50mlを添加する。
第6日目:細胞を計数する。1アリコートのEB14細胞を新しいF175フラスコにおいて、2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地25ml中0.4×106細胞/mLで播種する。これが希釈+2となる。
第1日目:EB14細胞をF175フラスコにおいて、2.5mMグルタミンを含有するJRH社のExcell 65319培地40mL中、0.4×106細胞/mLで播種する。細胞を攪拌下(60rpm)、37℃、7,5%CO2、加湿雰囲気でインキュベートする。
第2日目および第3日目:細胞を計数する。
第4日目:細胞を計数する。フラスコ内の細胞密度が約4×106細胞/mlであるときに、EB14細胞を、1フラスコ当たりウイルス感染用ミックス1mlを用いてMOI 0.01TCID50/細胞で感染させる。ウイルス感染用ミックスは、2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地でのウイルスの希釈により使用直前に調製する。接種材料はそれぞれ、15mlのFalcon(商標)チューブに入れて氷上で30秒超音波処理する(振幅100%および連続サイクル)。接種材料は、室温で温めた後、細胞培養物と混合する。接種後、感染させた培養培地を37℃で1時間インキュベートする。その後、そのフラスコに60mlの新鮮培地、2.5mMグルタミン、0.5×Yeastolate、および0.35ml/L脂肪酸を補給したExcell 65319を添加する。その感染細胞培養物を37℃で少なくとも144時間の間(nb:ウイルスの生産ピークはpi+72時間〜pi+120時間の間である)さらにインキュベートする。
3.3.1−材料
容器:500mlおよび1Lスピナーボトル(Corning)
回転式攪拌装置:IKA社のKS260または等価物
ソニケーター:IKA社のU50(US50−3プローブでモニタリングされる)
培地:2.5mMグルタミン(Cambrex Ref. BE17605E)含有Excell 65319(SAFC-JRH);
工程1:EB14細胞の調製
細胞は感染試験開始の2週間前に調製する。
第0日目:EB14細胞をF175フラスコにおいて、2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地25ml中、0.4×106細胞/mLで播種する[集塊破壊後の第1回目の播種]。細胞を攪拌下(60rpm)、37℃、7,5%CO2、加湿雰囲気でインキュベートする。
第1日目:2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地25mlを添加する。
第2日目:2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地50mlを添加する。
第3日目:細胞を計数する。1アリコートのEB14細胞を新しいF175フラスコにおいて、2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地25ml中、0.4×106細胞/mLで播種する。これが希釈+1となる。
第4日目:2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地25mlを添加する。
第5日目:2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地50mlを添加する。
第6日目:細胞を計数する。1アリコートのEB14細胞を新しいF175フラスコにおいて、2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地25ml中、0.4×106細胞/mLで播種する。これが希釈+2となる。
第1日目:EB14細胞を500ml(または1,000ml)のスピナーボトルにおいて、2.5mMグルタミンを含有するJRH社のExcell 65319培地150mL(または300ml)中、0.4×106細胞/mLで播種する。細胞を攪拌下(100rpm)、37℃、7,5%CO2、加湿雰囲気でインキュベートする。
第2日目および第3日目:細胞を計数する。
第4日目:細胞を計数する。スピナー内の細胞密度が約4×106細胞/mlであるときに、EB14細胞を、1スピナーボトル当たりウイルス感染用ミックス1mlを用いてMOI 0.01TCID50/細胞で感染させる。ウイルス感染用ミックスは、2.5mMグルタミン含有Excell 65319培地でのウイルスの希釈により使用直前に調製する。接種材料はそれぞれ、15mlのFalcon(商標)チューブに入れて氷上で30秒超音波処理する(振幅100%および連続サイクル)。接種材料は、室温で温めた後、細胞培養物と混合する。接種後、感染させた培養培地を37℃で1時間インキュベートする。その後、その500ml(または1,000ml)のスピナーボトルに60mlの新鮮培地、2.5mMグルタミン、0.5×Yeastolate、および0.35ml/L脂肪酸を補給したExcell 65319を添加する。その感染細胞培養物を37℃で少なくとも144時間の間(nb:ウイルスの生産ピークはpi+72時間〜pi+120時間の間である)さらにインキュベートする。
3.4.1−方法
細胞の解凍
細胞の冷凍バイアルは液体窒素中−196℃で保存される;各冷凍バイアルには20.106細胞入っている。冷凍バイアルを急速解凍するためには、冷凍バイアルを37℃の予温した水浴で直接解凍する。その細胞懸濁液を予温した培養培地30mLの入った50mLのPP滅菌チューブにピペットで移す。その細胞懸濁液を室温で300±20gにて5分遠心分離し、その上清を廃棄し、ペレットを新鮮培養培地15mlに再懸濁し、ゆっくりとホモジナイズする。この細胞懸濁液をT75cm2フラスコに入れ、7.5%CO2雰囲気下、オービタルシェーカーで50rpmにて37℃でインキュベートする。培養の24時間後および48時間後、その細胞培養物に予温した培養培地15mlを添加する。培養の72時間後、サンプルを採取し(バルクホモジナイゼーション後)、計数を行う:>40.106細胞と見込まれる。その後、第1回目の増幅を行う。
懸濁細胞をフラスコから50mLのPP滅菌チューブに採取する。室温で300±20gにて5分遠心分離した後、その上清を廃棄し、ペレットに予温した新鮮培養培地10mLを添加する。この細胞集塊を10mLのピペットでゆっくりと解離し、細胞懸濁液を必要に応じて1つの50mLのPP滅菌チューブにプールする。必要に応じて新鮮な予温した培養培地を添加して、培養物量を最終20mLまでとする。トリパンブルーを用いて計数を行って、細胞密度および細胞生存率(細胞生存率は一般におよそ80%である)を決定する。1つのT175cm2フラスコにおいて、予温した培養培地40mlに0.4.106細胞.mL−1を播種する。この細胞培養物を7.5%CO2雰囲気下、オービタルシェーカーで50rpmにて37℃でインキュベートする。第2日目に、その細胞培養物に予温した培養培地60mlを添加する。第3日目に、細胞の希釈を行う。
(ゆっくりと混合した後)T175フラスコからサンプルを採取して、トリプタンブルーを用いて計数を行って、細胞密度を決定する。(ゆっくりと混合した後)T175フラスコからサンプルを採取して、総量25mlの予温した培養培地の入った1つのT175cm2フラスコに0.4.106細胞.mL−1播種する。これが希釈+1となる。
第1日目に、予温した培養培地50mlを添加する。第2日目に、希釈+1の場合と同じ方法を用いて希釈+2を行う(上記参照)。このように、希釈+3〜+5まで細胞の増幅を行う。3Lバイオリアクターの場合の接種材料は、希釈+3〜希釈+5までから調製することができる。接種材料として2つのT175フラスコを調製する。
播種−第0日目
接種材料を調製する(3L−バイオリアクターに接種するには320.106細胞が必要である)。2つのT175フラスコにプールする。ゆっくりと混合した(細胞集塊を破壊してはならない)後サンプルを採取して、トリパンブルーを用いて計数を行って、細胞密度を決定する。150mLの細胞混合物を調製して、バイオリアクターにおける最終培養物量800mlに細胞濃度0.40.106細胞.mL−1を得る。
定期的に細胞の計数を行う。培養期間を通じて、BioProfile Basicソフトウェアを用いて、グルタミン酸塩、グルタミン、乳酸塩、およびグルコースなどの代謝物を解析する。必要に応じて代謝物の濃度を調整する。例えば、グルタミン濃度を2mMに調整する。
細胞密度は、培養の3日後に、3.106細胞.mL−1より高くなっているはずである。目的の細胞密度に達していた場合には(3〜5.106細胞.mL−1)、ウイルス感染をMOI 10−2TCID50/細胞で行う。ウイルス株を氷上で解凍する。感染用ミックスは、生産培地10mLを用いて50mLのPP滅菌チューブで調製する。感染用ミックスは氷上で30秒間超音波処理する(振幅100%および連続サイクル)。その感染用ミックスをバイオリアクターに接種する。ウイルス吸着の1時間後、その容器に最終生産培地を添加する。Excell 65319生産培地1.5Lに、Yeastolateおよび脂肪酸をそれぞれ、終濃度0.5Xおよび0.35ml/Lまで補給する(最終量:2,3L)。
MVAウイルスの生産ピークは感染の72時間後〜120時間後の間に達する。毎日バイオリアクターからおよそ15mlのサンプルを採取して、細胞の計数、細胞形態解析を行い、CPEを観察する。培養期間を通じて、BioProfile Basicソフトウェアを用いて、グルタミン酸塩、グルタミン、乳酸塩、およびグルコースなどの代謝物を解析する。必要に応じて代謝物の濃度を調整する。例えば、必要に応じてグルタミン濃度を2mMに調整する。必要に応じてグルコース濃度を2g.L−1に調整する。
試験終了時に、採取したサンプル総てを用いて、ウイルス力価測定を実施する。
3.5−結果
3.5.1−3LフェドバッチバイオリアクターにおけるEB14細胞の細胞増殖速度
攪拌槽型バイオリアクターにおいてEB14細胞を規定どおりに培養する。EB14由来バイオマスを、細胞密度5〜6.106細胞/mLに達するまで、細胞増殖培地中に37℃で蓄積させる。次いで、その混合物をおよそ3倍希釈し、細胞増殖速度を10日間かけて追跡調査する。かかる条件では、通常、5〜8日目あたりに細胞密度1200〜1600万細胞/mlに達する(図7A)。EB14細胞の分割比は増加してよい。図7Bは10倍希釈したEB14細胞の増殖速度を示している。
EB14細胞は懸濁培養により増殖する。しかしながら、EB14細胞はフラスコおよびプレートにおいて接着状態で増殖する能力も有する。この特徴によって、本発明者らは、接着EB14細胞におけるMVA−GFPのプラーク精製の実施を可能にする。そうするために、MVA−GFPウイルスの10倍連続希釈物を、24時間前に6ウェルプレートに密度7.104細胞/cm2で播種された接着EB−14細胞に接種した。ウイルス吸着後、細胞の上に1.2%LMPアガロース/2.5%FCS DMEMの混合物の層を形成し、37℃で数日間インキュベートした。最後に、ウェルをニュートラルレッドで染色した。その後、プラーク形成単位の力価を算出することができ、希釈により単離プラークを得る。
EB14に、細胞増殖培地(Excell 65319)での細胞増殖中にT175攪拌槽型フラスコ内で、小型または大型集塊を形成させた。次いで、集塊を10−2TCID50/細胞のMVA−GFPウイルスに感染させ、その混合物をいくつかの生産培地(Optipro、Excell 319、Excell 421、Excell 625、Excell 626、Excell 627、Excell 628、Excell 629、G9916)で希釈した。EB14細胞の大型集塊が存在することによりウイルス感染および増殖が向上し(図8)、より高いMVAウイルス力価がもたらされる(図9)。ウイルス生産培地に、yeastolate(補給物1)および脂肪酸(補給物2)などの補給物を添加することにより、MVAウイルス力価はさらに向上する。図10で示されるように、培地にyeastolate 1X(補給物1)を添加しただけの場合には、MVA−GFPウイルス収量が増加するが、細胞増殖培地にyeastolate(補給物1)および脂肪酸(補給物2)を添加した場合には、相乗効果までも得られる。実際に、脂肪酸1X単独ではウイルス力価は増加しない。
細胞増殖期中にEB14由来バイオマスをExcell 65319増殖培地中に蓄積させた。次いで、細胞を10−2TCID50/細胞のMVA−GFPウイルスに感染させ、その混合物をExcell 65319生産培地で希釈した。Excell 65319の添加後、細胞密度は低下した(第3日目)が、第5日目には感染細胞の細胞密度は増加し、4百万細胞/mlに達した。細胞増幅中に遠心分離が行われないという事実により、感染の2〜4日後に培養により大型集塊サイズを得ることが可能になる(図11)。かかる条件では、MVA−GFP生産性は高い。感染後6日目以降、MVA−GFPの力価はおよそ108.32 TCID50/ml(細胞濃度1.49×106細胞/ml)であり、この値はTCID50/細胞=414(増幅係数41,000)に相当する(図12)。EB14細胞を、(例えば、希釈により)集塊を破壊しないで増幅する場合には、3L−バイオリアクターにおいて大型集塊の不在下で細胞培養物に得られるウイルス力価(増幅係数およそ1900およびTCID50/細胞=19)よりも高いウイルス力価が得られるようである。
MVAウイルスに感染したEB14細胞を電子顕微鏡(Drs. Daniele Spehner & Robert Drillien, IGBMC, Strasbourg France)により解析した。EB14細胞において生産されるMVAウイルスの成熟は標準的であり、一次ニワトリ胚繊維芽細胞において認められる成熟と同様である。
4.1−材料および方法
4.1.1−インフルエンザウイルス感染性試験(TCID50)
伝染性インフルエンザウイルスの力価測定をMDCK細胞において行った。簡潔には、細胞を、2.5mM L−グルタミンを補給したUltraMDCK培地の入った96平底ウェルプレートに密度3.103細胞/ウェルで播種した。24時間後、細胞を、6μg.mL−1トリプシン−EDTAを含むUltraMDCKで10倍連続希釈したサンプルに感染させ、33℃、5%CO2で加湿雰囲気中1週間インキュベートした。その後、ウイルス複製を、ニワトリ赤血球を用いてHAアッセイにより試験し、TCID50力価をReed and Muench法(1938)*に従って算出した。
*Reed L, Muench H, 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97.
インフルエンザウイルス感染EB14細胞由来のサンプル中の血球凝集素濃度を、Wood and colleagues*に記載のとおり決定した。簡潔には、ガラスプレートを抗インフルエンザ血清を含む(NIBSCにより提供された推奨濃度)アガロースゲルでコーティングした。ゲルをセットした後、参照およびサンプルの適当な希釈物10μLを直径3mmの穴のあいたウェルにのせた。湿室内、室温で18〜24時間のインキュベーション後、プレートを0.9%NaClに浸漬し、蒸留水で洗浄した。その後、そのゲルをプレスし、乾燥させた。プレートをクーマシーブリラントブルー溶液で15分間染色し、はっきりとした染色域が目に見えるようになるまでメタノールと酢酸の混合物で2回脱染した。プレートを乾燥させた後、抗原のウェル周囲の染色域の直径を直角に2方向に測定した。表面に対する抗原希釈物の用量反応曲線を作成し、それらの結果を標準的な傾斜比法に従って算出した。*Wood JM. Et al. "An improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: application for potency determinations of inactivated whole virus and subunit vaccines". J Biol Stand. 1977;5(3):237-47).
SDS−PAGEを、Laemmli UK (1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 259:680-685)によって記載されているとおり、10%ポリアクリルアミドゲルで行った。変性タンパク質(1%SDS、70mM β−メルカプトエタノール)を、半乾燥ブロッティング手法によりポリビニリデンジフルオライドメンブレン(hybond P, Amersham)に移した(Kyhse-Andersen J (1984) Electroblotting of multiple gels : a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. J Biochem Biophys Methods 10:203-209)。ブロットを、1%FCS(SAFC)を補給したTBST中の5%脂肪乾燥粉乳からなる混合物を用いて室温で1時間ブロッキングした。その後、それらのブロットを、特異的ポリクローナル抗HAヒツジ血清(1:500(NIBSC)を補給したブロッキング溶液中で一晩インキュベートした。それらのブロットをTBSTで6回洗浄し、ブロッキング溶液中でhrpコンジュゲートウサギ抗ヒツジIgGポリクローナル抗体(1:5000(Rockland)とともに室温で1時間インキュベートした。TBSTで6回洗浄した後、最後に、化学発光(ECLキット, Amersham)およびフィルム(Hyperfilm, Amersham)を用いてタンパク質コンジュゲート複合体を明らかにした。
4.2.1−材料および装置
細胞解凍用材料
T75cm2フラスコ(Sarstedt, カタログ番号831813502)
培養培地(無血清培地)
L−グルタミン 200mM(Biowhittaker, カタログ番号BE17-605E)
回転式攪拌装置 IKA社のKS260(Fisher Bioblock, カタログ番号F35044)
T175cm2フラスコ(Sarstedt, カタログ番号831812502)
培養培地(無血清培地):2.5mMグルタミンを添加したExcell 65319(JRH, カタログ番号65319-1000M 1687)
L−グルタミン 200mM(Biowhittaker, カタログ番号BE17-605E)
Yeastolate UF溶液 50X(JRH, カタログ番号58902-100M)
D(+)グルコース(45%)(Sigma, カタログ番号G8769)
生産培地(無血清培地):2.5mM glnを補給したExcell 65629(JRH, カタログ番号65629)
Yeastolate UF溶液 50X(JRH, カタログ番号58902-100M)
L−グルタミン 200mM(Biowhittaker, カタログ番号BE17-605E)
D(+)グルコース(45%)(Sigma, カタログ番号G8769)
トリプシン(Trypzean 1X, Sigma, カタログ番号T3449)
7.5%重炭酸ナトリウム溶液(Sigma, カタログ番号205-633-8)
インフルエンザウイルス株(−80℃で冷凍)
細胞の解凍
細胞の冷凍バイアルは液体窒素中−196℃で保存される;各冷凍バイアルには20.106細胞入っている。冷凍バイアルを37℃の予温した水浴で直接解凍する。その細胞懸濁液を予温した培養培地30mLの入った50mLのPP滅菌チューブに入れる。遠心分離(室温で300±20gにて5分)後、ペレットに新鮮培養培地15mlを添加し、ゆっくりとホモジナイズする。そのサンプルを、トリパンブルーを用いて計数する。良好な培養を保証するためには、計数では≧20.106細胞でなければならず、生存率は>70%でなければならない。この細胞懸濁液をT75cm2フラスコに入れ、7.5%CO2雰囲気下、オービタルシェーカーで50rpmにて37℃でインキュベートする。培養の24時間後および48時間後、その培養物に予温した培養培地15mlを添加する。培養の72時間後、サンプルを採取し(バルクホモジナイゼーション後)、計数を行う:20〜30.106細胞と見込まれる。その後、第1回目の増幅を行う。
懸濁細胞をフラスコから50mLのPP滅菌チューブに採取し、室温で300±20gにて5分遠心分離する。ペレットに予温した新鮮培養培地10mLを添加する。この細胞集塊をゆっくりと解離し、細胞懸濁液をプールし、新鮮な予温した培養培地を添加して、容量を最終40mLにする。1つのT175cm2フラスコにおいて、予温した培地40mlに0.25.106細胞.mL−1を入れ、7.5%CO2雰囲気下、オービタルシェーカーで50rpmにて37℃でインキュベートする。第2日目に、予温した培養培地60mlを添加する。第3日目に、第2回目の増幅を行う。
播種−第0日目
接種材料を調製する(3L−バイオリアクターに接種するには320.106細胞が必要である)。2つのT175フラスコにプールする。ゆっくりと混合した(細胞集塊を破壊してはならない)後サンプルを採取して、トリパンブルーを用いて計数を行って、細胞密度を決定する。150mLの細胞混合物を調製して、バイオリアクターにおける最終培養物量800mlに細胞濃度0.40.106細胞.mL−1を得る。
細胞播種の前に、容器内のpHを7.2に設定する(pHはCO2表面注入により低下するため)。pO2は50%O2飽和に設定する(質量流量調整器を、50mL.分−1の最大スパージャー流量に相当する100%に調整する)。この処理の初めには、pHをCO2表面注入により維持し、後には、7.5%NaHCO3を添加することにより制御する。表面通気は流速0.3mL.分−1の空気で開始する。
定期的に細胞の計数を行う。培養期間を通じて、BioProfile Basicソフトウェアを用いて、グルタミン酸塩、グルタミン、乳酸塩、およびグルコースなどの代謝物を解析する。必要に応じて代謝物の濃度を調整する。例えば、グルタミン濃度を2mMに調整する。
細胞密度は、培養の3日後に、4〜5.106細胞.mL−1より高くなっているはずである。目的の細胞密度に達していた場合には、ウイルス感染をMOI 10−4で行う。容器の温度を33℃に設定する。ウイルス株を氷上で解凍する。感染用ミックスは、生産培地10mLで調製する。感染用ミックスをバイオリアクターに接種した後、ウイルス吸着を1時間の間行う。最終生産培地を調製する:生産培地1.5L中にトリプシンを添加して、容器における終濃度0.3U.mL−1を得(全体で2.3L)、0.5X Yeastolateを添加する。その後、予温した最終生産培地を添加する。
毎日バイオリアクターからおよそ15mlのサンプルを採取して、細胞の計数、細胞形態解析を行い、CPEを観察する。培養期間を通じて、BioProfile Basicソフトウェアを用いて、グルタミン酸塩、グルタミン、乳酸塩、およびグルコースなどの代謝物を解析する。必要に応じて代謝物の濃度を調整する。例えば、必要に応じてグルタミン濃度を2mMに調整する。必要に応じてグルコース濃度を2g.L−1に調整する。
試験終了時に、採取したサンプル総てを用いて、ウイルス力価測定、ヘマグルチニンアッセイ(HAU)、およびHA抗原の定量(ウエスタンブロット、SRID)を実施する。
本発明者らは、EB14細胞がインフルエンザウイルスの様々なAおよびB株の複製のための信頼できる効率的な細胞基質であることを証明している。インフルエンザウイルスの生産は、フラスコおよびスピナー(データは示さず)、ならびにバイオリアクターなどの様々な容器において行うことができる。3Lおよび30L攪拌槽型バイオリアクターにおけるインフルエンザウイルス生産の再現性のある効率的なフェドバッチ法は、本発明者らによって得られた。フラスコでは通常、血球凝集素25mg/lを上回る生産性が得られるが、インフルエンザウイルスのAおよびB株に関してはフラスコにおいて通常、血球凝集素35mg/lを上回る生産性が得られる。
Claims (42)
- 鳥類胚性幹細胞EBx(登録商標)において、アデノウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択されるウイルスを複製する方法であって、
a)該EBx(登録商標)細胞を培養器内で、無血清培地N°1中、懸濁状態で増殖させる工程;
b)該細胞密度が少なくとも150万細胞/mlであるときに、該細胞を該選択されたウイルスに感染させる工程;
c)感染直前に、感染と同時に、または感染直後に、細胞培養物に無血清培地N°2を添加する工程;および
d)ウイルス複製を可能にするために、感染細胞をさらに培養する工程;さらに
e)所望により、該ウイルスを採取する工程
を含んでなる、方法。 - 前記培養器が、連続攪拌槽型バイオリアクターである、請求項1に記載の方法。
- 前記無血清培地N°1と前記無血清培地N°2が同じ培地である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記無血清培地N°1と前記無血清培地N°2が異なる組成を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 無血清培地N°1に、0.25〜10容量の無血清培地N°2が加えられる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無血清培地N°1および/または前記無血清培地N°2に、アミノ酸、脂質、脂肪酸、コレステロール、炭水化物、非動物起源のタンパク質加水分解物、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの成分が補給される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞に、アミノ酸、脂肪酸、炭水化物、非動物起源のタンパク質加水分解物、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの成分を供給するさらなる工程を含んでなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記供給が工程a)〜d)中に、好ましくは工程b)〜d)中に生じる、請求項7に記載の方法。
- 前記供給が毎日生じる、請求項8に記載の方法。
- 前記供給が継続的に生じる、請求項8に記載の方法。
- 前記供給が1日当たり1回以上生じる、請求項8に記載の方法。
- 前記供給が1日当たり1回未満生じる、請求項8に記載の方法。
- アミノ酸が、アスパラギンおよびグルタミン、またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項6〜12のいずれか一項に記載の方法。
- グルタミンの供給が、工程a)〜d)中に行われ、前記培地中のグルタミン濃度が0.5mM〜5mMの間、好ましくはおよそ2mMに維持される、請求項13に記載の方法。
- 炭水化物が、D−グルコース、およびD−ガラクトース、またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項6〜12のいずれか一項に記載の方法。
- D−グルコースの供給が、工程b)〜d)中に行われ、前記培地中のD−グルコース濃度が、D−グルコースがおよそ0.5g/l〜25g/l、好ましくはおよそ2g/lに維持される、請求項15に記載の方法。
- 脂肪酸が、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項6〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 非動物起源のタンパク質加水分解物が、細菌トリプトン、酵母トリプトン、植物加水分解物、またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項6〜12のいずれか一項に記載の方法。
- EBx(登録商標)細胞が、集塊細胞として懸濁状態で培養される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)においてEBx(登録商標)細胞培養物の、1つの培養器から別の培養器への少なくとも1回の継代、好ましくは少なくとも総ての継代、がEBx(登録商標)細胞集塊を破壊することなく希釈により行われる、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)においてEBx(登録商標)細胞培養物の、1つの培養器から別の培養器への少なくとも1回の継代、好ましくは少なくとも総ての継代、が細胞集塊を遠心分離および/または破壊する工程を含まない、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)が感染工程b)後、好ましくは工程b)のおよそ1時間後、に行われる、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 感染工程b)が、m.o.i(多重感染度)約10〜10−6、好ましくは約10−3〜10−5、およびより好ましくは約10−4、で行われる、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスが、改変ワクシニアAnkara(MVA)ウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス(すなわち、ALVAC)、ユキヒメドリ痘ウイルス、キュウカンチョウ痘ウイルス、鳩痘ウイルス、オウム科のポックスウイルス、ウズラ痘ウイルス、スズメ痘ウイルス、ムクドリ痘ウイルス、シチメンチョウ痘ウイルスからなる群の中から選択される天然ポックスウイルスまたは組換えポックスウイルスである、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスが、麻疹ウイルス、および流行性耳下腺炎ウイルスからなる群の中から選択される天然ウイルスまたは組換えウイルスである、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスが、ヒトインフルエンザウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルスの中から選択される、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒトインフルエンザウイルスが、H1N1株、H2N2株、H3N2株、H4N2株、H4N6株、H5N1株、H7N7およびH9N2株の中から選択されるA株である、請求項26に記載の方法。
- 工程a)の培養が、バッチ培養、反復バッチ培養、フェドバッチ培養、または灌流培養により行われる、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)における感染が、前記細胞密度がバッチ法またはフェドバッチ法において、少なくともおよそ400万細胞/ml、好ましくは600万細胞/ml、である場合に行われる、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)における感染が、前記細胞密度が灌流法において少なくとも800万細胞/ml、好ましくはおよそ900万〜1000万細胞/mlである場合に行われる、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)、b)、c)、およびd)における無血清培養培地のpHが、6.5〜7.8の範囲である、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 工程d)が、採取前の2〜10日間続く、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞培養が、30℃〜39℃の間を含む温度、好ましくはおよそ37℃で行われる、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法により得られた、ウイルス。
- 請求項34に記載のウイルスを、適切な場合にはその免疫応答を増強する物質と組み合わせて含む、ワクチン。
- 前記ウイルスが、無傷ウイルス粒子として存在する、請求項35に記載のワクチン。
- 前記ウイルスが、分解されたウイルスの粒子として存在する、請求項35に記載のワクチン。
- 前記ウイルスが、弱毒化ウイルスとして存在する、請求項35に記載のワクチン。
- 請求項34に記載のウイルスの構成成分を、適切な場合にはその免疫応答を増強する物質と組み合わせて含む、ワクチン。
- 前記ウイルスの単離タンパク質を含む、請求項35に記載のワクチン。
- 請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法により得ることができ、かつ工程d)において採取される感染細胞株EBx(登録商標)を含んでなる、ワクチン。
- 請求項34に記載のウイルスまたはその構成成分を含む、診断用組成物。
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