JP2020533986A - 細胞を培養および増殖させるための組成物および方法 - Google Patents

細胞を培養および増殖させるための組成物および方法 Download PDF

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    • C12N2710/16751—Methods of production or purification of viral material

Abstract

本明細書では、とりわけ、細胞（Ｔ細胞、二倍体細胞、または非二倍体細胞等）を培養および増殖させるための組成物、系、キット、および方法が提供され、障害を（例えば、Ｔ細胞で）治療するための方法、ならびにワクチンを含む生物学的分子および組成物（例えば、タンパク質、ウイルス、ウイルス粒子、またはそれらの断片等）を生産するための方法も提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月１５日に提出された米国特許仮出願第６２／５５９，３９１号および２０１８年８月３１日に提出された米国特許仮出願第６２／７２５，３７６号の利益を主張する。上述の出願の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
細胞分裂等の細胞特性の速度の増加を可能にする方法は、特に、細胞を個体から取り出し、培養し、その後その個体に再導入する場合に、生物学的産生および治療的介入の両方を改善する潜在性を有する。
例えば、Ｔ細胞が様々ながんまたは感染性生物に関連する抗原の構造を認識する能力は、α（アルファ）鎖およびβ（ベータ）鎖またはγ（ガンマ）鎖およびδ（デルタ）鎖の両方からなるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）によってもたらされる。Ｔ細胞および様々なサブセットは、がん、自己免疫障害、炎症性疾患、アレルギー性疾患、および感染性疾患の治療において広範囲の治療的意義を有する。Ｔ細胞および他の細胞を増殖させるための信頼性が高く効率的かつ迅速な方法に対して、長年にわたる切実な必要性が存在する。
細胞（例えば、ヒト細胞）を培養および／または増殖させるための組成物および方法が提供され、細胞は、１つ以上の産物（例えば、１つ以上のタンパク質（例えば、１つ以上の異種タンパク質）、１つ以上の核酸分子（例えば、１つ以上の異種タンパク質）、１つ以上のウイルス、および／または１つ以上のＶＬＰ）を産生する。とりわけ、細胞（例えば、Ｔ細胞）を培養および／または増殖させるための組成物、系、キット、および方法、ならびに障害を細胞（例えば、Ｔ細胞）で治療するための方法が本明細書でさらに提供される。
一態様では、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む培養培地組成物（例えば、無血清細胞培養培地組成物）が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本組成物は、リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびメチル化シクロデキストリンを含む。
一態様では、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む培養補助剤組成物（例えば、無血清細胞培養補助剤組成物）が本明細書に含まれる。いくつかの実施形態では、本組成物は、リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびメチル化シクロデキストリンを含む。
リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、および少なくとも１つのシクロデキストリンを含む細胞培養培地組成物（例えば、無血清細胞培養培地組成物）、ならびにリノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、および少なくとも１つのシクロデキストリンを含む細胞培養補助剤組成物（例えば、無血清細胞培養補助剤組成物）が本明細書でさらに提供される。多くの場合、シクロデキストリンは、メチル化シクロデキストリンである。多くの場合、シクロデキストリンは、約５０μＭ〜約２００μＭのレベルで存在する。多くの場合、コレステロールは、合成コレステロールであり、コレステロールは、約５μＭ〜約３０μＭの濃度で存在する。加えて、いくつかの例では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、多価不飽和オメガ−６脂肪酸である。場合によっては、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、アラキドン酸であるか、またはそれを含む。場合によっては、多価不飽和オメガ−６脂肪酸は、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸からなる群から選択される１つ以上の脂肪酸である。場合によっては、細胞培養補助剤組成物の有効希釈度は、約１：１０〜約１：５０００である。
本明細書で提供される細胞培養培地組成物（例えば、無血清細胞培養培地組成物）および／または本明細書で提供される細胞培養培地補助剤（例えば、無血清細胞培養培地補助剤）は、タンパク質（例えば、異種タンパク質）、核酸分子（例えば、異種タンパク質）、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生し得る細胞の培養に使用することができる。
本明細書で提供される細胞培養培地組成物を使用して培養することができる細胞には、真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母細胞）、植物細胞および動物細胞（例えば、ｓｆ９細胞等の昆虫細胞、およびヒト細胞、ニワトリ細胞、サル細胞等の哺乳動物細胞）が含まれる。場合によっては、動物細胞は、ウシ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である。さらに、本明細書に明記されるように培養される細胞は、二倍体細胞であってもよい。
場合によっては、本明細書で提供される細胞培養培地組成物は、細胞の培養に使用され、細胞は、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＭＲＣ−９、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝臓、Ｕ９３７、ＭＤＣＫ、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ、および前述の細胞の任意のクローンから選択される。
場合によっては、本明細書で提供される細胞培養培地組成物は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースをさらに含む。
場合によっては、本明細書で提供される細胞培養培地組成物は、細胞の成長（例えば、１つ以上の成分を省略する細胞培養培地組成物と比較した成長速度）、細胞の生存細胞密度、感染した細胞によって産生されるウイルスのウイルス力価、またはそれらの組み合わせを増加させるために使用することができる。
場合によっては、本明細書で提供される細胞培養培地組成物を使用して培養される細胞は、ウイルス（例えば、動物ウイルス、植物ウイルス、バクテリオファージ等）に感染しているか、または産生が所望される１つ以上の発現産物（例えば、１つ以上のサイトカイン、エリスロポエチン、抗体等の１つ以上のタンパク質）をコードする異種核酸を含有する。場合によっては、そのようなウイルスは、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、風疹、麻疹、流行性耳下腺炎、Ａ型肝炎、アデノウイルス、ポリオ、ロタウイルス、痘瘡、水痘、黄熱、パピローマウイルス、エボラウイルス、ＨＩＶ、狂犬病、または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびデングウイルスからなる群から選択される１つ以上のウイルスである。場合によっては、本明細書で提供される細胞培養培地組成物中で培養された細胞を使用して産生されたウイルス粒子は、パルボウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、またはバクテリオファージに由来する。
本明細書で提供される細胞培養補助剤組成物を基本培地に添加して、タンパク質、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、および／またはウイルス断片を産生することができる細胞（例えば、二倍体細胞）を培養してもよい。多くの場合、そのような細胞は、無血清条件下で培養される。
細胞集団（例えば、二倍体細胞集団）を培養するための方法であって、細胞集団を、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地中でインキュベートすることを含む、方法が本明細書でさらに提供される。場合によっては、そのような方法は、ワクチン産生細胞（例えば、二倍体細胞）を含み、本方法は、細胞集団を、（ｉ）シクロデキストリン（例えば、メチル化シクロデキストリン）、リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸（例えば、以下、アラキドン酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸のうちの１つ以上等の１つ以上の多価不飽和オメガ−６脂肪酸）、ならびにコレステロール、または好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤を含む、無血清細胞培養培地中でインキュベートすることを含み、培養は、シクロデキストリンを有しない血清含有培地中の生存細胞密度と比較して、該無血清細胞培養培地中の生存細胞密度を増加させる。
場合によっては、細胞集団（例えば、二倍体細胞集団）を培養するための方法には、（ｉ）培地または補助剤が、細胞の成長、細胞の生存細胞密度、ウイルスに感染した細胞のウイルス力価、またはそれらの組み合わせを増加させる場合、および／あるいは（ｉｉ）細胞（例えば、二倍体細胞）が、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはそれらのウイルス断片を産生することができる場合、および／あるいは（ｉｉｉ）該細胞が、ウイルスに感染している場合が含まれる。さらに、場合によっては、（ｉ）ウイルスは、動物ウイルス、植物ウイルス、もしくはバクテリオファージであり、かつ／または（ｉｉ）ウイルスは、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、風疹、麻疹、流行性耳下腺炎、Ａ型肝炎、アデノウイルス、ポリオ、ロタウイルス、痘瘡、水痘、黄熱、パピローマウイルス、エボラウイルス、ＨＩＶ、狂犬病もしくは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびデングウイルスからなる群から選択され、かつ／または（ｉｉｉ）ウイルス粒子は、パルボウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、もしくはバクテリオファージに由来する。
場合によっては、本明細書で提供される組成物および方法を使用して培養される細胞集団は、ＭＲＣ−５細胞、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ細胞、ＭＲＣ−９細胞、ＷＩ−３８細胞、２ＢＳ細胞、Ｗａｌｖａｘ−２細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＩＭＲ−９１細胞、ＫＭＢ−１７細胞、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝細胞、Ｕ９３７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ細胞、およびこれらの細胞の任意のクローンからなる群から選択される。
（Ａ）（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む無血清細胞培養培地、または（Ｂ）（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤、または（Ｃ）（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤を含む組み合わせが本明細書でさらに提供される。そのような組み合わせの場合によっては、（ｉ）細胞は、動物細胞であり、かつ／または（ｉｉ）動物細胞は、ウシ細胞、ネコ細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、霊長類細胞、もしくはヒト細胞であり、かつ／または（ｉｉｉ）動物細胞は、二倍体細胞であり、かつ／または（ｉｖ）細胞は、ＭＲＣ−５細胞、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ細胞、ＭＲＣ−９細胞、ＷＩ−３８細胞、２ＢＳ細胞、Ｗａｌｖａｘ−２細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＩＭＲ−９１細胞、ＫＭＢ−１７細胞、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝細胞、Ｕ９３７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ細胞、およびこれらの細胞の任意のクローンからなる群から選択される。場合によっては、細胞（例えば、二倍体細胞）は、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生する。
細胞培養培地（例えば、無血清培養培地、無血清二倍体細胞培養培地等）を作製する方法であって、（ｉ）基本培地と、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤、または（ｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤のいずれかとを混合することを含む、方法が本明細書でさらに提供される。場合によっては、補助剤は、１つ以上の成長因子をさらに含む。
細胞培地（例えば、二倍体細胞培地）の補充のための系であって、（ｉ）１つ以上の異なるシクロデキストリンであって、各シクロデキストリンが、別個の容器内にある、シクロデキストリンと、（ｉｉ）２つ以上の異なる脂肪酸であって、各脂肪酸が、別個の容器内にある、脂肪酸とを含む、系が本明細書でさらに提供される。
細胞または細胞株を培養するためのキットであって、（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む無血清細胞培養培地、ならびに／または（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、および（ｉｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤、ならびに／または（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、および（ｉｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤を含む、キットが本明細書でさらに提供される。本明細書で提供されるキットには、（ｉ）細胞が、動物細胞であるもの、または（ｉｉ）動物細胞が、ウシ細胞、ネコ細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、霊長類細胞、もしくはヒト細胞であるもの、または（ｉｉｉ）動物細胞が、二倍体細胞であるもの、または（ｉｖ）細胞が、ＭＲＣ−５細胞、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ細胞、ＭＲＣ−９細胞、ＷＩ−３８細胞、２ＢＳ細胞、Ｗａｌｖａｘ−２細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＩＭＲ−９１細胞、ＫＭＢ−１７細胞、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝細胞、Ｕ９３７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ細胞、およびこれらの細胞の任意のクローンからなる群から選択されるものが含まれる。本明細書で提供されるキットには、細胞が、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生するものもまた含まれる。
一態様では、細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団）を培養するための方法が本明細書で提供される。そのような方法は、集団を、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地中でインキュベートすることを含む。
一態様では、集団内のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比の変化を最小化しながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を培養するための方法が本明細書で提供される。そのような方法は、集団を、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質（例えば、多価不飽和脂肪酸）を含む培地中でインキュベートすることを含む。
一態様では、細胞亜集団（例えば、Ｔ細胞亜集団）のメンバーを優先的に増殖させるための方法が本明細書で提供される。そのような方法は、細胞（例えば、Ｔ細胞）の混合集団を、（ｉ）シクロデキストリンおよび（ｉｉ）脂肪酸に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の脂肪酸のモル比を調整して、細胞亜集団（Ｔ細胞亜集団）のメンバーを誘導して、他の細胞亜集団（１つ以上の他のＴ細胞亜集団）のメンバーに対して優先的に増殖させるように調整される。
一態様では、集団内のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を増加させながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を培養する方法が本明細書で提供される。そのような方法は、集団を、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を含む細胞培地中でインキュベートすることを含む。
本発明は、集団内のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を調整および／または維持するための組成物および方法をさらに含む。そのような方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との混合集団の細胞が、（１）本明細書に明記されるシクロデキストリン／脂質組成物、（２）２−ＤＧ、ならびに／または（１）および（２）の組み合わせと接触するものを含む。場合によっては、ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比が、１：１であるか、またはそれに近い、Ｔ細胞の集団を生成または維持することが望ましい。この文脈では、「１：１に近い」比は、１０％未満の変動を指す。したがって、１：０．９５のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比は、１：１に近いものである。
場合によっては、ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比が、１：１ではないか、またはそれに近くない、Ｔ細胞の集団を生成および／または維持することが望ましくあり得る。そのような場合では、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかが、その集団内で優勢であってもよい。一例として、場合によっては、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数よりも２倍多い（１：０．５の比のＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞）、Ｔ細胞集団を有することが望ましくあり得る。したがって、本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比またはＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞の比が、約１：１〜約１：０．１（例えば、約１：１〜約１：０．２、約１：１〜約１：０．３、約１：１〜約１：０．４、約１：１〜約１：０．５、約１：１〜約１：０．７等）である、Ｔ細胞集団を生成および／または維持するための組成物および方法を提供する。
一態様では、疾患の治療を必要とする対象において疾患を治療するための方法であって、本明細書で提供される方法、組成物、キット、または系を使用して得られたＴ細胞を、対象に投与することを含む、方法が本明細書で提供される。
一態様では、（ｉ）細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地、ならびに／または（ｉｉｉ）２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を含む細胞培養培地を含む組み合わせが本明細書で提供される。
一態様では、本明細書で提供される培地および／または補助剤、ならびに細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団の組み合わせを含む、生物発酵槽が本明細書で提供される。一態様では、本明細書で提供される培地および／または補助剤、ならびに細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団の組み合わせを含む、細胞培養プレートまたはフラスコが本明細書で提供される。
一態様では、細胞培地（例えば、Ｔ細胞培地）の補充のための系が提供される。この系は、（ｉ）２つ以上の異なるシクロデキストリンであって、各シクロデキストリンが、別個の容器内にある、シクロデキストリンと、（ｉｉ）２つ以上の異なる脂肪酸であって、各脂肪酸が、別個の容器内にある、脂肪酸と、（ｉｉｉ）２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）とを含む。
一態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞）を培養するためのキットが提供される。このキットは、以下、培養培地（例えば、無血清培養培地）、シクロデキストリン、１つ以上の脂質、および／または２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）のうちの１つ以上を含み得る。
（ｉ）細胞（例えば、二倍体または非二倍体細胞）の集団、ならびに（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地を含む、組み合わせもまた、本明細書で提供される。場合によっては、細胞（例えば、二倍体細胞）は、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生する。多くの場合、組み合わせは、無血清であるだろう。
細胞集団（例えば、二倍体細胞集団）を培養するための方法であって、細胞集団を、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地中でインキュベートすることを含む、方法が本明細書でさらに提供される。多くの場合、細胞培養培地は、無血清であるだろう。場合によっては、細胞集団は、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、ＶＥＲＯ細胞、チャン肝細胞、Ｕ９３７、ＭＲＣ−９、ＭＤＣＫ、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＨＵＴ（Ｔ細胞株）系列（例えば、ＨＵＴ７８、ＨＵＴ１０２等）、または任意のそのような細胞のクローンからなる群から選択される。場合によっては、細胞は、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生する。多くの場合、そのような産生は、無血清条件下で行われるだろう。
細胞培地（例えば、二倍体細胞培地）の補充のための系であって、（ｉ）１つ以上の異なるシクロデキストリンであって、各シクロデキストリンが、別個の容器内にある、シクロデキストリンと、（ｉｉ）２つ以上の異なる脂肪酸であって、各脂肪酸が、別個の容器内にある、脂肪酸とを含む、系もまた、本明細書で提供される。そのような系は、成長因子をさらに含み得る。
（ｉ）シクロデキストリンと、（ｉｉ）２つ以上の異なる脂肪酸であって、各脂肪酸が、別個の容器内にある、脂肪酸とを含む、二倍体細胞培地の補充のための系が本明細書でさらに提供される。
基本培地および無血清増殖補助剤を含む、ワクチン産生細胞または細胞株を培養するためのキットもまた、提供される。場合によっては、そのようなキットの無血清成長補助剤は、シクロデキストリンおよび１つ以上の脂質を含むだろう。さらに、キットは、ワクチン産生細胞または細胞株を含有するか、またはその培養に好適であり得る。場合によっては、ワクチン産生細胞は、二倍体細胞（例えば、ヒト細胞）または非二倍体細胞である。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される、例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、ならびに添付の図面を参照することにより得られるであろう。
表４に提示されるデータを描写する。結果は、ＣＤ補助剤１、２、および３（１：５００）が、脂質濃縮物（１：１００）および脂質補助剤を有しない培地と比較して、経時的な累積集団倍加として表されるＴ細胞増殖を増加させることを示す。ＣＤ補助剤１、２、および３の滴定は、高濃度（１：２５０）が毒性を引き起こす一方で、低濃度（１：１０００、１：１２５０）がより少ない集団倍加および故にＴ細胞増殖の減少をもたらすことを示す。 表５に提示されるデータを、図１の増殖から選択した条件を強調して描写する。結果は、ＣＤ補助剤１、２、および３（１：５００）が、脂質濃縮物および脂質補助剤を有しない培地よりも多くの集団倍加をもたらすことを実証する。 表６に提示されるデータを描写し、これは、図１（表４）と同じ成長データであるが、経時的な累積生存Ｔ細胞で表される。結果は、ＣＤ補助剤１、２、および３（１：５００）が、１２日目までに最も多くの生存Ｔ細胞をもたらすことを実証する。ＣＤ補助剤１、２、および３の滴定は、高濃度（１：２５０）が毒性を引き起こす一方で、低濃度（１：１０００、１：１２５０）がより少ない生存Ｔ細胞および故にＴ細胞増殖の減少をもたらすことを示す。ＣＤ補助剤１、２、および３の性能の差は、経時的な累積集団倍加と比較した累積細胞数で表したときにより明白になる。 表７に表されるデータを、図３の増殖から選択した条件を強調して描写する。結果は、ＣＤ補助剤１、２、および３（１：５００）が、脂質濃縮物および脂質補助剤を有しない培地よりも多くの累積生存Ｔ細胞をもたらすことを実証する。 表８に提示されるデータを描写し、これは、図１および３によって表される増殖中のＴ細胞生存率を表す。結果は、ＣＤ補助剤１、２、および３（１：５００）が、他のＣＤ補助剤濃度、脂質濃縮物、および脂質補助剤なしと比較して、増殖全体を通して細胞生存率の増加を維持することを実証する。ＣＤ補助剤１、２、および３の滴定は、高濃度（１：２５０）が毒性を引き起こす一方で、低濃度（１：１０００、１：１２５０）が細胞生存率の増加を維持するのに十分な脂質を提供しない可能性があることを示す。 表９に提示されるデータを、図５の増殖から選択した条件を強調して描写する。結果は、ＣＤ補助剤１、２、および３（１：５００）が、脂質濃縮物および脂質補助剤を有しない培地と比較して、増殖全体を通して細胞生存率の増加を維持することを実証する。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌに対する抗体で染色した。連続ゲーティングを使用して、Ｔ細胞を、セントラルメモリー（ＴＣＭ：ＣＣＲ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋）、中間体（ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ＋）、およびエフェクターメモリー（ＴＥＭ：ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−）として特性評価した。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓ分析機で実行した。 表１０に提示される、ゲート付きＣＤ３＋集団内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセンテージを描写する。０日目は、増殖前の２つの集団の平均頻度を表す。結果は、５％のヒトＡＢ血清ならびにＣＤ補助剤２および３を補充した培地と比較した、ＣＤ補助剤１を補充した培養培地中でのＣＤ８＋Ｔ細胞の優先的な増殖を実証する。誤差バーは、３回の反復における標準偏差を表す。いかなる理論によっても拘束されるものではないが、ＣＤ補助剤１は、全ての多価不飽和脂肪酸を含有し、最も好ましいＣＤ４＋／ＣＤ８＋比をもたらすため、多価不飽和脂肪酸が、より多くのＣＤ８＋細胞成長をもたらすことを期待することができる。具体的には、ＣＤ補助剤１は、主にオメガ−６多価不飽和脂肪酸および本質的脂肪酸を含有するため、これらの特定の脂肪酸が、ＣＤ８＋細胞増殖の増加に寄与している可能性がある。 ５％のヒトＡＢ血清中ならびにＣＤ補助剤１、２、および３中で増殖させたＣＤ４＋Ｔ細胞の分化状態を描写する。５％のヒトＡＢ血清とともに培養したＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＣＲ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋表現型を失い、ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−表現型を蓄積し、これは、細胞ストレスおよび栄養欠乏を示す。あるいは、ＣＤ補助剤１、２、および３とともに培養したＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−蓄積を回避する。 ５％のヒトＡＢ血清中ならびにＣＤ補助剤１、２、および３中で増殖させたＣＤ８＋Ｔ細胞の分化状態を描写する。５％のヒトＡＢ血清とともに培養したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＣＲ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋表現型を失い、ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−表現型を蓄積し、これは、細胞ストレスおよび栄養欠乏を示す。あるいは、ＣＤ補助剤１、２、および３とともに培養したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−蓄積を回避する。 ５％のヒトＡＢ血清またはＣＤ補助剤１のいずれかを含有する培地中で成長させたＴ細胞間のＴｈ１サイトカインプロファイルを比較する。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キットを用いて、正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化し、ＣＤ補助剤１（１：５００）または５％のヒトＡＢ血清を補充した無血清培地中で培養した。Ｔ細胞を計数し、５および７日目にＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｖｉ−Ｃｅｌｌ分析機で供給し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。１１日目にＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を培養物から除去し、細胞を回転させて、条件培地を除去し、新鮮な培地中に一晩静置した。１００万個のＴ細胞を、１：１のビーズ対細胞比でＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３で再刺激し、２４時間インキュベートした。ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ３５−Ｐｌｅｘ Ｐａｎｅｌを用いた分析のために、上清を収集し、処理した。図１１に描写されるように、結果は、無血清培地プラスＣＤ補助剤１中で培養したＴ細胞のサイトカインプロファイルが、５％のヒトＡＢ血清とともに培養したＴ細胞のプロファイルよりも、わずかにより良好であるとは言わないまでも、それと同等であることを実証する。これは、ＭＩＰ−１αの増加、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、およびＩＬ−６の減少、ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生の変化がないことによって表される（表１１）。１ミリリットル当たりの生存細胞＝ｖｃ／ｍＬ。 Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞での２−ＤＧの滴定から得られるデータ（表１２）を示す。５％のヒトＡＢ血清を補充したＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地を、陽性対照として使用した。簡潔には、２−ＤＧを、１００ｍＭのストック濃度で滅菌濾過水中で調製した。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キットを用いて、正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化し、４つの脂質補助剤のうちの１つを補充したコレステロールおよび遊離脂肪酸を含まない無血清培地中で培養した。５、７、１０、および１２日目にＴ細胞をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで、ならびに１０日目に１×１０6ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。図１２の結果は、０．２５ｍＭおよび０．５ｍＭの濃度の２−ＤＧで処理した培養物中での対照と同等の増殖を実証する。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表１３に示されるデータを表す。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓ分析機で実行した。結果は、０．２５ｍＭの２−ＤＧまたは０．５ｍＭの２−ＤＧのいずれかの細胞への補充が、ＣＤ８＋対ＣＤ４＋の比の約３倍の増加をもたらすことを示す。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表１３に示されるデータを表す。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓ分析機で実行した。結果は、０．２５ｍＭの２−ＤＧまたは０．５ｍＭの２−ＤＧのいずれかの細胞への補充が、ＣＤ８＋対ＣＤ４＋の比の約３倍の増加をもたらすことを示す。 ４ｍＭの２−ＤＧを有する培養ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞の成長曲線を表す。データを表１４および１５に表す。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞キットを使用した負の選択によって、ＰＢＭＣから単離した。ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞を、ＣＤ４５ＲＡナノビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した正の選択によって、富化Ｔ細胞から単離した。Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞からナイーブおよび非ナイーブＴ細胞を精製したが、これは、２−ＤＧが高分化型ドナーまたは非高分化型ドナー（非ナイーブＴ細胞）に対して効果を有するかどうかを決定するためである。両方の細胞型が、２−ＤＧとともに成長した。 ４ｍＭの２−ＤＧを有する培養ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞の成長曲線を表す。データを表１４および１５に表す。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞キットを使用した負の選択によって、ＰＢＭＣから単離した。ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞を、ＣＤ４５ＲＡナノビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した正の選択によって、富化Ｔ細胞から単離した。Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞からナイーブおよび非ナイーブＴ細胞を精製したが、これは、２−ＤＧが高分化型ドナーまたは非高分化型ドナー（非ナイーブＴ細胞）に対して効果を有するかどうかを決定するためである。両方の細胞型が、２−ＤＧとともに成長した。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表１６および表１７に示されるデータを図示する。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。結果は、２−ＤＧが、非ナイーブＴ細胞に対するよりも、ナイーブＴ細胞に対してはるかに強い効果を有する（ＣＤ８＋対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比の３．２倍の増加）ことを強調する。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表１６および表１７に示されるデータを図示する。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。結果は、２−ＤＧが、非ナイーブＴ細胞に対するよりも、ナイーブＴ細胞に対してはるかに強い効果を有する（ＣＤ８＋対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比の３．２倍の増加）ことを強調する。 設定した比（それぞれ５：１および１０：１）で混合したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞内での２−ＤＧの成長曲線を表す。細胞の両方の比が、同様に成長した。（表１８および１９を参照されたい。） 設定した比（それぞれ５：１および１０：１）で混合したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞内での２−ＤＧの成長曲線を表す。細胞の両方の比が、同様に成長した。（表１８および１９を参照されたい。） 表２０および２１に表される、ゲート付きＣＤ３＋集団内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセンテージを描写する。０日目は、増殖前の２つの集団の平均頻度を表す。これらの結果は、２−ＤＨが、０日目と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の実質的な欠損を補正することができることを実証する。 表２０および２１に表される、ゲート付きＣＤ３＋集団内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセンテージを描写する。０日目は、増殖前の２つの集団の平均頻度を表す。これらの結果は、２−ＤＨが、０日目と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の実質的な欠損を補正することができることを実証する。 Ｔ細胞を１２日間培養するのに使用されるプロトコルを例示する。Ｔ細胞を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて刺激し、無血清、無動物起源培地中で培養し、細胞を２−ＤＧとともに培養する。その後、様々な時点（３日目、５日目、７日目、および細胞の供給ごと）で、細胞に２−ＤＧを供給する。 ２−ＤＧの存在下または不在下で培養したＴ細胞の成長曲線、および示される異なる時点での増殖中の導入を示す。補助剤による処理は、０、３、５、７日目に開始し、その後の供給で維持した。Ｔ細胞を、無血清Ｔ細胞培地中および５％のヒトＡＢ血清を補充したＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で１２日間培養した。 ２−ＤＧの存在下または不在下で培養したＴ細胞の成長曲線、および示される異なる時点での増殖中の導入を示す。補助剤による処理は、０、３、５、７日目に開始し、その後の供給で維持した。Ｔ細胞を、無血清Ｔ細胞培地中および５％のヒトＡＢ血清を補充したＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で１２日間培養した。 異なる時点およびその後の供給での、２−ＤＧの不在下または存在下で培養したＴ細胞のＣＤ８＋対ＣＤ４＋の比の倍数増加を強調する、表２４に示されるデータを表す。結果は、７日目のみおよび細胞の供給ごとに、Ｔ細胞を０．２５ｍＭの２−ＤＧとともに培養することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の同じ３倍の増加がもたらされることを実証する。 １２日間の増殖Ｔ細胞を表し、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて再刺激した。再刺激時のサイトカイン産生を、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ３５−Ｐｌｅｘ Ｐａｎｅｌを用いて評価した。３５プレックスのアッセイのうち１５個のサイトカインが示された。全ての値を、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地に対して正規化した。結果は、２−ＤＧが、マルチプレックスサイトカインアッセイによって測定して、細胞の機能を変化させないことを実証する。 Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞内の２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）（０、１ｍＭ、２ｍＭ、および４ｍＭ）の滴定について記載する（表２５）。５％のヒトＡＢ血清を補充したＸ−ＶＩＶＯ（商標）を、陽性対照として添加した。簡潔には、２−ＤＧを、１００ｍＭのストック濃度で滅菌濾過水中で調製した。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キットを用いて、正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化し、４つの脂質補助剤のうちの１つを補充したコレステロールおよび遊離脂肪酸を含まない無血清培地中で培養した。５、７、１０、および１２日目にＴ細胞をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで、ならびに１０日目に１×１０6ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。結果は、２−ＤＧの補充が、細胞成長に影響を与えないことを示す。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表２６に示されるデータを表す。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧＡＬＬＩＯＳ（商標）分析機で実行した。結果は、４ｍＭの２−ＤＧの細胞への補充が、ＣＤ８＋対ＣＤ４＋の比の約４．１倍の増加をもたらすことを示す。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表２６に示されるデータを表す。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧＡＬＬＩＯＳ（商標）分析機で実行した。結果は、４ｍＭの２−ＤＧの細胞への補充が、ＣＤ８＋対ＣＤ４＋の比の約４．１倍の増加をもたらすことを示す。 ４ｍＭの２−ＤＧを有する培養ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞の成長曲線を表す。データを表２７および２８に表す。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞キットを使用した負の選択によって、ＰＢＭＣから単離した。ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞を、ＣＤ４５ＲＡナノビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した正の選択によって、富化Ｔ細胞から単離した。Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞からナイーブおよび非ナイーブＴ細胞を精製する理由は、２−ＤＧが、高分化型ドナーまたは非高分化型ドナー（非ナイーブＴ細胞）に対して効果を有するかどうかを確認するためである。両方の細胞型が、２−ＤＧとともに成長した。 ４ｍＭの２−ＤＧを有する培養ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞の成長曲線を表す。データを表２７および２８に表す。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞キットを使用した負の選択によって、ＰＢＭＣから単離した。ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞を、ＣＤ４５ＲＡナノビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した正の選択によって、富化Ｔ細胞から単離した。Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞からナイーブおよび非ナイーブＴ細胞を精製する理由は、２−ＤＧが、高分化型ドナーまたは非高分化型ドナー（非ナイーブＴ細胞）に対して効果を有するかどうかを確認するためである。両方の細胞型が、２−ＤＧとともに成長した。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表２９および表３０に示されるデータを図示する。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。結果は、２−ＤＧが、非ナイーブＴ細胞内でよりも、ナイーブＴ細胞内ではるかに強い効果を有する（ＣＤ８対ＣＤ４の比の２．４倍の増加）ことを強調する。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表２９および表３０に示されるデータを図示する。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。結果は、２−ＤＧが、非ナイーブＴ細胞内でよりも、ナイーブＴ細胞内ではるかに強い効果を有する（ＣＤ８対ＣＤ４の比の２．４倍の増加）ことを強調する。 Ｐａｎ ＣＤ３＋Ｔ細胞内の２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）（０ｍＭ、０．２５ｍＭ、および０．５ｍＭ）の滴定について記載する、表３１に示されるデータを表す。５％のヒトＡＢ血清を補充したＸ−ＶＩＶＯ（商標）を、陽性対照として添加した。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キットを用いて、正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化し、４つの脂質補助剤のうちの１つを補充したコレステロールおよび遊離脂肪酸を含まない無血清培地中で培養した。５、７、１０、および１２日目にＴ細胞をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで、ならびに１０日目に１×１０6ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。結果は、２−ＤＧの補充が、細胞成長に影響を与えないことを示す。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表３２に示されるデータを表す。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓ分析機で実行した。結果は、０．２５ｍＭの２−ＤＧおよび０．５ｍＭの２−ＤＧの両方が、ＣＤ８＋対ＣＤ４＋の比の約３倍の増加をもたらすことを示す。図３６のデータは、単一のドナーからの代表的なものである。図３７は、３人の異なるドナーからの代表的なものである。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表３２に示されるデータを表す。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓ分析機で実行した。結果は、０．２５ｍＭの２−ＤＧおよび０．５ｍＭの２−ＤＧの両方が、ＣＤ８＋対ＣＤ４＋の比の約３倍の増加をもたらすことを示す。図３６のデータは、単一のドナーからの代表的なものである。図３７は、３人の異なるドナーからの代表的なものである。 設定した比（それぞれ５：１および１０：１）で混合したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞内での２−ＤＧの成長曲線を表す、表３３および３４に示されるデータを示す。両方の細胞の比が、同様に成長した。 設定した比（それぞれ５：１および１０：１）で混合したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞内での２−ＤＧの成長曲線を表す、表３３および３４に示されるデータを示す。両方の細胞の比が、同様に成長した。 表３５および３６に表される、ゲート付きＣＤ３＋集団内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセンテージを描写する。０日目は、増殖前の２つの集団の平均頻度を表す。結果は、２−ＤＧが、０日目と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きな欠損を補正することができることを実証する。 表３５および３６に表される、ゲート付きＣＤ３＋集団内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセンテージを描写する。０日目は、増殖前の２つの集団の平均頻度を表す。結果は、２−ＤＧが、０日目と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きな欠損を補正することができることを実証する。 Ｔ細胞の１２日間の培養を例示する。Ｔ細胞を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて刺激し、無血清、無動物起源培地中で培養し、細胞を２−ＤＧとともに培養する。その後、様々な時点（３日目、５日目、７日目、および細胞の供給ごと）で、細胞に２−ＤＧを供給する。 異なる時点で２−ＤＧとともに培養したＴ細胞の成長曲線を示す。０、３、５、７日目に２−ＤＧを細胞とともに培養し、その後の供給で維持した。Ｔ細胞を、無血清Ｔ細胞培地中および５％のヒトＡＢ血清を有する培地中で１２日間培養した。表３７および３８。 異なる時点で２−ＤＧとともに培養したＴ細胞の成長曲線を示す。０、３、５、７日目に２−ＤＧを細胞とともに培養し、その後の供給で維持した。Ｔ細胞を、無血清Ｔ細胞培地中および５％のヒトＡＢ血清を有する培地中で１２日間培養した。表３７および３８。 異なる時点および細胞の供給ごとの、２−ＤＧとともに培養したＴ細胞のＣＤ８＋対ＣＤ４＋の比の倍数増加を強調する、表３９に示されるデータを表す。結果は、７日目単独および細胞の供給ごとに、Ｔ細胞を０．２５ｍＭの２−ＤＧとともに培養することで、ＣＤ８：ＣＤ４比の同じ３倍の増加がもたらされることを実証する。 それぞれ異なる濃度のＣＤ脂質濃縮物１および２とともに培養した２−ＤＧ、ならびに表４０および４１に示される陽性対照として、５％のヒトＡＢ血清中で培養した２−ＤＧの成長曲線を表す。細胞を、１２日間増殖させた。結果は、２−ＤＧを有する１：１０００のＣＬＣ１およびＣＬＣ２が、最適な細胞増殖を実証することを実証する。 それぞれ異なる濃度のＣＤ脂質濃縮物１および２とともに培養した２−ＤＧ、ならびに表４０および４１に示される陽性対照として、５％のヒトＡＢ血清中で培養した２−ＤＧの成長曲線を表す。細胞を、１２日間増殖させた。結果は、２−ＤＧを有する１：１０００のＣＬＣ１およびＣＬＣ２が、最適な細胞増殖を実証することを実証する。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表４２および表４３のデータを表す。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓ分析機で実行した。結果は、０日前の増殖前と比較して、ＣＬＣ１を有する２−ＤＧの添加時にＣＤ８：ＣＤ４比の１．６倍の増加が存在し、ＣＬＣ２を有する２−ＤＧの添加時にＣＤ８：ＣＤ４比の１．４倍の増加が存在することを示す。 分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する、表４２および表４３のデータを表す。１０日間増殖させたＴ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に対する抗体で染色した。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓ分析機で実行した。結果は、０日前の増殖前と比較して、ＣＬＣ１を有する２−ＤＧの添加時にＣＤ８：ＣＤ４比の１．６倍の増加が存在し、ＣＬＣ２を有する２−ＤＧの添加時にＣＤ８：ＣＤ４比の１．４倍の増加が存在することを示す。 二倍体生存細胞密度（ＶＣＤ）を、１ミリリットル当たりの生存細胞として表す。この図の結果は、二倍体ＳＦＭが、ワクチン産生で一般的に使用される様々な二倍体細胞株（例えば、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＩＭＲ−９０等）内で細胞成長をもたらすことを示す。結果は、例示的な二倍体細胞（例えば、ＭＲＣ−５）について本明細書に示され、少なくとも３つの独立した実験を代表するものである。 この図の結果は、ＣＤ補助剤１および２が、脂質濃縮物（１：１００および１：１０００）と比較して、ＭＲＣ−５のＶＣＤを増加させることを示す。加えて、ＣＤ補助剤１および２は、それぞれ１：５００および１：２０００の濃度で、血清含有培地と同等のＶＣＤをもたらす。 この図の結果は、二倍体成長ＳＦＭ中で成長させたＭＲＣ−５細胞が、血清含有培地中で成長させた細胞と同等の水痘帯状疱疹ウイルス産生をもたらすことを示す。
定義
別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、（例えば、細胞培養、免疫学、分子遺伝学、および生化学の）当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。
以下の定義は、本主題を理解する目的、および添付の特許請求の範囲を構築する目的で含まれる。本明細書で使用される略語は、化学および生物学の当該技術分野におけるそれらの従来の意味を有する。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段文脈が明確に指示しない限り、複数形の参照対象を含む。したがって、例えば、「シクロデキストリン」、「脂質」、または「脂肪酸」への言及は、１つ以上のそのような実施形態への言及であり、当業者に既知であるそれらの等価物を含む、等である。
本明細書で使用される場合、「治療」は、例えば、障害の進行の阻害、退行、または停滞を包含する。治療には、障害の任意の症状（複数可）の予防または寛解もまた含まれる。排除はしないが、障害または病態の治療が、障害、病態、またはそれに関連する症状を完全に取り除くことを必要としないことが理解される。本明細書で使用される場合、対象における疾患の進行または疾患の合併症の「阻害」は、対象における疾患の進行および／または疾患の合併症を予防または低減することを意味する。本明細書で使用される場合、障害に関連する「症状」は、障害に関連する任意の臨床的または実験所見を含み、対象が感じるかまたは観察できるものに限定されない。
本明細書で使用される場合、治療化合物の量を指す際の「有効」は、本開示の様式で使用される場合の合理的な利益／リスク比と釣り合って、過度の有害な副作用（毒性、刺激、またはアレルギー反応等）を伴わずに所望の治療反応をもたらすのに十分な化合物の量を指す。
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」、または「を特徴とする」と同義である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、包括的または非限定的なものであり、列挙されていない追加の要素または方法ステップを除外しない。対照的に、「からなる」という移行句は、特許請求の範囲で特定されていない、いかなる要素、ステップ、または成分も除外する。「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲を、特定の材料またはステップ、および特許請求される発明の基本的および新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
本明細書で使用される場合、数値または範囲の文脈における「約」という用語は、別段文脈がより限定的な範囲を要求しない限り、列挙または特許請求される数値または範囲の±１０％を意味する。
本明細書の説明では、「少なくとも１つの」または「１つ以上の」等の語句が出現し、その後に要素または特徴の接続リストが続く場合がある。「および／または」という用語もまた、２つ以上の要素または特徴のリストに出現する場合がある。別段それが使用される文脈が暗黙的または明示的に矛盾しない限り、そのような語句は、列挙される要素もしくは特徴のいずれかを個々に、または列挙される要素もしくは特徴のいずれかを他の列挙される要素もしくは特徴のいずれかと組み合わせて、意味することが意図される。例えば、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」、「ＡおよびＢの１つ以上」、および「Ａおよび／またはＢ」という語句は各々、「Ａ単独、Ｂ単独、またはＡおよびＢともに」を意味することが意図される。同様の解釈が、３つ以上の項目を含むリストにも意図される。例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、およびＣの１つ以上」、および「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」という語句は各々、「Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢともに、ＡおよびＣともに、ＢおよびＣともに、またはＡおよびＢおよびＣともに」を意味することが意図される。加えて、上記および特許請求の範囲における「に基づいて」という用語の使用は、「に少なくとも部分的に基づいて」を意味することが意図され、そのため、列挙されていない特徴または要素もまた許容される。
パラメータ範囲が提供される場合、その範囲内の全ての整数、およびそれらの１０分の１もまた本発明によって提供されることが理解される。例えば、「０．２〜５ｍｇ」は、５．０ｍｇまでかつ５．０ｍｇを含む、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ等の開示である。
小分子は、質量が２０００ダルトン未満の化合物である。小分子の分子量は、好ましくは１０００ダルトン未満、より好ましくは６００ダルトン未満であり、例えば、化合物は、５００ダルトン、４００ダルトン、３００ダルトン、２００ダルトン、または１００ダルトン未満である。
本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、ワックス、脂肪、油、脂肪酸、ステロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、およびリン脂質等を含む。実施形態では、脂質は、アルコール中には溶解するが水中には溶解しないワックス、脂肪、油、脂肪酸、ステロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、またはリン脂質等の物質である。実施形態では、脂質は、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、プレノール脂質、糖脂質、またはポリケタイドである。実施形態では、脂質は、ケトアシルまたはイソプレン基を含む。実施形態では、脂質は、ワックスエステルである。実施形態では、脂質は、エイコサノイド（例えば、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、リポキシン、レゾルビン、またはエオキシン）である。実施形態では、脂質は、ステロール脂質である。実施形態では、ステロール脂質は、コレステロールまたはその誘導体である。実施形態では、コレステロールは、ｎａｔ−コレステロールおよび／またはｅｎｔ−コレステロールである。
本明細書で使用される場合、「脂肪酸」という用語は、飽和または不飽和のいずれかの、多くの場合長い脂肪族尾部を有するカルボン酸（または有機酸）を指す。実施形態では、脂肪酸は、少なくとも４個の炭素原子長の炭素−炭素結合鎖を有する。実施形態では、脂肪酸は、少なくとも８個の炭素原子長の炭素−炭素結合鎖を有する。実施形態では、脂肪酸は、少なくとも１２個の炭素原子長の炭素−炭素結合鎖を有する。実施形態では、脂肪酸は、４〜２４個の炭素原子長の炭素−炭素結合鎖を有する。実施形態では、脂肪酸は、天然に存在する脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、人工のものである（例えば、天然には産生されない）。実施形態では、天然に存在する脂肪酸は、偶数個の炭素原子を有する。実施形態では、天然に存在する脂肪酸の生合成は、２個の炭素原子を有するアセテートに関与する。実施形態では、脂肪酸は、遊離状態（エステル化されていない）であっても、トリグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル−ＣｏＡ（チオエステル）結合、または他の結合形態等のエステル化された形態であってもよい。実施形態では、脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、またはジホスファチジルグリセロール形態等のリン脂質としてエステル化されてもよい。実施形態では、脂肪酸または脂肪酸の誘導体は、遊離脂肪酸、本明細書に開示される脂肪酸のエステル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）、モノ、ジ、もしくはトリグリセリド（例えば、グリセロールエステル）、アルデヒド、アミド、またはリン脂質バージョンである。「飽和脂肪酸」は、いかなる二重結合または鎖に沿った他の官能基も含有しない。「飽和」という用語は、全ての炭素（カルボン酸［−ＣＯＯＨ］基を除く）が可能な限り多くの水素を含有するという点で、水素を指す。換言すると、オメガ末端は、３個の水素（ＣＨ３−）を含有し、鎖内の各炭素は、２個の水素（−ＣＨ２−）を含有する。「不飽和脂肪酸」では、鎖に沿って１つ以上のアルケン官能基が存在し、各アルケンは、鎖の単結合の「−ＣＨ２−ＣＨ２−」部分を二重結合の「−ＣＨ＝ＣＨ−」部分（つまり、別の炭素に二重結合した炭素）で置換する。二重結合のいずれかの側に結合している鎖内の次の２個の炭素原子は、シスまたはトランス配置で発生し得る。脂肪酸の非限定的な例の表は、以下のとおりである。
シクロデキストリン（シクロアミロースと呼ばれることもある）は、環内でともに結合した糖分子（環状オリゴ糖）で構成される化合物である。実施形態では、シクロデキストリンは、１〜４個が結合した（例えば、α（１−４）結合）５つ以上のα−Ｄ−グルコピラノシド単位を含む。実施形態では、シクロデキストリンは、α（１−４）結合によって接合した少なくとも５つのグルコピラノース単位を有するシクロマルトオリゴ糖である。実施形態では、シクロデキストリンは、外面にヒドロキシル基および中心に空洞を有する環状オリゴ糖である。実施形態では、シクロデキストリンは、特定の体積の中空内部または細孔（例えば、空洞）を有する剛性の切断された円錐形分子構造を特徴とする。シクロデキストリンは、分子全体またはその一部をその中心（例えば、空洞）に取り込むことによって、多種多様な疎水性分子と包接複合体を形成することができる。実施形態では、形成される複合体の安定性は、ゲスト分子がシクロデキストリン空洞にいかに良好に適合するかに依存する。シクロデキストリンの非限定的な例には、α−、β−、またはγ−シクロデキストリンが含まれ、α−シクロデキストリンは、６つのグルコース残基を有し、β−シクロデキストリンは、７つのグルコース残基を有し、β−シクロデキストリンは、８つのグルコース残基を有する。シクロデキストリンには、シクロデキストリン誘導体（例えば、α−、β−、およびγ−シクロデキストリンの誘導体）、または１つ以上のシクロデキストリンおよび／もしくはシクロデキストリン誘導体のブレンドが含まれる。一般的なシクロデキストリン誘導体は、ヒドロキシル基のアルキル化（例えば、メチル−およびエチル−β−シクロデキストリン）もしくはヒドロキシアルキル化（例えば、α−、β−、およびγ−シクロデキストリンのヒドロキシプロピル−およびヒドロキシエチル誘導体）によって、または一次ヒドロキシル基を糖類（例えば、グルコシル−およびマルトシル−β−シクロデキストリン）で置換することによって形成される。
実施形態では、シクロデキストリンは、６〜８個のグルコピラノシド単位を含み、かつトロイドのより大きい開口部およびより小さい開口部がそれぞれ、溶媒の第二級および第一級ヒドロキシル基に曝露しているトロイドとして形態的に表すことができる。実施形態では、トロイドの内部は、疎水性ではないが、水性環境よりもかなり親水性が低く、したがって他の疎水性分子を収容することができる。対照的に、外部は、水溶液中でシクロデキストリン（またはそれらの複合体）に溶解性を付与するのに十分に親水性である。
本明細書で使用される場合、「一価不飽和脂肪酸」という用語は、鎖内に１つのみのアルケン基（炭素−炭素二重結合）を含む脂肪酸を指す。本明細書で使用される場合、「多価不飽和脂肪酸」および「ＰＵＦＡ」という用語は、少なくとも２つのアルケン基（炭素−炭素二重結合）を含む脂肪酸を指す。
本明細書で使用される場合、「長鎖多価不飽和脂肪酸」および「ＬＣ−ＰＵＦＡ」という用語は、その炭素鎖内に少なくとも２０個の炭素原子および少なくとも２つの炭素−炭素二重結合を含み、したがってＶＬＣ−ＰＵＦＡを含む、脂肪酸を指す。本明細書で使用される場合、「超長鎖多価不飽和脂肪酸」および「ＶＬＣ−ＰＵＦＡ」という用語は、その炭素鎖内に少なくとも２２個の炭素原子および少なくとも２つまたは３つの炭素−炭素二重結合を含む、脂肪酸を指す。通常、脂肪酸の炭素鎖内の炭素原子の数は、分岐していない炭素鎖を指す。炭素鎖が分岐している場合、炭素原子の数は、側基中の炭素原子を除外する。
実施形態では、脂肪酸は、脂肪酸のメチル末端から３番目の炭素−炭素結合に不飽和化（炭素−炭素二重結合）を有するオメガ−３脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、脂肪酸のメチル末端から６番目の炭素−炭素結合に不飽和化（炭素−炭素二重結合）を有するオメガ−６脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、脂肪酸のメチル末端から９番目の炭素−炭素結合に不飽和化（炭素−炭素二重結合）を有するオメガ−９脂肪酸である。
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、細胞に関して使用される場合、通常は細胞に関連しない材料（例えば、タンパク質、核酸、タンパク質またはタンパク質核酸複合体、ウイルス等）を指す。明確にする目的で、細胞に天然に感染するウイルスは、細胞の「天然」状態にある細胞に通常関連する成分ではないため、その細胞に対して「異種」であると見なされる。したがって、細胞に導入される発現ベクターもまた、「異種」と見なされる。
「疾患」という用語は、哺乳動物の正常な健康状態からの任意の偏位を指し、疾患症状が存在する状態、ならびに偏位（例えば、感染症、遺伝子変異、遺伝的欠陥等）が発生しているが症状はまだ現れていない病態を含む。実施形態では、本明細書に開示される方法は、例えば、霊長類、げっ歯類、家畜、および愛玩動物（例えば、伴侶動物）を含むがこれらに限定されない脊椎動物種、哺乳類のメンバーである、患者における使用に好適である。典型的には、患者は、ヒト患者である。
本明細書で使用される場合、「対象」、「患者」、および「個体」等の用語は、限定的であることは意図されず、一般に互換的であり得る。つまり、「患者」と記載される個体は、必ずしも所与の疾患を有するわけではなく、単に医学的な助言を求めているだけであってもよい。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、示される障害に苦しむ可能性がある動物界の全てのメンバーを含む。実施形態では、対象は、哺乳動物である。実施形態では、対象は、霊長類、非霊長類、またはげっ歯類である。実施形態では、対象は、ヒトである。実施形態では、対象は、研究動物である。実施形態では、対象は、労働用動物（例えば、警察用もしくは軍用の犬もしくは馬）、介助動物、または愛玩動物である。実施形態では、対象は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、またはモルモットである。実施形態では、対象は、例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、またはテナガザル等の非ヒト霊長類である。
文脈に応じて、「細胞培養補助剤」および「細胞培養補助剤組成物」という用語は、互換的に使用される。
文脈に応じて、「細胞培養培地」および「細胞培養培地組成物」という用語は、互換的に使用される。
「酸化的リン酸化」（ＯＸＰＨＯＳ）という用語は、細胞が酵素を使用して、栄養素を酸化させ、ＡＴＰの改質に使用されるエネルギーを放出する代謝経路を指す。これは、ミトコンドリア内で行われる。ほぼ全ての好気性生物は、酸化的リン酸化を実行する。この経路は、嫌気性解糖等の代替的な発酵プロセスと比較して、エネルギーを放出する高度に効率的な方法である。酸化的リン酸化中、酸化還元反応において、電子は、電子供与体から酸素等の電子受容体へと移動する。これらの酸化還元反応は、エネルギーを放出し、このエネルギーは、ＡＴＰの形成に使用される。これらの酸化還元反応は、細胞のミトコンドリアの内膜内の一連のタンパク質複合体によって行われる。これらの結合されたタンパク質の組は、電子伝達鎖と呼ばれる。この電子伝達鎖を流れる電子によって放出されるエネルギーは、電子伝達と呼ばれるプロセスで、ミトコンドリア膜を渡ってプロトンを伝達するために使用される。
本明細書で使用される場合、「活性化」という用語は、測定可能な形態的、表現型的、および／または機能的変化を誘導するのに十分な細胞表面部分のライゲーションの後の細胞の状態を指す。Ｔ細胞の文脈において、そのような活性化は、細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞の状態であり得る。Ｔ細胞の活性化はまた、サイトカイン産生および／または分泌、ならびに受容体もしくは接着分子等の細胞表面分子の発現の上方制御もしくは下方制御、または特定の分子の分泌の上方制御もしくは下方制御、ならびに制御性または細胞傷害性エフェクター機能の実行も誘導し得る。他の細胞の文脈において、この用語は、特定の物理化学プロセスの上方制御もしくは下方制御のいずれかを暗示する。
実施形態では、刺激は、細胞表面部分のライゲーションによって誘導される一次応答を含む。例えば、受容体の文脈において、そのような刺激は、受容体のライゲーションおよびその後のシグナル伝達事象を伴い得る。実施形態では、Ｔ細胞の培養は、Ｔ細胞を刺激することを含む。Ｔ細胞の刺激に関して、そのような刺激は、一実施形態では、その後にＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合等のシグナル伝達事象を誘導するＴ細胞表面部分のライゲーションを指す。実施形態では、刺激事象は、細胞を活性化し、受容体もしくは接着分子等の細胞表面分子の発現を上方制御もしくは下方制御するか、または腫瘍成長因子βの下方制御等、分子の分泌を上方制御もしくは下方制御（腫瘍成長因子β（ＴＧＦ−β）の下方制御もしくはＩＬ−２、ＩＦＮ−γ等の上方制御等）することができる。実施形態では、細胞表面部分のライゲーションは、直接的なシグナル伝達事象の不在下でさえ、細胞骨格構造の再編成または細胞表面部分の癒合をもたらすことができ、これらの各々は、その後の細胞応答を増強、修飾、または変更する役割を果たし得る。
本明細書で使用される場合、「リガンド」または「作用物質」という用語は、１つ以上の定義された細胞の集団（例えば、Ｔ細胞亜集団のメンバー）と結合し、細胞応答を誘導する分子を指す。作用物質は、受容体、抗原決定基、または標的細胞集団上に存在する他の結合部位等の任意の細胞表面部分に結合し得る。作用物質は、タンパク質、ペプチド、抗体およびその抗体断片、融合タンパク質、合成分子、または有機分子（例えば、小分子）等であってもよい。実施形態では、Ｔ細胞刺激の文脈において、抗体は、そのような作用物質の原型例として使用される。
本発明の方法で使用するための抗体は、任意の種、クラス、または亜型の抗体であってもよいが、但し、そのような抗体は、必要に応じて、対象となる標的、例えば、ＣＤ３、ＴＣＲ、またはＣＤ２８と反応することができることを条件とする。
したがって、本発明で使用するための「抗体」には、
（ａ）免疫グロブリンの様々なクラスまたはサブクラスのいずれか（例えば、任意の動物、例えば、従来使用される動物のいずれか、例えば、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラクダ類、または卵黄由来のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ）、
（ｂ）モノクローナルまたはポリクローナル抗体、
（ｃ）モノクローナルであるかポリクローナルであるかに関わらず、無傷抗体または抗体の断片（この断片は、抗体の結合領域を含有するもの、例えば、Ｆｃ部分を欠く断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、または他の単一ドメイン抗体）、無傷抗体内の重鎖成分を接続するジスルフィド結合の還元開裂によって得られるいわゆる「半分子」断片である。Ｆｖは、２つの鎖として発現した、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する断片と定義され得る）、
（ｄ）モノクローナル抗体、抗体の断片、「ヒト化抗体」、キメラ抗体、または合成的に作製もしくは変更された抗体様構造体を含む、組み換えＤＮＡまたは他の合成技術によって産生または修飾された抗体が含まれる。
抗体、例えば、一本鎖抗体、ＣＤＲ移植抗体等の機能的誘導体または「等価物」もまた含まれる。一本鎖抗体（ＳＣＡ）は、融合した一本鎖分子として、好適なポリペプチドリンカーによって結合された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する、遺伝子操作された分子と定義され得る。
抗体断片ならびに合成および誘導体化された抗体を調製する方法は、当該技術分野で周知であり、文献に広く記載されており、本明細書には記載されない。
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、細胞の生活環の発達における段階を指す。Ｔ細胞は、骨髄内の造血幹細胞に起源を持ち、未熟な胸腺細胞の大集団を生成する。胸腺細胞（またはＴ細胞）は、二重陰性細胞から進行して二重陽性胸腺細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）になり、最終的に単一陽性（ＣＤ４＋ＣＤ８−またはＣＤ４−ＣＤ８＋）へと成熟する。Ｔ細胞の分化中、ナイーブＴ細胞は、芽球細胞になり、これは、クローン増殖によって増殖し、メモリーＴ細胞およびエフェクターＴ細胞へと分化する。ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）の多くのサブセットは、Ｔ細胞の分化中に作製され、免疫系の様々な機能を実行する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の分化段階は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ２７８、ＣＤ３３５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１６１、ＣＣＲ７、および転写制御因子ＦＯＸＰ３、ＲＯＲγ、Ｔ−ｂｅｔ、ｃ−Ｒｅｌ、ＧＡＴＡ３等を含むがこれらに限定されないマーカーの存在または不在によって評価され得る。
本明細書で使用される場合、「蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）」という用語は、特殊な種類のフローサイトメトリーを指す。ＦＡＣＳは、各細胞の特定の光散乱および蛍光特徴に基づいて、生物細胞の異種混合物を、一度に１つの細胞で、２つ以上の容器に分類するための方法を提供する。ＦＡＣＳは、個々の細胞からの蛍光シグナルの迅速で客観的かつ定量的な記録、および特定の対象となる細胞の物理的な分離を提供する。
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、新たな細胞を産生することによって成長または増殖することを意味する。
本明細書で使用される場合、「無血清培地」という用語は、血清を含有する細胞培養培地を指す。「低血清培地」は、低いパーセンテージの血清補充（０．５〜２％の血清）を有する細胞培養培地を指す。
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーション等の一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞の増殖および／または活性化および／または極性化につながるシグナルを指す。
本明細書で使用される場合、「分離」は、（例えば、濾過、親和性、浮遊密度、または磁気引力によって）１つの成分を別の成分から実質的に精製する任意の手段を含む。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」という用語は、その表面上に共受容体ＣＤ８を提示するＴ細胞を指す。ＣＤ８は、特定の抗原を認識することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体としての役割を果たす膜貫通糖タンパク質である。ＴＣＲと同様に、ＣＤ８は、主要組織適合性複合体Ｉ（ＭＨＣ Ｉ）分子に結合する。実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、（細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、またはキラーＴ細胞としても知られる）細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞である。実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞抑制因子とも称される制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」という用語は、その表面上に共受容体ＣＤ４を提示するＴ細胞を指す。ＣＤ４は、特定の抗原を認識することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体としての役割を果たす膜貫通糖タンパク質である。実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞である。Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫プロセスにおいて、他の白血球細胞を支援する。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原に提示されたときに活性化される。一旦活性化された後、それらは、急速に分裂し、サイトカインと呼ばれる小タンパク質（これは、能動的な免疫応答を制御または支援する）を分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨを含むいくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができ、これらは、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を促進する。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を特定のサブタイプへと指向する。実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞である。
本明細書には、制御性Ｔ細胞（または「Ｔ制御性細胞」もしくは「Ｔｒｅｇ」）を効率的に生成するための方法、および例えば、免疫療法で用途を有するＴ細胞集団の生成におけるこれらの方法の使用が含まれる。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋、ＣＤ１２７負／低等のマーカーを特徴とし得る。実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法を使用して増殖されるＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３−である。ＦＯＸＰ３制御性Ｔ細胞を生成するための組成物および方法の非限定的な例は、Ａａｒｖａｋらの米国特許第９，１１９，８０７号に明記されている。
いかなる科学理論によっても拘束されるものではないが、天然に存在する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、エフェクターＴ細胞を含む他のＴ細胞、および自然免疫系細胞の活性化を負に制御し、自己免疫性疾患に対する免疫療法で利用することができ、移植免疫寛容を提供することができる。様々なＴｒｅｇ細胞の集団が記載されており、それらには、天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞、ならびにそれぞれＩＬ−１０およびＴＧＦ−βを分泌する誘導性Ｔｒ１およびＴｈ３細胞が含まれる。
Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞応答の持続抑制を特徴とする。伝統的または従来的なＴｒｅｇ細胞は、例えば、脾臓もしくはリンパ節内または循環内に見出すことができる。Ｔｒｅｇは、マウスモデルにおいてＧＶＨＤおよび自己免疫を予防する上で非常に有効であることが証明されている。移植、ならびに糖尿病および他の適応症の治療において、Ｔｒｅｇの養子移入による臨床試験が進行中である。末梢血液中のＴｒｅｇの相対頻度は、全リンパ球の約１〜２％であり、これは、大部分の臨床的適用について養子移入前にＴｒｅｇをエクスビボで増殖させる必要性を意味する。エクスビボでの増殖中に十分なＴｒｅｇを産生することは、ヒトに対するＴｒｅｇ療法の適用において主要な課題となっている。
Ｔヘルパー１７細胞（または「Ｔｈ１７細胞」または「Ｔｈ１７ヘルパー細胞」）は、宿主防御を制御するＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の炎症サブセットであり、組織の炎症および様々な自己免疫性疾患に関与する。Ｔｈ１７細胞は、様々なヒト腫瘍に見出されているが、がん免疫におけるそれらの機能は不明である。腫瘍担持マウスに養子移入した場合、Ｔｈ１７細胞は、黒色腫の根絶においてＴｈ１または非極性化（Ｔｈ０）Ｔ細胞よりも強力であることが見出されている（Ｍｕｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００８）。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１およびＴｈ２系譜とは発生的に異なる。Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ−１Ｒ１およびＩＬ−２３Ｒシグナル伝達に応答性であるＣＤ４＋であり、サイトカインＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７ＡＦ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２６（ヒト）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−３α、およびＴＮＦαを産生する。Ｔｈ１７細胞の表現型には議論の余地があるが、それらは現在、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＣＲ４＋、ＣＣＲ６＋、またはＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＣＲ６＋、ＣＸＣＲ３＋と定義されている。養子細胞移入のためのＴｈ１７細胞の使用に対する１つの障壁は、Ｔｈ１７細胞サブセットを体内で増殖させることができる、しっかりとした培養条件の特定（腫瘍微小環境）である。
本明細書には、Ｔ細胞サブタイプの生成のための組成物および方法が含まれる。本発明の組成物および方法を使用して産生することができる１つのＴ細胞サブタイプは、Ｔｈ１７細胞である。
Ｔヘルパー９細胞（または「Ｔｈ９細胞」または「Ｔｈ９ヘルパー細胞」）は、宿主防御を制御するＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の炎症サブセットであり、アレルギー、炎症、および様々な自己免疫性疾患に関与する。Ｔｈ９細胞は、特性サイトカインＩＬ−９の分泌によって特定される。Ｔｈ９細胞は、アレルギー性炎症および蠕虫性寄生虫免疫の促進を含め、Ｔｈ２細胞といくつかの機能的役割を共有するが、Ｔｈ９細胞はまた、一般にＴｈ１またはＴｈ１７細胞に依存するものとして特徴付けられる応答においても自己免疫を促進することができる。Ｔｈ９細胞は、ＩＬ−４および形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）の両方を含有するサイトカイン環境下で分化し、これは、ＩＬ−９の発現に必要な転写ネットワークを誘導する。Ｔｈ９サブセットは、それが大量の特性サイトカインＩＬ−９を産生する能力によって定義される。Ｔｈ９細胞の発達に必要な転写因子には、シグナル伝達性転写因子６（ＳＴＡＴ６）、インターフェロン制御因子４（ＩＲＦ４）、Ｂ細胞活性化転写因子様（ＢＡＴＦ）、ＧＡＴＡ３、ＰＵ．１、およびＳｍａｄが含まれる。Ｔｈ９細胞は、Ｔｈ９細胞を他のＴヘルパーサブセットから区別する潜在的な表面マーカーである、高レベルのＩＬ−２５受容体（ＩＬ１７ＲＢ）を発現する。Ｔｈ９細胞によって媒介される免疫応答は、腸内寄生虫感染症に対する防御免疫、および抗腫瘍免疫に寄与する。
Ｔ細胞サブタイプを生成するための組成物および方法が本明細書で提供される。本発明の組成物および方法を使用して産生することができる１つの特異的Ｔ細胞サブタイプの非限定的な例は、Ｔｈ９細胞である。
メモリーＴ細胞、または抗原経験細胞は、抗原との遭遇前に経験される。これらのＴ細胞は、長寿命であり、抗原を認識し、これらのＴ細胞が以前に曝露された抗原に対する免疫応答に迅速かつ強力に影響を与えることができる。メモリーＴ細胞は、幹メモリー細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリー細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ¬）を包含し得る。ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、およびＩＬ−７Ｒα＋を有するが、それらはまた、大量のＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、およびＬＦＡ−１も発現する。ＴＣＭ細胞は、Ｌ−セレクチンおよびＣＣＲ７を発現し、それらは、ＩＬ−２を分泌する。ＴＥＭ細胞は、Ｌ−セレクチンまたはＣＣＲ７は発現しないが、ＩＦＮγおよびＩＬ−４等のエフェクターサイトカインは産生する。
Ｔ細胞集団の増殖のための方法および組成物が、本明細書に含まれる。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲ（複数）」は、抗原特異性を細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞等のＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせ）に移植する、操作された受容体を指す。ＣＡＲはまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られる。実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原特異的標的化ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。実施形態では、ＣＡＲが２つの異なる抗原を標的化する場合、抗原特異的標的化ドメインは、直列に配置され得る。実施形態では、ＣＡＲが２つの異なる抗原を標的化する場合、抗原特異的標的化ドメインは、直列に配置され、リンカー配列により分離され得る。
ＣＡＲは、操作された受容体であり、これは、任意の特異性を免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞）に移植する。これらの受容体を使用して、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植し、それらのコード配列の移入は、レトロウイルスベクターによって促進される。受容体は、キメラと呼ばれるが、これは、それらが異なる源に由来する部分で構成されているためである。ＣＡＲは、養子細胞移入によるがんの療法として使用することができる。Ｔ細胞を患者から取り出し、それらが患者の特定のがんに特異的な受容体を発現するように修飾する。がん細胞を認識および殺滅するＴ細胞を、患者に再導入する。実施形態では、患者以外のドナーから供給されたＴ細胞の修飾を使用して、患者を治療することができる。
キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の養子移入を使用して、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞を操作して、任意の腫瘍関連抗原を標的化することができる。患者のＴ細胞を収集した後、患者に注入して戻す前に、細胞を遺伝子操作して、患者の腫瘍細胞上の抗原に特異的に指向されたＣＡＲを発現するようにする。
がん免疫療法のためにＣＡＲ Ｔ細胞を操作するための方法は、導入遺伝子を宿主細胞ゲノムに組み込む、レトロウイルス、レンチウイルス、またはトランスポゾン等のウイルスベクターを使用することである。あるいは、プラスミドまたはｍＲＮＡ等の非組み込みベクターを使用してもよいが、これらの種類のエピソームＤＮＡ／ＲＮＡは、細胞分裂を繰り返した後に失われる可能性がある。結果として、操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、最終的にそれらのＣＡＲ発現を失う可能性がある。別のアプローチでは、そのゲノムに組み込まれることなく、Ｔ細胞内で安定して維持されるベクターが使用される。この戦略は、挿入変異原性または遺伝毒性のリスクを有することなく、長期的な導入遺伝子発現を可能にすることが見出されている。
本明細書全体を通して与えられる全ての最大数値限定は、そのようなより低い数値限定が明示的に本明細書に記載されているかのように、全てのより小さい数値限定を含むことが意図される。本明細書全体を通して与えられる全ての最小数値限定は、そのようなより大きい数値限定が明示的に本明細書に記載されているかのように、全てのより大きい数値限定を含む。本明細書全体を通して与えられる全ての数値範囲は、そのようなより狭い数値範囲が全て明示的に本明細書に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲内にある全てのより狭い数値範囲を含む。
培地および培地補助剤
一態様では、シクロデキストリン、および少なくとも１つの脂質（例えば、約または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０個の脂質）を含む、（例えば、Ｔ細胞のための）細胞培養培地が本明細書で提供される。実施形態では、細胞培養培地は、（１）シクロデキストリン、および（２）少なくとも２つの脂質、少なくとも３つの脂質、少なくとも４つの脂質、少なくとも５つの脂質、少なくとも６つの脂質、少なくとも７つの脂質、少なくとも８つ脂質、少なくとも９つの脂質、少なくとも１０個の脂質、少なくとも１５個の脂質、または少なくとも２０個の脂質（例えば、約３〜約２０個、約４〜約２０個、約５〜約２０個、約６〜約２０個、約７〜約２０個、約３〜約１５個、約３〜約１２個、約３〜約１０個、約３〜約８個、約５〜約２０個、約５〜約１５個、約５〜約１２個、約５〜約９個等の脂肪酸））を含む。別の態様では、細胞培養培地は、シクロデキストリン、少なくとも１つの脂質（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０個の脂質）、および／または２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を含む。
一態様では、シクロデキストリン、少なくとも１つの脂質（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０個の脂質）、および／または２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を含む、細胞（例えば、Ｔ細胞）のための細胞培養培地補助剤が本明細書で提供される。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、（１）シクロデキストリン、（２）少なくとも２つの脂質、少なくとも３つの脂質、少なくとも４つの脂質、少なくとも５つの脂質、少なくとも６つの脂質、少なくとも７つの脂質、少なくとも８つ脂質、少なくとも９つの脂質、少なくとも１０個の脂質、少なくとも１５個の脂質、または少なくとも２０個の脂質（例えば、約３〜約２０個、約４〜約２０個、約５〜約２０個、約６〜約２０個、約７〜約２０個、約３〜約１５個、約３〜約１２個、約３〜約１０個、約３〜約８個、約５〜約２０個、約５〜約１５個、約５〜約１２個、約５〜約９個等の脂肪酸）、および／または２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を含む。
実施形態では、少なくとも１つの脂質（１）または（２）は、コレステロール、脂肪酸、脂肪酸エステル、リン脂質、および／またはグリセロ脂質からなる群から選択される。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、コレステロールである。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、脂肪酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、脂肪酸エステルである。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、リン脂質である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、グリセロ脂質である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの脂質、２つ以上の脂質は、コレステロール、脂肪酸、脂肪酸エステル、リン脂質、および／またはグリセロ脂質からなる群から選択される。
実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、または多価不飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、一価不飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、多価不飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、一価不飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、多価不飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、（１）飽和脂肪酸、（２）一価不飽和脂肪酸、および（１）多価不飽和脂肪酸、ならびにそのような脂肪酸の組み合わせ（例えば、２つの多価不飽和脂肪酸、３つの一価不飽和脂肪酸、および１つの飽和脂肪酸）からなる群から選択される、１つ以上の脂肪酸の種類である。
実施形態では、脂肪酸は、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸、またはオメガ−９脂肪酸、またはオメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸、もしくはオメガ−９脂肪酸の１つ以上（例えば、２つ以上もしくは３つ）の組み合わせである。実施形態では、脂肪酸は、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）である。実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、一価不飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、多価不飽和脂肪酸である。
いくつかの実施形態では、培地または補助剤は、リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、メチル化シクロデキストリンを含む。他の実施形態では、培地または補助剤は、（ｉ）リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、メチル化シクロデキストリン、および／または（ｉｉ）２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、（１）リノール酸、（２）リノレン酸、（３）アラキドン酸、（４）ミリスチン酸、（５）オレイン酸、（６）パルミチン酸、（７）パルミトレイン酸、（８）ステアリン酸、（９）オレイン酸、および（１０）パルミチン酸からなる群から選択される１つ以上の脂肪酸をさらに含む。特定の実施形態では、細胞培養培地は、（１）リノール酸および／または（２）リノレン酸からなる群から選択される１つ以上の脂肪酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、リノレン酸は、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ならびに／またはα−リノレン酸およびγ−リノレン酸である。いくつかの実施形態では、リノレン酸は、α−リノレン酸である。実施形態では、リノレン酸は、γ−リノレン酸である。実施形態では、リノレン酸は、α−リノレン酸およびγ−リノレン酸である。
実施形態では、細胞培養培地は、アラキドン酸をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、アラキドン酸をさらに含む。
実施形態では、細胞培養培地は、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、および／またはステアリン酸をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、ミリスチン酸をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、オレイン酸をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、パルミチン酸をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、パルミトレイン酸をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、ステアリン酸をさらに含む。
実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、および／またはステアリン酸をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ミリスチン酸をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、オレイン酸をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、パルミチン酸をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、パルミトレイン酸をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ステアリン酸をさらに含む。
実施形態では、少なくとも１つの脂質は、（ａ）リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、もしくはステアリン酸のいずれか１つ、（ｂ）リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸のいずれか２、３、４、５、６、もしくは７つ、（ｃ）リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸の混合物、（ｄ）飽和脂肪酸であって、酪酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、もしくはセロチン酸である、飽和脂肪酸、（ｅ）一価不飽和脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、もしくはネルボン酸である、一価不飽和脂肪酸、（ｆ）多価不飽和脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、多価不飽和脂肪酸、（ｇ）オメガ−３脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、オメガ−３脂肪酸、（ｈ）オメガ−６脂肪酸であって、リノール酸、γリノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、もしくはテトラコサペンタエン酸である、オメガ−６脂肪酸、または（ｉ）オメガ−９脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ネルボン酸、もしくはミード酸である、オメガ−９脂肪酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、またはステアリン酸のいずれか１つである。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸のうちの２、３、４、５、６、または７つである。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、飽和脂肪酸であり、飽和脂肪酸は、酪酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、またはセロチン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、一価不飽和脂肪酸であり、一価不飽和脂肪酸は、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、またはネルボン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、多価不飽和脂肪酸であり、多価不飽和脂肪酸は、ヘキサデカトリエン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、またはテトラコサヘキサエン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、オメガ−３脂肪酸であり、オメガ−３脂肪酸は、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、またはテトラコサヘキサエン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、オメガ−６脂肪酸であり、オメガ−６脂肪酸は、リノール酸、γリノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、またはテトラコサペンタエン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、オメガ−９脂肪酸であり、オメガ−９脂肪酸は、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ネルボン酸、またはミード酸である。
実施形態では、少なくとも１つの脂質は、コレステロールである。実施形態では、コレステロールは、合成コレステロールである。実施形態では、コレステロールは、遊離コレステロールである。
いくつかの実施形態では、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、および／またはγ−シクロデキストリンである。実施形態では、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリンである。実施形態では、シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンである。実施形態では、シクロデキストリンは、γ−シクロデキストリンである。実施形態では、シクロデキストリンは、メチル化されている。実施形態では、シクロデキストリンは、メチル−β−シクロデキストリンである。
実施形態では、シクロデキストリンは、以下、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、２，６−ジメチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンポリスルフェート、トリメチルβ−シクロデキストリン、および／またはγ−シクロデキストリンポリスルフェートの１つ以上である。実施形態では、シクロデキストリンは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、２，６−ジメチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンポリスルフェート、トリメチルβ−シクロデキストリン、および／またはγ−シクロデキストリンポリスルフェートである。
実施形態では、本組成物は、複数の異なるシクロデキストリンを含み、複数のシクロデキストリンは、少なくとも２つのシクロデキストリン（例えば、約または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のシクロデキストリン）を含む。実施形態では、本組成物は、約２〜約１０個（例えば、約２〜約１０、約３〜約１０、約４〜約１０、約５〜約１０、約２〜約８、約３〜約８、約４〜約８、約２〜約１０個等）の範囲の異なるシクロデキストリンを含む。
実施形態では、複数のシクロデキストリンは、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のα−シクロデキストリン、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のβ−シクロデキストリン、および／または少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のγ−シクロデキストリンを含む。実施形態では、複数のシクロデキストリンは、少なくとも２つのα−シクロデキストリン、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のβ−シクロデキストリン、および／または少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のγ−シクロデキストリンを含む。実施形態では、複数のシクロデキストリンは、少なくとも３つのα−シクロデキストリン、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のβ−シクロデキストリン、および／または少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のγ−シクロデキストリンを含む。実施形態では、複数のシクロデキストリンは、少なくとも４つのα−シクロデキストリン、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のβ−シクロデキストリン、および／または少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のγ−シクロデキストリンを含む。実施形態では、複数のシクロデキストリンは、少なくとも５つのα−シクロデキストリン、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のβ−シクロデキストリン、および／または少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のγ−シクロデキストリンを含む。
実施形態では、細胞培養培地は、リノール酸、コレステロール、およびシクロデキストリンを含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、リノール酸、コレステロール、およびシクロデキストリンを含む。
実施形態では、組成物または組み合わせ中のコレステロール分子の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％（例えば、約５％〜約５０％、約５％〜約５０％、約５％〜約５０％、約５％〜約９８％、約５％〜約８５％、約５％〜約７５％、約５％〜約６０％、約１０％〜約９８％、約１５％〜約９５％、約２０％〜約９５％、約４０％〜約８０％、約６５％〜約９９％等）が、シクロデキストリン分子の環内にある（例えば、少なくともその一部分が、その内側にある）。
実施形態では、組成物または組み合わせ中の脂肪酸分子の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％（例えば、約５％〜約５０％、約５％〜約５０％、約５％〜約５０％、約５％〜約９８％、約５％〜約８５％、約５％〜約７５％、約５％〜約６０％、約１０％〜約９８％、約１５％〜約９５％、約２０％〜約９５％、約４０％〜約８０％、約６５％〜約９９％等）が、シクロデキストリン分子の環内にある（例えば、少なくともその一部分が、その内側にある）。
一態様では、本明細書で提供される主題は、シクロデキストリン／脂肪酸比等の定義された比を有する配合物に関する。シクロデキストリン毒性、使用される特定のシクロデキストリン（複数可）の脂肪酸「運搬能力」、およびシクロデキストリン／脂肪酸配合物が併せて使用される特定の細胞集団に対する所望の効果等の多くの因子が、そのような配合物の成分の比を決定する。別の態様では、本明細書で提供される主題は、シクロデキストリン／脂肪酸／２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）比またはシクロデキストリン／脂質／２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）比等の定義された比を有する配合物に関する。
配合物中の１つの化合物（または化合物の群）対別の化合物（または化合物の群）の相対量（すなわち、比）の記載に使用することができる式は、Ｘ：Ｘであり、式中、各Ｘは、個々に具体的に命名された化合物または化合物のクラスである。例えば、各Ｘは、個々に、（１）配合物中に存在するシクロデキストリン（複数可）の総量（ＴＣ）、配合物中に存在する具体的に命名されたあるシクロデキストリンの総量、もしくは配合物中に存在するあるクラスのシクロデキストリンの総量、（２）配合物中に存在する脂肪酸（複数可）の総量（ＴＦＡ）、配合物中に存在する具体的に命名されたある脂肪酸の総量、もしくは配合物中に存在するあるクラスの脂肪酸の総量、または（３）配合物中に存在するコレステロールの総量（ＴＣＯＬ）、配合物中に存在する具体的に命名されたあるコレステロール、もしくは配合物中に存在するあるクラスのコレステロールの総量であり得る。
任意で、配合物（細胞培養培地または細胞培養補助剤等）中のシクロデキストリン（複数可）および脂肪酸（複数可）の相対量の記載に使用することができる式は、ＴＣ：ＴＦＡであり、式中、ＴＣは、存在するシクロデキストリン（複数可）の総量を表し、ＴＦＡは、存在する脂肪酸（複数可）の総量を表す。あるいは、式ＴＦＡ：ＴＣを使用してもよい。そのような式の値を設定する１つの好都合な方法は、モル量、および具体的にはモル比を使用することである。実施形態では、ＴＣ：ＴＦＡの好適なモル比は、１：０．００１〜１：０．５（例えば、１：０．０１〜約１：０．４、約１：０．０１〜約１：０．３、約１：０．０１〜約１：０．２、約１：０．０１〜約１：０．１５、約１：０．０１〜約１：０．１、約１：０．０５〜約１：０．１、約１：０．０５〜約１：０．０８、約１：０．０２〜約１：０．２、約１：０．０２〜約１：０．１、約１：０．０２〜約１：０．０８、約１：０．０４〜約１：０．２等）の範囲である。追加の非限定的な比の例は、本明細書に開示されている。
総シクロデキストリン量（ＴＣ）は、単一のシクロデキストリンまたは２つ以上のシクロデキストリンによって表すことができる。さらに、２つ以上のシクロデキストリンが存在する場合、これらのシクロデキストリンの量は、同じでも異なっていてもよい。実施形態では、１つのシクロデキストリン対１つ以上の他のシクロデキストリン（例えば、配合物中に存在する他の全てのシクロデキストリン）のモル比は、例えば、１：０．１〜１：１０（例えば、約１：０．１〜約１：５、約１：０．２〜約１：５、約１：０．３〜約１：５、約１：０．４〜約１：５、約１：０．５〜約１：５、約１：１〜約１：１０、約１：２〜約１：１０、約１：３〜約１：１０、約１：４〜約１：１０、約１：５〜約１：１０等）であり得る。
多くの場合、２つ以上の脂肪酸が、配合物中に存在する（細胞培養培地または細胞培養補助剤等）。さらに、本明細書で提供される配合物中に２つ以上の脂肪酸が存在する場合、これらの脂肪酸は、同じ量で存在しても、異なる量で存在してもよい。表１〜３は、本明細書で提供される例示的な配合物および成分の例示的なモル比を明記する。
実施形態では、本明細書で提供される配合物中に存在する少なくともいくつかの脂肪酸は、異なる量で存在する。
実施形態では、細胞培養培地および／または細胞培養培地補助剤は、シクロデキストリンおよびコレステロールを含み、ＴＣ対ＴＣＯＬのモル比は、１０．５：１未満、１０：１未満、９．５：１未満、９：１未満、８．５：１未満、８：１未満、７．５：１未満、７：１未満、６．５：１未満、６：１未満、５．５：１未満、５：１未満、４．５：１未満、４：１未満、３．５：１未満、３：１未満、２．５：１未満、２：１未満、１．５：１未満、１：１未満、未満０．５：１、０．２５：１未満、または０．１：１未満である。したがって、ＴＣ対ＴＣＯＬのモル比は、約１０．５：１〜約０．１：１、約８：１〜約０．１：１、約７：１〜約０．１：１、約６：１〜約０．１：１、約５：１〜約０．１：１、約３：１〜約０．１：１、約２：１〜約０．１：１等であり得る。
実施形態では、細胞培養培地および／または培地補助剤は、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂肪酸を含み、ＴＣ対ＴＦＡのモル比は、１１．５：１未満、１１：１未満、１０．５：１未満、１０：１未満、９．５：１未満、９：１未満、８．５：１未満、８：１未満、７．５：１未満、７：１未満、６．５：１未満、未満６：１、５．５：１未満、５：１未満、４．５：１未満、４：１未満、３．５：１未満、３：１未満、２．５：１未満、２：１未満、１．５：１未満、１：１未満、０．５：１未満、０．２５：１未満、または０．１：１未満である。したがって、シクロデキストリン対少なくとも１つの脂肪酸のモル比は、約１１．５：１〜約０．１：１、約１０．５：１〜約０．１：１、約８：１〜約０．１：１、約７：１〜約０．１：１、約６：１〜約０．１：１、約５：１〜約０．１：１、約３：１〜約０．１：１、約２：１〜約０．１：１等であり得る。
実施形態では、細胞培養培地および／または培養培地補助剤は、シクロデキストリン、コレステロール、および少なくとも１つの脂肪酸を含み、（１）ＴＣ対（２）ＴＣＯＬおよびＴＦＡ（例えば、ＴＣＯＬおよびＴＦＡのモル値の合計）のモル比は、７．５：１未満、７：１未満、６．５：１未満、６：１未満、５．５：１未満、５：１未満、４．５：１未満、４：１未満、３．５：１未満、３：１未満、２．５：１未満、２：１未満、１．５：１未満、１：１未満、０．５：１未満、０．２５未満：１、または０．１：１未満である。したがって、（１）ＴＣ対（２）ＴＣＯＬおよびＴＦＡのモル比は、約７：１〜約０．１：１、約６：１〜約０．１：１、約５：１〜約０．１：１、約３：１〜約０．１：１、約２：１〜約０．１：１等であり得る。
実施形態では、モル基準でのＴＣ対ＴＣＯＬの比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜約９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
実施形態では、モル基準でのＴＦＡ対ＴＣの比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜約９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
実施形態では、モル基準でのＴＦＡ対ＴＣＯＬの比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
実施形態では、モル基準での総多価不飽和脂肪酸分子対他の脂肪酸分子の比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜約９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
実施形態では、モル基準での総オメガ−３、オメガ−６、および／またはオメガ−９多価不飽和脂肪酸分子対他の脂肪酸分子の比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜約９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
いくつかの実施形態では、プロスタグランジン、コルチコステロイド、ロイコトリエン、リポキシン、プロテクチン、およびレゾルビンを含む、免疫活性を有する複数の疎水性化合物が、脂質補助剤に組み込まれる。また、エトモキシルおよびスタチン等の脂質薬も組み込まれる。エトモキシルは、不可逆的なＯ−カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１（ＣＰＴ−１）阻害およびＰＰＡＲα活性化に関連する活性を有することが示されている、化学成分である。本発明の方法に存在し、使用され得る追加の化合物は、ＣＰＴ−１阻害および／またはＰＰＡＲα活性化活性を有する化学成分である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが、シクロデキストリンに充填される。薬物送達におけるシクロデキストリンの使用の非限定的な概説については、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｏｒｄｉｙａ ａｎｄ Ｓｅｎｔｈｉｌｋｕｍａｒａｎ（２０１２）Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１（１）：１９−２９（特に、その表２、担体として使用される異なるシコデックストリンについて記載するため）を参照されたい。
実施形態では、細胞培養培地は、プロスタグランジン、コルチコステロイド、ロイコトリエン、リポキシン、プロテクチン、レゾルビン、オリゴヌクレオチド、または疎水性薬物化合物をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、プロスタグランジンをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、コルチコステロイドをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、ロイコトリエンをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、リポキシンをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、プロテクチンをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、レゾルビンをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、オリゴヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地は、疎水性薬物化合物をさらに含む。
実施形態では、細胞培養培地補助剤は、プロスタグランジン、コルチコステロイド、ロイコトリエン、リポキシン、プロテクチン、レゾルビン、オリゴヌクレオチド、または疎水性薬物化合物をさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、プロスタグランジンをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、コルチコステロイドをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ロイコトリエンをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、リポキシンをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、プロテクチンをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、レゾルビンをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、オリゴヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、疎水性薬物化合物をさらに含む。
実施形態では、疎水性薬物化合物は、エトモキシルまたはスタチンである。実施形態では、疎水性薬物化合物は、エトモキシルである。実施形態では、疎水性薬物化合物は、スタチンである。
実施形態では、細胞培養培地は、２−ＤＧを含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、２−ＤＧを含む。
実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、または１０ｍＭであるレベルの２−ＤＧを含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約２ｍＭ、または約０．２５ｍＭ〜約１ｍＭのレベルの２−ＤＧを含む。実施形態では、２−ＤＧのレベルは、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、または０．２５ｍＭ未満である。実施形態では、２−ＤＧのレベルは、約５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、または０．２５ｍＭである。
実施形態では、細胞培養培地は、約２００μＭ、１５０μＭ、１４０μＭ、１３０μＭ、１２０μＭ、１１０μＭ、１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、６０μＭ、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１μＭ、０．０５μＭ、０．０２５μＭ、０．００１μＭ、２００μＭ未満、１５０μＭ未満、１４０未満μＭ、１３０μＭ未満、１２０μＭ未満、１１０μＭ未満、１００μＭ未満、９０μＭ未満、８０μＭ未満、７０μＭ未満、６０μＭ未満、５０μＭ未満、４０未満μＭ、３０μＭ未満、２０μＭ未満、１０μＭ未満、５μＭ未満、１μＭ未満、０．５μＭ未満、０．２５μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０５μＭ未満、０．０２５未満μＭ、または０．０１μＭ未満であるレベルのシクロデキストリンを含む。
実施形態では、細胞培養培地は、約５０μＭ〜約２００μＭ、約５５μＭ〜約１９５μＭ、約５０μＭ〜約１９０μＭ、約６５μＭ〜約１８５μＭ、約７０μＭ〜約１８０μＭ、約７５μＭ〜約１７５μＭ、約８０μＭ〜約１７０μＭ、約８５μＭ〜約１６５μＭ、約９０μＭ〜約１６０μＭ、約９０μＭ〜約１５５μＭ、約９５μＭ〜約１５０μＭ、約１００μＭ〜約１４５μＭ、約１０５μＭ〜約１４０μＭ、約１１０μＭ〜約１３５μＭ、約１１５μＭ〜約１３０μＭ、または約１２０μＭ〜約１２５μＭであるレベルのシクロデキストリンを含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの少なくとも１つの脂質を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ、１０μＭ、または１５μＭから、約２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの少なくとも１つの脂質を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約４０μＭ、約５μＭ〜約３０μＭ、約１０μＭ〜約３０μＭ、約１１μＭ〜約２９μＭ、約１２μＭ〜約２８μＭ、約１３μＭ〜約２７μＭ、約１４μＭ〜約２６μＭ、約１５μＭ〜約２５μＭ、約１６μＭ〜約２４μＭ、約１７μＭ〜約２３μＭ、約１８μＭ〜約２２μＭ、約１９μＭ〜約２１μＭであるレベルの少なくとも１つの脂質を含む。実施形態では、細胞培養培地中の少なくとも１つの脂質のレベルは、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、または３０μＭである。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの少なくとも１つの脂肪酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ、１０μＭ、または１５μＭから、約２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの少なくとも１つの脂肪酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約４０μＭ、約５μＭ〜約３０μＭ、約１０μＭ〜約３０μＭ、約１１μＭ〜約２９μＭ、約１２μＭ〜約２８μＭ、約１３μＭ〜約２７μＭ、約１４μＭ〜約２６μＭ、約１５μＭ〜約２５μＭ、約１６μＭ〜約２４μＭ、約１７μＭ〜約２３μＭ、約１８μＭ〜約２２μＭ、約１９μＭ〜約２１μＭであるレベルの少なくとも１つの脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地中の少なくとも１つの脂肪酸のレベルは、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、または３０μＭである。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸、リノール酸、および／またはγ−リノレン酸等のオメガ−６脂肪酸）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルの少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのアラキドン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのアラキドン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのアラキドン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのリノール酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのリノール酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのリノール酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのリノレン酸（例えば、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、またはそれらの組み合わせ）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのリノレン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのリノレン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの多価不飽和脂肪酸以外の少なくとも１つの脂肪酸（例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、もしくはステアリン酸等の飽和脂肪酸、および／またはパルミトレイン酸もしくはオレイン酸等の一価不飽和脂肪酸）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの脂肪酸（複数可）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルの脂肪酸（複数可）を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのミリスチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのミリスチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、約１μＭ〜約５μＭであるレベルのミリスチン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのパルミチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのパルミチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのパルミチン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのステアリン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのステアリン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのステアリン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのパルミトレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのパルミトレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのパルミトレイン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのオレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのオレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのオレイン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのコレステロールを含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ、１０μＭ、または１５μＭから、約２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのコレステロールを含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約４０μＭ、約５μＭ〜約３０μＭ、約１０μＭ〜約３０μＭ、約１１μＭ〜約２９μＭ、約１２μＭ〜約２８μＭ、約１３μＭ〜約２７μＭ、約１４μＭ〜約２６μＭ、約１５μＭ〜約２５μＭ、約１６μＭ〜約２４μＭ、約１７μＭ〜約２３μＭ、約１８μＭ〜約２２μＭ、約１８μＭ〜約２１μＭ、約１９μＭ〜約２０μＭであるレベルのコレステロールを含む。実施形態では、細胞培養培地は、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、または３０μＭであるレベルのコレステロールを含む。
実施形態では、細胞培養培地は、薬物化合物を含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、薬物化合物を含まない。
実施形態では、細胞培養培地は、アルプロスタジル、セフォチアムヘキセチルＨＣｌ、ベネクセートＨＣｌ、デキサメタゾン、ヨード、ニコチン、ニメスリド、ニトログリセリン、オメプラゾール、ＰＧＥ２、ピロキシカム、チアプロフェン酸、シサプリド、ヒドロコルチゾン、ルドメタシン、イトラコナゾール、マイトマイシン、１７β−エストラジオール、クロラムフェニコール、ボリコナゾール、マレイン酸ジプラシドウ（ｚｉｐｒａｓｉｄｏｕｅ ｍａｌｅａｔｅ）、ジクロフェナクナトリウム、エトモキシル、またはスタチンを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、アルプロスタジルを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、セフォチアムヘキセチルＨＣｌを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ベネクセートＨＣｌを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、デキサメタゾンを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ヨードを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ニコチンを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ニメスリドを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ニトログリセリンを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ニトログリセリンを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、オメプラゾールを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ＰＧＥ２を含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ピロキシカムを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、チアプロフェン酸を含まない。実施形態では、細胞培養培地は、シサプリドを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ルドメタシンを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、イトラコナゾールを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、マイトマイシンを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、１７β−エストラジオールを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、クロラムフェニコールを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ボリコナゾールを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、マレイン酸ジプラシドウを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、ジクロフェナクナトリウムを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、エトモキシルを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、スタチンを含まない。
実施形態では、細胞培養培地補助剤は、アルプロスタジル、セフォチアムヘキセチルＨＣｌ、ベネクセートＨＣｌ、デキサメタゾン、ヨード、ニコチン、ニメスリド、ニトログリセリン、オメプラゾール、ＰＧＥ２、ピロキシカム、チアプロフェン酸、シサプリド、ヒドロコルチゾン、ルドメタシン、イトラコナゾール、マイトマイシン、１７β−エストラジオール、クロラムフェニコール、ボリコナゾール、マレイン酸ジプラシドウ、ジクロフェナクナトリウム、エトモキシル、またはスタチンを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、アルプロスタジルを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、セフォチアムヘキセチルＨＣｌを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ベネクセートＨＣｌを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、デキサメタゾンを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ヨードを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ニコチンを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ニメスリドを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ニトログリセリンを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ニトログリセリンを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、オメプラゾールを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ＰＧＥ２を含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ピロキシカムを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、チアプロフェン酸を含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、シサプリドを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ヒドロコルチゾンを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ルドメタシンを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、イトラコナゾールを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、マイトマイシンを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、１７β−エストラジオールを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、クロラムフェニコールを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ボリコナゾールを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、マレイン酸ジプラシドウを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、ジクロフェナクナトリウムを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、エトモキシルを含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、スタチンを含まない。
実施形態では、細胞培養培地は、疎水性薬物化合物を含まない。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、疎水性薬物化合物を含まない。実施形態では、細胞培養培地は、アルブミンを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、タンパク質を含まない。実施形態では、細胞培養培地は、無血清細胞培養培地である。したがって、本発明は、無血清、無アルブミン、または無タンパク質である組成物（例えば、細胞培養培地および補助剤）を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、アルブミンを含む。実施形態では、細胞培養培地は、タンパク質を含む。
実施形態では、Ｔ細胞の集団は、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含まない細胞培養培地と組み合わせたＴ細胞の集団内の対応するＴ細胞と比較して、表現型のより大きな保持、より大きな増殖、より大きな効力、および／またはより高い形質導入効率が可能なＴ細胞を含む。
一態様では、リノール酸、少なくとも１つ（例えば、約または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびメチル化シクロデキストリンを含む、無血清細胞培養培地組成物が提供される。
一態様では、リノール酸、少なくとも１つ（例えば、約または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびメチル化シクロデキストリンを含む、無血清細胞培養補助剤組成物が提供される。
実施形態では、メチル化シクロデキストリンは、５０μＭ〜２００μＭ、５５μＭ〜１９５μＭ、６０μＭ〜１９０μＭ、６５μＭ〜１８５μＭ、７０μＭ〜１８０μＭ、７５μＭ〜１７５μＭ、８０μＭ〜１７０μＭ、８５μＭ〜１６５μＭ、９０μＭ〜１６０μＭ、９５μＭ〜１５５μＭ、９５μＭ〜１５０μＭ、１００μＭ〜１４５μＭ、１０５μＭ〜１４０μＭ、１１０μＭ〜１３５μＭ、１１５μＭ〜１３０μＭ、または１２０μＭ〜１２５μＭのレベルで細胞培養培地中に存在する。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの少なくとも１つの脂質を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ、１０μＭ、または１５μＭから、約２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの少なくとも１つの脂質を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約４０μＭ、約５μＭ〜約３０μＭ、約１０μＭ〜約３０μＭ、約１１μＭ〜約２９μＭ、約１２μＭ〜約２８μＭ、約１３μＭ〜約２７μＭ、約１４μＭ〜約２６μＭ、約１５μＭ〜約２５μＭ、約１６μＭ〜約２４μＭ、約１７μＭ〜約２３μＭ、約１８μＭ〜約２２μＭ、約１９μＭ〜約２１μＭであるレベルの少なくとも１つの脂質を含む。実施形態では、細胞培養培地中の少なくとも１つの脂質のレベルは、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、または３０μＭである。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの少なくとも１つの脂肪酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ、１０μＭ、または１５μＭから、約２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの少なくとも１つの脂肪酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約４０μＭ、約５μＭ〜約３０μＭ、約１０μＭ〜約３０μＭ、約１１μＭ〜約２９μＭ、約１２μＭ〜約２８μＭ、約１３μＭ〜約２７μＭ、約１４μＭ〜約２６μＭ、約１５μＭ〜約２５μＭ、約１６μＭ〜約２４μＭ、約１７μＭ〜約２３μＭ、約１８μＭ〜約２２μＭ、約１９μＭ〜約２１μＭであるレベルの少なくとも１つの脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地中の少なくとも１つの脂肪酸のレベルは、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、または３０μＭである。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸、リノール酸、および／またはγ−リノレン酸等のオメガ−６脂肪酸）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルの少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのアラキドン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのアラキドン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのアラキドン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのリノール酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのリノール酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのリノール酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのリノレン酸（例えば、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、またはそれらの組み合わせ）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのリノレン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのリノレン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの多価不飽和脂肪酸以外の少なくとも１つの脂肪酸（例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、もしくはステアリン酸等の飽和脂肪酸、および／またはパルミトレイン酸もしくはオレイン酸等の一価不飽和脂肪酸）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの脂肪酸（複数可）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルの脂肪酸（複数可）を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのミリスチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのミリスチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、約１μＭ〜約５μＭであるレベルのミリスチン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのパルミチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのパルミチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのパルミチン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのステアリン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのステアリン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのステアリン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのパルミトレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのパルミトレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのパルミトレイン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのオレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのオレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのオレイン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのコレステロールを含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ、１０μＭ、または１５μＭから、約２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのコレステロールを含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約４０μＭ、約５μＭ〜約３０μＭ、約１０μＭ〜約３０μＭ、約１１μＭ〜約２９μＭ、約１２μＭ〜約２８μＭ、約１３μＭ〜約２７μＭ、約１４μＭ〜約２６μＭ、約１５μＭ〜約２５μＭ、約１６μＭ〜約２４μＭ、約１７μＭ〜約２３μＭ、約１８μＭ〜約２２μＭ、約１８μＭ〜約２１μＭ、約１９μＭ〜約２０μＭであるレベルのコレステロールを含む。実施形態では、細胞培養培地は、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、または３０μＭであるレベルのコレステロールを含む。
実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、多価不飽和オメガ−６脂肪酸である。
実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、γリノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、またはテトラコサペンタエン酸である。実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、γリノレン酸である。実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、エイコサジエン酸である。実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、ジホモ−γ−リノレン酸である。実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、アラキドン酸である。実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、ドコサジエン酸である。実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、アドレン酸である。実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、ドコサペンタエン酸である。実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、テトラコサテトラエン酸である。実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、テトラコサペンタエン酸である。
実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、アラキドン酸である。
実施形態では、無血清細胞培養培地組成物は、α−リノレン酸をさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養補助剤組成物は、α−リノレン酸をさらに含む。
実施形態では、無血清細胞培養培地組成物は、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、および／またはステアリン酸をさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養培地組成物は、ミリスチン酸をさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養培地組成物は、オレイン酸をさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養培地組成物は、パルミチン酸をさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養培地組成物は、パルミトレイン酸をさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養培地組成物は、ステアリン酸をさらに含む。
実施形態では、無血清細胞培養補助剤組成物は、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、および／またはステアリン酸をさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養補助剤組成物は、ミリスチン酸をさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養補助剤組成物は、オレイン酸をさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養補助剤組成物は、パルミチン酸をさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養補助剤組成物は、パルミトレイン酸をさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養補助剤組成物は、ステアリン酸をさらに含む。
実施形態では、無血清細胞培養培地組成物は、少なくとも３、４、５、６、７、または８つの異なる脂肪酸を含む。
実施形態では、無血清細胞培養補助剤組成物は、少なくとも３、４、５、６、７、または８つの異なる脂肪酸を含む。
実施形態では、無血清細胞培養培地組成物は、３、４、５、６、７、または８つの異なる脂肪酸を含む。
実施形態では、無血清細胞培養補助剤組成物は、３、４、５、６、７、または８つの異なる脂肪酸を含む。
実施形態では、無血清細胞培養培地組成物は、（ａ）リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、もしくはステアリン酸のいずれか１つ、（ｂ）リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸のうちの２、３、４、５、６、もしくは７つ、（ｃ）リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸、（ｄ）飽和脂肪酸であって、酪酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、もしくはセロチン酸である、飽和脂肪酸、（ｅ）一価不飽和脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、もしくはネルボン酸である、一価不飽和脂肪酸、（ｆ）多価不飽和脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、多価不飽和脂肪酸、（ｇ）オメガ−３脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、オメガ−３脂肪酸、（ｈ）オメガ−６脂肪酸であって、リノール酸、アラキドン酸、γリノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、もしくはテトラコサペンタエン酸である、オメガ−６脂肪酸、または（ｉ）オメガ−９脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ネルボン酸、もしくはミード酸である、オメガ−９脂肪酸を含む。
実施形態では、無血清細胞培養補助剤組成物は、（ａ）リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、もしくはステアリン酸のいずれか１つ、（ｂ）リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸のうちの２、３、４、５、６、もしくは７つ、（ｃ）リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸、（ｄ）飽和脂肪酸であって、酪酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、もしくはセロチン酸である、飽和脂肪酸、（ｅ）一価不飽和脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、もしくはネルボン酸である、一価不飽和脂肪酸、（ｆ）多価不飽和脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、多価不飽和脂肪酸、（ｇ）オメガ−３脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、オメガ−３脂肪酸、（ｈ）オメガ−６脂肪酸であって、リノール酸、アラキドン酸、γリノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、もしくはテトラコサペンタエン酸である、オメガ−６脂肪酸、または（ｉ）オメガ−９脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ネルボン酸、もしくはミード酸である、オメガ−９脂肪酸を含む。
実施形態では、コレステロールは、合成コレステロールである。
実施形態では、メチル化シクロデキストリンは、メチル化α−シクロデキストリン、メチル化β−シクロデキストリン、またはメチル化γ−シクロデキストリンである。実施形態では、メチル化シクロデキストリンは、メチル化α−シクロデキストリンである。実施形態では、メチル化シクロデキストリンは、メチル化β−シクロデキストリンである。実施形態では、メチル化シクロデキストリンは、メチル化γ−シクロデキストリンである。実施形態では、メチル化シクロデキストリンは、メチル−β−シクロデキストリンである。
実施形態では、無血清細胞培養培地組成物は、非メチル化シクロデキストリンをさらに含む。実施形態では、無血清細胞培養補助剤組成物は、非メチル化シクロデキストリンをさらに含む。
実施形態では、メチル化シクロデキストリン対ＴＣＯＬのモル比は、１０．５：１未満、１０：１未満、９．５：１未満、９：１未満、８．５：１未満、８：１未満、７．５：１未満、７：１未満、６．５：１未満、６：１未満、５．５：１未満、５：１未満、４．５：１未満、４：１未満、３．５：１未満、３：１未満、２．５：１未満、２：１未満、１．５：１未満、１：１未満、０．５：１未満、０．２５：１未満、または０．１：１未満である。
実施形態では、本組成物中のメチル化シクロデキストリン対ＴＬのモル比は、１１．５：１未満、１１：１未満、１０．５：１未満、１０：１未満、９．５：１未満、９：１未満、８．５：１未満、８：１未満、７．５：１未満、７：１未満、６．５：１未満、６：１未満、５．５：１未満、５：１未満、４．５：１未満、４：１未満、３．５：１未満、３：１未満、２．５：１未満、２：１未満、１．５：１未満、１：１未満、０．５：１未満、０．２５：１未満、または０．１：１未満である。
実施形態では、無血清細胞培養培地は、アルブミンを含むか、または含まない。実施形態では、無血清細胞培養補助剤は、アルブミンを含むか、または含まない。したがって、本発明は、無アルブミンである無血清培地および補助剤を含む。アルブミンが存在する場合、それは、組み換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）であり得る。
実施形態では、細胞培養培地補助剤は、アルブミンを含む。実施形態では、細胞培養培地補助剤は、タンパク質を含む。
実施形態では、無血清細胞培養培地は、タンパク質を含まない。実施形態では、無血清細胞培養補助剤は、タンパク質を含まない。
一実施形態では、０．００６４７ｍｏｌ／Ｌの合成コレステロール、０．０６７６ｍｏｌ／Ｌのメチル−β−シクロデキストリン、０．０００７２ｍｏｌ／Ｌのアラキドン酸、０．００５０８ｍｏｌ／Ｌのリノール酸、０．０００１４ｍｏｌ／Ｌのリノレン酸、２７．７５４２２ｍｏｌ／Ｌの熱水、および２７．７５４２２ｍｏｌ／Ｌの冷水を含む、細胞培養培地補助剤が提供される。実施形態では、細胞培養培地補助剤の有効希釈度は、約１：１０〜約１：５０００（例えば、約１：１０、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００、約１：１５０、約１：２００、約１：２５０、約１：３００、約１：３５０、約１：４００、約１：４５０、約１：４５５、約１：４６０、約１：４６５、約１：４７０、約１：４７５、約１：４８０、約１：４８５、約１：４９０、約１：４９５、約１：５００、約１：５０５、約１：５１０、約１：５１５、約１：５２０、約１：５２５、約１：５３０、約１：５３５、約１：５４０、約１：５４５、約１：５５０、約１：５５５、約１：５６０、約１：５６５、約１：５７０、約１：５７５、約１：５８０、約１：５８５、約１：５９０、約１：５９５、約１：６００、約１：６５０、約１：７００、約１：７５０、約１：８００、約１：８５０、約１：９００、約１：９５０、約１：１０００、約１：１５００、約１：２０００、約１：２５００、約１：３０００、約１：３５００、約１：４０００、約１：４５００、約１：５０００）である。実施形態では、細胞培養培地補助剤の有効希釈度は、約１：２５０〜約１：７５０である。実施形態では、細胞培養培地補助剤の有効希釈度は、約１：４００〜約１：６００である。
一実施形態では、０．００６４７ｍｏｌ／Ｌの合成コレステロール、０．０６７６ｍｏｌ／Ｌのメチル−β−シクロデキストリン、０．００００６５７ｍｏｌ／Ｌのアラキドン酸、０．０００３６ｍｏｌ／Ｌのリノール酸、０．０００３６ｍｏｌ／Ｌのリノレン酸、０．０００４４ｍｏｌ／Ｌのミリスチン酸、０．０００３５ｍｏｌ／Ｌのオレイン酸、０．０００３９ｍｏｌ／Ｌのパルミチン酸、０．０００３９ｍｏｌ／Ｌのパルミトレイン酸、０．０００３５ｍｏｌ／Ｌのステアリン酸、２７．７５４２２ｍｏｌ／Ｌの熱水、および２７．７５４２２ｍｏｌ／Ｌの冷水を含む、細胞培養培地補助剤が提供される。実施形態では、細胞培養培地補助剤の有効希釈度は、約１：１０〜約１：５０００（例えば、約１：１０、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００、約１：１５０、約１：２００、約１：２５０、約１：３００、約１：３５０、約１：４００、約１：４５０、約１：４５５、約１：４６０、約１：４６５、約１：４７０、約１：４７５、約１：４８０、約１：４８５、約１：４９０、約１：４９５、約１：５００、約１：５０５、約１：５１０、約１：５１５、約１：５２０、約１：５２５、約１：５３０、約１：５３５、約１：５４０、約１：５４５、約１：５５０、約１：５５５、約１：５６０、約１：５６５、約１：５７０、約１：５７５、約１：５８０、約１：５８５、約１：５９０、約１：５９５、約１：６００、約１：６５０、約１：７００、約１：７５０、約１：８００、約１：８５０、約１：９００、約１：９５０、約１：１０００、約１：１５００、約１：２０００、約１：２５００、約１：３０００、約１：３５００、約１：４０００、約１：４５００、約１：５０００）である。実施形態では、細胞培養培地補助剤の有効希釈度は、約１：２５０〜約１：７５０である。実施形態では、細胞培養培地補助剤の有効希釈度は、約１：４００〜約１：６００である。
一実施形態では、０．００６４７ｍｏｌ／Ｌの合成コレステロール、０．０６７６ｍｏｌ／Ｌのメチル−β−シクロデキストリン、０．０００３２ｍｏｌ／Ｌのアラキドン酸、０．００１０５ｍｏｌ／Ｌのリノール酸、０．００１０５ｍｏｌ／Ｌのリノレン酸、０．０００１１ｍｏｌ／Ｌのミリスチン酸、０．００２７３ｍｏｌ／Ｌのオレイン酸、０．００１７ｍｏｌ／Ｌのパルミチン酸、０．０００１７ｍｏｌ／Ｌのパルミトレイン酸、０．００２０２ｍｏｌ／Ｌのステアリン酸、２７．７５４２２ｍｏｌ／Ｌの熱水、および２７．７５４２２ｍｏｌ／Ｌの冷水を含む、細胞培養培地補助剤が提供される。実施形態では、細胞培養培地補助剤の有効希釈度は、約１：１０〜約１：５０００（例えば、約１：１０、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、約１：１００、約１：１５０、約１：２００、約１：２５０、約１：３００、約１：３５０、約１：４００、約１：４５０、約１：４５５、約１：４６０、約１：４６５、約１：４７０、約１：４７５、約１：４８０、約１：４８５、約１：４９０、約１：４９５、約１：５００、約１：５０５、約１：５１０、約１：５１５、約１：５２０、約１：５２５、約１：５３０、約１：５３５、約１：５４０、約１：５４５、約１：５５０、約１：５５５、約１：５６０、約１：５６５、約１：５７０、約１：５７５、約１：５８０、約１：５８５、約１：５９０、約１：５９５、約１：６００、約１：６５０、約１：７００、約１：７５０、約１：８００、約１：８５０、約１：９００、約１：９５０、約１：１０００、約１：１５００、約１：２０００、約１：２５００、約１：３０００、約１：３５００、約１：４０００、約１：４５００、約１：５０００）である。実施形態では、細胞培養培地補助剤の有効希釈度は、約１：２５０〜約１：７５０である。実施形態では、細胞培養培地補助剤の有効希釈度は、約１：４００〜約１：６００である。
組み合わせおよび培養方法
本発明はまた、異なる化合物の組成物、ならびにそのような組成物を調製および／または使用するための方法を含む。これらの異なる化合物は、（１）培養培地補助剤としてまたはその中に存在しても、（２）培養培地として存在してもよい。さらに、そのような組み合わせは、キットに含まれてもよい。本発明の組成物は、（１）コレステロールおよび／もしくはその誘導体、（２）１つ以上のシクロデキストリン、（３）１つ以上の脂肪酸、（４）２−ＤＧ、ならびに／または（５）１つの他の化合物（例えば、プロスタグランジン、エトモキシル、ロイコトリエン、スタチン等）を含み得る。したがって、本発明の組成物は、コレステロール、１つ以上の脂肪酸、および２−ＤＧは含有するが、シクロデキストリンは含有しない、培養培地を含む。本発明の組成物はまた、コレステロール、１つ以上の脂肪酸、およびシクロデキストリンは含有するが、２−ＤＧは含有しない、培養培地も含む。さらに、本発明の組成物はまた、コレステロール、１つ以上の脂肪酸、シクロデキストリン、および２−ＤＧを含有する、培養培地も含む。
本明細書に明記される組成物は、培養培地補助剤、培養培地補助剤への添加剤、および培養培地を含む。もちろん、存在する特定の化合物の量は、組成物の種類によって変動する。一例として、１倍濃度に達するように、５倍溶液を別の溶液と混合することによって、１０倍培養培地補助剤を調製すると想定する。さらに、５倍溶液が、５００μｇ／ｍｌの化合物Ａを含有すると想定する。そのような場合、培養培地補助剤は、１００μｇ／ｍｌの化合物Ａを含有し、培養培地は、１０μｇ／ｍｌの化合物Ａを含有する。
最終的に、本発明の配合物は、典型的には、培養培地の調製のために設計される。さらに、そのような培養培地は一般に、所望の特徴を有するように配合される。いくつかのそのような所望の特徴は、本明細書の他の箇所に明記されている。さらに、そのような所望の特徴には、高レベルの細胞増殖速度、および１つの細胞型の別の細胞型に対する選択的増殖が含まれる（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する増殖）。したがって、存在する様々な化合物の量は、典型的には、細胞の培養による所望の目的の達成を促進するために調整される。
一態様では、（ｉ）Ｔ細胞の集団、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地、ならびに／または（ｉｉｉ）２−ＤＧを含む、組み合わせが提供される。
Ｔ細胞の集団および細胞培養培地を含む組み合わせの文脈において、「細胞培養培地」は、Ｔ細胞集団に起源を持つ可能性のある化合物を含まない。したがって、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地は、細胞培養培地がＴ細胞の集団と組み合わされる時点で、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む。
実施形態では、Ｔ細胞の培養（例えば、増殖）は、Ｔ細胞の活性化（例えば、刺激）を含む。実施形態では、Ｔ細胞が活性化されない限り、Ｔ細胞の集団は、増加しないか、またはほとんど増加しない（例えば、約１０％未満）。Ｔ細胞を刺激するための様々な方法および組成物が、当該技術分野で既知である。実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞を、抗体、リガンド［植物性血球凝集素（ＰＨＡ）等］、または化学化合物［１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）またはイオノマイシン等］と接触させる（例えば、Ｔ細胞を含む培地に添加する）ことによって活性化される。実施形態では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体コーティングビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）等）、ＰＨＡ、可溶性抗ＣＤ３抗体、またはプレート結合抗ＣＤ３抗体で活性化（例えば、刺激）される。実施形態では、Ｔ細胞は、ビーズにカップリング（例えば、共有結合）または吸収されたＴ細胞活性化抗体で刺激される。実施形態では、ビーズは、超常磁性球状ポリマー粒子である。実施形態では、粒子は、均一なサイズを有する。
実施形態では、少なくとも１つの脂質は、コレステロール、脂肪酸、脂肪酸エステル、リン脂質、またはグリセロ脂質である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、コレステロールである。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、脂肪酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、脂肪酸エステルである。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、リン脂質である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、グリセロ脂質である。
実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、または多価不飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、一価不飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、多価不飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、一価不飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、多価不飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、（１）飽和脂肪酸、（２）一価不飽和脂肪酸、および（１）多価不飽和脂肪酸、ならびにそのような脂肪酸の組み合わせ（例えば、２つの多価不飽和脂肪酸、３つの一価不飽和脂肪酸、および１つの飽和脂肪酸）からなる群から選択される、１つ以上の脂肪酸の種類である。
実施形態では、脂肪酸は、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸、またはオメガ−９脂肪酸、またはオメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸、もしくはオメガ−９脂肪酸の１つ以上（例えば、２つ以上もしくは３つ）の組み合わせである。実施形態では、脂肪酸は、ＬＣ−ＰＵＦＡである。実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、一価不飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、多価不飽和脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、リノール酸である。
実施形態では、組み合わせは、リノレン酸をさらに含む。実施形態では、リノレン酸は、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ならびにα−リノレン酸およびγ−リノレン酸である。実施形態では、リノレン酸は、α−リノレン酸である。実施形態では、リノレン酸は、γ−リノレン酸である。実施形態では、リノレン酸は、α−リノレン酸およびγ−リノレン酸である。
実施形態では、組み合わせは、アラキドン酸をさらに含む。実施形態では、組み合わせは、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、および／またはステアリン酸をさらに含む。実施形態では、組み合わせは、ミリスチン酸をさらに含む。実施形態では、組み合わせは、オレイン酸をさらに含む。実施形態では、組み合わせは、パルミチン酸をさらに含む。実施形態では、組み合わせは、パルミトレイン酸をさらに含む。実施形態では、組み合わせは、ステアリン酸をさらに含む。
実施形態では、少なくとも１つの脂質は、（ａ）リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、もしくはステアリン酸のいずれか１つ、（ｂ）リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸のうちの２、３、４、５、６、もしくは７つ、（ｃ）リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸、（ｄ）飽和脂肪酸であって、酪酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、もしくはセロチン酸である、飽和脂肪酸、（ｅ）一価不飽和脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、もしくはネルボン酸である、一価不飽和脂肪酸、（ｆ）多価不飽和脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、多価不飽和脂肪酸、（ｇ）オメガ−３脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、オメガ−３脂肪酸、（ｈ）オメガ−６脂肪酸であって、リノール酸、γリノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、もしくはテトラコサペンタエン酸である、オメガ−６脂肪酸、または（ｉ）オメガ−９脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ネルボン酸、もしくはミード酸である、オメガ−９脂肪酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、またはステアリン酸のいずれか１つである。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸のうちの２、３、４、５、６、または７つである。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、飽和脂肪酸であり、飽和脂肪酸は、酪酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、またはセロチン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、一価不飽和脂肪酸であり、一価不飽和脂肪酸は、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、またはネルボン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、多価不飽和脂肪酸であり、多価不飽和脂肪酸は、ヘキサデカトリエン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、またはテトラコサヘキサエン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、オメガ−３脂肪酸であり、オメガ−３脂肪酸は、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、またはテトラコサヘキサエン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、オメガ−６脂肪酸であり、オメガ−６脂肪酸は、リノール酸、γリノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、またはテトラコサペンタエン酸である。実施形態では、少なくとも１つの脂質は、オメガ−９脂肪酸であり、オメガ−９脂肪酸は、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ネルボン酸、またはミード酸である。
実施形態では、少なくとも１つの脂質は、コレステロールである。実施形態では、コレステロールは、合成コレステロールである。
実施形態では、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、またはγ−シクロデキストリンである。実施形態では、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリンである。実施形態では、シクロデキストリンは、β−シクロデキストリンである。実施形態では、シクロデキストリンは、γ−シクロデキストリンである。実施形態では、シクロデキストリンは、メチル化されている。実施形態では、シクロデキストリンは、メチル−β−シクロデキストリンである。
実施形態では、シクロデキストリンは、以下、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、２，６−ジメチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンポリスルフェート、トリメチルβ−シクロデキストリン、および／またはγ−シクロデキストリンポリスルフェートの１つ以上である。実施形態では、シクロデキストリンは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、２，６−ジメチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンポリスルフェート、トリメチルβ−シクロデキストリン、および／またはγ−シクロデキストリンポリスルフェートである。
実施形態では、本組成物は、複数の異なるシクロデキストリンを含み、複数のシクロデキストリンは、少なくとも２つのシクロデキストリン（例えば、約または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のシクロデキストリン）を含む。実施形態では、本組成物は、約２〜約１０個（例えば、約２〜約１０、約３〜約１０、約４〜約１０、約５〜約１０、約２〜約８、約３〜約８、約４〜約８、約２〜約１０個等）の範囲の異なるシクロデキストリンを含む。
実施形態では、複数のシクロデキストリンは、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のα−シクロデキストリン、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のβ−シクロデキストリン、および／または少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のγ−シクロデキストリンを含む。実施形態では、複数のシクロデキストリンは、少なくとも２つのα−シクロデキストリン、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のβ−シクロデキストリン、および／または少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のγ−シクロデキストリンを含む。実施形態では、複数のシクロデキストリンは、少なくとも３つのα−シクロデキストリン、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のβ−シクロデキストリン、および／または少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のγ−シクロデキストリンを含む。実施形態では、複数のシクロデキストリンは、少なくとも４つのα−シクロデキストリン、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のβ−シクロデキストリン、および／または少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のγ−シクロデキストリンを含む。実施形態では、複数のシクロデキストリンは、少なくとも５つのα−シクロデキストリン、少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のβ−シクロデキストリン、および／または少なくとも１つ（例えば、約もしくは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個）のγ−シクロデキストリンを含む。
実施形態では、組み合わせは、リノール酸、コレステロール、およびシクロデキストリンを含む。
実施形態では、組み合わせは、２−ＤＧをさらに含む。実施形態では、組み合わせは、約０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、または１０ｍＭであるレベルの２−ＤＧを含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約２ｍＭ、または約０．２５ｍＭ〜約１ｍＭのレベルの２−ＤＧを含む。実施形態では、２−ＤＧのレベルは、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、または０．２５ｍＭ未満である。実施形態では、２−ＤＧのレベルは、約５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、または０．２５ｍＭである。
実施形態では、組成物または組み合わせ中のコレステロール分子の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％（例えば、約５％〜約５０％、約５％〜約５０％、約５％〜約５０％、約５％〜約９８％、約５％〜約８５％、約５％〜約７５％、約５％〜約６０％、約１０％〜約９８％、約１５％〜約９５％、約２０％〜約９５％、約４０％〜約８０％、約６５％〜約９９％等）が、シクロデキストリン分子の環内にある（例えば、少なくともその一部分が、その内側にある）。
実施形態では、組成物または組み合わせ中の脂肪酸分子の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％（例えば、約５％〜約５０％、約５％〜約５０％、約５％〜約５０％、約５％〜約９８％、約５％〜約８５％、約５％〜約７５％、約５％〜約６０％、約１０％〜約９８％、約１５％〜約９５％、約２０％〜約９５％、約４０％〜約８０％、約６５％〜約９９％等）が、シクロデキストリン分子の環内にある（例えば、少なくともその一部分が、その内側にある）。
実施形態では、組み合わせは、シクロデキストリンおよびコレステロールを含み、ＴＣ対ＴＣＯＬのモル比は、１０．５：１未満、１０：１未満、９．５：１未満、９：１未満、８．５：１未満、８：１未満、７．５：１未満、７：１未満、６．５：１未満、６：１未満、５．５：１未満、５：１未満、４．５：１未満、４：１未満、３．５：１未満、３：１未満、２．５：１未満、２：１未満、１．５：１未満、１：１未満、未満０．５：１、０．２５：１未満、または０．１：１未満である。したがって、ＴＣ対ＴＣＯＬのモル比は、約１０．５：１〜約０．１：１、約８：１〜約０．１：１、約７：１〜約０．１：１、約６：１〜約０．１：１、約５：１〜約０．１：１、約３：１〜約０．１：１、約２：１〜約０．１：１等であり得る。
実施形態では、組み合わせは、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂肪酸を含み、ＴＣ対ＴＦＡのモル比は、１１．５：１未満、１１：１未満、１０．５：１未満、１０：１未満、９．５：１未満、９：１未満、８．５：１未満、８：１未満、７．５：１未満、７：１未満、６．５：１未満、未満６：１、５．５：１未満、５：１未満、４．５：１未満、４：１未満、３．５：１未満、３：１未満、２．５：１未満、２：１未満、１．５：１未満、１：１未満、０．５：１未満、０．２５：１未満、または０．１：１未満である。したがって、シクロデキストリン対少なくとも１つの脂肪酸のモル比は、約１１．５：１〜約０．１：１、約１０．５：１〜約０．１：１、約８：１〜約０．１：１、約７：１〜約０．１：１、約６：１〜約０．１：１、約５：１〜約０．１：１、約３：１〜約０．１：１、約２：１〜約０．１：１等であり得る。
実施形態では、組み合わせは、シクロデキストリン、コレステロール、および少なくとも１つの脂肪酸を含み、（１）ＴＣ対（２）ＴＣＯＬおよびＴＦＡ（例えば、ＴＣＯＬおよびＴＦＡのモル値の合計）のモル比は、７．５：１未満、７：１未満、６．５：１未満、６：１未満、５．５：１未満、５：１未満、４．５：１未満、４：１未満、３．５：１未満、３：１未満、２．５：１未満、２：１未満、１．５：１未満、１：１未満、０．５：１未満、０．２５未満：１、または０．１：１未満である。したがって、（１）ＴＣ対（２）ＴＣＯＬおよびＴＦＡのモル比は、約７：１〜約０．１：１、約６：１〜約０．１：１、約５：１〜約０．１：１、約３：１〜約０．１：１、約２：１〜約０．１：１等であり得る。
実施形態では、モル基準でのＴＣ対ＴＣＯＬは、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜約９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
実施形態では、モル基準でのＴＦＡ対ＴＣの比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜約９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
実施形態では、モル基準でのＴＦＡ対ＴＣＯＬの比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
実施形態では、モル基準での総多価不飽和脂肪酸分子対他の脂肪酸分子の比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜約９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
実施形態では、オメガ−３多価不飽和脂肪酸分子対他の脂肪酸分子の比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜約９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
実施形態では、オメガ−６多価不飽和脂肪酸分子対他の脂肪酸分子の比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜約９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
実施形態では、オメガ−９多価不飽和脂肪酸分子対他の脂肪酸分子の比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、および９０：１０（例えば、約１０：９０〜約９０：１０、約２０：８０〜約９０：１０、約３０：７０〜約９０：１０、約４０：６０〜約９０：１０、約１０：９０〜約８０：２０、約１０：９０〜約７０：３０、約１０：９０〜約６０：４０、約２０：８０〜約８０：２０、約３０：７０〜約７０：３０、約４０：６０〜約６０：４０等）である。
実施形態では、組み合わせは、プロスタグランジン、コルチコステロイド、ロイコトリエン、リポキシン、プロテクチン、レゾルビン、オリゴヌクレオチド、または疎水性薬物化合物をさらに含む。実施形態では、組み合わせは、プロスタグランジンをさらに含む。実施形態では、組み合わせは、コルチコステロイドをさらに含む。実施形態では、組み合わせは、ロイコトリエンをさらに含む。実施形態では、組み合わせは、リポキシンをさらに含む。実施形態では、組み合わせは、プロテクチンをさらに含む。実施形態では、組み合わせは、レゾルビンをさらに含む。実施形態では、組み合わせは、オリゴヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、組み合わせは、疎水性薬物化合物をさらに含む。実施形態では、疎水性薬物化合物は、エトモキシルまたはスタチンである。実施形態では、疎水性薬物化合物は、エトモキシルである。実施形態では、疎水性薬物化合物は、スタチンである。
実施形態では、細胞培養培地は、約２００μＭ、１５０μＭ、１４０μＭ、１３０μＭ、１２０μＭ、１１０μＭ、１００μＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、６０μＭ、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１μＭ、０．０５μＭ、０．０２５μＭ、０．００１μＭ、２００μＭ未満、１５０μＭ未満、１４０未満μＭ、１３０μＭ未満、１２０μＭ未満、１１０μＭ未満、１００μＭ未満、９０μＭ未満、８０μＭ未満、７０μＭ未満、６０μＭ未満、５０μＭ未満、４０未満μＭ、３０μＭ未満、２０μＭ未満、１０μＭ未満、５μＭ未満、１μＭ未満、０．５μＭ未満、０．２５μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０５μＭ未満、０．０２５未満μＭ、または０．０１μＭ未満であるレベルのシクロデキストリンを含む。
実施形態では、細胞培養培地は、約５０μＭ〜約２００μＭ、約５５μＭ〜約１９５μＭ、約５０μＭ〜約１９０μＭ、約６５μＭ〜約１８５μＭ、約７０μＭ〜約１８０μＭ、約７５μＭ〜約１７５μＭ、約８０μＭ〜約１７０μＭ、約８５μＭ〜約１６５μＭ、約９０μＭ〜約１６０μＭ、約９０μＭ〜約１５５μＭ、約９５μＭ〜約１５０μＭ、約１００μＭ〜約１４５μＭ、約１０５μＭ〜約１４０μＭ、約１１０μＭ〜約１３５μＭ、約１１５μＭ〜約１３０μＭ、または約１２０μＭ〜約１２５μＭであるレベルのシクロデキストリンを含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの少なくとも１つの脂質を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ、１０μＭ、または１５μＭから、約２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの少なくとも１つの脂質を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約４０μＭ、約５μＭ〜約３０μＭ、約１０μＭ〜約３０μＭ、約１１μＭ〜約２９μＭ、約１２μＭ〜約２８μＭ、約１３μＭ〜約２７μＭ、約１４μＭ〜約２６μＭ、約１５μＭ〜約２５μＭ、約１６μＭ〜約２４μＭ、約１７μＭ〜約２３μＭ、約１８μＭ〜約２２μＭ、約１９μＭ〜約２１μＭであるレベルの少なくとも１つの脂質を含む。実施形態では、細胞培養培地中の少なくとも１つの脂質のレベルは、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、または３０μＭである。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの少なくとも１つの脂肪酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ、１０μＭ、または１５μＭから、約２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの少なくとも１つの脂肪酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約４０μＭ、約５μＭ〜約３０μＭ、約１０μＭ〜約３０μＭ、約１１μＭ〜約２９μＭ、約１２μＭ〜約２８μＭ、約１３μＭ〜約２７μＭ、約１４μＭ〜約２６μＭ、約１５μＭ〜約２５μＭ、約１６μＭ〜約２４μＭ、約１７μＭ〜約２３μＭ、約１８μＭ〜約２２μＭ、約１９μＭ〜約２１μＭであるレベルの少なくとも１つの脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地中の少なくとも１つの脂肪酸のレベルは、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、または３０μＭである。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸、リノール酸、および／またはγ−リノレン酸等のオメガ−６脂肪酸）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルの少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのアラキドン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのアラキドン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのアラキドン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのリノール酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのリノール酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのリノール酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのリノレン酸（例えば、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、またはそれらの組み合わせ）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのリノレン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのリノレン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルの多価不飽和脂肪酸以外の少なくとも１つの脂肪酸（例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸、もしくはステアリン酸等の飽和脂肪酸、および／またはパルミトレイン酸もしくはオレイン酸等の一価不飽和脂肪酸）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルの脂肪酸（複数可）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルの脂肪酸（複数可）を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのミリスチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのミリスチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、約１μＭ〜約５μＭであるレベルのミリスチン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのパルミチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのパルミチン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのパルミチン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのステアリン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのステアリン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのステアリン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのパルミトレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのパルミトレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのパルミトレイン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのオレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、または１μＭから、約１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのオレイン酸を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭ〜約５μＭであるレベルのオレイン酸を含む。
実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも約５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであるレベルのコレステロール（例えば、合成コレステロール、無動物起源コレステロール等）を含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ、１０μＭ、または１５μＭから、約２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭまでであるレベルのコレステロールを含む。実施形態では、細胞培養培地は、約５μＭ〜約５０μＭ、約５μＭ〜約４０μＭ、約５μＭ〜約３０μＭ、約１０μＭ〜約３０μＭ、約１１μＭ〜約２９μＭ、約１２μＭ〜約２８μＭ、約１３μＭ〜約２７μＭ、約１４μＭ〜約２６μＭ、約１５μＭ〜約２５μＭ、約１６μＭ〜約２４μＭ、約１７μＭ〜約２３μＭ、約１８μＭ〜約２２μＭ、約１８μＭ〜約２１μＭ、約１９μＭ〜約２０μＭであるレベルのコレステロールを含む。実施形態では、細胞培養培地は、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、２１μＭ、２２μＭ、２３μＭ、２４μＭ、２５μＭ、２６μＭ、２７μＭ、２８μＭ、２９μＭ、または３０μＭであるレベルのコレステロールを含む。
実施形態では、組み合わせは、薬物化合物を含まない。実施形態では、組み合わせは、アルプロスタジル、セフォチアムヘキセチルＨＣｌ、ベネクセートＨＣｌ、デキサメタゾン、ヨード、ニコチン、ニメスリド、ニトログリセリン、オメプラゾール、ＰＧＥ２、ピロキシカム、チアプロフェン酸、シサプリド、ヒドロコルチゾン、ルドメタシン、イトラコナゾール、マイトマイシン、１７β−エストラジオール、クロラムフェニコール、ボリコナゾール、マレイン酸ジプラシドウ、ジクロフェナクナトリウム、エトモキシル、またはスタチンを含まない。実施形態では、組み合わせは、疎水性薬物化合物を含まない。
実施形態では、細胞培養培地は、アルブミンを含まない。実施形態では、細胞培養培地は、タンパク質を含まない。実施形態では、細胞培養培地は、無血清細胞培養培地である。
実施形態では、細胞培養培地は、アルブミンを含む。実施形態では、細胞培養培地は、タンパク質を含む。
実施形態では、Ｔ細胞の集団は、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含まない細胞培養培地と組み合わせたＴ細胞の集団内の対応するＴ細胞と比較して、表現型のより大きな保持、より大きな増殖、より大きな効力、および／またはより高い形質導入効率が可能なＴ細胞を含む。
一態様では、Ｔ細胞集団を培養するための方法であって、シクロデキストリンおよび少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の脂質を含む細胞培地中で集団をインキュベートすることを含む、方法が提供される。実施形態では、Ｔ細胞集団を培養するための方法は、（１）シクロデキストリン、および（２）少なくとも２つの脂質、少なくとも３つの脂質、少なくとも４つの脂質、少なくとも５つの脂質、少なくとも６つの脂質、少なくとも７つの脂質、少なくとも８つ脂質、少なくとも９つの脂質、少なくとも１０個の脂質、少なくとも１５個の脂質、または少なくとも２０個の脂質（例えば、約３〜約２０個、約４〜約２０個、約５〜約２０個、約６〜約２０個、約７〜約２０個、約３〜約１５個、約３〜約１２個、約３〜約１０個、約３〜約８個、約５〜約２０個、約５〜約１５個、約５〜約１２個、約５〜約９個等の脂肪酸））を含む細胞培養培地中で集団をインキュベートすることを含む。
実施形態では、細胞培養培地は、その実施形態を含む、本明細書で提供される無血清細胞培養補助剤組成物を含む。
実施形態では、Ｔ細胞集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。実施形態では、Ｔ細胞集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。実施形態では、Ｔ細胞集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。
一態様では、集団内のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比の変化を最小化しながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を培養する方法であって、シクロデキストリンおよび多価不飽和脂肪酸を含む培地中で集団をインキュベートすることを含む、方法が提供される。実施形態では、多価不飽和脂肪酸は、オメガ−６多価不飽和脂肪酸である。実施形態では、オメガ−６多価不飽和脂肪酸は、リノール酸である。
実施形態では、培地は、コレステロールをさらに含む。実施形態では、培地は、リノレン酸をさらに含む。実施形態では、多価不飽和脂肪酸は、リノレン酸である。実施形態では、培地は、アラキドン酸をさらに含む。
本方法の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比の変化を最小化することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数対ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が、集団が最初に培地と接触したときのＣＤ８＋Ｔ細胞の数対ＣＤ４＋Ｔ細胞の数と比較して、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満だけ異なる、ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を維持することを含む。
実施形態では、集団が最初に培地と接触するとき、集団は、約１：１（例えば、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、または約１．０１：１〜１．１：１もしくは約１：１．０１〜１：１．１）のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を含む。実施形態では、集団が最初に培地と接触するとき、集団は、１：１のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を含む。
実施形態では、培地は、（ｉ）シクロデキストリン、（ｉｉ）コレステロール、および（ｉｉｉ）脂肪酸を含み、脂肪酸は、リノール酸、リノレン酸、およびアラキドン酸からなる。実施形態では、培地は、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸のいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせを欠く。
実施形態では、培地は、少なくとも１：１（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１）の多価不飽和脂肪酸（複数可）対他の脂肪酸のモル比を含む。実施形態では、培地は、少なくとも１：１（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１）のオメガ−３多価不飽和脂肪酸（複数可）対他の脂肪酸のモル比を含む。実施形態では、培地は、少なくとも１：１（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１）のオメガ−６多価不飽和脂肪酸（複数可）対他の脂肪酸のモル比を含む。実施形態では、培地は、少なくとも１：１（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１）のオメガ−９多価不飽和脂肪酸（複数可）対他の脂肪酸のモル比を含む。
実施形態では、培地は、少なくとも１：１（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１）のリノール酸、リノレン酸、および／またはアラキドン酸対他の脂肪酸のモル比を含む。実施形態では、培地は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、または少なくとも１０：１の（１）リノール酸、リノレン酸、および／またはアラキドン酸対（２）他の脂肪酸のモル比を含む。
実施形態では、本方法は、Ｔ細胞が所望の数、分化段階、および／または表現型に達するまで十分な期間にわたって集団をインキュベートすることと、任意で、培養物からＴ細胞を採取することとをさらに含む。
一態様では、あるＴ細胞亜集団のメンバーを優先的に増殖させるための方法であって、Ｔ細胞の混合集団を、（ｉ）シクロデキストリンおよび（ｉｉ）脂肪酸に曝露することを含み、２つ以上の脂肪酸のモル比が、Ｔ細胞亜集団のメンバーを誘導して、他のＴ細胞亜集団のメンバーに対して優先的に増殖するように調整される、方法が提供される。
実施形態では、Ｔ細胞亜集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
実施形態では、Ｔ細胞の混合集団は、他の脂肪酸よりも多くの多価不飽和脂肪酸に曝露される。実施形態では、Ｔ細胞の混合集団は、他の脂肪酸よりも多くのオメガ−６多価不飽和脂肪酸に曝露される。
実施形態では、Ｔ細胞亜集団は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞である。実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト対象の血液から単離されている。
実施形態では、Ｔ細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞である。実施形態では、Ｔ細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞受容体を発現する。実施形態では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現する。
実施形態では、Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔヘルパー細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、高分化型エフェクター（ＴＴＤ）Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、または操作されたＴ細胞である。
実施形態では、Ｔ細胞集団のサイズは、７日以内に少なくとも３（例えば、４、５、６、７、８、９、１０）倍に倍増する。
実施形態では、Ｔ細胞集団のサイズは、１０日以内に少なくとも３、４、または５倍に倍増する。
実施形態では、Ｔ細胞集団内のＴ細胞の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％は、Ｔ細胞集団が最初に培地と接触してから７、８、９、または１０日後に生存可能である。実施形態では、Ｔ細胞集団内のＴ細胞の少なくとも９５％は、Ｔ細胞集団が最初に培地と接触してから１０日後に生存可能である。
実施形態では、本方法は、疾患または病態に苦しんでいるか、またはそれに苦しむリスクがある対象への投与のための培養Ｔ細胞を調製することをさらに含む。実施形態では、本方法は、Ｔ細胞を対象に投与することをさらに含む。
実施形態では、その実施形態を含む、本明細書で提供される組み合わせを含む、細胞培養プレート、フラスコ、バッグ、生物発酵槽、もしくは生物反応器系（またはＴ細胞の培養に好適な他の培養容器）が提供される。
所望のＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比を得るための方法
本明細書には、所望のＣＤ４＋：ＣＤ８＋Ｔ細胞比を含有するＴ細胞集団を得るための組成物および方法もまた含まれる。例えば、本主題は、Ｔ細胞集団内のあるＴ細胞亜集団（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）のメンバーを優先的に増殖させるための方法を提供する。そのような方法は、（ＣＤ８＋Ｔ細胞、および例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む）Ｔ細胞の混合集団を、２−ＤＧと接触させることを含む。
一態様では、集団内のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を増加させながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を培養する方法が本明細書で提供される。実施形態では、集団を、２−ＤＧを含む細胞培養培地中でインキュベートする。実施形態では、細胞培養培地は、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質（コレステロールおよび／または脂肪酸等）をさらに含む。実施形態では、シクロデキストリンならびに／または脂質（コレステロールおよび／もしくは脂肪酸等）は、本明細書で提供される細胞培養培地、細胞培養補助剤、または組み合わせに関して開示される量またはモル比で存在する。実施形態では、シクロデキストリンは、本明細書に開示される任意のシクロデキストリンまたはシクロデキストリンの組み合わせである。実施形態では、脂質は、本明細書に開示される任意の脂質（脂肪酸および／もしくはコレステロール等）または脂質の組み合わせである。
実施形態では、２−ＤＧは、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭのレベルで存在する。実施形態では、組み合わせは、約０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、または１０ｍＭであるレベルの２−ＤＧを含む。実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約４ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．２５ｍＭ〜約２ｍＭ、または約０．２５ｍＭ〜約１ｍＭのレベルの２−ＤＧを含む。実施形態では、２−ＤＧのレベルは、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、または０．２５ｍＭ未満である。実施形態では、２−ＤＧのレベルは、約５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、または０．２５ｍＭである。
実施形態では、細胞培養培地は、血清を含む。実施形態では、血清は、ヒト血清である。実施形態では、血清は、ウシ血清である。実施形態では、ウシ血清は、ウシ胎児血清である。実施形態では、血清は、細胞培養培地の１体積％、２体積％、３体積％、４体積％、５体積％、６体積％、７体積％、８体積％、９体積％、１０体積％、１１体積％、１２体積％、１３体積％、１４体積％、１５体積％、１６体積％、１７体積％、１８体積％、１９体積％、２０体積％、２１体積％、２２体積％、２３体積％、２４体積％、２５体積％、１〜５体積％、１〜１０体積％、１〜１５体積％、１〜２０体積％、１０〜２０体積％、５〜１５体積％、１０〜２０体積％、または１５〜１０体積％である。
実施形態では、細胞培養培地は、無血清細胞培養培地である。
実施形態では、集団内のＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４＋Ｔ細胞の比は、集団が最初に培地と接触した後、約２、３、４、５、６、または７日以内に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、または５倍増加する。
実施形態では、集団が最初に培地と接触するとき、集団内にはＣＤ８＋Ｔ細胞よりも多くのＣＤ４＋Ｔ細胞が存在する。
実施形態では、集団が最初に培地と接触するとき、集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞の比は、少なくとも５：１（例えば、少なくとも５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１）である。
実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞である。実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト対象の血液から単離されている。実施形態では、Ｔ細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞である。実施形態では、Ｔ細胞は、遺伝子改変Ｔ細胞受容体を発現する。実施形態では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現する。
実施形態では、Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔヘルパー細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、高分化型エフェクター（ＴＴＤ）Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、または操作されたＴ細胞である。
実施形態では、Ｔ細胞集団のサイズは、７日以内に少なくとも３（例えば、４、５、６、７、８、９、１０）倍に倍増する。
実施形態では、Ｔ細胞集団のサイズは、１０日以内に少なくとも３、４、または５倍に倍増する。
実施形態では、Ｔ細胞集団内のＴ細胞の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％は、Ｔ細胞集団が最初に培地と接触してから７、８、９、または１０日後に生存可能である。実施形態では、Ｔ細胞集団内のＴ細胞の少なくとも９５％は、Ｔ細胞集団が最初に培地と接触した後１０日間生存可能である。
治療方法
一態様では、疾患の治療を必要とする対象において疾患を治療する方法であって、その実施形態を含む、本明細書で提供される方法によって得られたＴ細胞を、対象に投与することを含む、方法が提供される。ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、増加したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を含むＴ細胞の増殖集団、またはそのような増殖集団から単離したＣＤ８＋Ｔ細胞）の用途の非限定的な例には、免疫抑制された移植患者の治療のための、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症等のためのウイルス特異的Ｔ細胞に基づく免疫療法が含まれる。例えば、その内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｓｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ１１５（５）：９２５−３５を参照されたい。追加の非限定的な例には、がんおよび感染性疾患の治療のための、ＣＡＲ−Ｔおよび他の様式のウイルス特異的Ｔ細胞の操作の使用が含まれる。例えば、それら各々の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｕｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１１５（５）：９２５−３５およびＧｈａｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ３５（２）：１５９−１６８を参照されたい。ＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、増加したＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を含むＴ細胞の増殖集団、またはそのような増殖集団から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞）の用途の非限定的な例には、ＨＩＶ＋患者の治療、および増殖させたＣＤ４＋Ｔヘルパーサブセット（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨ）、および自己免疫を治療するための制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）が含まれる。例えば、それら各々の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｅｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３７０（１０）：９０１−１０およびＲｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３０（５）：６５６−６６５を参照されたい。
実施形態では、疾患は、過剰増殖性障害である。実施形態では、疾患は、自己免疫性疾患である。実施形態では、疾患は、炎症性疾患である。実施形態では、疾患は、アレルギー性疾患である。実施形態では、疾患は、感染性疾患である。
実施形態では、感染性疾患は、ウイルス感染症である。実施形態では、ウイルス感染症は、サイトメガロウイルス感染症、エプスタイン・バーウイルス感染症、またはヒト免疫不全ウイルス感染症である。
実施形態では、対象は、抑制された免疫系を有する。実施形態では、対象は、組織または臓器の移植を受けている。実施形態では、対象は、後天性免疫不全症候群を有する。
実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。
本明細書で提供される組成物および方法を使用して産生されるＴ細胞亜集団は、治療目的および／または研究／発見目的で、任意の数の生理学的病態、疾患、および／または疾患状態において使用することができる。実施形態では、異常な免疫応答を典型とする病態または疾患は、自己免疫性疾患、例えば、糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、ループス、リウマチ性関節炎、乾癬、または炎症性腸疾患である。実施形態では、免疫抑制が有益である病態には、正常または活性化された免疫応答が哺乳動物にとって不利益になる病態、例えば、拒絶反応を避けるための、例えば、体液もしくは部分の同種移植、または不適切な免疫応答が不妊および流産に関係付けられる不妊治療における同種移植が含まれる。実施形態では、移植前、移植中、または移植後のそのような細胞の使用によって、治療される患者（例えば、移植患者）において発生し得る広範囲の慢性移植片対宿主病が回避される。実施形態では、これらの細胞は、採取直後に増殖させても、増殖前または増殖後かつそれらの治療使用前に（例えば、凍結によって）保管してもよい。実施形態では、そのような療法は、既知の免疫抑制療法と併せて実行されてもよい。
実施形態では、Ｔ細胞は、分化の段階に基づいて単離される。Ｔ細胞集団は、特定の細胞マーカーまたはタンパク質の存在または不在に基づいて分化の段階を評価することができる。Ｔ細胞分化の段階を評価するために使用されるマーカーには、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ２７８、ＣＤ３３５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１６１、ＣＣＲ７、および転写因子ＦＯＸＰ３が含まれる。
実施形態では、一旦適切なＴ細胞集団または亜集団が患者または動物から単離された後、本発明の方法および支持体を使用して、得られたＴ細胞集団を増殖させる前に、遺伝子の、または任意の他の適切な改変もしくは操作を任意で行ってもよい。この操作は、例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いてＴ細胞を刺激／再刺激して、それらを活性化／再活性化させる形態をとり得る。
実施形態では、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、次いでその後に再び採血し（またはアフェレーシスを実行し）、本発明で提供される方法に従って、その血液からＴ細胞を活性化および増殖させ、これらの活性化および増殖させたＴ細胞を患者に再注入することが望ましくあり得る。このプロセスは、数週間ごとに複数回行われ得る。実施形態では、Ｔ細胞を、１０ｍｌ〜４００ｍｌの採血から増殖させることができる。実施形態では、Ｔ細胞を、約２０ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌ、約５０ｍｌ、約６０ｍｌ、約７０ｍｌ、約８０ｍｌ、約９０ｍｌ、または約１００ｍｌの採血から増殖させる。実施形態では、主題の組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、インプラント、または移植による様式を含む、任意の好都合な様式で行われ得る。実施形態では、本明細書に記載の組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に投与され得る。実施形態では、Ｔ細胞は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。実施形態では、Ｔ細胞は、静脈内注射によって投与され得る。実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍、リンパ節、または感染／炎症部位内に直接注射され得る（自己免疫）。
実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるＴ細胞亜集団は、実験用途および治療用途を含む多くの潜在的な用途を有し得る。実施形態では、少数のＴ細胞を患者から取り出し、その後それらをエクスビボで操作し、増殖させてから、患者に再注入する。この方法で治療することができる疾患の非限定的な例は、抑制された免疫活性が（例えば、同種移植免疫寛容のために）望ましい、自己免疫性疾患および病態である。実施形態では、治療方法は、哺乳動物を提供し、Ｔ細胞を含有する該哺乳動物から生体試料を得ることと、本明細書で提供される方法に従って、エクスビボでＴ細胞を増殖／活性化させることと、増殖／活性化させたＴ細胞を治療される哺乳動物に投与することとを含む。実施形態では、第１の哺乳動物および治療される哺乳動物は、同じであっても異なっていてもよい。実施形態では、哺乳動物は一般に、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、またはヒト等の任意の哺乳動物であり得る。実施形態では、第１の哺乳動物（「ドナー」）は、同系、同種、または異種であり得る。実施形態では、療法は、異常な免疫応答（例えば、糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、ループス、リウマチ性関節炎、乾癬、および炎症性腸疾患を含む、自己免疫性疾患等）、組織移植、または不妊治療を有する哺乳動物に投与され得る。
実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法を使用して産生されるＴ細胞亜集団は、様々な用途および治療モダリティで使用することができる。実施形態では、Ｔ細胞亜集団は、がん、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、感染性疾患、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含むがこれらに限定されない疾患状態の治療において使用することができる。実施形態では、Ｔ細胞療法には、免疫枯渇後もしくは免疫枯渇後ではない、本明細書で提供される方法によって外部で増殖させたＴ細胞亜集団の対象への注入、またはドナー対象から単離した、外部で増殖させた異種Ｔ細胞の対象への注入（例えば、養子細胞移入）が含まれる。
自己免疫性疾患または障害は、自己抗原に対する不適切および過剰な応答から生じる疾患である。実施形態では、自己免疫障害は、欠損Ｔｒｅｇ細胞を含む。自己免疫性疾患の非限定的な例には、真性糖尿病、網膜ぶどう膜炎および多発性硬化症、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーブス病、橋本病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、脊椎関節症、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、クローン病、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、リウマチ性関節炎、シェーグレン症候群、および全身性エリテマトーデスが非限定的な例として含まれる。自己免疫性疾患状態では、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの数が減少して存在し得るか、または機能不全であり得る。Ｔ細胞増殖を抑制する能力が低減した末梢血由来のＴｒｅｇが、多発性硬化症（Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９：９７１−９７９（２００４）．）、ＩＩ型多腺性自己免疫症候群（Ｋｒｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９：１２８５−１２９１（２００４）．）、Ｉ型糖尿病（Ｌｉｎｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ５４：９２−９２９（２００５）．）、乾癬（Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：１６４−１７３（２００５））、および重症筋無力症（Ｂａｌａｎｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０５：７３５−７４１（２００５））を有する患者において見出されている。
実施形態では、Ｔ細胞療法を用いた自己免疫性障害の治療は、異なる機構に関与し得る。実施形態では、血液または免疫細胞の別の源を、自己免疫性障害に苦しむ対象から取り出してもよい。実施形態では、本明細書に開示される方法を使用して、患者試料からメモリーＴ細胞以外のＴ細胞型を増殖させる。実施形態では、自己細胞を取り出し、増殖させた後に、低線量全身放射線、胸腺照射、抗胸腺細胞グロブリン、および化学療法の投与を含む、既知の方法によって、不適切なメモリーＴ細胞を、それを必要とする対象において枯渇させてもよい。化学療法剤の例には、Ｃａｍｐａｔｈ、抗ＣＤ３抗体、Ｃｙｔｏｘｉｎ、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および放射線が含まれるが、これらに限定されない。実施形態では、自己抗原を認識することができる不適切なメモリーＴ細胞を枯渇させた後に、外部で増殖させた自己Ｔ細胞を対象に再投与して、対象の免疫系を再構成または再刺激することができる。
あるいは、または上記の治療モダリティに加えて、Ｔｒｅｇ細胞は、末梢血液単核細胞、骨髄、胸腺、組織バイオプシー、腫瘍、リンパ節組織、胃腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓組織、または任意の他のリンパ組織、および腫瘍を含む源から単離することができる。実施形態では、これらのＴ細胞を、本明細書で提供される方法を使用して増殖させる。実施形態では、これらの増殖させたＴｒｅｇ細胞は、不適切な免疫応答を抑制するために患者に再投与され得る。実施形態では、このＴｒｅｇ療法は、免疫枯渇後に最小限の残りの免疫応答を抑制するため、または免疫枯渇を受けていない対象においてのいずれかで投与され得る。
実施形態では、Ｔ細胞療法を用いて有害なＧＶＨＤ事象を治療し、そのリスクまたはその重症度を低減する方法が提供される。実施形態では、対象は、ＧＶＨＤを有する。実施形態では、ＧＶＨＤは、幹細胞移植後に生じる。実施形態では、ＧＶＨＤは、注入された造血幹細胞調製物中に存在するアロ反応性Ｔ細胞によって引き起こされる。実施形態では、対象は、臓器移植を受けており、アロ反応性宿主Ｔ細胞によって媒介される移植片拒絶に苦しんでいるか、またはそれに苦しむリスクがある。実施形態では、血液または免疫細胞の別の源を、ＧＶＨＤに苦しむ対象から取り出してもよい。実施形態では、本明細書で提供される方法は、外因性組織由来の抗原の持続的な認識を含まない細胞型を選択的に増殖させて、メモリーＴ細胞以外のＴ細胞型を選択的に増殖させるために使用される。実施形態では、自己細胞を取り出し、外部で増殖させた後に、低線量全身放射線、胸腺照射、抗胸腺細胞グロブリン、および化学療法の投与を含む、既知の方法によって、不適切なメモリーＴ細胞を、それを必要とする対象において枯渇させてもよい。化学療法剤の例には、Ｃａｍｐａｔｈ、抗ＣＤ３抗体、Ｃｙｔｏｘｉｎ、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および放射線が含まれるが、これらに限定されない。実施形態では、外因性組織上の抗原を認識することができる不適切なメモリーＴ細胞を枯渇させた後に、外部で増殖させた自己Ｔ細胞を対象に再投与して、対象の免疫系を再構成または再刺激することができる。
実施形態では、患者の血液から取り出したＴｒｅｇ細胞を、増殖させてもよい。
実施形態では、これらの増殖させたＴｒｅｇ細胞は、免疫枯渇後に最小限の残りの免疫反応を抑制するため、または免疫枯渇を受けていない対象においてのいずれかで、不適当な免疫反応を抑制するために患者に再び投与される。
本明細書には、アレルギー性疾患を治療するための方法が含まれる。実施形態では、アレルギー性疾患は、Ｔ細胞機能不全を含む。研究は、アレルゲン特異的Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ媒介阻害の障害が、季節性アレルギーに苦しむ患者において存在することを示している（Ｌｉｎｇ ＥＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ２００４；３６３：６０８−１５．、Ｇｒｉｎｄｅｂａｃｋｅ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ２００４；３４：１３６４−７２．）。さらに、Ｔ細胞集団の割合の変化が、健康な対象と比較して、アレルギーおよび喘息疾患を有する個体において関連付けられている（Ａｋｄｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ２００４；１９９：１５６７−７５、Ｔｉｅｍｅｓｓｅｎ ＭＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ２００４；１１３：９３２−９．）。
実施形態では、アレルギー性疾患に苦しむ対象から、血液を取り出してもよい。実施形態では、本明細書で提供される方法は、不適切な抗原由来の抗原（例えば、マメ科植物タンパク質）の持続的な認識を含まない細胞型を選択的に増殖させて、非Ｔメモリー細胞Ｔ細胞型を選択的に増殖させるために使用される。実施形態では、自己細胞を取り出し、増殖させた後に、低線量全身放射線、胸腺照射、抗胸腺細胞グロブリン、および化学療法の投与を含む、既知の方法によって、不適切なメモリーＴ細胞を、それを必要とする対象において枯渇させてもよい。化学療法剤の例には、Ｃａｍｐａｔｈ、抗ＣＤ３抗体、Ｃｙｔｏｘｉｎ、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および放射線が含まれるが、これらに限定されない。実施形態では、外因性組織上の抗原を認識することができる不適切なメモリーＴ細胞を枯渇させた後に、外部で増殖させた自己Ｔ細胞を対象に再投与して、対象の免疫系を再構成または再刺激することができる。
実施形態では、患者の血液から取り出したＴｒｅｇ細胞を、増殖させてもよい。これらの増殖させたＴｒｅｇ細胞は、免疫枯渇後に最小限の残りの免疫反応を抑制するため、または免疫枯渇を受けていない対象においてのいずれかで、不適切な免疫反応を抑制するために患者に再投与され得る。
炎症性疾患および炎症関連障害を治療するための方法もまた、本明細書で提供される。これらの疾患の多くも、自己免疫性障害に分類され得る。炎症性疾患および炎症関連障害の非限定的な例には、糖尿病、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、家族性地中海熱、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、インターロイキン−１受容体拮抗分子欠損症（ＤＩＲＡ）、およびベーチェット病が含まれる。
いかなる理論によっても拘束されるものではないが、Ｔｒｅｇ細胞が非病原性抗原に対する不適切な免疫応答を抑制する役割のため、これらのＴ細胞亜集団の数の減少または機能の障害は、炎症性疾患に寄与し得る。これは、例えば、炎症性腸疾患にも当てはまる（Ｍ Ｈｉｍｍｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１２ Ｊｕｎ；１３６（２）：１１５−１２２）およびｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（Ｍ Ｎｏａｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１４ Ｊｕｎ；１３（６）：６６８−６７７）。
実施形態では、炎症性障害に苦しむ対象から、血液を取り出してもよい。実施形態では、本明細書で提供される方法は、不適切な抗原由来の抗原（例えば、抗カルバミル化タンパク質（抗ＣａｒＰ）抗体媒介リウマチ性関節炎におけるカルバミル化タンパク質）の持続的な認識を含まない細胞型を選択的に増殖させて、非Ｔメモリー細胞Ｔ細胞型を選択的に増殖させるために使用することができる。自己細胞を取り出し、増殖させた後に、低線量全身放射線、胸腺照射、抗胸腺細胞グロブリン、および化学療法の投与を含む、既知の方法によって、不適切なメモリーＴ細胞を、それを必要とする対象において枯渇させてもよい。化学療法剤の例には、Ｃａｍｐａｔｈ、抗ＣＤ３抗体、Ｃｙｔｏｘｉｎ、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および放射線が含まれるが、これらに限定されない。実施形態では、自己抗原を認識し、結果として生じる炎症応答を開始することができる不適切なメモリーＴ細胞を枯渇させた後に、外部で増殖させた自己Ｔ細胞を対象に再投与して、対象の免疫系を再構成することができる。
実施形態では、患者の血液由来のＴｒｅｇ細胞を、増殖させてもよい。
これらの増殖させたＴｒｅｇ細胞は、免疫枯渇後に最小限の残りの免疫反応を抑制するため、または免疫枯渇を受けていない対象においてのいずれかで、不適切な免疫反応を抑制するために患者に再投与され得る。
過剰増殖性障害（がん等）を治療するための方法もまた、本明細書で提供される。実施形態では、Ｔｒｅｇ活性の増加は、腫瘍抗原に対する不良な免疫応答をもたらし、免疫機能不全に寄与し得る。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の集団の増加が、肺がん、膵臓がん、乳がん、肝臓がん、および皮膚がん患者において、血液または腫瘍自体のいずれかで見出されているＷｏｏ ＥＹ，ｅｔ ａｌ．；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ２００２；１６８：４２７２−６．、Ｗｏｌｆ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２００３；９：６０６−１２．、Ｌｉｙａｎａｇｅ ＵＫ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；１６９：２７５６−６１．、Ｖｉｇｕｉｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ２００４；１７３：１４４４−５３．、Ｏｒｍａｎｄｙ ＬＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２００５；６５：２４５７−６４．）。
実施形態では、腫瘍抗原、または過剰増殖性障害抗原もしくは過剰増殖性障害に関連する抗原に特異的なＴ細胞を、本明細書に開示される方法または組成物を使用して増殖させる。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。
実施形態では、治療され得るがんには、血管形成されていない腫瘍、またはまだ実質的に血管形成されていない腫瘍、および血管形成された腫瘍が含まれる。実施形態では、がんは、非固形腫瘍（血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫等）を含んでも、固形腫瘍を含んでもよい。治療されるがんの種類には、がん腫、芽細胞腫、および肉腫だけでなく、特定の白血病またはリンパ系腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば、肉腫、がん腫、および黒色腫も含まれるが、これらに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんも含まれる。これらの中でもとりわけ、皮膚がん、脳がんおよび他の中枢神経系がん、頭がん、頸部がん、筋肉／肉腫がん、骨がん、肺がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、結腸がん、直腸がん、子宮がん、子宮頸がん、膣がん、外陰部がん、陰茎がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、膀胱がん、もしくは甲状腺がん、または膠芽腫を含むがんである。
血液のがんは、血液または骨髄のがんである。血液の（血行性の）がんの非限定的な例には、急性白血病（急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病等）、慢性白血病（慢性骨髄球性（果粒球）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病等）を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性および高悪性度の形態）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高γグロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、ならびに脊髄形成異常症が含まれる。
固形腫瘍は、通常、嚢胞または液体領域を含有しない異常な腫瘤である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。異なる種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類（肉腫、がん腫、およびリンパ腫等）から名付けられる。肉腫およびがん腫等の固形腫瘍の非限定的な例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、リンパ系腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、甲状腺髄様がん、甲状腺乳頭がん、褐色細胞腫脂腺がん、乳頭部がん、乳頭状腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、ヘパトーマ、胆管がん、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱がん、黒色腫、ならびにＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合膠腫等）、膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られている）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン頭蓋咽頭腫（Ｓｃｈｗａｎｎｏｍａ ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽腫、網膜芽細胞腫、ならびに脳転移等）が含まれる。
実施形態では、増殖させたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現を通して腫瘍細胞上に発現される抗原を標的とするように、Ｔ細胞を遺伝子改変させる。実施形態では、ＣＡＲを発現するＴ細胞を、増殖させる。ＣＡＲは、ヒト白血球抗原から独立した様式で、細胞表面抗原を認識するように設計された抗原受容体である。実施形態では、免疫細胞を、患者の血液または他の組織から収集してもよい。実施形態では、Ｔ細胞は、それらの表面上にＣＡＲを発現するように、下記のように操作され、これにより、それらが特異的抗原（例えば、腫瘍抗原）を認識することが可能になる。実施形態では、その後これらのＣＡＲ Ｔ細胞を、本発明の方法によって増殖させ、患者に注入してもよい。実施形態では、Ｔ細胞は、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、５×１０8、１×１０9、５×１０9、１×１０10、５×１０10、１×１０11、５×１０11、または１×１０12個の細胞で対象に投与される。実施形態では、患者への注入後、Ｔ細胞は、増殖およびＣＡＲの発現を続け、これが、ＣＡＲが認識するように操作されている特異的抗原を抱える細胞に対する免疫応答の開始を可能にする。
実施形態では、ＣＡＲを発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）が提供され、ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗腫瘍特性を呈する。実施形態では、ＣＡＲは、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ）の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように操作される。実施形態では、ＣＡＲは、Ｔ細胞内で発現されたとき、抗原結合特異性に基づいて、抗原認識の方向を変えることができる。
実施形態では、ＣＡＲの抗原結合部分は、別様には抗原結合部分と称される標的特異的結合エレメントを含む。実施形態では、部分の選択は、標的細胞の表面を定義するリガンドの種類および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上で細胞表面マーカーとして機能するリガンドを認識するように選択されてもよい。したがって、ＣＡＲの抗原部分ドメインは、例えば、ウイルス、細菌、および寄生虫感染症、自己免疫性疾患、ならびにがん細胞に関連するものを含み得る。
実施形態では、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドまたはその部分をコードする核酸をプロモーターに結合させ、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、複製および組み込み真核生物に好適であり得る。実施形態では、クローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の制御に有用なプロモーターを含有する。
実施形態では、Ｔ細胞は、標準的遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫化および遺伝子療法に使用することができる。遺伝子送達のための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照されたい。実施形態では、遺伝子療法ベクターが提供される。
実施形態では、核酸をクローニングして、いくつかの種類のベクターにすることができる。例えば、核酸をクローニングして、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにすることができる。特定の目的のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが含まれる。
実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物体内に複製機能の起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択可能マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、および米国特許第６，３２６，１９３号）。
いくつかのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞内への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための好都合なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、ベクター内に挿入され、当該技術分野で既知の技術を使用して、レトロウイルス粒子内にパッケージ化され得る。その後、組み換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達してもよい。いくつかのレトロウイルス系は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかのアデノウイルスベクターは、当該技術分野で既知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
実施形態では、追加のプロモーターエレメント（例えば、エンハンサー）が、転写開始の頻度を制御する。実施形態では、これらは、開始部位の３０〜１１０塩基対上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、近年、開始部位の下流にも機能エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隙は、しばしば融通が利くため、エレメントが反転または互いに対して移動したときにプロモーター機能が保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隙は、活性が低下し始める前に、５０塩基対離れるまで増加され得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化させるように協働してまたは独立して機能し得るようである。ＣＡＲ Ｔ細胞を作製する方法は、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第８，９０６，６８２号を参照されたい）。
Ｔ細胞がＣＡＲ Ｔ細胞である実施形態では、本発明の抗原結合部分の選択は、治療されるがんの特定の種類に依存する。腫瘍抗原は、当該技術分野で既知であり、例えば、膠腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、β−ヒト慢性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵＬ ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビングおよびテロメラーゼ（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ａｎｄ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）、前立腺がん腫腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、およびメソセリンが含まれる。
実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子には、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、およびＧＰ１００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）等の組織特異的抗原が含まれるが、これらに限定されない。他の標的分子は、がん遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２等の形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）等のがん胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的免疫グロブリンは、個々の腫瘍に固有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、λ／κ軽鎖等のＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原に対する他の候補である。
実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは、腫瘍細胞に固有であり、体内の他の細胞上に発生しない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に固有ではなく、代わりに、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導することができない条件下で、正常な細胞上にも発現する。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で発生し得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟で、応答することができない場合、胎児発生の間に正常な細胞上に発現される抗原であり得るか、またはそれらは、通常、極めて低いレベルで正常な細胞上に存在するが、大幅により高いレベルで腫瘍細胞上に発現される抗原であり得る。
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例には、以下、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２等の分化抗原、およびＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５等の腫瘍特異的多系譜抗原；ＣＥＡ等の過剰発現胎児性抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ等の過剰発現発がん遺伝子および変異腫瘍抑制遺伝子；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ等の染色体転座から生じた固有腫瘍抗原；ならびにエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７等のウイルス抗原が含まれる。他のラージタンパク質ベース抗原には、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ １９−９、ＣＡ ７２−４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、βカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ １５、ｐ １６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２４、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５−３＼ＣＡ ２７／２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｃ２５０、ＧＡ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０、ＭＡＣ−２結合タンパク質＼サイクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡｌ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、および他のものが含まれる。
感染性疾患を治療する方法もまた、本明細書で提供される。感染性疾患に対する免疫応答には、抗病原体と抗炎症応答とのバランスが関与している。Ｔ細胞は、この複雑なバランスに大いに関与している。実施形態では、Ｔ細胞応答を誘発することができる感染性病原体は、細菌、ウイルス、原虫、寄生虫、または真菌であり得る。Ｔｒｅｇ細胞は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｌｕｎｄｇｒｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ２００３；７１：１７５５−６２．）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（Ｃａｂｒｅｒａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２００４；４０：１０６２−７１．、Ｓｔｏｏｐ ＪＮ，ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２００５；４１：７７１−８．、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ２００３；３８：１４３７−４８．）による感染症の慢性化への寄与に関連付けられている。実施形態では、特定のＴ細胞亜集団の増加は、メモリーＴ細胞応答を不適切に抑制することによって、感染症の延長性質に寄与し得る。実施形態では、本明細書で提供される組成物は、特定のＴ細胞亜集団を特異的に増殖させるために、および感染性疾患の治療のために利用される。
実施形態では、感染性疾患は、病原体との直接接触によって引き起こされ、ヒトからヒトへ、動物からヒトへ、または母から胎児へと伝播する。
実施形態では、感染性疾患は、間接的接触を通して、例えば、ドアのハンドル、テーブル、カウンター、または蛇口のハンドル等の感染した表面との接触から伝播する。実施形態では、感染性疾患は、虫刺されまたは食物汚染を介して伝播する。ＨＩＶまたはＡＩＤＳ等の特定の自己免疫性障害、およびいくつかのがんは、感染性疾患に対する易罹患性を増加させ得る。免疫系を抑制する特定の治療レジメンもまた、感染性疾患に対する易罹患性を増強し得る。例示的な感染性疾患には、痘瘡、マラリア、結核、発疹チフス、ペスト、ジフテリア、腸チフス、コレラ、赤痢、肺炎が含まれるが、これらに限定されない。
実施形態では、Ｔ細胞の増殖を、感染性疾患状態の治療において使用することができる。実施形態では、感染症に苦しむ患者は、感染性作用物質に対して十分な免疫を有しない。実施形態では、本明細書で提供される方法は、特定の感染性作用物質に対する免疫を有するドナーから異種Ｔメモリー細胞を増殖させるために使用され、養子Ｔ細胞移入において利用される。実施形態では、その後、感染性作用物質を経験したドナー由来の外部で増殖させたＴ細胞を、その感染症に感染した患者に注入することができる。実施形態では、Ｔ細胞は、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、５×１０8、１×１０9、５×１０9、１×１０10、５×１０10、１×１０11、５×１０11、または１×１０12個の細胞で対象に投与される。実施形態では、感染性抗原コンピテントドナーメモリーＴ細胞は、患者における自己免疫応答の開始を補助する。
実施形態では、感染性疾患の治療は、それぞれ再注入または養子細胞移入のための自己または異種Ｔｈ１７細胞の増殖を含む。実施形態では、患者から単離された血液または組織由来のＴ細胞を、外部で増殖させてもよい。実施形態では、その後、これらの増殖させたＴ細胞を患者に注入して、Ｂ細胞が特定の感染性抗原（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ Ｍ−タンパク質、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｐｉｌｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉリポタンパク質ＶｉｓＥ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ多糖類抗原、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓガラクトマンナン、またはＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓリポ多糖類）に対する抗体を分泌するような誘導を補助することができる。実施形態では、Ｔ細胞は、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０8、５×１０8、１×１０9、５×１０9、１×１０10、５×１０10、１×１０11、５×１０11、または１×１０12個の細胞で対象に投与される。
既存の治療が、上記に列挙される疾患状態の多くに対して推奨される場合がある。本明細書に開示される方法および組成物を使用して増殖させたＴ細胞亜集団は、場合によっては、唯一の補充療法として、または他の既知の療法と併せて使用してもよい。Ｔ細胞療法は、他の療法の投与前、それと同時、またはその後に投与され得る。
実施形態では、本明細書で提供される方法をワクチンとともに利用して、抗原の反応性を増強し、インビボ効果を増強する。実施形態では、（例えば、Ｔ細胞を含む）組成物は、インビボでＴ細胞、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、および／またはＩＬ−１５を増強する組成物と併せて患者に投与される。本明細書で提供される方法に従って増殖させたＴ細胞は、目的の所望の核酸配列を運び、がん、疾患、または感染症の部位に潜在的にホーミングすることによって、上記の遺伝子療法のビヒクルとして機能し得る。したがって、本明細書で提供される方法によって増殖させた細胞は、ワクチン、１つ以上のサイトカイン、１つ以上の治療抗体等と併せて患者に送達することができる。より頑強なＴ細胞集団によって利益を得るであろう実質的にあらゆる療法を、本明細書で提供される組成物と併せて使用することができる。
細胞産生およびワクチン
本明細書の他の箇所に示されるように、シクロデキストリンおよび１つ以上の脂質を含有する培養培地中で細胞（例えば、ヒト細胞、ヒト二倍体細胞、霊長類二倍体細胞、ウイルス産生に有用な細胞、Ｔ細胞等）を培養するための組成物および方法が本明細書で提供される。そのような細胞を使用して、タンパク質、核酸分子、ならびにウイルスおよびＶＬＰ等の組み立て材料等の産物を産生することができる。
細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物等の動物細胞培養物）は、組み換えタンパク質産生の発現に使用することができる。典型的には、動物または哺乳動物細胞等の細胞は、大量の特定のタンパク質、より具体的には目的の糖タンパク質を培養培地に発現および分泌するか、または発現および分泌するように遺伝子操作することができる。宿主細胞によって産生される糖タンパク質は、宿主細胞に対して内因性または相同であり得ることが理解されるであろう。あるいは、かつ通常、糖タンパク質は、宿主細胞に対して異種、すなわち、外来性である場合があり、例えば、ヒト糖タンパク質は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞によって産生および分泌され得る。適切にグリコシル化された組み換えタンパク質産物は、治療製品および予防製品として医学的および臨床的にますます重要である。生物学的産生の所望の目標は、高い産物品質（産生される糖タンパク質のシアル酸含有量等によって決定され得る）とともに、最終糖タンパク質産物の濃度の増加を同時に達成することができる、信頼性が高く、経済的で、かつ効率的な細胞培養プロセスの開発である。したがって、細胞の培養およびタンパク質（例えば、組み換えタンパク質）の産生のための組成物および方法が本明細書で提供される。
一旦タンパク質産生のための細胞またはクローンを特定した後、培地または補助剤の成分の調整が必要である可能性があり、加えて、細胞および／またはタンパク質の力価を増加させるため、および／またはタンパク質品質（グリコシル化レベル）を改善するための、様々なプロセスパラメータの操作が必要である可能性がある。パラメータ操作の例には、以下、大規模な培養容器の使用；インキュベーション温度、溶存酸素濃度、ｐＨ、温度シフト等の培養条件の変更が含まれ得る。加えて、実行時間の延長の進歩により、高いタンパク質品質を維持しながら、最終産物濃度を増加させることができる。
培養培地中に発現されるタンパク質または糖タンパク質の凝集体は、バイオ製造プロセス中のいずれの段階でも生じる可能性がある。細胞培養では、分泌されたタンパク質は、タンパク質の安定性に好ましくない条件に曝露される場合があるが、しかし、多くの場合、多量のタンパク質の蓄積は、折り畳まれていないタンパク質分子の相互作用、または適切な折り畳みを担う分子シャペロンによる新生ペプチド鎖の非効率的な認識のいずれかにより、細胞内凝集につながる可能性がある。そのような凝集体は、投与時に患者における有害な副作用につながる可能性があるため、分子量がより高い種を除去するための高価な下流処理ステップが考案されている。凝集のレベルを低減するための１つのアプローチは、重要なプロセスパラメータを慎重に調整し、凝集を破壊する細胞培養添加剤、例えば、３１℃への温度シフト、４２０ｍＯｓｍ／ｋｇ超の浸透圧、１００ｒｐｍでの撹拌、および０．０４％（ｗ／ｖ）の消泡剤を特定することである（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１８Ｍａｙ；１１５（５）：１１７３−１１８５）。
培養物中の細胞片および死細胞の内容物の存在は、下流のタンパク質最終産物の単離および／または精製に悪影響を与える可能性がある。培養物中で細胞をより長期間生存可能にすると、細胞タンパク質および酵素、例えば、細胞プロテアーゼおよびシアリダーゼによる培養培地の汚染の低減が同時にもたらされる可能性があり、これは、糖タンパク質品質の劣化および最終的な低減に寄与する。下流のタンパク質精製の懸念は、培養物中で高い細胞生存率を維持するさらに別の理由であり得る。
本明細書で提供される組成物および方法を使用する細胞培養物は、ワクチンの産生に使用することができる。ウイルス産生に有用な細胞には、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＫＭＢ−１７、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１等のヒト二倍体細胞、およびＶＥＲＯ（アフリカミドリザル腎臓）またはＭＤＣＫ（メイディン・ダービー・イヌ腎臓）等の非ヒト二倍体細胞が含まれる。ｓｆ９細胞等の昆虫細胞もまた、本明細書で提供される組成物および方法を使用して成長させることができる。さらに、昆虫細胞はまた、例えば、組み換えタンパク質およびウイルスの産生にも使用することができる。
ワクチンに好適な細胞株（例えば、ウイルス産生、ＶＬＰ産生等）は一般に、哺乳動物起源のもの（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞）、ネコ、およびげっ歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞等のハムスター細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞））であるが、非哺乳動物起源のもの（例えば、ニワトリ細胞、昆虫細胞（ｓｆ９細胞等）等）であってもよい。
上記の細胞培養培地および／または補助剤組成物は、ウイルスに感染し得る細胞の培養に使用することができる。細胞にウイルスを感染させるには、上記の補助剤ありまたはなしの好適な培地を、数日間にわたって細胞に添加する。ウイルス核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のトランスフェクションは、細胞のコンフルエントまたはコンフルエントに近い成長で行ってもよく、核酸を含有するトランスフェクション培地を、細胞に直接添加してもよい。いくつかの方法では、数時間後、例えば、３７℃での１８時間のインキュベーション後に、培地を交換する。成長に血清が使用される条件では、血清含有培地を添加して、トランスフェクションを停止させてもよい。トランスフェクションの約８日後、（ウイルスを含有する）細胞上清を収集して、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を採取することができる。
ワクチン産生のための細胞の大規模な産物を調製する前に、指標細胞株に対する細胞変性効果の検出を通して、細胞を、ｉ）抗ウイルス剤、ｉｉ）外来性作用物質について試験してもよい。
ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはワクチンの一部を形成するウイルス断片のワクチン産生のための大量の産物を産生するために、ほとんどが静置方法である培養皿、ローラーボトル、チューブ、特殊なガラスもしくはプラスチック製のルー瓶で、または製造業者の指示に従ってマイクロキャリアビーズで、細胞を増殖させてもよい。細胞は、半連続的に培養することができる（例えば、有限回数継代することができる二倍体細胞、例えば、ＨＥＫ（ヒト胚腎臓）細胞、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８細胞）か、またはそれらは、連続的に培養することができる（例えば、不死化されており、無制限に継代することができる形質転換細胞株、例えば、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、Ｈｅｐ−２、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＢＧＭ等）。
有限寿命の半連続細胞株は、通常、二倍体であり、ある程度の分化を維持する。そのような細胞株が、約３０周期の分裂後に老化するという事実は、そのような細胞株を長期間維持するための親株常用バンクの系を確立することが不可欠であることを意味する。
連続細胞株は、腫瘍細胞に形質転換されているため、無制限に増殖させることができる。腫瘍細胞株は、多くの場合、実際の臨床腫瘍に由来するが、ウイルスがん遺伝子を使用して、または化学的処理によって、形質転換を誘導することもできる。形質転換された細胞株は、ほぼ無制限の利用可能性があるという利点を呈するが、元のインビボ特徴をほとんど保持していないという欠点も呈する。
細胞は、細胞の成長に好適な培養条件下で増殖させ、生存率を維持するために、例えば、ほとんどの細胞について３７℃、５％のＣＯ2で増殖させてもよい。好ましくは０．０１のＭＯＩを得るために、細胞にウイルスを接種しても、細胞をウイルスに感染させてもよい。場合によっては、培地または補助剤のそれ以上の交換なしで、接種を続けてもよい。
増殖後に存在する細胞の数は、手動血球計の使用等の標準的計数技術を使用して、または細胞計数機器の使用によって、決定することができる。ウイルス力価もまた、プラークアッセイと併せた段階希釈によって測定することができる。ウイルス力価について正しいクローンが得られたかどうかを決定するために、ウイルス核酸を抽出し、配列決定してもよい。
ウイルスに感染させて、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生することができる細胞（例えば、ヒト細胞、ヒト二倍体細胞、霊長類二倍体細胞、ウイルス産生に有用な細胞、Ｔ細胞等）を成長させるための方法が本明細書で提供される。そのような方法には、二倍体細胞集団を培養するための方法が含まれ得る。ステップには、細胞を、細胞の成長、細胞の生存細胞密度、ウイルスに感染した細胞のウイルス力価、またはそれらの組み合わせを増加させる、シクロデキストリン−脂質を含む培地、またはシクロデキストリン−脂質を含む補助剤と接触させることが含まれる。これにより培養された細胞を使用して、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはそれらのウイルス断片を産生することができる。あるいは、細胞をウイルスに感染させても、細胞にウイルス由来の核酸をトランスフェクトしてもよい。
上記の感染した細胞から産生されるウイルスは、動物ウイルス、植物ウイルス、またはバクテリオファージであり得る。これらのウイルスには、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、風疹、麻疹、流行性耳下腺炎、Ａ型肝炎、アデノウイルス、ポリオ、ロタウイルス、ライノウイルス、痘瘡、水痘、黄熱病、パピローマウイルス、エボラウイルス、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ミクソウイルス、パラミクソウイルス、エンテロウイルス、呼吸器多核体ウイルス、狂犬病または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびデング熱ウイルスが含まれ得るが、これらに限定されず、かつ／またはウイルス粒子は、パルボウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、バクテリオファージ等に由来し得る。
ウイルストランスフェクション、またはワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、ウイルス断片の産生に使用される細胞の種類は、動物細胞であり得る。動物細胞は、ウシ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞であり得る。具体的には、動物の細胞は、二倍体細胞であり得る。または、細胞は、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＭＲＣ−９、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝臓、Ｕ９３７、ＭＤＣＫ、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ、および前述の細胞のクローンからなる群から選択され得る。
細胞は、連続培養または半連続培養で培養することができる。さらに、細胞は、付着培養物として、またはマイクロキャリア上で培養してもよい。各細胞型は、特定の培地および／または基本培地の要件を有し得る。適切な基本培地の決定は、代謝分析および／または実験計画法（ＤＯＥ）の理論的根拠を含むがこれらに限定されない技術を使用して、当該技術分野で日常的に行われる。例えば、二倍体細胞を培養するための無血清細胞培養培地を作製する典型的な方法は、（ｉ）基本培地と、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤、または（ｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤のいずれかとを混合することを含み得る。補助剤は、成長因子をさらに含み得る。上記のＣＤ（シクロデキストリン−脂質）含有補助剤とともに、細胞は、ウイルストランスフェクション、またはワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、ウイルス断片産生のために無血清で培養することができる。
例えば、二倍体細胞を培養するための細胞培地の補充のための系が本明細書で提供され、（ｉ）１つ以上の異なるシクロデキストリンであって、各シクロデキストリンが、別個の容器内にある、シクロデキストリンと、（ｉｉ）２つ以上の異なる脂肪酸であって、各脂肪酸が、別個の容器内にある、脂肪酸とを含み得る。
細胞または細胞株を培養するためのキットであって、（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む無血清細胞培養培地を含む、キットが本明細書で提供される。他のキットは、（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤を含み得る。さらに別のキットは、（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤を含み得る。本明細書で提供されるキットは、ウイルストランスフェクション、またはワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、ウイルス断片産生の調製に使用される細胞の無血清培養に使用することができる。これらのキットは、動物細胞の培養に使用することができ、動物細胞は、ウシ細胞、ネコ細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、霊長類細胞、もしくはヒト細胞であってもよいか、または動物細胞は、二倍体細胞であるか、または細胞は、ＭＲＣ−５細胞、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ細胞、ＭＲＣ−９細胞、ＷＩ−３８細胞、２ＢＳ細胞、Ｗａｌｖａｘ−２細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＩＭＲ−９１細胞、ＫＭＢ−１７細胞、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝細胞、Ｕ９３７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ細胞、およびこれらの細胞の任意のクローンからなる群から選択される。
さらに、細胞を、培養培地中で培養し、洗浄し、その後培養培地と再接触させてもよい。その後、ウイルス、ＶＬＰ、および／またはウイルス成分は、培養培地から、直接または細胞の溶解によってのいずれかで得ることができる。細胞を、ウイルスまたは１つ以上のウイルス成分をコードする核酸分子と接触させる場合、細胞を、洗浄ステップ、または洗浄ステップと培地との再接触との間を含む任意のステップで、ウイルスまたは核酸分子と接触させてもよい。加えて、細胞は、ウイルスまたはウイルス成分をコードするそれらのゲノムに組み込まれた核酸とともに使用してもよい。
ワクチンは、上記に明記されるような方法によって、または洗浄ステップが不要な同様の方法によって産生される。ワクチン成分が産生細胞のゲノムに組み込まれた核酸によってコードされている場合、および核酸（ウイルスを含む）が培養物中の細胞によって取り込まれ得る場合、洗浄ステップは一般に、必要とされない。
本明細書に明記されるように培養された細胞は、（例えば、ウイルス接種による）核酸取り込み前に第１の培養培地中で、ならびに核酸取り込み時および／またはその後に第２の培養培地中で培養されてもよい。細胞による（例えば、ウイルス感染による）核酸の取り込み時、細胞は、第１の培地と同じであるか、または異なる培地であってもよい、第２の細胞培地中で培養されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、第１の細胞培養培地中で培養してもよく、その後第１の細胞培養培地を除去し、細胞を、（例えば、ＰＢＳ等の水性緩衝液で）任意にすすいでもよく、第２の培養培地を、細胞に添加してもよい。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、細胞による取り込みのための細胞による取り込みのための核酸（例えば、ウイルス）を含有し得る。いくつかの実施形態では、第１の培養培地および第２の培養培地は、同じ培養培地である（例えば、同じ組成を有するが、これは、いくつかの実施形態では、必ずしも同じ物理的培地ではない）。他の実施形態では、第１の培地および第２の培地は、異なる（例えば、異なる組成を有する）。
ウイルス産生に有用な細胞には、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＫＭＢ−１７、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１等のヒト二倍体細胞、およびＶＥＲＯ（アフリカミドリザル腎臓）またはＭＤＣＫ（メイディン・ダービー・イヌ腎臓）等の非ヒト二倍体細胞が含まれる。ｓｆ９細胞等の昆虫細胞もまた、本明細書で提供される組成物および方法を使用して成長させることができる。さらに、昆虫細胞はまた、ウイルスの産生にも使用することができる。
本明細書に明記される方法および組成物の使用によって産生され得るウイルスには、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、風疹、麻疹、ＭＭＲ、Ａ型肝炎、アデノウイルス、ポリオ、ロタウイルス、狂犬病または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびデングウイルスが含まれる。
本明細書で提供される組成物および方法はまた、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生にも使用することができる。例えば、本明細書に明記されるように産生されるＶＬＰが本明細書でさらに提供される。ＶＬＰは、Ｂ型肝炎ウイルスに由来し、小ＨＢＶ由来表面抗原（ＨＢｓＡｇ）で構成され得る。ＶＬＰは、パルボウイルス科（例えば、アデノ随伴ウイルス）、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、およびバクテリオファージ（例えば、Ｑβ、ＡＰ２０５）を含む、多種多様なウイルス科の成分から産生され得る。
本明細書の他の箇所に述べられるように、本明細書で提供される組成物および方法はまた、ワクチンの産生にも使用することができる。産生され得るワクチンのカテゴリには、不活化ワクチン、弱毒化ワクチン、トキソイドワクチン、サブユニットワクチン、および結合型ワクチンが含まれる。不活化ワクチンは、疾患を引き起こす作用物質またはそれに関連する作用物質を、（例えば、化学的、熱、または放射線処理によって）疾患誘導不能にしたワクチンである。弱毒化ワクチンは一般に、（１）それらの病原性が破壊されているか、または（２）密接に関連するが、危険性がより低い生物体を使用して、広範囲の免疫応答を産生させる、生作用物質または複製可能な作用物質を含有する。ほとんどの弱毒化ワクチンの性質は、ウイルス性であるが、いくつかは、細菌性である。トキソイドワクチンは、微生物ではなくむしろ疾病を引き起こす不活性化された毒性化合物から作製される。全てのトキソイドが、ウイルスまたは微生物のものであるわけではない。例えば、Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｔｒｏｘ（すなわち、ニシダイヤガラガラヘビ）トキソイドは、ガラガラヘビの咬傷に対する個体のワクチン接種に使用される。サブユニットワクチンは、防御免疫応答を誘発することができる疾患を引き起こす作用物質の抗原の断片で構成される。この一例は、このウイルスの表面タンパク質のみで構成された、Ｂ型肝炎ウイルスに対するサブユニットワクチンである。
本明細書で提供される細胞培養培地および／または補助剤組成物は、上記の細胞のいずれかの培養に好適であり得る。これらの細胞培養培地および／または補助剤組成物は、多くの場合、シクロデキストリンベースの脂質組成物を含む。本明細書で提供される培地組成物は、少なくとも２種類のもの、（ｉ）細胞培養成分、シクロデキストリン、および少なくとも１つの脂質を含むもの、または（ｉｉ）基本細胞培養培地、およびシクロデキストリンベースの脂質を含む別個の補助剤を含むものであり得る。例えば、シクロデキストリンベースの脂質補助剤は、リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびシクロデキストリンを含み得る。
いくつかの例示的なシクロデキストリンベースの脂質補助剤は、本出願の実施例１の表１、２、および３に記載されており、また、それぞれＣＤ（シクロデキストリン−脂質）補助剤１、２、および３と称されることもある。加えて、Ｄｉｐｌｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔと呼ばれるシクロデキストリン−脂質含有補助剤が、市販されている（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３９６９５ＳＡ）。したがって、培地組成物は、（ｉ）好適な基本細胞培養培地（市販の（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３９６９３ＤＫ等）、および（ｉｉ）好適な希釈度の表１、表２、表３（実施例１）に記載の補助剤を含み得る。基本培地は、タンパク質、ビタミン、ミネラル、およびアミノ酸を含有してもよく、必要に応じてウシ胎児血清で富化して、成長を可能にしてもよい。しかしながら、多くの場合、基本培地は、上記のもの等のシクロデキストリンベースの脂質を含む補助剤（上記または実施例１の表１、２、および３に記載のもの、二倍体成長補助剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３９６９５ＳＡ）を含む）等の無血清補助剤と組み合わせ、したがって無血清条件下での細胞成長を可能にしてもよい。最適な成長のために、ＣＤ補助剤またはＤｉｐｌｏｉｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔは、培養される細胞株に応じて適切に希釈してもよい。例えば、特定の例では、ＭＲＣ−５二倍体細胞を、１：５００または１：２０００の希釈度のＣＤ補助剤１またはＣＤ補助剤２（実施例１を参照されたい）を有する二倍体基本ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３９６９３ＤＫ）中で成長させた（本出願の図５１および表４５も参照されたい）。
ウイルスまたはワクチン等を産生する細胞の培養に使用される細胞培養補助剤は、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、またはγ−シクロデキストリンであるシクロデキストリンを含んでもよい。一実施形態では、シクロデキストリンは、メチル化されていてもよい。さらなる実施形態では、シクロデキストリンは、メチル−β−シクロデキストリンであってもよい。特定の実施形態では、細胞培養培地または補助剤は、約１０μＭ〜約２００μＭであるレベルのシクロデキストリンを含む。
ウイルスまたはワクチン等を産生する細胞の培養に使用される細胞培養補助剤は、コレステロールを含んでもよく、コレステロールは、合成コレステロールであってもよいか、または約５μＭ〜約３０μＭのレベルで存在してもよい。一実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、多価不飽和オメガ−６脂肪酸である。さらなる実施形態では、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸は、アラキドン酸である。特定の実施形態では、多価不飽和オメガ−６脂肪酸は、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸からなる群から選択される。
キットおよび培地補助剤系
一態様では、Ｔ細胞培地の補充のための系であって、（ｉ）２つ以上の異なるシクロデキストリンであって、各シクロデキストリンが、別個の容器内にある、シクロデキストリンと、（ｉｉ）２つ以上の異なる脂質（例えば、脂肪酸）であって、各脂質が、別個の容器内にある、脂肪酸とを含む、系が提供される。別の態様では、Ｔ細胞培地の補充のための系であって、（ｉ）２つ以上の異なるシクロデキストリンの組み合わせであって、各シクロデキストリンが、別個の容器内にある、シクロデキストリン、および２つ以上の異なる脂質（例えば、脂肪酸）であって、各脂質が、別個の容器内にある、脂肪酸と、（ｉｉ）２−ＤＧとを含む、系が提供される。さらに別の態様では、２−ＤＧを含む、Ｔ細胞培地の補充のための系が提供される。実施形態では、２つ以上の異なるシクロデキストリンは、本明細書に開示されるシクロデキストリンの任意の組み合わせを含む。実施形態では、２つ以上の異なる脂質は、本明細書に開示される脂質（例えば、脂肪酸）の任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、無血清培地、シクロデキストリン、１つ以上の脂質、および／または２−ＤＧを含む、Ｔ細胞の培養のためのキットが本明細書で提供される。
キットはまた、洗浄ステップ、培養条件、および特異的Ｔ細胞亜集団を選択的に増殖させるために、単離されたＴ細胞を本明細書で提供される組成物とともにインキュベートする持続時間についての説明書等の、キットの使用についての書面での指示書も含み得る。
Ｔ細胞の混合集団の源の例
実施形態では、Ｔ細胞の混合集団の出発源は、対象から単離され得る血液（例えば、循環血液）である。実施形態では、循環血液は、１単位以上の血液から、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスから得ることができる。実施形態では、アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、および血小板を含む、リンパ球を含有する。Ｔ細胞は、血液単核細胞、骨髄、胸腺、組織バイオプシー、腫瘍、リンパ節組織、胃腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓組織、または任意の他のリンパ組織、および腫瘍を含む（がこれらに限定されない）いくつかの源から得ることができる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞株および自己または同種の源から得ることができる。Ｔ細胞はまた、異種の源、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびブタからも得ることができる。
実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ分離等の当業者に既知の任意の数の技術を使用して対象から収集された、単位の血液から得ることができる。Ｔ細胞は、対象の循環血液から単離されてもよい。実施形態では、血液は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって対象から得ることができる。実施形態では、アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、および血小板を含む、リンパ球を含有する。実施形態では、感作組成物への曝露ならびにその後の活性化および／または刺激の前に、Ｔ細胞の源は、対象から得られる。実施形態では、アフェレーシスによって収集した細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を、その後の処理ステップのために、適切な緩衝液または培地中に入れてもよい。本発明の実施形態では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、かつマグネシウムを欠いてもよいか、または全てではなくとも多くの二価カチオンを欠いてもよい。当業者であれば容易に理解するように、洗浄ステップは、製造業者の指示に従う、半自動「流水式」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞プロセッサであるＢａｘｔｅｒ）の使用等によって、当業者に既知の方法によって達成されてもよい。実施形態では、洗浄後、細胞を、例えば、無カルシウム（Ｃａ）無マグネシウム（Ｍｇ）ＰＢＳ等の様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁させてもよい。実施形態では、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁させてもよい。
実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球細胞を溶解または除去し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離によって単球を枯渇させることによって、末梢血液リンパ球から単離される。実施形態では、特異的なＴ細胞の亜集団は、正または負の選択技術によってさらに単離することができる。
実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋細胞について正に選択することができる。当業者に既知の任意の選択技術が、使用されてもよい。非限定的な一例は、フローサイトメトリー選別である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３ビーズとともにインキュベートすることによって単離することができる。非限定的な一例は、所望のＴ細胞の正の選択に十分な期間にわたる、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号１１１４１Ｄ）等の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８結合ビーズである。実施形態では、期間は、３０分間〜３６時間以上、およびそれらの間の全ての整数値の範囲である。実施形態では、期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。別の実施形態では、期間は、１０〜２４時間である。実施形態では、インキュベーション時間は、２４時間である。２４時間等のより長いインキュベーション時間は、細胞の産生量を増加させ得る。実施形態では、他の細胞型と比較して、Ｔ細胞がほとんど存在しないあらゆる状況において、より長いインキュベーション時間を使用して、Ｔ細胞を単離することができる。実施形態では、負の選択によるＴ細胞集団の富化は、負に選択された細胞に固有の表面マーカーに指向された抗体の組み合わせを用いて達成することができる。１つの可能性のある方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向されたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。実施形態では、増殖倍率は、ドナー細胞の可変性のために、出発材料に基づいて異なり得る。実施形態では、通常の出発密度は、約０．５×１０6個〜約１．５×１０6個であり得る。
実施形態では、Ｔ細胞亜集団は、１つ以上のマーカー（複数可）が存在するかまたは不在であるかに基づく選択によって生成され得る。例えば、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７負／低、および任意でＦＯＸＰ３＋である細胞の選択に基づいて、混合集団から得ることができる。実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＦＯＸＰ３−であり得る。この例では、選択は、１つ以上の定義可能な特徴に基づいて、細胞を「選ぶこと」を事実上指す。さらに、選択は、１つ以上の特徴を有する細胞（正）または１つ以上の特徴を有しない細胞（負）に関しての選択であり得るという点で、正または負であり得る。
Ｔｒｅｇ細胞に関して、例示の目的で、これらの細胞は、これらの細胞がＣＤ４および／またはＣＤ２５に結合する抗体が結合した表面（例えば、磁気ビーズ）に結合すること、ならびにＣＤ１２７に結合する抗体が結合した表面（例えば、磁気ビーズ）に非Ｔｒｅｇ細胞が結合することを通して、混合集団から得ることができる。特定の例として、ＣＤ３に結合する抗体が結合した磁気ビーズを使用して、ＣＤ３＋細胞を単離してもよい。一旦放出された後、得られたＣＤ３＋細胞を、ＣＤ４に結合する抗体が結合した磁気ビーズと接触させてもよい。その後、得られたＣＤ３＋、ＣＤ４＋細胞を、ＣＤ２５に結合する抗体が結合した磁気ビーズと接触させてもよい。その後、得られたＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞を、ＣＤ１２７に結合する抗体が結合した磁気ビーズと接触させてもよく、収集される細胞は、これらのビーズに結合しない細胞である。
実施形態では、複数の特徴を同時に使用して、Ｔ細胞亜集団（例えば、Ｔｒｅｇ細胞）を得てもよい。例えば、２つ以上の細胞表面マーカーに結合する抗体をそれに結合した状態で含有する表面もまた、使用することができる。特定の例として、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞は、混合集団から、ＣＤ４およびＣＤ２５に結合する抗体が結合した表面にこれらの細胞が結合することにより、得ることができる。複数の特徴の同時選択は、所望の細胞型（複数可）とともに「共精製」する望ましくない細胞型の数をもたらし得る。これは、上記の特定の実施例を使用して、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−およびＣＤ４−、ＣＤ２５＋である細胞が、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞に加えて得られ得るため、その通りである。
フローサイトメトリーは、所望の特徴に基づく細胞の分離に特に有用である。細胞は、目的の細胞に結合する分子（例えば、ＣＤ１２７に結合するＩＬ−７、ＣＤ２５に特異的な抗体等の天然リガンド）に関連する検出可能な標識に基づいて分離することができる。したがって、フローサイトメトリー系によって検出および／または分化され得る細胞成分に結合するリガンドを使用して、特定の特徴を有するＴ細胞を精製／単離してもよい。さらに、複数の特徴の存在または不在を、フローサイトメトリーによって同時に決定してもよい。
１つ以上のＴ細胞亜集団のメンバーを得るための方法であって、Ｔ細胞亜集団のメンバーが、特定の特徴によって特定され、これらの特徴に関して異なる細胞から分離される、方法が本発明に含まれる。本発明の方法で使用され得る特徴の例には、以下のタンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ２７８、ＣＤ３３５、ＣＣＲ７、Ｋ５６２Ｐ、Ｋ５６２ＣＤ１９、およびＦＯＸＰ３の存在または不在が含まれる。
以下の実施例は、本発明のいくらかの特定の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定は意図されない。
本明細書の実施形態は、以下の実施例および詳細なプロトコルによってさらに例示される。しかしながら、実施例は、単に実施形態を例示することが意図されており、本明細書の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての参考文献ならびに公開特許および特許出願の内容が、これによって参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１：実施例２〜４の方法論および結果
材料および方法
ＣＤ補助剤配合物：各１ＬのＣＤ補助剤について、０．５Ｌの製造等級の水を４度に予冷し、さらに０．５Ｌを８０度以上まで加熱した。合成コレステロールならびに粉末脂肪酸（該当する場合、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸）を熱水に添加し、最大１０分間混合した。混合している間に、３６ｇのメチル−β−シクロデキストリンを緩徐に添加し、各添加が、タンクの周囲に触れることなく、表面上でわずかに層になるようにした。タンクに覆いをして、最低６０分間高温を維持した。５４ｇのメチル−β−シクロデキストリンを以前に述べたように緩徐に添加し、覆いをし、最低３０分間混合した。気泡が消散するまで、混合速度を低減させた。予冷水を使用して、ＱＳおよび総産生体積（１Ｌ）をもたらし、温度が２５度未満に達するまで混合した。残りの脂質（該当する場合、アラキドン酸、リノレン酸、オレイン酸、およびパルミトレイン酸）を添加し、覆いをし、最低９０分間混合した。各ＣＤ補助剤を、１ＬのＳＴＥＲＩＣＵＰ（登録商標）フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＶＰＵ１１ＲＥ）を使用してフィルター滅菌し、４℃で保管した。
細胞培養物：Ｔ細胞の単離：正常なドナー由来の非特定化された凍結アフェレーシスバッグを、ＨｅｍａＣａｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１３４４Ｄ）を用いて、Ｔ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。
Ｔ細胞活性化および増殖：Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４１Ｄ）を用いて活性化し、４つの脂質補助剤のうちの１つを補充した、または対照として補助剤を有しない、コレステロールおよび遊離脂肪酸を含まない無血清培地中で培養した。５、７、１０、および１２日目にＴ細胞をＶｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで、ならびに１０日目に１×１０6ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。
表現型：初代ヒトＴ細胞を、ＣＤ補助剤のうちの１つまたは５％のヒトＡＢ血清を用いて、１０日間増殖させた。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を、磁気分離によって２×１０6個の細胞から除去した。ＣＤ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＣＤ０３２９）、ＣＤ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ａ１５８５８）、ＣＤ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＭＨＣＤ０８２８）、ＣＣＲ７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ａ１８３７０）、およびＣＤ６２Ｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＡ１−１９６１８）に対する抗体を用いて、表面染色を行った。連続ゲーティングを使用して、Ｔ細胞を、セントラルメモリー（ＴＣＭ：ＣＣＲ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋）、中間体（ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ＋）、およびエフェクターメモリー（ＴＥＭ：ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−）として特性評価した。ＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーターおよびＫａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で、フローサイトメトリー分析を行った。
サイトカインプロファイル：ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１３４４Ｄ）を用いて、正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４１Ｄ）を用いて活性化し、ＣＤ補助剤１（１：５００）補充したコレステロールおよび遊離脂肪酸を含まない無血清培地中、または５％のヒトＡＢ血清を補充した対照培地Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＢＥ０２−０５４Ｑ）中で培養した。５および７日目にＴ細胞をＶｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。１１日目にＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を培養物から磁気的に除去し、細胞を回転させて、条件培地を除去し、新鮮な培地中に一晩静置した。１００万個のＴ細胞を、１：１のビーズ対細胞比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１５１Ｄ）を用いて再刺激し、２４時間インキュベートした。Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）用Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ３５−Ｐｌｅｘ Ｐａｎｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＬＨＣ６００５Ｍ）を用いた分析のために、上清を収集し、処理した。ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を使用して、分析を行った。
結果
表１〜３は、細胞、例えば、Ｔ細胞、二倍体細胞内で配合および試験した３つのシクロデキストリンベースの補助剤をまとめたものである。簡潔には、コレステロールを熱水中に可溶化し、その後メチル−β−シクロデキストリンおよび脂肪酸を緩徐に添加した。外観が透明になるまで溶液を監視し、滅菌濾過した。ＣＤ補助剤１（表１）の配合は、ＣＤ補助剤２およびＣＤ補助剤３（それぞれ表２および３）で同じ脂肪酸：コレステロールのモル比を維持しながら変更した。ＣＤ補助剤２の配合物は、脂質濃縮物中の脂肪酸濃度（ｇ／Ｌ）に基づいている一方で、ＣＤ補助剤３の配合は、ウシ血清アルブミン中に典型的に見出される脂肪酸濃度（ｇ／Ｌ）に基づいている。既知組成の脂質濃縮物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１９０５−０３１）、略称「脂質濃縮物」。
図１〜６は、エマルジョンベースの脂質濃縮物を含有する無血清培地が、シクロデキストリンベースの補充と比較して、ヒトＴ細胞の増殖について最適以下であることを実証する一連のグラフである。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キットを用いて、正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化し、４つの脂質補助剤のうちの１つを補充したコレステロールおよび遊離脂肪酸を含まない無血清培地中で培養した。５、７、１０、および１２日目にＴ細胞をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで、ならびに１０日目に１×１０6ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。
図７〜１０は、５％のヒトＡＢ血清を含有する培地中で培養したＴ細胞と比較して、ＣＤ補助剤１、２、および３とともに培養したＴ細胞内のセントラルメモリーサブセットの保存の増加を実証する一連のグラフである。
細胞成長および生存率：Ｔ細胞の増殖を、累積集団倍加または経時的な累積生存Ｔ細胞（日数）として表す。結果は、少なくとも３つの独立した実験を代表するものである。表４〜９は、図１〜６に表示されるグラフ結果を定量化する。結果は、無血清培地中の選択された濃度のＣＤ補助剤１、２、および３を介した、シクロデキストリンベースの補充と比較して、脂質濃縮物（１：１００）が、（累積集団倍加として表される）最適以下のＴ細胞増殖を提供することを実証する（図１および２）。図３および４は、図１および２と同じ成長データを示すが、経時的な累積生存Ｔ細胞（日子）で表される。ＣＤ補助剤１、２、および３（１：５００）の性能の差は、細胞増殖を、１２日目までの累積集団倍加と比較した累積細胞数として表したときに明白である。図５および６は、ＣＤ補助剤１、２、および３（１：５００）が、脂質濃縮物、脂質補充なし、ならびに他の濃度のＣＤ補助剤１、２、および３と比較して、Ｔ細胞生存率の増加を維持することを描写する。
表現型：図７は、分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する。図８および表１０は、増殖前（０日目）の元のサブセット分布と比較したＣＤ４＋／ＣＤ８＋比の平均変化を描写する。図９および１０は、５％のヒトＡＢ血清ならびにＣＤ補助剤１、２、および３中で増殖させた、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞（それぞれ）の分化状態を描写する。結果は、５％のヒトＡＢ血清とともに培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＣＲ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋表現型を失い、ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−表現型を蓄積することを表し、これは、細胞ストレスおよび栄養欠乏を示す。あるいは、ＣＤ補助剤１、２、および３とともに培養したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−の蓄積を回避する。
サイトカインプロファイル：ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８で増殖させたＴ細胞は、典型的には、主要なＴｈ１様エフェクター機能を示す。ＩＦＮ−γは、Ｔｈ１免疫応答の重要なメディエーターである。図１１に描写されるように、結果は、ＣＤ補助剤１を含有する無血清培地中で培養したＴ細胞のサイトカインプロファイルが、５％のヒトＡＢ血清を含有する培地中で培養したＴ細胞のプロファイルよりも、わずかにより良好であるとは言わないまでも、それと同等であることを実証する。これは、ＭＩＰ−１αの増加、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、およびＩＬ−６の減少、ならびにＩＦＮ−γおよびＩＬ−２産生の変化がないことによって表される（図１１および表１１）。
実施例２：脂質を含有する無血清培地中でのＴ細胞の培養
脂質は、無血清培地中で成長させたＴ細胞の酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）のエネルギー源であるようであり、最適なＴ細胞の増殖に必要とされる。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キットで、３人の正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化した。細胞を、４つの脂質補助剤のうちの１つを補充した、または対照として脂質補充を有しない、コレステロールおよび遊離脂肪酸を含まない無血清培地中で培養した。５、７、１０、および１２日目にＴ細胞をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで、ならびに１０日目に１×１０6ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。Ｔ細胞の増殖を、累積集団倍加または経時的な累積生存Ｔ細胞のいずれかとして表した。図１〜４の結果は、無血清培地が、最適なＴ細胞増殖をもたらすのに定義された濃度での脂質補充を必要とすることを実証する。ＣＤ補助剤１、２、および３（１：５００）は、脂質濃縮物（１：１００）、他の濃度のＣＤ補助剤１、２、および３、ならびに脂質補充なしと比較して、最適なＴ細胞の増殖を提供する。結果は、少なくとも３つの独立した実験を代表するものである。
実施例３：ＣＤ補助剤１を含有する無血清培地によるＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの優先的な増殖
ＣＤ補助剤１を含有する無血清培地中でのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの優先的な増殖を、分析した。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キットで、３人の正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化した。細胞を、４つの脂質補助剤のうちの１つ、または対照として５％のヒトＡＢ血清を補充したコレステロールおよび遊離脂肪酸を含まない無血清培地中で培養した。５、７、および１０日にＴ細胞をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。Ｔ細胞の増殖を、累積集団倍加または経時的な累積生存Ｔ細胞のいずれかとして表した（図１〜６）。各条件からの２×１０6個の細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌに対する抗体で染色した。連続ゲーティングを使用して、Ｔ細胞を、セントラルメモリー（ＴＣＭ：ＣＣＲ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋）、中間体（ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ＋）、およびエフェクターメモリー（ＴＥＭ：ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−）として特性評価した（図７）。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓ分析機で実行した。図８の結果は、ＣＤ補助剤２、３、および５％のヒトＡＢ血清を含有する培地中での頻度と比較した場合の、ＣＤ補助剤１を含有する無血清培地中でのＣＤ８＋Ｔ細胞の優先的な増殖を実証する。結果は、少なくとも３つの独立した実験を代表するものである。
実施例４：ＣＤ補助剤１、２、および３を含有する無血清培地中で増殖させたＴ細胞の表現型
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キットで、３人の正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化した。細胞を、４つの脂質補助剤のうちの１つ、または対照として５％のヒトＡＢ血清を補充したコレステロールおよび遊離脂肪酸を含まない無血清培地中で培養した。５、７、および１０日にＴ細胞をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。Ｔ細胞の増殖を、累積集団倍加または経時的な累積生存Ｔ細胞のいずれかとして表した（図１〜６）。各条件からの２×１０6個の細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌに対する抗体で染色した。連続ゲーティングを使用して、Ｔ細胞を、セントラルメモリー（ＴＣＭ：ＣＣＲ７＋／ＣＤ６２Ｌ＋）、中間体（ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ＋）、およびエフェクターメモリー（ＴＥＭ：ＣＣＲ７−／ＣＤ６２Ｌ−）として特性評価した（図７）。フローサイトメトリー分析を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｌｉｏｓ分析機で実行した。図９は、ＣＤ補助剤１、２、および３対５％のヒトＡＢ血清を含有する無血清培地中で増殖させたＣＤ４＋Ｔ細胞の分化状態を描写する。図１０は、ＣＤ補助剤１、２、および３対５％のヒトＡＢ血清を含有する無血清培地中で増殖させたＣＤ８＋Ｔ細胞の分化状態を描写する。結果は、対照培地に対して、採取時のより高い頻度のＴＣＭおよび中間体サブセットによって定義される、ＣＤ補助剤１、２、および３を含有する無血清培地中で増殖させたＴ細胞のより好ましい表現型を実証する。結果は、少なくとも３つの独立した実験を代表するものである。
実施例５：ＣＤ補助剤１を含有する無血清培地対血清含有培地中でのサイトカインプロファイル
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８で増殖させたＴ細胞は、典型的には、主要なＴｈ１様エフェクター機能を示す。ＩＦＮ−γは、Ｔｈ１免疫応答の重要なメディエーターである。Ｔｈ１サイトカインプロファイルを、ＣＤ補助剤１を含有する無血清培地対血清含有培地中で成長させたＴ細胞間で比較した。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キットを用いて、正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化し、ＣＤ補助剤１（１：５００）を補充したコレステロールおよび遊離脂肪酸を含まない無血清培地中、または５％のヒトＡＢ血清を補充した対照培地Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＢＥ０２−０５４Ｑ）中で培養した。５および７日目にＴ細胞をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。１１日目にＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を培養物から除去し、細胞を回転させて、条件培地を除去し、新鮮な培地中に一晩静置した。１００万個のＴ細胞を、１：１のビーズ対細胞比でＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＣＤ３で再刺激し、２４時間インキュベートした。Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ３５−Ｐｌｅｘ Ｐａｎｅｌによる分析のために、上清を収集し、処理した。図１１および表１１に描写されるように、結果は、ＣＤ補助剤１を含有する無血清培地中で増殖させたＴ細胞が、対照血清含有培地と比較した場合に、ＩＦＮ−γ産生の障害なく、同様のサイトカイン産生プロファイルを示すことを示す。結果は、２つの独立した実験を代表するものである。
実施例６
材料／方法：
２−デオキシ−Ｄ−グルコースの調製：２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ、１６４．１６ｇ／ｍｏｌ）は、（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、カタログ番号１１１９８０−２５０）によって製造された。２−ＤＧ溶液を、１００ｍＭのストック濃度で滅菌濾過水中に調製し、その後各チューブ内１ｍＬの最終体積でＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内にアリコートした。
細胞培養：Ｔ細胞の分離：正常なドナー由来の非特定化された凍結アフェレーシスバッグを、ＨｅｍａＣａｒｅ Ｃｏｒｐ．（Ｖａｎ Ｎｕｙｓ，ＣＡ９１４０６）から入手した。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１３４４Ｄ）を用いて、正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。
Ｔ細胞活性化および増殖：Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４１Ｄ）を用いて活性化し、無血清培地、無動物起源培地中で培養した。５、７、１０、および１２日目にＴ細胞をＶｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で計数し、２−ＤＧ（０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、および４ｍＭ）ならびに５％のヒトＡＢ血清ありまたはなしで、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで、ならびに１０日目に１×１０6ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。
いくつかの研究のために、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞キットを使用した負の選択によって、ＰＢＭＣから単離した。ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞を、ＣＤ４５ＲＡナノビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した正の選択によって、富化Ｔ細胞から単離した。
表現型：初代ヒトＴ細胞を、２−ＤＧおよび５％のヒトＡＢ血清ありおよびなしで、１０日間増殖させた。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を、磁気分離によって２×１０6個の細胞から除去した。ＣＤ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＣＤ０３２９）、ＣＤ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ａ１５８５８）、ＣＤ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＭＨＣＤ０８２８）。ＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーターおよびＫａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で、フローサイトメトリー分析を行った。
サイトカインプロファイル：ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１３４４Ｄ）を用いて、正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４１Ｄ）を用いて活性化し、無血清かつ無動物起源培地または５％のヒトＡＢ血清を補充した対照培地Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＢＥ０２−０５４Ｑ）中で培養した。５、７、１０、および１２日目にＴ細胞をＶｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで、ならびに１０日目に１ｘ１０6ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。１０日目にＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を培養物から磁気的に除去し、細胞を回転させて、条件培地を除去し、新鮮な培地中に一晩静置した。１００万個のＴ細胞を、１：１のビーズ対細胞比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４１Ｄ）で再刺激し、２４時間インキュベートした。Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）用Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ３５−Ｐｌｅｘ Ｐａｎｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＬＨＣ６００５Ｍ）による分析のために、上清を収集し、処理した。ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）系（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を使用して、分析を行った。
結果：
細胞の成長および生存率：Ｔ細胞の増殖を、累積集団倍加として表す。結果は、少なくとも３つの独立した実験を代表するものである。表１２、１４〜１５、１８〜１９、２２〜２３はそれぞれ、図１２、１５〜１６、１９〜２０、２４〜２５に表示されるグラフ結果を定量化する。図１２の結果は、２−ＤＧの補充が、Ｔ細胞成長に影響を与えないことを実証する。より低い濃度の２−ＤＧは、無血清培地中のより高い濃度と比較して、（累積集団倍加として表される）最適以下のＴ細胞増殖を提供する。４ｍＭの２−ＤＧは、約６倍の集団倍加まで増殖した。実施形態では、２−ＤＧの濃度は、４ｍＭ以下である。実施形態では、２−ＤＧの濃度は、０．５ｍＭ以下である。実施形態では、２−ＤＧの濃度は、０．２５ｍＭ以下である。
図１５および１６は、ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞の成長曲線を実証する。細胞増殖は、累積集団倍加として表される。細胞は、４ｍＭの２−ＤＧありまたはなしで、５％のヒト血清を有するＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５中で、１２日間増殖させた。２−ＤＧの補充は、いずれの細胞型の成長にも影響を与えなかった。
図１５および１６は、ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞の成長曲線を実証する。細胞増殖は、累積集団倍加として表される。細胞は、４ｍＭの２−ＤＧありまたはなしで、５％のヒト血清を有するＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５中で、１２日間増殖させた。２−ＤＧの補充は、いずれの細胞型の成長にも影響を与えなかった。
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、２つの異なるＣＤ４＋：ＣＤ８＋比（５：１および１０：１）で混合して、２−ＤＧがＣＤ８＋Ｔ細胞に与える効果を決定した。２−ＤＧの有無に関わらず、全ての条件は、約６〜７倍の集団倍加まで増殖した。結果は、細胞成長における２−ＤＧ処理の効果が、両方の混合物で類似していたことを例示する。（図１９および２０）。
図２５は、図２４と同じ成長データを示しているが、最適条件を用いたものである。Ｔ細胞を、異なる時点（０、３、５、７日目）および細胞の供給ごとに、０．２５ｍｍの２−ＤＧとともに培養した。全ての条件は、約６〜７倍の集団倍加まで成長した。
表現型：図１３は、分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する。増殖前の０日目に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、１９％で開始した。増殖後の１０日目に、２−ＤＧを添加せずに、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、３０％まで成長した。しかしながら、０．２５ｍＭおよび０．５ｍＭの２−ＤＧでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、４８％まで増加した。
図１４は、増殖前（０日目）の元のサブセット分布と比較したＣＤ８＋：ＣＤ４＋比を描写する。結果は、０日目と比較して、ＣＤ８＋：ＣＤ４＋Ｔ細胞比の約３．２倍の増加が存在したことを表す。
図１７および１８は、増殖前（０日目）の元のサブセット分布と比較したＣＤ８＋：ＣＤ４＋比を示す。結果は、非ナイーブＴ細胞内での影響がより少ないナイーブＴ細胞内で、ＣＤ８＋：ＣＤ４＋Ｔ細胞比の３．４倍の増加が存在することを実証する。
図２１および図２２は、増殖前の２つの集団の頻度を表す増殖前（０日目）の元のサブセット分布と比較した、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比の平均変化を描写する。２−ＤＧは、０日目と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きな欠損を補正することができた。
図２６は、０日目と比較したＣＤ８＋：ＣＤ４＋Ｔ細胞比の倍数増加を表す。結果は、７日目のみおよび細胞の供給ごとに、細胞を０．２５ｍＭの２−ＤＧとともに培養することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の同じ３倍の増加がもたらされることを実証する。
サイトカインプロファイル：
Ｔ細胞を１２日間増殖させ、（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて再刺激した。再刺激時のサイトカイン産生を、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ３５−Ｐｌｅｘ Ｐａｎｅｌを用いて評価した。３５プレックスのアッセイのうち１５個のサイトカインが示された。全ての値を、５％のヒトＡＢ血清を補充したＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地に対して正規化した。結果は、サイトカイン産生に変化が存在しないことを実証し、これは、２−ＤＧが、マルチプレックスサイトカインアッセイによって測定して、細胞の機能を変化させないことを意味する（図２７）。

実施例７
材料／方法：
２−デオキシ−Ｄ−グルコースの調製：２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ、１６４．１６ｇ／ｍｏｌ）は、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部）によって製造された。２−ＤＧ溶液を、１００ｍＭのストック濃度で滅菌濾過水中に調製し、その後各チューブ内１ｍＬの最終体積でＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内にアリコートした。
細胞培養：Ｔ細胞の単離：正常なドナー由来の非特定化された凍結アフェレーシスバッグを、ＨｅｍａＣａｒｅから入手した。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１３４４Ｄ）を用いて、正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。
Ｔ細胞活性化および増殖：Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４１Ｄ）を用いて活性化し、無血清培地、無動物起源培地中で培養した。５、７、１０、および１２日目にＴ細胞をＶｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で計数し、２−ＤＧ（０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、および４ｍＭ）ならびに５％のヒトＡＢ血清ありまたはなしで、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで、ならびに１０日目に１×１０6ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。
いくつかの研究のために、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞キットを使用した負の選択によって、ＰＢＭＣから単離した。ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞を、ＣＤ４５ＲＡナノビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した正の選択によって、富化Ｔ細胞から単離した。
表現型：初代ヒトＴ細胞を、２−ＤＧおよび５％のヒトＡＢ血清ありおよびなしで、１０日間増殖させた。ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を、磁気分離によって２×１０6個の細胞から除去した。ＣＤ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＣＤ０３２９）、ＣＤ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ａ１５８５８）、ＣＤ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＭＨＣＤ０８２８）。ＧａｌｌｉｏｓフローサイトメーターおよびＫａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で、フローサイトメトリー分析を行った。
サイトカインプロファイル：ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＵＮＴＯＵＣＨＥＤ（商標）ヒトＴ細胞キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１３４４Ｄ）を用いて、正常なドナー由来の初代ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから負に単離した。Ｔ細胞（播種密度１×１０6ｖｃ／ｍＬ）を、１個のＴ細胞当たり３個のビーズの割合で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４１Ｄ）を用いて活性化し、無血清かつ無動物起源培地または５％のヒトＡＢ血清を補充した対照培地Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＢＥ０２−０５４Ｑ）中で培養した。５、７、１０、および１２日目にＴ細胞をＶｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で計数し、３、５、および７日目に５×１０5ｖｃ／ｍＬの密度まで、ならびに１０日目に１ｘ１０6ｖｃ／ｍＬの密度まで供給した。１０日目にＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を培養物から磁気的に除去し、細胞を回転させて、条件培地を除去し、新鮮な培地中に一晩静置した。１００万個のＴ細胞を、１：１のビーズ対細胞比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１４１Ｄ）で再刺激し、２４時間インキュベートした。Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）用Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ３５−Ｐｌｅｘ Ｐａｎｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＬＨＣ６００５Ｍ）による分析のために、上清を収集し、処理した。ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）系（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を使用して、分析を行った。
結果：
細胞の成長および生存率：Ｔ細胞の増殖を、累積集団倍加として表す。結果は、少なくとも３つの独立した実験を代表するものである。表２５、２７〜２８、３１、３３〜３４、３７〜３８、および４０〜４１はそれぞれ、図２８、３１〜３２、３５、３８〜３９、４３〜４４、および４６〜４７に表示されるグラフ結果を定量化する。図２８は、バルクＴ細胞内での２−ＤＧ（０、１ｍＭ、２ｍＭ、および４ｍＭ）の用量応答を例示する。結果は、２−ＤＧの補充が、Ｔ細胞成長に影響を与えないことを実証する。図３１および３２は、ナイーブおよび非ナイーブＴ細胞の成長曲線を実証する。細胞増殖は、累積集団倍加として表される。細胞は、４ｍＭの２−ＤＧありまたはなしで、５％のヒト血清とともに１２日間増殖させた。２−ＤＧの補充は、ナイーブＴ細胞内での成長には影響を与えなかったが、非ナイーブＴ細胞にはわずかな効果が存在した。
図３５は、バルクＴ細胞内での２−ＤＧのより小さな用量応答（０．２５ｍＭおよび０．５ｍＭ）を例示する。より低い濃度の２−ＤＧを試験したのは、異なる用途では異なる濃度の２−ＤＧが必要とされるようであるためである（設定した比でのＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合）。結果は、２−ＤＧの補充が、より低い濃度であってもＴ細胞成長に影響を与えないことを示す。
図３８および３９では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、２つの異なるＣＤ４：ＣＤ８比（５：１および１０：１）で混合して、２−ＤＧがＣＤ８＋Ｔ細胞に与える効果を決定した。２−ＤＧの有無に関わらず、全ての条件は、約６〜７倍の集団倍加まで増殖した。結果は、細胞成長における２−ＤＧ処理の効果が、両方の混合物で類似していたことを例示する。
図４３は、図１７と同じ成長データを示しているが、最適条件を用いたものである。Ｔ細胞を、異なる時点（０、３、５、７日目）および細胞の供給ごとに、０．２５ｍｍの２−ＤＧとともに培養した。全ての条件は、約６〜７倍の集団倍加まで成長した。
図４６および４７は、それぞれ２−ＤＧを有するＣＤ脂質濃縮物１（ＣＬＣ１）およびＣＤ脂質濃縮物２（ＣＬＣ２）の用量応答を例示する。結果は、２−ＤＧありまたはなしの１：１０００のＣＬＣ１および１：１０００のＣＬＣ２が、Ｔ細胞の最適な成長を実証することを示す。
表現型：
図２９は、分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する。増殖前の０日目に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、２７％で開始した。増殖後の１０日目に、２−ＤＧを添加せずに、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、３８％まで成長した。しかしながら、４ｍＭの２−ＤＧでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、６３％まで増加した。
図３０は、増殖前（０日目）の元のサブセット分布と比較したＣＤ８＋：ＣＤ４＋比を描写する。結果は、４ｍＭの２−ＤＧが、増殖前の０日目と比較して、ＣＤ８：ＣＤ４比の４．１倍の増加をもたらすことを示す。
図３３および３４は増殖前（０日目）の元のサブセット分布と比較したＣＤ８＋：ＣＤ４＋比を表す。結果は、非ナイーブＴ細胞内での影響がより少ないナイーブＴ細胞内での、ＣＤ８：ＣＤ４比の２．４倍の増加が存在することを実証する。
図３６は、分化表現型決定のゲーティング戦略を描写する。増殖前の０日目に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、１９％で開始した。増殖後の１０日目に、２−ＤＧを添加せずに、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、３０％まで成長した。しかしながら、０．２５ｍＭおよび０．５ｍＭの２−ＤＧでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、４８％まで増加した。単一のドナーからの代表的なもの。
図３７は、増殖前（０日目）の元のサブセット分布と比較したＣＤ８＋：ＣＤ４＋比を描写する。結果は、増殖前の０日目と比較して、０．２５ｍＭおよび０．５ｍｍの２−ＤＧでは、ＣＤ８：ＣＤ４比の２．１および２．２倍の増加が存在することを示す。３人の異なるドナーからの代表的なものである。
図４０および４１は、増殖前の２つの集団の頻度を表す増殖前（０日目）の元のサブセット分布と比較した、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比の平均変化を描写する。２−ＤＧは、増殖前の０日目と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の大きな欠損を補正することができた。
図４５は、０日目と比較したＣＤ８：ＣＤ４比の倍数増加を表す。結果は、７日目のみに０．２５ｍＭの２−ＤＧとともに細胞を培養すると、供給ごとに細胞を２−ＤＧとともに培養した場合と同じ結果が実証され、両方とも、ＣＤ８：ＣＤ４比の３倍の増加をもたらしたことを示す。これにより、２−ＤＧ操作を、プロセス開発のツールとして我々のプロトコルに添加することが、より容易になる。
図４８および４９は、０日目と比較したＣＤ８：ＣＤ４比の倍数増加を表す。結果は、０日前の増殖前と比較して、ＣＬＣ１を有する２−ＤＧの追加時にＣＤ８：ＣＤ４比の１．６倍の増加が存在し、ＣＬＣ２を有する２−ＤＧの追加時にＣＤ８：ＣＤ４比の１．４倍の増加が存在することを示す。
サイトカインプロファイル：
Ｔ細胞を１２日間増殖させ、（登録商標）ヒトＴ増殖剤ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて再刺激した。再刺激時のサイトカイン産生を、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ３５−Ｐｌｅｘ Ｐａｎｅｌを用いて評価した。結果は、サイトカイン産生に変化が存在しないことを実証し、これは、示されるように、２−ＤＧが、マルチプレックスサイトカインアッセイによって測定して、細胞の機能を変化させないことを意味する（データ示さず）。
実施例８：脂質を含有する無血清培地（ＳＦＭ）でのワクチン産生のための二倍体細胞の培養
背景
ウシ胎仔血清によって伝統的に供給される脂質もまた、無血清培地中で成長する二倍体細胞および最適な二倍体細胞増殖に必要であるようである。
一般に、二倍体細胞は、ワクチン産生に使用され、これは、ウイルス全体もしくはウイルスの一部、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質、ウイルスＤＮＡ、またはそれらの断片の産生に関与し得る。ワクチン用に産生されているウイルスの例には、水痘帯状疱疹（ＶＺＶ）、風疹、麻疹、ＭＭＲ、Ａ型肝炎、アデノウイルス、ポリオ、ロタウイルス、狂犬病または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、デングウイルス等が含まれるが、これらに限定されない。ワクチン産生に使用される細胞には、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＫＭＢ−１７、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１等のヒト二倍体細胞、自社内のワクチン製造に使用される他の独自の二倍体細胞株、およびＶＥＲＯ（アフリカミドリザル腎臓）細胞等の非ヒト二倍体細胞が含まれる。
ワクチン製造業者は一般に、１０％のウシ血清を含有する古典的培地中で二倍体細胞を培養しており、血清に関連する潜在的な規制およびサプライチェーンのリスクのために、無血清配合物への移行を望んでいる。代謝物分析および実験計画法（ＤＯＥ）の理論的根拠を使用して、我々は、二倍体細胞の「成長」のための最初の無血清培地（ＳＦＭ）を開発し、我々はまた、これを二倍体成長ＳＦＭとも呼んでいる。二倍体成長ＳＦＭを使用する利点は、それが無血清であり、それが解凍から無順応増殖まで細胞の直接的な回収を支持し、それが血清含有培地中で以前に凍結させた二倍体細胞の回収を支持することができるためであり、これらは全て、血清含有培地と同等の性能をもたらしながら行われる。ウイルスの産生要件は、細胞成長要件とは異なるため、二倍体産生培地は、別個に最適化され、これにより、無動物起源（ＡＯＦ）二倍体産生ＳＦＭの作製がもたらされた。合わせると、二倍体成長ＳＦＭおよびＡＯＦ二倍体産生ＳＦＭは、製造業者がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在を懸念することなくワクチンを生産する機会を与え、これによりＷＨＯが設定した５０ｎｇ／用量のＢＳＡ制限を満たす。無血清プロセスに切り替えることによって、ワクチン製造業者は、血清への依存を低減し、生産および精製コストを低減し、製品の一貫性および安全性を増加させることができる。
材料および方法
下記のＣＤシクロデキストリン−脂質補助剤を調製するための組成物および方法論は、実施例１：ＣＤ補助剤配合物の下に上記のものと同じである。二倍体成長補助剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３９６９５ＳＡ）を、下記のように、ＣＤシクロデキストリン−脂質補助剤ありまたはなしで調製した。
１．細胞培養
ＭＲＣ−５ ｐｄ１９細胞（ＥＣＡＣＣ、カタログ番号０５０７２１０１）を、ＣＤ脂質補助剤ありまたはなしで、６ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％の二倍体成長補助剤を含有する二倍体基本ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｎｏ．Ａ３９６９３ＤＫ）中に解凍した。対照のために、ＭＲＣ−５ ｐｄ１９細胞を、１０％のウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１００８２）、４ｍＭのＬ−グルタミン、および２ｇ／ＬのＤ−グルコースを補充したＭＥＭα培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１２５７１−０６３）中に解凍した。細胞を、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４１９０−１３６）で洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２５３００−０５４）で解離させ、定義された２×トリプシン阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ−００７−１００）で反応停止させ、３〜４日ごとに継代した。細胞計数は、Ｖｉ−ＣＥＬＬ ＸＲ分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して行い、通気Ｔフラスコ７５ｃｍ2（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５３１３６）内での３日間の培養のために、２５ｍＬの成長培地中に０．６×１０6ＶＣＤの密度で播種したか、または通気Ｔフラスコ７５ｃｍ2（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５３１３６）内での４日間の培養のために、２５ｍＬの成長培地中に０．３×１０6ＶＣＤの密度で播種した。で播種した。
２．ウイルス産生
ウイルス産生（例えば、水痘帯状疱疹ウイルス産生）のために、例示的な二倍体細胞、例えば、ＭＲＣ−５を、６ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％の二倍体産生（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３９６９６ＳＡ）を含有する二倍体基本ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３９６９３ＤＫ）中、または対照のために、１０％のウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１００８２）、４ｍＭのＬ−グルタミン、および２ｇ／ＬのＤ−グルコースを補充したＭＥＭα培地中のいずれかで、４０，０００個の細胞／ｃｍ2で播種した。２４時間後、培地を、６ｍＭのＬ−グルタミンを含有する二倍体ＳＦＭ、または２％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、および２ｇ／ＬのＤ−グルコースを有するＭＥＭαとそれぞれ交換した。細胞を、水痘帯状疱疹ウイルス（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１３６７（商標））に０．０１のＭＯＩで感染させ、２日後に採取した。ウイルス力価を、ＴＣＩＤ50アッセイによって決定した。
結果
細胞成長および生存率測定
二倍体生細胞密度（ＶＣＤ）は、１ミリリットルあたりの生存細胞として表され、二倍体成長ＳＦＭ対血清含有培地対照（ＭＥＭα＋１０％のＦＢＳ）内の各細胞株の対照％として示され、これらの結果は、少なくとも３つの独立した実験を代表するものである。
以下の図５０および表４４は、対照ＭＥＭα培地＋１０％ＦＢＳ内での各細胞株の成長と比較した、５継代にわたるＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、およびＩＭＲ−９０細胞株の平均％（ＶＣＤ）を描写する。結果は、ＭＲＣ−５細胞の場合、成長は、血清含有培地対照の成長とほぼ同等であることを示す。
以下の図５１および表４５は、対照ＭＥＭα培地中で成長させたＭＲＣ−５細胞と比較した、脂質補充ありまたはなしの二倍体成長ＳＦＭ中のＭＲＣ−５細胞のＶＣＤの比較を描写する。さらに、１）「脂質濃縮物」（１：１００および１：１０００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１９０５−０３１）中、ならびに２）ＣＤ補助剤１および２（各々１：２０００および１：５００）中で、２種類の脂質補充の比較を行った（これらの調製は、実施例１に上記）。結果は、ＣＤ補助剤１および２が、脂質濃縮物（１：１００および１：１０００）と比較して、ＭＲＣ−５のＶＣＤを増加させることを示す。加えて、結果はまた、ＣＤ（シクロデキストリンベースの）補助剤１および２が、血清含有培地中のＶＣＤと同等のＭＲＣ−５ ＶＣＤを増加させたことも示す（図５１および表４５）。
したがって、ＣＤ脂質補助剤を含有する二倍体ＳＦＭは、血清含有培地の二倍体細胞成長と同等であるか、またはそれより優れた二倍体細胞成長をもたらす。
以下の図５２および表４６は、二倍体ＳＦＭ中で成長させたＭＲＣ−５細胞が、血清含有培地中で成長させた細胞の水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）産生と同等の水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）産生をもたらすことを実証する。
（上記に示される）ヒト二倍体細胞の培養に加えて、二倍体成長補助剤ＣＤ１またはＣＤ２を含む二倍体成長ＳＦＭはまた、ＶＥＲＯ細胞等の非ヒト二倍体細胞も培養することができた（データ示さず）。
ＳＦＭ条件下でウイルス産生用の細胞を成長させるためのキット
二倍体および非二倍体細胞を含む、ワクチン産生用の細胞を培養するための例示的なキットは、キット１および２に示される以下の成分を含有し得る。
キット１は、１Ｌの二倍体基本培地＋１０ｍＬの二倍体成長補助剤または１０Ｌの二倍体基本培地＋１００ｍＬの二倍体成長補助剤からなる。
キット２は、１Ｌの二倍体基本培地＋１０ｍＬの二倍体産生補助剤または１０Ｌの二倍体基本培地＋１００ｍＬの二倍体産生補助剤からなる。
いくつかの実施形態では、二倍体成長補助剤のみが、シクロデキストリン脂質を含有してもよい一方で、二倍体基本培地および二倍体産生補助剤は、シクロデキストリンおよび／または脂質を含有しない。
ワクチン産生細胞を培養するためのこれらの以下のキットは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能である。
別の実施形態では、二倍体成長補助剤および二倍体産生補助剤の両方が、シクロデキストリンおよび／または脂質を含有してもよい。
ＳＦＭ条件下で培養した二倍体細胞が使用されるいくつかの用途
１．これら全てが参照により本明細書に組み込まれる、以下の参考文献に記載の方法および／またはプロトコルを使用する、ウイルス／ワクチン産生用。
ａ）Ｍｉｒｃｈａｍｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｎｓｔ．Ｒａｚｉ，（１９７９）３１，９７−１０２．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅａｓｌｅｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ、
ｂ）Ｒａｂｉｅｓ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｏｖａｘ（登録商標）Ｒａｂｉｅｓ ｂｙ Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ａｐｒｉｌ（２０１３）ｖ０．２ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｂｉｏｌｏｇｉｃｓｂｌｏｏｄｖａｃｃｉｎｅｓ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ａｐｐｒｏｖｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｕｃｍ１３３４８４．ｐｄｆ。
ｃ）Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ ｉｎ ＭＲＣ−５Ｃｅｌｌｓ ａｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ ｉｎ Ｖｅｒｏ Ｃｅｌｌｓ，”３：ｅ１８１０（２００８）。
２．参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ｈｏｎｇ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１５）１２：１０１に記載の方法および／またはプロトコルを使用する、ワクチン産生の有効性の試験用、またはウイルス力価の決定用。
３．ＭＲＣ−５細胞、Ｖｅｒｏ細胞等の指標細胞株に対する細胞変性効果の検出を通した、ｉ）抗ウイルス剤、ｉｉ）外来性作用物質の試験用（参照により本明細書に組み込まれる、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｄｓ−ｕｓａ．ｃｏｍ／ｃｅｌｌｃｈａｒａｃｔｅｒ＿ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ．ｈｔｍｌを参照されたい）。
４．好適なトランスフェクション試薬を用いたトランスフェクション用（参照により本明細書に組み込まれる、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｒｃｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ＩＮＴＥＲＳＨＯＰ／ｗｅｂ／ＷＦＳ／Ｍｅｒｃｋ−ＪＰ−Ｓｉｔｅ／ｊａ＿ＪＰ／−／ＪＰＹ／ＳｈｏｗＤｏｃｕｍｅｎｔ−Ｐｒｏｎｅｔ？ｉｄ＝２０１７０８．１４６を参照されたい）。
５．ＣＭＶ、狂犬病、単純ヘルペス、ＶＳＶ、エコー、ライノウイルス（参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｉｌｎｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｄｅｒｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２：１０２（２００７））の診断試験用（例えば、ＣＭＶ：Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，１７：６０５−６０９（１９８３））。
６．細胞モデル内（例えば、肺がんモデル（参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｕｃｈｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ１１：０２４１１０（２０１７）））。
７．染色体不安定性の研究用（Ｃｏｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ１０７：１５４５５−１５４６０（２０１０）を参照されたい）、または複製老化の研究用（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｃｔｉｖｅｍｏｔｉｆ．ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｄｅｔａｉｌｓ／４０３１０／ｗｉ−３８−ｎｕｃｌｅａｒ−ｅｘｔｒａｃｔを参照されたい）。これらは、両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態
本発明を、発明を実施するための形態と併せて記載している一方で、前述の記載は、例示を意図し、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではない。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用される全ての米国特許および公開または非公開米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書に引用される全ての公開外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用される受託番号によって示されるＧｅｎＢａｎｋおよびＮＣＢＩへの提出は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用される他の全ての公開参考文献、文書、原稿、および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれている。
本発明が、その好ましい実施形態を参照して具体的に示され、記載される一方で、当業者であれば、形態および詳細の様々な変更が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その中で行われ得ることを理解するであろう。
本発明の例示的な主題を、以下の項によって表す。
項１．（ｉ）Ｔ細胞の集団、ならびに（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培地を含む、組み合わせ。
項２．少なくとも１つの脂質が、コレステロール、脂肪酸、脂肪酸エステル、リン脂質、またはグリセロ脂質である、項１に記載の組み合わせ。
項３．脂肪酸が、飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、または多価不飽和脂肪酸である、項２に記載の組み合わせ。
項４．脂肪酸が、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸、またはオメガ−９脂肪酸である、項２または３に記載の組み合わせ。
項５．脂肪酸が、リノール酸である、項２〜４のいずれかに記載の組み合わせ。
項６．リノレン酸をさらに含む、項５に記載の組み合わせ。
項７．リノレン酸が、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、またはα−リノレン酸およびγ−リノレン酸である、項６に記載の組み合わせ。
項８．アラキドン酸をさらに含む、項５〜７のいずれかに記載の組み合わせ。
項９．ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、またはステアリン酸をさらに含む、項５〜８のいずれかに記載の組み合わせ。
項１０．少なくとも１つの脂質が、少なくとも２、３、４、５、６、７、または８つの異なる脂肪酸である、項１〜９のいずれかに記載の組み合わせ。
項１１．少なくとも１つの脂質が、２、３、４、５、６、７、または８つの異なる脂肪酸である、項１〜１０のいずれかに記載の組み合わせ。
項１２．少なくとも１つの脂質が、
（ａ）リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、もしくはステアリン酸のいずれか１つ、
（ｂ）リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸のうちの２、３、４、５、６、もしくは７つ、
（ｃ）リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸、
（ｄ）飽和脂肪酸であって、酪酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、もしくはセロチン酸である、飽和脂肪酸、
（ｅ）一価不飽和脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、もしくはネルボン酸である、一価不飽和脂肪酸、
（ｆ）多価不飽和脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、多価不飽和脂肪酸、
（ｇ）オメガ−３脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、オメガ−３脂肪酸、
（ｈ）オメガ−６脂肪酸であって、リノール酸、γリノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、もしくはテトラコサペンタエン酸である、オメガ−６脂肪酸、または
（ｉ）オメガ−９脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ネルボン酸、またはミード酸である、オメガ−９脂肪酸である、項１〜１１のいずれかに記載の組み合わせ。
項１３．少なくとも１つの脂質が、コレステロールである、項１または２の組み合わせ。
項１４．コレステロールが、合成コレステロールである、項１３の組み合わせ。
項１５．シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、またはγ−シクロデキストリンである、項１〜１４のいずれかに記載の組み合わせ。
項１６．シクロデキストリンが、メチル化されている、項１〜１５のいずれかに記載の組み合わせ。
項１７．シクロデキストリンが、メチル−β−シクロデキストリンである、項１６に記載の組み合わせ。
項１８．シクロデキストリンが、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、２，６−ジメチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンポリスルフェート、トリメチルβ−シクロデキストリン、またはγ−シクロデキストリンポリスルフェートである、項１〜１６のいずれかに記載の組み合わせ。
項１９．組成物が、複数の異なるシクロデキストリンを含み、複数のシクロデキストリンが、少なくとも２つのシクロデキストリンを含む、１〜１８のいずれかに記載の組み合わせ。
項２０．複数のシクロデキストリンが、少なくとも１つのα−シクロデキストリン、少なくとも１つのβ−シクロデキストリン、および／または少なくとも１つのγ−シクロデキストリンを含む、項１９に記載の組み合わせ。
項２１．リノール酸、コレステロール、およびシクロデキストリンを含む、項１〜２０のいずれかに記載の組み合わせ。
項２２．シクロデキストリンおよびコレステロールを含み、シクロデキストリン対コレステロールのモル比が、１０．５：１未満である、項１〜２１のいずれかに記載の組み合わせ。
項２３．シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂肪酸を含み、シクロデキストリン対少なくとも１つの脂肪酸のモル比が、１１．５：１未満である、項１〜２１のいずれかに記載の組み合わせ。
項２４．シクロデキストリン、コレステロール、および少なくとも１つの脂肪酸を含み、シクロデキストリン対コレステロールおよび少なくとも１つの脂肪酸のモル比が、７．５：１未満である、項１〜２１のいずれかに記載の組み合わせ。
項２５．シクロデキストリン、コレステロール、および少なくとも１つの脂肪酸を含み、シクロデキストリン対コレステロールおよび少なくとも１つの脂肪酸のモル比が、５．５：１未満である、項１〜２１のいずれかに記載の組み合わせ。
項２６．シクロデキストリン、コレステロール、および少なくとも１つの脂肪酸を含み、シクロデキストリン対コレステロールおよび少なくとも１つの脂肪酸のモル比が、４．５：１未満である、項１〜２１のいずれかに記載の組み合わせ。
項２７．プロスタグランジン、コルチコステロイド、ロイコトリエン、リポキシン、プロテクチン、レゾルビン、オリゴヌクレオチド、または疎水性薬物化合物をさらに含む、項１〜２６のいずれかに記載の組み合わせ。
項２８．疎水性薬物化合物が、エトモキシルまたはスタチンである、項２７に記載の組み合わせ。
項２９．細胞培養培地が、約２００μＭ未満であるレベルのシクロデキストリンを含む、項１〜２８のいずれかに記載の組み合わせ。
項３０．細胞培養培地が、約５０μＭ〜約２００μＭであるレベルのシクロデキストリンを含む、項１〜２８のいずれかに記載の組み合わせ。
項３１．細胞培養培地が、約１０μＭ〜約３０μＭであるレベルのコレステロールを含む、項１〜３０のいずれかに記載の組み合わせ。
項３２．細胞培養培地中の少なくとも１つの脂質のレベルが、約１０μＭ〜約３０μＭである、項１〜３１のいずれかに記載の組み合わせ。
項３３．薬物化合物を含まない、項１〜２６または２９〜３２のいずれかに記載の組み合わせ。
項３４．アルプロスタジル、セフォチアムヘキセチルＨＣｌ、ベネクセートＨＣｌ、デキサメタゾン、ヨード、ニコチン、ニメスリド、ニトログリセリン、オメプラゾール、ＰＧＥ２、ピロキシカム、チアプロフェン酸、シサプリド、ヒドロコルチゾン、ルドメタシン、イトラコナゾール、マイトマイシン、１７β−エストラジオール、クロラムフェニコール、ボリコナゾール、マレイン酸ジプラシドウ、ジクロフェナクナトリウム、エトモキシル、またはスタチンを含まない、項１〜２６または２９〜３２のいずれかに記載の組み合わせ。
項３５．疎水性薬物化合物を含まない、項１〜２６または２９〜３２のいずれかに記載の組み合わせ。
項３６．（ｉ）細胞培養培地が、アルブミンを含むか、または（ｉｉ）細胞培養培地が、アルブミンを含まない、項１〜３５のいずれかに記載の組み合わせ。
項３７．（ｉ）細胞培養培地が、アルブミンを含むか、または（ｉｉ）細胞培養培地が、タンパク質を含まない、項１〜３６のいずれかに記載の組み合わせ。
項３８．細胞培養培地が、無血清細胞培養培地である、項１〜３７のいずれかに記載の組み合わせ。
項３９．Ｔ細胞の集団が、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含まない細胞培養培地と組み合わせたＴ細胞の集団内の対応するＴ細胞と比較して、表現型のより大きな保持、より大きな増殖、より大きな効力、および／またはより高い形質導入効率が可能なＴ細胞を含む、項１〜３８のいずれかに記載の組み合わせ。
項４０．２−デオキシ−Ｄ−グルコースをさらに含む、項１〜３９のいずれかに記載の組み合わせ。
項４１．１〜４０項のいずれか１項に記載の組み合わせを含む、細胞培養プレートもしくはフラスコ、バッグ、生物発酵槽、または生物反応器系。
項４２．リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびメチル化シクロデキストリンを含む、無血清細胞培養培地組成物。
項４３．メチル化シクロデキストリンが、約５０μＭ〜約２００μＭのレベルで存在する、項４２に記載の組成物。
項４４．コレステロールが、約１０μＭ〜約３０μＭのレベルで存在する、項４２または４３に記載の組成物。
項４５．リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびメチル化シクロデキストリンを含む、無血清細胞培養補助剤組成物。
項４６．少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸が、多価不飽和オメガ−６脂肪酸である、項４２〜４５のいずれかに記載の組成物。
項４７．少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸が、γリノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、またはテトラコサペンタエン酸である、項４２〜４６のいずれかに記載の組成物。
項４８．少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸が、アラキドン酸である、項４２〜４７のいずれかに記載の組成物。
項４９．α−リノレン酸をさらに含む、項４２〜４８のいずれかに記載の組成物。
項５０．ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、またはステアリン酸をさらに含む、項４２〜４９のいずれかに記載の組成物。
項５１．少なくとも３、４、５、６、７、または８つの異なる脂肪酸を含む、項４２〜５０のいずれかに記載の組成物。
項５２．３、４、５、６、７、または８つの異なる脂肪酸を含む、項４２〜５０のいずれかに記載の組成物。
項５３．
（ａ）リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、もしくはステアリン酸のいずれか１つ、
（ｂ）リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸のうちの２、３、４、５、６、もしくは７つ、
（ｃ）リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸、
（ｄ）飽和脂肪酸であって、酪酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、もしくはセロチン酸である、飽和脂肪酸、
（ｅ）一価不飽和脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、もしくはネルボン酸である、一価不飽和脂肪酸、
（ｆ）多価不飽和脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ミード酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、多価不飽和脂肪酸、
（ｇ）オメガ−３脂肪酸であって、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘネイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、もしくはテトラコサヘキサエン酸である、オメガ−３脂肪酸、
（ｈ）オメガ−６脂肪酸であって、リノール酸、アラキドン酸、γリノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、もしくはテトラコサペンタエン酸である、オメガ−６脂肪酸、または
（ｉ）オメガ−９脂肪酸であって、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ネルボン酸、またはミード酸である、オメガ−９脂肪酸である、項４２〜５２のいずれかに記載の組み合わせ。
項５４．コレステロールが、合成コレステロールである、項４２〜５３のいずれかに記載の組成物。
項５５．メチル化シクロデキストリンが、メチル化α−シクロデキストリン、メチル化β−シクロデキストリン、またはメチル化γ−シクロデキストリンである、項４２〜５４のいずれかに記載の組成物。
項５６．メチル化シクロデキストリンが、メチル−β−シクロデキストリンである、項４２〜５５のいずれかに記載の組成物。
項５７．非メチル化シクロデキストリンをさらに含む、項４２〜５６のいずれかに記載の組成物。
項５８．メチル化シクロデキストリン対コレステロールのモル比が、１０．５：１未満である、項４２〜５７のいずれかに記載の組成物。
項５９．組成物中のメチル化シクロデキストリン対他の脂質とのモル比が、１１．５：１未満である、項４２〜５８のいずれかに記載の組成物。
項６０．（ｉ）アルブミンを含むか、または（ｉｉ）アルブミンを含まない、項４２〜５９のいずれかに記載の組成物。
項６１．（ｉ）タンパク質を含むか、または（ｉｉ）タンパク質を含まない、項４２〜６０のいずれかに記載の組成物。
項６２．２−デオキシ−Ｄ−グルコースをさらに含む、項４２〜６１のいずれかに記載の組成物。
項６３．Ｔ細胞集団を培養するための方法であって、集団を、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地中でインキュベートすることを含む、方法。
項６４．細胞培養培地が、項４５〜６２のいずれか１項に記載の無血清細胞培養補助剤組成物を含む、項６３に記載の方法。
項６５．Ｔ細胞集団が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、項６３または６４に記載の方法。
項６６．Ｔ細胞集団が、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、項６３または６４に記載の方法。
項６７．Ｔ細胞集団が、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、項６３または６４に記載の方法。
項６８．細胞培養培地が、２−デオキシ−Ｄ−グルコースをさらに含む、項６３〜６７のいずれかに記載の方法。
項６９．集団内のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比の変化を最小化しながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を培養する方法であって、シクロデキストリンおよび多価不飽和脂肪酸を含む細胞培養培地中で集団をインキュベートすることを含む、方法。
項７０．多価不飽和脂肪酸が、オメガ−６多価不飽和脂肪酸である、項６９に記載の方法。
項７１．オメガ−６多価不飽和脂肪酸が、リノール酸である、項７０に記載の方法。
項７２．細胞培養培地が、コレステロールをさらに含む、項６９〜７１のいずれかに記載の方法。
項７３．細胞培養培地が、リノレン酸をさらに含む、項７１または７２のいずれかに記載の方法。
項７４．多価不飽和脂肪酸が、リノレン酸である、項６９に記載の方法。
項７５．細胞培養培地が、アラキドン酸をさらに含む、項６９〜７４のいずれかに記載の方法。
項７６．ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比の変化を最小化することが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数対ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が、集団が最初に培地と接触したときのＣＤ８＋Ｔ細胞の数対ＣＤ４＋Ｔ細胞の数と比較して、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満だけ異なる、ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を維持することを含む、項６９〜７５のいずれかに記載の方法。
項７７．集団が最初に培地と接触するとき、集団が、約１：１のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を含む、項６９〜７６のいずれかに記載の方法。
項７８．培地が、（ｉ）シクロデキストリン、（ｉｉ）コレステロール、および（ｉｉｉ）脂肪酸を含み、脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、およびアラキドン酸を含む、項６９に記載の方法。
項７９．培地が、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸のいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせを欠く、項６９〜７８のいずれかに記載の方法。
項８０．培地が、少なくとも１：１のリノール酸、リノレン酸、および／またはアラキドン酸対他の脂肪酸のモル比を含む、項６９〜７９のいずれかに記載の方法。
項８１．Ｔ細胞が所望の数、分化段階、および／または表現型に達するまで十分な期間にわたって集団をインキュベートすることと、任意で、培養物からＴ細胞を採取することとをさらに含む、項６９〜８０のいずれかに記載の方法。
項８２．Ｔ細胞亜集団のメンバーを優先的に増殖させるための方法であって、Ｔ細胞の混合集団を、
（ｉ）シクロデキストリン、および
（ｉｉ）脂肪酸に曝露することを含み、
２つ以上の脂肪酸のモル比が、Ｔ細胞亜集団のメンバーを誘導して、他のＴ細胞亜集団のメンバーに対して優先的に増殖するように調整される、方法が提供される。
項８３．Ｔ細胞亜集団が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、項８２に記載の方法。
項８４．Ｔ細胞の混合集団が、他の脂肪酸よりも多くの多価不飽和脂肪酸に曝露される、項８３に記載の方法。
項８５．Ｔ細胞の混合集団が、他の脂肪酸よりも多くのオメガ−６多価不飽和脂肪酸に曝露される、項８３に記載の方法。
項８６．Ｔ細胞の混合集団を、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに曝露することをさらに含む、項８２〜８５のいずれかに記載の方法。
項８７．Ｔ細胞亜集団が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、項８２に記載の方法。
項８８．Ｔ細胞が、初代Ｔ細胞である、項８２〜８７のいずれかに記載の方法。
項８９．Ｔ細胞が、ヒト対象の血液から単離されている、項８２〜８８のいずれかに記載の方法。
項９０．Ｔ細胞が、遺伝子改変Ｔ細胞である、項８２〜８７のいずれかに記載の方法。
項９１．Ｔ細胞が、遺伝子改変Ｔ細胞受容体を発現する、項９０に記載の方法。
項９２．Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体を発現する、項９０に記載の方法。
項９３．集団内のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を増加させながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を培養する方法であって、集団を、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含む細胞培養培地中でインキュベートすることを含む、方法。
項９４．２−デオキシ−Ｄ−グルコースが、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭのレベルで存在する、項９３に記載の方法。
項９５．細胞培養培地が、血清をさらに含む、項９３または９４に記載の方法。
項９６．血清が、ヒト血清である、項９５に記載の方法。
項９７．細胞培養培地が、無血清細胞培養培地である、項９３または９４に記載の方法。
項９８．集団内のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比が、集団が最初に培地と接触した後、約７日以内に、少なくとも２倍、２．５倍、３倍、または３．５倍増加する、項９３〜９７のいずれかに記載の方法。
項９９．集団が最初に培地と接触するとき、集団内にはＣＤ８＋Ｔ細胞よりも多くのＣＤ４＋Ｔ細胞が存在する、項９３〜９８のいずれかに記載の方法。
項１００．集団が最初に培地と接触するとき、集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞の比が、少なくとも５：１である、項９９に記載の方法。
項１０１．Ｔ細胞が、初代Ｔ細胞である、項６３〜１００のいずれかに記載の方法。
項１０２．Ｔ細胞が、ヒト対象の血液から単離されている、項６３〜１０１のいずれかに記載の方法。
項１０３．Ｔ細胞が、遺伝子改変Ｔ細胞である、項６３〜１００のいずれかに記載の方法。
項１０４．Ｔ細胞が、遺伝子改変Ｔ細胞受容体を発現する、項１０３に記載の方法。
項１０５．Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体を発現する、項１０３に記載の方法。
項１０６．Ｔ細胞が、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔヘルパー細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、高分化型エフェクター（ＴＴＤ）Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、または操作されたＴ細胞である、項６３〜１０５のいずれかに記載の方法。
項１０７．Ｔ細胞集団のサイズが、７日以内に少なくとも３倍に倍増する、項６３〜１０６のいずれかに記載の方法。
項１０８．Ｔ細胞集団のサイズが、１０日以内に少なくとも３、４、または５倍に倍増する、項６３〜１０７のいずれかに記載の方法。
項１０９．Ｔ細胞集団内のＴ細胞の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が、Ｔ細胞集団が最初に培地と接触してから７、８、９、または１０日後に生存可能である、項６３〜１０８のいずれかに記載の方法。
項１１０．Ｔ細胞集団内のＴ細胞の少なくとも９５％が、Ｔ細胞集団が最初に培地と接触した後１０日間生存可能である、項６３〜１０９のいずれかに記載の方法。
項１１１．疾患または病態に苦しんでいるか、またはそれに苦しむリスクがある対象への投与のための培養Ｔ細胞を調製することをさらに含む、項６３〜１１０のいずれかに記載の方法。
項１１２．Ｔ細胞を対象に投与することをさらに含む、項１１１に記載の方法。
項１１３．疾患の治療を必要とする対象において疾患を治療するための方法であって、項６３〜１１１のいずれか１項に記載の方法によって得られたＴ細胞を、対象に投与することを含む、方法。
項１１４．疾患が、過剰増殖性障害である、項１１３に記載の方法。
項１１５．疾患が、自己免疫性疾患である、項１１３に記載の方法。
項１１６．疾患が、炎症性疾患である、項１１３に記載の方法。
項１１７．疾患が、アレルギー性疾患である、項１１３に記載の方法。
項１１８．疾患が、感染性疾患である、項１１３に記載の方法。
項１１９．感染性疾患が、ウイルス感染症である、項１１８に記載の方法。
項１２０．ウイルス感染症が、サイトメガロウイルス感染症、エプスタイン・バーウイルス感染症、またはヒト免疫不全ウイルス感染症である、項１１９に記載の方法。
項１２１．対象が、抑制された免疫系を有する、項１１３〜１２０のいずれかに記載の方法。
項１２２．対象が、組織または臓器の移植を受けている、項１１３〜１２１のいずれかに記載の方法。
項１２３．対象が、後天性免疫不全症候群を有する、項１１３〜１２２のいずれかに記載の方法。
項１２４．Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、項１１３〜１２３のいずれかに記載の方法。
項１２５．Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、項１１３〜１２３のいずれかに記載の方法。
項１２６．Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞である、項１１３〜１２５のいずれかに記載の方法。
項１２７．Ｔ細胞培地の補充のための系であって、（ｉ）２つ以上の異なるシクロデキストリンであって、各シクロデキストリンが、別個の容器内にある、シクロデキストリンと、（ｉｉ）２つ以上の異なる脂肪酸であって、各脂肪酸が、別個の容器内にある、脂肪酸とを含む、系。
項１２８．２−デオキシ−Ｄ−グルコースをさらに含む、項１２７に記載の系。
項１２９．無血清培地、シクロデキストリン、および１つ以上の脂質を含むＴ細胞を培養するための、キット。
項１３０．２−デオキシ−Ｄ−グルコースをさらに含む、項１２９に記載のキット。
項１３１．エトモキシルをさらに含む、項１２９または１３０に記載のキット。
項１３２．（ｉ）Ｔ細胞の集団、（ｉｉ）細胞培養培地、ならびに（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤を含む、組み合わせ。
項１３３．（ｉ）細胞培養培地、および（ｉｉ）項４２〜６２のいずれかに記載の組成物を含む、キットまたは組み合わせ。
項１３４．（ｉ）二倍体または非二倍体細胞の集団、ならびに（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地を含む、組み合わせ。
項１３５．二倍体細胞が、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生する、項１３４に記載の組み合わせ。
項１３６．二倍体細胞集団を培養するための方法であって、細胞集団を、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地中でインキュベートすることを含む、方法。
項１３７．細胞培養培地が、無血清である、項１３６に記載の方法。
項１３８．細胞集団が、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、およびＶＥＲＯ細胞からなる群から選択される、項１３７〜１３７のいずれかに記載の方法。
項１３９．細胞が、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生する、項１３７〜１３８のいずれかに記載の方法。
項１４０．二倍体細胞培地の補充のための系であって、（ｉ）１つ以上の異なるシクロデキストリンであって、各シクロデキストリンが、別個の容器内にある、シクロデキストリンと、（ｉｉ）２つ以上の異なる脂肪酸であって、各脂肪酸が、別個の容器内にある、脂肪酸とを含む、系。
項１４１．成長因子をさらに含む、項１４０に記載の系。
項１４２．（ｉ）シクロデキストリンと、（ｉｉ）２つ以上の異なる脂肪酸であって、各脂肪酸が、別個の容器内にある、脂肪酸とを含む、二倍体細胞培地の補充のための系。
項１４３．基本培地および無血清増殖補助を含む、ワクチン産生細胞または細胞株を培養するためのキット。
項１４４．項１４３に記載の細胞または細胞株を産生するワクチンを培養するためのキットであって、無血清成長補助剤が、シクロデキストリンおよび１つ以上の脂質をさらに含む、キット。
項１４５．ワクチン産生細胞が、二倍体細胞または非二倍体細胞である、項１４４に記載のワクチン産生細胞または細胞株を培養するためのキット。
項１４６．二倍体細胞が、ヒト細胞である、項１４５に記載のワクチン産生細胞または細胞株を培養するためのキット。
項１４７．リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびシクロデキストリンを含む、無血清細胞培養培地組成物。
項１４８．リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびシクロデキストリンを含む、無血清細胞培養補助剤組成物。
項１４９．シクロデキストリンが、メチル化シクロデキストリンである、項１４７に記載の無血清細胞培養培地組成物または項１４８に記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
項１５０．メチル化シクロデキストリンが、約５０μＭ〜約２００μＭのレベルで存在する、項１４９に記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
項１５１．コレステロールが、合成コレステロールであり、かつ／またはコレステロールが、約５μＭ〜約３０μＭのレベルで存在する、項１４７〜１５０のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または項１４８〜１５０のいずれかに記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
項１５２．少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸が、多価不飽和オメガ−６脂肪酸である、項１４７〜１５１のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または項１４８〜１５１のいずれかに記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
項１５３．少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸が、アラキドン酸である、項１４７〜１５２のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または項１４８〜１５２のいずれかに記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
項１５４．多価不飽和オメガ−６脂肪酸が、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸からなる群から選択される、項１４７〜１５３のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または項１４８〜１５３のいずれかに記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
項１５５．補助剤の有効希釈度が、約１：１０〜約１：５０００である、項１４８〜１５４のいずれかに記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
項１５６．ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生し得る細胞を培養することができる、項１４７に記載の無血清細胞培養培地組成物または項１４８に記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
項１５７．細胞が、動物細胞である、項１４７〜１５６のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
項１５８．動物細胞が、ウシ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である、項１４７〜１５７のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
項１５９．動物細胞が、二倍体細胞である、項１４７〜１５８のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
項１６０．細胞が、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＭＲＣ−９、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝臓、Ｕ９３７、ＭＤＣＫ、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ、および前述の細胞の任意のクローンからなる群から選択される、項１４７〜１５９のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
項１６１．培地または補助剤が、細胞の成長、細胞の生存細胞密度、ウイルスに感染した細胞のウイルス力価、またはそれらの組み合わせを増加させる、項１４７〜１６０のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
項１６２．細胞が、ウイルスに感染している、項１４７〜１６１のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
項１６３．ウイルスが、動物ウイルス、植物ウイルス、またはバクテリオファージである、項１４７〜１６２のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
項１６４．ウイルスが、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、風疹、麻疹、流行性耳下腺炎、Ａ型肝炎、アデノウイルス、ポリオ、ロタウイルス、痘瘡、水痘、黄熱、パピローマウイルス、エボラウイルス、ＨＩＶ、狂犬病または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびデングウイルスからなる群から選択される、項１４７〜１６３のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
項１６５．ウイルス粒子が、パルボウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、またはバクテリオファージに由来する、項１４７〜１６４のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
項１６６．ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生することができる二倍体細胞を培養するために基本培地に添加され、細胞が、無血清条件下で培養される、項１４８に記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
項１６７．二倍体細胞集団を培養するための方法であって、細胞集団を、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地中でインキュベートすることを含む、方法。
項１６８．ワクチン産生二倍体細胞を含む、項１６７に記載の細胞集団を培養する方法であって、細胞集団を、
（ｉ）シクロデキストリン、リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、およびコレステロール、または
（ｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤を含む、無血清細胞培養培地中でインキュベートすることを含み、培養が、シクロデキストリンを有しない血清含有培地中の生存細胞密度と比較して、無血清細胞培養培地中の生存細胞密度を増加させる、方法。
項１６９．シクロデキストリンが、メチル化シクロデキストリンである、項１６７に記載の二倍体細胞集団を培養するための方法。
項１７０．メチル化シクロデキストリンが、約５０μＭ〜約２００μＭのレベルで存在する、項１６９に記載の二倍体細胞集団を培養するための方法。
項１７１．少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸が、多価不飽和オメガ−６脂肪酸である、項１６８または１６９に記載の二倍体細胞集団を培養するための方法。
項１７２．多価不飽和オメガ−６脂肪酸が、アラキドン酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸からなる群から選択される、項１６８または１６９に記載の二倍体細胞集団を培養するための方法。
項１７３．項１６７〜１７２のいずれかに記載の二倍体細胞集団を培養するための方法であって、
（ｉ）培地または補助剤が、細胞の成長、細胞の生存細胞密度、ウイルスに感染した細胞のウイルス力価、またはそれらの組み合わせを増加させ、かつ／あるいは
（ｉｉ）二倍体細胞が、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはそれらのウイルス断片を産生することができ、かつ／あるいは
（ｉｉｉ）細胞が、ウイルスに感染している、方法。
項１７４．項１６７〜１７３のいずれかに記載の二倍体細胞集団を培養するための方法であって、
（ｉ）ウイルスが、動物ウイルス、植物ウイルス、もしくはバクテリオファージであり、かつ／または
（ｉｉ）ウイルスが、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、風疹、麻疹、流行性耳下腺炎、Ａ型肝炎、アデノウイルス、ポリオ、ロタウイルス、痘瘡、水痘、黄熱、パピローマウイルス、エボラウイルス、ＨＩＶ、狂犬病もしくは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびデングウイルスからなる群から選択され、かつ／または
（ｉｉｉ）ウイルス粒子が、パルボウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、もしくはバクテリオファージに由来する、方法。
項１７５．細胞集団が、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＭＲＣ−９、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝臓、Ｕ９３７、ＭＤＣＫ、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ、および前述の細胞の任意のクローンからなる群から選択される、項１６７〜１７４のいずれかに記載の方法。
項１７６．組み合わせであって、
（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む無血清細胞培養培地、または
（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤、または
（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤を含む、組み合わせ。
項１７７．項１７６に記載の組み合わせであって、
（ｉ）細胞が、動物細胞であるか、または
（ｉｉ）動物細胞が、ウシ細胞、ネコ細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、霊長類細胞、もしくはヒト細胞であるか、または
（ｉｉｉ）動物細胞が、二倍体細胞であるか、または
（ｉｖ）細胞が、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＭＲＣ−９、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝臓、Ｕ９３７、ＭＤＣＫ、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ、および前述の細胞の任意のクローンからなる群から選択される、組み合わせ。
項１７８．二倍体細胞が、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生する、項１７６〜１７７のいずれかに記載の組み合わせ。
項１７９．無血清二倍体細胞培養培地を作製する方法であって、（ｉ）基本培地と、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤、または（ｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤のいずれかとを混合することを含む、方法。
項１８０．補助剤が、成長因子をさらに含む、項１７９に記載の無血清二倍体細胞培養培地を作製する方法。
項１８１．二倍体細胞培地の補充のための系であって、（ｉ）１つ以上の異なるシクロデキストリンであって、各シクロデキストリンが、別個の容器内にある、シクロデキストリンと、（ｉｉ）２つ以上の異なる脂肪酸であって、各脂肪酸が、別個の容器内にある、脂肪酸とを含む、系。
項１８２．（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む無血清細胞培養培地、または
（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤、または
（ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤を含む、組み合わせを含む、細胞または細胞株を培養するためのキット。
項１８３．項１８２に記載のキットであって、
（ｉ）細胞が、動物細胞であるか、または
（ｉｉ）動物細胞が、ウシ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、霊長類細胞、もしくはヒト細胞であるか、または
（ｉｉｉ）動物細胞が、二倍体細胞であるか、または
（ｉｖ）細胞が、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＭＲＣ−９、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝臓、Ｕ９３７、ＭＤＣＫ、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ、および前述の細胞の任意のクローンからなる群から選択される、キット。
項１８４．細胞が、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生する、項１８２〜１８３に記載のキット。

Claims (94)

  1. リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびシクロデキストリンを含む、無血清細胞培養培地組成物。
  2. リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびシクロデキストリンを含む、無血清細胞培養補助剤組成物。
  3. 前記シクロデキストリンが、メチル化シクロデキストリンである、請求項１に記載の無血清細胞培養培地組成物または請求項２に記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
  4. 前記メチル化シクロデキストリンが、約５０μＭ〜約２００μＭのレベルで存在する、請求項３に記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
  5. 前記コレステロールが、合成コレステロールであり、かつ／または前記コレステロールが、約５μＭ〜約３０μＭのレベルで存在する、請求項１〜４のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または請求項１〜４のいずれかに記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
  6. 前記少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸が、多価不飽和オメガ−６脂肪酸である、請求項１〜５のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または請求項１〜５のいずれかに記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
  7. 前記少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸が、アラキドン酸である、請求項１〜６のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または請求項１〜６のいずれかに記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
  8. 前記多価不飽和オメガ−６脂肪酸が、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または請求項１〜７のいずれかに記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
  9. 前記補助剤の有効希釈度が、約１：１０〜約１：５０００である、請求項１〜８のいずれかに記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
  10. ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生し得る細胞を培養することができる、請求項１に記載の無血清細胞培養培地組成物または請求項２に記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
  11. 前記細胞が、動物細胞である、請求項１〜１０のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
  12. 前記動物細胞が、ウシ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞である、請求項１１に記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
  13. 前記動物細胞が、二倍体細胞である、請求項１１または１２に記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
  14. ２−デオキシ−Ｄ−グルコースをさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物。
  15. 前記細胞が、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＭＲＣ−９、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝臓、Ｕ９３７、ＭＤＣＫ、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ、および前述の細胞のクローンからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
  16. 培地または補助剤が、前記細胞の成長、前記細胞の生存細胞密度、ウイルスに感染した細胞のウイルス力価、またはそれらの組み合わせを増加させる、請求項１〜１５のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
  17. 前記細胞が、ウイルスに感染している、請求項１〜１６のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
  18. 前記ウイルスが、動物ウイルス、植物ウイルス、またはバクテリオファージである、請求項１６または１７に記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
  19. 前記ウイルスが、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、風疹、麻疹、流行性耳下腺炎、Ａ型肝炎、アデノウイルス、ポリオ、ロタウイルス、痘瘡、水痘、黄熱、パピローマウイルス、エボラウイルス、ＨＩＶ、狂犬病または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびデングウイルスからなる群から選択される、請求項１６〜１８に記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
  20. 前記ウイルス粒子が、パルボウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、またはバクテリオファージに由来する、請求項１０〜１９のいずれかに記載の無血清細胞培養培地組成物または無血清細胞培養補助剤組成物。
  21. ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生することができる二倍体細胞を培養するために基本培地に添加され、前記細胞が、無血清条件下で培養されるものである、請求項２に記載の無血清細胞培養補助剤組成物。
  22. 二倍体細胞集団を培養するための方法であって、前記細胞集団を、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地中でインキュベートすることを含む、方法。
  23. ワクチン産生二倍体細胞を含む、請求項２２に記載の細胞集団を培養する方法であって、前記細胞集団を、
    （ｉ）シクロデキストリン、リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、およびコレステロール、または
    （ｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤を含む、無血清細胞培養培地中でインキュベートすることを含み、
    前記培養が、シクロデキストリンを有しない血清含有培地中の生存細胞密度と比較して、前記無血清細胞培養培地中の生存細胞密度を増加させる、方法。
  24. 前記シクロデキストリンが、メチル化シクロデキストリンである、請求項２３に記載の二倍体細胞集団を培養するための方法。
  25. 前記メチル化シクロデキストリンが、約５０μＭ〜約２００μＭのレベルで存在する、請求項２４に記載の二倍体細胞集団を培養するための方法。
  26. 前記少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸が、多価不飽和オメガ−６脂肪酸である、請求項２３に記載の二倍体細胞集団を培養するための方法。
  27. 前記多価不飽和オメガ−６脂肪酸が、アラキドン酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、およびステアリン酸からなる群から選択される、請求項２３に記載の二倍体細胞集団を培養するための方法。
  28. （ｉ）前記培地または補助剤が、前記細胞の成長、前記細胞の生存細胞密度、ウイルスに感染した細胞のウイルス力価、またはそれらの組み合わせを増加させ、かつ／あるいは
    （ｉｉ）前記二倍体細胞が、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはそれらのウイルス断片を産生することができ、かつ／あるいは
    （ｉｉｉ）前記細胞が、ウイルスに感染している、
    請求項２２〜２７のいずれかに記載の二倍体細胞集団を培養するための方法。
  29. （ｉ）前記ウイルスが、動物ウイルス、植物ウイルス、もしくはバクテリオファージであり、かつ／または
    （ｉｉ）前記ウイルスが、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、風疹、麻疹、流行性耳下腺炎、Ａ型肝炎、アデノウイルス、ポリオ、ロタウイルス、痘瘡、水痘、黄熱、パピローマウイルス、エボラウイルス、ＨＩＶ、狂犬病もしくは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびデングウイルスからなる群から選択され、かつ／または
    （ｉｉｉ）前記ウイルス粒子が、パルボウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、もしくはバクテリオファージに由来する、請求項２２〜２８のいずれかに記載の二倍体細胞集団を培養するための方法。
  30. 前記細胞集団が、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＭＲＣ−９、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝臓、Ｕ９３７、ＭＤＣＫ、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ、および前述の細胞のクローンからなる群から選択される、請求項２２〜２９のいずれかに記載の方法。
  31. （ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む無血清細胞培養培地、または
    （ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤、または
    （ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤
    を含む、組み合わせ。
  32. （ｉ）前記細胞が、動物細胞であるか、または
    （ｉｉ）前記動物細胞が、ウシ細胞、ネコ細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、霊長類細胞、もしくはヒト細胞であるか、または
    （ｉｉｉ）前記動物細胞が、二倍体細胞であるか、または
    （ｉｖ）前記細胞が、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＭＲＣ−９、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝臓、Ｕ９３７、ＭＤＣＫ、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ、および前述の細胞のクローンからなる群から選択される、請求項３１に記載の組み合わせ。
  33. 前記二倍体細胞が、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生する、請求項３１または３２に記載の組み合わせ。
  34. 無血清二倍体細胞培養培地を作製する方法であって、（ｉ）基本培地と、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤、または（ｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤、のいずれかとを混合することを含む、方法。
  35. 前記補助剤が、成長因子をさらに含む、請求項３４に記載の無血清二倍体細胞培養培地を作製する方法。
  36. （ｉ）１種以上の異なるシクロデキストリンであって、各シクロデキストリンが、別個の容器内にある、シクロデキストリンと、（ｉｉ）２種以上の異なる脂肪酸であって、各脂肪酸が、別個の容器内にある、脂肪酸とを含む、二倍体細胞培地の補充のための系。
  37. 細胞または細胞株を培養するためのキットであって、
    （ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む無血清細胞培養培地、または
    （ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む補助剤、または
    （ｉ）細胞の集団、（ｉｉ）無血清基本細胞培地、ならびに（ｉｉｉ）好適な希釈度の表１および／もしくは表２に記載の補助剤、を含む、キット。
  38. （ｉ）前記細胞が、動物細胞であるか、または
    （ｉｉ）前記動物細胞が、ウシ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、霊長類細胞、もしくはヒト細胞であるか、または
    （ｉｉｉ）前記動物細胞が、二倍体細胞であるか、または
    （ｉｖ）前記細胞が、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−５ ＲＣＢ、ＭＲＣ−９、ＷＩ−３８、２ＢＳ、Ｗａｌｖａｘ−２、ＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＫＭＢ−１７、ＨＵＴ系列細胞、チャン肝臓、Ｕ９３７、ＭＤＣＫ、ＣＤ４発現Ｔ細胞、ＣＤ８発現Ｔ細胞、ＶＥＲＯ、および前述の細胞のクローンからなる群から選択される、請求項３７に記載のキット。
  39. 前記細胞が、無血清条件下で、ワクチン、ウイルス、ウイルス粒子、ウイルスタンパク質もしくは核酸、またはウイルス断片を産生する、請求項３７〜３８のいずれかに記載のキット。
  40. （ｉ）Ｔ細胞の集団、ならびに（ｉｉ）シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む培地を含む、組み合わせ。
  41. 前記少なくとも１つの脂質が、コレステロール、脂肪酸、脂肪酸エステル、リン脂質、またはグリセロ脂質である、請求項４０に記載の組み合わせ。
  42. 前記脂肪酸が、飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸、または多価不飽和脂肪酸である、請求項４１に記載の組み合わせ。
  43. 前記脂肪酸が、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸、またはオメガ−９脂肪酸である、請求項４１に記載の組み合わせ。
  44. 前記脂肪酸が、リノール酸である、請求項４１に記載の組み合わせ。
  45. リノレン酸をさらに含む、請求項４１に記載の組み合わせ。
  46. 前記リノレン酸が、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、またはα−リノレン酸およびγ−リノレン酸である、請求項４５に記載の組み合わせ。
  47. アラキドン酸をさらに含む、請求項４１に記載の組み合わせ。
  48. 前記少なくとも１つの脂質が、コレステロールである、請求項４０に記載の組み合わせ。
  49. 前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、またはγ−シクロデキストリンである、請求項４０に記載の組み合わせ。
  50. 前記シクロデキストリンが、メチル化されている、請求項４０に記載の組み合わせ。
  51. 前記シクロデキストリンが、メチル−β−シクロデキストリンである、請求項５０に記載の組み合わせ。
  52. 組成物が、複数の異なるシクロデキストリンを含み、前記複数のシクロデキストリンが、少なくとも２種のシクロデキストリンを含む、請求項４０に記載の組み合わせ。
  53. 前記シクロデキストリン対コレステロールのモル比が、１１．５：１より小さいである、請求項４８に記載の組み合わせ。
  54. 前記細胞培養培地が、約１０μＭ〜約２００μＭであるレベルのシクロデキストリンを含む、請求項４０に記載の組み合わせ。
  55. 前記細胞培養培地が、無血清培養培地である、請求項４０に記載の組み合わせ。
  56. 前記細胞培養培地が、アルブミンを含まない、請求項４０に記載の組み合わせ。
  57. ２−デオキシ−Ｄ−グルコースをさらに含む、請求項４０に記載の組み合わせ。
  58. Ｔ細胞集団を培養するための方法であって、前記集団を、シクロデキストリンおよび少なくとも１つの脂質を含む細胞培養培地中でインキュベートすることを含む、方法。
  59. 前記細胞培養培地が、リノール酸、少なくとも１つの他のオメガ−６脂肪酸、コレステロール、およびシクロデキストリンを含む無血清細胞培養補助剤組成物を含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記Ｔ細胞集団が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記Ｔ細胞集団が、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項５８に記載の方法。
  62. 前記Ｔ細胞集団が、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項５８に記載の方法。
  63. 前記細胞培養培地が、２−デオキシ−Ｄ−グルコースをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
  64. ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を培養する方法であって、前記集団を、シクロデキストリンおよび多価不飽和脂肪酸を含む細胞培養培地中でインキュベートすることを含み、
    前記集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞の比の変化が、１０日間の培養後に５０％未満であり、
    前記細胞培養培地が、０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含有する、方法。
  65. 前記多価不飽和脂肪酸が、オメガ−６多価不飽和脂肪酸である、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記オメガ−６多価不飽和脂肪酸が、リノール酸である、請求項６４に記載の方法。
  67. 前記細胞培養培地が、コレステロールをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
  68. 前記集団が最初に前記培地と接触するとき、前記集団が、約１：１のＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞の比を含む、請求項６４に記載の方法。
  69. Ｔ細胞亜集団のメンバーを優先的に増殖させるための方法であって、Ｔ細胞の混合集団を、
    （ｉ）シクロデキストリン、および
    （ｉｉ）２種以上の脂肪酸に曝露することを含み、
    ２種以上の脂肪酸のモル比が、前記Ｔ細胞亜集団の前記メンバーを誘導して、他のＴ細胞亜集団のメンバーに対して優先的に増殖するように調整される、方法。
  70. 前記Ｔ細胞亜集団が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記Ｔ細胞亜集団が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項６９に記載の方法。
  72. 前記Ｔ細胞の混合集団を、２−デオキシ−Ｄ−グルコースに曝露することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
  73. 前記Ｔ細胞の混合集団が、他の脂肪酸よりも多くの多価不飽和脂肪酸に曝露される、請求項６９に記載の方法。
  74. 前記Ｔ細胞が、初代Ｔ細胞である、請求項６９に記載の方法。
  75. 前記Ｔ細胞が、ヒト対象の血液から単離されたものである、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記Ｔ細胞が、遺伝子改変Ｔ細胞である、請求項６９に記載の方法。
  77. 前記Ｔ細胞が、遺伝子改変Ｔ細胞受容体を発現する、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体を発現する、請求項６９に記載の方法。
  79. ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を増加させながらＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞集団を培養する方法であって、前記集団を、２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含む細胞培養培地中でインキュベートすることを含む、方法。
  80. 前記２−デオキシ−Ｄ−グルコースが、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭのレベルで存在する、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記細胞培養培地が、血清をさらに含む、請求項７９に記載の方法。
  82. 前記細胞培養培地が、無血清細胞培養培地である、請求項７９に記載の方法。
  83. 前記集団内のＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比が、前記培養培地との最初の接触から７日後に２倍〜５倍増加する、請求項７９に記載の方法。
  84. 前記Ｔ細胞が、初代Ｔ細胞である、請求項７９に記載の方法。
  85. 前記Ｔ細胞が、ヒト対象の血液から単離されたものである、請求項７９に記載の方法。
  86. 前記Ｔ細胞が、遺伝子改変Ｔ細胞である、請求項７９に記載の方法。
  87. 前記Ｔ細胞が、遺伝子改変Ｔ細胞受容体を発現する、請求項７９に記載の方法。
  88. 前記Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体を発現する、請求項７９に記載の方法。
  89. 前記Ｔ細胞が、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ヘルパーＴ細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、高分化型エフェクター（ＴTD）Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、または操作されたＴ細胞である、請求項７９に記載の方法。
  90. 疾患または病態に罹患しているか、またはそれに罹患するリスクがある対象への投与のための培養Ｔ細胞を調製することをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
  91. 前記Ｔ細胞を前記対象に投与することをさらに含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 疾患の治療を必要とする対象において疾患を治療するための方法であって、請求項９１に記載の方法によって得られたＴ細胞を、前記対象に投与することを含む、方法。
  93. 無血清培地、シクロデキストリン、および１つ以上の脂質を含むＴ細胞を培養するための、キット。
  94. ２−デオキシ−Ｄ−グルコースをさらに含む、請求項９３に記載のキット。
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